CN104987360A - 一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质，其化学结构式为：

Description

一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一类非病毒基因载体及制备方法。
技术背景
随着人们在细胞水平上对疾病发病机制认识的不断深入，基因治疗已日渐成为科学家们研究的热点。基因治疗是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段，来纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病，其中癌症基因治疗是其主要应用领域。用于基因转运的载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体如重组腺病毒载体，这类载体由于转染效率较高且对大多数细胞都具有靶向作用，因此在基因转运方面具有一定的优越性。但它会引起体内的一些免疫反应，而且含有可转录的病毒基因，可能在体内发生基因的重组或互补，进一步对人体造成伤害。非病毒载体与之相比虽然转染效率有限，但是具有无传染性、不限制载体容量、化学结构可控以及可大量制备等优点而越来越受到研究者的青睐。
阳离子脂质体具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可以保护其运载基因片段的生物活性，是一种有临床应用潜力的非病毒基因转染载体。脂质体的这种结构可以压缩基因形成复合物，递送至病变组织或细胞。自从1987年Felgner等首次利用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)对COS-7等细胞进行成功转染后，脂质体已经发展成为除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法，特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。但由于其仍存在一定的局限性，如细胞毒性大，对器官的靶向性不明显，基因转运机制不明确等限制了其广泛应用。因此，人们一直致力于对阳离子脂质体的各种构建及化学修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗药物。
脂质体发展的近30年来，从广泛使用的季铵盐头部、胍基头部到多胺头部阳离子脂质，已经形成了比较完善的脂质体载体系统，但这些载体系统仍然存在许多问题，如介导基因的转运效率还有待提高；对靶组织无定向识别性；阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞后，核酸被束缚于内涵体中，释放困难，不利于在细胞质或细胞核中表达，从而无法达到治疗目的。中国专利CN103613516A，2014-03-05公开了一类双子型阳离子类脂的制备及其在药物或基因转运中的应用，该载体由于具有双头部结构生物降解性较差而存在一定的细胞毒性，因此在体内基因转染方面受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一类细胞毒性小，在体外和体内基因转染效率高的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用。
本发明的技术方案为：
一、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及制备方法
1、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质，其化学结构由通式I表示：
其中：
x选自1～6，最优选2～4；
y选自1～8，最优选2～4；
R选自C8-20烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基；
AA选自精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、鸟氨酸(Orn)或赖氨酸(Lys)；
B选自鸟氨酸(Orn)或赖氨酸(Lys)。
2、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质的合成方法，是以氨基保护的氨基酸制备肽头部中间体；以酰化试剂和醇类化合物进行酰化，酰化产物再与多胺类化合物反应，制备双长碳链中间体；将制备的肽头部中间体与制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接；将保护基团脱掉，再与氨基保护的氨基酸进行反应，脱保护后得到所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物。
具体步骤如下：
(1)以酰化试剂对醇类化合物进行酰化，所述酰化试剂为羰基二咪唑；所述醇类化合物为十二醇、十四醇、十六醇或十八醇；所述酰化试剂与醇类物质的摩尔比为1:10～10:1，反应溶剂为甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿，反应温度为10～60℃，反应时间为0.5～12h；
(2)酰化产物再与多胺类化合物反应，制备双长碳链中间体。所述多胺类化合物为二乙烯三胺、二丙烯三胺或二丁烯三胺等多胺，多胺与酰化产物摩尔比为1:2～1:8；催化剂为三乙胺、碳酸钠或甲基吡啶等，催化剂的加入量为多胺投料质量的10％，反应温度为10～100℃，反应时间为2～48h，经重结晶得到带有双长碳链的中间体N,N-双烷氧酰胺烷基胺，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯或无水乙醇/水混合溶剂(v/v＝5:1)；
(3)采用保护试剂保护氨基酸的氨基，所述氨基酸为Lys、His、Arg、Asp、Ala、Gly或Orn；所述保护试剂为二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)或氯甲酸苄酯(CbzCl)；所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:8～8:1；反应溶剂为水、乙腈或丙酮，反应温度为0～25℃，反应时间为0.5～2h，经重结晶得到肽头部中间体，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(v/v＝3：1)；
(4)将步骤(3)制备的肽头部中间体，与步骤(2)制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接：a首先将肽头部中间体进行活化生成活泼酯，活化试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)或HOBt，氨基酸与活化试剂摩尔比为1:1～1:8，反应溶剂为二氯甲烷、DMF或三氯甲烷，活化时间为0.5～2h，活化温度为0～30℃。b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烷、DMF或三氯甲烷溶液，经过酰胺化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，两者摩尔比为1:8～8:1，催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，催化剂加入量与双长碳链中间体摩尔比为1:1～1:8，反应时间为2h～120h，反应温度为20～60℃；
(5)脱掉氨基保护试剂。所述脱保护试剂为三氟乙酸或质量分数10％NaHCO3，脱保护试剂与类脂化合物摩尔比为1:1～1:2。脱保护时间为0.5～12h，脱保护温度为0～4℃。经重结晶法进行提纯，重结晶溶剂乙腈、无水乙醇、超纯水、乙酸乙酯或石油醚；
(6)重结晶后，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱。在70℃下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个氨基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物。
(7)以含有一个氨基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，合成其他双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质：将步骤(3)制备的肽头部中间体与步骤(6)制备的含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质，经过氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1～4个氨基酸的阳离子脂质化合物。两者摩尔比为1:8～8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤(4)(5)(6)相同。
二、阳离子肽脂质体及制备方法
1、一种由所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质制备的阳离子肽脂质体，该阳离子肽脂质体为双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小为100nm左右的均一稳定的表面带有正电荷的脂质体。
2、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体的制备方法，步骤如下：按摩尔比1:1～8:1将所述双烷氧酰胺烷基肽脂质化合物和助剂在氯仿、甲苯、甲醇等有机溶剂中混合，使双烷氧酰胺烷基肽脂质化合物的浓度为0.5～3mg/ml。在氮气下将溶液吹干，形成均匀薄膜，真空干燥2～24h(真空度为0.09MPa，常温)。加入超纯水、乙醇、磷酸缓冲液或三种物质的混合液，在10～80℃水化1～10h，超声频率为100Hz下超声震荡至澄清透明，所述阳离子肽脂质体浓度为0.5～3mg/mL。所述助剂为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇或蔗糖酯。
三、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物及制备方法
1、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物是由所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体与质粒DNA(pDNA)或小干扰RNA(siRNA)，通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗粒。
2、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步骤如下：
(1)取所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体分散在细胞培养液(DMEM或RPMI1640)中，混匀，使浓度为0.02μg/μL-0.16μg/μL；
(2)将0.5～1.0μg pDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀，使质粒浓度为0.02μg/μL；
(3)按照脂质体与基因质量比1:1～8:1比例，将(1)和(2)两稀释液混匀，室温放置10～40min，即可得到双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。
四、所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物在细胞转染中的应用和体内转染中的应用，主要包括：
1、所述肽脂质体基因载体可进入癌细胞中，完成目的基因在细胞内的转染。
2、所述细胞为人喉癌上皮细胞(Hep-2)和非小肺腺癌细胞(A549)。不同氮磷比下结合获得的所述肽脂质基因载体系统，在不同细胞内的转染效率会有所差异。
3、本发明提供的肽脂质体/基因复合物适用于编码荧光素酶、绿色荧光蛋白报告基因，也适用于其他各种实验所需的siRNA。该载体能高效运载pDNA和siRNA转染细胞，并对细胞几乎不产生毒性。
4、氨基酸或肽分子具有带正电荷的氨基，可与带负电的基因物质结合，增加了基因载体压缩基因的能力，提高基因转染效率。
本发明的作用机理大致如下：本发明提供的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，由于其阳离子肽脂质具有氨基酸或氨基酸组成的肽头部、氨基甲酸酯键和烷基疏水尾部，因此同时具有疏水和亲水特性，其疏水部分来源于双长碳链，亲水部分取自于具有良好生物相容性的氨基酸或肽构成的脂质头部，由于氨基酸或肽具有多氨基结构，可与带负电的遗传物质(核酸、基因和遗传物质要统一)结合，对细胞及核酸具有良好的亲和性，提高压缩基因的能力，从而可提高载体的转染效率。另外，氨基酸和肽为生物体必需的物质，可降低阳离子脂质极性头部带来的毒性。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明的双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质合成方法简单，采用的反应试剂及得到的产物无毒无污染，且原料成本低，具有较好的推广性；反应过程中，条件温和，副产物少且易提纯；可广泛应用于科学研究及生产。
2、本发明提供的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体，富含阳离子，具有压缩pDNA和siRNA的能力，可以形成纳米级的阳离子脂质体/基因复合物。所述阳离子肽脂质体/基因复合物为酸敏感型，可有利于基因的细胞内释放，提高转染效率。复合物的阳离子头部为肽，大部分氨基酸为人体必需氨基酸，生物相容性好，比传统季铵盐型阳离子脂质的毒性要低。
3、本发明所述的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体稳定性好，粒径为100nm左右，Zeta电位在40～70mV之间，可压缩更多带负电的基因物质，提高体外体内转染效率、细胞相容性好、毒性小，可作为新型高效低毒的非病毒基因载体和转染试剂。
4、本发明提供的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，在运载siRNA用于基因沉默时也有良好的效果，其沉默效率高达70％。
5、本发明提供的肽脂质体/基因复合物用于体内试验时，不会影响小鼠的正常生长，对小鼠的肝脏和肾脏无毒性。
6、本发明提供的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体与中国专利CN103613516A中双子型阳离子脂质体载体G14相比，具有对肿瘤细胞的高效转染和更低的细胞毒性。
7、本发明提供的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物使用方便，将有望成为用于临床基因治疗的新型基因载体和转染试剂。
附图说明
图1为阳离子肽脂质体R12KA、R14ODD、R16KHHH和R18ORRR的粒径检测图。
图2为阳离子肽脂质体R12KA、R14ODD、R16KHHH和R18ORRR的Zeta电位检测图。
图3为阳离子阳离子肽脂质体R12KA、R14ODD、R16KHHH和R18ORRR与质粒DNA的电泳延滞实验结果图。
图4是采用倒置荧光显微镜检测阳离子肽脂质体运载pGFP-N2质粒转染NCI-H460细胞(人大细胞肺癌细胞，图4A)和Hep-2细胞(人喉癌细胞，图4B)的绿色荧光蛋白表达图。
图5是采用酶标仪检测的阳离子肽脂质体运载pGL-3质粒转染NCI-H460细胞的荧光素酶表达图。
图6是采用酶标仪检测的阳离子肽脂质体运载pGL-3质粒转染Hep-2细胞的荧光素酶表达图。
图7是酶标仪检测阳离子肽脂质体运载siRNA转染A549细胞，Luciferase基因沉默情况图。
图8是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转染过程中对NCI-H460细胞毒性的检测。
图9是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转染过程中对Hep-2细胞毒性的测定图。
图10是阳离子肽脂质体/基因复合物细胞摄入情况图。
图11是阳离子肽脂质体R14ODD运载siRNA体内沉默Luciferase基因情况图。
图12是阳离子肽脂质体/基因复合物体内转染小鼠的体重变化曲线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明实施方案进行阐述，但是这些阐述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本说明书中，脂质化合物N,N-双十二烷氧酰胺乙基赖氨酸丙氨酸酰胺用R12KA表示，脂质化合物N,N-双十四烷氧酰胺乙基鸟氨酸二聚天冬氨酸酰胺用R14ODD表示，肽脂质化合物N,N-双十六烷氧酰胺乙基赖氨酸三聚组氨酸酰胺用R16KHHH表示，脂质化合物N,N-双十八烷氧酰胺乙基鸟氨酸三聚精氨酸酰胺用R18ORRR表示。
实施例1阳离子肽脂质化合物R12KA合成方法如下：
(1)将20mmoL羰基二咪唑和200mmoL十二醇(摩尔比1：10)用200mL二氯甲烷溶解，在60℃反应2h，生成单取代中间体。将二乙烯三胺的二氯甲烷溶液滴加到上述反应液中(二乙烯三胺与酰化产物摩尔比为1：2)，加入等摩尔量的催化剂三乙胺，在100℃下继续反应2h，生成双取代中间体。反应完毕，过滤，旋转蒸发得到白色透明的粘稠状液体。用乙酸乙酯进行重结晶提纯3次，得白色粉末状双取代长碳链中间体R12。
(2)称取2mmol L-Lys溶于15mL乙腈中，6mmol Boc2O溶于乙腈并滴加到赖氨酸乙腈溶液中，25℃搅拌反应2h，再加入6mmol Fmoc-OSu的乙腈溶液，继续反应6h，反应结束后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(v/v＝3：1)重结晶，得到肽头部中间体Fmoc-L-Lys(Boc)-OH。
(3)1mmol肽头部中间体Fmoc-L-Lys(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:2溶解于二氯甲烷溶液，0℃下活化2h，再加入长碳链中间体R12的二氯甲烷溶液(赖氨酸与长碳链中间体两者摩尔比为1:8)，加入1mmol催化剂DMAP，在20℃下酰胺化反应120h，反应后在70℃旋转蒸发干溶剂，用二氯甲烷/三氟乙酸＝2/1溶剂溶解，置于4℃下8h，脱去保护基团Boc，用10％NaHCO3溶剂溶解，反应1h，脱去Fmoc基团。
(4)将产物用乙酸乙酯重结晶2次，乙腈重结晶2次。产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱。在70℃下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个赖氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质。
(5)将5mmol丙氨酸溶于四氢呋喃中，10mmol的Boc2O溶于四氢呋喃中滴加到丙氨酸中，加入5mmol DMAP，反应温度为0℃，反应2h。反应完毕，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用乙腈重结晶2次，得到肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH。
(6)以步骤(4)制备的含有一个赖氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH反应，两者摩尔比为8：1，经过氨基酸活化和酰胺化，得到含有一个Lys一个Ala的二肽头部阳离子肽脂质R12KA，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)相同。
其结构表征如下：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:0.95(6H,CH3),1.32(28H,((CH2)7),1.49(4H,CH2CH2O),3.32(6H,CONHCH2,CH2NH),3.89(4H,NH),4.08(4H,CH2CH2O),4.95(6H,NH2)。13C NMR(400MHz,CD3OD)δ17.25(CH3),25.44(CH3CH2),33.01((CH2)8),35.12(CHCH2),35.92(CH3CH2CH2),42.10(NHCH2),57.03(NHCH,NH2CH),68.92(CH2NH2),162.13(COONH),172.78(NCOCH),177.35(NHCOCH)。IR ν/cm-1:3323.29(νNH),2924.56(νCH),1691.23(νC＝O),1545.37(δNH),1270.30-1195.36(νCOC,νCN)。
实施例2阳离子肽脂质化合物R14ODD合成方法如下：
(1)将40mmoL羰基二咪唑和240mmoL十四醇(摩尔比1:6)用200mL二氯甲烷溶解，在60℃反应2h，生成单取代中间体。将二乙烯三胺的二氯甲烷溶液滴加到上述反应液中(二乙烯三胺与酰化产物摩尔比为1:1)，加入等摩尔量的催化剂三乙胺，在40℃下继续反应10h，生成双取代中间体。反应完毕，过滤，旋转蒸发得到白色透明的粘稠状液体。用乙酸乙酯、乙醇混合溶剂(5:1体积比)进行重结晶提纯3次，得白色粉末状双取代长碳链中间体R14。
(2)称取50mmol L-Orn溶于150mL水中，100mmol Boc2O溶于水并滴加到鸟氨酸水溶液中，30℃搅拌反应2h，再加入100mmol Fmoc-OSu的乙腈溶液，继续反应10h，反应结束后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(2：1)体系重结晶，得到肽头部中间体L-Fmoc-Orn(Boc)-OH。
(3)20mmol已保护的鸟氨酸肽头部中间体L-Fmoc-Orn(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:4溶解于二氯甲烷溶液，0℃下活化2h，再加入长碳链中间体R14的二氯甲烷溶液(鸟氨酸与长碳链中间体两者摩尔比为1:7)，加入1.5mmol催化剂DMAP，在40℃下酰胺化反应2h，反应后旋转蒸发干溶剂，将产物用二氯甲烷/三氟乙酸＝3/1体积比溶剂溶解，置于4℃下8h，脱去保护基团Boc。用二氧六环/NaHCO3溶剂溶解，反应12h，脱去Fmoc基团.
(4)用石油醚重结晶2次，乙醇和水5：1混合溶剂重结晶2次，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱。在70℃下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个鸟氨酸头部的阳离子肽脂质化合物。
(5)将20mmol天冬氨酸与保护试剂Boc2O按照8:1摩尔比溶于水中，加入20mmol HOBt，在60℃，反应1h。反应完毕，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用石油醚进行重结晶3次，制备肽头部中间体L-Asp(Boc)-OH。
(6)以步骤(4)制备的含有一个鸟氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-Asp(Boc)-OH反应，两者摩尔比为1：4，经过氨基酸活化和酰胺化，得到含有一个Orn两个Asp的三肽头部阳离子肽脂质R12ODD，具体反应条件与提纯方法与步骤(3)(4)相同。
其结构表征如下：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:0.902(s,6H,CH3)；1.293(t,36H,J＝6.8,CH3CH2)；1.612(s,4H,CH2CH2O)；4.013(s,4H,CH2CH2O)；3.256(s,6H,NHCH2)；2.980(s,8H,CH2N)；3.544(t,3H,J＝6.0,COCH)；1.893-1.911(s,6H,CHCH2CH2)；1.536(s,6H,CHCH2CH2CH2)；1.724(s,4H,CH2CH2NH).13C NMR(400MHz,CD3OD)δ161.662(C＝O),173.20(COCH),64.999(CHNH),26.658(NHCH CH2CH2),30.69(CH2CH2NH),48.243(NHCH2),31.879(CH2CH2CH3),30.063～28.785((CH2)10),26.872-25.843(CH2CH3),13.253(CH3)。IR ν/cm-1:3322.78(νNH),2921.78(νCH),1690.90(νC＝O),1542.37(δNH),1269.35-1195.36(νCOC,νCN)。
实施例3阳离子肽脂质化合物R16KHHH合成方法如下：
(1)5mmol羰基二咪唑溶于氯仿，加入0.5mmol十六醇，加入40mmol二丙烯三胺的氯仿溶液，加入2mmol催化剂甲基吡啶，在10℃反应48h，得到带有双取代的长碳链中间体化合物。反应完毕，过滤，旋转蒸发得到白色透明的粘稠状液体。用乙酸乙酯、乙醇混合溶剂(5:1体积比)进行重结晶提纯3次，得白色粉末状双取代长碳链中间体R16。
(2)称取2mmol L-Lys溶于15mL乙腈中，6mmol Boc2O溶于乙腈并滴加到赖氨酸乙腈溶液中，60℃搅拌反应3h，再加入12mmol Fmoc-OSu的乙腈溶液，继续反应8h，反应结束后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯重结晶，得到L-Fmoc-Lys(Boc)-OH。
(3)已保护的赖氨酸与活化试剂按照1：1摩尔比溶于丙酮，在40℃反应0.5h，加入赖氨酸8倍摩尔比的长碳链中间体R16，加入2mmol吡啶，在40℃反应48h。反应完毕，旋转蒸发掉溶剂。将产物用二氯甲烷/三氟乙酸＝3/1溶剂溶解，置于4℃下8h，脱去保护基团Boc。用二氧六环/NaHCO3溶剂溶解，反应12h，脱去Fmoc基团。
(4)采用石油醚进行重结晶3次，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1)混合试剂进行洗脱。在70℃下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个赖氨酸头部的阳离子肽脂质化合物。
(5)将5mmol His溶于25mL蒸馏水中，保护试剂CbzCl按照1：5摩尔比溶于50ml四氢呋喃中，两者缓慢滴加混合均匀，加入2mmol DMAP，在20℃，反应4h。反应完毕，在70℃下旋转蒸发掉溶剂，用乙腈进行重结晶3次，制备肽头部中间体L-His(CbzCl)-OH。
(6)以步骤(4)制备的含有一个赖氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-His(CbzCl)-OH反应，两者摩尔比为1：6，经过氨基酸活化和酰胺化，具体反应条件与步骤(3)相同。产物加入10％NaHCO3水溶液20mL，反应4h脱掉CbzCl保护基团。提纯条件与步骤(4)相同，得到含有一个Lys三个His的四肽头部阳离子肽脂质R16KHHH。
其结构表征如下：1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:0.877(s,6H,CH3)；1.286(t,44H,J＝6.8,CH3CH2)；1.486(s,4H,CH2CH2NH)；1.731(s,6H,CH2CH2NH2)；1.881-1.912(s,6H,CHCH2CH2)；2.966-2.993(s,4H,CH2NH2)；3.091(t,6H,J＝6.0,CH2NH)；3.304(s,2H,CHCH2NH)；3.963(s,2H,NH2CH)；4.045(s,2H,OCH2CH2)；4.35(s,1H,CHNH)；4.953(s,1H,OCHCH2).13C NMR(400MHz,CD3OD)δ172.34(CONH),157.5(COOCH2),168.0(NHCOCH),156.2(COOCH),53.29(CHNH2),30.15-31.06(CHCH2CH2),22.37(CHCH2CH2),27.82(CHCH2CH2CH2),39.99(CH2NH2),54.9(CHNH),38.82(NH CH2CH),72.07(CH2CHO),62.9(CH2CH2O),38.35(CH2NH),29.92-28.45((CH2)12,NHCHCH2),32.094(CH2CH2CH3),22.37(CH2CH3),12.402(CH3)。IR ν/cm-1:3365(νNH),2929-2848(νCH,νCH2),1654(νC＝O),1247(νCN)。
实施例4阳离子肽脂质R18ORRR化合物合成方法如下：
(1)10mmol羰基二咪唑溶于氯仿，加入0.5mmol十八醇，加入40mmol二丙烯三胺的氯仿溶液，加入2mmol催化剂甲基吡啶，在10℃反应48h，得到带有双取代的长碳链中间体化合物。反应完毕，过滤，旋转蒸发得到白色透明的粘稠状液体。用乙酸乙酯、乙醇混合溶剂进行重结晶提纯3次，得白色粉末状双取代长碳链中间体R18。
(2)称取50mmol L-Orn溶于150mL水中，100mmol Boc2O溶于水并滴加到鸟氨酸水溶液中，30℃搅拌反应2h，再加入100mmol Fmoc-OSu的乙腈溶液，继续反应10h，反应结束后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(2:1体积比)体系重结晶，得到肽头部中间体L-Fmoc-Orn(Boc)-OH。
(3)10mmol已保护的鸟氨酸肽头部中间体L-Fmoc-Orn(Boc)-OH与活化试剂HATU以摩尔比1:4溶解于二氯甲烷溶液，0℃下活化2h，再加入长碳链中间体R18的二氯甲烷溶液(鸟氨酸与长碳链中间体两者摩尔比为4:1)，加入0.5mmol催化剂DMAP，在40℃下酰胺化反应2h，反应后旋转蒸发干溶剂，将产物用二氯甲烷/三氟乙酸＝3/1(体积比)溶剂溶解，置于4℃下8h，脱去保护基团Boc。用二氧六环/NaHCO3溶剂溶解，反应12h，脱去Fmoc基团.
(4)用石油醚重结晶2次，乙醇和水5：1(体积比)混合溶剂重结晶2次，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱。在70℃下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个鸟氨酸头部的阳离子肽脂质化合物。
(5)称取10molArg溶于60mL乙腈和水的混合溶剂(乙腈：水＝3：1)中，30mmol Boc2O溶于乙腈并滴加到天冬氨酸乙腈溶液中，20℃搅拌反应4h，将30mmol Fmoc-OSu加入到上述溶液中，20℃反应3h，反应结束后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(2:1体积比)体系重结晶，得到肽头部中间体L-Fmoc-Arg(Boc)-OH。
(6)以步骤(4)制备的含有一个鸟氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-Fmoc-Arg(Boc)-OH反应，两者摩尔比为2:1，经过氨基酸活化和酰胺化，具体反应条件和提纯条件与步骤(3)(4)相同，得到含有一个Orn一个Arg的二肽头部阳离子肽脂质R18OR。
(7)将步骤(6)制备的二肽头部阳离子肽脂质R18OR化合物为原料，与步骤(5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-Fmoc-Arg(Boc)-OH反应，两者摩尔比为1:4，经过氨基酸活化和酰胺化，具体反应条件和提纯条件与步骤(3)(4)相同，得到含有一个Orn三个Arg的四肽头部阳离子肽脂质R18ORRR。
其结构表征如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.866(s,6H,CH3)；1.244(t,52H,J＝6.8,CH3CH2)；1.564(s,4H,CH2CH2O)；3.969(s,4H,CH2CH2O)；2.945(s,8H,CH2N)；2.871(t,3H,J＝6.0,COCH)；1.906-1.998(s,6H,CHCH2CH2)；1.564(s,6H,CHCH2CH2CH2)；1.660(s,4H,CH2CH2NH).13C NMR(400MHz,CD3OD)δ46.011(CHNH),22.888(NHCH CH2CH2),14.285(CH2CH2NH),32.146(CH2CH2CH3),29.594～29.971((CH2)14),25.146-26.038(CH2CH3),8.898(CH3)。IRν/cm-1:3420.78(νNH),2925.20(νCH),1679.13(νC＝O),1261.32(νCN)。
实施例5用R12KA制备阳离子肽脂质体
称量1mg的阳离子肽脂质R12KA与相同摩尔比的助剂胆固醇溶于1mL甲醇和三氯甲烷混合溶剂中(混合比例为2:1体积比)，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥5h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，用100μL无水乙醇溶解后，加入900μL超纯水，使脂质体浓度为1mg/mL，在80℃左右水化1h，超声频率为100Hz下超声震荡至澄清透明，制得阳离子肽脂质体。
实施例6用R14ODD制备阳离子肽脂质体
称量0.5mg的阳离子肽脂质R14ODD溶于1mL三氯甲烷，加入助剂卵磷脂(R14ODD与卵磷脂摩尔比为1:2)，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥12h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，用1mL超纯水浸泡2h，使膜脱落，在55℃左右反复超声震荡(震荡频率为100Hz)至澄清透明，制得浓度为0.5mg/mL的阳离子肽脂质体。
实施例7用R16KHHH制备阳离子肽脂质体
称量5mg的阳离子肽脂质R16KHHH与助剂DOPE(R16KHHH与DOPE摩尔比为8:1)溶于5mL三氯甲烷中，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥8h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，加入5mL磷酸盐缓冲液，在30℃水化8h，超声频率为100Hz下超声震荡至澄清透明，制得浓度为5mg/mL阳离子肽脂质体。
实施例8用R18ORRR制备阳离子肽脂质体
准确称量摩尔比为3:1的阳离子肽脂质R18ORRR与助剂蔗糖酯S070(阳离子肽脂质体为2mg)，溶于1mL甲醇和三氯甲烷混合溶剂中(甲醇：三氯甲烷＝1:2体积比)，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥4h使溶剂全部挥发(真空度为-0.09MPa，常温)，加入200μL55℃左右的无水乙醇使膜脱落，加入800μL缓冲夜，在40℃左右反复超声震荡(超声频率为100Hz)至澄清透明，制得浓度为2mg/mL的阳离子肽脂质体。
实施例9脂质体的粒径及Zeta电位检测
采用激光散射粒度仪(HORIBA纳米粒度仪SZ-100)在25℃，光散射角度90°条件下测定制备的阳离子肽脂质体的粒径及其Zeta电位，用移液枪取20μL实施例1～实施例8制备的阳离子肽脂质体稀释于1mL超纯水中分别进行粒径和Zeta电位检测，结果见图1和图2。图1为4种阳离子肽脂质体的平均粒径，图2为4种阳离子肽脂质体的Zeta电位。
结果显示，4种阳离子肽脂质形成的脂质体粒径都在100nm左右，在转染的有效粒径(＜1μm)范围之内。Zeta电位绝对值均大于30mV，具有较好的静电稳定性。
实施例10R12KA脂质体/DNA复合物的制备
如实施例5中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取1mg/mL脂质体R12KA0.5μg用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5mg/mL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为1:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育10min，得到R12KA脂质体/DNA复合物。
实施例11R14ODD脂质体/DNA复合物的制备
如实施例6中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取0.5mg/mL脂质体R14ODD1μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5mg/mL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为2:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育20min，得到R14ODD脂质体/DNA复合物。
实施例12R16KHHH脂质体/DNA复合物的制备
如实施例7中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取1.5mg/mL脂质体R16KHHH3.0μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5mg/mL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为6:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育30min，得到R16KHHH脂质体/DNA复合物。
实施例13R18ORRR脂质体/DNA复合物的制备
如实施例8中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取3.0mg/mL脂质体R18ORRR4.0μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.5μg/μL质粒DNA0.5μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与DNA质量比为8:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育40min，得到R18ORRR脂质体/DNA复合物。
实施例14阳离子肽脂质体/siRNA复合物的制备
如实施例5～实施例8中所述方法制备得到阳离子肽脂质体，取脂质体1mg/mLR14ODD0.9μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；取0.3μg/μLsiRNA0.3μg，用无血清DMEM培养基稀释到25μL；两稀释液混合(脂质体与siRNA质量比为3:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育20min，得到R14ODD脂质体/siRNA复合物。
实施例15脂质体结合质粒DNA电泳延滞实验
采用琼脂糖凝胶电泳延滞实验，检测阳离子肽脂质体与质粒DNA在不同质量比时其相应的电荷比情况，进一步得出压缩的有效比例。将阳离子肽脂质体与质粒DNA按质量比依次为0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、8:1分别稀释于15μL RPMI1640培养液中轻微漩涡震荡混匀，室温孵育20min，取2μL的6×DNA Loading buffer依次加入上述15μL阳离子肽脂质体与质粒DNA复合物中混匀，并依次上样于1.2％的琼脂糖凝胶上样孔中，电压设为90V，电泳40min。制胶时已加入核酸染液NA-Red，电泳结束后直接在凝胶成像系统Gene GeniusBio-imaging System(SYNGENE公司)中观察DNA延滞情况。电泳结果如附图3所示，其中泳道1～8为阳离子肽脂质体与DNA按质量比分别为0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1和8:1的脂质体/DNA复合物。A为阳离子肽脂质体R12KA结合DNA电泳图，B为阳离子肽脂质体R14KDD结合DNA电泳图，C为阳离子肽脂质体R16KHHH结合DNA电泳图，D为阳离子肽脂质体R18ORRR结合DNA电泳图。
图3的A结果显示，随着脂质体质量的增加，DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比为6:1时DNA已完全延滞。图3的B结果显示，随着脂质体质量的增加，DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比为8:1时DNA已完全延滞。图3的C结果显示，随着脂质体质量的增加，DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比为6:1时DNA已完全延滞。图3的D结果显示，随着脂质体质量的增加，DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比为6:1时DNA已完全延滞。
实施例16体外生物学评价实验
(1)运载pGFP-N2质粒转染细胞实验
将Hep-2及NCI-H460细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔加细胞浓度约为1.0×105个/孔，孵育24h后，使在转染日细胞密度达80～90％。将脂质体与pGFP-N2质粒分别按照1:1，2:1，3:1，4:1，6:1和8:1比例复合，复合后总体积为100μL。将复合物加到细胞培养板中，培养4-5h，更换含血清10％和抗生素的培养基，培育48h。绿色荧光蛋白基因表达的产物GFP能激射峰值508nm的绿色荧光，采用倒置荧光显微镜进行基因表达分析。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无，GFP阳性细胞越多，信号越强，表明转染率越高。观察倍数20×10。
结果如附图4和图5所示，脂质体与DNA质量比为6:1，图4是阳离子肽脂质体转染NCI-H460细胞的转染结果；图5是阳离子肽脂质体转染Hep-2细胞的转染结果，结果表明：脂质体能高效转染NCI-H460和Hep-2细胞，与双子型脂质体基因载体G14相比，转染效率提高了50％。
(2)运载pGL-3质粒转染细胞实验
细胞培养方法与上述步骤(1)相同。脂质体与pGL3质粒分别按照1/1，2/1，3/1，4/1，6/1和8/1比例复合，复合后总体积为100μL。将复合物加到细胞培养板中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2(培养箱)中培养4-5h，更换含血清10％和抗生素的培养基，培育48h。转染后将细胞用DPBS洗1次，每孔加入600μL裂解液，20min后，移至96孔白板中，每孔加80μL普洛麦格E151A检测液。利用Synergy2多功能酶标仪(BioTek)检测相对酶活力。以热电公司的PierceBCAProteinAssay试剂盒为标准对照测定总蛋白含量。蛋白质测定后，转染效率可表示为：RLU/mg蛋白。采用商品化基因转染试剂Lipofectamine2000及DOTAP做对照。
实验结果如附图6所示，其中，G14为双子型脂质体基因载体；优选的脂质体与DNA质量比为6:1。4个脂质体均能够运载pGL3质粒转染NCI-H460和Hep-2细胞。在N/P为3:1时，转染效率达到最佳。与双子型脂质体基因载体相比，转染效率提高约50％。
(3)RNA干扰实验
细胞铺板没有计数，取基本长满的A549细胞，加到12孔板中，每孔加2mL，培养约24h，细胞密度约为50-60％。每孔加入200μL脂质体/siRNA复合物，转染18h，换生长培养基培养30h。将细胞用DPBS洗1次，每孔加入600μL裂解液，20min后，移至96孔白板中，每孔加20μL，加80μL普洛麦格E151A检测液，用多功能酶标仪(BioTek)检测相对酶活力。取裂解液5μL加到96孔透明板中，以热电公司的Pierce BCA Protein Assay试剂盒为标准对照测定总蛋白含量。
图7选择脂质体与siRNA最佳N/P比6:1，介导RNAi研究考察4种阳离子脂质体运载siRNA转染A549细胞沉默luciferase基因的能力。G14为双子型脂质体基因载体，siRNA和Control为空白对照。结果显示转染后，luciferase基因的表达水平均受到不同程度的抑制。其中，脂质体R16KHHH/siRNA和R18ORRR/siRNA与空白组相比，荧光素酶基因的沉默效率可达75％，与双子型脂质体相比，沉默效率提高约20％。说明脂质体介导siRNA进入细胞后可与细胞质中的蛋白质形成核酸蛋白复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，在RISC的作用下，siRNA特异识别目的mRNA，在核酸内切酶作用下切割目的mRNA，mRNA片段在核酸外切酶作用下降解后无法指导合成相应的蛋白质，从而实现了对luciferase基因的沉默。
(4)细胞毒性研究(MTT比色法)
采用MTT法对转染效率较高的阳离子脂质体进行细胞毒性试验，以商品化基因转染试剂Lipofectamine2000及DOTAP为对照。将Hep-2及NCI-H460细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔加细胞培养液(含双抗和血清)100μL，浓度约为1.0×106个/孔，孵育24h，使在转染日细胞密度达80～90％。移去生长培养基，用100μL培养基清洗，再用等量(100μL)培养基替换。将脂质体与质粒DNA分别按照1:1，2:1，3:1，4:1，6:1和8:1比例复合加到细胞培养板中。细胞培养24h后，每孔中加入20μL MTT(Sigma，5mg/mL)，孵育培养4-4.5h。弃去培养液，加入150μL DMSO溶破细胞。
基于MTT比色法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。故此，以空白对照(未转染细胞)的吸光值为100％，计算转染后细胞存活的百分率(％)。计算公式为：
细胞存活率(％)＝[A]样品/[A]对照×100％
[A]样品为测试孔的吸光值，[A]对照为阴性空白对照孔的吸光值。
实验结果如图8和图9，横坐标为所制备的阳离子肽脂质体，优选的脂质体与DNA质量比为6:1。图8是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转染过程中对NCI-H460细胞毒性的检测。图9是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转染过程中对Hep-2细胞毒性的测定图。4个脂质体对NCI-H460细胞和Hep-2细胞的毒性都不大，细胞存活率在80％～100％之间。与双子型脂质体基因载体相比，细胞存活率提高20％。
(5)细胞摄入研究
将A549细胞种植于6孔细胞培养板中，每孔加细胞培养液(含双抗和血清)1mL，浓度约为4.0×106个/孔，孵育24h，使在转染日细胞密度达70～80％。
将脂质体与siRNA以质量比为3:1复合，总体积200μL加到每孔中，培养30h。
用DPBS洗一次，每孔加入0.3mL胰酶消化细胞，1-2min后，加入0.8mL培养基。离心后，将细胞用0.4mL DPBS稀释，用流式细胞仪分析。
图10为细胞摄入检测结果，肽脂质体与siRNA质量比为6:1，G14为双子型脂质体基因载体，Oligo和Control为空白对照。4种脂质体均能进入细胞，其中，脂质体R16KHHH和R18ORRR细胞摄入量均达到90％以上，R14KDD细胞摄入量达到80％，高于双子型脂质体基因载体。
实施例17体内生物学评价实验
(1)小鼠模型的建立
取长满的A549细胞，用DPBS洗一次，加3mL Trypsin-EDTA放置3-4min，加5mL有血清和双抗的PRMI1640，轻轻吹打，转移到15mL离心管中，在1200rpm下离心5min。移除上清液，稀释于1.5mL PBS中，植于裸鼠皮下，每只约100μL，肿瘤长到60-70mm3时，可以使用。
(2)运载siRNA沉默Luciferase基因
将脂质体/siRNA以质量比3:1复合，经尾静脉注射于荷瘤小鼠，24h后取肿瘤，放于约500μL裂解液中，30min后，4℃下5000rmp离心10min。
沉默效果分析方法与实施例18中步骤(3)相同。
总蛋白含量分析方法与实施例18中步骤(2)相同。
阳离子脂质体R18ORRR运载siRNA，在小鼠肿瘤细胞内沉默luciferase基因的结果如附图11所示，其中Control为空白对照，G14为双子型脂质体基因载体，肽脂质体与siRNA质量比为6:1。注射脂质体R18ORRR后，小鼠细胞中luciferase基因蛋白表达显著降低，与空白对照相比，大约降低2倍。且沉默效率优于双子型脂质体基因载体。说明阳离子肽脂质R18ORRR可特异性地、高效地下调luciferase基因的过量表达。
(3)体内细胞毒性研究
将脂质体/siRNA以质量比3:1复合，经尾静脉注射于荷瘤小鼠，隔两天注射一次，共注射5次。每天给药前测量小鼠体重，观察各组小鼠每天体重增长的变化。
小鼠的体重变化如图12所示，在注射复合物前，小鼠的平均体重为25.9g，注射复合物后第6天小鼠体重呈明显上升趋势，第15天小鼠的平均体重达到27.89g，体重增长7.6％，表明小鼠对一定剂量的脂质体R18ORRR的适应，脂质体不会影响小鼠的正常生长。

Claims (7)

1.一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质，其化学结构式为：
其中：
x选自1～6；y选自1～8；R选自C8-20烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基；AA选自精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、鸟氨酸(Orn)或赖氨酸(Lys)；B选自Orn或Lys。
2.权利要求1所述双烷氧酰胺烷基类阳离子脂质的合成方法，其特征是：步骤如下：
(1)以酰化试剂和醇类化合物进行酰化，所述酰化试剂为羰基二咪唑；所述醇类化合物为十二醇、十四醇、十六醇或十八醇；酰化试剂与醇类物质的摩尔比为1:10～10:1，反应溶剂为甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿，反应温度为10～60℃，反应时间为0.5～12h；
(2)酰化产物再与多胺类化合物反应，制备双长碳链中间体，所述多胺类化合物为二乙烯三胺、二丙烯三胺或二丁烯三胺等多胺，多胺与酰化产物摩尔比为1:2～1:8；催化剂为三乙胺、碳酸钠或甲基吡啶等，催化剂的加入量为多胺投料质量的10％，反应温度为10～100℃，反应时间为2～48h，经重结晶得到带有双长碳链的中间体N,N-双烷氧酰胺烷基胺，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯或无水乙醇/水混合溶剂(v/v＝5:1)；
(3)采用保护试剂保护氨基酸的氨基，制备肽头部中间体：所述氨基酸为Lys、His、Arg、Asp、Ala、Gly或Orn；所述保护试剂为二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)或氯甲酸苄酯(CbzCl)；所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:8～8:1；反应溶剂为30～300mL水、乙腈或丙酮，反应温度为0～25℃，反应时间为0.5～2h，经重结晶得到肽头部中间体，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(v/v＝3：1)；
(4)将步骤(3)制备的肽头部中间体，与步骤(2)制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接：
a首先将肽头部中间体进行活化生成活泼酯，活化试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)或HOBt，氨基酸与活化试剂摩尔比为1:1～1:8，反应溶剂为二氯甲烷、DMF或三氯甲烷，活化时间为0.5～2h，活化温度为0～30℃；
b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烷、DMF或三氯甲烷溶液，经过酰胺化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，两者摩尔比为1:8～8:1，催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，催化剂加入量与双长碳链中间体摩尔比为1:1～1:8，反应时间为2h～120h，反应温度为20～60℃；
(5)脱掉氨基保护试剂。所述脱保护试剂为三氟乙酸或10％NaHCO3，脱保护试剂与类脂化合物摩尔比为1:1～1:2，脱保护时间为0.5～12h，脱保护温度为0～4℃。经重结晶法进行提纯，重结晶溶剂为乙腈、无水乙醇、超纯水、乙酸乙酯或石油醚；
(6)重结晶后，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿(3:1体积比)混合试剂进行洗脱。在70℃下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个氨基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物；
(7)以含有一个氨基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，合成其他双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质：将步骤(3)制备的肽头部中间体与步骤(6)制备的含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质，进行氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1～4个氨基酸的阳离子脂质化合物。两者摩尔比为1:8～8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤(4)(5)(6)相同。
3.一种由权利要求1所述双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质制备的阳离子脂质体，其特征是：该阳离子肽脂质体为双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小为100nm左右的均一稳定的表面带有正电荷的脂质体。
4.权利要求3所述的双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质体的制备方法，其特征是：步骤如下：
(1)将双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质和助剂按照摩尔比1:1～8:1比例溶解于氯仿或甲醇中，使双烷氧酰胺烷基肽脂质化合物的浓度为0.5～3mg/mL，所述助剂为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇或蔗糖酯；
(2)溶液在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥4～12h；
(3)用乙醇、水、磷酸缓冲液或三种物质的混合液进行水化，水化温度为10～80℃；水化时间为1～10h，超声震荡至澄清，得到双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体，浓度为0.5～3.0mg/mL。
5.一种由权利要求3所述的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体制备的阳离子肽脂质体/基因复合物，其特征是：由权利要求3所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体与质粒DNA(pDNA)或小干扰RNA(siRNA)，通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步骤如下：
(1)取如权利要求3所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体分散在细胞培养液(DMEM或RPMI1640)中，混匀，使浓度为0.02μg/μL-0.16μg/μL；
(2)将0.5～1.0μg pDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀，使质粒浓度为0.02μg/μL；
(3)按照脂质体与基因质量比1:1～8:1比例，将(1)和(2)两稀释液混匀，室温放置10～40min，即可得到双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。
7.一种权利要求5所述的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，其特征是：该基因复合物在细胞转染中的应用及在体内转染中的应用。
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