CN101680037A - 筛选细胞内化核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明包括组合物和方法,用于使一种或多种细胞与一种包含RNA的随机文库接触,用变性剂或一种或多种核酸酶消化处理被接触的细胞,以及从细胞中提取出对核酸酶或变性剂有抗性的一种或多种内化的核酸。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物化学领域。更具体地说,本发明涉及核酸定向,以及筛选和输送包含RNA的分子的方法、组合物以及试剂盒。
背景技术
目前,将试剂输送到细胞内需要对应的输送装置,这些装置通常有毒性、效率低下,或者特异性很差。此外,许多输送进入细胞的试剂有毒,并且要求特异和快速地内化进入适当的细胞,以防止对机体造成不希望有的毒性。
发明内容
人们需要一种起到识别和筛选作用的化合物,这种化合物能够将试剂输送到细胞内,同时对机体的毒性和非特异性作用降低。另外,人们需要一种筛选能够快速将试剂内化进入预定组织、细胞,或细胞群的化合物的方法。
通过分析细胞内化的机制,人们已经发现某些种类的分子可以将分子“货物”输送进入细胞。该发现已经被用于提供筛选、优化,和/或修饰这些分子的方法以利于细胞内化和分子货物输送。根据某些观点,一些方法也可用来鉴别最快内化的分子。
一方面,本发明提供一种筛选核酸酶抗性的包含RNA的分子的方法,在某些实施方式中,这些分子是固定化的。该方法包括使细胞(例如真核或原核细胞)与包含RNA的分子的随机库接触,然后将与随机库接触的细胞用一种或多种核酸酶处理。从细胞中提取出总RNA并且扩增,以筛选包含RNA的分子一这些分子已经进入细胞并且是核酸酶抗性分子。因此,该方法可筛选核酸酶抗性的已经内化进入细胞的包含RNA的分子。在一些特别的实施方式中,这些RNAs起到在其它输送材料,如阳离子脂质体、脂质体,或电穿孔不存在的情况下使化合物内化进入细胞的功能。
另一方面,本发明提供一种筛选可内化的包含RNA的分子的方法。该方法需要使细胞(例如一种真核细胞或原核细胞)与包含RNA的分子的随机库接触。将与随机库接触的细胞用一种或多种核酸酶处理。提取这些细胞的总RNA并且扩增,使得提取出来的包含RNA的分子得到扩增。
在一些实施方式中,重复利用从一轮筛选中鉴别出包含RNA的分子的筛选方法。在其它的实施方式中,一种内化的包含RNA的分子是通过两轮或更多轮的筛选方法筛选出来的。在某些实施方式中,一种内化的包含RNA的分子是通过至少十轮的筛选方法筛选出来的。在某些实施方式中,可内化的包含RNA的分子在每个后一轮的筛选中与细胞接触的时间递减。在一些特别的实施方式中,可内化的包含RNA的分子与细胞接触大约24小时。在更特别的实施方式中,可内化的包含RNA的分子与细胞接触的时间小于10小时。在更进一步的实施方式中,可内化的包含RNA的分子与细胞接触的时间小于5小时。在其它实施方式中,可内化的包含RNA的分子与细胞接触的时间小于2小时,小于1小时,小于30分钟,小于20分钟,小于10分钟,小于5分钟,小于2分钟,小于1分钟,或小于30秒。
在很特别的实施方式中,该方法包括通过多轮的筛选来分离可内化的、包含RNA的分子,其中每个后一轮的筛选使得从前一轮获得的可内化的包含RNA的分子与细胞接触的时间与该前一轮处理的时间相比减少。例如,第一轮的筛选包括使可内化的包含RNA的分子与细胞接触10小时,第二轮使得从第一轮中筛选出来的包含RNA的分子与细胞接触5小时,然后,从第二轮筛选出来的包含RNA的分子与细胞接触2小时等等。这样的程序能够鉴别出那些能够最快地内化进入我们所感兴趣的细胞内的化合物。
在其他的实施方式中,文库中包含从随机序列库中得到的功能性的包含RNA的分子。在某些实施方式中,这些RNAs的每一个至少包含一个随机序列。在别的实施方式中,包含RNA的分子包含至少一个恒定序列。在更特别的实施方式中,RNAs包含两个或更多恒定序列。
在更多实施方式中,随机序列包括至少10个核苷酸。在某些实施方式中,随机序列包括至少20个核苷酸。在某些实施方式中,随机序列包括至少30个核苷酸。在特别的实施方式中,随机序列包括至少40个核苷酸。在更特别的实施方式中,随机序列包括至少50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸,或超过100个核苷酸。
在更多的实施方式中,随机库包括固定化的RNAs。在某些实施方式中,该固定化的RNAs是2’-荧光修饰的RNA库。
在一个实施例中,该方法包括确定内化核酸的步骤。在一些实施例中,该步骤包括直接测序,反转录酶-聚合酶链式反应,与阵列结合,质谱分析以及上述方式的组合。
在特定的实施方式中,核酸酶包括核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶1、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒细胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳动物核糖核酸酶1、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5’-3’核糖核酸外切酶、3’-5’核糖核酸外切酶、脱帽酶、脱腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I,I*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2,0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(OligoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St以及上述酶的联合,或者市场上可买到的核酸酶组合。在别的实施方式中,该核酸酶是脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶IIa或脱氧核糖核酸酶IIβ。
在某些实施方式中,筛选特定的核酸用于内化进入表达CD4受体的细胞(例如HeLa细胞)。在另外一些实施方式中,所筛选的包含RNA的分子连接有siRNAs、毒素、miRNAs、小分子及其他分子,用于转送进入表达CD4的细胞,如Hela细胞中。
在某些方面,一些筛选能够内化进入细胞的RNA的方案没有借助于已经开发出的传统的转染或输送装置(例如,阳离子脂质体、电穿孔、转染试剂等等)。该方案可适于产生内化进入特定细胞、不同状态的细胞、或普通的细胞。包含RNA的分子可以筛选携带有不同的应用于治疗、诊断、或检测的分子货物。这包括多种将小分子转送进入细胞或标记细胞的技术,包括但不限于:基因表达调节,如siRNA剔除研究;致死药物转送;FACS分析;肿瘤检测等等。
另外一个方面,本发明还提供了用于筛选可内化的包含RNA的分子组合物以及方法,它是使一种或多种细胞与包含恒定序列区域的随机核酸文库接触;洗涤该细胞;使该细胞暴露于一种或多种核酸酶中;从该细胞中提取总核糖核酸;以及扩增内化的核糖核酸,例如,通过逆转录、聚合酶链式反应以及转录所提取的核酸,其中每个后一轮的筛选包括使细胞与扩增的核酸池接触的时间递减。包含RNA的分子可以包含RNA、DNA、修饰的RNA,或者嵌合的核酸。该分子还可以至少具有部分的核酸酶抗性。
在一个实施例中,包括了一个确定内化核酸序列的步骤。该步骤可以包含直接测序、反转录酶-聚合酶链式反应、与阵列结合、质谱分析以及上述的组合。
在某些实施方式中,用于该方法的核酸酶是RNases或称核糖核酸酶。在一些实施例中,核酸酶包括核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶1、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒细胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳动物核糖核酸酶1、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5’-3’核糖核酸外切酶、3’-5’核糖核酸外切酶、脱帽酶、脱腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I,I*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2,0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(OligoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St以及上述酶的联合,或者市场上可买到的核酸酶组合以及它们的组合或者市场上可买到的核酸酶混合物。在别的实施方式中,核酸酶是脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶IIa或脱氧核糖核酸酶IIβ。
在别的实施方式中,细胞可能经过处理,以防止在细胞与文库接触期间的有活性的内吞作用(active endocytosis)。为了便于利用,在某些实施方式中,核酸进行可检测的标记。在特定的实施方式中,标记是染料标记、荧光标记、放射性标记、或化学发光标记。可检测的标记的例子包括一种或多种发色团、一段扩增的核酸序列、一种酶、一种肽、一种金属、一种磁珠、一种聚合珠、一种树枝状化合物(dendrimer)、一种脂质体、一种量子点、一种荧光共振能量传递分子或别的核酸。在一些实施例中,细胞在与包含RNA的分子文库接触前被固定。
在其它的实施方式中,包含RNA的分子包括第二种分子或者与第二种分子相连接,例如,siRNAs、miRNAs、小分子、毒素、或其它起转运进入细胞作用的分子。在其它的实施方式中,包含RNA的分子通过杂交、共价结合、生物素化、与抗生物素蛋白链菌素缀合、非特异性结合、螯合作用、定向于特定氨基酸序列,以及上述方式的组合而缀合到一种作为内化靶标的分子上。
在其它的实施方式中,该包含RNA的分子进行可检测的标记。在特定的实施方式中,包含RNA的分子可操作地连接于可检测的标记,例如化学发光标记、放射性同位素标记、或荧光标记上。在某些实施方式中,包含RNA的分子经由体内FISH、FACS、微阵列,或显微术而鉴别出来。在其它的实施方式中,筛选那些不进入细胞而保持在细胞外溶液中的核酸。在一个实施例中,筛选进入细胞然后再从细胞中重新出来的核酸,例如,通过循环胞吞途径(cycling endocytotic pathway)。
另一方面,该方法也包括接触一种或多种宿主有机体内细胞的步骤,在其中宿主核酸酶破坏没有被靶细胞、器官、或代谢区(compartment)吸收的核酸,并且剩余的核酸被分离出来。用于内化核酸筛选的细胞的筛选是基于细胞或分子表型,包括细胞形态、荧光蛋白表达、表面标志表达、或凋亡等特性。
另一个方面,本发明提供一种筛选稳定的、可内化的包含RNA的分子的方法,其包括使一种或多种细胞与包含RNA的分子的随机文库接触,该随机文库中的包含RNA的分子包括稳定的核酸以及恒定序列区域。细胞经洗涤,然后与一种或多种核酸酶接触。然后提取出细胞中的总核糖核酸,再将内化的包含RNA的分子进行扩增。重复这些筛选步骤,每个后一轮的筛选包括反复地使细胞与扩增的核糖核酸分子池接触的时间递减。在一些实施例中,包含RNA的分子通过RT-PCR进行扩增。
在一些实施例中,包含RNA的分子包括RNA、DNA、修饰的RNA、或嵌合的核酸。在某些实施方式中,包含RNA的分子至少具有部分的核酸酶抗性。在特定的实施方式中,稳定的包含RNA的分子包括2’-荧光修饰的核酸。在一些实施例中,包含RNA的分子与siRNAs、miRNAs、小分子、毒素,或适体连接。在特定的实施方式中,包含RNA的分子中的核酸具有可检测的标记,例如带有荧光标记、放射性标记或化学发光标记。
在一些实施例中,随机序列文库中包含RNA的分子的序列包括至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸,或超过100个核苷酸。在某些实施方式中,包含RNA的分子包括两个或更多恒定序列。
在一些实施例中,一种或多种核酸酶是RNases或核糖核酸酶。在某些实施方式中,一种或多种核酸酶是微球菌核酸酶、5’-3’核糖核酸外切酶、3’-5’核糖核酸外切酶、脱帽酶、脱腺苷酶,或以上酶的组合。在其它的实施方式中,一种或多种核酸酶是脱氧核糖核酸酶,如脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶IIa或脱氧核糖核酸酶IIβ,或以上酶的组合。在特别的实施方式中,一种或多种核酸酶经混合成为核酸酶混合物。
在某些实施方式中,包含RNA的分子经由体内FISH、FACS、微阵列,或荧光显微术而鉴别出来。在一些实施例中,该方法进一步包括处理细胞以防止有活性的内吞作用的步骤。另外,该方法的一些实施方式中,内化核酸的序列可以决定。在某些实施方式中,测序是通过直接测序、反转录酶-聚合酶链式反应、微阵列、质谱分析,或以上方法的组合而完成。此外,在一些实施例中,该方法进一步包括在与核酸文库接触前固定细胞的步骤。
另一方面,本发明提供一种用于筛选可内化的包含RNA的分子的试剂盒。该试剂盒包括一种随机的核酸分子库;数量上足以降解所有非内化核酸的一种或多种核酸酶;一种逆转录酶、一种DNA聚合酶、或一种RNA转录酶;一种或多种缓冲液,以及根据本发明权利要求的方法的说明书。在某些实施例中,核酸酶是核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶1、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒细胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳动物核糖核酸酶1、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5’-3’核糖核酸外切酶、3’-5’核糖核酸外切酶、脱帽酶、脱腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I,I*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2,0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(OligoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St。
附图说明
为更完整地理解本发明的特色及优点,下面对发明详述及附图的含义作出说明,其中:
图1显示一种实施方式中内化核酸的筛选方案。
图2显示富集内化RNAs的筛选方法。
图3显示掺入PSMA的轮次中输送lamin A/C siRNA缀合物进入细胞的能力的改进。
图4显示掺入的PSMA适体克隆有效地输送lamin A/C siRNA缀合物进入到细胞内。
图5显示在HeLa-CD4细胞上进行的N30分子池内化筛选进程。
具体实施方式
本专利以及本专利所引用的科学文献的知识基础是本领域技术人员所能够达到的。本申请所引用的已颁布的美国专利、已允许的申请、已公开的外国申请,以及参考文献,包括GenBank数据库序列籍参考合并入本申请,其程度就如特别地、逐一地指出,籍参考而合并入本申请。在下面详细论述本发明各种实施方式的完成以及利用时,应当理解在多种特定的情形下,有许多适当的构思可以概括在里面。本申请中所论述的特定的实施方式只是用于说明完成和利用本发明的特定方式,而不用于限制本发明的范围。
本发明包括组合物、方法以及试剂盒,其可用于快速筛选容易内化进入特定类型细胞内的分离的核酸(DNA、RNA、以及它们的修饰形式)而不考虑其序列。一旦筛选和分离出核酸,包含RNA的分子的序列就可以被确定。包含RNA的分子可用于增强特异性治疗分子或使特定的化合物附着于癌细胞中(用于杀死癌细胞)的药物输送装置,或者增强治疗传染或其它疾病相关的病原体损害细胞疗法。本申请描述的方法对于增强产物的功效或降低其毒性有很高的价值。
本申请包括组合物以及方法,用于筛选能够内化进入细胞的包含RNA的分子而不借助于传统的转染或输送装置。这些方法适合于生产能够内化进入特定细胞、不同状态细胞(例如分化的细胞)或者一般细胞内的包含RNA的分子。本发明的优点在于筛选出的包含RNA的分子能够特异性地定向,并且,在一些实施例中,它还没有相关的毒性。在一些实施例中,可内化的包含RNA的分子可用于定向地使“载荷”或“货物”输送到特定的细胞或组织而不需要对细胞或包含RNA的分子进行较高程度的表征。可内化的包含RNA的分子还可以用于标记细胞的内部状态,而不需要损害细胞或组织的结构完整性。
术语“基因”用于代表一种编码功能蛋白、多肽或肽的编码单位。如本申请中所使用的,“基因”是一个功能性术语,包括基因组序列、cDNA序列或片段,或者以上的组合,同样,基因产物包括那些可能已经人工改变的产物。纯化的基因、核酸、蛋白质等等用于指代那些经鉴别、并且与至少一种通常与其结合的污染核酸或蛋白质分离的物质。本申请中的术语“序列”用于指代核苷酸或氨基酸,无论其是天然的还是人工的,例如,修饰的核酸或氨基酸。“转录的核酸”指的是从相应的核酸序列模板产生的核糖核酸。术语“基因”包括基因的cDNA形式和基因组形式。一种基因可以产生多个RNA种类,其由原始RNA转录产物的不同剪切形成。
本申请所使用的术语“扩增”意思是扩大一种样品中目标分子的数或量。目标分子包括但不限于:miRNA、siRNA,以及双链RNA。示范性的扩增方法包括PCR、RT-PCR、体外转录、以及标准克隆技术。
本发明中使用的术语“扩大”,当涉及核酸时,指利用本领域公知的任何方法生产一种核酸序列的大量拷贝。术语“扩大反应”通常指涉及核酸生物分子,例如RNA和DNA的反应。“核酸扩增”通常指增加核酸,特别是一种筛选的核酸和/或一种筛选的核酸规定的片段浓度的任何步骤。“扩增或扩增产物”或“扩增子”通常指的是实行一种核酸扩增反应而得到的产物。
本发明中的术语“互补的”或“互补性”指的是多核苷酸在允许的盐度和温度条件通过碱基对与其它的核酸发生自然的结合。例如,序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两条单链分子之间存在互补性时,互补性有可能是局部的,其中只有一些核酸结合,也可能是完全互补的。核酸链之间互补性的程度对于核酸链之间杂交的效率和强度有明显的影响。这在扩增反应中具有特别的重要性,因为扩增反应依赖于核酸链之间的结合。
本发明中使用的术语“可内化的”指的是一种核酸,例如一种包含RNA的分子,或一种修饰的核酸,其与细胞结合,并且能够进入或者内化进入细胞,而不需要借助于外部的试剂或条件(例如,磷酸钙-DNA共沉淀、DEAF-右旋糖酐-介导的转染、聚凝胺-介导的转染、电穿孔、微量注射、脂质体熔合、原生质体融合、逆转录病毒传染、和基因枪)。在有些情况下,可内化的包含RNA的分子在检测到它的内化之前已经内化进入细胞。另外,在已经筛选出最初的可内化的核酸后,可内化的核酸可与试剂或其它条件结合,以增强内化率。
本发明中使用的术语“包含RNA的分子”指的是一种包含至少一部分RNA或修饰的RNA的分子。包含RNA的分子可以由多个部分连接组成。包含RNA的分子可与一种分子货物,例如一种核酸、一种多肽、一种蛋白质、一种小分子、一种脂肪酸、和/或一种抗体连接。在某些实施方式中,包含RNA的分子是具有最少一个RNA部分的单个分子。在一些实施例中,包含RNA的分子也包含一个RNA分子货物,例如siRNA或微小RNA。
在某些实施方式中,包含RNA的分子与分子货物通过接头连接,连接方式取决于分子货物的类型。例如,在RNA和分子货物之间的接头可以包括二硫基接头,使得在进入细胞内的还原性环境时,分子货物能够被切除。其它有用的接头有磷酸二酯接头、硫代磷酸接头、磷酸烷基酯、亚磷酰胺、氨基甲酸盐、碳酸盐、磷酸酯、乙酰胺、和羧甲基醚(例如,可参见,Agrawal等人,(1987)Tetrahedron Lett.28:3539-3542;Agrawal等人,(1988)PNAS(USA)85:7079-7083;Uhlmann等人,(1990)Chem.Rev.90:534-583;Agrawal等人,(1992)Trends Biotechnol.10:152-158)。
包含RNA的化合物还可以与分子货物通过HA肽或类似的化合物连接,或者通过能容许分子货物从吞饮泡内逃逸的基因融合肽连接;或者与在暴露于一种特定光的波长时能够使得分子货物从包含核糖核酸的化合物上断裂下来的光解元件连接。
本发明中使用的术语“引物”指的是一种寡核苷酸,无论其是否是天然的,如限制性水解液中纯化出来的,或者是通过合成制备出来的,它在能够引发与一种核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(即,在核苷酸和引发试剂如DNA聚合酶和适宜的温度以及pH存在的情况下)能够作为合成的起始点。为了最大程度地提高扩增效率,引物可以是单链的,但是也可以是双链的。如果是双链的,引物在用于制备延伸产物之前首先要经过处理,以分开它的双链。引物必须有足够的长度,以便在引发试剂存在时启动延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于许多因素,包括温度、引物来源以及方法的应用。
本发明中使用的术语“蛋白”、“多肽”或者“肽”指的是由氨基酸组成的化合物,其通过肽键连接,并且这些术语可以交互使用。
本申请中使用的“随机分子库”指的是寡核苷酸的集合,例如包含RNA的分子,其包括不同的序列。分子库中的每个成员可以至少部分是随机的,但也可以具有一个或多个共同的和/或已知的序列或序列区域。例如,分子库可以完全随机、部分随机、在核酸的某一部分随机、长度和/或单链或双链随机。随机的核酸分子库可以通过合成、组合而制得,或来自天然源。
本申请中使用的术语“可检测的标记”指的是一些化合物和/或元件,由于他们的特定的功能性和/或化学特性能够被检测,利用它们可以检测它们所连接的试剂,和/或如果需要的话进一步地定量,例如酶、抗体、接头、放射性同位素、电子密度粒子、磁性颗粒和/或发色团或以上的组合,例如,荧光共振能量传递(FRET)。有许多种可检测的标记,包括荧光标记,其容易操作、便宜而且无毒。
本发明中使用的术语“接触”指的是一个寡核苷酸分子库暴露于一种或多种靶体,如细胞或组织,持续一段时间,导致一些或全部的核酸内化,而不需要辅助的试剂或条件。
本发明中的术语“靶细胞”指的是任何细胞(例如真核细胞或原核细胞),分子池的核酸与其接触而内化进入细胞中。本发明中使用的内化性由核酸的功能定义,就是该核酸是可内化的和/或被内化的,而不需要一种定位载体、或任何辅助的试剂或条件来促进核酸进入靶细胞。
本发明提供组合物、方法和试剂盒,用于分离和表征特异性定向和快速内化的包含RNA的分子。本发明公开的组合物和方法可以快速分离能够内化进入细胞内的核酸,而无需借助于传统的转染或输送装置(例如,阳离子脂质体、电穿孔、转染试剂,等等)。该方法可适于产生内化进入特定细胞、不同状态的细胞、或普通的细胞。RNAs可以筛选携带有不同的应用于治疗、诊断、或检测的分子货物。这包括多种将小分子转送进入细胞或标记细胞的技术,包括但不限于:基因表达调节,如siRNA剔除研究;致死药物转送;FACS分析;肿瘤检测等等。
在特定的实施方式中,与随机文库接触的细胞包括从组织中分离的细胞或在活体外繁殖的细胞(例如细胞系)。在更特别的实施方式中,细胞可以是癌细胞,包括但不限于:淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、肉瘤细胞、白血病细胞、成视网膜细胞瘤细胞、肝癌细胞、骨髓瘤细胞、神经胶质瘤细胞、间皮瘤细胞、以及癌细胞。
在其它的实施方式中,细胞可以是细胞系。示范性的细胞系包括但不限于:HeLa,MCF7,MDA,SKOV3,OVCAR3,2008,PC3,T84,HCT-116,H69,H460,HeLa,以及MOLT4。细胞系也可以通过公知的技术产生(例如,参见Griffin等人,(1984)Nature309(5963):78-82)。
此外,与随机文库接触的细胞还包括原核细胞(即细菌细胞)。本发明描述的方法可用于鉴别包含RNA的分子,其能够输送和内化分子货物(即,试剂,例如小分子、抗体、蛋白质、肽、脂肪酸、治疗剂、抗生素或化学毒剂)进入细菌细胞。本发明描述的方法还可以用于鉴别能够输送和内化分子货物进入真菌细胞的包含RNA的分子。
在某些方面,本发明提供一种筛选可内化的包含RNA的分子的方法。这种包含RNA的分子能够内化进入细胞并且携带分子货物(例如药物、细胞毒素试剂、凋亡试剂)进入指定的细胞。该方法包括使细胞与一种包含RNA的分子的随机文库接触,随机文库中的包含RNA的分子可以是经修饰的以增加稳定性。
被接触的细胞可以用一种变性剂洗涤以除去粘附在细胞表面的过量的包含RNA的分子。可用的洗涤剂包括变性剂,例如阴离子洗涤剂,如十二烷基硫酸钠(SDS),非离子洗涤剂例如Tween-以及阳离子洗涤剂例如十六烷基三甲基溴化铵,以上这些都可在市场上买到(Sigma公司,St.Louis,MO)。
我们发现核酸酶可用于除去没有内化的包含RNA的分子。这个结果是使人惊奇的,因为包含RNA的分子通常对于降解是稳定的,由于下面更详细描述的修饰以及二级结构。由于这个发现,该方法的某些实施方式需要使与细胞接触的随机文库暴露于核酸酶或核酸酶的混合物,以除去保持在细胞表面而没有内化进入细胞的包含RNA的分子。示范性的核酸酶包括、但不限于:核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶1、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒细胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳动物核糖核酸酶1、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5’-3’核糖核酸外切酶、3’-5’核糖核酸外切酶、脱帽酶、脱腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I,I*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2,0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(OligoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St以及它们的组合。在其它的实施方式中,核酸酶是脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶IIa或脱氧核糖核酸酶IIβ。另外,核糖核酸酶混合物可以在市场上购自Ambion公司(Austin,TX)、新英格兰BioLabs公司(Ipswich,MA)和Epicenter Technologies公司(Madison,WI)。
在特定的实施方式中,该方法重复多次以从最初的包含RNA的分子的分子池中获得能够最快内化的包含RNA的分子。在这些实施方式中,将核酸分子池添加到细胞中,并且在筛选步骤的过程中同细胞保温的时间持续减少(即,将反复执行如上所述的方法)。当过程完成后,将细胞洗涤几次和/或用核酸酶进行处理。
在某些实施方式中,细胞与包含RNA的分子保温的时间递减。在细胞与包含RNA的分子接触后,可以洗涤1小时至24小时或者更长的时间,以除去没有内化的包含RNA的分子。细胞与包含RNA的分子接触后,每个后一次洗涤的时间可以递减。细胞与包含RNA的分子接触保温的时间可以持续任意长的时间。持续时间包括但不限于:1分钟到10分钟、11分钟到20分钟、21分钟到30分钟、31分钟到40分钟、41分钟到50分钟、51分钟到1小时、1小时到2小时、2小时到3小时、3小时到4小时、4小时到5小时、5小时到6小时、6小时到7小时、7小时到8小时、8小时到9小时、9小时到10小时、10小时或更久、15小时或更久、20小时或更久、或24小时或更久。
在一个示范性的实施方式中,包含RNA的分子是通过细胞与包含RNA的分子接触保温24小时后第一次洗涤而筛选出来的。洗涤被接触的细胞,分离包含RNA的分子,并与细胞接触1小时。洗涤细胞并分离包含RNA的分子。分离的RNA与细胞接触30分钟,然后进行洗涤。然后再次分离出内化的包含RNA的分子,然后使该过程继续,并且洗涤前的保温时间持续减少。
在某些实施方式中,从细胞中提取出总RNA,已内化的任何序列都可以通过RT-PCR和/或转录得以回收。这些包含RNA的分子代表了能够最快内化进入细胞中的分子集合体。
包含RNA的分子可以通过本领域公知的任何方法制得。例如,它们可以利用ExpediteTM核酸合成仪(应用生物系统公司,Foster市、CA)或其它类似装置(例如,参见应用生物系统公司,Foster市、CA)进行合成生产。合成的寡核苷酸也可以通过本领域公知的技术进行生产,例如亚磷酰胺法(例如,参见Pan等人,(2004)Biol.Proc.Online.6:257-262)、氢膦酸酯法(例如,参见Agrawal等人,(1987)Tetrahedron Lett.28(31):3539-3542)和phosphite trimester法(Nucleic Acids Res.(1984),12:4539;(1983)Tetrahedron Lett.24:5843)。
包含RNA的分子可与接头连接,例如3’氨基接头或5’氨基接头,而不改变包含RNA的分子的功能。另外,在核酸合成期间,包含RNA的分子的3’端也可以连接附加的核苷酸作为接头(例如,参见Steinberg等人,(2004)Biopolymers 73(5):597-605)。
另外,包含RNA的分子可以进行多种方式的修饰,而不损害其内化进入细胞的能力。核酸结构的修饰可以包括合成性接头,例如磷酸烷基酯、亚磷酰胺、氨基甲酸盐、硫代磷酸、二硫代磷酸酯、碳酸盐、磷酸酯、乙酰胺以及羧甲基醚(例如,参见Agrawal等人,(1987)Tetrahedron Lett.28:3539-3542;Agrawal等人,(1988)PNAS(USA)85:7079-7083;Uhlmann等人,(1990)Chem.Rev.90:534-583;Agrawal等人,(1992)TrendsBiotechnol.10:152-158)。另外,核酸的修饰包括磷酸核苷内接头,例如胆固醇基接头或二胺化合物,在氨基和末端核糖之间碳残基数可变。包含RNA的分子的其它的修饰包括转变为糖部分,如阿拉伯糖或3’、5’取代的核酸,其在3’和5’端通过一种除羟基之外的化学基团连接有一种糖。因此,那些不会损害包含RNA的分子的内化或转运分子货物的修饰在本发明的范围之内。
包含RNA的分子可以利用标准的固相DNA化学进行合成,该技术在本领域是公知的。下面的描述表示一种生产RNA分子池的示范性的方法。将A、C、G和U的亚磷酰胺以3∶3∶2∶2.4的摩尔比混合,这样使得每种碱基的偶联效率近似相等以产生随机化的位点,并且最终一个随机位点具有25%的机率是A、C、G或U。至于掺入型分子池,亚磷酰胺的混合物中可以进一步用于产生掺入A、掺入C、掺入G和掺入U的附加的分子池,使得任何掺入核苷酸的偶联效率是70%,而其余3种核苷酸的效率为10%。例如,一种掺入A的容器将得到70%的A,10%的C,10%的G以及10%的U。接着进行脱保护和纯化步骤,通过PCR或引物延伸使单链的DNA分子池转变成为dsDNA。在该过程中,一种T7启动子被添加到分子池的5’末端,使得到的双链DNA成为T7RNA聚合酶的底物。然后通过失控转录产生RNA或修饰的RNA分子池。同类的分子池还可以通过商业来源购买得到,如Invitrogen公司(Carlsbad,CA)或Integrated DNA Technologies公司(Coralville,IA)。
在某些实施方式中,包含RNA的分子包含随机区域。随机区域可以具有合成法或纯化法能够实际上允许的任何长度。在特定的实施例中,随机区的大小可以从10个随机位点(N30)到超过100个随机位点(N100)。包含RNA的分子还包含恒定区,使得PCR引物能够结合以进行转录。因此,随机长度与恒定长度的比值将依赖于随机区域的长度而变化。也就是说,N30分子池中固定位点与随机区域几乎有相同的数量,而N100分子池相对于恒定区将会有更多的随机位点。在少数几种情况下,经筛选后发现恒定区参与最终筛选得到的种类的功能。
包含RNA的分子的分子池还可以合成为具有不同程度的随机性。“掺入性的”分子池是通过对已经存在的序列的部分位点随机化而得到的。例如,筛选一种结合HIV逆转录酶(RT)的序列要求得到RT的天然底物,对该序列进行部分地随机化,并筛选那些与RT的结合优于它的天然底物的序列。
在其它的实施方式中,包含RNA的分子经过修饰以增强其稳定性。例如,包含RNA的分子可以在所有的嘧啶残基上进行2’-氟代修饰以增强其对于碱降解以及天然产生的核酸酶的稳定性。其它的碱基修饰在本领域中是公知的。
对于本发明描述的方法,可在该过程的几个不同的点引入变化。包含RNA的分子可以有不同的修饰,例如2’-氟代修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-O-甲基-修饰的RNAs、具有肽骨架的核酸,或者上述的联合。另外,可以使用不同的核酸酶溶液,并且核酸酶的保温时间可以不同。
在一个特别的方面,包含RNA的分子可进行可检测的标记。本发明中使用的“可检测的标记”指的是一种包含RNA的分子可操作地连接有一个能够被检测的部分。“可检测地连接”指的是该部分是通过一种共价或非共价键(例如,离子键)与探针连接。产生共价键的方法是已知的(参见下列通用实验方案,例如Wong,S.S.,Chemistry ofProtein Conjugation和Cross-Linking,CRC Press 1991;Burkhart等人,The Chemistry和Application of Amino Crosslinking Agents or Aminoplasts,John Wiley&Sons Inc.,New York City,NY,1999)。
根据本发明,一种“可检测的标记”是一种可被检测到的部分。这种标记可以是,但不限于:荧光基团(例如荧光素(FITC)、藻红蛋白、罗丹明)、化学染料、或者具有放射性、化学发光性、磁性、顺磁性、亲磁性的化合物,或者一种酶,其产物可以是有颜色的、化学发光的,或者是磁性的。信号可利用任何合适的方法进行检测,包括光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电学法、光学法或者化学方法。在某些情况下,信号可利用两种或更多种方法进行检测。在某些实施方式中,核酸标记包括荧光染料、放射性同位素,以及化学发光标记,其并非用于限制本发明的范围。(例如,参见Yu等人,(1994)Nucleic Acids Res.22(16):3226-3232;Zhu等人,(1994)NucleicAcids Res.22(16):3418-3422)。
例如,包含RNA的分子中的核苷酸可以缀合到Cy5/Cy3荧光染料上。这些染料在本领域中经常使用(例如,参见Yang等人,(2005)Clin Cancer Res.11(2 Pt 1):612-20)。荧光标记可以选自各种结构种类,包括非限制性的例子,如1-和2-氨基萘、p,p’二氨基芪、嵌二萘、季菲啶盐、9-氨基吖啶、p,p’-二氨基二苯甲酮亚胺、蒽、噁碳菁(oxacarbocyanine)、部花青(marocyanine)、3-氨基、氨基马萘雌酮、二萘嵌苯、双苯并恶唑、二-p-恶唑基苯、1,2-苯并吩嗪、视黄醇、二-3-氨基吡啶盐、嚏根草甙元、四环素、立体苯酚(sterophenol)、苯并咪唑基苯胺、2-氧-3-色烯、吲哚、呫吨、7-羟基香豆素、吩恶嗪、水杨酸盐、乌本甙元、卟啉、三芳基甲烷、黄素、呫吨染料(例如荧光素和罗丹明染色剂);花青染料;4,4-二氟-4-硼-3a,4a-氮杂-s-引达省染料以及荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白、藻胆蛋白)。
其它有用的染料是化学发光染料,包括但不限于生物素缀合的RNA核苷酸。对RNAs的标记可以利用本领域公知的任何方法实现,例如,CyScribeTM第一链cDNA标记试剂盒(#RPN6200,Amersham Biosciences公司,Piscataway,NJ)。
通过将分子货物添加到包含RNA的分子上可以使包含RNA的分子与分子货物共同内化。例如,siRNA及其他核酸序列可以直接合成在选定的RNA上,与选定的RNA杂交,或者利用本领域公知的方法通过化学方式连接。示范性的分子货物包括、但不限于:siRNA和微小RNA。
在本发明的特别方面,能够成功使分子货物内化到细胞里面的包含RNA的分子被鉴定出来。在某些实施方式中,包含RNA的分子是通过功能分析而鉴定出来的。例如,一种能够输送抑制某一特定通路的siRNA的包含RNA的分子可通过观测受该通路影响的表型而鉴定出来。或者,siRNA目标的表达水平可以在蛋白质或RNA水平进行分析。因此,这些方法可用于传递分子货物到细胞内的特定通路。
当“一个”或“一种”与权利要求和/或说明书中的术语“包括”连接时,可以指“一个”,但也同样具有“一个或更多”、“至少一个”,以及“一个或比一个更多”的意思。权利要求中的术语“或”意思是“和/或”,除非明确指出意思是任取其一的,或者任取其一的各项是互斥的,即使范围只支持任取其一以及“和/或”。在整个申请中,术语“大约”指代一个包括固有误差变化的值,例如±10%。
在说明书和权利要求中,“由……组成”(以及该词的任何形式),“具有”(以及该词的任何形式)、“包括”(以及该词的任何形式)或“包含”(以及该词的任何形式)是封闭式的,或者是开放式的,不排除附加的、没有提及的要素或方法步骤。
本申请中的术语“或它们的联合”指的是该术语前面所列的项目所有的排列与组合。例如,“A,B,C或它们的组合”至少包括:A,B,C,AB,AC,BC,或ABC,如果在特定的场合中顺序也是重要的话,还包括BA,CA,CB,CBA,BCA,ACB,BAC,或者CAB。继续这个例子,明确包括的还有包含一个或更多项目或术语的重复的组合,例如BB,AAA,MB,BBC,AAABCCCC,CBBAAA,CABABB等等。本领域技术人员可以理解任何组合中的项目或术语的数目没有限制,除非上下文明显不同。
实施例
本发明通过下列实施例进一步说明,其不应被视为限制发明范围。
实施例1
序列和引物
被用来筛选的N30分子池具有下列序列:
5’GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT 3’(SEQ ID NO.:1);
其中N是四种碱基中的任何一种。分子池按照如下所述的方法合成和纯化。N30分子池的扩增引物如下:
(正向引物)41.30:
5’GATAATACGACTCACTATAGGGAATGGATCCACATCTACGA 3’(SEQ ID NO.:2);
(反向引物)24.30:5’AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA 3’(SEQ ID NO.:3);
用于这些试验的抗PSMA适体A9的模板具有下列序列:
5’GGGAGGACGAUGCGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUCCCAGACGACUCGCCCGA 3’,(SEQ ID NO.:4);
其中带下划线的序列代表用于扩增适体的恒定区。A9的扩增引物如下:
(正向引物)5’TTCTAATACGACTCACTAT AGGGAGGACGATGCGG 3’(SEQID NO.:5);
(反向引物)5’TCGGGCGAGTCGTCTG 3’(SEQ ID NO.:6);
所有的引物和A9模板购自IDT公司(Coralville,IA)。
分子池的合成和纯化
用于筛选的分子池包括30个随机残基,侧面与恒定区相连。在ABI快速8909合成仪(Foster City,CA)上合成分子池。将A、C、G和T的亚磷酰胺以3∶3∶2∶2.4的摩尔比混合,这样使得每种碱基的偶联效率近似相等以产生随机化的位点,并且最终一个随机位点具有25%的机率是A、C、G或T。
合成的固相树脂悬浮在1mL 30%NH4OH中,在55℃过夜,对DNA脱保护。反应过程是离心使树脂沉淀,包含DNA的NH4OH层用10mL正丁醇在4℃下以13,000rpm沉淀45分钟。用70%乙醇洗涤沉淀,然后干燥。如果长序列中经常含有中断合成产物,可将DNA在10%丙烯酰胺/7M尿素凝胶上进行凝胶纯化。从凝胶上切下对应于全长产物的条带,切成碎片并且用dH2O洗脱过夜。洗脱的DNA用100%乙醇与作为沉淀载体的糖原进行沉淀,用70%乙醇洗涤,然后干燥。
接着进行脱保护和纯化,利用引物41.30和24.30进行延伸和大规模PCR,使单链的DNA分子池转变为dsDNA。引物41.30也用于向分子池添加一种T7启动子序列,以利于后面的转录步骤。大约2.8nmol单链的分子池DNA与115nmol 24.30引物和0.2mM各种核苷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP,GE Healthcare公司,Piscataway,NJ)在总体积43mL中进行混合。样品在65℃变性5分钟,然后冷却到4℃。向变性的分子池中加入总体积为43.3毫升的标准混合液,其中含有50mM KCl,100mL Tris-Cl(pH=8.3)、1.5mMMgCl2、1,440U Taq聚合酶(NEB公司,Ipswich,MA),然后以72°保温1小时。在延伸反应的最后,在总体积28.7mL中加入115nmol 41.30,反应在94℃30秒、50℃30秒以及72℃1分钟循环8到9次,然后在72℃保温2分钟。PCR产物在2.5X体积的100%乙醇于4℃沉淀45分钟,然后用70%乙醇洗涤并干燥。
执行大规模转录程序以得到起始轮次0的分子池,在该程序中,将75μg分子池PCR产物加入1.5mL转录混合液中,混合液中含有40mM Tris(pH=8.0)、26mM MgCl2、5mM DTT、5mM ATP、5mM GTP、5mM 2’-氟代-CTP、2’-氟代-UTP、0.01U焦磷酸酶以及75U的Y639F T7聚合酶。据估计,N30分子池有大约1015序列的复杂度。因此,这些投入量表现了大约1.5倍基因组值的序列。这种规模足以说明各种可能的合成序列,因此表现出了最大的多样性。
转录反应可以在37℃下运行过夜。保温后,向反应液中加入75U的DNAse I(Epicentre公司,Madison,WI),然后使反应液再保温30分钟。在反应液进行凝胶纯化前向反应液中加入相当于2X体积的变性染料(7M尿素、90mM三羟甲基氨基甲烷、90mM硼酸、0.5mMEDTA以及0.1%溴酚蓝),使反应液在70℃变性3分钟,如上所述。
细胞系和培养
HeLa-CD4细胞得自美国国立卫生研究院AIDS试剂计划(Germantown,MD)。LnCap细胞通过ATCC(Manassas,VA)购买。这两种细胞系都利用补充有10%胎牛血清(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)的RPMI-1640(ATCC公司,Manassas,VA)在37℃和含有5%CO2空气的条件下培养。进行胰酶消化时,将细胞用1倍培养体积的DPBS洗涤,然后向细胞添加1/10体积的0.05%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)。细胞在37℃下保温2分钟直到细胞离壁。加入培养基使胰蛋白酶失活。所有的细胞洗涤步骤都使用室温的PBS。所有的细胞离心作用步骤都是在4℃,并且以1500rpm离心5分钟。
核酸酶试验
为了保证修饰的RNAs和细胞能够在消化和筛选方案后继续存在,将dsDNA分子池按如上所述的方法以按比例缩小的反应进行转录。将α-32P-标记-GTP(Perkin Elmer公司,Shelton,CT)引入到反应中以产生主体标记的放射性转录产物。
在本试验中,每管中加入大约4×106HeLa-CD4细胞,4℃以1500rpm慢速旋转5分钟。用500μL PBS洗涤一次后,每个管中的细胞重悬浮在85μL的RNA中,并在室温下保温15分钟。向细胞中加入不同量的Riboshredder或核糖核酸酶T1另外保温30分钟。将细胞沉淀,回收的RNA在含有1XTBE和7M尿素的8%丙烯酰胺凝胶上跑胶。凝胶在滤纸(Whatman公司,Florham Park,NJ)上晾干,并在磷屏下曝光过夜进行扫描。
为了确定细胞没有受到洗涤、保温、或核酸酶处理步骤的不利影响,重复进行核酸酶消化试验,然后对细胞进行计数,再将其等份加入单独的管。在不同的间隔时间,将每个管中的细胞进行混合然后重新计数。没有发现显著的细胞健康后果。
内化试验
内化试验中利用一种细胞表面适体,即抗-PSMA适体A9(Lupold等人,(2002)Cancer Res.62(14):4029-33)。A9是利用一种如上面“分子池合成和纯化”所述的分子池的缩小型从一种寡聚模板转录而成。
在本试验三天前,将1×105LnCap细胞接种在24孔板中。当细胞着壁后,洗涤细胞并添加新鲜的培养基。在37℃和5%CO2环境下平衡一小时后,将细胞进行四种条件之一的处理:在“RNA”样品中,将50nM的A9直接添加到细胞的培养基中45分钟。在“az-dG”样品中,细胞先用10mM叠氮化钠和50mM脱氧葡萄糖处理10分钟以防止内吞作用,然后在用250μL的DPBS洗涤后向培养基中添加RNA。在“Rb”样品中,RNA与细胞进行保温,然后用250μL的DPBS洗涤细胞15分钟以消化结合剂,然后用0.02U/uL的Riboshredder(Epicentre公司,Madison,WI)进行核酸酶处理。最后,在“az-dG/Rb”样品中,细胞用az-dG进行处理,然后加入RNA,在RNA消化后对细胞用核酸酶进行处理。接着添加RNA,那些用az-dG处理的样品也在冰冷的保温块上保温,以抑制其它的内化机制。每种处理做三份。
处理以后,所有的样品用500μL DPBS洗涤,利用相位锁定管按照厂家的方案(Eppendorf公司,Westbury,NY)用Trizol试剂(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)从每个样品中提取总细胞RNA。对RNAs的定量显示回收的RNA量接近(数据未显示),说明处理过程并未使含量发生显著变化。全部提取的RNA以适体特异性引物进行按比例缩小的逆转录反应,反应过程类似于在“分子池合成和纯化”中所述的,并进行实时PCR试验。
在实时PCR中,将600nM的psma5和psma3与12.5μL的2X SybrMix和10μL 1∶10的逆转录反应稀释液混合。样品上到ABI 7300实时反应仪上并按如下循环:95℃10分钟,然后进行以下40个循环:95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟。循环后,进行一个如下的解离步骤以验证产物的完整性:95℃15秒、60℃30秒和95℃15秒。计算出ΔCT以比较每个样品相对于未处理的细胞对照的CT值。
内化筛选
在筛选轮次开始前一天,将4×105HeLa-CD4细胞接种在60mm组织培养平板中。在每一轮的筛选前一小时,将培养基替换为新鲜培养基。在第一轮筛选中,向两个平板中的一个加入54μg的修饰的分子池RNA(1.2mM),其代表了分子池基因组大约1倍的值。保温大约3天后,将细胞用胰蛋白酶处理,用D-PBS(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)洗涤两次,利用1mL Trizol试剂(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和相位锁定管按照厂家说明(Eppendorf公司,Westbury,NY)将两个平板中的总细胞RNA提取出来。
回收的总细胞RNA按照如下程序进行逆转录:含有84μg总RNA和在1X RT缓冲液(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)中含有的10μM 24.30反向引物的反应液在70℃变性5分钟,然后缓慢地冷却到室温。向混合液中加入一种标准混合液,其中含有10mMDTT,每种dNTP各1mM以及28U的Superscript III逆转录酶(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)并在50℃保温1小时。少量没有进行逆转录的两种(曝光的和非曝光的)分子池对照也进行同样的操作,以确认没有任何回收的产物加入分子池RNA以及没有细胞产生或携带DNA模板。
逆转录反应的一半作为下一轮大规模PCR的种子。每一轮的分子池按照“分子池的合成和纯化”中所列的方案以修饰调整进行更新以适应每一轮减小规模的核酸。在后面的轮次中,我们发现被用于最初的分子池扩增的引物浓度过量,所以将每种PCR引物的浓度降至0.4mM。
随筛选轮次的进行,加入的RNA逐渐减少,保温时间缩短,而洗涤步骤增加。筛选的过程通过评估在扩增产物能够看到之前所需的PCR循环数而确定。这经常与加料量直接相关,在该情况下,在每一轮的筛选中能回收多少分子池RNA。在第3轮(第一轮大幅减少了添加到细胞的分子池的量)和第5轮当使用了一种新鲜保存的细胞后,循环数发生了剧列的减少。9轮以后,PCRs似乎在循环数上已不再提高,可认为筛选结束。
实施例2
1、包含RNA的分子的鉴定
一种内化RNA序列,抗PSMA适体A9被用于测试本发明公开的新条件,并用于鉴定包含RNA的分子以及确保内化序列的存留。
图1显示核酸酶条件的有效性。大约106LnCap细胞用下述四种条件之一进行处理:将抗PSMA适体直接添加到细胞培养基中(RNA);首先用10mM叠氮化钠和50mM脱氧葡萄糖处理细胞10分钟以防止内吞作用,然后在洗涤后向培养基中添加RNA(az-dG);向细胞中添加RNA,然后将细胞用0.02U/uL Riboshredder(Epicentre)进行核酸酶处理以消化结合剂(Rb);或者细胞在添加RNA前先以az-dG处理,然后在经RNA消化后进行核酸酶处理。每种处理都做三份样品。从每个处理的样品中提取出的总细胞RNA以适体特异性引物进行逆转录,实时PCR循环数由GAPDH水平决定。以az-dG处理使ΔCT信号轻微地减少,而以Rb进行处理则显著地减少了该信号,这说明多数的适体停留在细胞外,但有一些得到保护。同时以az-dG和Rb进行处理完全消除了信号;Rb处理的信号是由于适体的内化。
2、筛选
一种掺入型的、基于A9适体的2’-氟代修饰的RNA分子池,其中适体的每个碱基位点掺入率大约30%,被用于测试本发明所提出的筛选方案。向T25玻璃瓶汇合率在70-80%的LnCap细胞中添加3到5微克掺入型PSMA分子池,将细胞保温过夜。然后用PBS洗涤细胞,并用在PBS中含有0.01U/μL Riboshredder处理10分钟。然后将细胞洗涤三遍,并用1mL Trizol试剂提取出总细胞RNA。回收的RNA进行逆转录并通过PCR进行扩增以生成下一轮转录所需的模板。
经过五轮的筛选后,测试这些轮次中内化负载有抗-lamin A/C siRNA的抗生物素蛋白链菌素/生物素缀合物的能力,方法如以前针对A9适体本身的一样(Chu等人,(2006)Nucleic Acids Res.34(10):e73)。一种抗-eGFP siRNA作为阴性对照(图3)。第5轮分子池中的五个克隆进行了扩增、测序并检测lamin A/C siRNA的内化。全部5个克隆(p1、p2、p6-8)以GAPDH和细胞对照为标准都表现出lamin A/C的表达降低,说明其进入细胞的能力不依赖于任何转染方法。没有A9的siRNA缀合物或克隆没有表现出lamin A/C剔除。五个克隆中的三个(p1、p7、p8)相对于野生型A9适体显示出稍好一些的剔除lamin A/C的效果。
从核酸随机分子池中筛选内化子。在最初的筛选中,用一种带有30个碱基随机区域的2’-氟代修饰的RNA分子池筛选那些内化进入HeLa-CD4细胞的序列。在最初的两轮中不包括核酸酶步骤。在第1-6轮中,RNA分子池与细胞保温时间为1天。周期性地,分子池处理的细胞用Trizol试剂提取总RNA并进行逆转录和实时PCR反应扩增以检查细胞内分子池RNA的存在。6轮以后,扩增信号达到峰值(参见图5)。多进行一轮保温1天的试验,接下来的一轮细胞保温时间只有1小时。第9轮没有明显的提高。将第9轮的克隆分离并测试其运输siRNA进入细胞的能力。表1总结了各轮的筛选。
表1
实施例3
1、鉴定包含RNA的分子
一种内化RNA序列,抗PSMA适体A9,被用于测试本发明反复降低细胞与包含RNA的分子接触时间的方法。反应条件与试剂与如上所述的相同。
2、筛选
筛选条件大体上类似于上面所公开的方法。简单来说,一种掺入型的、基于A9适体的2’-氟代修饰的RNA分子池,其中适体的各碱基位点掺入大约30%,这种分子池被用于测试本发明提出的筛选方案。在一个T25玻璃瓶中,向汇合度为70-80%的LnCap细胞中加入3到5微克掺入型PSMA分子池,将细胞保温过夜。然后用PBS洗涤细胞并用含有0.01U/μL Riboshredder的PBS处理10分钟。然后将细胞洗涤三遍,并用1mLTrizol试剂提取出总细胞RNA。回收的RNA进行逆转录并通过PCR进行扩增以生成下一轮转录所需的模板。
然后将回收的RNA按如上所述的流程进行保温,只是保温时间缩短为12小时。第二轮筛选回收的RNA保温10小时,其它的洗涤方法和条件与第一轮相同。第四轮的保温时间为8小时,第五轮保温时间为4小时,第六轮保温时间为2小时,第七轮至第九轮保温时间为1小时。经过头五轮的筛选后,测试这些轮次中内化负载有抗-lamin A/C siRNA的抗生物素蛋白链菌素/生物素缀合物的能力,方法如以前针对A9适体本身的一样(Chu等人,(2006)Nucleic Acids Res.34(10):e73)。一种抗eGFP siRNA作为阴性对照。第9轮分子池的克隆进行扩增、测序并检测lamin A/C siRNA的内化。以GAPDH和没有与siRNA接触的对照为标准,这些克隆显示出lamin A/C表达水平的降低。这说明其进入细胞的能力不依赖于任何转染方法。没有A9的siRNA缀合物或克隆没有表现出lamin A/C剔除。后几轮的保温试验中鉴定出的克隆显示出比第1轮鉴定的克隆更快的内化,这说明后几轮筛选的克隆更快地内化。
等同替换
本领域技术人员可以认识到、或仅根据常规实验能够确定本发明所描述的特定组分和流程的许多等同替换。这种等同替换应视为在本发明的范围之内,或者被权利要求所覆盖。
本发明所公开和要求保护的所有组合物和/或方法都可以按照公开的内容不需过度的试验而实现。由于本发明的组合物和方法已经通过最优方案得到描述,对本领域技术人员显而易见的是,可能有多种变化被应用于本发明的组合物和/或方法以及步骤或者步骤的顺序而不脱离本发明的构思、精神及范围。所有这些对于本领域技术人员显而易见的类似的替代和改变被视为如所附的权利要求中所定义的本发明的精神、范围和构思之内。
序列表
<110>德克萨斯州大学系统董事会
安德鲁·D·埃林顿
马修·莱维
闫艾米
楚池泰
<120>筛选细胞内化核酸的方法
<130>UTAU:2108
<150>US 60/910,792
<151>2007-04-09
<160>6
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(56)
<223>n是A、T、C或G碱基中的任何一种
<400>1
gggaatggat ccacatctac gaattcnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnttca 60
ctgcagactt gacgaagctt 80
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aagcttcgtc aagtctgcag tgaa 24
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ttctaatacg actcactata gggaggacga tgcgg 35
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的寡核苷酸
<400>6
tcgggcgagt cgtctg 16
Claims (29)
1、一种筛选有核酸酶抗性的包含RNA的分子的方法,包括:
a)使细胞与一种包含RNA的分子的随机文库接触;
b)使被接触的细胞暴露于一种或多种核酸酶;
c)从被接触的细胞中提取总RNA;和
d)扩增从细胞中分离出的总RNA中的包含RNA的分子,
其中内化的、核酸酶抗性的包含RNA的分子中选。
2、权利要求1的方法,其中利用一轮筛选出的包含RNA的分子进行筛选方法的重复。
3、权利要求1的方法,其中内化的包含RNA的分子是利用两轮或更多轮的筛选方法选出的。
4、权利要求3的方法,其中在每一个后续的筛选轮次中,可内化的包含RNA的分子与一种或多种细胞接触的时间递减。
5、权利要求1的方法,其中一种或多种细胞与可内化的包含RNA的分子接触的时间小于24小时,小于10小时,小于5小时,小于2小时,小于1小时,小于30分钟,小于20分钟,小于10分钟,小于5分钟,小于2分钟,小于1分钟,或小于30秒。
6、权利要求1的方法,进一步包括通过多轮的筛选来分离可内化的、包含RNA的分子,其中每个后一轮的筛选包括使前一轮获得的可内化的包含RNA的分子与细胞接触的时间与该前一轮处理的时间相比减少。
7、权利要求1的方法,其中文库包含一种随机化序列分子池中的功能性RNAs。
8、权利要求1的方法,其中RNA包括至少一个随机序列和至少一个恒定序列。
9、权利要求1的方法,其中RNA包括两个或更多恒定序列。
10、权利要求1的方法,其中随机序列包括至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸,或超过100个核苷酸。
11、权利要求1的方法,其中随机文库包括稳定的RNAs。
12、权利要求1的方法,其中一种或多种核酸酶是RNases或核糖核酸酶。
13、权利要求1的方法,其中一种或多种核酸酶是脱氧核糖核酸酶。
14、权利要求1的方法,其中筛选的包含RNA的分子内化进入表达CD4受体的细胞。
15、权利要求14的方法,其中筛选的包含RNA的分子与siRNAs、毒素、miRNAs、适体、或小分子连接。
16、权利要求1的方法,进一步包括处理细胞以防止有活性的内吞作用的步骤。
17、权利要求1的方法,其中包含RNA的分子被可检测地标记。
18、权利要求1的方法,其中细胞在与包含RNA的分子的文库接触前被固定。
19、一种筛选稳定的、可内化的包含RNA的分子的方法,包括:
a)使一种或多种细胞与一种包含RNA的分子的随机核酸文库接触,其中包含RNA的分子包括稳定的核酸并包含恒定序列区域;
b)洗涤细胞;
c)使细胞暴露于一种或多种核酸酶;
d)从细胞中提取总核糖核酸;
e)扩增内化的核糖核酸;和
f)重复筛选步骤a)-e),
其中每个后一轮的筛选包括使细胞与扩增的核酸分子池接触的时间反复递减。
20、权利要求19的方法,其中包含RNA的分子至少具有部分的核酸酶抗性。
21、权利要求19的方法,其中一种或多种核酸酶是RNases或核糖核酸酶。
22、权利要求19的方法,其中一种或多种核酸酶是脱氧核糖核酸酶。
23、权利要求19的方法,进一步包括处理细胞以防止有活性的内吞作用的步骤。
24、权利要求19的方法,其中包含RNA的分子的核酸被可检测地标记。
25、权利要求19的方法,进一步包括在与核酸文库接触前固定细胞的步骤。
26、权利要求19的方法,其中包含RNA的分子与siRNAs、miRNAs、小分子、毒素、或适体连接。
27、权利要求19的方法,其中包含RNA的分子包括两个或更多恒定序列。
28、权利要求19的方法,其中文库中包含RNA的分子的随机序列包括至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸,或超过100个核苷酸。
29、一种用于筛选可内化的、包含RNA的分子的试剂盒,包括:
a)一种随机核酸文库;
b)一种或多种核酸酶,其数量足以降解所有非内化的核酸;
c)一种逆转录酶、一种DNA聚合酶、或一种RNA转录酶;
d)一种或多种缓冲液;和
e)根据权利要求1的方法的说明书。
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