CN108795990B

CN108795990B - 一种构建桔小实蝇白眼品系的方法

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Publication number: CN108795990B
Application number: CN201810675973.3A
Authority: CN
Inventors: 颜日辉; 赵三涛; 刘焱晖; 刘中更; 刘向蕊; 郉增珠
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2038-06-27
Also published as: CN108795990A

Abstract

本发明公开了一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，将Cas9 mRNA与靶基因gRNA混合后，利用显微注射的方式，注射到胚胎中，再经过遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系。本发明考虑了最佳的研究步骤和技术参数，构建了桔小实蝇白眼品系的基因编辑方法，快速、准确地获得稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系，填补了技术空白，为桔小实蝇的生物学研究提供了理想的实验材料及研究思路，具有良好的应用前景。

Description

一种构建桔小实蝇白眼品系的方法

技术领域

本发明涉及一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

基因编辑技术是通过对特定基因进行定点修饰来研究基因功能的重要手段，包括锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术和CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9技术是近几年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，与ZFN技术和TALEN技术相比，CRISPR/Cas9技术具有操作更为简便、毒性小，准确性高，效率高，成功周期短等特点；CRISPR/Cas9系统被认为是一种具有广阔应用前景的分子改造工具，在基因功能研究与物种的遗传改良中得到了广泛应用，迄今已在斑马鱼、小鼠、鲟鱼等物种中得到应用。

桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)，又名东方果实蝇(Oriental fruit fly)、黄苍蝇、果蛆，属双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、果实蝇属(Bactrocera)，为世界性检疫害虫中的一种。迄今没有将CRISPR/Cas9技术应用于桔小实蝇白眼品系的研究先例。建立桔小实蝇CRISPR/Cas9技术，一方面可以用于桔小实蝇功能基因研究；另一方面可以用于探索桔小实蝇的生物防控技术。

发明内容

本发明提供一种将野生型红眼桔小实蝇构建成桔小实蝇白眼品系的方法，应用该方法获得稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系，为桔小实蝇的生物学研究提供了理想的实验材料及研究思路。

本发明采取的技术方案如下：

一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，包括以下步骤：

1)以线性化Cas9质粒为模版，进行体外转录，合成Cas9mRNA；

2)选择white基因靶点，确认选择的靶点位于一个单独的外显子，设计含有white基因靶点的上游引物及与其匹配的下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物与载体连接并转化到感受态细胞，Amp抗性平板涂布，进行菌落PCR确定阳性克隆，培养阳性菌株后提取质粒，以所提取质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，体外转录合成gRNA；

3)对桔小实蝇胚胎显微注射gRNA和Cas9mRNA的混合溶液，然后继续培养，直至成虫羽化；

4)遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系。

优选的，步骤2)中，上游引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQID NO:4所示。

优选的，步骤2)中，所述载体为pJET1.2。

优选的，步骤2)中，所述感受态细胞为JM109感受态细胞。

所述步骤3)中，混合溶液中Cas9mRNA的浓度为300～400ng/μl，gRNA的浓度为50～60ng/μl。

优选的，所述步骤3)中，混合溶液的注射量为不少于1μL。

优选的，所述步骤4)为：

羽化成功的G0代雌性成虫与G0代雄虫杂交，获得了G1代白眼雄虫；将G1代白眼雄虫与野生型雌虫杂交，获得G2代雌虫，将G2代雌虫与G1代白眼雄虫回交，获得G3代白眼雄虫和G3代白眼雌虫，然后将G3代白眼雄虫和G3代白眼雌虫混合培养，即可获得可以稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明考虑了最佳的研究步骤和技术参数，构建了桔小实蝇白眼品系的基因编辑方法，快速、准确地获得稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系，填补了技术空白，为桔小实蝇的生物学研究提供了理想的实验材料及研究思路，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为桔小实蝇白眼品系。左：白眼雄虫，右：白眼雌虫。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一：Cas9质粒的构建及mRNA的合成

实验所用的Cas9质粒已经连接到pTD1体外转录载体中，上游含有T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO:1)，可直接用于后续转化。

1.1 Cas9质粒的转化：将质粒转化到JM109感受态细胞，Amp抗性平板涂布。

1.2 Cas9质粒的纯化：用Mini BEST Plasmid Purification Kit(TAKARA)质粒抽提试剂盒提取质粒，根据试剂盒操作说明书进行。

1.3 Cas9质粒线性化

Cas9质粒用Not I限制性内切酶进行酶切，用FastAp将粘性末端切平。Fermentas酶切体系如下：

将反应液涡旋充分混匀，短暂离心，置于37℃反应16h。

1.4纯化线性化的载体，最后将沉淀下来的载体溶于Nuclease-Free Water。

1.5电泳检测酶切纯化产物

将Cas9质粒酶切后与酶切之前的载体同时进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，电泳电压120v，时间30min。

甲醛变性RNA凝胶电泳，按如下体系配制样品：

电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中，根据条带的大小确认是否完全切开。以Nanodrop 2000超微量分光光度计测定浓度和纯度。

1.6 Cas9mRNA的合成

Cas9 mRNA的合成参照Invitrogen公司mMESSAGEKit试剂盒说明书进行，反应体系如下：

反应结束后用超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，分装-80℃保存备用。

实施例二：gRNA靶点的选择、构建及mRNA合成

2.1 gRNA靶点的选择

(1)登录NCBI网站，搜索并下载桔小实蝇white基因的转录本。

(2)在CRISPR靶标设计网站上输入white基因的转录本序列，按照说明操作，系统会给出可用于white基因编辑的靶标序列。

(3)根据靶点的位置，经序列比对确认选择的靶点位于一个单独的外显子上。

2.2 gRNA引物的设计

(1)正向引物：

①w1-gRNA_F:

②w2-gRNA_F:

(黑色加粗字体为T7启动子序列，下划线为靶点序列)

(2)反向引物(共用引物)：

gRNA_R:

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA(SEQ ID NO:4)

2.3 gRNA模板的制备

(1)gRNA模板的制备，参照TAKARA公司Prime STAR高保真聚合酶试剂盒说明书进行操作，反应体系如下：

反应条件为：

(2)PCR产物回收，参照TAKARA公司的凝胶DNA回收试剂盒Agarose Gel DNAExtraction kit操作说明书进行。

(3)连接反应

将回收的gRNA片段连接至pJET1.2平端克隆载体上，连接反应体系如下：

将离心管短暂涡旋，离心3-5s，22℃孵育5min，快速进入下一步。

(4)转化反应，将质粒转化到JM109感受态细胞，Amp抗性平板涂布。

(5)菌落PCR

挑取白色菌落进行菌落PCR，筛选阳性克隆，反应体系如下：

经1％琼脂糖凝胶电泳检测确定阳性克隆。

(6)质粒提取

将阳性菌落挑入含Amp的LB液体培养基中，37℃摇菌16h，然后用Mini BESTPlasmid Purification Kit(TAKARA)质粒抽提试剂盒提取质粒。

(7)gRNA模板的合成

以步骤(6)中测序正确的质粒作为模板，以菌落PCR引物扩增模板序列，反应体系如下：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，用胶回收试剂盒Agarose GelDNA Extraction kit(TAKARA)回收PCR产物，测定浓度。

2.4 gRNA的合成

(1)装配反应在室温下进行，反应体系如下：

(2)甲醛变性RNA凝胶电泳，按如下体系配制样品：

(3)电泳结束后置于凝胶成像系统检测合成质量。

实施例三：桔小实蝇胚胎显微注射

3.1用微量移液管向注射针内注入2μl混合的RNA溶液(混合溶液中Cas9mRNA的浓度为300～400ng/μl，gRNA的浓度为50～60ng/μl)，将注射针安装到注射仪上并固定，针头轻轻触碰盖玻片锻针，调节注射移油压，让RNA溶液从针头均匀缓慢流出；

3.2将带有卵的载玻片放置在载物台上，调节注射移，使针头浸入Halocarbon oil中，通过调节载物台，使针头从胚胎尾部前三分之一刺入；

3.3注射结束后，用吸水纸将覆盖在卵上的油吸走，将载玻片置于湿润的塑料盒中，27℃培养；

3.4待幼虫孵化后，将幼虫挑至新鲜橙子上饲养，直到成虫羽化。

实施例四：遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系

将实施例三中羽化成功的雌性成虫(G0代)与雄虫杂交(G0代)，获得了白眼雄虫(G1代)。将G1代白眼雄虫(Y/w)与野生型雌虫杂交，获得(G2代)雌虫(w/w⁺)，将其与G1代白眼雄虫(Y/w)回交，获得G3代白眼雄虫(Y/w)和白眼雌虫(w/w)，将其混合培养，即获得了可以稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种构建桔小实蝇白眼品系的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactatagg 19

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggt gctaataaga ggcggcagtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggt cgtgtgaaag gcttatcgtt ttagagctag aaatagcaag 60

<210> 4

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60

gctatttcta gctctaaaa 79

Claims

1.一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以线性化Cas9质粒为模版，进行体外转录，合成Cas9 mRNA；

2)选择white基因靶点，确认选择的靶点位于一个单独的外显子，设计含有white基因靶点的上游引物及与其匹配的下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物与载体连接并转化到感受态细胞，Amp抗性平板涂布，进行菌落PCR确定阳性克隆，培养阳性菌株后提取质粒，以所提取质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，体外转录合成gRNA；其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

3)对桔小实蝇胚胎显微注射gRNA和Cas9 mRNA的混合溶液，然后继续培养，直至成虫羽化；混合溶液中Cas9 mRNA的浓度为300～400ng/μ L ，gRNA的浓度为50～60ng/μ L ；

4)遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系：羽化成功的G0代雌性成虫与G0代雄虫杂交，获得了G1代白眼雄虫；将G1代白眼雄虫与野生型雌虫杂交，获得G2代雌虫，将G2代雌虫与G1代白眼雄虫回交，获得G3代白眼雄虫和G3代白眼雌虫，然后将G3代白眼雄虫和G3代白眼雌虫混合培养，即可获得可以稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系。

2.根据权利要求1所述的一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，其特征在于，步骤2)中，所述载体为pJET1.2。

3.根据权利要求1所述的一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，其特征在于，步骤2)中，所述感受态细胞为JM109感受态细胞。

4.根据权利要求3所述的一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，其特征在于，所述步骤3)中，混合溶液的注射量为不少于1μL。