CN103613516A - 一类双子型阳离子类脂的制备及其在药物或基因转运中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双子型阳离子类脂及其制备方法。该阳离子类脂应用于转运药物或基因的载体的制备。本发明运用化学合成的方法制备了双子型阳离子类脂化合物，合成方法简单，产物收率较高。本发明的双子型阳离子类脂化合物与类脂助剂混合，可制备包括悬浮液，乳浊液，微胶粒和脂质体等组合物。这些组合物具有低毒、细胞相容性好、转染效率高、使用方便等优点，是一种新型的高效的基因载体和转运试剂。

Description

一类双子型阳离子类脂的制备及其在药物或基因转运中的应用

技术领域

本发明涉及一类阳离子类脂及其制备方法和应用，尤其涉及一类双子型阳离子类脂、其制备方法以及该类双子型阳离子类脂在药物或基因在胞内转运中的应用。

背景技术

基因治疗作为一种全新的、革命性的治疗手段，它的有效性已得到许多研究的验证，已经成为化学、生物学和医药工程等最活跃的研究领域之一，是对传统医学治疗手段的一场变革，将对传统制药业产生深远影响，具有广阔的应用前景。基因的靶向转运是基因治疗的关键技术之一，在基因转运过程中，通过适当的载体将治疗基因输送到靶细胞内，以使细胞产生内源性的目的蛋白质或多肽，发挥其特异的生物治疗作用。然而，其核心技术-基因转运的难题一直限制着基因治疗的发展和临床试验，因此，近年来基因转运载体的研究倍受关注[1,2]。

基因载体可分为病毒基因载体和非病毒基因载体，病毒基因载体是利用病毒侵染细胞的能力，以病毒为基础构建的一种运载遗传物质的载体，与此相对应，不使用病毒进行基因转运的载体统称为非病毒基因载体。虽然病毒基因载体用于基因的转运具有效率高的优点，但存在免疫原性高、容量小、变异性和致癌性等缺点[3]。与病毒基因载体相比，非病毒基因载体虽然具有安全性高、容易制备以及能够装载大体积DNA等优点。然而，非病毒基因载体的转染效率与病毒载体相比还有一定的差距，成为制约其临床试验的瓶颈。开发高效、低毒的非病毒基因载体已成为基因治疗的重要研究内容之一。到目前为止，人们已经制备了多种新型阳离子类脂、阳离子高聚物和多肽等非病毒基因载体材料[4-8]。

阳离子脂质体作为基因载体的研究很受重视，阳离子脂质体的主要组分是阳离子类脂。Felgner在1987年合成的第一个阳离子类脂是单价DOTMA[9]。由于单价阳离子类脂不能有效压缩基因，转染效率不能达到治疗的要求。所以人们又开发了一系列多价阳离子类脂，如DOGS[10]，DPPES[10]和DOSPA[11]等，这些化合物的转染效率较DOTMA等单价阳离子类脂有一定的提高，但还是不能满足临床试验的要求。

本发明利用新的化学合成方法，制备出一系列满足运载药物（包括遗传物质）以及相关物质等需要的高效低毒的双子型阳离子类脂。

参考文献

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发明内容

本发明提供一类双子型阳离子类脂化合物，具有通式I的结构：

其中：

X^-选自F^-、Cl^-、Br^-、I^-、H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、NO₃ ^-、HSO₃ ^-、CH₃COO^-、葡萄糖酸根、葡萄糖醛酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根（CH₃CH₂COO^-）和甲磺酸根（CH₃SO₃ ^-）；

其中所述葡萄糖酸根（A1）、葡萄糖醛酸根（A2）、半乳糖酸根（A3）、半乳糖醛酸根（A4）结构如下：

R₁选自C_1-20烷基、十八烯基（C₁₇H₃₄CH₂-）和胆固醇基（C₂₇H₄₅-）；

其中所述胆固醇基（A5）结构如下：

R₂选自C_1-6烷基、C_1-6羟烷基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和叶酸酯基；

其中所述葡萄糖基（A6）、半乳糖基（A7）、甘露糖基（A8）、叶酸酯基（A9）的结构如下：

本发明的另一方面提供所述一类双子型阳离子类脂化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）羰基二咪唑和式ⅰ的化合物按照摩尔比8:1～1:8反应，制备式ⅱ化合物：

反应温度为10～100℃,反应时间为1～10h,反应溶剂为甲苯、苯、氯仿或二氯甲烷；

（2）式ⅱ化合物和二乙烯三胺按照摩尔比16:1～1:16反应，制备式ⅲ化合物：

反应温度为10～100℃,反应时间为1～10h,反应溶剂为甲苯、苯、氯仿或二氯甲烷；

（3）式ⅲ化合物与式ⅳ的化合物按照摩尔比1:1～80反应，制备式Ⅰ的化合物：

反应温度为50～100℃，反应时间为10～48h，反应溶剂为乙醚、石油醚或二氯甲烷。

上述对本发明的一类双子型阳离子类脂化合物的制备方法的描述中，各个取代基的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。

本发明再一方面提供一种双子型阳离子类脂组合物，该组合物包括上述的双子型阳离子类脂化合物和类脂助剂；

所述类脂助剂选自卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘髓磷脂、脑磷脂、心肌磷脂、磷脂酸、糖脂、磷酸三十二烷酯、二油酰磷脂酰氯（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰氯（DPPC）、棕榈酰油酰磷脂酰氯（POPC）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺（POPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和二油酰磷脂酰乙醇胺4-（N-马来酰亚胺基-甲基）环己烷-1-羧酸酯（DOPE-mal）、硬脂酰胺、十六烷胺、十四烷胺、十二烷胺、乙酰十六酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸盐、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化的脂肪酸酰胺、二十八烷基二甲基溴化铵、麦角甾醇B1，B2和B3、麦角甾醇、胆固醇、雄甾醇、胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、壳聚糖、蔗糖酯中的一种或两种以上的混合物。

上述双子型阳离子类脂组合物，所述双子型阳离子类脂化合物包括至少一种上述双子型阳离子类脂化合物。

上述双子型阳离子类脂组合物优选为悬浮液，乳浊液，微胶粒或脂质体。

上述双子型阳离子类脂组合物中，所述的双子型阳离子类脂化合物与类脂助剂的质量比为10:1～1:10。

本发明还提供上述阳离子类脂组合物向细胞内传递药物或传递遗传物质或传递药物和遗传物质中的应用。

上述应用中所述药物为阿霉素、阿巴瑞克、5-氟尿嘧啶、干扰素、丝裂霉素、多肽中的一种或两种以上的混合物；所述遗传物质为多核苷酸、DNA、RNA、MicroRNA、siRNA中的一种或两种以上的混合物。

上述的类脂组合物与所述药物或遗传物质或药物和遗传物质结合形成类脂复合物，所述复合物为悬浮液，乳浊液，微胶粒或脂质体。

本发明的双子型阳离子类脂化合物采用氨基甲酸酯作为类脂的连接键。连接键决定了阳离子脂质体的化学结构稳定性和被生物降解的能力。连接键类型对转染效率和细胞毒性也会产生影响。在最早研究的类脂分子中，极性与非极性的连接键多为醚键或C-N键，阳离子类脂分子的稳定性较好，转染后在体内不易分解，但容易积存从而导致细胞毒性。针对这个问题，易分解的酯键引起人们重视，酯键可以被有效降解代谢，却又不够稳定，采用这种连接键的脂质体往往在未到达目标组织时便已在循环系统中分解，从而影响转染效率。类似的还有酰氨键，虽能降解，但转染活力小，且稳定性不好。本发明采用了一种pH敏感的连接键—氨基甲酸酯键，因为氨基甲酸酯连接键具有酸敏感特性，由于细胞内涵体的pH值较之循环系统中要低1～2，由此可预期由这种连接键连接的阳离子类脂在循环系统中保持稳定，当进入细胞时由于pH值降低而分解，释放出药物（包括核酸等），从而达到既提高转染效率，又降低细胞毒性的目的。

传统观点认为，目标化合物中的氨基甲酸酯连接键可以通过异氰酸酯与醇羟基的加成而形成。异氰酸酯是一种难闻的催泪性液体，其分子中有一个碳原子与两个双键相连，有类似烯酮的结构，具有极高的化学活泼性，易与具有活泼氢的各类化合物发生反应，如水、醇和胺等，给使用和存储带来不便。制备目标分子的异氰酸酯需自行制备，现有的合成方法通常会引入剧毒的光气、氰酸化合物或易爆炸的叠氮化物等，存在着巨大的潜在性事故隐患。近年来也有其他异氰酸酯的制备方法，但操作较复杂，且产率不高。

鉴于传统方法的缺陷，考虑到实验室制备和工业化的条件，本发明采用一种安全高效的方法制备氨基甲酸酯。羰基二咪唑（CDI）可与-COOH、-NH₂、-OH等官能团进行反应，合成许多用一般方法难以得到的酮、酯、脲等化合物。本发明采用具有较强活性的羰基二咪唑为原料，与醇和氨反应，构建氨基甲酸酯连接键。该方法具有环保、安全等特点，适于实验室制备以及工业化生产。

本发明的有益效果：本发明的双子型阳离子类脂化合物采用对pH敏感的氨基甲酸酯作为类脂的连接键，达到降低细胞毒性的目的。本发明的双子型阳离子类脂化合物具有双子型头部，含有较多的正电荷，可以有效的压缩核酸，达到提高转染效率的目的。本发明的双子型阳离子类脂化合物的制备方法具有环保、安全等特点，适于实验室制备以及工业化生产。本发明的双子型阳离子类脂组合物，应用于药物或遗传物质的细胞内转染，其转染效率相当于或高于目前常用的转染试剂的转染效率，且对细胞的毒性低。因此，其有望成为一种新型的高效的载体，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明的一类双子型阳离子类脂化合物的结构通式I。

图2是实施例6脂质体的TEM照片。

图3是实施例7的阳离子脂质体-DNA复合物的电泳图谱，其中泳道1为2kb DNA marker，泳道2为裸DNA，泳道3～10为脂质体与DNA质量比分别是0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、6:1和8:1的脂质体-DNA复合物。

图4a是实施例8的阳离子脂质体-DNA复合物对Hep～2细胞内转染后绿色荧光蛋白检测结果：用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号，考查不同碳链长度的CTA对脂质体转染活性的影响。

图4b是实施例8的阳离子脂质体-DNA复合物对HeLa细胞内转染后荧光素酶检测结果：在Luminometer上进行检测相对光单元（RUL）值，测量发光时间为10s，以考查不同比例的类脂助剂对CTA12脂质体转染效率的影响。

图5是实施例9的阳离子脂质体对转染后对细胞存活率的影响：用MTT法测定。

具体实施方式

除了另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。例如“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其他基团。

本发明中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

本发明中使用的X^-表示阴离子，其可为可药用平衡阴离子，包括但不限于无机阴离子或有机阴离子，例如卤素离子、磷酸二氢根（H₂PO₄ ^ˉ）、碳酸氢根（HCO₃ ^-）、硝酸根（NO₃ ^-）、亚硫酸氢根（HSO₃ ^-）、葡萄糖酸根、葡萄糖醛酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根或甲磺酸根。

本发明的一类双子型阳离子类脂化合物，具有通式I的结构：

本发明的通式I的化合物中，X^ˉ为卤素离子、H₂PO₄ ^ˉ、HCO₃ ^ˉ、NO₃ ^ˉ、HSO₃ ^ˉ、CH₃COO^-、C₅H₁₁O₅COO^-（葡萄糖酸根）、C₅H₉O₅COO^-（葡萄糖醛酸根）、C₅H₁₁O₅COO^-（半乳糖酸根）、C₅H₉O₅COO^-（半乳糖醛酸根）、CH₃CH₂COO^-（丙酸根）和CH₃SO₃ ^ˉ（甲磺酸根）；X^ˉ优选选自卤素离子、NO₃ ^ˉ、HSO₃ ^ˉ、CH₃COO^ˉ、C₅H₁₁O₅COO^-（葡萄糖酸根）、C₅H₁₁O₅COO^-（半乳糖酸根）、C₅H₉O₅COO^-（半乳糖醛酸根）、CH₃CH₂COO^-（丙酸根）和CH₃SO₃ ^-（甲磺酸根）；更优选X^-选自卤素离子或C₅H₁₁O₅COO^ˉ（半乳糖酸根）。所述卤素离子为F^ˉ、Cl^ˉ、Br^ˉ、I^ˉ。

本发明的通式I的化合物中，R₁选自C_1-20烷基、十八烯基（C₁₇H₃₄CH₂-）和胆固醇基（C₂₇H₄₅-）；在优选的技术方案中，R₁优选选自C_12-18烷基，十八烯基和胆固醇基;更优选R₁选自C₁₂烷基，C₁₄烷基,十八烯基和胆固醇基。

本发明的通式I的化合物中,R₂选自C_1-6烷基，C_1-6羟烷基，C₆H₁₁O₆-（葡萄糖基）、C₆H₁₁O₆-（半乳糖基）、C₆H₁₁O₆-（甘露糖基）和C₁₈H₁₈N₇O₄COOCH₂CH₂-；在优选的技术方案中，R₂优选选自C_1-3烷基，C_1-3羟烷基，C₆H₁₁O₆-（半乳糖基）、C₆H₁₁O₆-（甘露糖基）和叶酸酯基（C₁₈H₁₈N₇O₄COOCH₂CH₂-）;更优选R₂选自甲基，乙基，羟乙基，半乳糖基和叶酸酯基。

本发明的另一方面提供所述一类双子型阳离子类脂化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）羰基二咪唑（CDI）和式ⅰ的化合物按照摩尔比8:1～1:8反应，制备式ⅱ化合物：

反应温度为10～100℃,反应时间为1～10h,反应溶剂为甲苯、苯、氯仿或二氯甲烷；

在一个优选的实施方式中，反应温度为20～80℃,反应时间为2～7h,反应溶剂为甲苯、氯仿或二氯甲烷，羰基二咪唑（CDI）和式ⅰ的化合物摩尔比为4:1～1:4;

在一个更优选的实施方式中，反应温度为30～60℃,反应时间为3～6h,反应溶剂为二氯甲烷，羰基二咪唑（CDI）和式ⅰ的化合物的摩尔比为2:1～1:2。

（2）式ⅱ化合物和二乙烯三胺按照摩尔比16:1～1:16反应，制备式ⅲ化合物：

反应温度为10～100℃,反应时间为1～10h,反应溶剂为甲苯、苯、氯仿或二氯甲烷；

在一个优选的实施方式中，反应温度为20～80℃,反应时间为2～7h,反应溶剂为甲苯、氯仿或二氯甲烷，式ⅱ化合物和二乙烯三胺的摩尔比为8:1～1:8;

在一个更优选的实施方式中，反应温度为30～60℃,反应时间为3～6h,反应溶剂为二氯甲烷，式ⅱ化合物和二乙烯三胺的摩尔比为4:1～1:4。

（3）式ⅲ化合物与式ⅳ的化合物按照摩尔比1:1～80反应，制备式Ⅰ的化合物：

反应温度为50～100℃,反应时间为10～48h,反应溶剂为乙醚、石油醚或二氯甲烷；

在一个优选的实施方式中，反应温度为50～80℃,反应时间为15～40h,反应溶剂为石油醚或二氯甲烷，式ⅲ化合物与式ⅳ的化合物的摩尔比为1:1～30;

在一个更优选的实施方式中，反应温度为70～80℃,反应时间为20～30h,反应溶剂为石油醚，式ⅲ化合物与式ⅳ的化合物的摩尔比为1:10～25。

上述对本发明的一类双子型阳离子类脂化合物的制备方法的描述中，各个取代基的定义及优选，均与本发明中对化合物的描述中的定义及优选相同。

本发明采用上述方法合成的双子型阳离子类脂化合物，采用红外光谱（IR）、核磁共振谱（¹H NMR和¹³C NMR）或质谱来确认其结构，并且辅以高分辨质谱测试来辅助确认其结构。

本发明再一方面提供一种双子型阳离子类脂组合物，该组合物包括上述的双子型阳离子类脂化合物和类脂助剂；

所述类脂助剂选自卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘髓磷脂、脑磷脂、心肌磷脂、磷脂酸、糖脂、磷酸三十二烷酯、二油酰磷脂酰氯（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰氯（DPPC）、棕榈酰油酰磷脂酰氯（POPC）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺（POPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和二油酰磷脂酰乙醇胺4-（N-马来酰亚胺基-甲基）环己烷-1-羧酸酯（DOPE-mal）、硬脂酰胺、十六烷胺、十四烷胺、十二烷胺、乙酰十六酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸盐、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化的脂肪酸酰胺、二十八烷基二甲基溴化铵、麦角甾醇B1，B2和B3、麦角甾醇、胆固醇、雄甾醇、胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、壳聚糖、蔗糖酯中的一种或两种以上的混合物；在优选的技术方案中，类脂助剂选自卵磷脂、二油酰磷脂酰氯（DOPC）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、胆固醇、壳聚糖、蔗糖酯,更优选选自二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、胆固醇、壳聚糖、蔗糖酯，最优选选自DOPE和胆固醇。

本发明的双子型阳离子类脂组合物，所述组合物中各组分的用量为：所述的双子型阳离子类脂化合物与类脂助剂的质量比为10:1～1:10；在优选的技术方案中，双子型阳离子类脂化合物与类脂助剂的质量比为5:1～1:5,更优选3:1～1:3。

本发明的双子型阳离子类脂组合物优选为悬浮液，乳浊液，微胶粒或脂质体。

含有本发明双子型阳离子类脂的脂质体可用本领域所熟知的方法进行制备。一般是将阳离子类脂（带有一个或多个助类脂）的有机溶液干燥得到类脂膜，然后将其再水化得到脂质体的悬液。从所需类脂成分制备干燥类脂膜的适宜溶剂可理解为是能溶解所有成分并可在其后通过蒸发或冷冻干燥而方便去除的任何溶剂。所述适宜溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇、或其它脂肪族醇如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇、己醇中的一种或两种以上的混合物。

用于由干燥类脂膜水化形成脂质体的合适水性介质可以是水、缓冲水溶液、或组织培养基。合适的缓冲液为磷酸盐缓液，即：pH7.4的10mM的磷酸钾在0.9%NaCl中的溶液。水性介质的pH值应该在2～12的范围内，但优选5～9，最优选7。在某些情况下，药物将包括在水化介质中，形成阳离子脂质体复合物，而在其它情况下，如对于核酸，它们将在脂质体形成后再加入。

水化得到的脂质体悬液可经过超声处理、逆向蒸发、冷冻-熔化或挤压方法以生成特定尺寸范围的脂质体。优选制备直径为50～200nm的单层脂质体。

双子型阳离子类脂组合物的悬浮液，乳浊液，微胶粒可用本领域所熟知的方法进行制备，在本发明中不予详细描述。

上述本发明的双子型阳离子类脂组合物按一定的配比与药物或/和遗传物质结合形成复合物，用于细胞内转染。其中，所述药物为阿霉素、阿巴瑞克、5-氟尿嘧啶、干扰素、丝裂霉素、多肽中的一种或两种以上的混合物;所述遗传物质为多核苷酸、DNA、RNA、MicroRNA、siRNA中的一种或两种以上的混合物。

本发明所述的双子型阳离子类脂化合物具备以下特点：

本发明的化合物采用对pH敏感的氨基甲酸酯作为类脂的连接键，达到提高转染效率，降低细胞毒性的目的。

本发明的化合物产品毒副性小，原料易得，制备方法简单，具有环保、安全，适于实验室制备以及工业化生产。

本发明的化合物与上述类脂助剂形成阳离子类脂组合物，应用于药物或遗传物质的细胞内转染，其转染效率相当于或高于目前常用的转染试剂的转染效率，且对细胞的毒性低。

实施例1化合物N,N-二乙氨基甲酸双十四酯甲基碘化铵(CTA14)的制备

（1）N,N-二乙氨基甲酸双十四酯胺的合成

在装有具CaCl₂干燥管的回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入7.5g羰基二咪唑（CDI）的CH₂Cl₂溶液50ml，水浴恒温至24℃，磁力搅拌下缓慢滴加适量十四醇的CH₂Cl₂溶液50ml，在30℃恒温反应4h。磁力搅拌下缓慢滴加1.91g的二乙烯三胺（DETA）的四氢呋喃（THF）溶液10ml，在30℃恒温反应4h。冷却至室温，补加50ml CH₂Cl₂溶解析出的固体，将液体转移至分液漏斗中，饱和食盐水洗涤2～3次至pH中性。取有机相，无水NaSO₄脱水，旋转减压蒸干液体，得白色胶状固体，乙醇重结晶3次得白色粉末，其结构表征如下：IRν_max:3315.67(ν_NH),1677.42(ν_C=O),1544.70(δ_NH),1266-1240(ν_COC,ν_CN).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.119(s,2H,2×O(C=O)NH),[4.059,4.043,4.026,(t,J=6.8,6.4,4H,2×CH₂O)],[3.285,3.271,(d,J=5.6,4H,2×O(C=O)NHCH₂)],[2.772,2.754,(d,J=7.2,4H,CH₂NHCH₂)],[2.572,2.559,2.543,(t,J=6.4,5.2,4H,NH CH₂CH₂NH)],1.602(s,4H,2×CH₂CH₂O),(1.398-1.199,36H,2×(CH₂)₉),[0.897,0.880,0.862,(t,J=7.2,5.2,6H,2×CH₃)];¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ:157.426(C=O),65.241(CH₂O),49.224((C=O)NHCH₂CH₂NH),49.120(NHCH₂CH₂NH),38.911(O(C=O)NHCH₂),32.061(CH₂CH₂CH₃),31.080-26.025((CH₂)₈),22.831(CH₂CH₃),14.259(CH₃).ESI-MS:571.5[M+H]⁺.

（2）N,N-二乙氨基甲酸双十四酯甲基碘化铵的合成（CTA14）

在100ml高压釜中加入4mmol的步骤（1）得到的二乙氨基甲酸双十四酯胺。在通风橱中，避光，用取样器吸取碘甲烷5ml，加入上述反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，搅拌下缓慢升温至70℃，恒温反应20h。停止加热，自然冷却至室温，冰浴冷却至0℃。在通风橱中打开釜盖，稍加热蒸去多余的季铵化试剂，向高压釜中加入30ml石油醚后过滤得到粗产品。加入30ml氯仿充分溶解粗产品，饱和食盐水洗涤2～3次，无水硫酸镁脱水，溶液在减压下蒸干，得白色粉末。该粉末在乙醇中多次重结晶，得白色片状晶体，其结构表征如下：IRν/cm^-1:3303.23(ν_NH),1685.71(ν_C=O),1544.70(δ_NH),1250-1230(ν_COC,ν_CN).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:(6.190,s,2×O(C=O)NH),(4.687,s,2×CH₂O),(4.037,s,N⁺CH₂CH₂N⁺),3.832(s,4H,2×NH CH₂CH₂N⁺),3.702(s,12H,4×CH₃N⁺),1.715(s,4H,2×CH₂CH₂O),1.599(s,4H,2×CH₂CH₂CH₂O),1.398～1.210(32H,2×(CH₂)₈),0.897～0.863(t,J₁=7.2Hz,J₂=6.4Hz,6H,2×CH₂CH₃)。¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ:157.469(C=O),66.303(CH₂O),64.395(NHCH₂CH₂N⁺),55.965(N⁺CH₂CH₂N⁺),53.966(CH₃N⁺),36.027(NHCH₂),32.178(CH₂CH₂CH₃),29.968～26.089((CH₂)₈),22.950(CH₂CH₃),14.392(CH₃).ESI-MS:314.10[M-2I]^-2/2,126.5[I]^-.

实施例2化合物N,N-二乙氨基甲酸双十二酯甲基碘化铵(CTA12)的制备

（1）N,N-二乙氨基甲酸双十二酯胺的合成

在装有具CaCl₂干燥管的回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入6.59g羰基二咪唑（CDI）的CH₂Cl₂溶液50ml，水浴恒温至24℃，磁力搅拌下缓慢滴加适量十二醇的CH₂Cl₂溶液50ml，在60℃恒温反应3h。磁力搅拌下缓慢滴加2.50g的二乙烯三胺（DETA）的四氢呋喃（THF）溶液20ml，在60℃恒温反应3h。冷却至室温，补加50ml CH₂Cl₂溶解析出的固体，将液体转移至分液漏斗中，饱和食盐水洗涤2～3次至pH中性。取有机相，无水NaSO₄脱水，旋转减压蒸干液体，得白色胶状固体，乙醇重结晶3次得白色粉末，其结构表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.119(s,2H,2×O(C=O)NH),[4.059,4.043,4.026,(t,J=6.8,6.4,4H,2×CH₂O)],[3.285,3.271,(d,J=5.6,4H,2×O(C=O)NHCH₂)],[2.772,2.754,(d,J=7.2,4H,CH₂NHCH₂)],[2.572,2.559,2.543,(t,J=6.4,5.2,4H,NHCH₂CH₂NH)],1.602(s,4H,2×CH₂CH₂O),(1.398-1.199,36H,2×(CH₂)₉),[0.897,0.880,0.862,(t,J=7.2,5.2,6H,2×CH₃)];¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ157.426(C=O),65.241(CH₂O),49.224((C=O)NHCH₂CH₂NH),49.120(NHCH₂CH₂NH),38.911(O(C=O)NHCH₂),32.061(CH₂CH₂CH₃),31.080-26.025((CH₂)₈),22.831(CH₂CH₃),14.259(CH₃);ESI-MS:571.5[M+H]⁺;IRν_max:3315.67(ν_NH),1677.42(ν_C=O),1544.70(δ_NH),1266-1240(ν_COC,ν_CN).

（2）N,N-二乙氨基甲酸双十二酯甲基碘化铵的合成（CTA12）

在100ml高压釜中加入4mmol的步骤（1）得到的二乙氨基甲酸双十二酯胺。在通风橱中，避光，用取样器吸取碘甲烷5ml，加入上述反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，搅拌下缓慢升温至70℃，恒温反应20h。停止加热，自然冷却至室温，冰浴冷却至0℃。在通风橱中打开釜盖，稍加热蒸去多余的季铵化试剂，向高压釜中加入30ml石油醚后过滤得到粗产品。加入30ml氯仿充分溶解粗产品，饱和食盐水洗涤2～3次，无水硫酸镁脱水，溶液在减压下蒸干，得白色粉末。该粉末在乙醇中多次重结晶，得白色片状晶体，其结构表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:(6.190,s,2×O(C=O)NH),(4.687,s,2×CH₂O),(4.037,s,N⁺CH₂CH₂N⁺),3.832(s,4H,2×NH CH₂CH₂N⁺),3.702(s,12H,4×CH₃N⁺),1.715(s,4H,2×CH₂CH₂O),1.599(s,4H,2×CH₂CH₂CH₂O),1.398～1.210(32H,2×(CH₂)₈),0.897～0.863(t,J₁=7.2Hz,J₂=6.4Hz,6H,2×CH₂CH₃)。¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ157.469(C=O),66.303(CH₂O),64.395(NHCH₂CH₂N⁺),55.965(N⁺CH₂CH₂N⁺),53.966(CH₃N⁺),36.027(NHCH₂),32.178(CH₂CH₂CH₃),29.968～26.089((CH₂)₈),22.950(CH₂CH₃),14.392(CH₃).ESI-MS:314.10[M-2I]^-2/2,126.5[I]^-.IRν/cm^-1:3303.23(ν_NH),1685.71(ν_C=O),1544.70(δ_NH),1250-1230(ν_COC,ν_CN).

实施例3化合物N,N-二乙氨基甲酸双十八酯甲基碘化铵(CTA18)的制备

（1）N,N-二乙氨基甲酸双十八酯胺的合成

在装有具CaCl₂干燥管的回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入7.19g羰基二咪唑（CDI）的CH₂Cl₂溶液50ml，水浴恒温至24℃，磁力搅拌下缓慢滴加适量十八醇的CH₂Cl₂溶液50ml，在60℃恒温反应4h。磁力搅拌下缓慢滴加2.63g的二乙烯三胺（DETA）的四氢呋喃（THF）溶液20ml，在60℃恒温反应4h。冷却至室温，补加50ml CH₂Cl₂溶解析出的固体，将液体转移至分液漏斗中，饱和食盐水洗涤2～3次至pH中性。取有机相，无水NaSO₄脱水，旋转减压蒸干液体，得白色胶状固体，乙醇重结晶3次得白色粉末，其结构表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.116(s,2H,2×O(C=O)NH),[4.058,4.042,4.026,(t,J=5.6,4H,2×CH₂O)],[3.300,3.284,3.270,(t,J=6.4,5.6,4H,2×O(C=O)NHCH₂)],2.760(s,4H,CH₂NHCH₂),[2.572,2.559,2.545,(t,J=5.6,5.2,4H,NHCH₂CH₂NH)],1.568(s,4H,2×CH₂CH₂O),(1.395-1.194,60H,2×(CH₂)₁₅),[0.897,0.881,0.863,(t,J=7.2,5.6,6H,2×CH₃)];¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ157.322(C=O),65.221(CH₂O),49.220((C=O)NHCH₂CH₂NH),49.113(NHCH₂CH₂NH),38.863(O(C=O)NHCH₂),32.044(CH₂CH₂CH₃),30.986-25.985((CH₂)₁₄),22.842(CH₂CH₃),14.255(CH₃);ESI-MS:739.5[M+H]⁺;IRν_max:3298.37(ν_NH),1675.40(ν_C=O),1544.38(δ_NH),1265-1245(ν_COC,ν_CN).

（2）N,N-二乙氨基甲酸双十八酯甲基碘化铵的合成（CTA18）

在100ml高压釜中加入4mmol的步骤（1）得到的二乙氨基甲酸双十八酯胺。在通风橱中，避光，用取样器吸取碘甲烷20ml，加入上述反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，搅拌下缓慢升温至70℃，恒温反应20h。停止加热，自然冷却至室温，冰浴冷却至0℃。在通风橱中打开釜盖，稍加热蒸去多余的季铵化试剂，得白色粉末。该粉末在乙醇中多次重结晶，得白色片状晶体2.596g，其结构表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:(6.184,s,2×O(C=O)NH),(4.697,s,2×CH₂O),(4.039,s,N⁺CH₂CH₂N⁺),3.846(s,4H,2×NHCH₂CH₂N⁺),3.652(s,12H,4×CH₃N⁺),1.671(s,4H,2×CH₂CH₂O),1.603(s,4H,2×CH₂CH₂CH₂O),1.380～1.198(56H,2×(CH₂)₁₄),0.897～0.863(t,J=6.8Hz,6H,2×CH₂CH₃)。¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ157.583(C=O),66.334(CH₂O),64.362(NHCH₂CH₂N⁺),55.974(N⁺CH₂CH₂N⁺),53.998(CH₃N⁺),36.041(NHCH₂),32.179(CH₂CH₂CH₃),29.979～26.090((CH₂)₁₄),22.955(CH₂CH₃),14.405(CH₃).ESI-MS:398.15[M-2I]^-2/2,126.5[I]^-.IRν/cm^-1:3365.44(ν_NH),1718.85(ν_C=O),1523.96(δ_NH),1254-1240(ν_COC,ν_CN).

实施例4化合物N,N-二乙氨基甲酸双十六酯甲基碘化铵(CTA16)的制备

（1）N,N-二乙氨基甲酸双十六酯胺的合成

在装有具CaCl₂干燥管的回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入7.59g羰基二咪唑（CDI）的CH₂Cl₂溶液50ml，水浴恒温至24℃，磁力搅拌下缓慢滴加适量十六醇的CH₂Cl₂溶液50ml，在60℃恒温反应4h。磁力搅拌下缓慢滴加2.81g的二乙烯三胺（DETA）的四氢呋喃（THF）溶液20ml，在60℃恒温反应4h。冷却至室温，补加50ml CH₂Cl₂溶解析出的固体，将液体转移至分液漏斗中，饱和食盐水洗涤2～3次至pH中性。取有机相，无水NaSO₄脱水，旋转减压蒸干液体，得白色胶状固体，乙醇重结晶3次得白色粉末，其结构表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.256(s,2H,2×O(C=O)NH),[4.056,4.039,4.023,(t,J=6.8,6.4,4H,2×CH₂O)],[3.287,3.273,(d,J=5.6,4H,2×O(C=O)NHCH₂)],[2.749,2.735,(d,J=5.6,4H,CH₂NHCH₂)],[2.570,2.556,2.543,(t,J=6.8,5.6,4H,NHCH₂CH₂NH)],1.596(s,4H,2×CH₂CH₂O),(1.401-1.182,52H,2×(CH₂)₁₃),[0.896,0.880,0.862,(t,J=7.2,5.6,6H,2×CH₃)];¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ157.347(C=O),65.183(CH₂O),49.218((C=O)NHCH₂CH₂NH),48.936(NHCH₂CH₂NH),40.797(O(C=O)NHCH₂),32.117(CH₂CH₂CH₃),29.862-26.074((CH₂)₁₂),22.889(CH₂CH₃),14.323(CH₃);ESI-MS:683.5[M+H]⁺;IRν_max:3306.56(ν_NH),1681.45(ν_C=O),1540.72(δ_NH),1263-1240(ν_COC,ν_CN).

（2）N,N-二乙氨基甲酸双十六酯甲基碘化铵的合成（CTA16）

在100ml高压釜中加入4mmol的步骤（1）得到的二乙氨基甲酸双十六酯胺。在通风橱中，避光，用取样器吸取碘甲烷20ml，加入上述反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，搅拌下缓慢升温至90℃，恒温反应20h。停止加热，自然冷却至室温，冰浴冷却至0℃。在通风橱中打开釜盖，稍加热蒸去多余的季铵化试剂，得白色粉末。该粉末在乙醇中多次重结晶，得白色片状晶体2.596g，其结构表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:(6.192,s,2×O(C=O)NH),(4.703,s,2×CH₂O),(4.042,s,N⁺CH₂CH₂N⁺),3.848(s,4H,2×NHCH₂CH₂N⁺),3.657(s,12H,4×CH₃N⁺),1.671(s,4H,2×CH₂CH₂O),1.599(s,4H,2×CH₂CH₂CH₂O),1.401～1.199(48H,2×(CH₂)₁₂),0.896～0.862(t,J=6.8Hz,6H,2×CH₂CH₃)。¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ157.337(C=O),66.179(CH₂O),64.337(NHCH₂CH₂N⁺),55.951(N⁺CH₂CH₂N⁺),53.826(CH₃N⁺),36.041(NHCH₂),32.046(CH₂CH₂CH₃),29.873～25.957((CH₂)₁₂),22.825(CH₂CH₃),14.275(CH₃).ESI-MS:370.15[M-2I]^-2/2,126.5[I]^-.IRν/cm^-1:3265.90(ν_NH),1706.45(ν_C=O),1523.96(δ_NH),1250-1230(ν_COC,ν_CN).

实施例5阳离子脂质体的制备

上述实施例1-4得到的双子型阳离子类脂化合物(CTA12、CTA14、CTA16或CTA18)，在紫外灯下照1h，称取1mg的阳离子类脂，分别与一定量的DOPE（各阳离子类脂与DOPE的摩尔比分别为2:1、1:1或1:2）加入到1ml氯仿/甲醇（v/v=2:1）充分溶解，均匀氮气流吹干，形成薄膜，真空干燥10h，除净有机溶剂。加入1ml无菌去离子水，恒温45℃下超声1-3h，至透明澄清，制备成终浓度为1.00mM的阳离子脂质体。

实施例6脂质体的形态观察

按照实施例5所述的方法得到双子型阳离子类脂和类脂助剂制备的阳离子脂质体。其中所述的脂质体分别为CTA14和DOPE的1:1的混合物。

将上述脂质体，用透射电镜观察其形态结构，采用重金属负染色法，染色剂为2%磷钨酸溶液，400目铜网制膜，分别在320K、140K和100K倍镜下观测。电镜照片如图2所示：脂质体的形态基本呈压扁的球形，个别脂质体有聚集状态存在。脂质体的粒径在70-150nm之间，粒径范围在有效转染粒径范围（<1μm）内。图2中a，b，c分别为320K、140K和100K倍镜下观测结果。

实施例7阳离子脂质体压缩核酸能力

使用DNA延滞实验检测定实施例5制备的脂质体结合DNA的能力。

具体方法如下：首先将一定量的质粒DNA(pGFP-N2质粒)稀释于DMEM中；分别取一定体积的浓度为1μg/μL的实施例5的脂质体稀释于DMEM中，使其分别制成10μL的体系，然后将10μL脂质体稀释液滴加到10μL质粒DNA的稀释液中，使得脂质体和DNA的质量比（μg/μg）分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、6:1和8:1，用旋涡振荡器充分混匀，室温温育20min,使其形成脂质体-DNA复合物。取20μL上述复合物溶液与1.6μL的上样缓冲液（loadingbuffer，日本Takara公司）混匀，加入到1.2%琼脂糖凝胶中，90V电泳1h。在凝胶成像系统中观察DNA电泳图谱并照相，如图3所示。图3的a、b、c分别为CTA12：DOPE=2:1，CTA12：DOPE=1:1，CTA12：DOPE=1:2混合制备的脂质体；d、e、f分别为单独的CTA12、CTA14和CTA16脂质体。

图3的a、b、c、d、e、f中：第1泳道为2kb DNA marker(λDNA/EcoR I+Hind III Markers，购自SABC)，第2泳道为裸DNA，第3-10泳道为脂质体与DNA比例分别是0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、6:1和8:1的脂质体-DNA复合物。在未加入脂质体时（裸DNA），出现典型的质粒条带。在加入脂质体后，DNA条带明显减弱，随着脂质体的加入量的增加，DNA的延滞能力明显增强，说明本发明所制备的脂质体具有与DNA结合的能力。

实施例8转染效率的测定

（1）脂质体-核酸复合物的制备

按照实施例5所述的方法获得本发明的双子型阳离子类脂和类脂助剂制备的阳离子脂质体。其中所述的脂质体分别采用不同比例混合的CTA12和DOPE的混合物，按质量比其比例为2:1、1:2和1:1，以评价DOPE的加入量对脂质体转染效率的影响；脂质体还采用不同碳链的CTA(如CTA12、CTA14、CTA16、CTA18)和DOPE的1:1的混合物，以评价碳链长度对脂质体转染效率的影响。

首先将一定量的质粒DNA(pGFP-N2或pGL-3）稀释于DMEM中；分别取一定体积的浓度为1μg/μl所述阳离子脂质体稀释于DMEM中，使其分别制成25μl的体系，然后将25μl脂质体稀释液滴加到25μl质粒DNA的稀释液中，使得脂质体和DNA的质量比（μg/μg）分别为1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、6:1和8:1，用旋涡振荡器充分混匀，室温温育20min,使其形成50μl脂质体-DNA复合物。

脂质体-DNA复合物也可利用两种商业上可获得的类脂转染试剂Lipofectamine2000（与质粒的质量比为3:1）和DOTAP（与质粒的质量比为6:1）来制备。这些用于转染的商业试剂将作为标准来评价所合成类脂的转染效率。

（2）复合物转染效率的测定

取步骤（1）制备的脂质体-DNA复合物在两种不同细胞系Hep-2（人喉癌上皮细胞）和HeLa（人宫颈癌细胞）中进行条件实验，考察不同条件下的转染效率，优化试剂的使用条件。

将细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔接种适量的细胞，细胞培养液（含血清和抗生素）总体积100μL。将细胞放置在37℃，5%CO₂培养箱中孵16～24h使在转染日细胞密度达到1～1.5×10⁴。

移去生长培养基，用等量（100μL，无血清和抗生素）培养基替换。直接将50μL步骤（1）的脂质体-DNA复合物样品加入板孔中，每个样品设3个平行孔，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃、5%CO₂培养箱中培养4h～5h，更换含血清和抗生素的培养基，培育48h后进行基因表达分析。

基因表达分析：

（1）绿色荧光蛋白检测（Hep-2细胞中）：用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无，结果如图4a所示。

（2）萤光素酶检测（HeLa细胞中）：先用PBS洗3次，然后每孔加入100μl裂解缓冲液，收集溶胞产物，在12000rpm、4℃离心5min，取20μl上清液用于荧光素酶活力的检测，用荧光素酶检测试剂，在Luminometer上进行检测相对光单元（RUL）值，测量发光时间为10s，结果如图4b所示。

图4a和4b的结果显示，合成类脂所表现出的转染效率略低于或相当于商品试剂Lipofectamine2000，如CTA14/DOPE=1/1在脂质体/DNA比例为3/1的条件下（见图4a）。大部分合成类脂所表现出的转染效率要高于商品试剂DOTAP。随着阳离子类脂的结构以及实验方案和条件的进一步优化，还有继续提高其转染效率的可能。

实施例9MTT毒性测定

在96孔细胞培养板上种植HeLa细胞，平行3孔，取平均值。每孔种植5×10⁵个细胞/100μL培养液，在37℃，5%CO₂环境下培养至90%汇合度。移去培养基，用D-Hank’s洗1次。将实施例8制备得到的部分脂质体25μl滴加到质粒DNA（pGFP-N2）稀释液25μl中（脂质体和DNA质量比为0.5/1，1/1，2/1，3/1，4/1，6/1和8/1），边加边用漩涡振荡器振荡后加入到96孔细胞培养板里；同样Lipofectamine2000（与质粒的质量比为3∶1）和DOTAP（与质粒的质量比为6∶1）的复合物作为阳性对照加入到96孔细胞培养板里；采用不含阳离子脂质体的100μL培养基（无血清和无抗生素）作为阴性对照。在37℃，5%二氧化碳培养箱中继续培养，24h后向每孔加入20μL3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液（5mg/ml in PBS,pH7.4），继续培养4～5h，移除培养基。生成的甲臜结晶用150μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，剧烈混合使甲臜溶解。在酶标仪上进行读数，吸收波长570nm，酶标仪用无细胞的培养基调零。阳离子脂质体相对于对照细胞的相对存活率按下式计算：

[A]_样品/[A]_对照×100

[A]_样品为测试孔的吸光值，[A]_对照为阴性对照孔的吸光值。

实验结果如图5所示，实验结果如图5所示，本发明所合成部分基因载体阳离子脂质体在两种人体癌细胞中的细胞毒性普遍较低，细胞存活率与商品试剂Lipofectamine2000和DOTAP相当，上述转染效率可见所合成的阳离子脂质体，本发明的双子型阳离子类脂具有作为基因载体的应用前景。

Claims (10)

1.一类双子型阳离子类脂化合物，具有通式I的结构：

其中：

X^-选自F^-、Cl^-、Br^-、I^-、H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、NO₃ ^-、HSO₃ ^-、CH₃COO^-、葡萄糖酸根、葡萄糖醛酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根和甲磺酸根；

R₁选自C_1-20烷基、十八烯基和胆固醇基；

R₂选自C_1-6烷基、C_1-6羟烷基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和叶酸酯基。

2.根据权利要求1所述的双子型阳离子类脂化合物，其特征在于，所述X^-选自F^-、Cl^-、Br^-、I^-、NO₃ ^-、HSO₃ ^-、CH₃COO^-、葡萄糖酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根和甲磺酸根。

3.根据权利要求1所述的双子型阳离子类脂化合物，其特征在于，所述R₁选自C_12-18烷基、十八烯基和胆固醇基。

4.根据权利要求1所述的双子型阳离子类脂化合物，其特征在于，所述R₂选自C_1-3烷基、C_1-3羟烷基、半乳糖基、甘露糖基和叶酸酯基。

5.如权利要求1～4的任一项所述的双子型阳离子类脂化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）羰基二咪唑和式ⅰ的化合物按照摩尔比8:1～1:8反应，制备式ⅱ化合物：

反应温度为10～100℃,反应时间为1～10h,反应溶剂为甲苯、苯、氯仿或二氯甲烷；

（2）式ⅱ化合物和二乙烯三胺按照摩尔比16:1～1:16反应，制备式ⅲ化合物：

反应温度为10～100℃,反应时间为1～10h,反应溶剂为甲苯、苯、氯仿或二氯甲烷；

（3）式ⅲ化合物与式ⅳ的化合物按照摩尔比1:1～80反应，制备式Ⅰ的化合物：

反应温度为50～100℃,反应时间为10～48h,反应溶剂为乙醚、石油醚或二氯甲烷。

6.一种阳离子类脂组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1～4的任一项所述的双子型阳离子类脂化合物和类脂助剂；

所述类脂助剂选自卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘髓磷脂、脑磷脂、心肌磷脂、磷脂酸、糖脂、磷酸三十二烷酯、二油酰磷脂酰氯、二棕榈酰磷脂酰氯、棕榈酰油酰磷脂酰氯、二油酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺4-（N-马来酰亚胺基-甲基）环己烷-1-羧酸酯、硬脂酰胺、十六烷胺、十四烷胺、十二烷胺、乙酰十六酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸盐、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化的脂肪酸酰胺、二十八烷基二甲基溴化铵、麦角甾醇B1，B2和B3、麦角甾醇、胆固醇、雄甾醇、胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、壳聚糖、蔗糖酯中的一种或两种以上的混合物。

7.根据权利要求6所述的阳离子类脂组合物，其特征在于，所述组合物为悬浮液，乳浊液，微胶粒或脂质体。

8.根据权利要求6所述的阳离子类脂组合物，其特征在于，所述的双子型阳离子类脂化合物与类脂助剂的质量比为10:1～1:10。

9.如权利要求6所述的阳离子类脂组合物向细胞内传递药物或/和遗传物质中的应用，其中所述药物为阿霉素、阿巴瑞克、5-氟尿嘧啶、干扰素、丝裂霉素、多肽中的一种或两种以上的混合物;所述遗传物质为多核苷酸、DNA、RNA、MicroRNA、siRNA中的一种或两种以上的混合物。

10.一种阳离子类脂复合物，其特征在于，所述复合物包括药物或/和遗传物质和权利要求1～4的任一项所述的双子型阳离子类脂化合物。

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