CN116875668A - 一种捕获特定rna结合蛋白介导的rna-rna相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA‑RNA相互作用的方法，通过对细胞进行UV交联固定RNA结合蛋白和RNA的相互作用，裂解细胞之后，通过结合特异性抗体的磁珠将特定的RNA结合蛋白及其结合的RNA富集在磁珠上，将RNA酶切成片段，然后在RNA的3’末端进行pCp‑biotin标记并在磁珠上进行近端连接。将RNA结合蛋白‑RNA复合物从磁珠上洗脱，1/3的复合物用蛋白胶电泳并转移到硝酸纤维素膜上后，通过化学发光的方法进行检测，2/3的复合物在转移到硝酸纤维素膜上后，切下RNA结合蛋白‑RNA复合物，分离纯化RNA并构建链特异性文库进行测序。本发明使用化学发光法替代放射性元素检测蛋白‑RNA复合物，提高了安全性和方便性；无需过表达特定RNA结合蛋白，提高了嵌合体RNA的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用的方法。
背景技术
约85％的人类基因组转录为RNA，仅2-7％的转录本是mRNA，其余为非编码RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)。大量ncRNAs的功能尚不清楚。许多ncRNAs的功能在RNA-RNA相互作用的研究中被发现，这些研究表明RNA-RNA相互作用在RNA转录、剪切、翻译和降解中具有重要作用。
然而，在全转录组水平鉴定RNA相互作用仍然面临挑战。最近报道的MARIO和RIC-seq技术描绘了整个RNA-RNA相互作用组。这些方法促进了人们对RNA相互作用及其调节环路的认识。但是，RNA分子间的作用通常由多种RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)介导。在特定的生理过程中，不同的RBPs如何通过RNA-RNA相互作用发挥各自独特的功能，尚不清楚。要解决这一问题，鉴定特定RBP介导的RNA-RNA相互作用也不可或缺。CLASH技术检测了特定RBPs结合的RNA duplexes，该方法因直接连接构成duplex的RNA，存在三个缺点：不能确切分配duplex位置，连接效率低，过表达RBPs会扰乱天然的RNA-RNA相互作用。与CLASH相似，hiCLIP检测了蛋白Staufen1结合的RNA duplex。虽然hiCLIP有所改进，但是二者存在的不足是：需要过表达RBP，需要借助放射性同位素可视化RBP-RNA复合物，以及嵌合体reads的比率低，只有2％。
发明内容
本发明的目的是提出一种捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用的方法，即lhCLIP法(pCp-biotin labelled RNA hybrid and ultraviolet crosslinking andimmunoprecipitation)。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
本发明一方面提供了一种捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：
(1)对细胞或组织进行UV交联，以固定蛋白质和RNA的相互作用；
(2)用结合特异性抗体的磁珠免疫沉淀特定蛋白-RNA复合物；
(3)在磁珠上将RNA酶切成片段，去除不与特定蛋白结合的RNA片段；
(4)pCp-biotin标记在磁珠上的RNA的3’末端，所述pCp-biotin为生物素标记的两端为磷酸基团的胞嘧啶核苷酸，pCp-biotin标记的RNA可与偶联辣根过氧化物酶的链霉亲和素结合，然后可通过化学发光法进行检测；
(5)近端连接；
(6)磁珠上洗脱蛋白-RNA复合物，其中，1/3的复合物用蛋白胶电泳并转移到硝酸纤维素膜上后，用化学发光检测生物素标记的蛋白-RNA复合物；2/3的复合物在转移到硝酸纤维素膜上后，根据化学发光检测结果，切下蛋白-RNA复合物，分离纯化RNA；
(7)构建链特异性文库并测序。
进一步的，所述步骤(1)中，细胞或组织的UV交联的条件为：波长254nm的UV-C0.1J/cm2-0.4J/cm2，优选的，波长254nm的UV-C0.3J/cm2。
进一步的，所述步骤(2)包括如下步骤：先准备结合特异性抗体的磁珠；在磁珠和特异性抗体孵育期间，将步骤(1)处理后的细胞或组织，用完全细胞裂解液裂解混悬，将细胞裂解产物和结合特异性抗体的磁珠混匀，得到磁珠-特定蛋白-RNA复合物。
进一步的，所述步骤(2)中，所述磁珠为Protein G/A Dynabeads，所述特定蛋白为hnRNPK，所述特异性抗体为anti-hnRNPK抗体或IgG。
进一步的，所述步骤(3)包括如下步骤：使用微球菌核酸酶在磁珠上将RNA酶切成片段，并用碱性磷酸酶将RNA的3’末端磷酸基团转变为羟基。
进一步的，所述步骤(4)包括如下步骤：在磁珠上通过连接酶将pCp-biotin连接到RNA的3’末端，然后通过碱性磷酸酶将Cp-biotin的磷酸基团转变为碱基，随后通过T4 PNK酶将RNA的5’末端磷酸化。
进一步的，所述步骤(5)中，通过T4 RNA连接酶在磁珠上完成RNA近端连接。
进一步的，所述步骤(6)中化学发光检测试剂盒为Chemiluminescent RNA EMSA Kit(Thermo Fisher,20158)。
进一步的，所述步骤(7)中构建链特异性文库所使用的试剂盒为VAHTS UniversalV8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina。
本发明另一方面提供了一种文库构建方法，包括上述方法的步骤(1)-步骤(7)。
本发明另一方面提供了一种上述的文库在捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用中的应用。
本发明的突出效果为：本发明通过对细胞进行UV交联固定细胞或组织中RNA结合蛋白和RNA的相互作用，裂解细胞之后，通过结合特异性抗体的磁珠将特定的RNA结合蛋白及其结合的RNA富集在磁珠上。利用微球菌核酸酶将RNA酶切成片段，去除不与特定RNA结合蛋白结合的RNA片段，然后在RNA的3’末端进行pCp-biotin标记并在磁珠上进行近端连接。磁珠上洗脱RNA结合蛋白-RNA复合物，其中1/3的复合物用蛋白胶电泳并转移到硝酸纤维素膜上后，用Chemiluminescent RNAEMSA Kit通过化学发光的方法进行检测；另外2/3的复合物在转移到硝酸纤维素膜上后，根据化学发光检测结果，切下RNA结合蛋白-RNA复合物，分离纯化RNA并构建链特异性文库进行测序。本发明无需使用放射性元素，可通过化学发光法可视化蛋白-RNA复合物，显著提高了方法的简便性和安全性。本发明的lhCLIP技术无需过表达特定的RNA结合蛋白，提高了嵌合体RNA的检出率，获得特定蛋白介导的更多的RNA-RNA相互作用信息。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
图1为本发明实施例1的lhCLIP技术示意图。包括UV交联、免疫沉淀、RNA酶切、pCp-biotin标记和近端连接、RBP-RNA复合物洗脱以及SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜、分离纯化RNA和构建链特异性文库；
图2为本发明实施例2的lhCLIP数据分析流程图；
图3为本发明实施例2的2种嵌合体reads的定义；
图4为本发明实施例2的2100Bioanalyzer分析lhCLIP文库片段大小；
图5为本发明实施例2的化学发光检测pCp生物素标记的hnRNPK-RNA复合物；
图6为本发明实施例2的lhCLIP实验2个生物学重复嵌合体reads相关性分析；
图7为本发明实施例2的分子内和分子间嵌合体reads的数量；
图8为本发明实施例2的lhCLIP捕获到的分子间相互作用RNA的类型及其百分比；
图9为本发明实施例2的Venn图展示RIC-seq和lhCLIP检测到的分子内嵌合体readcluster的交集；
图10为本发明实施例2的lhCLIP捕获到的RNU11的相互作用与其已知结构的比较；其中顶部的图为eCLIP数据展示HepG2细胞中hnRNPK在RNU11上的结合位置；中部图为已知的RNU11的结构；底部图为lhCLIP捕获的RNU11 RNA分子内的相互作用；
图11为本发明实施例2的hnRNPK结合RNA的motif；
图12为本发明实施例2的hnRNPK结合在RNU11二级结构上的示意图；
图13为本发明实施例2的lhCLIP捕获的RNU4-2的结构与其已知结构的比较；
图14为本发明实施例2的RNA 3D图谱展示hnRNPK介导的11号染色体转录的RNA-RNA相互作用；
图15为由图14放大的lncRNA NEAT1和MALAT1相互作用；
图16为本发明实施例2的分别为NEAT1、MALAT1和PID1与其他RNA的相互作用；
图17为本发明实施例2的地高辛标记的smFISH探针结合的位点；
图18为本发明实施例2的smFISH共定位证实Hela细胞中的MALAT1和PID1 pre-mRNA之间的相互作用；
图19为本发明实施例2的RAP–qPCR验证TERC与RABGGTB特异性结合，而与MTOR没有相互作用，数据为mean±s.d.；n＝3生物学重复；
图20为本发明实施例2的lhCLIP捕获的小核仁RNA(snoRNA)之间相互作用的热图；
图21为本发明实施例2的lhCLIP捕获的小核RNA (snRNA)之间相互作用的热图；
图22为本发明实施例2的lhCLIP捕获的snoRNA和snRNA之间相互作用的热图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限本发明。
本发明上下文中所使用的试剂，均通过市售获得。本发明所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。
实施例1lhCLIP文库构建
本实施例的lhCLIP文库构建流程如图1所示，包括培养的细胞进行UV交联、免疫沉淀、RNA酶切、pCp-biotin标记和近端连接、RBP-RNA复合物洗脱以及SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜、分离纯化RNA和构建链特异性文库。具体实验步骤如下：
1.Hela细胞培养在15cm的培养皿中，每个实验需3皿细胞。细胞培养至80-90％融合。
2.100μl Protein G Dynabeads(Thermo Fisher Scientific,货号：10004D)或者Protein A Dynabeads(Thermo Fisher Scientific,货号：10002D)，用500μl 5mg/ml BSA/PBS室温封闭1h。取10μg anti-hnRNPK抗体(Santa Cruz，货号：sc-28380)或IgG(abcam，货号：ab18413)与封闭好的Protein G Dynabeads加入到200μl细胞裂解液中(50mM Tris-HClpH 7.4,100mM NaCl,1％ NP-40,0.1％ SDS,0.5％sodium deoxycholate(避光保存))，在4℃，旋转摇床上孵育4h。免疫沉淀之前,磁珠用细胞裂解液洗2次。
3.将步骤1的细胞用预冷的PBS洗一次，然后加入4ml预冷的PBS并将细胞置于冰上，0.3J/cm2 UV-C(254nm)交联。刮下细胞并转移到15ml离心管中，4℃，500g离心5min，去除上清。
4.用1ml完全细胞裂解液(细胞裂解液加上1:100蛋白酶抑制剂和10μlSUPERaseIn(Life Technologies，货号：AM2694))混悬，置于冰上裂解15min。然后加入2μlTurbo DNase(Life Technologies,货号：AM2239),并在Thermomixer中1200rpm，37℃，孵育5min。4℃,15,000g离心10min后，将上清转移到新的管中。
5.将步骤2的细胞裂解液从磁珠上移除。将磁珠与步骤4的细胞裂解产物混匀。磁珠/细胞裂解产物在4℃旋转摇床上过夜。第2天，在磁力架上移除上清，磁珠用high saltwash buffer(50mM Tris-HCl pH7.4，1M NaCl，1mM EDTA，1％ NP-40，0.1％ SDS，0.5％sodium deoxycholate)和1×PNK buffer(50mM Tris-HCl pH 7.4，10mM MgCl2，0.2％ NP-40)洗2次。
6.将步骤5的磁珠与200μl 1×MN混合液(50mM Tris-HCl pH 8.0,5mM CaCl2,0.03U/μl微球菌核酸酶(Thermo Fisher,货号：EN0181)混匀，并在Eppendorf Thermomixer中37℃,15s 1,400r.p.m.,90s暂停，孵育10min，将RNA酶切成片段。用1×PNK+EGTA buffer(50mM Tris-HCl pH 7.4,20mM EGTA,0.5％ NP-40)洗2次磁珠终止反应，再用1×PNKbuffer(50mM Tris-HCl pH 7.4,10mM MgCl2,0.05％ NP-40)洗2次，洗去不与蛋白结合的RNA片段。
7.将磁珠与100μl的FastAP碱性磷酸酶反应液(1×FastAP buffer，10U FastAP碱性磷酸酶(Thermo Fisher，货号：EF0651)和2μlTurbo DNase)混匀，并在EppendorfThermomixer中37℃，15s 1,400r.p.m.，90s暂停，孵育15min，去除RNA的3’末端的磷酸基团，转变为羟基。用1×PNK+EGTA buffer,high salt wash buffer和1×PNK buffer各洗2次磁珠。
8.为了pCp-biotin标记RNA的3’末端，将磁珠与50μl连接混合液(5μl 10×RNAligase reaction buffer,3μl 40U/μl RNase inhibitor,2μl1mM pCp-biotin(ThermoFisher,货号：20160),50U T4 RNA ligase,12.5μl无酶水和25μl 30％ PEG 20000)混匀，并在Eppendorf Thermomixer中16℃,15s 1,400r.p.m.,90s暂停，孵育过夜。第2天，磁力架上去除上清，然后用1×PNK buffer洗3次磁珠。
9.磁珠用含有10U FastAP碱性磷酸酶的100μl 1×FastAP buffer处理15min，去除-Cp上的磷酸基，转变为羟基。用1×PNK+EGTA buffer,high salt wash buffer和1×PNKbuffer各洗2次磁珠。
10.将磁珠用PNK混合液(10μl 10×PNK buffer A,15μl 10mM ATP,10μl T4polynucleotide kinase(Thermo Fisher，货号：EK0032),2μl40U/μl RNase inhibitor,63μl无酶水)混悬，并在Eppendorf Thermomixer中37℃,15s 1,400r.p.m.,90s暂停，处理45min,在RNA的5’末端加上磷酸基。PNK处理产物用1×PNK+EGTA buffer和1×PNK buffer(0.05％ NP-40)各洗2次。
11.为了实现RNA近端连接,将磁珠与连接反应混合液(10μl 10×RNA ligasereaction buffer,4μl 40U/μl RNA inhibitor(Thermo Fisher,货号：EO0381),5μl 10U/μl T4 RNA ligase(Thermo Fisher,货号：EL0021),10μl 1mg/ml BSA,71μl无酶水)混匀，并在Eppendorf Thermomixer中16℃,15s 1,400r.p.m.,90s暂停，孵育过夜。
12.第2天用1×PNK buffer洗磁珠2次，然后将磁珠用elution/loading mastermix(20μl wash buffer(20mM Tris-HCl pH 7.4,10mM MgCl2,0.2％ Tween-20),7.5μl 4×NuPAGE sample buffer,3μl 1MDTT)混悬，置于Thermomixer中,1200rpm,70℃加热10min。然后将样本置于磁力架上，吸取上清转移到新的1.5ml EP管中。样本按1/3和2/3分成2份。2份样本分别用NuPAGE 4–12％ Bis-Tris Gels(1.0mm×12well)，160V，电泳45min。400mA，4℃，60min将hnRNPK-RNA复合物从胶转移到硝酸纤维素膜上。
13.步骤12硝酸纤维素膜上含1/3样品的biotin标记的hnRNPK-RNA复合物用Chemiluminescent RNAEMSAKit(Thermo Fisher,20158)通过化学发光的方法检测。
14.步骤12另外2/3的样本在转移到硝酸纤维素膜上后，放置在湿润的滤纸上，根据步骤13化学发光检测结果，用刀片切下RBP-RNA复合物。将膜剪成0.5-1mm的细小条带，以便条带落到1.5ml EP管底部。管中加入200μl含有10μl蛋白激酶K(Thermo FisherScientific,cat#AM2546)的反应液(100mM Tris，pH 7.5；50mM NaCl；1mM EDTA；0.2％SDS)，并在Eppendorf Thermomixer中，50℃,15s 1,000r.p.m.,30s暂停，孵育60min。60min后,取出EP管简单离心。加入200μl水饱和的酚-氯仿(pH 6.7),在Eppendorf Thermomixer中，37℃,1,400r.p.m.孵育10min。简单离心后，将液体转移到2ml Heavy Phase Lock Gel管中。>13,000r.p.m.离心2min,在此同一个2ml Heavy Phase Lock Gel管中，用1ml氯仿再次提取水相中的杂质(上下颠倒10次混匀；不要涡旋和振动)，>13,000r.p.m.离心2min,上层水相转移至新的1.5ml EP管中。加入18μl 5M NaCl,3μl Linear Polyacrylamide(sigma,货号：56575),0.8ml 100％乙醇，-20℃沉淀过夜。第2天,在4℃，>13,000r.p.m.，45min离心沉淀RNA,并用1ml预冷的75％乙醇洗涤沉淀,风干之后，用8μl无酶水溶解RNA沉淀。
15.用VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina(Vazyme,货号：NR605)试剂盒构建链特异性文库。将步骤14提取的8μl RNA与8μl 2×Frag/PrimeBuffer混匀，94℃孵育5min，将RNA打断成片段150-200nt的片段，然后迅速放置冰上。将7μl1st Strand Buffer 3和2μl1st Strand Enzyme Mix 3加入到RNA片段中，放入PCR仪中25℃10min，42℃15min，70℃15min，最后4℃Hold，以合成第一链cDNA。然后构建dUTP第二链cDNA，将反应混合液(2nd Strand Buffer 2(5μl dNTP和20μl dUTP),15μl 2nd StrandEnzyme Super Mix 2)与第一链cDNA混匀，放入PCR仪中16℃30min,65℃15min,4℃Hold。然后将连接反应混合液(25μl Rapid Ligation Buffer 4,5μlRapid DNALigase 4,1μl RNAAdapter,4μl H2O)与上一步合成的dsDNA混匀，20℃孵育15min，将接头连接到dsDNA上。加接头的cDNA 产物用0.5×VAHTSDNA Clean Beads(Vazyme,货号：N411-01-AA)纯化，20μl无酶水洗脱。将纯化的加接头cDNA与1μl PCR Primer Mix 4,1μl 50mM MgSO4,25μl 2×HFAmplification Mix,3μlUSER enzyme(NEB,货号：M5505S)混匀，37℃孵育15min以便USERenzyme消化含dUTP的链,94℃2min灭活酶。PCR扩增文库的程序为:98℃45s；17-19循环98℃15s,60℃30s，72℃30s；最后72℃延伸1min。用1×VAHTSDNA Clean Beads分选180-400bpPCR产物。DNA浓度用Qubit(Thermo Fisher,Q32854)进行检测，并用Illumina NovaSeq双端测序。
实施例2：数据分析及结果
1、数据分析方法
数据分析流程如图2所示。首先利用Trimmomatic(0.36)软件过滤lhCLIP原始测序数据中的接头序列和低质量的测序片段，进一步去除冗余片段后利用Cutadapt(v1.15)去除低复杂度序列，随后利用STAR(2.5.2b)将高质量数据比对到人类45S pre-rRNA，未比对上的序列再利用STAR(2.5.2b)比对到人类参考基因组(hg19版本)，最后从人类参考基因组比对结果中筛选来自于RNA连接产物的测序片段(定义为嵌合体reads，如图3所示)。通过比较每段基因组(3000bp)的嵌合体reads个数，计算2个生物学重复的皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)以评估实验的可重复性。利用IGVtools以及Juicebox对lhCLIP数据进行可视化展示。
2、数据分析结果
先对lhCLIP数据进行质控。2100Bioanalyzer分析lhCLIP文库片段大小分布在180-450bp之间(图4)，是较为理想的长度。化学发光检测到的pCp生物素标记的hnRNPK-RNA复合物(图5)，检测的灵敏度非常良好，除了IgG对照组有少量背景信号外，其他另外2个阴性对照未检出信号。lhCLIP数据2个生物学重复的重复性非常好，Pearson相关系数为0.989(图6)。
然后分析了hnRNPK介导的RNA-RNA相互作用概况。分子内和分子间嵌合体reads的数量总共约60万(图7)，是唯一比对reads的4.87％(表1)。lhCLIP捕获到的分子间相互作用RNA主要类型是mRNA-mRNA，lncRNA-mRNA和lncRNA-lncRNA之间的相互作用(图8)将每个转录本分子内的嵌合体reads聚集为一个cluster，并分析了RIC-seq和1hCLIP检测到的分子内嵌合体read cluster的交集，lhCLIP84.8％的分子内嵌合体read clusters与RIC-seq捕获到的重叠(图9)。
表1.lhCLIP文库的比对结果.
*Each patred-end read repfesents a fragment that was sequenced
为了进一步确定lhCLIP获得的RNA-RNA相互作用的真实性，将lhCLIP获得的RNA结构与已知的RNA结构比较。lhCLIP捕获的RNU11(图10)和RNU4-2(图13)茎环结构与已知的结构有很好的重叠，少量不重叠部分为hnRNP介导的新相互作用(图10)。hnRNPK结合RNA的motif表明，hnRNPK倾向于结合在CA/U富集的区域(图11)，与lhCLIP获得的数据一致。根据上述结果绘制了hnRNPK结合在RNU11二级结构上的示意图(图12)。
然后构建了hnRNPK介导的RNA-RNA相互作用3D图谱(图14)。进一步分析发现，与hnRNPK结合的lncRNA NEAT1和MALAT1之间存在显著的相互作用(图15)。接着分析了几个具有代表性的RNA相互作用情况。例如lncRNAMALAT1和NEAT1，mRNAPID1在全转录组水平结合多种RNA(图16)。随后，通过实验验证lhCLIP鉴定的新的RNA-RNA相互作用。首先在MALAT1靶向PID1 pre-mRNA的位点设计了地高辛标记的单分子荧光原位杂交(简称smFISH)探针，用于标记PID1 pre-mRNA(图17)；在MALAT1的多个位点设计探针用于标记MALAT1。随后通过smFISH共定位证实Hela细胞中的MALAT1和PID1 pre-mRNA之间的相互作用(图18)。用RAP–qPCR(antisense purification(RAP)coupled with quantitative PCR)验证lhCLIP捕获的另外一对RNATERC与RABGGTB之间的相互作用，MTOR与TERC之间无相互作用为阴性对照，结果表明TERC的探针能富集RABGGTB的RNA,从而证实两者之间的相互作用(图19)。最后分析发现hnRNPK介导了多个小核仁RNA(Small nucleolar RNAs；snoRNAs)(图20)，小核RNA(small nuclear RNA；snRNA)之间的相互作用(图21-图22)。
本发明的lhCLIP技术可以检测到感兴趣的特定蛋白质介导的分子内和分子间RNA-RNA相互作用。该技术不仅可以检测到已知的RNA结构，如RNU11的茎环结构；以及检测到已知的RNA-RNA相互作用，例如MALAT1-NEAT1相互作用，而且有助于生成人体细胞中特定蛋白质识别的RNA-RNA相互作用三维图谱。使用这些图谱，可以发现lncRNA与其靶标之间的新相互作用，包括lncRNA和mRNA。例如，发现hnRNPK介导的lncRNA MALAT1与新生PID1 pre-mRNA之间的相互作用。提示hnRNPK可能通过介导MALAT1-PID1 pre-mRNA 之间的相互作用而调节PID1 pre-mRNA的可变剪切。除了上述观察结果外，还发现其他新的RNA-RNA相互作用，如TERC与RABGGTB之间的相互作用，小核仁RNA之间的相互作用。因此，lhCLIP技术揭示了以前无法获得的由特定蛋白质介导的RNA-RNA相互作用信息，提供了特定蛋白质独特的功能和作用机制信息。此外，本发明可通过化学发光可视化蛋白质-RNA复合物，替代了放射性同位素的使用，以及不需要引入任何外源性编码基因蛋白，并提高了特定蛋白质介导的强合体reads的比率，这些优点均有助于扩大lhCLIP技术的在科学研究中的使用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：
(1)对细胞或组织进行UV交联，以固定蛋白质和RNA的相互作用；
(2)用结合特异性抗体的磁珠免疫沉淀特定蛋白-RNA复合物；
(3)在磁珠上将RNA酶切成片段，去除不与特定蛋白结合的RNA片段；
(4)pCp-biotin标记在磁珠上的RNA的3’末端，所述pCp-biotin为生物素标记的两端为磷酸基团的胞嘧啶核苷酸；
(5)近端连接；
(6)磁珠上洗脱蛋白-RNA复合物，其中，1/3的复合物用蛋白胶电泳并转移到硝酸纤维素膜上后，用化学发光检测生物素标记的蛋白-RNA复合物；2/3的复合物在转移到硝酸纤维素膜上后，根据化学发光检测结果，切下蛋白-RNA复合物，分离纯化RNA；
(7)构建链特异性文库并测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，细胞或组织的UV交联的条件为：波长254nm的UV-C 0.1J/cm2-0.4J/cm2，优选的，波长254nm的UV-C 0.3J/cm2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)包括如下步骤：先准备结合特异性抗体的磁珠；在磁珠和特异性抗体孵育期间，将步骤(1)处理后的细胞或组织，用完全细胞裂解液裂解混悬，将细胞裂解产物和结合特异性抗体的磁珠混匀，得到磁珠-特定蛋白-RNA复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述磁珠为Protein G/ADynabeads，所述特定蛋白为hnRNPK，所述特异性抗体为anti-hnRNPK抗体或IgG。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)包括如下步骤：使用微球菌核酸酶在磁珠上将RNA酶切成片段，并用碱性磷酸酶将RNA的3’末端磷酸基团转变为羟基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)包括如下步骤：在磁珠上通过连接酶将pCp-biotin连接到RNA的3’末端，然后通过碱性磷酸酶将Cp-biotin的磷酸基团转变为碱基，随后通过T4 PNK酶将RNA的5’末端磷酸化。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，通过T4 RNA连接酶在磁珠上完成RNA近端连接。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中化学发光检测试剂盒为Chemiluminescent RNA EMSA Kit；所述步骤(7)中构建链特异性文库所使用的试剂盒为VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina。
9.一种文库构建方法，包括权利要求1-8中任一所述方法的步骤(1)-步骤(7)。
10.权利要求9所述的文库在捕获特定RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用中的应用。
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