JP2010523157A - 核酸を内部移行している細胞の選択方法 - Google Patents
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Abstract
Description
配列およびプライマー
これらの選択に使用されるN30プールは、以下の配列を有する:
この選択において使用されたプールは、定常領域に隣接した無作為の30残基から成った。プールは、ABI Expedite 8909合成機(Foster City、カリフォルニア州)で合成した。ランダム化された位置は、各塩基のカップリング効率がほぼ等しくなるようにモル比3:3:2:2.4でA、C、GおよびTに対するホスホラミダイトを混合することによって生成され、ランダム位置の最終組成物は、A、C、GまたはTとなる25%の可能性を有する。
HeLa−CD4細胞をNIH AIDS Research & Reference Reagent Program(Germantown、メリーランド州)から入手した。LnCap細胞をATCC(Manassas、バージニア州)を通じて購入した。どちらの系も10%fbs(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)を補充したRPMI−1640(ATCC、Manassas、バージニア州)中で維持し、37℃、5%CO2雰囲気中で増殖させた。トリプシン処理のために、細胞を1培養容量のDPBSで1回洗浄し、次いで1/10容量の0.05%トリプシン−EDTA(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)を細胞に加えた。細胞を37℃でおよそ2分間、細胞が剥がれるまでインキュベートした。培養培地を加えることによってトリプシンを不活性化した。すべての細胞洗浄ステップは、室温のPBSを使用した。すべての細胞遠心分離ステップは、4℃、1500rpm、5分間であった。
修飾RNAおよび細胞が消化および選択手順を耐え得ることを確認するために、dsDNAプールを上に記載の通り規模を縮小した反応で転写した。本体に標識した放射性転写物を生成するためにα−32P標識GTP(Perkin Elmer、Shelton、コネティカット州)を反応物に含ませた。
内部移行アッセイを細胞表面アプタマー、抗PSMAアプタマー、A9(Lupoldら、(2002年)Cancer Res.62巻(14号):4029〜33頁)を使用して実施した。A9は、上の「プール合成および精製」で述べたプール転写の小規模版を使用してオリゴ鋳型から転写した。
選択ラウンドの1日前、HeLa−CD4細胞4×105個を2個の60mm組織培養プレート上に置いた。各選択ラウンドの1時間前に培養培地を新鮮培地に置き換えた。選択の最初のラウンドのために、プールのおよそ1ゲノム分に相当する修飾プールRNA(1.2mM)54μgを2個のプレートの内の1個に添加した。3日間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、D−PBS(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)で2回洗浄し、両方のプレートからトリゾール(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)1mLおよびPhase Lockチューブを製造者の手順書(Eppendorf、Westbury、ニューヨーク州)に従って使用して全細胞RNAを抽出した。
1.RNA含有分子の同定
内部移行RNA配列、抗PSMAアプタマー、A9を本明細書において開示の新規条件を検査するため、ならびにRNA含有分子を同定するためおよび内部移行物の残存を確認するために使用した。
アプタマーの各塩基位置を約30%ドープ化した、A9アプタマーに基づくドープ化2’−フルオロ修飾RNAプールを本明細書において提案する選択計画を検査するために使用した。ドープ化PSMAプールの3から5マイクログラムをT25フラスコ中の70〜80%コンフルエンスのLnCap細胞に加え、細胞を一晩インキュベートした。次いで細胞をPBSで洗浄し、PBS中の0.01U/μL Riboshredderで10分間処理した。次いで細胞を3回洗浄し、全細胞RNAを1mLトリゾールで抽出した。回収したRNAを逆転写し、次のラウンドの転写のための鋳型を生成するためにPCRを介して増幅した。
1.RNA含有分子の同定
内部移行RNA配列、抗PSMAアプタマー、A9を、細胞とRNA含有分子とを接触させる時間の長さを反復的に減少させる方法を検査するために使用する。条件および試薬は、上に記載のものと同一である。
選択条件は、上に記載のものと実質的に同じである。簡潔には、アプタマーの各塩基位置を約30%までドープ化した、A9アプタマーに基づく、ドープ化2’−フルオロ修飾RNAプールを本明細書において提案する選択計画を検査するために使用する。ドープ化PSMAプールの3から5マイクログラムをT25フラスコ中の70〜80%コンフルエンスのLnCap細胞に加え、細胞を一晩インキュベートする。次いで細胞をPBSで洗浄し、PBS中の0.01U/μL Riboshredderで10分間処理する。細胞を3回洗浄し、全細胞RNAを1mLトリゾールで抽出する。回収されるRNAを逆転写し、次のラウンドの転写のための鋳型を生成するためにPCRを介して増幅する。
当業者は、本明細書に記載の具体的な組成物および手順に対する多数の等価物を、単なる日常的な実験を使用して認識する、または確認できるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の請求項によって包含される。
Claims (29)
- ヌクレアーゼ耐性RNA含有分子を選択するための方法であって、
a)細胞をRNA含有分子のランダムライブラリーと接触させるステップ;
b)前記接触させた細胞を1つまたは複数のヌクレアーゼにさらすステップ;
c)前記接触させた細胞から全RNAを抽出するステップ;および
d)前記細胞から単離された前記全RNAから前記RNA含有分子を増加させるステップ
を含み、前記内部移行したヌクレアーゼ耐性RNA含有分子が選択される方法。 - 前記選択方法が、選択の1つのラウンドから同定された前記RNA含有分子を使用して繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 内部移行したRNA含有分子が前記選択方法の2つ以上のラウンドを使用して選択される、請求項1に記載の方法。
- 内部移行可能なRNA含有分子を選択の後の各ラウンドでの時間を短くするために1つまたは複数の細胞と接触させる、請求項3に記載の方法。
- 1つまたは複数の細胞を内部移行可能なRNA含有分子と24時間未満、10時間未満、5時間未満、2時間未満、1時間未満、30分間未満、20分間未満、10分間未満、5分間未満、2分間未満、1分間未満または30秒間未満接触させる、請求項1に記載の方法。
- 複数ラウンドの選択によって内部移行可能なRNA含有分子を単離するステップをさらに含み、以前の選択ラウンドと比較して時間を短くするために、選択の後の各ラウンドが以前のラウンドの選択によって得られた前記内部移行可能なRNA含有分子を前記細胞にさらすことを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリーがランダム配列のプール由来の機能性RNAを含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAが少なくとも1つのランダム配列および少なくとも1つの定常配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAが2つ以上の定常配列を含む、請求項1に記載の方法。
- ランダム配列が少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチドまたは100を超えるヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ランダムライブラリーが安定化RNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のヌクレアーゼがRNA分解酵素またはリボヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のヌクレアーゼがDNA分解酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA含有分子がCD4受容体を発現している細胞への内部移行について選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記選択されるRNA含有分子がsiRNA、毒素、miRNA、アプタマーまたは小分子に連結される、請求項14に記載の方法。
- 活発なエンドサイトーシスを抑制するために前記細胞を処理するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA含有分子が検出可能に標識される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がRNA含有分子の前記ライブラリーと接触する前に固定される、請求項1に記載の方法。
- 安定化された内部移行可能なRNA含有分子を選択するための方法であって、
a)1つまたは複数の細胞を、安定化された核酸を含み、かつ定常配列領域を含有するRNA含有分子のランダム核酸ライブラリーと接触させるステップ;
b)前記細胞を洗浄するステップ;
c)1つまたは複数のヌクレアーゼに前記細胞をさらすステップ;
d)前記細胞から全リボ核酸を抽出するステップ;
e)前記内部移行したリボ核酸を増加させるステップ;および
f)選択ステップa)〜e)を繰り返すステップ
を含み、時間を短くするために選択の各後のラウンドが、前記細胞を前記増加された核酸プールに繰り返し接触させるステップを含む方法。 - 前記RNA含有分子が、少なくとも部分的にヌクレアーゼ耐性である、請求項19に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のヌクレアーゼがRNA分解酵素またはリボヌクレアーゼである、請求項19に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のヌクレアーゼがDNA分解酵素である、請求項19に記載の方法。
- 活発なエンドサイトーシスを抑制するために前記細胞を処理するステップをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記RNA含有分子の前記核酸が検出可能に標識される、請求項19に記載の方法。
- 前記核酸ライブラリーと接触する前に前記細胞を固定するステップをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記RNA含有分子がsiRNA、miRNA、小分子、毒素、またはアプタマーに連結される、請求項19に記載の方法。
- 前記RNA含有分子が2つ以上の定常配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の前記RNA含有分子のランダム配列が少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチドまたは100を超えるヌクレオチドを含む、請求項19に記載の方法。
- 内部移行可能なRNA含有分子を選択するためのキットであって、
a)ランダム核酸ライブラリー;
b)内部移行していないすべての核酸を分解するために十分な量の1つまたは複数のヌクレアーゼ;
c)逆転写酵素、DNAポリメラーゼまたはRNA転写酵素;
d)1つまたは複数の緩衝剤;および
e)請求項1の方法と一致する説明書
を含むキット。
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