KR20220030195A

KR20220030195A - Cas9을 위한 신규 tracrRNA 시스템

Info

Publication number: KR20220030195A
Application number: KR1020210116536A
Authority: KR
Inventors: 안대로; 박지현; 정학숙; 정철현
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2022-03-10
Also published as: US20220090065A1

Abstract

본 발명은 tracrRNA의 단편을 포함하는 신규 tracrRNA(trans-activating crispr RNA), 상기 tracrRNA를 포함하는 gRNA, CRISPR-Cas9 시스템, 및 키트에 관한 것이다.

Description

Cas9을 위한 신규 tracrRNA 시스템 {A novel tracrRNA system for Cas9}

본 발명은 tracrRNA의 단편을 포함하는 신규 tracrRNA 시스템, 상기 신규 tracrRNA 시스템을 포함하는 gRNA, 및 CRISPR-Cas9 시스템에 관한 것이다.

유전자 가위는 특정 유전자 부위를 절단하여 대상 유전자 기능을 넉아웃(knock-out)시키거나 넉아웃된 유전자를 원하는 유전자로 치환하는 유전자 기술인 넉인(knock-in)을 가능하게 하는 생명공학 기술이다. 1세대 ZFN 및 2세대 TALEN을 거쳐 개발된 CRISPR-Cas9 시스템은 3세대 유전자 가위로서, DNA 결합 영역을 매번 새로 만들 필요가 없다는 점 및 특이성에서 우수한 면이 있어 널리 사용된다 (Zhang, F., et al, CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges. Human Molecular Genetics, 2014, 23(R1), R40-R46).

이러한 CRISPR-Cas9 시스템은 gRNA(guide RNA)에 의해 표적 유전자 주위의 3-4개 염기로 이루어지는 특정 염기서열을 인식함으로써 유전자 절단을 진행하는 점에서 1세대 및 2세대 유전자 가위와 차이점이 있다. 구체적인 gRNA로는 sgRNA(single gRNA) 또는 double gRNA가 사용되어왔으나, 두 종류의 gRNA 모두 실용성 등에서 문제가 지속적으로 제기되고 있다.

예를 들어, 기존의 sgRNA의 경우, sgRNA 및 Cas9를 조합한 RNP(ribonucleoprotein) 복합체로 사용되어왔다. 상기 sgRNA 및 Cas9는 각각 DNA 벡터에 클로닝하여 각각 발현시키는 방식으로 생산되어왔으나, 이 경우 플라스미드 벡터 사용으로 Cas9 활성이 저하되고 표적 외 효과를 유발하며 세포 내 독성을 일으키는 문제점이 제기되어 왔다. 또한 전체 길이가 100 뉴클레오티드를 넘는 긴 서열로 이루어져 있어 합성 수율이 매우 낮고, 대량생산이 어려운 실정이다.

뿐만 아니라, 2가지 gRNA를 화학적 합성을 통해 제작하여 사용하는 dual-crRNA:tracrRNA gRNA 시스템의 경우에도, tracrRNA가 일반적으로 89 뉴클레오티드의 긴 RNA 서열로 이루어져 있어 대량생산을 현저히 저해하는 단점이 있으나, 효율적인 gRNA 개발이 미미한 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 기존의 단일 및 이중 gRNA 시스템보다 더욱 간편하고 대량생산이 가능하여 실용적으로 널리 응용 가능하면서도 타겟 서열에 대한 민감도를 유지할 수 있는 gRNA을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 일반적인 tracrRNA의 단편 또는 이의 조합을 tracrRNA로 활용한 CRISPR-Cas9 시스템을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 tracrRNA(trans-activating crispr RNA)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 tracrRNA를 포함하는 gRNA(guide RNA)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 tracrRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 DNA 발현 억제 및 DNA 표적용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 유전자 교정용 키트를 제공하는 것이다.

이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 tracrRNA(trans-activating crispr RNA)를 제공한다.

본 발명에서 용어 "tracrRNA"(trans-activating crispr RNA)는 crRNA와 결합하여 gRNA(guide RNA)를 구성하는 RNA를 의미하며, CRISPR-Cas9 시스템의 일 구성요소이다.

야생형 tracrRNA는 일반적으로 75 뉴클레오티드 이상의 크기를 갖는 폴리뉴클레오티드이나, 본 발명에서 야생형 tracrRNA의 일부이며 서열번호 1의 염기서열(67 뉴클레오티드)로 이루어진 tracrRNA(67)도 tracrRNA의 기능을 수행하는 것을 확인하였고 (실시예 3 및 4), 이는 기존에 알려진 tracrRNA의 기능에 상응하는 결과이다. 다만, 본 발명의 목적상 상기 tracrRNA는 서열번호 2의 염기서열을 포함하면서 tracrRNA로서의 기능을 수행하는 것으로서, 상기 야생형 tracrRNA 또는 tracrRNA(67)에 비해 짧은 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 tracrRNA는 서열번호 1의 염기서열의 단편을 하나 이상 더 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열의 하나 또는 두 단편을 더 포함하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로, 서열번호 1의 염기서열의 단편을 하나 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 염기서열을 하나 더 포함하는 tracrRNA는 서열번호 1의 염기서열의 두 단편을 포함하는 tracrRNA로서 상기 두 단편 중 하나 이상은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "단편"은 특정 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 일부 서열을 의미하는 것으로, 구체적으로는, 야생형 tracrRNA 또는 tracrRNA(67)의 일부 서열이면서 tracrRNA에 포함되어 활용될 수 있는 일부 영역의 서열을 의미한다. 야생형 tracrRNA 또는 tracrRNA(67)의 일부 서열이면서 tracrRNA에 포함되어 Cas9 시스템에서 활성을 가질 수 있는 한 서열이나 길이는 제한되지 않고, 상기 단편의 양 말단에 무의미한 서열이 부가되거나, 일부 서열이 치환된 서열 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

구체적으로, 상기 단편은 야생형 tracrRNA의 단편 또는 서열번호 1(tracrRNA(67))의 단편일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2 내지 27 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 단편은 서열번호 2, 4, 6, 8, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 및 27 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단편의 크기는 15 뉴클레오티드 이상 50 뉴클레오티드 이하일 수 있으며, 구체적으로 18 뉴클레오티드 이상 49 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 44 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 43 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 42 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 41 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 40 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 39 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 38 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 37 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 36 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 35 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 34 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 33 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 32 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 31 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 30 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 29 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 28 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 27 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 26 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 25 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 24 뉴클레오티드 이하, 18 뉴클레오티드 이상 23 뉴클레오티드 이하, 26 뉴클레오티드 이상 44 뉴클레오티드 이하, 26 뉴클레오티드 이상 43 뉴클레오티드 이하, 26 뉴클레오티드 이상 42 뉴클레오티드 이하, 또는 26 뉴클레오티드 이상 41 뉴클레오티드 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단편의 주요서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 tracrRNA의 5'말단으로부터 18개; 3'말단으로부터 18개; 또는 3'말단으로부터 20개의 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명에서는 야생형 tracrRNA 또는 tracrRNA(67)이 crRNA와 결합하는 영역을 포함하는 단편을 포함하는 tracrRNA는 야생형 tracrRNA와 유사하게 tracrRNA로서 기능할 수 있음을 확인하였으며, 상기 crRNA와 상보적으로 결합하는 영역은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 영역(도 1에서 영역 1)으로서, 야생형 tracrRNA 보다 짧은 길이의 tracrRNA, 야생형 tracrRNA의 단편, 및 tracrRNA의 단편을 포함하는 tracrRNA로서 tracrRNA로 기능할 수 있는 것이라면 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 영역을 포함하고 있음을 확인하여, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 영역은 tracrRNA로 작용하기 위한 필수 영역임을 확인하였다.

일 구현 예로, 상기 tracrRNA는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편(도 1의 A); 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 단편(도 1의 A+3); 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 단편(도 1의 A+4); 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 단편, 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 단편(도 1의 A+3+4); 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 단편(도 2); 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 단편(도 1의 A+B); 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편(도 2); 및/또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 단편(도 2)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현 예로, 상기 tracrRNA는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편; 및/또는 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현 예로, 상기 tracrRNA는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편; 및/또는 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현 예로, 상기 tracrRNA는 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 단편; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 단편; 및/또는 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 단편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 둘 이상의 단편을 포함하는 tracrRNA는 각 단편이 서로 연결된 형태일 수 있고, 또는 서로 연결되지 않더라도 3차원 구조상 인접하여 Cas9 시스템 내에서 서로 인접하여 타겟 서열을 인식하는 특성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 단편을 포함하는 tracrRNA는 작은 사이즈, 간편성, 실용성, 및 경제성을 가지면서도, 동시에 CRISPR-Cas9 시스템에 도입하였을 때 야생형 tracrRNA를 도입한 CRISPR-Cas9 시스템과 같이 높은 민감성을 갖는 것을 확인하였다(실시예 3 및 4).

본 발명에서 용어 "CRISPR-Cas9" 시스템은 3세대 유전자 가위이며, gRNA 및 Cas9 단백질이 결합하여 형성된 염기서열 특이적 엔도뉴클라아제(endonuclease) 시스템을 의미한다.

본 발명에서 용어 "gRNA"(guide RNA)는 타겟 영역의 DNA 염기서열 특이성을 유도하여 염기서열에 특이적으로 표적 유전자를 절단할 수 있도록 역할을 하는 RNA를 의미한다. 상기 gRNA를 구성하는 RNA 개수에 따라 sgRNA(single guide RNA) 및 dual gRNA(dual guide RNA) 시스템으로 구분할 수 있으며, dual gRNA는 일반적으로 crRNA(crispr RNA) 및 tracrRNA의 결합으로 형성되므로, crRNA:tracrRNA 또는 dual-crRNA:tracrRNA와 혼용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "Cas9"(CRISPR-associated protein9)는 gRNA와 결합하여 CRISPR-Cas9 시스템을 이루는 단백질을 의미한다.

본 발명에서, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 단백질이 특정 서열번호의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 것으로 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 염기서열 또는 아미노산 서열로 이루어진 DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 서열을 갖는 DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.

또한, 특정 서열번호로 표현되는 염기서열 또는 아미노산 서열의 DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 단백질과 동일 또는 상응하는 활성을 갖는 이상, 특정 서열번호로 표현되는 염기서열 또는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 서열도 본 발명의 범주에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 특정 서열번호의 염기서열 또는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있으며, 상응하는 효능 또는 활성을 나타내는 것으로, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 발명에서 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 tracrRNA를 포함하는 gRNA(guide RNA)를 제공한다. 상기 gRNA는 crRNA(crispr RNA)를 더 포함하는 것일 수 있으며, 본 발명의 목적상 상기 crRNA는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 단편, tracrRNA, crRNA, 및 gRNA는 전술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 tracrRNA, crRNA, 및/또는 gRNA는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 상기 변형 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 RNA(2'-O-methyl RNA; 2'-OMe RNA), 2'-O-메틸톡시에틸 RNA(2'-O-methoxyethyl RNA; 2'-MOE RNA), 2'-플루오로 RNA(2'-fluoro RNA; 2'-F RNA), 포스포로티오에이트 RNA(phosphorothioate RNA; PS RNA), 2'-아미노 RNA(2'-amino RNA; 2'-NH₂ RNA), 2'-플루오로 아라비노스 핵산(2'-fluoro arabinose nucleic acid; FANA), 4'-티오 RNA(4'-thio RNA; 4'-S RNA), 닫힌 핵산(locked nucleic acid; LNA), 트레오스 핵산(threose nucleic acid; TNA), 포스포로티오에이트 DNA (phosphorothioate DNA; PS DNA), DNA, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid; PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide; PMO), 헥시톨 핵산(hexitol nucleic acid; HNA), 사이클로헥센 핵산(clohexene nucleic acid; CeNA), 및 아라비노스 핵산(arabinose nucleicacid; ANA)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 tracrRNA는 안정화된 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 당 골격을 변화시켜 이중사슬 결합력을 안정화, 스템 루프(stem-loop) 포함 또는 구아닌(G) 또는 시토신(C)을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 구아닌 또는 시토신은 스템루프 전후에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 당 골격 변화는 RNA 대신 2'-플루오로-RNA(2'-fluoro-RNA), 2'-O-메틸-RNA(2'-OMe-RNA), LNA(locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid) 등을 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 tracrRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템을 제공한다. 상기 용어 단편, tracrRNA, 및 CRISPR-Cas9 시스템은 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 tracrRNA 또는 상기 tracrRNA를 암호화하는 DNA; crRNA 또는 상기 crRNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas9 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, DNA 발현 억제 및 DNA 표적용 키트를 제공한다. 상기 용어 단편, tracrRNA, crRNA, 및 Cas9은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 DNA 발현 억제 및 DNA 표적화를 할 수 있다면 그 작동 원리나 형태에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 DNA 발현 억제 및 DNA 표적화를 위해 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분　조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다른 구성 성분의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 버퍼 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 tracrRNA 또는 상기 tracrRNA를 암호화하는 DNA; crRNA 또는 상기 crRNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자 교정용 키트를 제공한다. 상기 용어 단편, tracrRNA, crRNA, Cas9, 및 키트는 전술한 바와 같다.

본 발명의 짧은 tracrRNA를 이용한 tracrRNA 시스템뿐만 아니라 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 시스템은 기존의 시스템의 민감성은 유지하면서도 간편성, 경제성, 실용성을 모두 갖춘 tracrRNA 시스템으로 응용할 수 있다. 이를 통해, 유전정보의 기능 규명, 유전자 편집(gene editing), 및 질병 치료에서의 산업적 활용을 기대할 수 있다.

도 1은 서열번호 1의 단편의 필수 영역을 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 2a 및 2b는 서열번호 1 또는 이의 단편을 포함하는 tracrRNA의 서열 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 in vitro target cleavage assay 결과를 나타낸 도이다.
도 4 내지 6은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 off-target 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법) 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(웨스턴 블럿) 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(T7E1 assay) 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(TIDE analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 올리고뉴클레오티드의 길이가 증가할수록 이의 합성 수율이 감소함을 나타낸 도이다.
도 12는 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 in vitro target cleavage assay 결과를 나타낸 도이다.
도 13a 및 13b는 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 off-target 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법) 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(TIDE analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 서열번호 1의 단편을 포함하는 tracrRNA의 서열 모식도를 나타낸 도이다.
도 17은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 in vitro target cleavage assay 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법) 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 서열번호 1 또는 이의 단편을 tracrRNA에 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(TIDE analysis) 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 서열번호 1 또는 이의 단편을 포함하면서 스템루프 2(stem loop 2) 일부 서열이 결실된 tracrRNA를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 in vitro target cleavage assay 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 서열번호 1의 단편 조합에서 스템루프 2(stem loop 2)가 제거된 후 이의 인접 뉴클레오티드의 일부가 시토신 또는 구아닌으로 치환된 서열을 포함하는 tracrRNA의 서열 모식도를 나타낸 도이다.
도 22는 서열번호 1의 단편 조합에서 스템루프 2(stem loop 2)가 제거된 후 이의 인접 뉴클레오티드의 일부가 시토신 또는 구아닌으로 치환된 서열을 포함하는 tracrRNA를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 in vitro target cleavage assay 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 서열번호 1의 단편 조합에서 스템루프 2(stem loop 2)가 제거된 후 이의 인접 뉴클레오티드의 일부가 시토신 또는 구아닌으로 치환된 서열을 포함하는 tracrRNA를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법) 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 서열번호 1의 단편 조합에서 스템루프 2(stem loop 2)가 제거된 후 이의 인접 뉴클레오티드의 일부가 시토신 또는 구아닌으로 치환된 서열을 포함하는 tracrRNA를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 타겟 절단 활성 확인(TIDE analysis) 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: DNA, crRNA, 야생형 tracrRNA, 및 Cas9 수득

실시예 1-1: DNA, crRNA, 및 야생형 tracrRNA의 수득

DNA, crRNA(crispr RNA), 및 키메라 올리고뉴클레오티드(chimeric oligonucleotides)는 Integrated DNA Technologies (USA) 및 Bioneer (Korea) 에서 구입하였다. 야생형 tracrRNA(transactivating crRNA)는 Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA (Integrated DNA Technologies, USA)를 사용하였다.

실시예 1-2: Cas9 제조

Addgene (USA, plasmid #62934)으로부터 pET-NLS-Cas9-6xHis 플라스미드를 구입하여 정제하였다. 이후, 펠렛을 배양하고 완충액 A(buffer A; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole 및 5 mM 2-Mercaptoethanol (Bio-rad))에 다시 현탁하여 초음파 처리(sonication)로 용해하였다. 이러한 용해물을 10,000g 및 4℃에서 40분동안 원심분리한 후, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 NLS-Cas9를 분리하였다. 분리된 Cas9은 Hiprep SP HP 16/10 컬럼(GE Health-care Life Sciences)에 로딩하고, 완충액 B(20 mM HEPES, pH 7.5, 10 % glycerol, 및 2 mM DTT)에서 0.15 M부터 1M까지 KCl 농도 순서에 따라 정제하였다. 분리된 단백질을 농축하여 액체 질소에서 급속냉동하고 -80℃에 보관하였다. Cas9의 최종 순도 및 농도는, BSA(bovine serum albumin)을 단백질 표준으로 하여 SDS PAGE 겔 및 Bradford protein assay (Bio-Rad, USA)로 결정하였다. 촉매 비활성 변이체 dCas9 (D10A/H840A)는 제조사의 프로토콜(Agilent, USA)에 따라 Quick change site-directed mutagenesis에 의해 발생시켰다.

실시예 2: tracrRNA 기능 평가 방법

본 발명자들은 발굴한 tracrRNA의 기능을 평가하기 위해, 상기 tracrRNA를 포함하는 RNP 복합체, 즉, CRISPR-Cas9를 제조하였다. 제조된 RNP 복합체와 관련하여, in vitro 상에서 타겟 절단 활성을 확인 및 세포 외 Off target 효과 분석을 수행하였고, 세포 내 수준에서는 세포 내 transfection(on/off target) 및 타겟 절단 활성 확인(표적 유전자 넉아웃 확인; 유동세포분석법, 웨스턴 블럿, T7E1 assay, 및 TIDE analysis)을 수행하였다. 유동세포분석법 및 웨스턴블럿은 일반적인 공지된 방법을 이용하였으며, 이외의 방법은 다음과 같이 수행하였다.

실시예 2-1: in vitro 타겟 절단 활성 확인(in vitro target cleavage assay, in vitro Cas9 activity assay)

GFP(green fluorescent protein) 유전자를 코딩하는 pSMART-EGFP 플라스미드 서울대학교에서 제공받아 in vitro DNA cleavage assays의 DNA 기질로 사용하였다. 반응 완충액(20 mM HEPES pH6.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM EDTA)에 Cas9 (33 nM), 선형(linearized) pSMART-EGFP 기질 (1 nM), crRNA (33 nM), 및 tracrRNA (33 nM)를 함유하는 반응 혼합물(30 μL)을 10 또는 60분동안 37℃에서 배양하였다. 6 x gel loading buffer (19.8 mM Tris-HCl, pH 8.0, 66 mM EDTA, 0.017% SDS, 2.5% Ficoll®-400, 0.015% bromophenol blue,5 ㎕, New England Biolabs, USA)를 첨가한 후 아가로스 겔 (0.7%) 전기영동으로 분석하였다. 겔은 SYBR gold (Life Technologies, USA)으로 염색하고 ChemiDoc XRS + system (Bio-rad)으로 이미지화 하였다. 밴드의 강도는 ImageJ를 사용하여 정량하였다(도 1 및 3 등). 절단 수준(cleavage level)은 다음과 같은 방식으로 결정하였으며, 데이터는 독립된 세가지 실험의 평균값 및 표준편차를 나타낸다.

- 절단 수준(%) = 100X[절단 산물의 밴드 강도의 합 / 모든 밴드 강도의 합]

실시예 2-2: Off target 효과 분석

Off-target 효과는 유전자 가위가 원하는 DNA 서열을 지닌 위치에 작동함으로써 예상했던 곳과 전혀 다른 위치에 유전자 변이를 유발하기도 하는 부작용 효과를 의미한다.

표적 외 활성 부작용(off-target) 분석을 위해 EGFP 유전자 내 점 돌연변이(point mutation)를 유도한 플라스미드 구조체를 제작하여 한 개의 염기서열만 변화시킨 단일 돌연변이와 둘 이상의 염기서열을 변화시킨 이중 및 삼중 돌연변이체도 함께 제작하여 각각의 RNP 복합체의 타겟 서열 민감도를 비교하였다.

Off-target을 포함하는 변이형 pSMART-EGFP 플라스미드들은 Q5 site-directed mutagenesis kit (New England Biolabs, USA)를 사용하여 pSMART-EGFP 플라스미드 기질을 돌연변이하여 제조하였다. 변이형 플라스미드의 서열은 DNA 시퀀싱 (Macrogene, Korea)에 의해 확인하였다. 이러한 변이형 플라스미드에 CRISPR/Cas9 시스템을 처리하여 off-target 효과를 평가하였다(도 4 내지 6 등).

실시예 2-3: 타겟 절단 활성 확인(유동세포분석법)

세포 수준에서의 타겟 절단 활성을 확인하기 위해, Hela-EGFP/RFP 세포주를 활용하였다. HeLa/EGFP/RFP 세포(1x10⁵)를 12-웰 플레이트에 시딩(seeding)하고 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 DMEM 배지에 배양하였다. CAS9(1 ㎍)는 하나의 튜브에서 crRNA (125 ng) 및 tracrRNA(125 ng)와 복합체를 형성하고, 5분동안 상온에서 배양하였다. 그 이후, 전기천공(electroporation, 1350 V, 30ms, 1 pulse)으로 RNP(ribonucleoprotein)를 Hela/EGFP/RFP 세포에 주입하였다. FBS 포함 배지에서 48시간동안 세포를 회수하고, 유동세포분석법(flow cytometry; GUAVA, Millipore, USA)을 이용하여 세포 내에서 EGFP 발현 수준을 분석하였다(도 7 등).

실시예 2-4: 타겟 절단 활성 확인(T7E1 assay)

세포 수준에서의 유전자 분해 수준을 확인하기 위하여, 상기 전기천공으로 RNP가 주입된 세포 내의 PCR로 증폭된 타겟 유전자를 사용하여 T7E1 assay를 수행하였다.

T7E1(T7 endonuclease I)은 heteroduplex DNA에서 구조적 변형을 감지할 수 있는 구조-선택적 효소로서, 상기 T7E1 assay는 공지된 방법을 이용하였다. 구체적으로, CRISPR-Cas9에 의한 유전자 편집을 검출하기 위하여, 시약들을 세포 내로 transfection 시키고 타겟 부분 주위의 유전체 DNA를 PCR로 수 일 동안 증폭시켰다. 상기 RNP가 주입된 세포의 유전제 DNA를 제조하기 위해 DNA 추출 키트(MagListo 5M genomic DNA extraction kit, Bioneer, Korea)를 이용하였으며, 제조사의 프로토콜에 의해 Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (Engen mutation detection kit, New England Biolabs, USA)을 이용하여 PCR로 상기 유전체 DNA를 증폭하였다. PCR 산물은 15분동안 37℃에서 분해하여 2% 아가로스 겔에서 분석하였다. PCR 산물은 온도 상승 및 하강에 따라 분해 및 재결합되며, CRISPR-Cas9에 의한 NHEJ(Non-Homologous End-Joining)이 발생하면 heteroduplex DNA가 다른 길이의 앰플리콘(amplicon) 사이에 형성되고 T7E1에 의해 인식되어 절단될 수 있는 DNA 구조 변화를 초래한다. 이후, 돌연변이 빈도를 확인하기 위해 대조군과 실험군의 이러한 절단 산물의 밴딩 패턴을 대조하여 CRISPR-Cas9의 활성을 비교하였다(도 9 등).

실시예 2-5: 타겟 절단 활성 확인(Sequencing and TIDE analysis)

상기 전기천공으로 RNP가 주입된 세포에서 MagListo TM 5M Genomic DNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후, on-target 부분과 off-target 부분을 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR산물의 서열을 sanger sequencing (Macrogen, Korea)으로 분석한 후 Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) 분석을 통해 CRISPR/Cas9 절단에 의해 생긴 non-homologous end joining 부분을 확인하였다(도 10 등).

실시예 3: 짧은 서열을 갖는 우수한 tracrRNA(67) 및 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 발굴

야생형 tracrRNA 일부를 절단한 작은 크기의 tracrRNA 중에서 그 기능이 감소된 경우도 많다는 것은 본 기술분야에서 널리 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 작은 tracrRNA 또는 이의 단편들을 활용하면서 민감성이 높은 새로운 CRISPR-Cas9 시스템을 개발하기 위해, 상기 야생형 tracrRNA로부터 짧은 서열을 갖는 우수한 tracrRNA(67nt)및 이의 단편 조합을 발굴하였다.

우선, 실시예 2-1의 in vitro 유전자 절단 활성 확인을 위해 EGFP 유전자 내 타겟 부분을 설정한 후 타겟 DNA와 결합할 수 있는 서열을 포함한 crRNA를 확보하였다. 또한, 타겟 DNA 절단능을 갖는 필수서열을 포함한 tracrRNA를 발굴하기 위해 3' 말단이 일부 절단된 다양한 tracrRNA들을 확보하였다. 이후, tracrRNA 필수 서열을 동정하기 위해, tracrRNA 구조를 바탕으로 각각의 스템루프(stem loop)를 포함하는 tracrRNA를 조각으로 나누어 제작하였다. 다양한 tracrRNA를 이용하여 RNP 복합체를 생성한 후 선형 EGFP 플라스미드와 반응하여 절단 활성을 측정하고 속도 상수를 도출하였다.

그 중, 기존의 야생형 tracrRNA와 유사한 활성을 갖는 tracrRNA 단편 조합을 선별하여 3-guide RNA 시스템의 응용 가능 여부를 확인하였다. 이를 위하여, EGFP 유전자 내 추가적인 타겟부위를 설정하고, 선별된 tracrRNA를 이용한 in vitro 상의 Cas9 활성 유무 및 속도 상수를 도출하였으며, 기존의 dual-guide RNA 시스템과 비교분석하였다. 또한, 기존 시스템과의 비교를 위하여 표적 외 활성 부작용(off-target) 분석 및 타겟 절단 활성 분석을 수행하였다.

그 결과, 기존의 야생형 tracrRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템과 유사한 민감도 및 효과를 나타내면서도 짧은 서열을 가지며, 실용성 및 경제성이 우수한 tracrRNA로서, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 tracrRNA(67)를 발굴하였다.

또한, 야생형 tracrRNA, tracrRNA(67)의 단편, 및 상기 단편의 조합도 tracrRNA로서 기능을 할 수 있음을 검증하기 위해, tracrRNA(67)의 단편 여러 종류를 포함한 CRISPR/Cas9의 타겟 절단능을 확인하였다.

그 결과, 서열번호 1을 A 영역 및 B 영역으로 구분하고, A 영역은 1번 영역 및 2번 영역으로 구분하며, B 영역을 3번 영역 및 4번 영역으로 구분하였을 때, B, B+1, B+2, 또는 B+1+2를 tracrRNA로 사용한 경우 tracrRNA로 기능하지 않은 반면, A, A+3, A+4, 또는 A+3+4를 tracrRNA로 사용한 경우에는 tracrRNA로 기능하여, 상기 A, A+3, A+4, 또는 A+3+4 tracrRNA를 포함한 CRISPR/Cas9 시스템은 타겟 절단능이 있음을 확인하였다(도 1).

뿐만 아니라, 서열번호 1의 두 단편을 포함하는 dual-tracrRNA도 tracrRNA로서 우수한 효과를 가짐을 확인하였다. 이러한 tracrRNA 의 모식도는 도 1 및 2에 나타내었다.

상기 결과로부터, 야생형 tracrRNA, tracrRNA(67)의 단편, 및 상기 단편의 조합도 tracrRNA로서 기능을 할 수 있음을 확인하였으며, 상기 단편을 포함하는 tracrRNA는 모두 crRNA에 상보적인 영역으로서 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 영역을 필수적으로 포함함을 확인하였다. 이에 따라, 서열번호 1의 5'부터 18번째 뉴클레오티드 영역에 해당하는 A 영역(서열번호 2)의 존재가 tracrRNA로 작동하기 위한 필수요소임을 확인하였다.

실시예 4: tracrRNA(67) 또는 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 기능 평가

본 발명자들은 상기 실시예 2에 나타난 방법으로, tracrRNA(67) 또는 이의 두 단편을 포함하는 tracrRNA 시스템을 갖는 CRISPR-Cas9 시스템의 기능을 평가하였다.

실시예 4-1. DNA 절단 능력 평가(in vitro target cleavage assay)

실시예 2-1의 방법을 이용하여, 상기 실시예 3에서 확보한 서열번호 1의 염기서열을 갖는 tracrRNA(67) 및 이의 두 단편을 포함하는 tracrRNA의 DNA 절단 능력을 평가하였다.

서열번호 1의 두 단편으로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(18+49)); 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(33+34)); 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(41+26)); 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(49+18)) 각각의 네가지 dual-tracrRNA의 기능을 평가하였다.

그 결과, 야생형(WT)과 마찬가지로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 tracrRNA(67) 및 이의 두 단편을 포함하는 조합이 in vitro에서 타겟 영역을 절단하는 효과가 있음을 확인하였다. 특히, tracrRNA(67), tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), 및 tracrRNA(18+49)는 높은 속도로 절단능이 있음을 확인하였다(도 3).

실시예 4-2. 세포 외 off-target 부작용 평가

실시예 3에서 확보한 5 종류의 tracrRNA 중 tracrRNA(67), tracrRNA(41+26), 및 tracrRNA(18+49)를 대상으로 하여, 실시예 2-2의 방법으로 off-target 부작용을 평가하였다. 이를 위하여, tracrRNA(67), tracrRNA(41+26), 및 tracrRNA(18+49)의 off-target 효과가 어느 정도 나타나는지를 비교하여 야생형 tracrRNA와 기능이 동일한지 여부를 확인하였다.

그 결과, 실시예 tracrRNA(67), tracrRNA(41+26), 및 tracrRNA(18+49)는 야생형 tracrRNA과 off-target 효과에 있어 큰 차이가 없으므로, 길이가 짧은 tracrRNA(67) 또는 이의 단편의 조합인 tracrRNA(41+26), 및 tracrRNA(18+49)의 경우에도 off-target 효과가 증가되는 부작용이 없음을 확인하였다(도 4 내지 6).

실시예 4-3: 세포 내 타겟 절단 활성 확인(유동세포분석법, 웨스턴 블럿, T7E1 assay, TIDE analysis)

실시예 3에서 확보한 tracrRNA 중 대표적으로 tracrRNA(67), tracrRNA(18+49), 및 tracrRNA(41+26)를 대상으로, 실시예 2-3 내지 2-5의 방법을 이용하여 타겟 부위에 대한 절단 활성을 평가하였다.

그 결과, tracrRNA(67), tracrRNA(41+26), 및 tracrRNA(18+49) 모두 야생형 tracrRNA와 동일한 타겟 절단 효과를 가짐을 확인하였다(도 7; 유동세포 분석법, 도 8; 웨스턴 블럿, 도 9; T7E1 assay, 도 10: TIDE analysis).

상술한 실시예로부터, 야생형 tracrRNA(89 뉴클레오티드)보다 짧은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 tracrRNA(67) 뿐만 아니라, 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 시스템이 야생형tracrRNA와 동일한 수준의 민감성을 유지함을 확인하였다.

한편, 실제로 올리고뉴클레오티드의 길이가 50nt 이상인 경우 합성 수율이 약 40% 감소하며, 80nt 이상인 경우 절반 이하의 합성 수율을 보이는 것으로 알려져 있다(도 11). 즉, tracrRNA(67)을 포함하는 tracrRNA 시스템뿐만 아니라 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 시스템이 기존의 시스템보다 간편하면서 대량생산이 가능하여 실용적으로 응용이 가능하면서도 민감성은 유지된 효과적인 시스템이 될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: tracrRNA 기능 평가 방법 2

실시예 2의 방법 외에 다음과 같은 tracrRNA 기능 평가 방법 및 친화도 평가 방법을 사용하였다.

실시예 5-1: 타겟 절단 활성 확인(유동세포분석법)

세포 수준에서의 타겟 절단 활성을 확인하기 위해, Hela-EGFP 세포주를 활용하였다. HeLa/EGFP 세포(1x10⁵)를 12-웰 플레이트에 시딩(seeding)하고 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin)을 보충한 DMEM 배지에 배양하였다. CAS9(1 ㎍)는 하나의 튜브에서 crRNA (125 ng) 및 tracrRNA(125 ng)와 복합체를 형성하고, 5분동안 상온에서 배양하였다. 그 이후, 전기천공(electroporation, 1350 V, 30ms, 1 pulse)으로 RNP(ribonucleoprotein)를 Hela/EGFP 세포에 주입하였다. FBS 포함 배지에서 48시간동안 세포를 회수하고, 유동세포분석법(flow cytometry; GUAVA, Millipore, USA)을 이용하여 세포 내에서 EGFP 발현 수준을 분석하였다.

실시예 5-2: 타겟 절단 활성 확인(Sequencing and TIDE analysis)

48시간 동안의 전기천공으로 RNP가 주입된 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척하였으며, MagListoTM 5M Genomic DNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 제조사 설명에 따라 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 이 후, 이중가닥 DNA target/off-target 부분을 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR은 유전체 DNA로부터 Q5 High-Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA)를 이용하여 수행하였다. 엠플리콘(amplicon)의 서열은 sanger sequencing (Macrogen, Korea)으로 분석한 후에, Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) 분석을 통해 CRISPR/Cas9 절단에 의해 생긴 non-homologous end joining 부분을 평가하였다.

실시예 6: tracrRNA(67) 또는 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 기능 평가 2

실시예 6-1: DNA 절단 능력 평가(in vitro cleavage assay)

실시예 2-1의 방법을 이용하여, 상기 실시예 3에서 확보한 서열번호 1의 염기서열을 갖는 tracrRNA(67)의 두 단편을 포함하는 tracrRNA의 DNA 절단 능력을 평가하여 이를 정량화 하였다.

서열번호 1의 두 단편으로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 RNA 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(18+49)); 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(33+34)); 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(41+26)); 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 단편(tracrRNA(49+18)) 네가지 각각의 dual-tracrRNA의 기능을 평가하였다.

그 결과, tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), tracrRNA(33+34), 및 tracrRNA(18+49)의 절단능(%)이 tracrRNA(67)과 마찬가지로 우수함을 확인하였다(도 12). 전술한 실시예에서 tracrRNA(67)은 야생형(WT)과 마찬가지의 효과가 있음을 확인하였는 바, 상기 결과는 tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), tracrRNA(33+34), 및 tracrRNA(18+49) 역시 야생형(WT) 마찬가지로 효과가 우수함을 시사하는 것이다.

실시예 6-2: DNA 절단 능력 평가(in vitro off-target cleavage assay)

실시예 2-1 및 2-2의 방법을 이용하여, tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), tracrRNA(33+34), 및 tracrRNA(18+49) 4 종의 off-target 절단 여부를 평가하였다.

그 결과, 상기 4 종의 tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), tracrRNA(33+34), 및 tracrRNA(18+49) 모두 tracrRNA(67)와 마찬가지로 off-target 절단 부작용이 없음을 확인하였다 (도 13a 및 13b).

실시예 6-3: 세포 내 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법, TIDE assay)

상기 4 종의 tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), tracrRNA(33+34), 및 tracrRNA(18+49)를 대상으로, 실시예 5-1 및 실시예 5-2의 방법을 이용하여 타겟 부위에 대한 절단 활성을 평가하였다.

그 결과, tracrRNA(49+18), tracrRNA(41+26), tracrRNA(33+34), 및 tracrRNA(18+49) 모두 tracrRNA(67)와 마찬가지로 우수한 타겟 절단 효과가 있음을 확인하였다(도 14; 유동세포 분석법, 도 15: TIDE analysis).

실시예 7: stem-loop 2에 닉(nick)을 갖는, tracrRNA(67)의 단편을 포함하는 tracrRNA 발굴

실시예 3에서 확인한 단편 또는 이의 조합 외에 추가적으로 다른 단편 및 이의 조합도 발굴하였다. 이 과정에서, stem-loop2 부분의 다른 닉(nick) 버전의 활성을 조사하였으며, 닉(nick)의 위치 및 제작된 tracrRNA(40+27), tracrRNA(41+27), tracrRNA(42+25), tracrRNA(43+24), 및 tracrRNA(44+23)의 구조는 도 16에 나타내었다.

tracrRNA(40+27)는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 단편; tracrRNA(41+26)는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편; tracrRNA(42+25)는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편; tracrRNA(43+24)는 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편; 및 tracrRNA(44+23)는 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열의 dual-tracrRNA이며, 상기 서열번호 6, 7, 및 13 내지 20은 서열번호 1의 단편이며, 그 중에서도 상기 서열번호 6, 13, 15, 17, 및 19는 서열번호 2를 포함한다.

실시예 8: tracrRNA(67) 또는 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 기능 평가 3

실시예 8-1: DNA 절단 능력 평가(in vitro cleavage assay)

실시예 2-1의 방법을 이용하여, 상기 실시예 7에서 확보한 tracrRNA(40+27), tracrRNA(41+27), tracrRNA(42+25), tracrRNA(43+24), 및 tracrRNA(44+23) 5종의 DNA 절단 능력을 평가하여 이를 정량화 하였다.

그 결과, tracrRNA(40+27), tracrRNA(41+27), tracrRNA(42+25), tracrRNA(43+24), 및 tracrRNA(44+23) 5종 및 상기 5종의 tracrRNA 각각의 5' 단편에 해당하는 tracrRNA(5'-40), tracrRNA(5'-41), tracrRNA(5'-42), tracrRNA(5'-43), 및 tracrRNA(5'-44) 의 경우 모두 타겟 절단능(%)이 있음을 확인하였다. 다만, 상기 상기 5종의 tracrRNA 각각의 5' 단편(tracrRNA(5'-40), tracrRNA(5'-41), tracrRNA(5'-42), tracrRNA(5'-43), 및 tracrRNA(5'-44)) 보다 5' 단편 및 3' 단편을 모두 포함하는 상기 5 종의 dual-tracrRNA의 절단능이 우수함을 확인하였다(도 17).

실시예 8-2: 세포 내 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법, TIDE assay)

상기 5 종의 tracrRNA(40+27), tracrRNA(41+27), tracrRNA(42+25), tracrRNA(43+24), 및 tracrRNA(44+23)를 대상으로, 실시예 5-1 및 실시예 5-2의 방법을 이용하여 타겟 부위에 대한 절단 활성을 평가하였다.

그 결과, tracrRNA(40+27), tracrRNA(41+27), tracrRNA(42+25), tracrRNA(43+24), 및 tracrRNA(44+23) 모두 우수한 타겟 절단 효과가 있음을 확인하였다(도 18; 유동세포 분석법, 도 19: TIDE analysis).

실시예 9: stem-loop 2의 일부 또는 전부의 뉴클레오티드가 결실된, tracrRNA(67)의 단편을 포함하는 tracrRNA 발굴

실시예 3 및 7에서 확인한 단편 조합 외에 추가적으로 다른 단편 및 이의 조합을 발굴하였다. 이 과정에서, 실시예 7에서 발굴한 상기 5종의 tracrRNA 각각의 5' 단편에 해당하는 tracrRNA(5'-40), tracrRNA(5'-41), tracrRNA(5'-42), tracrRNA(5'-43), 및 tracrRNA(5'-44) 및 상기 5종의 tracrRNA 각각의 3'단편에 해당하는 tracrRNA(3'-23), tracrRNA(5'-24), tracrRNA(5'-25), tracrRNA(5'-26), 및 tracrRNA(5'-27)을 다른 조합으로 사용하여, stem-loop2 부분의 일부 뉴클레오티드가 결실된 dual-tracrRNA 또는 이의 단편을 제작하였다.

실시예 10: tracrRNA(67) 또는 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 기능 평가 4 - DNA 절단 능력 평가(in vitro cleavage assay)

실시예 2-1의 방법을 이용하여, 상기 실시예 9에서 확보한 tracrRNA(5'-40), tracrRNA(40+27), tracrRNA(40+26), tracrRNA(40+25), tracrRNA(40+24), tracrRNA(40+23), tracrRNA(5'-41), tracrRNA(41+26), tracrRNA(41+25), tracrRNA(41+24), tracrRNA(41+23), tracrRNA(5'-42), tracrRNA(42+25), tracrRNA(42+24), tracrRNA(42+23), tracrRNA(5'-43), tracrRNA(43+24), tracrRNA(43+23), tracrRNA(5'-44), 및 tracrRNA(44+23)의 DNA 절단 능력을 평가하여 이를 정량화 하였다.

그 결과, 평가한 모든 tracrRNA 모두 타겟 절단능(%)이 있음을 확인하였다. 다만, tracrRNA 각각의 5' 단편보다 5' 단편 및 3' 단편을 모두 포함하는 상기 5 종의 dual-tracrRNA의 절단능이 우수하며, stem-loop 2가 유지된 dual-tracrRNA가 stem-loop 2 일부 또는 전부가 결실된 dual-tracrRNA에 비해 절단능이 우수함을 확인하였다(도 20).

실시예 11: stem-loop 2 결실 및 stem-loop 2의 인접 뉴클레오티드가 치환된, tracrRNA(67)의 단편을 포함하는 tracrRNA 발굴

실시예 3, 7, 및 9에서 확인한 단편 조합 외에, stem-loop 2가 결실되며 이의 인접 뉴클레오티드 일부가 치환된 다른 단편 조합을 발굴하였다. 이 과정에서, stem-loop 2가 결실된 tracrRNA(40+23)의 5'단편의 3'말단 뉴클레오티드 2개 또는 4개를 시토신(C)으로 치환; tracrRNA(40+23)의 3'단편의 5'말단 뉴클레오티드 2개 또는 4개를 구아닌(G)으로 치환; tracrRNA(40+23)의 5'단편의 3'말단 뉴클레오티드 4개를 F-C(2'-fluoro-시토신)로 치환; 및/또는 tracrRNA(40+23)의 3'단편의 5'말단 뉴클레오티드 4개를 F-G(2'-fluoro-구아닌)로 치환하였다. 이의 구조 모식도는 도 21에 나타내었다.

실시예 12: tracrRNA(67) 또는 이의 단편을 포함하는 tracrRNA 기능 평가 5

실시예 12-1: DNA 절단 능력 평가(in vitro cleavage assay)

실시예 2-1의 방법을 이용하여, 상기 실시예 11에서 확보한 tracrRNA의 DNA 절단 능력을 평가하여 이를 정량화 하였다. 그 결과, C, F-C, G, 및/또는 F-G로의 치환이 증가할수록 절단능이 증가함을 확인하였다(도 22).

실시예 12-2: 세포 내 타겟 절단 활성 확인(유동세포 분석법, TIDE assay)

실시예 11에서 확보한 tracrRNA를 대상으로, 실시예 5-1 및 실시예 5-2의 방법을 이용하여 타겟 부위에 대한 절단 활성을 평가하였다.

그 결과, 스템루프 2(stem loop 2)가 제거된 dual-tracrRNA(40+23)에서, 스템루프 2(stem loop 2) 위치에 인접한 뉴클레오티드가 4 내지 8개 치환된 dual-tracrRNA인, tracrRNA(40(CC)+23(GG)), tracrRNA(40(CCCC)+23(GGGG)), tracrRNA(40(F-CCCC)+23(F-GGGG)), 및 tracrRNA(41(CCCCG)+23(FGGGG))의 타겟 절단 활성이 더 우수하며, 이는 스템루프 2(stem loop 2)가 제거되지 않은 tracrRNA(67) 및 dual-tracrRNA(41+26)의 타겟 절단 활성과 유사할 정도로 우수함을 확인하였다(도 23; 유동세포 분석법, 도 24; TIDE analysis).

상기와 같은 결과로부터 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 tracrRNA를 구성으로 하는 다양한 종류의 tracrRNA가 CRISPR-Cas9 시스템에서 우수한 타겟 절단 활성을 가지므로, 활용성이 높은 유전자 교정 시스템에 활용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> A novel tracrRNA system for Cas9 <130> KPA200831-KR-P1 <150> KR 10-2020-0111923 <151> 2020-09-02 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 1 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60 gugcuuu 67 <210> 2 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 2 agcauagcaa guuaaaau 18 <210> 3 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 3 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 49 <210> 4 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 4 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uua 33 <210> 5 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 5 ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cuuu 34 <210> 6 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 6 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu g 41 <210> 7 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 7 aaaaaguggc accgagucgg ugcuuu 26 <210> 8 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 8 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagug 49 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 9 gcaccgaguc ggugcuuu 18 <210> 10 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 10 aaggcuaguc cguua 15 <210> 11 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 11 ucaacuugaa aaagug 16 <210> 12 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA <400> 12 cgaggagcug uucaccgggg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 13 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 13 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu 40 <210> 14 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 14 gaaaaagugg caccgagucg gugcuuu 27 <210> 15 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 15 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu ga 42 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 16 aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 25 <210> 17 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 17 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaa 43 <210> 18 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 18 aaaguggcac cgagucggug cuuu 24 <210> 19 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 19 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaa 44 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 20 aaguggcacc gagucggugc uuu 23 <210> 21 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 21 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaaccc 40 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 22 ggguggcacc gagucggugc uuu 23 <210> 23 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 23 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacccc 40 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 24 ggggggcacc gagucggugc uuu 23 <210> 25 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> C is 2'-fluoro-cytosine. <400> 25 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacccc 40 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2'-fluoro-guanine. <400> 26 ggggggcacc gagucggugc uuu 23 <210> 27 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> C is 2'-fluoro-cytosine. <400> 27 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucacccc g 41

Claims

서열번호 2의 염기서열을 포함하는 tracrRNA(trans-activating crispr RNA).
제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열의 단편으로서, crRNA(crispr RNA)에 결합하는 영역인 것인, tracrRNA(trans-activating crispr RNA).
제1항에 있어서, 상기 tracrRNA는 서열번호 4, 6, 8, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 및 27로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것인, tracrRNA(trans-activating crispr RNA).
제1항에 있어서, 상기 tracrRNA는 서열번호 1의 염기서열의 하나 또는 두 단편을 더 포함하는 것인, tracrRNA(trans-activating crispr RNA).
제4항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열의 단편은 서열번호 3, 5, 7, 9 내지 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및 26으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것인, tracrRNA(trans-activating crispr RNA).
제4항에 있어서, 상기 tracrRNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 4의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 8의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 17의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 19의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 17의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 21의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 23의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 단편;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 단편; 및
서열번호 27의 염기서열로 이루어진 단편 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 단편으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인, tracrRNA(trans-activating crispr RNA).
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 tracrRNA를 포함하는 gRNA(guide RNA).
제7항에 있어서, 상기 gRNA는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 것인, gRNA(guide RNA).
제8항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 RNA(2'-O-methyl RNA; 2'-OMe RNA), 2'-O-메틸톡시에틸 RNA(2'-O-methoxyethyl RNA; 2'-MOE RNA), 2'-플루오로 RNA(2'-fluoro RNA; 2'-F RNA), 포스포로티오에이트 RNA(phosphorothioate RNA; PS RNA), 2'-아미노 RNA(2'-amino RNA; 2'-NH2 RNA), 2'-플루오로 아라비노스 핵산(2'-fluoro arabinose nucleic acid; FANA), 4'-티오 RNA(4'-thio RNA; 4'-S RNA), 닫힌 핵산(locked nucleic acid; LNA), 트레오스 핵산(threose nucleic acid; TNA), 포스포로티오에이트 DNA (phosphorothioate DNA; PS DNA), DNA, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid; PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide; PMO), 헥시톨 핵산(hexitol nucleic acid; HNA), 사이클로헥센 핵산 (cyclohexene nucleic acid; CeNA), 및 아라비노스 핵산(arabinose nucleic acid; ANA)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 gRNA(guide RNA).
제7항에 있어서, 상기 gRNA는 crRNA(crispr RNA)를 더 포함하는 것인, gRNA(guide RNA).
제10항에 있어서, 상기 crRNA는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것인, gRNA(guide RNA).
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 tracrRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 tracrRNA 또는 상기 tracrRNA를 암호화하는 DNA; crRNA 또는 상기 crRNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, DNA 발현 억제 및 DNA 표적용 키트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 tracrRNA 또는 상기 tracrRNA를 암호화하는 DNA; crRNA 또는 상기 crRNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자 교정용 키트.