ES2204114T3 - Derivados de macrolidas polienicos, utilizacion para la vectorizacion de moleculas. - Google Patents
Derivados de macrolidas polienicos, utilizacion para la vectorizacion de moleculas.Info
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Abstract
Composición consistente en: - una molécula de interés negativamente cargada y - un compuesto macrólido poliénico catiónico susceptible de interaccionar con dicha molécula.
Description
Derivados de macrólidas poliénicos, utilización
para la vectorización de moléculas.
La presente invención se relaciona con el campo
de la biología y, en particular, de la transferencia de compuestos
en las células. Se relaciona más concretamente con nuevos vectores y
composiciones para la transferencia de moléculas de interés, en
particular de ácidos nucleicos, en las células in vitro,
ex vivo o in vivo. La presente invención posee
numerosas aplicaciones en los campos de la biología experimental, de
la clínica o de la medicina.
La posibilidad de transferir eficazmente
moléculas de interés en las células constituye uno de los retos
principales en el desarrollo de la biología y de las
biotecnologías. Esta transferencia permite, por ejemplo, la
realización in vitro de experimentaciones biológicas o
bioquímicas (estudio de la regulación de la expresión de los genes,
mutagénesis, creación de plásmidos, estudios genómicos, etc.), la
producción de proteínas o de péptidos recombinantes, especialmente
de interés farmacéutico o agroalimentario, o también la producción
de virus recombinantes. Esta transferencia permite, ex vivo
o in vivo, la realización de estudios de marcaje, de
biodisponibilidad o de expresión tisular, la creación de animales
transgénicos que expresan genes extraños, por ejemplo, o también
aplicaciones biológicas o médicas (vacunaciones, terapias,
etc.).
Es, pues, particularmente importante poder
disponer de un sistema de transferencia de moléculas de interés que
sea aplicable a las poblaciones de células contempladas y no tóxico
para las células o los organismos utilizados.
Se han desarrollado diferentes aproximaciones en
la técnica anterior para transferir moléculas de interés en las
células. Se trata, por ejemplo, de vectores de origen vírico, cuya
eficacia de transferencia de ácidos nucleicos en las células es
notable. No obstante, este tipo de vectores presenta igualmente
ciertos inconvenientes potenciales, particularmente ligados a su
preparación, inocuidad, capacidad de clonación, etc.
Paralelamente a estos vectores víricos, se han
avanzado numerosos sistemas sintéticos para la vectorización (es
decir, la transferencia) de moléculas de interés, especialmente de
ácidos nucleicos. Estos sistemas sintéticos son, la mayor parte de
las veces, catiónicos para interaccionar con los ácidos nucleicos,
que están cargados negativamente (Legendre, 1996). Sin embargo, en
la mayoría de los casos (polilisina, polímeros catiónicos,
poliaminas, etc.), se considera que los complejos de ácidos
nucleicos/vectores penetran por endocitosis, lo que plantea un
problema (i) de ensanchamiento ulterior de los ácidos nucleicos
fuera de las vesículas de endocitosis con el fin de alcanzar su
objetivo y (ii) de degradación de los ácidos nucleicos en estos
compartimentos celulares. Además, estos sistemas no siempre aportan
una eficacia satisfactoria in vitro.
Para remediar este problema, se ha propuesto
añadir diferentes adyuvantes a las formulaciones iniciales, de forma
que se interrumpa la endocitosis y se permita una liberación
directa del ácido nucleico en el citoplasma. Los autores contemplan,
en general, un mecanismo de entrada por fusión de estos complejos
con las membranas endosómicas o plasmáticas (o por desestabilización
transitoria de estas membranas). Son muy utilizados, por ejemplo,
péptidos de fusión o dioleoilfosfatidilcolina ("DOPE").
Recientemente, se han contemplado efectores que inducen
específicamente una permeabilidad de membrana. Se trata primeramente
de la gramicidina S (o de la tirodicina) asociada a vesículas de
DOPE (Legendre y Szoka, 1993), formulación no obstante inactiva en
presencia de suero. Se encuentra también un péptido que perturba la
permeabilidad de membrana a pH bajo, asociado a otro péptido
anfifílico (Ohmori, BBRC, 1997). Esta formulación es menos activa
que Lipofectine®, compuesto de referencia, y presenta una toxicidad
no desdeñable.
Estas últimas formulaciones presentan además el
inconveniente de tener varios compuestos, lo que da mezclas
heterogéneas e inestables en los fluidos biológicos.
Por lo que se refiere a sistemas de un solo
compuesto, existe, siempre con el fin de actuar sobre la
permeabilidad celular, un péptido anfipático catiónico (Wyman,
1997) susceptible de provocar la fuga a través de la membrana a pH
bajo que se encuentra en los endosomas. También está la
dioleoilmelitina (Legendre, 1997), que presenta la ventaja de ser
activa en presencia de suero.
A pesar de los esfuerzos realizados, los sistemas
descritos en la técnica anterior presentan inconvenientes ligados a
una débil actividad in vivo, efectos secundarios in
vivo, espectros de actividad estrechos in vitro y/o
costes prohibitivos.
La presente invención se relaciona con un nuevo
sistema de vectorización de moléculas de interés en las células. El
sistema de la invención está adaptado a la vectorización (a la
transferencia) en las células de moléculas cargadas negativamente,
más en particular de ácidos nucleicos.
El sistema de la invención se basa más
concretamente en la puesta a punto y/o en la utilización de
compuestos que comprenden una parte catiónica, susceptible de
interaccionar con las moléculas de interés de carga negativa, y una
parte activa particular que permite la transferencia en las células.
Más concretamente, los compuestos utilizados en la presente
invención son compuestos macrólidos poliénicos catiónicos, que
incluyen antibióticos macrólidos y sus derivados (en particular
catiónicos).
\newpage
Las composiciones según la invención presentan la
ventaja de una preparación simple, débil toxicidad, actividad
conservada en presencia de suero, buena eficacia y compatibilidad
con un uso farmacéutico.
La presente invención describe también nuevos
compuestos derivados de antibióticos macrólidos poliénicos (tales
como la anfotericina B) utilizables especialmente para la
vectorización de moléculas de interés o como agente(s)
antifúngico(s).
La presente invención aporta, pues, una
alternativa a los sistemas descritos en la técnica anterior para
vectorización de moléculas de interés.
Un primer objeto de la invención consiste, por lo
tanto, en una composición que comprende:
- una molécula de interés cargada negativamente
y
- un compuesto macrólido poliénico catiónico
susceptible de interaccionar con dicha molécula.
Como se ha indicado anteriormente, la invención
contempla compuestos o composiciones que permiten la transferencia
en las células de "moléculas de interés". Se trata
esencialmente de moléculas cargadas negativamente, teniendo en
cuenta el carácter catiónico de los compuestos de vectorización
utilizados. Se pueden citar, a modo de ejemplo de tales moléculas
cargadas negativamente, proteínas, péptidos o polipéptidos, los PNA
o los ácidos nucleicos, por ejemplo.
Se trata ventajosamente de ácidos nucleicos. A
este respecto, los ácidos nucleicos pueden ser ácidos
desoxirribonucleicos (ADN) o ribonucleicos (ARN). Tratándose de
ADN, se pueden citar ADN complementario, genómico, sintético o
semisintético. Los ARN pueden ser ARN mensajeros, de transferencia,
ribosómico o sintético. Los ácidos nucleicos pueden ser de origen
humano, animal, vegetal, vírico, bacteriano o artificial, por
ejemplo. Se puede tratar de oligonucleótidos (que tengan, por
ejemplo, una longitud comprendida entre 3 y
80-meros) o de fases codificantes, genes, regiones
genómicas o cromosomas enteros. Se puede tratar de ácidos nucleicos
de cadena sencilla o doble. Se puede tratar, en particular, de
ácidos nucleicos antisentido (o antigén), es decir, capaces de
interferir, por hibridación, con la actividad de un gen o de un ARN
o de una región genómica particular. Puede tratarse igualmente de
ácidos nucleicos que comprenden una región codificante para un
producto peptídico de interés (un polipéptido o proteína que tenga
una actividad biológica interesante desde el punto de vista
inmunológico, farmacéutico o alimentario). Además, estos ácidos
nucleicos pueden estar en forma de plásmido, lineal o circular.
Los ácidos nucleicos pueden ser obtenidos por
cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la materia,
tales como síntesis artificial, selección de bancos, aislamiento a
partir de plásmidos, etc., así como por cualquier combinación de
estas técnicas clásicas o de cualquier otra técnica de biología
molecular.
La molécula cargada negativamente puede también
ser una proteína, un polipéptido o un péptido, en particular un
péptido antigénico.
Como se ha indicado antes, el sistema de la
invención se basa ventajosamente en la utilización de antibióticos
macrólidos poliénicos y de derivados (en particular catiónicos) de
éstos.
La familia de los antibióticos macrólidos
poliénicos incluye esencialmente dos grupos: los compuestos
macrólidos poliénicos aromáticos y los compuestos macrólidos
poliénicos no aromáticos. Los primeros son frecuentemente aislados
de microorganismos en una forma que lleva una cierta carga neta
positiva a pH neutro. Entre éstos, se pueden citar, en particular,
los compuestos macrólidos heptaénicos siguientes: hamicina,
tricomicina, candicidina, vacidina A (sin. partricina B),
gedamicina (sin. partricina A) o también la perimicina,
especialmente la perimicina A. Los compuestos del segundo grupo (no
aromáticos) son compuestos zwitteriónicos y, por lo tanto,
globalmente neutros, a excepción de la lienomicina. En este segundo
grupo, entra, en particular, la anfotericina B. La anfotericina B es
habitualmente utilizada en clínica como antifúngico en forma de
Fungizone® (anfotericina B asociada a desoxicolato). La anfotericina
B es además conocida por interaccionar con las membranas que
contienen esteroles y formar, a una concentración subletal, poros
transmembrana tanto en las células fúngicas como, a una
concentración más alta, en las células de mamíferos (Hartsel y
Bolard, 1996).
No obstante, no se ha descrito nunca la
utilización de estos compuestos macrólidos poliénicos o de derivados
catiónicos de éstos, en particular de compuestos macrólidos
heptaénicos catiónicos, para la vectorización de moléculas de
interés.
En particular, muchos de los antibióticos
macrólidos poliénicos están globalmente no cargados y, por ello, no
pueden permitir la realización de un complejo de ácido
nucleico/vector. Tal es el caso, por ejemplo, de la anfotericina B,
que, como tal, no parece capaz de interaccionar con los ácidos
nucleicos. La presente invención muestra ahora que es posible
utilizar compuestos macrólidos poliénicos, naturales, sintéticos o
semisintéticos, portadores de un grupo con carga positiva para la
transferencia de moléculas negativas, especialmente de ácidos
nucleicos. La presente invención muestra, en particular, que es
posible utilizar derivados de compuestos macrólidos poliénicos,
tales como la anfotericina B, por ejemplo, para formar complejos
con ácidos nucleicos y que estos complejos pueden ser vectorizados
eficazmente en las células, es decir, que (i) se establece una
unión electrostática entre este compuesto macrólido y las cargas
negativas del ácido nucleico y (ii) la parte poliénica del complejo
conserva su actividad transmembrana.
La presente invención muestra también que tales
complejos permiten proteger los ácidos nucleicos de la degradación
por el suero y, por lo tanto, aumentar la eficacia de la
transferencia en condiciones de suero, especialmente in vivo
o ex vivo.
Según un modo particular de realización, la
invención se relaciona con una composición tal como se ha definido
antes en donde el compuesto macrólido poliénico catiónico es un
antibiótico macrólido heptaénico aromático. Ventajosamente, el
compuesto es la perimicina.
Según otro modo particular de realización, la
invención se relaciona con una composición tal como se ha definido
anteriormente en donde el compuesto macrólido poliénico catiónico es
un derivado de antibiótico macrólido poliénico que contiene uno o
varios grupos funcionales catiónicos.
El término "derivado" representa en el
sentido de la invención cualquier forma modificada químicamente por
introducción de al menos un grupo funcional catiónico.
Además, la expresión "grupo funcional
catiónico" incluye cualquier grupo susceptible de hacerse
catiónico por protonación, según el medio utilizado (en particular,
el pH del medio), así como cualquier grupo portador de una o varias
cargas positivas permanentes. Como se ha indicado anteriormente, el
o los compuestos utilizados en el marco de la presente invención son
susceptibles de interaccionar con la molécula de interés debido a
la presencia de grupos funcionales catiónicos. Estos grupos están
generalmente unidos de manera covalente sobre el compuesto macrólido
poliénico. La función catiónica de los compuestos utilizados en la
invención puede estar compuesta más en particular por cualquier
grupo cargado positivamente susceptible de interaccionar con la o
las moléculas de interés. La expresión "susceptible de
interaccionar" significa que la parte catiónica puede asociarse
con la molécula de interés aniónica, especialmente un ácido
nucleico. La interacción entre los compuestos y el ácido nucleico
es esencialmente una interacción iónica, no covalente, de tipo
unión electrostática, que se establece entre las cargas positivas de
la parte catiónica del compuesto y las cargas negativas de la
molécula de interés (ácido nucleico). A esta interacción iónica se
le pueden sumar interacciones de tipo van der Waals o hidrofóbicas.
El carácter no covalente de la interacción es ventajosa en la
medida que permite la disociación del complejo en la célula y, por
lo tanto, la liberación de las moléculas de interés en las células.
Además, este tipo de unión permite una utilización simplificada, ya
que es suficiente poner en contacto los compuestos y las moléculas
de interés para formar los complejos.
A diferencia de los sistemas en los cuales el
ácido nucleico está directamente unido a la parte activa del efector
transmembrana y deben, pues, inhibir su especificidad, la presente
invención describe una formulación en la que el ácido nucleico está
unido al vector, también de una manera electrostática, pero deja
libre la parte activa, lo que permite mantener intacta su eficacia.
Además, a las concentraciones utilizadas, la actividad
permeabilizante obtenida con las composiciones de la invención es,
sin duda, transitoria y no debe ser tóxica para la célula.
Más preferiblemente, en las composiciones de la
invención, el compuesto es un derivado de antibiótico macrólido
heptaénico. Se trata, más en particular, de un derivado catiónico de
la anfotericina B, de la candidina, de la micoheptina o de la
vacidina. Puede tratarse también de un derivado de la nistatina.
Más preferiblemente aún, el compuesto es un derivado de antibiótico
macrólido heptaénico no aromático, preferiblemente un derivado de
la anfotericina B.
Preferiblemente, el compuesto utilizado lleva al
menos dos cargas positivas. Los grupos funcionales cargados
positivamente que pueden estar unidos a los compuestos macrólidos
poliénicos son, por ejemplo, ésteres, (poli)amidas,
hidrazida, poliaminas, N-alquilo,
N-aminoacilo, polilisinas, guanidinas o
combinaciones de éstos, o, más en general, cualquier grupo
hidrocarbonado que posea una o varias cargas positivas, que pueden
ser aportadas especialmente por átomos de nitrógeno. Se pueden
citar, a modo de ejemplos específicos de parte catiónica adaptada
para los compuestos de la invención, los grupos éster alquílico
(por ejemplo, éster metílico, etílico o propílico), alquilamonio
(especialmente trimetilamonio), lisilo, ornitilo, guanidino,
amídico o espermídico.
El o los grupos funcionales catiónicos pueden
estar unidos al compuesto macrólido en diferentes posiciones. En un
primer modo de realización, la parte catiónica es introducida sobre
una función amina del macrólido poliénico y, en particular, sobre
la función amina del grupo micosamina de la molécula. En otro modo
de realización, la parte catiónica es introducida sobre la función
ácido carboxílico del grupo aglicona de la molécula. Es además
posible introducir la parte catiónica por modificación de estas dos
posiciones de la molécula (véase Schnaffner y col. (1987),
incorporado a la presente invención como referencia, así como los
ejemplos que siguen). También se entiende que la parte catiónica
puede ser insertada en otras posiciones de la molécula.
En un modo particular de realización, la
invención se relaciona, pues, con una composición tal como se ha
definido antes en la que el derivado de antibiótico macrólido
poliénico tiene uno o varios grupos funcionales catiónicos unidos de
forma covalente a la función carboxílica del grupo aglicona y/o a
la o las funciones amina del antibiótico macrólido poliénico.
Además, se entiende que el compuesto derivado de
antibiótico macrólido poliénico según la invención puede tener,
además del(de los) grupo(s) funcional(es)
catiónico(s), otra(s) modificación(es)
estructural(s), siempre que el compuesto obtenido conserve
su actividad, es decir, (i) la capacidad de interaccionar con los
ácidos nucleicos y (ii) la capacidad de transferir moléculas. Esta
última propiedad permite, en efecto, a los compuestos de la
invención llevar las moléculas de interés a las células,
eventualmente por permeabilización transmembrana sin pasar por la
vía endocitósica. Esta propiedad está asegurada en los compuestos de
la invención por utilización original de macrólidos poliénicos,
tales como anfotericina B o sus derivados. La utilización de esta
parte activa original podría permitir ventajosamente inducir la
permeabilización transitoria de las células para permitir el paso de
las moléculas de interés. La utilización de los compuestos según la
invención es, por lo tanto, particularmente ventajoso, ya que las
células no resultan perturbadas de forma significativa por la
transferencia de la molécula. Esta "parte activa" puede, en
particular, estar constituida por anfotericina B (cuya fórmula está
representada en la Figura 1) o por cualquier variante de ésta o
antibiótico heptaénico macrólido que posea propiedades de
solubilidad, toxicidad, biodisponibilidad y/o permeabilización
modificadas. Tales variantes han sido descritas, por ejemplo, por
Schaffner y col. (1987), Malewicz y col. (1980), Binet y col.
(1988), Chéron y col. (1989) o también Brajtburg y col. (1990), en
particular, los cuales son aquí incorporados como referencia.
En un modo particularmente preferido de
realización, la presente invención se relaciona con una composición
que contiene una molécula de interés cargada negativamente, tal como
un ácido nucleico, y un derivado catiónico de la anfotericina B.
Según una primera variante particular, el
derivado catiónico es una amida primaria, secundaria o terciaria de
la anfotericina B (véase la Figura 2). En este sentido, se pueden
citar más en particular las aminoalquilamidas, tales como la
dimetilaminopropilamida; las amidas de poliaminas, en particular la
espermina; las amidas de ésteres poliaminoacílicos, especialmente
de éster dilisilmetílico; o también las amidas de aminas
heterocíclicas, tales como N-metilpiperazina,
2-piridiletilamina o
2-morfolinetilamina.
Según otra variante particular, el derivado
catiónico es un éster de la anfotericina B, preferiblemente un éster
de colina o un éster dimetilaminopropílico (véase la Figura 3).
Según una variante suplementaria particular, el
derivado catiónico es una hidrazida de la anfotericina B,
preferiblemente la N-metilpiperazinahidrazida de la
anfotericina B (véase la Figura 4).
Siempre según una variante particular, el
derivado catiónico es un derivado N-alquílico de la
anfotericina B, preferiblemente un derivado
N',N',N'-trimetil o
N',N'-dimetilaminopropil succinimidílico de éster
metílico de la anfotericina B (véase la Figura 5).
En otra variante particular, el derivado
catiónico es un derivado N-aminoacílico de la
anfotericina B, preferiblemente éster metílico de
N-ornitil-N-diaminopropionil-,
N-lisil-, N-hexametillisil-,
N-tetra-metillisil-,
N-piperidinapropio-nil-,
N-piperidinaacetil-,
N',N'-metil-1-piperazinapropionil-
y
N,N'-metil-1-pipera-zinacetil-anfotericina
B (véase la Figura 6).
En un modo de realización particular de la
invención, el derivado catiónico de la anfotericina B lleva un grupo
catiónico funcional simultáneamente en las posiciones carboxilo y
amino de la anfotericina B (véase la Figura 7). Tales derivados
son, por ejemplo, la N-ornitilanfotericina B
dimetilaminopropilamida o la
N-piperidinoacetilanfotericina
B-(4-metil)piperazida.
Además, en las composiciones de la invención, los
compuestos anteriores pueden estar en forma de sales, tales como, en
particular, cloruro, aspartato, glutamato o ascorbato.
En otro modo preferido de realización, la
presente invención se relaciona con una composición que contiene una
molécula de interés cargada negativamente, tal como un ácido
nucleico, y un derivado catiónico de un antibiótico macrólido
heptaénico seleccionado entre nistatina, candidina y vacidina (véase
la Figura 8). Tales compuestos son, por ejemplo, la amida de la
dimetilaminopropilnistatina, la amida de la
dimetilaminopropilcandidina, la amida de la
dimetilaminopropilvacidina o la
N'-dimetilaminoacetilvacidinadimetilaminopropilamida.
Son ejemplos particulares de compuestos
preferidos según la invención:
- dimetilaminopropilamida de anfotericina B
("AMA"). La AMA corresponde al compuesto (I) representado en la
Figura 2. Este compuesto está constituido por anfotericina B a la
cual se ha unido un grupo catiónico diamina
(HN-(CH_{2})_{3}-NH(CH_{3})_{2})
en la posición 16 (función ácido carboxílico del grupo aglicona).
Este compuesto lleva dos cargas catiónicas;
- N1-esperminilamida de
anfotericina B ("AMSA"). La AMSA corresponde al compuesto (II)
representado en la Figura 2;
- (éster metílico de
N^{2}-lisillisina)amida de anfotericina B
("AMDLA"). La AMDLA corresponde al compuesto (III) representado
en la Figura 2;
-
B-4-metilpiperizinamida de
anfotericina B ("AMPA"). La AMPA corresponde al compuesto (IV)
representado en la Figura 2;
- 2-(2-piridil)etilamida
de anfotericina B ("AMPEA"). La AMPEA corresponde al compuesto
(V) representado en la Figura 2;
- 2-(4-morfolil)etilamida
de anfotericina B ("AMMEA"). La AMMEA corresponde al compuesto
(VI) representado en la Figura 2;
- éster de colina de anfotericina B
("AMCE"). El AMCE corresponde al compuesto (VII) representado
en la Figura 3;
- éster 3-dimetilaminopropílico
de anfotericina B ("AMPE"). El AMPE corresponde al compuesto
(VIII) representado en la Figura 3;
- éster metílico de anfotericina B ("AME").
El AME corresponde al compuesto (IX) representado en la Figura 3.
Este compuesto está constituido por anfotericina B en la que la
función ácido carboxílico del grupo aglicona ha sido esterificado.
Este compuesto lleva una carga catiónica;
- éster 2-dimetilaminoetílico de
anfotericina B ("AMEE"). El AMEE corresponde al compuesto (XXV)
representado en la Figura 3;
-
B-4-metilpiperazinahidrazida de
anfotericina B ("HAMA"). La HAMA corresponde al compuesto (X)
representado en la Figura 4;
- N,N,N-trimetilamonio AME
("DMS-AME"). El DMS-AME
corresponde al compuesto (XI) representado en la Figura 5. Este
compuesto está constituido por anfotericina B en la cual se han
injertado dos grupos catiónicos: un grupo éster metílico en
posición 16 (función ácido carboxílico del grupo aglicona) y un
grupo trimetilamonio en posición 19 (en la función amina del grupo
micosamina). Este compuesto lleva dos cargas catiónicas;
- éster metílico de
N-(N'-3-dimetilaminopro-pilsuccinimido)anfotericina
B ("SAME"). El SAME corresponde al compuesto (XII)
representado en la Figura 5;
- N-ornitil AME ("OAME"). El
OAME corresponde al compuesto (XIII) representado en la Figura
6;
- N-diaminopropionil AME. El DAME
corresponde al compuesto (XIV) representado en la Figura 6;
- N-lisil-AME
("LAME"). El LAME corresponde al compuesto (XV) representado en
la Figura 6. Este compuesto está constituido por anfotericina B
sobre la cual se han injertado dos grupos catiónicos: un grupo éster
metílico en posición 16 (función ácido carboxílico del grupo
aglicona) y un grupo diamina en posición 19 (sobre la función amina
del grupo micosamina). Este compuesto lleva dos cargas
catiónicas;
-
N-(N\alpha,N\alpha,N\alpha,N\varepsilon,N\varepsilon,N\varepsilon-hexametil)
AME ("MLAME"). El MLAME corresponde al compuesto (XVI)
representado en la Figura 6;
-
N-(4-metil-1-piperazinapropionil)
AME ("PNAME"). El PNAME corresponde al compuesto (XVII)
representado en la Figura 6;
-N-(1-piperidinapropionil) AME
("PAME"). El PAME corresponde al compuesto (XVIII) representado
en la Figura 6;
- N-ornitil-AMA
("OAMA"). La OAMA corresponde al compuesto (XIX) representado
en la Figura 7;
- N-
(4-metil-1-piperazinapropionil)
AMPA ("PAMPA"). La PAMPA corresponde al compuesto XX
representado en la Figura 7;
- 3-dimetilaminopropilamida de
nistatina A1 ("NYA"). El NYA corresponde al compuesto XXI
representado en la Figura 8;
- 3-dimetilaminopropilamida de
candidina ("CAA"). El CAA corresponde al compuesto (XXII)
representado en la Figura 8;
- 3-dimetilaminopropilamida de
vacidina A (VAA). El VAA corresponde al compuesto (XXIII)
representado en la Figura 8;
- 3-dimetilaminopropilamida de
N-(N',N'-dimetilglicil)vacidina A
("VAGA"). El VAGA corresponde al compuesto (XXIV) representado
en la Figura 8.
Como se ilustra en los ejemplos, estos compuestos
cargados positivamente, y en particular los que poseen al menos 2
cargas positivas, tales como AMA, ha permitido obtener los
resultados siguientes:
- por interacción con el compuesto, los
oligonucléotidos quedan protegidos de la degradación inducida por el
suero;
- la internalización celular de oligonucleótidos
marcados con fluorescencia en las células (MCF7 y 3T3) experimenta
un marcado aumento gracias al compuesto. En particular, comparada
con la acción de un compuesto de referencia (Lipofectina®), la AMA
induce una distribución intracelular homogénea y no acentuada y se
dirige a la mayoría de la población celular;
- la expresión del gen MDR1 en los fibroblastos
transfectados con MDR1 se reduce fuertemente con oligonucleótidos
fosforotioatos antisentido anti-MDR1 vectorizados
por el compuesto;
- el compuesto permite también la vectorización
de genes: hemos podido, gracias a su utilización, transfectar el gen
GFP (proteína con fluorescencia verde).
Estos ejemplos muestran que los compuestos de la
invención, tales como la AMA, presentan características interesantes
de vector para la transferencia de ácidos nucleicos a las células
(genes, oligodesoxirribonucleótidos antisentido o antigén).
En las composiciones de la invención, las
cantidades respectivas de compuesto y de molécula(s) de
interés (por ejemplo, de ácido nucleico) son preferiblemente
escogidas de tal forma que la razón (R) de cargas positivas del
compuesto a cargas negativas de la molécula esté comprendida entre
0,1 y 20. Más preferiblemente, esta razón está comprendida entre 0,5
y 15. Se entiende que esta razón puede ser adaptada por el experto
en la técnica en función de la molécula de interés (en particular,
del ácido nucleico) y del compuesto utilizados, de las aplicaciones
contempladas y del tipo celular considerado.
Las composiciones de la invención son
generalmente preparadas por incubación (por ejemplo, poniendo en
contacto, en solución) del/de los compuesto/s con la/las molécula/s
de interés (ácidos nucleicos) durante un período de tiempo
suficiente para permitir su interacción. El tiempo de incubación es
también función de los compuestos utilizados y de las condiciones de
incubación (medio, agitación, etc.). Ventajosamente, la incubación
es realizada durante un período comprendido, por ejemplo, entre 15
minutos y 2 horas. El procedimiento comprende además una etapa de
formación de un complejo entre el/los compuesto/s y la/las
molécula/s (ácidos nucleicos), que puede continuar de diversos
modos, especialmente con medición del espectro de absorción de la
solución, tal como se ilustra en los ejemplos.
Se puede realizar la incubación en diferentes
medios, preferiblemente en ausencia de suero para evitar la
degradación de los ácidos nucleicos antes de la acomplejación.
Puede tratarse de soluciones salinas, tampones (PBS), etc., en los
cuales es/son soluble/s los compuestos/ácidos nucleicos. Son medios
adaptados, por ejemplo, los medios DMEM, RPMI o cualquier medio
compatible con una utilización in vitro, ex vivo o in
vivo. La elección del medio puede ser adaptada evidentemente por
el experto en la técnica.
Los compuestos utilizados en la invención pueden
ser sintetizados según diferentes rutas posibles conocidas por el
experto en la técnica. Así, es posible sintetizar estos compuestos
a partir de la anfotericina B por acoplamiento de la o de las
partes catiónicas según los métodos clásicos de la química. Se
pueden utilizar, en este sentido, los métodos de síntesis descritos
por Falkowski y col. (J. Antibiot. 33 (1980), 103; J. Antibiot. 35
(1982), 220; J. Antibiot. 28 (1975), 244, y J. Antibiot. 31 (1979),
1080), Schaffner y col. (Antibiot. Chemother. 11 (1961), 724),
Mechlinski y col. (J. Antibiot. 25 (1972), 256) o también Pandey y
col. (J. Antibiot. 30 (1977), 158), aquí incorporados como
referencia.
Es también posible producir estos compuestos
partiendo de otros antibióticos poliénicos macrólidos.
Se entiende que el experto en la técnica puede
adaptar el procedimiento de preparación con ayuda de sus
conocimientos generales comunes.
Además, la presente invención tiene también por
objeto nuevos compuestos derivados de antibióticos macrólidos
poliénicos, particularmente de antotericina B, dotados de la
capacidad de vectorización de ácidos nucleicos en las células, así
como de propiedades antifúngicas. Estos compuestos comprenden en
particular una parte derivada de la anfotericina B o de otros
antibióticos heptaénicos macrólidos sobre la que se unen, de modo
covalente, uno o varios grupos o combinaciones de grupos cargados
positivamente, cuyos grupos no han sido utilizados anteriormente
para modificaciones químicas de antibióticos poliénicos. Han sido
escogidos, en particular, entre los grupos siguientes: colina,
poliamina, hidrazida, N-acilo, etc. Tales
compuestos están representados, por ejemplo, por los productos
AMPEA, AMSA, AMDLA, AMPA, AMCE, AMPE, AMEE, SAME, PNAME, PAME,
MLAME, OAMA, PAMPA y VAGA, tales como los antes definidos.
Las estructuras de todos los derivados están
representadas en las figuras en forma ionizada, con el fin de
indicar la posición y el número de cargas positivas adquiridas a pH
fisiológico o por interacción con ácidos, incluyendo ácidos
nucleicos (protonación). Los compuestos con amonios cuaternarios
portan cargas positivas permanentes.
Los nuevos compuestos antes descritos poseen
además una actividad antifúngica propia elevada. En efecto, como se
ilustra en los ejemplos, estos compuestos son capaces de inhibir
fuertemente el crecimiento (y de causar la muerte) de las células
fúngicas. Estos compuestos pueden ser, pues, utilizados como
agente(s) antifúngico(s), en particular para inducir
la destrucción de células fúngicas in vitro, ex vivo
o in vivo. En este sentido, la invención se relaciona, pues,
igualmente con cualquier utilización farmacológica (particularmente
farmacéutica) de los derivados de la anfotericina B descritos
anteriormente. Se relaciona más concretamente con la utilización de
estos compuestos a modo de agente(s) antifúngico(s),
así como de cualquier composición antifúngica que contenga uno de
tales compuestos. La actividad antifúngica puede ser utilizada
sobre cualquier tipo de célula fúngica que exhiba preferiblemente un
grupo ergosterol o un precursor correspondiente, como se ilustra
más adelante. Las condiciones de utilización de esta actividad
(dosis, duración, etc.) in vitro e in vivo pueden ser
fácilmente extrapoladas a partir de las descritas para la
anfotericina B, por ejemplo teniendo en cuenta CI_{50}.
Los compuestos/composiciones de la invención
pueden ser utilizados para la transferencia de moléculas de interés
en diferentes tipos de células, tejidos u órganos in vitro,
ex vivo o in vivo. En particular, estos
compuestos/composiciones pueden ser usados para la transferencia en
todo tipo de células sensibles a los antibióticos macrólidos
poliénicos utilizados, en particular a la anfotericina B, es decir,
sobre las que este o estos antibióticos ejercen una actividad de
permeabilización de la membrana.
Preferiblemente, se trata de células que
contienen en su membrana grupos ergosterol o precursores de
éste.
Se pueden citar, por ejemplo, los protozoarios
parásitos (por ejemplo, leishmanias) o las células fúngicas, que son
el blanco privilegiado de los antibióticos poliénicos, tales como
la anfotericina B. Entre las células fúngicas, se pueden citar, en
particular, células de Candida, de Cryptococcus o de
Aspergillus.
También se pueden citar células de levaduras,
tales como Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.
Además, los compuestos según la invención son
también capaces de vectorizar moléculas en células somáticas de tipo
fibroblástico, hepático, muscular, nervioso, hematopoyético, etc.
Como muestran los ejemplos, estos compuestos son particularmente
eficaces sobre fibroblastos (3T3) y sobre células cancerosas
humanas (MCF-7), lo que muestra su gran espectro de
actividad.
Se entiende que, en el ámbito de la transferencia
de moléculas en las células, las dosis de compuesto(s)
utilizadas son preferiblemente no tóxicas para las células.
Otro objeto de la invención se relaciona también
con las células modificadas por una composición tal como la antes
descrita. En el sentido de la invención, se entiende por "célula
modificada" toda célula que contenga una molécula de interés
vectorizada por una composición o un compuesto tal como se ha
definido anteriormente. Como se ha indicado antes, las células
pueden ser células fúngicas, protozoarios parásitos (por ejemplo:
leishmanias) o células de mamíferos, especialmente células humanas.
Las células modificadas de la invención pueden ser obtenidas por un
procedimiento consistente en la incubación de células en presencia
de una composición de la invención in vitro, ex vivo
o in vivo. in vitro o ex vivo, la incubación
puede ser realizada en cualquier dispositivo apropiado (placa, caja,
fermentador, etc.). in vivo, la incubación puede hacerse por
administración de una composición según la invención a un sujeto
(preferiblemente un mamífero) en condiciones conocidas para el
experto en la técnica. Puede tratarse, en particular, de una
administración por vía tópica, oral, parenteral, nasal,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica,
etc. Para este tipo de aplicaciones, las composiciones según la
invención contienen ventajosamente un vehículo fisiológicamente
aceptable, tal como, por ejemplo, soluciones salinas (fosfato
monosódico o disódico; cloruro de sodio, potasio, calcio o
magnesio, etc., o mezclas de dichas sales) estériles isotónicas o
composiciones secas, especialmente liofilizadas, que, por adición
según sea el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico,
permiten la constitución de disoluciones administrables.
Las aplicaciones de las composiciones de la
invención son múltiples y comprenden, por ejemplo, la introducción
de proteínas recombinantes, el estudio de la regulación de la
expresión de genes, estudios de marcaje o de biodisponibilidad, la
creación de animales transgénicos no humanos o diferentes
aplicaciones médicas. En este sentido, los ejemplos muestran la
eficacia de las composiciones de la invención en el marco de
estrategias antisentido dirigidas contra la resistencia a los
antitumorales o en el marco de la transferencia de genes marcadores.
Estos resultados pueden ser extendidos, en particular:
- a la resistencia múltiple a los antifúngicos:
siendo las células fúngicas el blanco privilegiado de los
antibióticos poliénicos, la vectorización de oligonucleótidos o de
genes dirigidos contra la resistencia halla aquí una aplicación de
elección. Está apareciendo, en efecto, una resistencia a los nuevos
antifúngicos, como los derivados azol, y representa una seria
amenaza para el futuro si no se adoptan medidas preventivas. A este
efecto, un objeto particular de la invención consiste en la
utilización de una composición tal como se ha definido antes para la
preparación de un medicamento destinado a la transferencia, en una
célula fúngica, de un ácido nucleico que reduce las resistencias a
los antibióticos de dicha célula;
- a cualquier aproximación antisentido o antigén,
especialmente intracelular;
- a la producción de proteínas ex vivo o
in vivo, en particular de proteínas seleccionadas entre
hormonas, enzimas, factores de crecimiento, factores tróficos,
factores de coagulación, lipoproteínas, linfokinas, etc.;
- a la transfección para terapia génica.
Las ventajas de los compuestos/composiciones de
la invención son, por ejemplo:
- su preparación simple y poco costosa;
- su débil toxicidad;
- su actividad en presencia de suero y de
antibacterianos;
- una gran utilización en clínica de la
Fungizone®, que servirá de referencia a los estudios clínicos sobre
los derivados;
- su selectividad: mejor que la de la mayoría de
los efectores de membrana en cuanto a la acción sobre la
permeabilidad de las membranas: formación de poros transmembrana
transitorios y reversibles y ninguna acción lítica
desestabilizadora.
La presente invención será descrita con más
detalle con ayuda de los ejemplos que se darán a continuación, los
cuales deben ser considerados como ilustrativos y no
limitativos.
Descripción de las figuras
Figura 1: Estructura de la anfotericina B.
Figura 2: Estructura de los derivados amida de la
anfotericina B.
Figura 3: Estructura de los derivados éster de la
anfotericina B.
Figura 4: Estructura de los derivados hidrazida
de la anfotericina B.
Figura 5: Estructura de los derivados
N-alquilo de la anfotericina B.
Figura 6: Estructura de los derivados
N-aminoacilo de la anfotericina B.
Figura 7: Estructura de los derivados múltiples
de la anfotericina B.
Figura 8: Estructura de los derivados de otros
polienos macrólidos catiónicos.
Figura 9: Espectro de absorción de AMA
(5.10^{-6}M) antes y después de la adición de oligonucleótido
(ODN, 10^{-6}M).
Figura 10: Espectro de absorción de AME
(10^{-5}M) antes y después de la adición de oligonucleótido (ODN,
1,85.10^{-6}M).
Figura 11: Dicroísmo circular de AMA
(2.10^{-5}M) en presencia (b) y en ausencia (a) de pGFP.
Figura 12: Efecto de la AMA sola o en presencia
de oligonucleótido (AS, 20-mero, 0,5 \muM) sobre
la viabilidad de células 3T3 tratadas durante 4 h a 37ºC.
Figura 13: Internalización en células 3T3 de un
oligonucleótido marcado con fluoresceína (ODN,
20-mero) según que no esté vectorizado (A) o que
esté vectorizado con Lipofectine® (B) o con AMA (C y D).
Figura 14: Internalización en células
MCF-7 de un oligonucleótido marcado con fluoresceína
(ODN, 20-mero) según que no esté vectorizado (A) o
que esté vectorizado con Lipofectine® (B), con AME (C) o con AMA
(D).
Figura 15: Autorradiografía del gel
(poliacrilamida 20%-urea 7M) sobre el cual se depositó ODN en
ausencia o en presencia (+/- = 10) de AMA después de diferentes
tiempos de incubación (0, 4, 8 y 16 h, respectivamente) en tampón
Hepes que contiene un 10% (v/v) de suero de ternera fetal.
Figura 16: Niveles de expresión de
P-glicoproteína (P-gp) en células
3T3 R (colonias 1 y 3-8) ó 3T3 S (colonia 2) después
de cuarenta y ocho horas de tratamiento.
Los diferentes tratamientos, preparados en medio
DMEM sin suero de ternera fetal, son los siguientes:
1 - 3T3 R no tratadas.
2 - 3T3 S no tratadas.
3 - 3T3 R / AS5995 (1 \muM) vectorizado con
Lipofectine® (20 \mug/ml).
4 - 3T3 R / CTL (1 \muM) vectorizado con
Lipofectine® (20 \mug/ml).
6 - 3T3 R / AS5995 (1 \muM) vectorizado con AMA
(5.10^{-6}M).
7 - 3T3 R / CTL (1 \muM) vectorizado con AMA
(5.10^{-6}M).
9 - 3T3 R / AS5995 (1 \muM) no vectorizado.
5 - 3T3 R / Lipofectine® (20 \mug/ml).
8 - 3T3 R / AMA (10^{5}M).
A una mezcla de 22 \mul de AMA (solución stock
en DMSO a 7x10^{-4}M) y 16 \mul de un oligonucleótido
20-mero (Genosys Biotechnologies, The Woodland,
Inglaterra) (solución stock a 1,9x10^{-4}M en agua) se añadieron 3
ml de medio RPMI desprovisto de rojo fenol (Gibco BRL, Life
Technologies, S.A., Cergy Pontoise, Francia). Se incubó la solución
a temperatura ambiente durante 30 minutos. La secuencia del
oligonucleótido (CCATCCCGACCTCGCGCTCC, SEC. ID. Nº: 1) fue
seleccionada a partir de Alahari y col. (Alahari, Dean y col., 1996)
y corresponde a un oligonucleótido antisentido dirigido contra el
ARN del gen MDR1 y, por lo tanto, destinado a inhibir la expresión
del gen MDR1.
Los espectros de absorción de estas soluciones
fueron medidos en un espectrofotómetro 8452A
Hewlett-Packard UV-visible.
Los espectros fueron también medidos a partir de
una mezcla de 15 \mul de AME (solución stock en agua a
10^{-2}M), 3 ml de tampón PBS, pH 7,4, y 28 \mul de un
oligonucleótido 27-mero (Genosys Biotechnologies,
The Woodland, Inglaterra) (solución stock a 2x10^{-4}M). Se
determinó la secuencia de este oligonucleótido a partir de
Quattrone y col. (Quattrone y col., 1994) y corresponde a un
oligonucleótido antigén dirigido contra el gen MDR1, es decir, un
oligonucleótido capaz de inhibir la expresión del gen MDR1
(5'-TGT GTT TTT GTT TTG TTG GTT TTG
TTT-3'; SEC. ID. Nº: 2).
Los antibióticos poliénicos presentan bandas de
absorción específicas entre los 300 y los 450 nm. En las condiciones
de este experimento (5x10^{-6}M de antibiótico), el AME libre o
la AMA libre presentan una banda a 330 nm y un hombro a 420 nm,
característicos de las formas autoasociadas de antibiótico, y cuatro
bandas a 345, 365, 385 y 409 nm.
Con AMA, en presencia del oligonucleótido
(10^{-6}M), aparece un ruido de fondo, la intensidad de las bandas
de monómeros a 385 y 409 nm disminuye y la banda a 330 nm aumenta y
se desplaza hacia el rojo (véase la figura 9). Con AME, en
presencia del oligonucleótido, la intensidad de las bandas a 345 y
409 nm aumenta, mientras que la de las bandas a 409 y 385 nm deja
de crecer (véase la figura 10). En los dos casos, estos cambios
indican que se produce una interacción entre el antibiótico y el
oligonucleótido y que el estado de autoasociación del antibiótico se
modifica. El espectro del oligonucleótido alrededor de 255 nm no
cambia, si se considera el aumento de la absorción resultante del
aumento del ruido de fondo.
A una mezcla de 30 \mul de una solución stock
de AMA a 10^{-3}M en DMSO y 6 \mul de plásmido pGFP
emd-c [R] (Packard, Instrument Company, Meriden,
EE.UU.) (1 \mug/ml) se añadieron 1,5 ml de medio RPMI desprovisto
de rojo fenol. Se incubó la solución a temperatura ambiente durante
30 minutos. Se midieron los espectros de dicroísmo circular de
estas soluciones en un dicrógrafo Jobin-Yvon Mark
V.
Los antibióticos poliénicos presentan un doblete
específico alrededor de los 320 nm. En presencia del plásmido pGFP
emd-c [R], el doblete se desplaza hacia el rojo y
su intensidad disminuye (véase la figura 11). Estas características
indican una interacción entre AMA y el plásmido, que conduce a una
modificación del estado de autoasociación del antibiótico.
Se obtuvo un oligonucleótido
20-mero de Genosys Biotechnologies (The Woodlands,
Inglaterra). Se eligió su secuencia según Alahari y col. y
corresponde a un oligonucleótido antisentido que permite la
inhibición de la expresión del gen MDR1 (véase el ejemplo 1). Los
fibroblastos 3T3 fueron obtenidos de la ATCC (American Type Culture
Collection).
Se midió la toxicidad en dos soluciones que
contenían concentraciones de AMA desde 10^{-6}M hasta 5x10^{-5}M
en presencia o en ausencia de oligonucleótidos a una concentración
final de 10^{-4}M. En todas las experiencias, la mezcla fue
incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente y preparada en un
medio DMEM desprovisto de suero. Se sembraron luego las células en
un medio DMEM y se las puso en microplacas de 96 pocillos a razón
de 4x10^{4} células/ml. Después de 24 horas, se lavan las células
con un medio DMEM sin suero y se añadieron 200 \mul de la
solución de AMA/oligonucleótidos preparada justo antes por
pocillo.
Después de incubar durante 4 horas a 37º, se
midió la viabilidad celular por una prueba colorimétrica utilizando
MTT, según la metodología ya descrita en la literatura (Mosmann,
1983). Los resultados son presentados en la figura 12 y muestran
que más allá de 2x10^{-5}M no se observa ninguna toxicidad.
Además, estos resultados muestran que más allá de 10^{-5}M el
crecimiento celular parece estar estimulado.
Se obtuvo un oligonucleótido
20-mero marcado con TITC de Genosys Biotechnologies
(The Woodlands, Inglaterra). Se determinó su secuencia según
Alahari y col. (1995) y corresponde a un oligonucleótido antisentido
que permite la inhibición de la expresión del gen MDR1. Se obtuvo
la Lipofectine® de Gibco (Life Technologies,
Cergy-Pontoise, Francia). Se utilizó la Lipofectine®
como molécula de referencia para la transferencia de
oligonucleótidos a una concentración de 20 \mug/ml en las
condiciones recomendadas por el fabricante. Se obtuvieron los
fibroblastos 3T3 de la ATCC.
Se mezclaron alícuotas de una solución de AMA a
5,6x10^{-3}M en DMSO con 82 \mul de una solución de
oligonucleótidos a 2,4x10^{4}M y con medio DMEM para obtener
soluciones que tuvieran una concentración de AMA de 1x10^{-5} y
de 2x10^{-5}M y un volumen final de 2 ml. Se incubaron las
soluciones durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron
las células a un 80% de confluencia en placas de Petri (35 mm de
diámetro) con medio sin suero y se trataron con 2 ml de soluciones
de AMA-oligonucleótidos. Después de incubar durante
4 horas, se lavaron las células con un tampón PBS y se detectó la
internalización del oligonucleótido fluorescente con un
microespectrofluorímetro de láser confocal puesto a punto en el
laboratorio. Las longitudes de onda de excitación y de emisión eran
respectivamente de 488 y de 520 nm. Se eligieron 30 células al azar
y se midió su intensidad de fluorescencia. En la figura 13, se
muestra la distribución de las células en función de esta
intensidad (escala de fluorescencia arbitraria). Los resultados
obtenidos muestran que se observa una internalización mucho más
importante en presencia de AMA en comparación con la observada en
presencia de AME de Lipofectine® o de los oligonucleótidos
solos.
La fluorescencia aparece como distribuida de
manera homogénea en el interior de las células. No se observó
ninguna diferencia significativa de intensidad entre el núcleo y el
citoplasma.
Se obtuvo un oligonucleótido
27-mero marcado con FITC de la Sociedad Genosys
Biotechnologies, The Woodlands, Inglaterra). Se eligió su secuencia
según Quattrone y col. (1994) y corresponde a un oligonucleótido
antigén que permite la inhibición de la expresión de MDR1 (véase el
ejemplo 1). Las células MCF-7 son células de un
carcinoma mamario humano.
Se mezclaron alícuotas de una solución de AME o
de AMA a 10^{-3}M en agua con 12 \mul de una solución stock de
oligonucleótidos a 1,6x10^{-4}M y con 1 ml de un tampón Hepes 10
mM a pH 7,4, de forma que se obtuvieran soluciones con una
concentración de AME o de AMA respectiva de 2,7x10^{-4}M y
1,35x10^{-4}M. La razón de las cargas positivas (del compuesto
vector) a las cargas negativas (del ácido nucleico) era de 5 en las
dos series de experimentos. Las demás condiciones experimentales
eran idénticas a las del ejemplo 4.
La figura 14 muestra la distribución de las
células en función de la intensidad de fluorescencia (escala de
fluorescencia arbitraria). Estos resultados muestran una
internalización mucho más importante en presencia de AMA en
comparación con la observada en presencia de AME, Lipofectine® u
oligonucleótidos libres.
Se hace radiactivo un oligonucleótido (ODN) de
veintisiete meros por marcaje en 5' con ^{32}P según el
procedimiento estándar (Pharmacia) utilizando T4 polinucleótido
kinasa y ^{32}(\gamma)ATP. Se mezcla una pequeña
cantidad de este ODN marcado con ^{32}P con ODN frío. Se añade
AMA a una concentración tal que se obtenga una razón de cargas +/-
de 10 y se deja que se forme el complejo a temperatura ambiente
durante 30 minutos. Una muestra que no contiene AMA constituye un
patrón (ODN no vectorizado). Se activa la degradación del ODN, en el
tiempo 0, por adición a 37ºC de un 10% (v/v) de suero de ternera
fetal cuya actividad enzimática es esencialmente
3'-exonucleásica (Sirotkin, Cooley y col., 1978). Se
efectúan a lo largo del tiempo tomas de muestras, en el seno de las
cuales se detiene la acción de las enzimas por adición de formamida
y poniendo el tubo en hielo. Se detiene así la reacción después de
4, 6, 8 y 16 horas de incubación con el suero. Se hace migrar
después a las muestras sobre un gel desnaturalizador (urea 7M) de
poliacrilamida al 20%.
La autorradiografía del gel revela (Figura 15)
que la degradación sérica del oligonucleótido no vectorizado es muy
rápida; en efecto, en el tiempo de cuatro horas la forma inicial de
27 meros ha desaparecido totalmente en beneficio de productos de
degradación más cortos. En cambio, la vectorización con AMA permite
enlentecer esta degradación: no comienza más que en el tiempo de
dieciséis horas y la forma mayoritaria es todavía la forma inicial
de 27 meros.
Estos resultados muestran que los compuestos
según la invención permiten proteger los ácidos nucleicos de la
degradación por el suero.
Las células
NIH-MDR-G185 son fibroblastos
murinos 3R3 transfectados con el plásmido que contiene el gen MDR1
humano (pSK1 MDR). En consecuencia, estas células sobreexpresan la
glicoproteína P(P-gp) y presentan, pues, el
fenotipo de resistencia a multifármacos. Este ejemplo muestra que es
posible inhibir la expresión de esta proteína mediante utilización
del oligonucleótido fosforotioato antisentido (AS5995), que tiene
por blanco el ARN mensajero que codifica para la
P-gp (Alahari, Dean y col., 1996).
Para hacerlo, se siembran células 3T3 R
(resistentes y 3T3 S (sensibles, no transfectadas) en placas de
Petri en medio DMEM completo. Al cabo de veinticuatro horas, cuando
alcanzan el 80 al 90% de confluencia, se las trata durante 48
horas. Los tratamientos son todos ellos preparados en medio DMEM sin
suero de ternera fetal.
Al cabo de 48 horas, se cuantifica la
glicoproteína P por la técnica de Western-blot con
ayuda del anticuerpo monoclonal C219 (Dako S.A., Trappes, Francia).
Este anticuerpo, una IgG 2A kappa de ratón, reconoce un epitopo
intracelular localizado en la parte
carboxi-terminal de la glicoproteína P.
Se procede primeramente a la extracción de las
proteínas. Las células contenidas en cada placa de Petri son
tripsinizadas, lavadas con tampón PBS y centrifugadas. Se añaden a
cada pella celular 100 \mul de tampón de lisis RIPA al que se han
añadido extemporáneamente inhibidores de proteasas. Se efectúa la
lisis sobre hielo durante minutos, agitando vorticialmente cada 5
minutos. Se centrifuga luego la mezcla a 12.000 revoluciones por
minuto, a 4ºC y durante 15 minutos y se recupera el sobrenadante que
contiene las proteínas extraídas.
Se determina la concentración de proteínas
totales por la técnica de Bradford. Se preparan muestras que
contienen una cantidad idéntica (40 mg) de proteínas totales, se les
hace migrar por electroforesis en gel lineal de SDS- PAGE
(Electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de
poliacrilamida) con una concentración lineal de poliacrilamida de
7,5%.
Al final de la migración, las proteínas son
electrotransferidas a una membrana de celulosa
(Immobilon-P, Millipore). Se incuba la membrana
durante 1 h en tampón bloqueante (leche descremada al 5%, TBS Tween
0,05%) con el fin de saturar los sitios no específicos. Se añade
luego el anticuerpo C219 anti-P-gp
diluido a 1/200 en tampón de bloqueo durante 2 h. Después de dos
lavados con TBS Tween 0,05%, se realiza una última incubación con el
segundo anticuerpo acoplado a peroxidasa durante 1 h. Se trata de
una inmunoglobulina de cabra anti-inmunoglobulina de
ratón (Dako S.A., Trappes, Francia), utilizada en condiciones
saturantes (dilución al 1/5.000) en tampón de bloqueo.
Después de tres lavados con
TBS-Tween 0,05% y de un lavado con
Tris-HCl (pH 8), se hace el revelado por
quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham). La cantidad de
P-gp es proporcional a la intensidad de la
mancha.
Los resultados obtenidos son presentados en la
figura 16. Estos resultados muestran que el AS5995 inhibe la
expresión de la P-gp de forma significativa cuando
se vectoriza con Lipofectine®, vector que sirve de referencia
(colonia 3) o con AMA a una concentración de 5.10^{-6}M (colonia
6), mientras que está inactivo en ausencia de vector (resultado no
presentado aquí). El oligonucleótido control (misma secuencia que
el AS5995, pero a la inversa) es inactivo cualquiera que sea el
vector utilizado (colonia 4 y 7). La aportación del AMA con respecto
a la Lipofectine® es que no inhibe la síntesis de la
P-gp (colonias 5 y 8).
Este ejemplo describe la síntesis de derivados
catiónicos amida de la anfotericina B según la invención. Más
concretamente, este ejemplo describe la síntesis de los compuestos
AMMEA (compuesto VI, Figura 2), AMPEA (compuesto V, Figura 2), AMPA
(compuesto IV, Figura 2), AMSA (compuesto II, Figura 2) y AMDLA
(compuesto III, Figura 2).
A 1 mmol (0,923 g) de anfotericina B disuelta en
50 ml de DMF, se añaden 10 mmoles (1,31 ml) de
4-(2-aminoetil)morfolina, 10 mmoles (2,3 ml)
de nitruro de difenilfosfonilo (DPPA) y 10 mmoles (1,38 ml) de
trietil- amina con agitación. Se agita la mezcla de reacción durante
una noche a temperatura ordinaria. Una vez finalizada la reacción,
se añade un exceso de éter dietílico para precipitar el producto
bruto. Se centrifuga éste, se lava con éter dietílico, se seca a
vacío y se disuelve en n-butanol saturado con agua.
Se lava la capa de n-butanol varias veces con agua
y se reduce a un pequeño volumen por evaporación. Se precipita luego
el producto bruto con un exceso de éter dietílico, se centrifuga,
se lava varias veces con éter y se seca a vacío. Se aísla la
anfotericina B 2-(4-morfolil)etilamida por
cromatografía en columna de Silicagel 60, 70-230
mallas, utilizando el sistema solvente
CHCl_{3}-MeOH-H_{2}O, 10:6:1. Se
obtienen así 0,40 g (38,6%) de amida pura (E^{1%}_{1cm} = 1150
a \lambda = 382 nm en MeOH).
A una solución de 1 mmol (0,923 g) de
anfotericina B en 40 ml de DMF enfriada a 0ºC, se añaden 10 mmoles
(1,2 ml) de 2-(2-aminoetil)piridina, 10
mmoles (2,3 ml) de nitruro de difenilfosfonilo (DPPA) y 10 mmoles
(1,38 ml) de trietilamina con agitación. Se agita la mezcla de
reacción durante una noche. Se aísla el producto bruto de la mezcla
de reacción como se ha descrito en el ejemplo 8.1. Para purificar
el producto bruto, se le disuelve en la mezcla
H_{2}O-MeOH (1:2) y se le carga sobre una columna
de celulosa CM-52, se lava con el solvente y se
eluye con una solución al 5% de trietilamina en
MeOH-H_{2}O (2:1). Tras la evaporación a sequedad
de los solventes a presión reducida, se disuelve el residuo en un
pequeño volumen de DMF y se añade éter dietílico para precipitar el
derivado. Se centrifuga, se lava con éter y se seca a vacío. Se
obtienen así 0,37 g (36%) de anfotericina B
2-(2-piridil)etilamida (E^{1%}_{1cm} =
850 a \lambda = 382 nm en MeOH).
Se hace reaccionar a 1 mmol (0,923 g) de
anfotericina B en 50 ml de DMF con 10 mmoles (1,11 ml) de
1-metilpiperazina utilizando los reactivos y las
condiciones descritos en el ejemplo 8.2. Se realiza la purificación
del derivado final como se ha descrito en el ejemplo 8.2. Se
obtienen así 0,40 g (40%) de anfotericina B
4-metilpiperazinamida (E^{1%}_{1cm} = 1000 a
\lambda = 382 nm en MeOH).
A 0,5 mmoles de
N-F-moc-anfotericina
B (0,573 g) disuelta en 30 ml de DMF, se añaden 0,55 mmol de
N^{1},N^{10},N^{14}-tris(Fmoc)espermina
(0,477 g), 0,55 mmoles (0,13 ml) de DPPA y 0,55 mmoles (0,08 ml) de
trietilamina a 0ºC con agitación. Se deja una noche la mezcla de
reacción a temperatura ordinaria. Una vez finalizada la reacción,
se precipita el derivado de anfotericina B protegido con
F-moc con un exceso de éter dietílico, se
centrifuga, se lava varias veces con éter y se seca a vacío. Se
disuelve el sólido amarillo en un pequeño volumen de DMF y se añaden
3 mmoles (0,4 ml) de
1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno
(DBN) en 3 ml de MeOH a 0ºC con agitación para desproteger del
F-moc. Después de 2 h, se añade éter dietílico para
precipitar el producto bruto, el cual es luego centrifugado, lavado
varias veces con éter y secado a vacío. Se efectúa la purificación
utilizando una resina intercambiadora de iones
CM-52 según la descripción dada en el ejemplo 8.2.
Se obtienen así 194 mg (30%) de anfotericina B
N^{1}-esperminilamida (E^{1%}_{1cm} = 1000 a
\lambda = 382 nm en MeOH).
A 0,5 mmoles del éster de
N-Fmoc-anfotericina B
N-hidroxisuccinimida (0,621 g) disuelto en 40 ml de
DMF se añaden 0,55 mmoles (0,477 g) de
N^{1},N^{10},N^{14}-tris(Fmoc)es-permina
con agitación. Se agita la mezcla de reacción durante una noche a
temperatura ordinaria. Se retira luego la diciclohexilurea por
filtración y se trata el filtrado con un exceso de éter dietílico
para obtener un sólido amarillo. Las etapas siguientes han sido
descritas en el ejemplo 8.4.1. Se obtienen así 200 mg (31%) de
anfotericina B N1-esperminilamida (E^{1%}_{1cm}
= 1070 a \lambda = 382 nm en MeOH).
A 0,5 mmoles de éster de
N-Fmoc-anfotericina
B-N-hidroxisuccinimida (0,621 g) en
40 ml de DMF se añaden con agitación 0,55 mmoles del éster metílico
de
N^{\alpha}-Fmoc-lisil-N^{\varepsilon}-Fmoc-lisina
(0,403 g). Se deja una noche a temperatura ordinaria. Las etapas
siguientes están descritas en el ejemplo 8.4.2. Se obtienen así 190
mg (32%) de anfotericina B (éster metílico de
N^{\varepsilon}-lisillisina)amida
(E^{1%}_{1cm} = 990 a \lambda = 382 nm en MeOH).
A 0,5 mmoles de
N-Fmoc-anfotericina B (0,573 g) en
30 ml de DMF se añaden a 0ºC y con agitación 0,55 mmoles del éster
metílico de
N^{\alpha}-Fmoc-lisil-N^{\varepsilon}-Fmoc-lisina
(0,403 g), 0,55 mmoles (0,13 ml) de DPPA y 0,55 mmoles (0,08 ml) de
trietilamina. Se agita la mezcla de reacción durante una noche a
temperatura ordinaria. Las etapas siguientes están descritas en el
ejemplo 8.4.1. Se obtienen así 150 mg (25,3%) de anfotericina B
(éster metílico de N^{\varepsilon}-lisillisina)
amida (E^{1%}_{1cm} = 1020 a \lambda = 382 nm en MeOH).
Este ejemplo describe la síntesis de derivados
catiónicos éster de la anfotericina B según la invención. Más
concretamente, este ejemplo describe la síntesis de los compuestos
AMPE (compuesto VIII, Figura 3) y AMEE (compuesto XXV, Figura
3).
Se suspenden 0,5 mmoles (0,462 g) de anfotericina
B en 30 ml de 2-dimetilaminoetanol con agitación
vigorosa a 40ºC y se añaden 2,5 mmoles (0,519 mg) de
diciclohexilcarbodiimida. Después de 5 h, se añade un pequeño
volumen de DMF para clarificar la solución. Se agita la mezcla de
reacción durante 24 h a 40ºC. Se retira luego el precipitado de
diciclohexilurea por filtración y se lava con un pequeño volumen de
DMF. Se añade un exceso de éter dietílico al filtrado para
precipitar el residuo oleoso. Se centrifuga este residuo, se lava
con éter y se purifica por cromatografía en gel de sílice según la
descripción del ejemplo 8.1 o por cromatografía de intercambio
iónico en celulosa CM-52 según la descripción del
ejemplo 8.2. Se obtienen así 100 mg (20%) de éster
2-dimetilaminoetílico de anfotericina B
(E^{1%}_{1cm} = 1010 a \lambda = 382 nm en MeOH).
La reacción de 0,5 mmoles (0,462 g) de
anfotericina B con 3-dimetilaminopropanol según el
procedimiento descrito en el ejemplo 9.1 da 87 mg (17,3%) de éster
dimetilaminopropílico de anfotericina B (E^{1%}_{1cm} = 1000 a
\lambda = 382 nm en MeOH).
Este ejemplo describe la síntesis de derivados
alquílicos catiónicos de la anfotericina B según la invención. Más
concretamente, este ejemplo describe la síntesis del compuesto SAME
(compuesto XII, Figura 5).
Se enfrían 0,5 mmoles de
N-(N'-3-dimetilami-nopropilsuccinimido)anfotericina
B (0,552 g) disueltos en 40 ml de DMF en un baño helado hasta
0-2ºC. Se añade una solución de éter dietílico de
diazometano a razón de 2,5 mmoles de CH_{2}N_{2}:1 mmol de
substrato. Se agita la mezcla de reacción durante 1 a 2 horas a
0ºC. Cuando ha finalizado la reacción, se destruye el exceso de
diazometano con ácido acético y se evapora el éter dietílico a
presión reducida. Se precipita luego el producto con éter, se
centrifuga, se lava con éter y se seca por evaporación. Se obtienen
así 0,531 g (95%) de éster metílico de
N-(N'-3-dimetilaminopropilsuccinimido)anfotericina
B (SAME) (E^{1%} = 950 a \lambda = 382 nm en MeOH).
Este ejemplo describe la síntesis de derivados
catiónicos aminoacílicos de la anfotericina B según la invención.
Más concretamente, este ejemplo describe la síntesis de los
compuestos PAME (compuesto XVIII, figura 6), PNAME (compuesto XVII,
figura 6) y MLAME (compuesto XVI, figura 6).
\newpage
Se disuelven 0,75 mmoles (0,117 g) de ácido
1-piperidinapropiónico, 0,75 mmoles (0,155 g) de
diciclohexilcarbodiimida y 0,75 mmoles (0,086 g) de
N-hidroxisuccinimida en 15 ml de DMF y se agita
durante la noche a temperatura ambiente. Cuando finaliza la
reacción, se filtra el precipitado de diciclohexilurea, se lava la
solución con un pequeño volumen de DMF y se añade el filtrado a una
solución de 20 ml de DMF que contiene 0,375 mmol (0,346 g) de
anfotericina B y 0,375 mmoles (0,055 ml) de trietilamina. Se
mantiene la mezcla en agitación durante una noche a temperatura
ambiente y se añade después un exceso de éter dietílico para
precipitar un sólido amarillo. Se centrifuga éste, se lava varias
veces con éter dietílico y se seca por evaporación. Se disuelve el
producto bruto obtenido en 20 ml de DMF y se metila después
utilizando una solución de éter dietílico de diazometano como se ha
descrito en el ejemplo 10. Se realiza la purificación por
cromatografía en columna de gel de sílice en un sistema solvente de
CHCl_{3}-MeOH-H_{2}O (10:6:1).
Se obtienen así 0,16 g (39,7%) de PAME (E^{1%} = 1080 a 382 nm en
MeOH).
Se agitan 0,75 mmoles (0,129 g) de ácido
4-metil-1-piperazinapropiónico,
0,75 mmoles (0,155 g) de diciclohexilcarbodiimida y 0,75 mmoles
(0,086 g) de N-hidroxisuccinimida en 15 ml de DMF
durante una noche a temperatura ambiente. Se realizaron las fases de
síntesis y purificación como se ha descrito en el ejemplo 11.1. Se
obtienen así 0,143 g (35%) de PNAME (E^{1%} = 1020 a 382 nm en
MeOH).
A 0,5 mmoles (0,462 g) de anfotericina B y 0,5
mmoles (0,07 ml) de trietilamina en 30 ml de DMF se añaden con
agitación 0,55 mmoles (0,378 g) de éster
N-succinimidílico de
N^{\alpha},N^{\varepsilon}-di(Fmoc)lisina.
Se mantiene la mezcla de reacción con agitación durante una noche a
temperatura ambiente. Se añade un exceso de éter dietílico para
precipitar el sólido, el cual es centrifugado, lavado varias veces
con éter y secado por evaporación. Se disuelve entonces el
precipitado en un pequeño volumen de DMF y se añaden 2 mmoles (0,25
ml) de
1,5-diazabiciclo-[4.3.0]non-5-eno
en metanol a 0ºC con agitación. Al cabo de 2 a 3 horas, se añade
éter dietílico para precipitar el producto bruto, que es luego
centrifugado, lavado varias veces en éter y secado. Se recoge
entonces el producto en 40 ml de DMF y se metila utilizando 5 mmoles
(0,47 ml) de sulfato de dimetilo en presencia de 5 mmoles (0,42 g)
de NaHCO_{3} durante 10 horas. Se añade luego éter dietílico para
precipitar el residuo oleoso, el cual es disuelto en 20 ml de agua
saturada con n-butanol y agitado en presencia de
hidrocarbonato de amonio durante 2 horas. Se diluye luego la mezcla
en agua y se extrae con n-butanol varias veces. Se
lava la fase orgánica sucesivamente con agua, una solución acuosa
saturada de NaCl y luego agua y se concentra a un pequeño volumen a
baja presión. Se añade un exceso de éter dietílico para precipitar
el producto bruto, que es después centrifugado, lavado varias veces
en éter y secado por evaporación. Se realiza la purificación por
cromatografía de intercambio de iones sobre celulosa
CH-52 con un solvente de metanol:agua (1:1) y, como
efluente, una solución en metanol al 5% de NaCl:agua (1:1). Se
evapora el eluato para eliminar el metanol, se diluye en agua y se
extrae varias veces con n-butanol. Se lava la fase
del butanol varias veces en agua para eliminar el NaCl y se evapora
después para obtener un pequeño volumen. Se precipita luego el
producto final con éter dietílico, se lava con éter y se seca por
evaporación. Se obtienen así 0,11 g (18%) de cloruro de MLAME
(E^{1%} = 980 a 382 nm en MeOH).
Este ejemplo describe la síntesis de derivados
catiónicos combinados de la anfotericina B según la invención. Más
concretamente, este ejemplo describe la síntesis de los compuestos
OAMA (compuesto XIX, Figura 7), L-aspartato de OAMA
y PAMPA (compuesto XX, Figura 7).
A 0,5 mmoles de
3-dimetilaminopropilamida de anfotericina B (0,503
g) en 20 ml de DMF se añaden, a 0ºC, 1 mmol (0,576 g) de
N^{\alpha},N^{\varepsilon}-di-Fmoc-D-ornitina,
1,25 mmoles de azida difenilfosforílica (0,27 ml) y 1,25 mmoles de
trietilamina (0,17 ml). Se mantiene la mezcla de reacción bajo
agitación durante una noche a temperatura ambiente. El aislamiento
del derivado bruto Fmoc, así como de su producto desprotegido, y la
purificación del producto final son realizados como se ha descrito
en el ejemplo 8.4. Se obtienen así 0,18 g (32%) de OAMA (E^{1%} =
720 a \lambda = 382 nm en MeOH).
A 0,2 mmoles (0,227 g) de OAMA en un pequeño
volumen de agua se añaden con agitación gota a gota 0,6 mmoles (0,08
g) de ácido L-aspártico en 3 ml de agua. Se añade
luego un exceso de acetona para precipitar un sólido amarillo.
Después de la centrifugación, del lavado con acetona y luego con
éter dietílico y del secado a vacío se obtienen 0,29 g (94,4%) de
la sal L-aspartato de OAMA (E^{1%} = 700 a
\lambda = 382 nm en una mezcla de H_{2}O/MeOH (1:1)).
Se hace reaccionar a 0,5 mmoles (0,902 g) de
4-metilpiperazinamida de anfotericina B en 20 ml de
DMF con 1 mmol (0,172 g) de ácido
4-metil-1-piperazinapropió-nico
en presencia de azida difenilfosforílica (DPPA) y trietilamina en
las condiciones descritas en el ejemplo 12.1. Se aísla el producto
bruto de la mezcla y se purifica por cromatografía de intercambio
iónico como se ha descrito en el ejemplo 8.2. Se obtienen así 0,2 g
(35%) de PAMPA (E^{1%} = 850 a 382 nm en MeOH).
Este ejemplo demuestra que los derivados
catiónicos de la anfotericina B según la invención presentan, además
de su capacidad de vectorización de moléculas, propiedades
antifúngicas propias.
Se estudió la actividad antifúngica de los
compuestos descritos en los ejemplos 8 a 12 en una cepa de Candida
albicans. Más concretamente, cada compuesto fue incubado, a
diferentes concentraciones, con un cultivo de Candida
albicans ATCC10261 (inóculo 4.10^{3} células/ml) en medio de
Sabouraud líquido durante 24 horas a 30ºC. Se midió luego el
crecimiento celular por espectrofotometría a una longitud de onda de
660 nm. Se definió la actividad antifúngica por la CI_{50}, es
decir, la concentración de cada producto estudiado que induce un 50%
de inhibición del crecimiento de las cepas. En la siguiente Tabla se
presentan los resultados obtenidos.
| Compuesto | CI_{50} |
| AMMEA (Ejemplo 8) | 0,013 |
| AMPEA (Ejemplo 8) | 0,015 |
| AMPA (Ejemplo 8) | 0,015 |
| AMSA (Ejemplo 8) | 0,10 |
| AMDLA (Ejemplo 8) | 0,12 |
| AMEE (Ejemplo 9) | 0,08 |
| AMPE (Ejemplo 9) | 0,10 |
| SAME (Ejemplo 10) | 0,125 |
| PAME (Ejemplo 11) | 0,15 |
| PNAME (Ejemplo 11) | 0,16 |
| MLAME (Ejemplo 11) | 0,15 |
| OAMA (Ejemplo 12) | 0,15 |
| PAMPA (Ejemplo 12) | 0,17 |
| L-aspartato de OAMA (Ejemplo 12) | 0,17 |
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Schaffner y col. (Antibiot.
Chemother. 11 (1961) 724).
Mechlinski y col. (J. Antibiot. 25
(1972) 256).
Pandey y col. (J. Antibiot. 30
(1977) 158).
\vskip0.333000\baselineskip
<110> UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE
(PARIS VI) TECHNICAL UNIVERSITY OF GDANSK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES PARA LA VECTORIZACIÓN
DE MOLÉCULAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> B3850A - PB/KM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140>
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<150> 9804317
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
04-07-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: OLIGONUCLEÓTIDO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipccatcccgac ctcgcgctcc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: OLIGONUCLEÓTIDO
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<400> 2
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskiptgtgtttttg ttttgttggt tttgttt
\hfill
Claims (30)
1. Composición consistente en:
- una molécula de interés negativamente cargada
y
- un compuesto macrólido poliénico catiónico
susceptible de interaccionar con dicha molécula.
2. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que la molécula de interés
cargada negativamente es un ácido nucleico.
3. Composición según la reivindicación 2,
caracterizada por el hecho de que el ácido nucleico es un
oligonucleótido antisentido o antigén.
4. Composición según la reivindicación 2,
caracterizada por el hecho de que el ácido nucleico comprende
una región codificante de un polipéptido o de una proteína de
interés.
5. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto macrólido
poliénico catiónico es un antibiótico macrólido heptaénico
aromático, preferiblemente perimicina.
6. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto macrólido
poliénico catiónico es un derivado de antibiótico macrólido
poliénico que contiene uno o varios grupos funcionales catiónicos o
susceptibles de serlo.
7. Composición según la reivindicación 6,
caracterizada por el hecho de que el antibiótico macrólido
poliénico es un antibiótico macrólido heptaénico no aromático,
preferiblemente anfotericina B, candidina o micoheptina.
8. Composición según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizada por el hecho de que el derivado es un derivado
éster, amida, hidrazida, N-alquilo o
N-aminoacilo.
9. Composición según una de las reivindicaciones
6 a 8, caracterizada por el hecho de que el derivado de
antibiótico macrólido poliénico contiene uno o varios grupos
funcionales catiónicos unidos de manera covalente a la función
carboxílica del grupo aglicona y/o a la o las funciones amina del
antibiótico macrólido poliénico.
10. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto es una amida
primaria, secundaria o terciaria de la anfotericina B.
11. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto es un éster de
la anfotericina B, preferiblemente un éster de colina o un éster
dimetilaminopropílico.
12. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto es una
hidrazida de la anfotericina B, preferiblemente
N-metilpiperazinahidrazida de la anfotericina B.
13. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto es un derivado
N-alquílico de la anfotericina B, preferiblemente
un derivado N',N',N'-trimetil- o
N',N'-dimetilaminopro-pil-succinimidílico
del éster metílico de la anfotericina B.
14. Composición según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el compuesto es un derivado
N-aminoacílico de la anfotericina B, preferiblemente
el éster metílico de N-ornitil-,
N-diaminopropio-nil-,
N-lisil-, N-hexametillisil-,
N-piperidinapropionil- y
N,N'-metil-1-piperazinapropionil-anfotericina
B.
15. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto es un derivado
catiónico de la anfotericina B que lleva simultáneamente un grupo
catiónico funcional sobre las posiciones carboxilo y amino de la
anfotericina B.
16. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada por el hecho de que el compuesto es un derivado
catiónico de la nistatina, de la candidina, de la micoheptina o de
la vacidina.
17. Composición según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de
que las cantidades respectivas de compuesto y de ácido nucleico son
seleccionadas de tal forma que la razón de cargas positivas del
compuesto con respecto a las cargas negativas del ácido nucleico (R)
esté comprendida entre 0,1 y 20.
18. Derivado catiónico de antibiótico macrólido
poliénico seleccionado entre piridiletilamida de anfotericina B
(AMPEA), esperminilamida de anfotericina B (AMSA),
N^{2}-lisillisinametiléster amida de anfotericina
B (AMDLA), B-4-metilpiperazinamida
de anfotericina B (AMPA), éster de colina de anfotericina B (AMCE),
éster dimetilaminopropílico de anfotericina B (AMPE), éster 2-
dimetilaminoetílico de anfotericina B (AMEE), éster metílico de
N',N'- dimetilaminopropilsuccinimidoanfotericina B (SAME),
N-4-metil-1-piperazinacetil-
AME (PNAME), N-piperidinacetil-AME
(PAME), N-tetrametillisil-AME
(MLAME), N-ornitil-AMA (OAMA),
N-4-metil-1-piperazinacetil-AMPA
(PAMPA) y Vacidina A (VAGA) tal como se representa en la Figura
8.
19. Utilización de una composición según una de
las reivindicaciones 1 a 17 o de un compuesto según la
reivindicación 18 para la transferencia de moléculas de interés
cargadas negativamente en las células in vitro.
20. Utilización de una composición según una de
las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de una composición
destinada a la transferencia de un ácido nucleico en una célula, un
tejido o un órgano in vivo o ex vivo.
21. Utilización según la reivindicación 19 ó 20
para la transferencia de ácidos nucleicos en células fúngicas, de
protozoos parásitos y de levaduras.
22. Utilización según la reivindicación 19 ó 20
para la transferencia de ácidos nucleicos en células de
mamífero.
23. Utilización según la reivindicación 19 ó 20
para la transferencia del gen MDR.
24. Utilización de una composición según una de
las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de un producto
destinado a la transferencia, en una célula fúngica o del parásito
Leishmania, de un ácido nucleico que reduce las resistencias a los
antibióticos de dicha célula.
25. Procedimiento de preparación de una
composición según la reivindicación 1 que consiste en poner en
contacto, en solución, la molécula de interés con el compuesto.
26. Procedimiento según la reivindicación 25 que
incluye además una etapa de formación de complejos entre dicha
molécula y dicho compuesto.
27. Célula modificada por una composición según
la reivindicación 1.
28. Utilización de un compuesto macrólido según
la reivindicación 1 como agente protector de la degradación de los
ácidos nucleicos por el suero.
29. Sales de derivados catiónicos según la
reivindicación 18, preferiblemente cloruros, aspartatos, glutamatos
y ascorbatos.
30. Compuesto según la reivindicación 18 como
antifúngico.
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