PL199213B1 - Kationowe pochodne amfoterycyny B i ich zastosowanie do otrzymywania kompozycji wektorujących cząsteczki kwasów nukleinowych oraz do wytwarzania preparatów przeciwgrzybowych - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy kompozycji obejmuj acej cz asteczk e przedmiotow a na ladowan a ujemnie i zwi azek zawieraj acy cz es c kationow a, zdoln a do interakcji z wymienion a cz asteczk a i zwi azan a ko- walencyjnie z czescia aktywn a, pochodz ac a z makrolidowego antybiotyku polienowego. Wynalazek dotyczy te z zastosowania tej kompozycji do wektorowania przenoszenia cz asteczek przedmiotowych (zw laszcza kwasów nukleinowych), jak równie z komórek zmodyfikowanych przez t e kompozycj e. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy dziedziny biotechnologii, w szczególności zastosowania permeabilizujących błony komórek eukariotycznych, kationowych pochodnych antybiotyku z grupy makrolidów polienowych amfoterycyny B, zarówno jako nowych wektorów i ich kompozycji z kwasami nukleinowymi do przenoszenia cząsteczek tych kwasów do komórek eukariotycznych in vitro, ex vivo lub in vivo oraz jako nowych substancji do zwalczania drobnoustrojów grzybowych. Niniejszy wynalazek pozwala na liczne zastosowania w dziedzinach biologii doświadczalnej lub medycznej.

Możliwość skutecznego przenoszenia cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek stanowi jedno z głównych wyzwań w rozwoju biologii i biotechnologii. To przenoszenie pozwala np. in vitro na realizację doświadczeń biologicznych lub biochemicznych takich jak badanie regulacji ekspresji genów, mutagenezy, tworzenie plazmidów, badania genomowe itd., na wytwarzanie rekombinowanych białek lub peptydów, zwłaszcza korzystnych w dziedzinie rolno-spożywczej lub farmacji, albo też na wytwarzanie wirusów rekombinowanych. To przenoszenie ex vivo lub in vivo może także pozwalać na realizację badań dotyczących znakowania, biodostępności, ekspresji genów w tkankach, a także na tworzenie zwierząt transgenicznych lub też na zastosowanie biologiczne lub medyczne jak szczepienia, terapie itd.

Szczególnie ważna jest możliwość dysponowania skutecznym układem przenoszenia cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek, nadającym się do stosowania do populacji komórek docelowych i nietoksycznym dla użytych komórek lub organizmów.

W znanym stanie techniki rozwinię te są róż ne podejś cia do przenoszenia cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek. Chodzi tu np. o wektory pochodzenia wirusowego, których skuteczność przenoszenia kwasów nukleinowych do komórek jest znaczna. Jednakże ten typ wektora wykazuje też pewne potencjalne niedogodności, związane zwłaszcza z ich wytwarzaniem, ich szkodliwością, ich zdolnością klonowania itd.

Równolegle z wektorami wirusowymi nastąpił rozwój bardzo licznych układów syntetycznych do wektorowania, to jest przenoszenia, cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek. Te syntetyczne układy są w większości wypadków kationowe, aby oddziaływały z kwasami nukleinowymi, naładowanymi ujemnie (Legendre i in., 1996). Jednakże w większości wypadków (polilizyna, polimery kationowe, poliaminy itd.) bierze się pod uwagę, że kompleksy kwasy nukleinowe/wektory wnikają na drodze endocytozy, co przedstawia problem (i) późniejszego odłączania kwasów nukleinowych poza pęcherzyki endocytozy dla umożliwienia osiągnięcia przez nie celu molekularnego i (ii) degradacji kwasów nukleinowych w komórkach. Poza tym te układy ciągle nie dają wystarczającej skuteczności in vitro.

Dla zaradzenia temu problemowi proponowano dodawanie różnych związków wspomagających tak, aby ominąć endocytozę i pozwolić na bezpośrednie uwolnienie kwasu nukleinowego w cytoplazmie.

W znanym stanie techniki przyjęty jest na ogół mechanizm wejścia kwasów nukleinowych do komórki przez fuzję kompleksów kwas nukleinowy/wektor z błonami endosomalnymi. Bardzo często używane są np. peptydy fuzjogenne lub dioleilofosfatydylocholina (DOPE). Ostatnio wzięto pod uwagę preparaty specyficznie wzmagające przenikalność przez błonę poprzez jej permeabilizację. Chodzi tu przede wszystkim o gramicydynę S lub tyrocydynę związaną z pęcherzykami DOPE (Legendre i Szoka, 1993), preparat jednak nieaktywny w obecności surowicy. Znany jest też peptyd zakłócający przenikalność przez błonę przy niskim pH, związany z innym peptydem amfofilowym (Ohmori i in., BBRC, 1997). Ten preparat jest mniej aktywny niż Lipofectine®, związek odniesienia i wykazuje znaczną toksyczność.

Wymienione preparaty wykazują poza tym tę niedogodność, że zawierają liczne składniki, co daje mieszaniny niejednorodne, a więc trudne do standaryzacji i nietrwałe w płynach biologicznych.

Jeśli chodzi o układy z jednym wektorującym składnikiem, wpływającym na przenikalność przez błonę, znany jest kationowy peptyd amfopatyczny (Wyman i in., 1997) zdolny do spowodowania migracji transbłonowej przy niskim pH spotykanym w endosomach. Znana jest też dioleilomelityna (Legendre i in., 1997), która wykazuje tę zaletę, że jest aktywna w obecności surowicy.

Mimo podjętych wysiłków układy opisane w aktualnym stanie wiedzy wykazują niedogodności związane z małą aktywnością in vivo, działaniem ubocznym in vivo, wąskim spektrum aktywności in vitro i in vivo i/lub wysokimi kosztami wytwarzania.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego układu wektorowania cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek. Istotą wynalazku jest kompozycja wektorująca cząsteczki kwasów nukleinowych zawieraPL 199 213 B1 jąca kwas nukleinowy oraz kationową pochodną antybiotyku amfoterycyny B z grupy makrolidów polienowych zdolną do oddziaływania z kwasem nukleinowym.

Układ według wynalazku polega na otrzymaniu i zastosowaniu związków zawierających część kationową, zdolną do oddziaływania z cząsteczkami kwasów nukleinowych naładowanymi ujemnie i specyficzną część permeabilizują c ą błony, pozwalają c ą na przenoszenie powsta ł ych kompleksów do komórek. Związkami użytymi w niniejszym wynalazku są kationowe pochodne błonowo czynnego antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, amfoterycyny B.

Kompozycje według wynalazku wykazują zaletę prostego wytwarzania, małej toksyczności, aktywności zachowywanej w obecności surowicy i dobrej skuteczności wektorowej.

Niniejszy wynalazek przynosi więc korzystną alternatywę dla układów, opisanych w uprzednim stanie wiedzy, do wektorowania cząsteczek kwasów nukleinowych i odnosi się do kompozycji zawierającej:

- nał adowan ą ujemnie czą steczkę kwasu nukleinowego

- oraz kationową pochodną amfoterycyny B, zdolną do interakcji z czą steczką kwasu nukleinowego.

Kwasy nukleinowe mogą być kwasami dezoksyrybonukleinowymi (DNA) lub rybonukleinowymi (RNA). Co do DNA można wymienić DNA komplementarny, genomowy, syntetyczne lub półsyntetyczne. RNA mogą być RNA informacyjnymi, transferowymi, rybosomalnymi lub syntetycznymi. Kwasy nukleinowe mogą być np. pochodzenia ludzkiego, zwierzęcego, roślinnego, wirusowego, bakteryjnego lub syntetycznego. Mogą to być także oligonukleotydy (mające długość od 3 do 80 merów) lub fragmenty kodujące, geny, regiony genomowe lub całe chromosomy. Mogą to być kwasy nukleinowe o pojedynczej lub podwójnej nici. Mogą to być w szczególności kwasy nukleinowe antysensowe (lub antygenowe), to znaczy zdolne do modyfikowania przez hybrydyzację aktywności genu lub RNA albo szczególnego regionu genomowego. Mogą to być również kwasy nukleinowe zawierające region kodujący dany produkt peptydowy (polipeptyd lub białko mające interesującą aktywność biologiczną pod względem immunologicznym, farmaceutycznym lub żywnościowym). Ponadto te kwasy nukleinowe mogą być w postaci liniowej lub kołowej i plazmidu.

Kwasy nukleinowe można otrzymać każdą metodą znaną fachowcowi, jak synteza chemiczna, przeszukiwanie banków, wyodrębnienie z plazmidów itd., jak też każdym połączeniem tych klasycznych metod.

Amfoterycyna B (Wzór 1) jest powszechnie stosowana w lecznictwie klinicznym jako lek przeciwgrzybowy w postaci Fungizone® (amfoterycyna B połączona z dezoksycholanem). Amfoterycyna B jest związkiem oddziałującym z błonami zawierającymi sterole i tworząca w stężeniu subletalnym pory transbłonowe zarówno w komórkach grzybów, jak, w stężeniach większych, w komórkach ssaków (Hartsel i Bolard, 1996). Jednakże stosowanie makrolidów polienowych lub ich pochodnych kationowych, w szczególności amfoterycyny B, jako wektorów cząsteczek kwasów nukleinowych nigdy nie było znane.

Makrolidowe antybiotyki polienowe nie posiadające ładunku elektrycznego nie tworzą kompleksu kwas nukleinowy/wektor. Tak jest w wypadku np. amfoterycyny B, która jako taka nie jest zdolna do interakcji z kwasami nukleinowymi.

Niniejszy wynalazek pokazuje, że można stosować kationowe pochodne amfoterycyny B do tworzenia kompleksów z kwasami nukleinowymi i że te kompleksy mogą być przenoszone skutecznie do komórek, to znaczy (i) powstaje wiązanie elektrostatyczne między tym związkiem i ujemnymi ładunkami kwasu nukleinowego, oraz (ii) część polienowa kompleksu zachowuje swą aktywność błonową.

Niniejszy wynalazek pokazuje też, że takie kompleksy pozwalają na zabezpieczenie kwasów nukleinowych przed rozkładem przez surowicę, a więc na zwiększenie skuteczności przenoszenia w warunkach obecnoś ci surowicy, zwł aszcza in vivo lub ex vivo.

Wynalazek dotyczy kompozycji, takiej jak określona wyżej, w której makrolidowym związkiem polienowym kationowym jest pochodna makrolidowego antybiotyku polienowego, amfoterycyny B, zawierająca jedną lub kilka funkcyjnych grup kationowych.

Wyrażenie „funkcyjna grupa kationowa obejmuje każdą grupę zdolną do stania się kationową przez protonowanie, zależnie od stosowanego środowiska, zwłaszcza jego pH, jak też każdą grupę niosącą jeden lub kilka trwałych ładunków dodatnich. Jak wskazano wyżej związek lub związki stosowane w ramach niniejszego wynalazku są zdolne do interakcji z cząsteczką kwasu nukleinowego ze względu na obecność funkcyjnych grup kationowych. Wyrażenie „zdolna do inte4

PL 199 213 B1 rakcji oznacza, że część kationowa może łączyć się z anionową cząsteczką kwasu nukleinowego. Interakcja między związkami i kwasem nukleinowym jest zasadniczo interakcją jonową, niekowalencyjną, typu wiązania elektrostatycznego, które ustala się między ładunkami dodatnimi części kationowej związku i ładunkami ujemnymi cząsteczki kwasu nukleinowego. Do tej interakcji jonowej mogą dochodzić interakcje typu Van der Waalsa lub hydrofobowe. Charakter niekowalencyjny interakcji jest korzystny, gdyż pozwala na dysocjację kompleksu w komórce, a więc na uwolnienie w komórkach cząsteczek kwasów nukleinowych. Ponadto ten typ wiązania pozwala na uproszczenie wytwarzania, ponieważ do utworzenia kompleksów wystarcza obecność obok siebie związków i cząsteczek kwasów nukleinowych.

Grupy funkcyjne bądź fragmenty kationowe mogą być związane z amfoterycyną B w różnych pozycjach. Część kationowa może być wprowadzona do grupy aminowej antybiotyku. Część kationowa może też być wprowadzona do funkcyjnej grupy karboksylowej fragmentu aglikonowego cząsteczki. Można poza tym wprowadzić część kationową przez równoczesną modyfikację tych dwóch pozycji w czą steczce.

Pochodne amfoterycyny B według wynalazku wykazują: (i) zdolność interakcji z kwasami nukleinowymi i (ii) zdolność przenoszenia cząsteczek. Ta ostatnia właściwość pozwala w istocie związkom z wynalazku dostarczać czą steczki kwasów nukleinowych do komórek przez umoż liwienie przenikalności przez błony bez przejścia przez drogę endocytozy. Zastosowanie tej oryginalnej „części aktywnej kompozycji może korzystnie pozwolić na wywołanie przejściowej przenikalności komórek dla umożliwienia przejścia cząsteczek kwasów nukleinowych. Zastosowanie związków według wynalazku jest więc szczególnie korzystne, ponieważ komórki nie są zakłócane w znacznym stopniu przez przenoszenie cząsteczki. Opisano niektóre pochodne amfoterycyny B i ich właściwości np. Schaffner i in. (1987), Malewicz i in. (1980), Binet i in.(1988), Cheron i in. (1989), Brajtburg i in.(1990), Falkowski i in. (1979), Jarzębski i in. (1982), Mechliński i in. (1972), Wright i in. (1982), Czerwiński i in. (1991), Grzybowska i in. (1990)

Według wynalazku pochodna kationowa może być amidem pierwszorzędowym lub drugorzędowym amfoterycyny B, w tym aminoalkiloamidy, takie jak 3-dimetyloaminopropyloamid (Wzór 2) lub też amidy amin heterocyklicznych, jak N-metylopiperazyny (Wzór 3), 2-pirydyloetyloaminy (Wzór 4) lub

2-morfoliloetyloaminy (Wzór 5).

Według innego wariantu pochodna kationowa jest estrem amfoterycyny B, korzystnie estrem metylowym (Wzór 6) lub 2-dimetyloaminoetylowym (Wzór 7).

Według kolejnego wariantu pochodna kationowa jest hydrazydem amfoterycyny B, korzystnie 4-metylopiperazynohydrazydem (Wzór 8)

Według dalszego wariantu pochodna kationowa jest pochodną N-alkilową, korzystnie pochodną N',N'-dimetyloaminopropylosukcynoimidylową estru metylowego amfoterycyny B, (Wzór 9).

W innym wariancie pochodna kationowa jest pochodną N-aminoacylową, korzystnie estrem metylowym N-1-piperydynopropionyloamfoterycyny B (Wzór 10).

W kolejnej wersji wynalazku pochodna kationowa amfoterycyny B zawiera funkcyjną grupę kationową jednocześnie na pozycji karboksylowej i aminowej. Taką pochodną jest np. 3-dimetyloaminopropyloamid N-D-ornityloamfoterycyny B (Wzór 11)

Ponadto w kompozycjach z wynalazku powyższe związki mogą być w postaci soli, zwłaszcza chlorowodorku, asparginianu, glutaminianu lub askorbinianu.

Szczególnymi przykładami związków zalecanych według wynalazku są:

- 3-dimetyloaminopropyloamid amfoterycyny B (AMA). AMA odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 2. Ten związek zawiera dwa ładunki kationowe.

- 4-metylopiperazynoamid amfoterycyny B (AMPA). AMPA odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 3.

- 2-(2-pirydylo)etyloamid amfoterycyny B (AMPEA). AMPEA odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 4.

- 2-(4-morfolilo)etyloamid amfoterycyny B (AMMEA). AMMEA odpowiada związkowi, który przedstawia na Wzór 5.

- ester metylowy amfoterycyny B (AME). AME odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 6.

- ester 2-dimetyloaminoetylowy amfoterycyny B (AMEE). AMEE odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 7.

- 4-metylopiperazynohydrazyd amfoterycyny B (HAMA). HAMA odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 8.

PL 199 213 B1

- ester metylowy N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (SAME). SAME odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 9.

- N-(1-piperydynopropionylo)-AME (PAME). PAME odpowiada związkowi, który przedstawia Wzór 10.

- N-D-ornitylo-AMA (OAMA). OAMA odpowiada zwią zkowi, który przedstawia Wzór 11.

Jak objaśniono w przykładach te związki naładowane dodatnio i zwłaszcza posiadające co najmniej dwa ładunki dodatnie, takie jak AMA, pozwoliły na uzyskanie następujących wyników:

- przez interakcję ze związkiem oligonukleotydy są zabezpieczone przed rozkładem wywołanym przez surowicę;

- internalizacja komórkowa oligonukleotydów znakowanych fluoresceiną w komórkach (MCF7 i 3T3) jest mocno zwiększona. W szczególności w porównaniu z działaniem związku odniesienia (Lipofectine®), wywołują wewnątrzkomórkowy rozkład jednorodny, a nie punktowy i większość populacji komórek jest docelowa;

- ekspresja genu MDR1 w fibroblastach transfekowanych przez gen MDR1 jest mocno zredukowana przez oligonukleotydofosforotioniany nonsensowe anty-MDR1, dla których wektorem jest kationowa pochodna amfoterycyny B;

- zwią zek pozwala też na wektorowanie genów. Moż na dzię ki jego zastosowaniu transfekować np. gen GFP (green fluorescein protein).

Te przykłady pokazują, że związki według wynalazku wykazują interesujące właściwości jako wektory do przenoszenia kwasów nukleinowych do komórek (geny, oligodezoksyrybonukleotydy nonsensowe lub anty-geny).

W kompozycjach z wynalazku odpowiednie iloś ci zwią zku lub czą steczki(ek) kwasu nukleinowego są korzystnie tak dobrane, aby stosunek (R) ładunków dodatnich związku do ładunków ujemnych cząsteczki wynosił od 0,1 do 20. Korzystniej ten stosunek wynosi od 0,5 do 15. Rozumie się, że ten stosunek może być dostosowany przez fachowca w zależności od stosowanej cząsteczki kwasu nukleinowego i związku, przewidywanego zastosowania i odnośnego typu komórek.

Kompozycje z wynalazku są generalnie wytwarzane przez inkubację (np. skontaktowanie w roztworze) związku/związków z cząsteczką(ami) kwasów nukleinowych w ciągu dostatecznego okresu czasu dla umożliwienia ich interakcji. Czas inkubacji jest też zależny od użytych związków i warunków inkubacji (środowisko, mieszanie itd.). Korzystnie prowadzi się inkubację w ciągu okresu czasu, wynoszącego np. od 15 minut do 2 godzin. Sposób obejmuje poza tym etap tworzenia kompleksu między związkiem/związkami i cząsteczką/cząsteczkami kwasów nukleinowych, który może być śledzony w róż ny sposób, a zwłaszcza przez pomiar widma absorpcyjnego roztworu, jak objaś niono w przykładach.

Inkubację można wykonać w różnych środowiskach, korzystnie w nieobecności surowicy dla uniknięcia rozkładu kwasów nukleinowych przed utworzeniem kompleksów. Mogą to być roztwory soli, bufory (PBS), itd., w których są rozpuszczalne związki/kwasy nukleinowe. Środowiskami dostosowanymi są np. środowiska DMEM, RPMI lub każde środowisko kompatybilne dla doświadczeń in vitro, ex vivo lub in vivo. Wybór środowiska może być dobrze dopasowany przez fachowca.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są wcześniej opisane oraz nowe pochodne amfoterycyny B, mające zdolność do wektorowania kwasów nukleinowych do komórek i wykazujące właściwości przeciwgrzybowe, świadczące o zdolności tych pochodnych do permeabilizacji błon komórkowych. Te związki zawierają część pochodzącą od amfoterycyny B, z którą są kowalencyjnie związane jedna lub kilka fragmentów nadających pochodnym charakter kationowy. Takie związki są reprezentowane np. przez produkty AMPEA, AMPA, AMEE, SAME, PAME, AMA, AMMEA, AME, HAMA, O AMA, jakie określono wyżej.

Nowe związki opisane wyżej posiadają poza tym własną wysoką aktywność przeciwgrzybową. W istocie jak objaśniono w przykładach, związki te są zdolne do silnego hamowania wzrostu i powodowania śmierci komórek grzybów. Związki te można więc stosować jako środek(i) przeciwgrzybowy(e), w szczególności do wywołania destrukcji komórek grzybowych in vitro, ex vivo i in vivo. Pod tym względem wynalazek dotyczy więc też każdego zastosowania farmakologicznego (zwłaszcza farmaceutycznego) pochodnych amfoterycyny B opisanych wyżej. Dotyczy on szczególnie zastosowania tych związków jako środka(ów) przeciwgrzybowego(ych), jak też każdego preparatu kompozycji przeciwgrzybowego zawierającego ten związek. Aktywność przeciwgrzybowa może być wykorzystana wobec każdego typu komórek grzybowych. Warunki użycia

PL 199 213 B1 tej aktywności (dawki, czas trwania itd.) in vitro i in vivo można łatwo przetransponować z danych opisanych dla amfoterycyny B np. wziąwszy pod uwagę IC50.

Związki/kompozycje z wynalazku można stosować do przenoszenia cząsteczek kwasów nukleinowych do różnych typów komórek, tkanek lub narządów in vitro, ex vivo lub in vivo. W szczególności te związki/kompozycje można stosować do przenoszenia do wszystkich typów komórek wrażliwych na amfoterycynę B, to znaczy w których ten antybiotyk wykazuje aktywność w permeabilizacji błony. Korzystnie są to komórki zawierające w swej błonie sterole.

Jako przykłady można wymienić pasożytnicze pierwotniaki (np. Leishmania) lub komórki grzybów, które są uprzywilejowanym celem antybiotyków polienowych, takich jak amfoterycyna B. Spośród komórek grzybów można zwłaszcza wymienić komórki Saccharomyces, Candida, Cryptococcus lub Aspergillus.

Poza tym związki według wynalazku są też zdolne do wektorowania cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek somatycznych typu fibroblastów, komórek wątrobowych, mięśniowych, nerwowych, krwiotwórczych itd. Jak to pokazują przykłady, związki te są skuteczne zwłaszcza wobec fibroblastów (3T3) i ludzkich komórek rakowych (MCF-7), co ukazuje ich szerokie spektrum aktywności.

Rozumie się, że w zakresie przenoszenia cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek dawki stosowanego związku(ów) są korzystnie nietoksyczne dla komórek.

Inny przedmiot wynalazku dotyczy też komórek modyfikowanych przez kompozycję, jakie opisano wyżej. W sensie wynalazku przez „komórkę zmodyfikowaną rozumie się każdą komórkę zawierającą cząsteczkę kwasu nukleinowego wektorowaną przez kompozycję zawierającą związek, jaki określono przedtem. Jak wskazano wyżej komórki mogą być komórkami grzybów, pasożytniczych pierwotniaków (np. Leishmania) lub komórkami ssaków, zwłaszcza komórkami ludzkimi. Komórki zmodyfikowane według wynalazku można otrzymać sposobem obejmującym inkubację komórek w obecności kompozycji z wynalazku in vitro, ex vivo lub in vivo, przy czym inkubację można realizować w każdym odpowiednim urządzeniu (płytka, naczynie, fermentator itd.). In vivo inkubację można wykonać przez podanie kompozycji według wynalazku obiektowi (korzystnie ssakowi) w warunkach znanych fachowcowi. Może to być w szczególności podanie na drodze miejscowej, doustnej, pozajelitowej, donosowej, dożylnej, domięśniowej, podskórnej, doocznej, transdermalnej itd. Do tego typu zastosowania kompozycje według wynalazku zawierają korzystnie podłoże dopuszczalne fizjologicznie, jak np. roztwory solne (fosforanu monosodowego, disodowego, chlorku sodu, potasu, wapnia lub magnezu itd. lub mieszanin takich soli) sterylne, izotoniczne lub są kompozycjami suchymi, zwłaszcza liofilizowanymi, które przez dodanie zależnie od przypadku wody sterylizowanej lub roztworu fizjologicznego soli pozwalają na utworzenie roztworów nadających się do podania.

Zastosowanie kompozycji według wynalazku jest wielorakie i obejmuje np. wytwarzanie białek rekombinowanych, badanie regulacji ekspresji genów, badanie znakowania lub biodostępności, tworzenie zwierząt transgenicznych lub różne zastosowania medyczne. Przykłady pokazują w tym względzie skuteczność kompozycji z wynalazku w zakresie strategii antysensowych, skierowaną przeciw oporności na środki przeciwrakowe lub w zakresie przenoszenia genów znacznikowych. Te wyniki można zwłaszcza rozszerzyć na:

- wielolekową oporność na środki przeciwgrzybowe: komórki grzybów są uprzywilejowanym celem antybiotyków polienowych, wektorowanie oligonukleotydów lub genów skierowanych przeciw ich oporności znajduje tam zastosowanie z wyboru. Oporność na nowe środki przeciwgrzybowe, jak pochodne azolowe, stanowi poważne zagrożenie na przyszłość, jeśli nie podejmie się środków zapobiegawczych. W tym względzie szczególny przedmiot wynalazku polega na zastosowaniu kompozycji, jaką określono przedtem do wytwarzania leku przeznaczonego do przenoszenia, do komórki grzyba, kwasu nukleinowego zmniejszającego oporność wymienionej komórki na związki przeciwgrzybowe;

- każ de działanie antysensowe lub anty-genowe;

- produkcję białek ex vivo lub in vivo, zwłaszcza białek wybranych spośród hormonów, enzymów, czynników wzrostu, czynników troficznych, czynników koagulacji, lipoprotein, limfokin itd.;

- transfekcję do terapii genowej.

Zaletami związków/kompozycji według wynalazku są np.:

- ich wytwarzanie proste i mał o kosztowne,

- ich mała toksyczność,

- ich aktywność w obecnoś ci surowicy

PL 199 213 B1

- ich selektywność: przeważ nie lepsza niż selektywność zwią zków bł onowo czynnych, co do działania na przepuszczalność błon: tworzenie porów transbłonowych przejściowych i odwracalnych, a nie destabilizujące działanie lityczne.

Niniejszy wynalazek zostanie opisany bardziej szczegółowo za pomocą przykładów, które nastąpią i które powinny być uważane za objaśniające i nie ograniczające.

P r z y k ł a d 1 opisuje sposób otrzymywania kompozycji kationowej pochodnej amfoterycyny B, AMA, z cząsteczką oligonukleotydu i śledzenia procesu jego otrzymywania na drodze spektroskopii absorpcyjnej.

P r z y k ł a d 2 opisuje sposób otrzymywania kompozycji kationowej pochodnej amfoterycyny B, AMA, z cząsteczką plazmidu i śledzenia procesu jego otrzymywania na drodze spektroskopii dichroizmu kołowego.

P r z y k ł a d 3 przedstawia dowód stwierdzający brak toksyczności kompozycji złożonej z kationowej pochodnej amfoterycyny B, AMA, i oligonukleotydu antysensowego względem komórek linii 3T3.

P r z y k ł a d 4 przedstawia dowód stwierdzają cy internalizację oligonukleotydów antysensowych znakowanych FITC do komórek 3T3 przy udziale kompozycji złożonej z kationowej pochodnej amfoterycyny B, AMA, i oligonukleotydu.

P r z y k ł a d 5 przedstawia dowód stwierdzają cy internalizację oligonukleotydów antysensowych znakowanych FITC do komórek MCF-7 przy udziale kompozycji złożonej z kationowej pochodnej amfoterycyny B, AMA, i oligonukleotydu.

P r z y k ł a d 6 przedstawia dowód stwierdzający, że oligonukleotyd wektorowany przez kationową pochodną amfoterycyny B, AMA, nie ulega degradacji pod wpływem surowicy krwi.

P r z y k ł a d 7 przedstawia dowód stwierdzający, że oligonukleotyd antysensowy wektorowany przez kationową pochodną amfoterycyny B, AMA, do komórek NIH MDR-G185 zmniejsza ekspresję P-gp

P r z y k ł a d y od 8 do 10 opisują syntezy kationowych pochodnych amidowych amfoterycyny B: AMMEA (Wzór 5), AMPEA (Wzór 4), AMPA (Wzór3).

P r z y k ł a d 11 opisuje syntezę kationowej pochodnej estrowej amfoterycyny B: AMEE (Wzór 7).

P r z y k ł a d 12 opisuje syntezę kationowej N-alkilowej pochodnej estru amfoterycyny B: SAME (Wzór 9).

P r z y k ł a d 13 opisuje syntezę kationowej N-aminoacylowej pochodnej estru amfoterycyny B: PAME (Wzór 10).

P r z y k ł a d 14 opisuje syntezę dwupodstawionej pochodnej kationowej amfoterycyny B: OAMA (Wzór 11).

P r z y k ł a d 15 opisuje syntezę L-asparaginianu dwupodstawionej pochodnej kationowej amfoterycyny B, OAMA.

P r z y k ł a d 16 przedstawia dowód stwierdzający aktywność przeciwgrzybową kationowych pochodnych amfoterycyny B.

Opis wzorów i rysunków:

Wzór 1: Struktura amfoterycyny B (AMB).

Wzór 2: Struktura 3-dimetyloaminopropyloamidu amfoterycyny B (AMA)

Wzór 3: Struktura 4-metylopiperazynoamidu amfoterycyny B (AMPA)

Wzór 4: Struktura 2-(2-pirydylo)etyloamidu amfoterycyny B (AMPEA)

Wzór 5: Struktura 2-(4-morfolilo)etyloamidu amfoterycyny B (AMMEA)

Wzór 6: Struktura estru metylowego amfoterycyny B (AME)

Wzór 7: Struktura estru 2-dimetyloaminoetylowego amfoterycyny B (AMEE)

Wzór 8: Struktura 4-metylopiperazynohydrazydu amfoterycyny B (HAMA)

Wzór 9: Struktura estru metylowego N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (SAME)

Wzór 10: Struktura estru metylowego N-(1-piperydynopropionylo)amfoteryczny B(PAME)

Wzór 11: Struktura 3-dimetyloaminopropyloamidu N-D-ornityloamfoterycyny B (OAMA)

Rys. 1: Widmo absorpcji AMA (5.10^-6M) przed i po dodaniu oligonukleotydu (ODN, 10^-6 M)

Rys. 2: Widmo absorpcji AME (10^-5 M) przed i po dodaniu oligonukleotydu (ODN, 1,85.10^-6 M)

Rys. 3: Dichroizm kołowy AMA (2x10^-5 M) w obecności (b) i nieobecności (a) pGFP.

Rys. 4: Wpływ AMA samego lub w obecności oligonukleotydu (AS, 20-merowy, 0,5 μΜ) na ży wotność komórek 3T3 traktowanych podczas 4 godzin w temperaturze 37°C.

PL 199 213 B1

Rys. 5: Internalizacja w komórkach 3T3 oligonukleotydu znaczonego fluoresceiną (ODN, 20-merowy), zależnie od tego, czy jest nie wektorowany (A) czy wektorowany przez Lipofectine® (B) lub przez AMA (C i D).

Rys. 6: Internalizacja w komórkach MCF-7 oligonukleotydu znaczonego fluoresceiną (ODN, 20-merowy), zależnie od tego, czy jest nie wektorowany (A) czy wektorowany przez Lipofectine® (B), przez AME (C) lub przez AMA (D).

Rys. 7: Autoradiografia żelu (20% poliakrylamid-mocznik 7M), na którym osadzono ODN w nieobecnoś ci lub obecnoś ci (+/- =10) AMA po róż nych okresach inkubacji (odpowiednio 0,4, 8 i 16 godzin) w buforze Hepes, zawierają cym 10% (obję toś ciowo) surowicy pł odu cielę cego.

Rys. 8: Poziomy ekspresji P-glikoproteiny (P-gp)w komórkach 3T3 R (kolumny 1 i 3-8) lub 3T3 S (kolumna 2) po 48 godzinach traktowania.

Różne próbki do badań sporządzone w pożywce DMEM bez surowicy płodu cielęcego są następujące:

Ślepe próby kontrolne:

1- 3T3 R nie traktowane 2- 3T3 S nie traktowane

Badanie efektu antysensowego:

3- 3T3 R/AS5995 1 μΜ) wektorowany przez Lipofectine® (20 μg/ml)

4- 3T3 R/CTL (^M) wektorowany przez Lipofectine® (20 μg/ml)

6- 3T3 R/AS5995 (1 μM) wektorowany przez AMA (5.10^-6 M)

7- 3T3 R/CTL (1 μM) wektorowany przez AMA (5.10^-6 M)

9- 3T3 R/AS5995 (1 μM) nie wektorowany

Próby kontrolne:

5- 3T3 R/Lipofectine® (20 μg/ml)

8- 3T3 R/AMA (10^-5 M).

P r z y k ł a d 1

Do mieszaniny 22 μl AMA (roztwór macierzysty w DMSO o stężeniu 7x10^-4 M) i 16 μl oligonukleotydu 20-merowego (Genosys Biotechnologies, The Woodland, England, roztwór macierzysty o stężeniu 1,9x10^-4 M w wodzie) dodano 3 ml podłoża RPMI bez czerwieni fenolowej (Gibco BRL, Life Technologies, S.A., Cergy Pontoise, Francja). Roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut. Sekwencję oligonukleotydu (CCATCCCGACCTCGCGCTCC, SEQ ID nr 1) wybrano według Alahari i in. (Alahari, Dean i in.1996) i odpowiada ona oligonukleotydowi antysensowemu skierowanemu przeciw RNA genu MDR1, a więc przeznaczonemu do hamowania ekspresji genu MDR1.

Widma absorpcji tych roztworów zmierzono na spektrofotometrze 8452A Hewlett-Packard UV-widzialne.

Widma zmierzono też, wychodząc z mieszaniny 15 μl AME (roztwór macierzysty w wodzie o stężeniu 10^-2 M), 3 ml buforu PBS o pH 7,4 i 28 μl oligonukleotydu 27-merowego (Genosys Biotechnologies, The Woodland, England, roztwór macierzysty o stężeniu 2xl10^-4 M). Sekwencja tego oligonukleotydu odpowiada oligonukleotydowi antygenowemu skierowanemu przeciw genowi MDR1, to znaczy oligonukleotydowi zdolnemu do hamowania ekspresji genu MDR1 (5'-TGT GTT TTT GTT TTG TTG GTT TTG TTT-3'; SEQ ID nr 2).

Antybiotyki polienowe wykazują specyficzne pasma absorpcji między 300 i 450 nm. W warunkach tego doświadczenia (5x10^-6 M antybiotyku) AME wolny lub AMA wolny wykazuje pasmo w 330 nm i w 420 nm, charakterystyczne dla postaci antybiotyku zasocjowanego i cztery pasma w 345, 365, 385 i 409 nm.

W widmie AMA w obecności oligonukleotydu (10^-6 M) pojawia się tło i natężenie pasm monomerów w 385 i 409 nm zmniejsza się, a pasmo w 330 nm jest zwiększone i przemieszczone w kierunku czerwieni (patrz Rys. 1). Przy AME w obecności oligonukleotydu natężenie pasm w 345 i 420 nm zwiększa się, podczas gdy natężenie pasm w 409 i 385 nm zmniejsza się (patrz Rys. 2). W dwóch przypadkach te zmiany wskazują, że zachodzi oddziaływanie między antybiotykiem i oligonukleotydem i że stan asocjacji antybiotyku jest zmodyfikowany. Widmo oligonukleotydu wokół 255 nm nie zmienia się, jeśli uwzględnia się zwiększenie absorpcji będące wynikiem zwiększenia się tła.

PL 199 213 B1

P r z y k ł a d 2

Do mieszaniny 30 μΐ roztworu macierzystego AMA o stężeniu 10^-3 M w DMSO i 6 μΐ plazmidu pGFP emd-c[R] (Packard, Instrument Company, Meriden, USA, 1 μg/ml) dodano 1,5 ml podłoża RPMI bez czerwieni fenolowej. Roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut. Widma dichroizmu kołowego tych roztworów zmierzono na dichrografie Jobin-Yvon Mark V.

Antybiotyki polienowe wykazują specyficzny dublet wokół 320 nm. W obecności plazmidu pGFP emd-c[R] ten dublet przemieszcza się w kierunku czerwieni i jego natężenie zmniejsza się (patrz Rys. 3). Te właściwości wskazują na oddziaływanie między AMA i plazmidem prowadzącą do modyfikacji stanu asocjacji antybiotyku.

P r z y k ł a d 3

Oligonukleotyd 20-merowy otrzymano z Genosys Biotechnologies (The Woodland, England). Jego sekwencję wybrano według Alahari i in. (1996) i odpowiada ona oligonukleotydowi antysensowemu pozwalającemu na inhibicję ekspresji genu MDR1 (patrz przykład 1). Fibroblasty 3T3 otrzymano w ATCC (American Type Culture Collection).

Toksyczność zmierzono w roztworach zawierających stężenia AMA, wynoszące od 10^-6 M do 5x10^-5 M w obecności lub nieobecności oligonukleotydów przy końcowym stężeniu 10^-4 M. We wszystkich doświadczeniach mieszaninę inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej i utrzymywano w pożywce DMEM bez surowicy. Komórki posiano w pożywce DMEM i umieszczono na mikropłytkach o 96 studzienkach w ilości 4x10⁴ komórek/ml. Po 24 godzinach komórki przemyto pożywką DMEM bez surowicy i dodano na studzienkę 200 μl sporządzonego tuż przedtem roztworu AMA/oligonukleotydy.

Po inkubacji w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C zmierzono żywotność komórek za pomocą testu kolorymetrycznego, stosując MTT według metodologii już opisanej w literaturze (Mosmann, 1983). Wyniki przedstawiono na Rys. 4 i ukazują one, że przy dziesięciokrotności 2x10^-5 M nie zaobserwowano żadnej toksyczności. Ponadto te wyniki pokazują też, że przy dziesięciokrotności 10^-5 M wzrost komórek wydaje się być stymulowany.

P r z y k ł a d 4

Oligonukleotyd 20-merowy znakowany FITC otrzymano z Genosys Biotechnologies (The Woodland, England). Jego sekwencję wybrano według Alahari i in. (1996) i odpowiada ona oligonukleotydowi antysensowemu pozwalającemu na inhibicję ekspresji genu MDR1. Lipofectine® otrzymano z Gibco (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Francja). Lipofectine® użyto jako cząsteczkę odniesienia do przenoszenia oligonukleotydów w stężeniu 20 μg/ml w warunkach polecanych przez producenta. Fibroblasty 3T3 otrzymano z ATCC.

Równe porcje roztworu AMA o stężeniu 5,6x10^-3 M w DMSO zmieszano z 82 μl roztworu oligonukleotydów o stężeniu 2,4x10^-4 M i z pożywką DMEM, aby otrzymać roztwory mające stężenie AMA 1x10^-5 i 2x10^-5 M i końcową objętość 2 ml. Roztwory inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki o 80% zlania w płytkach Petriego (35 mm średnicy) przemyto pożywką bez surowicy i traktowano 2 ml roztworów AMA-oligonukleotydy. Po inkubacji w ciągu 4 godzin komórki przemyto buforem PBS i wykrywano internalizację oligonukleotydu fluoryzującego w mikrospektrofluorymetrze laserowym o wspólnej ogniskowej opracowanym w laboratorium. Długości fal pobudzenia i emisji wyniosły odpowiednio 488 i 520 nm. 30 komórek wybrano losowo i zmierzono ich natężenie fluorescencji. Na Rys.5 pokazano rozkład komórek w zależności od tego natężenia (skala fluorescencji arbitralna). Otrzymane wyniki pokazują, że obserwuje się dużo wyższą internalizację w obecności AMA w porównaniu z obserwowaną w obecności AME, Lipofectine® lub samych oligonukleotydów.

Fluorescencja zjawia się jako rozłożona jednorodnie wewnątrz komórek. Nie zauważono żadnej istotnej różnicy natężenia między jądrem i cytoplazmą.

P r z y k ł a d 5

Oligonukleotyd 27-merowy znakowany FITC otrzymano z Genosys Biotechnologies, The Woodland, England). Jego sekwencja odpowiada oligonukleotydowi antygenowemu pozwalającemu na inhibicję ekspresji MDR1 (patrz przykład 1). Komórki MCF-7 są komórkami ludzkiego raka sutka.

Równe porcje roztworu AME lub AMA o stężeniu 10^-3 M w wodzie zmieszano z 12 μl roztworu macierzystego oligonukleotydów o stężeniu 1,6x10^-4 M i z 1 ml buforu Hepes o stężeniu 10 mM i pH 7,4, aby otrzymać roztwory mające odpowiednie stężenie AME lub AMA 2,7x10^-4 M i 1,35x10^-4 M odpowiednio. Stosunek ładunków dodatnich (związku wektorowego) do ładunków ujemnych (kwasu nu10

PL 199 213 B1 kleinowego) wynosił 5 w dwóch seriach doświadczeń. Wszystkie inne warunki doświadczalne były takie same jak w przykładzie 4.

Rys. 6 pokazuje rozkład komórek w zależności od natężenia fluorescencji (skala fluorescencji arbitralna). Te wyniki pokazują dużo wyższą internalizację w obecności AMA w porównaniu z obserwowaną w obecności AME, Lipofectine® lub wolnych oligonukleotydów.

P r z y k ł a d 6

Oligonukleotyd (ODN) 27-merowy uczyniono radioaktywnym przez znakowanie w 5' za pomocą ³²P zgodnie z procedurą standardową (Pharmacia), stosując T4 polioligonukleotydokinazę i ³²( γ )ATP. Małą ilość tego ODN znakowanego ³²P zmieszano z ODN nieradioaktywnym. Dodano AMA o takim stężeniu, że stosunek ładunków +/- wynosił 10 i pozwolono na tworzenie się kompleksu w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut. Próbka nie zawierająca AMA stanowiła próbę kontrolną (ODN niewektorowany). Degradację ODN zatrzymano w czasie 0 przez dodanie w temperaturze 37°C 10% (objętościowo) surowicy z płodu cielęcego, której aktywność enzymatyczna odpowiada zasadniczo egzonukleazie 3' (Sirotkin, Cooley i in. 1978). Próby, w których zatrzymywano działanie enzymów przez dodanie formamidu i umieszczanie rurki w lodzie wykonywano z upł ywem czasu. Reakcję zatrzymywano po 4, 6, 8 i 16 godzinach inkubacji z surowicą. Nastę pnie próbki analizowano metodą elektroforezy na żelu denaturującym (7 M mocznik) z 20% poliakrylamidu.

Autoradiografia żelu ujawnia (Rys.7), że degradacja wobec surowicy oligonukleotydu niewektorowanego jest bardzo szybka, w istocie w czasie 4 godzin początkowa postać 27-merowa zniknęła całkowicie na korzyść bardzo krótkich produktów degradacji. Przeciwnie, wektorowanie przez AMA pozwala na zwolnienie tej degradacji: zaczyna się ona dopiero 16 godzinach i główną formą jest jeszcze niezmieniona forma 27-merowa.

Te wyniki pokazują, że związki według wynalazku pozwalają na zabezpieczenie kwasów nukleinowych przed zniszczeniem przez surowicę.

P r z y k ł a d 7

Komórki NIH MDR-G185 są fibroblastami mysimi 3T3 transfekowanymi przez plazmid zawierający ludzki gen MDR1 (pSK1 MDR). Stąd komórki wykazują nadekspresję glikoproteiny P(P-gp) i wykazują więc fenotyp o oporności wielolekowej. Ten przykład pokazuje, że można zahamować ekspresję tego białka przez zastosowanie oligonukleotydofosforotionianu antysensowego (AS5995), którego celem molekularnym jest RNA informacyjny, kodujący P-gp (Alahari, Dean i in.1996)

Aby tego dokonać, posiano komórki 3T3 R (oporne) i 3T3 S (wrażliwe, nie transfekowane) w płytkach Petriego w pełnej pożywce DMEM. Po 24 godzinach, gdy osiągnęły one 80-90% zlania, dodano AS5995 i pozostawiono na 48 godzin. Wszystkie próbki traktowane wytworzono w pożywce DMEM bez surowicy z płodu cielęcego.

Po 48 godzinach ilość glikoproteiny P obliczono metodą western-blot za pomocą przeciwciała monoklonalnego C219 (Dako S.A.,Trappes, Francja). To przeciwciało IgG 2A kappa z myszy rozpoznaje epitop wewnątrzkomórkowy zlokalizowany w C-terminalnej części glikoproteiny P.

Przystąpiono najpierw do ekstrakcji białek. Do komórek zawartych w każdej płytce Petriego dodano trypsynę, przemyto buforem PBS i odwirowano. Dodano do każdego osadu komórkowego

100 μΐ buforu RIPA do lizy, gdzie tuż przedtem dodano inhibitory proteaz. Lizę wykonano w lodzie w ciągu 30 minut, obracając co 5 minut. Następnie mieszaninę odwirowano przy 12000 obrotach na minutę, w temperaturze 4°C w ciągu 15 minut i odzyskano supernatant zawierający ekstrahowane białka.

Stężenie całkowitych białek określono metodą Bradforda. Sporządzono próbki zawierające jednakową ilość (40 mg) całkowitych białek. Następnie próbki analizowano metodą elektroforezy na żelu liniowym SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electroforesis) przy stężeniu końcowym poliakryloamidu wynoszącym 7,5%.

Po zakończeniu migracji białka przeniesiono na membranę z celulozy (Immobilon-P, Millipore). Membranę inkubowano w ciągu 1 godziny w buforze blokującym (5% mleko odciągnięte, 0,05% TBS Tween) w celu nasycenia miejsc niespecyficznych. Następnie dodano przeciwciało C219 anty-P-gp rozcieńczone 1/200 w buforze blokującym w ciągu 2 godzin. Po dwóch przemyciach 0,05% TBS Tween wykonano ostatnią inkubację z drugim przeciwciałem połączonym z peroksydazą w ciągu 1 godziny. Jest to immunoglobulina kozy i antyimmunoglobulina myszy (Dako

S.A., Trappes, Francja), stosowana w warunkach nasycenia (rozcieńczenie 1/5000) w buforze blokującym.

PL 199 213 B1

Po 3 przemyciach za pomocą 0,05% TBS Tween i przemyciu Tris-HCl (pH 8), wywołano elektroforegramy przez chemoluminescencję (zestaw ECL, Amersham). Ilość P-gp jest proporcjonalna do natężenia plamki.

Otrzymane wyniki przedstawiono na Rys.8. Te wyniki pokazują, że AS5995 istotnie hamuje ekspresję P-gp, gdy jest wektorowany przez Lipofectine®, wektor służący jako odniesienie (kolumna 3) lub przez AMA w stężeniu 5.10^-6 M (kolumna 6), podczas gdy jest nieaktywny w nieobecności wektora (wynik tutaj nieprzedstawiony). Oligonukleotyd kontrolny (ta sama sekwencja jak AS5995, ale na odwrót) jest nieaktywny z dowolnym użytym wektorem (kolumna 4 i 7).

P r z y k ł a d 8

Do 1 mmola (0,923 g) amfoterycyny B rozpuszczonego w 50 ml DMF, dodano mieszając 10 mmoli (1,31 ml) 4-(2-aminoetylo)morfoliny, 10 mmoli (2,3 ml) azydofosforanu difenylu (DPPA) i 10 mmoli (1,38 ml) trietyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji dodano nadmiar eteru dietylowego dla wytrącenia surowego produktu. Odwirowano go, przemyto eterem dietylowym, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w n-butanolu nasyconym wodą. Warstwę n-butanolu przemyto kilka razy wodą i odparowano do małej objętości. Surowy produkt następnie wytrącono nadmiarem eteru dietylowego, odwirowano, przemyto kilka razy eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Czysty 2-(4-morfolilo)etyloamid amfoterycyny B (AMMEA) wydzielono na drodze chromatografii kolumnowej przy użyciu żelu krzemionkowego 60, 70-230 mesh, stosując układ rozpuszczalników CHCl3-MeOH-H2O, 10:6:1. Otrzymano tak 0,40 g (38,6%) czystego amidu (E^1%1cm = 1150 przy α = 382 nm w MeOH).

P r z y k ł a d 9

Do roztworu 1 mmola (0,923 g) amfoterycyny B w 40 ml DMF schłodzonego do temperatury 0°C, dodano mieszając 10 mmoli (1,2 ml) 2-(2-aminoetylo)pirydyny, 10 mmoli (2,3 ml) azydofosforanu difenylu (DPPA) i 10 mmoli (1,38 ml) trietyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Surowy produkt wydzielono z mieszaniny reakcyjnej, jak opisano w przykładzie 8.1. Dla oczyszczenia surowego produktu rozpuszczono go w mieszaninie H2O-MeOH (1:2) i załadowano na kolumnę z celulozą CM-52, przemyto rozpuszczalnikiem i eluowano 5% roztworem trietyloaminy w MeOH2O (2:1). Po odparowaniu do sucha rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość rozpuszczono w małej objętości DMF i dodano eter dietylowy dla wytrącenia pochodnej. Odwirowano ją, przemyto eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano tak 0,37 g (36%) 2-(2-pirydylo)etyloamidu amfoterycyny B (AMPEA) (E^1%1cm = 850 przy α = 382 nm w MeOH).

P r z y k ł a d 10 mmol (0,923 g) amfoterycyny B w 50 ml DMF poddano reakcji z 10 mmolami (1,11 ml) 1-metylopiperazyny, stosując reagenty i warunki opisane w przykładzie 8.2. Oczyszczanie końcowej pochodnej wykonano, jak opisano w przykładzie 8.2. Otrzymano tak 0,40 g (40%) 4-metylopiperazynoamidu amfoterycyny B (AMPA) (E^1%1cm = 1000 przy α = 382 nm w MeOH).

P r z y k ł a d 11

0,5 mmola (0,462 g) amfoterycyny B zawieszono w 30 ml 2-dimetyloaminoetanolu przy silnym mieszaniu w temperaturze 40°C i dodano 2,5 mmola (0,519 mg) dicykloheksylokarbodiimidu. Po 5 godzinach dodano małą objętość DMF dla sklarowania roztworu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 24 godzin w temperaturze 40°C. Następnie oddzielono osad dicykloheksylomocznika przez filtrację, przemyto małą objętością DMF i do przesączu dodano nadmiar eteru dietylowego, wytrącając oleistą pozostałość. Tę pozostałość odwirowano, przemyto eterem i oczyszczono na drodze chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym zgodnie z opisem z przykładu 8.1 lub na drodze chromatografii jonowymiennej na celulozie CM-52 zgodnie z opisem z przykładu 8.2. Otrzymano tak 100 mg (20%) estru 2-dimetyloaminoetylowego amfoterycyny B (AMEE) (E^1%1cm - 1010 przy α = 382 nm w MeOH).

P r z y k ł a d 12

0,5 mmola N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (0,552 g) rozpuszczonego w 40 ml DMF ochłodzono w łaźni z lodem do temperatury 0-2°C. Dodano roztwór diazometanu w eterze dietylowym w stosunku 2,5 mmola CH2N2:1 mmol substratu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1-2 godziny w temperaturze 0°C. Po zakończeniu reakcji nadmiar diazometanu rozłożono kwasem octowym i eter dietylowy odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie produkt wytrącono eterem, odwirowano, przemyto eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano tak 0,531 g (95%) estru metylowego N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (SAME) (E^1%1cm = 950 przy 382 nm w MeOH).

PL 199 213 B1

P r z y k ł a d 13

0,75 mmola (0,117 g) kwasu 1-piperydynopropionowego, 0,75 mmola (0,155 g) dicykloheksylokarbodiimidu i 0,75 mmola (0,086 g) N-hydroksysukcynoimidu rozpuszczono w 15 ml DMF i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej . Po zakończeniu reakcji odsączono osad dicykloheksylomocznika, który przemyto małą objętością DMF i następnie przesącz dodano do 20 ml roztworu DMF, zawierającego 0,375 mmola (0,346 g) amfoterycyny B i 0,375 mmola (0,055 ml) trietyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym dodano nadmiar eteru dietylowego, wytrącając żółty osad. Osad odwirowano, przemyto kilka razy eterem dietylowym i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany surowy produkt rozpuszczono w 20 ml DMF, po czym poddano reakcji metylowania przy użyciu roztworu diazometanu w eterze dietylowym, jak opisano w przykładzie 10. Oczyszczanie wykonano na drodze chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym przy użyciu układu rozpuszczalników CHCl3-MeOH-H2O (10:6:1). Otrzymano tak 0,16 g (39,7%) estru metylowego N-(1-piperydynopropionylo)amfoterycyny B (PAME) (E^1%1cm = 1080 przy 382 nm w MeOH).

P r z y k ł a d 14

Do 0,5 mmola 3-dimetyloaminopropyloamidu amfoterycyny B (0,503 g) w 20 ml DMF dodano w temperaturze 0°C 1 mmol (0,576 g) NLN^diFmoc-D-ornityny, 1,25 mmola azydofosforanu difenylu (0,27 ml) i 1,25 mmola trietyloaminy (0,17 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji Fmoc chronioną pochodną amfoterycyny B wytrącono nadmiarem eteru dietylowego, odwirowano, przemyto kilka razy eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Żółty osad rozpuszczono w małej objętości DMF i mieszając dodano 0,9 mmola (0,11 ml) 1,5-diazabicyklo[4.3.0]non-5-enu (DBN) w 2 ml MeOH w temperaturze 0°C w celu usunięcia grupy ochronnej Fmoc. Po 2 godzinach dodano eter dietylowy, aby wytrącić surowy produkt, który następnie odwirowano, przemyto kilka razy eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono na drodze chromatografii jonowymiennej z zastosowaniem celulozy CM-52 zgodnie z opisem podanym w przykładzie 8.2. Otrzymano tak 0,18 g (32%) 3-dimetyloaminopropyloamidu N-D-ornityloamfoterycyny (OAMA) (E^1%1cm =720 przy 382 nm w MeOH).

P r z y k ł a d 15

Do 0,2 mmola (0,227 g) OAMA w małej objętości wody wkroplono mieszając 0,6 mmola (0,08 g) kwasu L-asparaginowego w 3 ml wody. Następnie dodano nadmiar acetonu aż do wytrącenia żółtego osadu. Po odwirowaniu, przemyciu acetonem, potem eterem dietylowym i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 0,29 g (94,4%) L-asparaginianu OAMA (E^1%1cm =700 przy 382 nm w mieszaninie H2O/MeOH (1:1).

P r z y k ł a d 16

Przykład ten pokazuje, że kationowe pochodne amfoterycyny B według wynalazku wykazują, poza swą zdolnością do wektorowania cząsteczek, aktywność przeciwgrzybową.

Aktywność przeciwgrzybową związków opisanych w przykładach 8-12 badano w stosunku do szczepu Candida albicans. Każdy związek inkubowano w różnych stężeniach z hodowlą Candida albicans ATCC10261 (inokulum 4.10³ komórek/ml) w pożywce płynnej Sabouraud'a przez 24 godziny w temperaturze 30°C. Następnie wzrost komórek mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 660 nm.

Aktywność przeciwgrzybową wyrażono jako IC50, to znaczy jako stężenie każdego testowanego produktu powodujące 50% zahamowania wzrostu komórek Candida albicans. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli.

Związek	IC50 (μg/ml)
AMMEA (przykład 8)	0,013
AMPEA (przykład 9)	0,075
AMPA (przykład 10)	0,015
AMEE (przykład 11)	0,080
SAME (przykład 12)	0,125
PAME (przykład 13)	0,15
OAMA (przykład 14)	0,15
L-asparaginian OAMA (przykład 15)	0,17

PL 199 213 B1

BIBLIOGRAFIA

S.K.Alahari, N.M. Dean i in., (1996), Inhibition of expression of the multidrug resistance-associated P-glycoprotein of phosphorothioate and 5'cholesterol-conjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides, Mol. Pharmacol. 50:808-819

A.Binet, J.Bolard, (1988), „Recovery of hepatocytes from attack by the pore former amphotericin B,

Biochem.J. 253:435-440

J.Brajtburg, W.G.Powderly i in., (1990) „Amphotericin B: current understanding of mechanisms of action, Antimicrob.Ag.Chemother 34:183-188

M. Cheron, B.Cybulska i in. (1988), „Quantitative structure-activity relationships in amphotericin B derivatives, Biochem. Pharmacol 37:627-836

A.Czerwiński, W.A. Konig i in. (1991), „New N-alkyl derivatives of amphotericin B. Synthesis and biological properties, J.Antibiotics 44:979-984

L.Falkowski, B.Stefańska i in. (1979), „Methyl esters of trimethylammonium derivatives of polyene macrolide antibiotics, J.Antibiotics 31:1080-1081

J. Grzybowska, E.Borowski i in. (1990), „Hydrazides - a novel type of derivatives of polyene macrolide antifungal antibiotics, J.Antibiotics 43:907-908

S. Hartsel and J.Bolard (1996), ,Amphotericin B: New Life of an Old Drug, TIPS 17:445-449

K. Hidaka, G.An i in.(1985), „Amphotericin B enhances efficiency of DNA-mediated gene transfer in mammalian cells, Somatic Cell and Molecular Genetics 11(2):109-115

A. Jarzębski, L.Falkowski i in. (1982) „Synthesis and structure-activity relationships of amides of Amphotericin B, J. Antibiotics 35(2):220-229

B. V.Kumar, G.Medoff i in. (1974), „Uptake of Echerichia coli DNA into HeLa cells enhanced by amphotericin B, Nature 250:323-325

J-Y.Legendre and F.C.Szoka Jr (1993), „Cyclic amphipatic peptide-DNA complexes mediate high efficiency transfection of adherent mammalian cells, PNAS 90:893-897

J-Y.Legendre, J.Haensler i in. (1996), „Non-viral gene delivery systems, MS Med.Sci.12(12):

1334-1341

J-Y.Legendre, ATrzeciak i in. (1997), „Dioleoylmelittin as a novel serum-insensitive reagent for efficient transfection of mammalian cells, Bioconjugate Chemistry 8(1):57-63

B.Malewicz, H.M.Jenkin i in. (1980), „Dissociation between the induction of potassium efflux and cytostatic activity of polyene macrolides in mammalian cells, Antimicrob.Ag.Chemother.17:699-706

B.Mechlinski and C.Schaffner (1972),Polyene macrolide derivatives I. N-acylation and esterification reactions with Amphotericin B, J. Antibiotics 25(4):256-258

T. Mosmann (1983), Rapid colometric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 16:55-63

N. Ohmori, T.Niidome i in.(1997), „The enhancing effect of anionie alpha-helical peptide on cationic peptide-mediating transfection systems, Biochem. Biophys. Res. Commun. 235(3):726-729

K.Sirotkin, W.Cooley i in. (1978), A role in true-late gene expression for the T4 bacteriophage 5' polynucleotide khiase 3'phosphatase, J. Mol. Biol. 123:221-233

J.J.K.Wright, J.A.Albarella i in. (1982), „N-aminoacyl derivatives polyene macrolide antibiotics and their esters, J. Antibiotics 35:911-914

T.B.Wyman, F.Nicol i in. (1997), „Design, synthesis and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers, Biochemistry 36(10):3008-3017

Claims (14)

1. Kompozycja wektorująca cząsteczki kwasów nukleinowych zawierająca kwas nukleinowy oraz kationową pochodną antybiotyku amfoterycyny B z grupy makrolidów polienowych zdolną do oddziaływania z kwasem nukleinowym.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas nukleinowy jest oligonukleotydem antysensowym, antygenowym lub genem.

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że kationowa pochodna amfoterycyny B zawiera jedną lub kilka funkcyjnych grup kationowych.

PL 199 213 B1

4. Kompozycja wed ł ug zastrz. 3, znamienna tym, ż e kationowa pochodna amfoterycyny B jest pochodną estrową, amidową, hydrazydową, N-alkilową lub N-aminoacylową.

5. Kompozycja wedł ug zastrz. 3, znamienna tym, ż e kationowa pochodna amfoterycyny B zawiera jedną lub więcej reszt kationowych związanych kowalencyjnie z grupą karboksylową lub aminową antybiotyku bądź z obiema tymi grupami naraz.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że kationowymi pochodnymi amfoterycyny B korzystnie są: 3-dimetyloaminopropyloamid amfoterycyny B (AMA) o wzorze 2, 4-metylopiperazynoamid amfoterycyny B (AMPA) o wzorze 3, 2-(2-pirydylo)etyloamid amfoterycyny B (AMPEA) o wzorze 4, 2-(4-morfolilo)etyloamid amfoterycyny B (AMMEA) o wzorze 5, 4-metylopiperazynohydrazyd amfoterycyny B (HAMA) o wzorze 8, ester metylowy N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (SAME) o wzorze 9, ester metylowy N-(1-piperydynopropionylo)amfoterycyny B (PAME) o wzorze 10, ester metylowy amfoterycyny B (AME) o wzorze 6, ester 2-dimetyloaminoetylowy amfoterycyny B (AMEE) o wzorze 7, 3-dimetyloaminopropyloamid N-D-ornityloamfoterycyny B (OAMA) o wzorze 11.

7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ilości kationowej pochodnej amfoterycyny B i kwasu nukleinowego są tak dobrane, aby stosunek ładunków dodatnich pochodnej do ładunków ujemnych kwasu nukleinowego wynosił od 0,1 do 20.

8. Nowe pochodne kationowe amfoterycyny B: 2-(2-pirydylo)etyloamid amfoterycyny B (AMPEA) o wzorze 4, 2-(4-morfolilo)etyloamid amfoterycyny B (AMMEA) o wzorze 5, 4-metylopiperazyno-amid amfoterycyny B (AMPA) o wzorze 3, ester 2-dimetyloaminoetylowy amfoterycyny B (AMEE) o wzorze 7, ester metylowy N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (SAME) o wzorze 9, ester metylowy N-(1-piperydynopropionylo)amfoterycyny B (PAME) o wzorze 10, 3-dimetyloaminopropyloamid N-D-ornityloamfoterycyny B (OAMA) o wzorze 11.

9. Sole nowych kationowych pochodnych amfoterycyny B: 2-(2-pirydylo)etyloamid amfoterycyny B (AMPEA) o wzorze 4, 2-(4-morfolilo)etyloamid amfoterycyny B (AMMEA) o wzorze 5, 4-metylopiperazynoamid amfoterycyny B (AMPA) o wzorze 3, ester 2-dimetyloaminoetylowy amfoterycyny B (AMEE) o wzorze 7, ester metylowy N-(N',N'-3-dimetyloaminopropylosukcynoimido)amfoterycyny B (SAME) o wzorze 9, ester metylowy N-(1-piperydynopropionylo)amfoterycyny B (PAME) o wzorze 10, 3-dimetyloaminopropyloamid N-D-ornityloamfoterycyny B (OAMA) o wzorze 11, korzystnie asparaginiany.

10. Sposób wytwarzania kompozycji wektorującej cząsteczki kwasów nukleinowych, jak określono w zastrz. 1, znamienny tym, że w roztworze soli, buforu, podłoża DMEM lub RPMI doprowadza się do skontaktowania cząsteczki kationowej pochodnej amfoterycyny B i cząsteczki kwasu nukleinowego, a następnie inkubuje się w temperaturze pokojowej w czasie od 15 minut do 2 godzin.

11. Kompozycja wektorująca cząsteczki kwasów nukleinowych, jak określono w zastrz. 1, do zastosowania jako środek do przenoszenia cząsteczek kwasów nukleinowych do komórek ssaków, pierwotniaków i grzybów.

12. Zastosowanie kompozycji wektorującej cząsteczki kwasów nukleinowych, jak określono w zastrz. 1, do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia chorób metodami strategii antysensowej i/lub terapii genowej.

13. Nowe pochodne kationowe amfoterycyny B, jak określono w zastrz. 8, do zastosowania jako środki przeciwgrzybowe.

14. Zastosowanie nowych pochodnych kationowych amfoterycyny B, jak określono w zastrz. 8, i ich soli, jak okreś lono w zastrz. 9, do wytwarzania leku dla leczenia chorób spowodowanych przez patogenne grzyby.