CN105037491A - 一类丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一类丙烷基阳离子肽脂质，其为具有下面通式结构的丙烷基阳离子肽脂质化合物：

Description

一类丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及非病毒基因载体及制备方法。
技术背景
基因治疗是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段，来纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病，其中癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。在基因治疗发展的几十年里，全世界启动了近2000例基因转染的基因治疗临床试验。1990年美国国立卫生研究院的Culver等首次将基因治疗应用到临床试验，采用基因治疗方法对腺苷脱氨酶(ADA)缺陷症进行治疗并取得了成功。2000年，法国成功采用基因治疗技术治愈联合免疫缺陷综合症(X-SCID)，从此证实了基因治疗策略的有效性。但是基因治疗要得到进一步的发展，必须克服三个方面的难题：一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因的细胞；二、实现基因表达的可调控性；三、获得具有靶向性的高效低毒的基因载体系统。其中，具有靶向性高效的基因载体系统，成为制约基因治疗发展的瓶颈之一。
阳离子脂质体具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可以保护其运载基因片段的生物活性，是一种有临床应用潜力的非病毒基因转染载体。脂质体的这种结构可以包裹药物粉末或压缩基因形成复合物，递送至病变组织或细胞，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。自从1987年Felgner等首次利用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)对COS-7等细胞进行成功转染后，脂质体已经发展成为除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法，特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。但由于其仍存在一定的局限性，如细胞毒性大，对器官的靶向性不明显，基因转运机制不明确等限制了其广泛应用。因此，人们一直致力于对阳离子脂质体的各种构建及化学修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗载体。
脂质体发展的近30年来，从广泛使用的季铵盐头部、胍基头部到多胺头部阳离子脂质，已经形成了比较完善的脂质体载体系统，但这些载体系统仍然存在许多问题，如介导基因的转运效率还有待提高；对靶组织无定向识别性；阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞后，核酸被束缚于内涵体中，释放困难，不利于在细胞质或细胞核中表达，从而无法达到治疗目的。中国专利CN103553970A，2014-02-05公开了一类氨基甲酸酯型阳离子脂质的制备及其在药物或基因转运中的应用，该载体虽具有高效的基因转运能力，但由于具有季铵盐头部结构而存在一定的细胞毒性，因此在体内基因转运方面受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一类细胞毒性小，在体外基因转染效率高的丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用。
本发明的技术方案为：
一、一类丙烷基阳离子肽脂质及制备方法
1、一类丙烷基阳离子肽脂质，其化学结构由通式I表示：
其中：
R1选自C1-20烷基，最优选C12、C14、C16或C18；
x选自1～6，最优选2～4；
AA选自Lys、Orn、Arg、His、Asp、Ala或Gly。
2、一类丙烷基阳离子肽脂质的合成方法，它是以氨基保护的氨基酸制备肽头部中间体；将已氨基保护的3-氨基-1,2-丙二醇用酰化试剂酰化后与烷基胺反应，制备双长碳链中间体；将制备的肽头部中间体与制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接；将保护基团脱掉，再与氨基保护的氨基酸进行反应，脱保护后得到所述丙烷基阳离子肽脂质化合物。
具体步骤如下：
(1)利用正交保护法，采用保护试剂保护氨基酸的氨基，制备氨基酸头部中间体：所述氨基酸为赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸或精氨酸。所述保护试剂为Boc2O、Fmoc-OSu或CbzCl等，所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:1～8:1，反应溶剂为乙腈、水、四氢呋喃、甲苯、丙酮或上述溶剂的混合物等，反应时间为1～20h，反应温度为0～100℃。反应后旋蒸掉溶剂，进行重结晶提纯，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(v/v＝3:1)。
(2)用Fmoc-OSu保护试剂保护3-氨基-1,2-丙二醇的氨基，并与酰化试剂酰化后，与烷基胺反应，制备双取代的丙烷基长碳链中间体化合物：所述酰化试剂为羰基二咪唑，所述酰化试剂与3-氨基-1,2-丙二醇的摩尔比为1:1～3:1，酰化后3-氨基-1,2-丙二醇与烷基胺的摩尔比为1:1～8:1，反应溶剂为30mL～300mL甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿，反应时间为12～48h，反应温度为25～100℃。反应后，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用DMF、乙酸乙酯、乙醇、水或乙醇/水的混合溶剂进行重结晶。
(3)将步骤(1)制备的肽头部中间体，与步骤(2)制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接：a首先将肽头部中间体进行活化，所述的活化试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)或1-羟基苯并三唑(HOBt)，肽头部中间体与活化试剂摩尔比为1:1～1:8，反应温度为0～60℃，反应时间为0.5～24h。b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烷、DMF或三氯甲烷溶液，经过酰胺化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，肽头部中间体与长碳链中间体两者摩尔比为1:1～8:1反应，反应溶剂为甲苯、DMF、氯仿、丙酮或二氯甲烷，反应时间为12～96h，反应温度为20～100℃。
(4)将保护基团脱掉，所述氨基脱保护试剂为10％NaHCO3(w/v)或三氟乙酸，脱保护试剂与类脂化合物摩尔比为1:1～1:2，脱保护时间1-8h，脱保护温度为0～4℃；产物进行重结晶提纯得到粗产物，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯、乙腈、乙醇、水或无水乙醚。
(5)重结晶后使用柱层析法进行纯化，粗产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱。用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质化合物。
(6)以含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质化合物为原料，合成其他丙烷基阳离子肽脂质：将步骤(1)制备的肽头部中间体与步骤(5)制备的含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质，经过氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1～4个氨基酸的阳离子脂质化合物。两者摩尔比为1:8～8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)(5)相同。
二、阳离子肽脂质体及制备方法
1、一种由所述丙烷基阳离子肽脂质制备的阳离子肽脂质体，该阳离子肽脂质体为丙烷基阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小为100nm左右的均一稳定的表面带有正电荷的脂质体。
2、丙烷基阳离子肽脂质体的制备方法，步骤如下：按摩尔比1:1～8:1将所述丙烷基肽脂质化合物和助剂在氯仿、甲醇等有机溶剂中混合，使丙烷基肽脂质化合物的浓度为1-8mg/mL。在氮气下将溶液吹干，形成均匀薄膜，真空干燥2～24h(真空度为0.09MPa，常温)。加入超纯水、乙醇或磷酸缓冲液，在10～80℃水化1～10h，超声频率为100Hz下超声震荡至澄清透明，所述阳离子肽脂质体浓度为0.5～3mg/mL。所述助剂为卵磷脂、蔗糖酯、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或胆固醇。
三、丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物及制备方法
1、丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物是由所述丙烷基阳离子肽脂质体与pDNA或siRNA通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗粒。
2、丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步骤如下：
(1)取所述丙烷基阳离子肽脂质体分散在细胞培养液(DMEM或RPMI1640)中，混匀，使浓度为0.02μg/μL～0.16μg/μL；
(2)将0.5～1.0μgpDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀使质粒浓度为0.02μg/μL；
(3)按照脂质体与基因质量比1:1～8:1比例，将(1)和(2)两稀释液混匀，室温放置10～40min，即可得到丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。
四、所述丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物在细胞转染中的应用，主要包括：
(1)所述丙烷基肽脂质体/基因复合物可进入癌细胞中，完成目的基因在细胞内的转染。
(2)所述细胞为人喉癌上皮细胞(Hep-2)和非小肺腺癌细胞(A549)。不同氮磷比下获得的所述肽脂质体/基因复合物在不同细胞内的转染效率会有所差异。
(3)本发明提供的丙烷基肽脂质体/基因复合物适用于包括编码荧光素酶、绿色荧光蛋白等报告基因在内的pDNA，也适用于其他各种实验所需的siRNA。该载体能高效运载质粒DNA和siRNA转染细胞。
本发明的作用机理大致如下：本发明提供的一类丙烷基肽脂质，同时具有疏水和亲水特性，其疏水部分来源于丙烷基双长碳链，亲水部分取自于具有良好生物相容性的氨基酸或肽构成脂质头部，由于氨基酸或肽具有多氨基结构，可与带负电的核酸结合，能有效压缩核酸，同时对细胞具有良好的亲和性，从而可提高载体的转染效率。另外，氨基酸和肽为生物体必需的物质，可降低阳离子季铵盐脂质极性头部带来的毒性。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明的丙烷基阳离子肽脂质合成方法简单，采用的反应试剂及得到的产物无毒无污染，且原料成本低，具有较好的推广性；反应过程中，条件温和，副产物少且易提纯；可广泛应用于科学研究及生产。
2、本发明提供的丙烷基阳离子肽脂质体富含阳离子，具有压缩质粒DNA和siRNA的能力，可以形成纳米级的阳离子脂质体/基因复合物。所述丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物为酸敏感型，可有利于基因的释放，提高转染效率。丙烷基阳离子肽脂质体的阳离子头部为赖氨酸、组氨酸、精氨酸或鸟氨酸组成的肽，这些氨基酸为人体所必须的氨基酸之一，生物降解性好，降低了阳离子头部带来的毒性。
3、本发明所述的丙烷基阳离子肽脂质体稳定性好，粒径为100nm左右，Zeta电位在40～70mV之间，可压缩更多带负电的基因物质，提高体外体内转染效率、细胞相容性好、毒性小，可作为新型高效低毒的非病毒基因载体和转染试剂。
本发明的丙烷基阳离子肽脂质体与中国专利CN103553970A中的氨基甲酸酯型阳离子脂质体(DDCTMA)相比，转染效率高，毒性低；具有与商品试剂Lipofectamine2000相当的转染效率，与DOTAP相当的细胞毒性(Lipofectamine2000和DOTAP为标准对照试剂，Lipofectamine2000转染效率较高，DOTAP毒性较低)。
4、本发明提供的丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物将有望成为用于临床基因治疗的新型基因载体。
附图说明
图1为丙烷基肽脂质化合物R12O的红外光谱图；
图2为丙烷基肽脂质化合物R12O的核磁氢谱图；
图3为丙烷基肽脂质化合物R14AO的红外光谱图；
图4为丙烷基肽脂质化合物R14AO的核磁氢谱图；
图5为丙烷基肽脂质化合物R16OKK的红外光谱图；
图6为丙烷基肽脂质化合物R16OKK的核磁氢谱图；
图7为丙烷基肽脂质化合物R18AOKK的红外光谱图；
图8为丙烷基肽脂质化合物R18AOKK的核磁氢谱图；
图9为丙烷基肽脂质体的粒径图；
图10为丙烷基肽脂质体的Zeta电位图；
图11为丙烷基肽脂质体与质粒DNA的结合能力检测图；
图12是丙烷基肽脂质体运载pGFP-N2质粒转染Hep-2细胞的绿色荧光蛋白表达图；
图13是采用酶标仪检测丙烷基肽脂质体运载pGL-3质粒转染Hep-2细胞的荧光素酶表达图；
图14是丙烷基肽脂质体运载siRNA转染A549细胞，Luciferase基因沉默图；
图15是采用MTT比色法检测阳离子肽脂质体细胞转染过程中对Hep-2细胞毒性图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行阐述，但是这些阐述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本说明书中，以下述四种丙烷基阳离子肽脂质化合物为例进行说明。含Orn阳离子头部、氨基甲酸酯连接键和14碳丙烷基双疏水尾链，命名为N-(1,2-双十二胺基甲酰氧丙基)鸟氨酸酰胺，用R12O表示；含Ala-Orn二肽阳离子头部、氨基甲酸酯连接键和14碳丙烷基双疏水尾链，命名为N-(1,2-双十四胺基甲酰氧丙基)丙氨酸鸟氨酸酰胺(R14AO)；含Orn-Lys-Lys三肽阳离子头部、氨基甲酸酯连接键和16碳丙烷基双疏水尾链，命名为N-(1,2-双十六胺基甲酰氧丙基)鸟氨酸二聚赖氨酸酰胺(R16OKK)；含Ala-Orn-Lys-Lys四肽阳离子头部、氨基甲酸酯连接键和18碳丙烷基双疏水尾链，命名为N-(1,2-双十八胺基甲酰氧丙基)丙氨酸-鸟氨酸-二聚赖氨酸酰胺(R18AOKK)。
实施例1阳离子肽脂质化合物R12O合成方法如下：
(1)称取2mmolL-Orn溶于15mL乙腈中，16mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到鸟氨酸乙腈溶液中，反应生成络合物，加入10mL20％的碳酸氢钠水溶液，分批加入2g无水碳酸钠和适量的8-羟基喹啉，室温搅拌反应4h脱除络合物中的铜离子，再将2mmolFmoc-OSu加入到上述溶液中，室温搅拌2h，产品再用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂重结晶，得到肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH。
(2)将3-氨基-1,2-丙二醇10mmol溶解在50mL的水中，加入碳酸氢钠10mmol，再将Fmoc-OSu10mmol溶解在100mL的丙酮中，缓慢滴加，搅拌过夜。旋转蒸发蒸出丙酮。将8.0mmol上述产物溶于二氯甲烷/甲苯混合溶剂中，8.0mmolCDI溶于甲苯中，氮气保护下，两者缓慢滴加，25℃反应12h。将1mmol十二胺溶于5mL甲苯溶液中，缓慢滴加到上述反应液中，25℃再反应24h。在反应液中加入3.0mmol的氢氧化钠，反应1h。反应结束后，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用乙腈/水(v/v＝5:1)重结晶，得到淡黄色的固体，真空干燥。再用DMF重结晶，得到双长碳链中间体R12。
(3)将制备的肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:8溶解于甲苯溶液，0℃下活化24h，再加入双长碳链中间体R12的甲苯溶液，肽头部中间体与双长碳链中间体按摩尔比8:1反应，在20℃下酰胺化反应96h，反应完毕在70℃旋转蒸发掉溶剂。用二氯甲烷/三氟乙酸＝2/1(v/v)溶剂溶解，置于4℃下8h，脱去保护基团Boc，用20mL10％NaHCO3溶剂溶解，反应1h，脱去Fmoc基团。
(4)将产物用乙酸乙酯、乙腈重结晶4次后，产物溶解于氯仿，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(体积比3:1)混合试剂进行洗脱。用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个鸟氨酸头部、12C双长碳链的丙烷基阳离子肽脂质R12O，结构表征如图1、图2所示。
其结构表征如下：1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:0.86(6H,CH3),1.25(36H,(CH2)9),2.95(2H,CH2NH2),3.08(2H,CH2NH),3.30(2H,OCHCH2),3.93(2H,CHNH2),4.01(2H,OCH2CH),5.02(1H,OCHCH2)。13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:12.98(CH3),23.09(CH3CH2),30.02((CH2)8),37.98(CH2NH),40.13(CH2NHCH),40.75(CH2NH2),52.76(CHNH,CHNH2),63.91(OCH2CH),71.45(OCH2CHO),158.80(NHCOO),169.15(NHCOCH)。IRν/cm-1:3289(νNH),2930(νCH),1679(νC＝O),1540(δNH),1190(νCN)。
实施例2阳离子肽脂质化合物R14AO合成方法如下：
(1)称取10mmolL-Ala溶于100mL乙腈中，12mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到Ala的乙腈溶液中，室温搅拌反应2h，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，再用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂重结晶，得到肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH。
(2)将3-氨基-1,2-丙二醇10mmol溶解在50mL的水中，加入碳酸氢钠10mmol，再将Fmoc-OSu20mmol溶解在100mL的丙酮中，缓慢滴加，搅拌过夜。旋转蒸发蒸出丙酮。将5.0mmol上述产物溶于二氯甲烷/甲苯混合溶剂中，氮气保护下加入5.0mmolCDI甲苯溶液，80℃反应2h。将12mmol十四胺的甲苯溶液，缓慢滴加到上述反应液中，80℃再反应2h。在反应液中加入3.0mmol的氢氧化钠，反应1h。反应结束后，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用乙腈/水(v/v＝5:1)重结晶，得到淡黄色的固体，再用DMF重结晶，得到双长碳链中间体R14。
(3)制备的肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:1溶解于甲苯溶液，60℃下活化0.5h，再加入长碳链中间体R14的甲苯溶液(肽头部中间体与长碳链中间体按摩尔比1:1反应)，在40℃下酰胺化反应48h，反应完毕在70℃旋转蒸发掉溶剂。用二氯甲烷/三氟乙酸＝3/1(v/v)溶剂溶解，置于4℃下2h，脱去保护基团Boc。用二氧六环溶剂溶解，加入10％NaHCO32mL，反应2h，脱去Fmoc基团，在70℃下旋转蒸发掉溶剂。
(4)将产物用乙腈重结晶2次，经乙酸乙酯重结晶2次后，产物溶解于氯仿，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(体积比3:1)混合试剂进行洗脱。在70℃下用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个丙氨酸头部的丙烷基阳离子肽脂质化合物。
(5)称取10mmolL-Orn溶于30mL乙腈中，20mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到鸟氨酸乙腈溶液中，反应生成络合物，加入15mL10％的碳酸氢钠水溶液，分批加入3g无水碳酸钠和适量的8-羟基喹啉，30℃搅拌反应2h脱除络合物中的铜离子，再将12mmolFmoc-OSu加入到上述溶液中，30℃搅拌2h，反应完毕旋转蒸发掉溶剂，再用乙酸乙酯/石油醚体系重结晶2次，得到肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH。
(6)以步骤(4)制备的含有一个丙氨酸头部的阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的鸟氨酸肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH反应，两者摩尔比为8:1，经过氨基酸活化和酰胺化，即得到含有Ala-Orn二肽阳离子头部、14C双长碳链的丙烷基阳离子肽脂质R14AO，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)相同，结构表征如图3、图4所示。
其结构表征如下：1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:0.88(6H,CH3),1.26(44H,(CH2)11),2.89(2H,CH2NH2),3.06(2H,CH2NH),3.32(2H,OCHCH2),3.93(2H,CHNH2),4.04(2H,OCH2CH),4.97(1H,OCHCH2)。13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:12.91(CH3),22.98(CH3CH2),30.04((CH2)10),38.18(CH2NH),39.56(CH2NHCH),40.71(CH2NH2),52.79(CHNH,CHNH2),63.96(OCH2CH),71.24(OCH2CH),158.12(NHCOO),168.55(NHCOCH)。IRν/cm-1:3320(νNH),2900(νCH),1675(νC＝O),1540(δNH),130(νCN)。
实施例3阳离子肽脂质化合物R16OKK合成方法如下：
(1)称取10mmolL-Orn溶于15mL乙腈中，80mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到鸟氨酸乙腈溶液中，反应生成络合物，加入20mL20％的碳酸氢钠水溶液，分批加入2g无水碳酸钠和适量的8-羟基喹啉，室温搅拌反应4h，脱除络合物中的铜离子，再将10mmolFmoc-OSu加入到上述溶液中，室温搅拌2h，产品再用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂重结晶，得到肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH。
(2)将3-氨基-1,2-丙二醇5mmol溶解在50mL的丙酮中，加入碳酸氢钠5mmol，再将Fmoc-OSu7mmol溶解在50mL的丙酮中，缓慢滴加，搅拌过夜。旋转蒸发蒸出丙酮。将2.0mmol上述产物溶于二氯甲烷溶剂中，2.0mmolCDI溶于甲苯中，氮气保护下，两者缓慢滴加，40℃反应24h。将2mmol十六胺溶于10mL甲苯溶液中，缓慢滴加到上述反应液中，40℃再反应48h。在反应液中加入5.0mmol的氢氧化钠，反应2h。反应结束后，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用乙腈/水(v/v＝5:1)重结晶，得到淡黄色的固体，真空干燥。再用DMF重结晶，得到双长碳链中间体R16。
(3)制备的肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:2溶解于甲苯溶液，室温下活化2h，再加入长碳链中间体R16的甲苯溶液，肽头部中间体与长碳链中间体按摩尔比1:2反应，在40℃下酰胺化反应48h，反应完毕在70℃旋转蒸发掉溶剂。用二氯甲烷/三氟乙酸＝2/1(v/v)溶剂溶解，置于4℃下1h，脱去保护基团Boc。用二氧六环溶剂溶解，加入30mL10％NaHCO3反应2h，脱去Fmoc基团。
(4)将产物用乙腈重结晶，再用石油醚重结晶4次后，产物溶解于氯仿，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(体积比3:1)混合试剂进行洗脱。在70℃下旋转蒸发去除溶剂，冻干，即得到含有一个鸟氨酸头部的丙烷基阳离子肽脂质化合物。
(5)称取2mmolL-Lys溶于15mL乙腈中，2mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到赖氨酸乙腈溶液中，加入1mmol五水硫酸铜，反应生成(LysBoc)2Cu络合物，加入10mL20％的碳酸氢钠水溶液，分批加入2g无水碳酸钠和适量的8-羟基喹啉，室温搅拌反应4h脱除络合物中的铜离子，再将2mmolFmoc-OSu加入到上述溶液中，室温搅拌2h，产品再用乙酸乙酯/石油醚体系重结晶，得到肽头部中间体Fmoc-L-Lys(Boc)-OH。
(6)以含有一个鸟氨酸头部的阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的赖氨酸肽头部中间体反应，两者摩尔比为1:2，经过氨基酸活化和酰胺化，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)相同，即得到含有一个鸟氨酸二个赖氨酸结构的阳离子头部、16C双长碳链的丙烷基阳离子肽脂质R16OKK，结构表征如图5、图6所示。
其结构表征如下：1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:0.89(6H,CH3),1.29(52H,(CH2)13),2.90(4H,CH2NH2),3.18(6H,CH2NH),3.33(2H,OCHCH2),3.93(2H,CHNH2),4.15(2H,OCH2CH),4.88(1H,OCHCH2)。13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:13.01(CH3),22.85(CH3CH2),29.78((CH2)12),39.04(CH2NH),40.33(CH2NHCH),41.28(CH2NH2),52.87(CHNH,CHNH2),63.90(OCH2CH),71.45(OCH2CHO),157.0(NHCOO),169.0(NHCOCH)。IRν/cm-1:3430(νNH),2920(νCH),1670(νC＝O),1255(νCN)。
实施例4阳离子肽脂质R18AOKK化合物合成方法如下：
(1)称取20mmolL-Ala溶于100mL乙腈中，40mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到Ala的乙腈溶液中，室温搅拌反应2h，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，再用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂重结晶，得到肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH。
(2)将3-氨基-1,2-丙二醇15mmol溶解在80mL的丙酮中，加入碳酸氢钠10mmol，再将Fmoc-OSu40mmol溶解在80mL的丙酮中，缓慢滴加，搅拌过夜。旋转蒸发蒸出丙酮。将10mmol上述产物溶于二氯甲烷溶剂中，14mmolCDI溶于甲苯中，氮气保护下，两者缓慢滴加，40℃反应24h。将10mmol十八胺溶于10mL甲苯溶液中，缓慢滴加到上述反应液中，40℃再反应48h。在反应液中加入2.0mmol的氢氧化钠，反应2h。反应结束后，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用乙腈/水(v/v＝5:1)重结晶，得到淡黄色的固体，真空干燥。再用DMF重结晶，得到双长碳链中间体R18。
(3)制备的肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:2溶解于甲苯溶液，室温下活化2h，再加入长碳链中间体R18的甲苯溶液，肽头部中间体与长碳链中间体按摩尔比1:2反应，在40℃下酰胺化反应48h，反应完毕在70℃旋转蒸发掉溶剂。用10mL三氟乙酸溶剂溶解，置于4℃下2h，脱去保护基团Boc，用20mL10％NaHCO3溶剂溶解，反应0.5h，脱去Fmoc基团。
(4)将产物用乙腈重结晶2次，乙醇和水的混合溶剂(体积比为5:1)重结晶2次后，溶解于氯仿，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(体积比3:1)混合试剂进行洗脱。在70℃下旋转蒸发去除溶剂，冻干，即得到含有一个丙氨酸头部的丙烷基阳离子肽脂质化合物。
(5)称取10mmolL-Orn溶于15mL乙腈中，80mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到鸟氨酸乙腈溶液中，反应生成络合物，加入20mL20％的碳酸氢钠水溶液，分批加入2g无水碳酸钠和适量的8-羟基喹啉，室温搅拌反应4h，脱除络合物中的铜离子，再将10mmolFmoc-OSu加入到上述溶液中，室温搅拌2h，产品再用乙酸乙酯/石油醚体系重结晶，得到肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH。
(6)以步骤(4)制备的含有一个丙氨酸头部的阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的鸟氨酸肽头部中间体Fmoc-L-Orn(Boc)-OH反应，两者摩尔比为1:4，经过氨基酸活化和酰胺化，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)相同，即得到含有Ala-Orn二肽阳离子头部、18C双长碳链的丙烷基阳离子肽脂质
(7)称取5mmolL-Lys溶于30mL乙腈中，5mmolBoc2O溶于乙腈并滴加到赖氨酸乙腈溶液中，加入1mmol五水硫酸铜，反应生成(LysBoc)2Cu络合物，加入10mL20％的碳酸氢钠水溶液，分批加入2g无水碳酸钠和适量的8-羟基喹啉，室温搅拌反应4h脱除络合物中的铜离子，再将5mmolFmoc-OSu加入到上述溶液中，室温搅拌2h，产品再用乙酸乙酯/石油醚体系重结晶，得到肽头部中间体Fmoc-L-Lys(Boc)-OH。
(8)以步骤(6)制备的含有Ala-Orn二肽头部的阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(7)制备的已氨基保护的赖氨酸肽头部中间体Fmoc-L-Lys(Boc)-OH反应，两者摩尔比为1:8，经过氨基酸活化和酰胺化，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)相同，即得到含有四个氨基酸头部、18C双长碳链的丙烷基阳离子肽脂质R18AOKK，结构表征如图7、图8所示。
其结构表征如下：1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:0.88(6H,CH3),1.28(60H,(CH2)15),2.94(4H,CH2NH2),3.16(8H,CH2NH),3.34(2H,OCHCH2),3.92(2H,CHNH2),4.15(2H,OCH2CH),4.33(1H,CHNH),4.89(1H,OCHCH2)。13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:13.12(CH3),22.65(CH3CH2),28.85((CH2)16),39.13(CH2NH),40.34(CH2NHCH),40.99(CH2NH2),52.72(CHNH,CHNH2),63.78(OCH2CH),71.25(OCH2CHO),157.10(NHCOO),169.0(NHCOCH)。IRν/cm-1:3435(νNH),2925(νCH),1675(νC＝O),1255(νCN)。
本领域技术人员将从实施例1～实施例4中很容易看出，本发明所述的各种丙烷基阳离子肽脂质，都能通过酰化试剂二乙烯三胺酰化3-氨基-1,2-丙二醇，与烷基醇类原料生成丙烷基长碳链中间体，并通过酯化和酰胺化反应与氨基酸的羧基发生缩合反应，生成含有1～8个氨基酸的丙烷基阳离子肽脂质，并通过一系列相似的分离纯化手段除去杂质，得到纯品。
实施例5用R12O制备阳离子肽脂质体
称量1mg的阳离子肽脂质R12O与8：1摩尔比的胆固醇溶于1mL三氯甲烷溶剂中，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥12h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，加入1000μL超纯水，在80℃左右水化2h，超声频率为100Hz下超声震荡至澄清透明，制得阳离子肽脂质体浓度为1mg/mL。
实施例6用R14AO制备阳离子肽脂质体
称量0.5mg的阳离子肽脂质R14AO溶于1mL三氯甲烷，加入蔗糖酯(R14AO蔗糖酯摩尔比为1:1)，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥4h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，用1mL超纯水浸泡6h，使膜脱落，在20℃左右反复超声震荡(震荡频率为100Hz)至澄清透明，制得浓度为0.5mg/mL的阳离子肽脂质体。
实施例7用R16OKK制备阳离子肽脂质体
称量1.5mg的阳离子肽脂质R16OKK与助类脂DOPE(R16OKK与DOPE摩尔比为2:1)溶于1mL三氯甲烷中，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥8h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，加入1mL磷酸盐缓冲液，水化4h，在55℃左右超声频率为100Hz下超声震荡至澄清透明，制得浓度为1.5mg/mL阳离子肽脂质体R16OKK。
实施例8用R18AOKK制备阳离子肽脂质体
准确称量摩尔比为3:1的阳离子肽脂质R18AOKK与DOPC(阳离子肽脂质体为3mg)，溶于1mL甲醇和三氯甲烷混合溶剂中，甲醇：三氯甲烷＝1：2(体积比)，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥5h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，加入200μL55℃左右的无水乙醇使膜脱落，加入800μL缓冲液，在35℃左右反复超声震荡(超声频率为100Hz)至澄清透明，制得浓度为3mg/mL的阳离子肽脂质体。
实施例9脂质体的粒径及Zeta电位检测
采用激光散射粒度仪(HORIBA纳米粒度仪SZ-100)在25℃，光散射角度90°条件下测定制备的阳离子肽脂质体的粒径及其Zeta电位，用移液枪取20μL实施例5～实施例8制备的阳离子肽脂质体稀释于1mL超纯水中分别进行粒径和Zeta电位检测，结果见图9和图10。图9为4种丙烷基肽脂质体的平均粒径，图10为4种丙烷基肽脂质体的Zeta电位。
结果显示，4种丙烷基阳离子肽脂质形成的脂质体粒径都在100nm左右，在转染的有效粒径(＜1μm)范围之内。Zeta电位为正，绝对值均大于30mV，证明脂质体具有较好的静电稳定性。
实施例10R12O脂质体/DNA复合物的制备
如实施例5中所述方法制备得到丙烷基阳离子肽脂质体。取1mg/mL脂质体R12O0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5mg/mL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为1:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育10min，得到R12O脂质体/DNA复合物。
实施例11R14AO脂质体/DNA复合物的制备
如实施例6中所述方法制备得到丙烷基阳离子肽脂质体。取0.5mg/mL脂质体R14AO1μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5mg/mL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为2:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育20min，得到R14AO脂质体/DNA复合物。
实施例12R16OKK脂质体/DNA复合物的制备
如实施例7中所述方法制备得到丙烷基阳离子肽脂质体。取1.5mg/mL脂质体R16OKK3.0μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5mg/mL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为6:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育30min，得到R16OKK脂质体/DNA复合物。
实施例13R18AOKK脂质体/DNA复合物的制备
如实施例8中所述方法制备得到丙烷基阳离子肽脂质体。取3.0mg/mL脂质体R18AOKK4.0μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5μg/μL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为8:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育40min，得到R18AOKK脂质体/DNA复合物。
实施例14丙烷基阳离子肽脂质体/siRNA复合物的制备
如实施例5～实施例8中所述方法制备得到丙烷基阳离子肽脂质体，取脂质体1mg/mLR14AO0.9μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.3μg/μLsiRNA0.3μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与siRNA质量比为3:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育20min，得到R14AO脂质体/siRNA复合物。
实施例15脂质体结合质粒DNA电泳延滞实验
采用琼脂糖凝胶电泳延滞实验，检测丙烷基阳离子肽脂质体与质粒DNA在不同质量比时其相应的电荷比情况，进一步得出压缩的有效比例。将肽脂质体与质粒DNA按质量比依次为0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、8:1分别稀释于25μLDMEM培养液中轻微漩涡震荡混匀，室温孵育20min，取2μL的6×DNALoadingbuffer依次加入上述20μL肽脂质体与质粒DNA复合物中混匀，并依次上样于1.2％的琼脂糖凝胶上样孔中，电压设为90V，电泳40min。制胶时已加入核酸染液NA-Red，电泳结束后直接在凝胶成像系统GeneGeniusBio-imagingSystem(SYNGENE公司)中观察DNA延滞情况。电泳结果如附图11所示，其中泳道1～8为阳离子肽脂质体与DNA按质量比分别为0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1和8:1的脂质体/DNA复合物。A为丙烷基肽脂质体R16OKK结合DNA电泳图，B为丙烷基肽脂质体R18AOKK结合DNA电泳图，C为丙烷基肽脂质体R12O结合DNA电泳图，D为丙烷基肽脂质体R14AO结合DNA电泳图。
图11结果显示，由R16OKK、R18AOKK和R14AO制备的肽脂质体都能有效压缩pDNA，随着肽脂质体浓度逐渐增加，游离出来的DNA条带逐渐减弱，在N/P大于2:1时，DNA即能完全被脂质体压缩；由R12O制备的脂质体压缩DNA的能力相对较差。
实施例16体外生物学评价实验
(1)运载pGFP-N2质粒转染细胞实验
将Hep-2细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔加细胞浓度约为1.0×105个/孔，孵育24h后，使在转染日细胞密度达80～90％。将脂质体与pGFP-N2质粒分别按照1:1，2:1，3:1，4:1，6:1和8:1比例复合，复合后总体积为100μL。将复合物加到细胞培养板中，培养4-5h，更换含血清10％和抗生素的培养基，培育48h。绿色荧光蛋白基因表达的产物GFP能激射峰值508nm的绿色荧光，采用倒置荧光显微镜进行基因表达分析。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无，GFP阳性细胞越多，信号越强，表明转染率越高。观察倍数20×10。
结果如附图12所示，脂质体与DNA质量比为3:1时，脂质体能高效转染Hep-2细胞，绿色荧光强度明显高于氨基甲酸酯型阳离子脂质体DDCTMA，与商品试剂Lipofectamine2000相比，绿色荧光蛋白强度明显增强。
(2)运载pGL-3质粒转染细胞实验
细胞培养方法与上述步骤(1)相同。脂质体与pGL3质粒分别按照1/1，2/1，3/1，4/1，6/1和8/1比例复合，复合后总体积为100μL。将复合物加到细胞培养板中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2(培养箱)中培养4-5h，更换含血清10％和抗生素的培养基，培育48h。转染后将细胞用DPBS洗1次，每孔加入600μL裂解液，20min后，移至96孔白板中，每孔加80μL普洛麦格E151A检测液。利用Synergy2多功能酶标仪(BioTek)检测相对酶活力。以热电公司的PierceBCAProteinAssay试剂盒为标准对照测定总蛋白含量。蛋白质测定后，转染效率可表示为：RLU/mg蛋白。
实验结果如附图13所示，4个脂质体均能够运载pGL3质粒转染Hep-2细胞，转染效率高于氨基甲酸酯型阳离子脂质体DDCTMA。其中，脂质体R16OKK在N/P比为4:1时，转染效率最高，是氨基甲酸酯型阳离子脂质体DDCTMA转染效率的2.5倍，是商品转染试剂Lipofectamine2000转染效率的2倍，是DOTAP转染效率的10倍，。
(3)RNA干扰实验
细胞铺板没有计数，取基本长满的A549细胞，加到12孔板中，每孔加2mL，培养约24h，细胞密度约为50-60％。每孔加入200μL脂质体/siRNA复合物，转染18h，换生长培养基培养30h。将细胞用DPBS洗1次，每孔加入600μL裂解液，20min后，移至96孔白板中，每孔加20μL，加80μL普洛麦格E151A检测液，用多功能酶标仪(BioTek)检测相对酶活力。取裂解液5μL加到96孔透明板中，以热电公司的PierceBCAProteinAssay试剂盒为标准对照测定总蛋白含量。
图14为4种丙烷基肽脂质体运载siRNA转染A549细胞沉默Luciferase基因的能力，siRNA和Control为空白对照。结果显示：4种丙烷基肽脂质体转染A549细胞后，Luciferase基因的表达水平均受到不同程度的抑制，与商品试剂Lipofectamine2000相比，沉默效率提高约40～50％。其中，脂质体R16OKK/siRNA和R18AOKK/siRNA与空白组相比，荧光素酶基因的沉默效率可达60～75％，与氨基甲酸酯型阳离子脂质/基因复合物DDCTMA和商品试剂DOTAP相比，沉默效率明显提高。
(4)细胞毒性研究(MTT比色法)
采用MTT法对转染效率较高的阳离子脂质体进行细胞毒性试验，以商品化基因转染试剂Lipofectamine2000及DOTAP为对照。将Hep-2细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔加细胞培养液(含双抗和血清)100μL，浓度约为1.0×106个/孔，孵育24h，使在转染日细胞密度达80～90％。移去生长培养基，用100μL培养基清洗，再用等量(100μL)培养基替换。将脂质体与质粒DNA分别按照1:1，2:1，3:1，4:1，6:1和8:1比例复合加到细胞培养板中。细胞培养24h后，每孔中加入20μLMTT(Sigma，5mg/mL)，孵育培养4～4.5h。弃去培养液，加入150μLDMSO溶破细胞，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光值，以空白对照(未转染细胞)的吸光值为100％，计算转染后细胞存活的百分率(％)。计算公式为：细胞存活率(％)＝[A]样品/[A]对照×100％。
实验结果如图15，横坐标为所制备的丙烷基阳离子肽脂质体，脂质体与DNA质量比为1:1～8:1。4个脂质体对Hep-2细胞的毒性都不大，细胞存活率在90以上。与氨基甲酸酯型阳离子脂质基因复合物DDCTMA、商品试剂Lipofectamine2000和DOTAP相比，细胞存活率明显提高。

Claims (8)

1.一类丙烷基阳离子肽脂质，其特征是：其具有通式I结构：
其中：
R1选自C1-20烷基，x选自1～6，AA选自赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)或甘氨酸(Gly)。
2.根据权利要求1所述的丙烷基阳离子肽脂质，其特征是：R1选自C12、C14、C16或C18烷基，x选自2～4。
3.权利要求1所述的丙烷基阳离子肽脂质的合成方法，其特征是：步骤如下：
1)采用正交保护法，用保护试剂保护氨基酸的氨基，制备肽头部中间体：所述氨基酸选自Lys、Orn、Arg、His、Asp、Ala或Gly，所述氨基保护试剂为二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)或氯甲酸苄酯(CbzCl)，所述保护试剂与氨基酸的摩尔比为1:1～8:1，反应溶剂为乙腈、甲苯、丙酮、四氢呋喃或水，反应时间为1～20h，反应温度为0～100℃。反应后旋蒸掉溶剂，进行重结晶提纯，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(v/v＝3:1)；
2)用Fmoc-OSu保护试剂保护3-氨基-1,2-丙二醇的氨基，并与酰化试剂酰化后，与烷基胺反应，制备双取代的丙烷基长碳链中间体化合物：所述酰化试剂为羰基二咪唑，所述酰化试剂与3-氨基-1,2-丙二醇的摩尔比为1:1～3:1，酰化后3-氨基-1,2-丙二醇与烷基胺的摩尔比为1:1～8:1，反应溶剂为30～300mL甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿，反应时间为12～48h，反应温度为25～100℃，反应后在70℃下
旋转蒸发掉溶剂，用DMF、乙醇、乙酸乙酯、水或乙醇/水的混合溶剂进行重结晶；
3)将步骤1)制备的肽头部中间体，与步骤2)制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接：
a首先将肽头部中间体进行活化，所述的活化试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)或1-羟基苯并三唑(HOBt)，肽头部中间体与活化试剂摩尔比为1:1～1:8，反应温度为0～60℃，反应时间为0.5～24h；
b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烷、DMF或三氯甲烷溶液，经过酰胺化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，肽头部中间体与长碳链中间体两者摩尔比为1:1～8:1反应，反应溶剂为甲苯、DMF、氯仿、丙酮或二氯甲烷，反应时间为12～96h，反应温度为20～100℃，
4)将保护基团脱掉，所述氨基脱保护试剂为10％NaHCO3(w/v)或三氟乙酸，脱保护试剂与类脂化合物摩尔比为1:1～1:2，脱保护时间1～8h，脱保护温度为0～4℃；产物进行重结晶提纯得到粗产物，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯、乙腈、乙醇、水或无水乙醚，
5)重结晶后使用柱层析法进行纯化，粗产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质化合物，
6)以含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质化合物为原料，合成其他丙烷基阳离子肽脂质：将步骤(1)制备的肽头部中间体与步骤(5)制备的含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质，进行氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1～6个氨基酸的阳离子脂质化合物，两者摩尔比为1:8～8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)(5)相同。
4.一种由权利要求1所述丙烷基阳离子肽脂质制备的阳离子肽脂质体，其特征是：该阳离子肽脂质体为丙烷基阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小为100nm左右的均一稳定的表面带有正电荷的脂质体。
5.权利要求4所述的丙烷基阳离子肽脂质体的制备方法，其特征是：步骤如下：
(1)将丙烷基阳离子肽脂质与助剂按照摩尔比1:1～8:1比例溶解于氯仿或甲醇中，所述助剂为卵磷脂、蔗糖酯、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或胆固醇；
(2)溶液在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥4～12h；
(3)在10～80℃下，用乙醇、超纯水或磷酸缓冲液水化1～6h，超声震荡至透明，得到丙烷基阳离子肽脂质体，浓度为0.5～3.0mg/mL。
6.一种由权利要求4所述的丙烷基阳离子肽脂质体制备的丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，其特征是：由权利要求4所述丙烷基阳离子肽脂质体与质粒DNA(pDNA)或小干扰RNA(siRNA)，通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步骤如下：
(1)取权利要求4所述丙烷基阳离子肽脂质体0.5～8μL分散在25～50μLDMEM或RPMI1640细胞培养液中，混匀，使浓度为0.02μg/μL～0.16μg/μL；
(2)将pDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀0.5～1.0μg,使质粒浓度为0.02μg/μL；
(3)按照脂质体与基因质量比1:1～8:1比例，将(1)和(2)两稀释液混匀，室温放置10～40min，即可得到丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。
8.一种权利要求5所述的丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，其特征是：该基因复合物在细胞转染中的应用。
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