KR20180042350A - 분자의 생체막 관통 전달용 화합물 및 방법 (compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules) - Google Patents

분자의 생체막 관통 전달용 화합물 및 방법 (compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules) Download PDF

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일란 지브
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Abstract

약물, 및 특히 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 거대분자류를 생체막을 관통하게하는 신규한 전달 시스템이 제공되며, 특히 siRNA의 전달시스템이 제공된다. 상기 전달 시스템은 막을 효과적으로 통과하게 할 수 있는 분체에 거대분자 약물을 접합시키는 것을 포함한다. 상기 전달 시스템을 이용하는 신규한 화합물들 및 약학적 조성물들이 각각 제공된다. 본 발명의 일 관점에서, 상기 화합물들은은, 의학적 실행, 예를 들어, siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생체막을 관통하여 전달함으로써 의학적 질병을 치료하는 데 이용될 수 있다.

Description

분자의 생체막 관통 전달용 화합물 및 방법 (COMPOUNDS AND METHODS FOR TRANS-MEMBRANE DELIVERY OF MOLECULES)
본 발명은 분자 및 거대 분자들을 생체막을 관통하여 세포 내로 전달하며, 그 후에 선택적으로 세포 내에 포획하게 하는 신규한 전달 시스템 및 방법에 관한 것이다.
단백질 병리학은, 특정 단백질이 신규 특성을 획득하는 데 독성이 되게 하는, 변이된 단백질의 기능부전에서부터 병리학적 기능을 수득하는 것에 이르기 까지 많은 질병들의 원인 또는 발병에서의 공통 분모이다. 개념적으로, 이러한 단백질들의 합성을 유전자 요법에 의해 저해하는 것은 그러한 단백질 이상을 가지는 환자들에게 가능성을 약속할 수 있다.
최근 주요 과학적 진보 중 하나는 소 간섭 RNA (siRNA)를 사용하여 RNA 간섭에 의한 특정 유전자의 발현을 사일런싱(침묵)하게 하는 개념이다. RNA 간섭은 짧은 (
Figure pct00001
19-27 염기쌍), 이중가닥 RNA 서열 (siRNA로 지칭)에 기초한 것으로서, 세포성 생물학적 시스템과 [특히 더 큰 이중가닥 RNA를 절단하여 siRNA를 생성하는 Dicer 단백질 복합체, 및 RNA-유도 사일런싱 복합체 (RISC)] 협력하여 작용할 수 있어서, 번역을 저해하고 특정 mRNA 서열을 분해하기 위해 표지하며, 그리하여 번역 단계에서 유전자 발현을 저해한다. 특정 메신저 RNA (mRNA)에 상보적인, 미변형 또는 화학적 변형 DNA 분자의 짧은 서열 (보통 13-25 뉴클레오타이드)인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO)를 사용하여 특정 타겟 단백질의 발현을 저해하고 생성을 차단해 왔다. 그러나, 의학적 보호에 관한 그러한 접근방법의 엄청난 잠재적 이점이 있을 지라도, 그러한 거대분자들을 세포 내로 전달하는 것은, 올리고뉴클레오타이드들의 상대적으로 크고 높은 하전 (예를 들어, siRNA는 13 kDa의 평균 분자량이고, 약 40 개 음전하 인산기를 가진다)로 인하여 실질적인 과제로서 남겨져 있다. 실제, 올리고뉴클레오타이드의 생체막 투과 전달은 매우 큰 에너지적 장애물을 극복해야 한다.
막 쌍극자 전위는 임의의 인지질 막 내에 존재하는, 물/막 계면 및 막 중앙(내부 양전하) 사이의 전위이다. 이는 인지질 글리세릴 에스테르성 결합의 고도의 정돈된 카르보닐 기에 의해 발생되는 것으로 추정되고, 이의 진폭은 약 220-280mV이다. 상기 막 쌍극자 전위는 2-4의 유전 상수의 고도의 소수성 환경에 놓여있기 때문에, 내부 막 전기장 (IMEF))으로 지칭되는, 108-109V/m의 매우 강한 전기장을 생성한다. 상기 막 쌍극자 전위 및 관련 내부막 전기장은 중요한 생리적 기능들을 가지는 것으로 여겨진다: 이것들은 단백질의 입체 구조 및 활성을 결정함으로써 막 단백질의 기능에 영향을 끼칠 수 있다. 그러나, 본 발명자들이 아는 한, 현재까지, 쌍극자 전위는 어떠한, 산업적, 생물학적 또는 의학적 응용에 사용되지 않았다.
올리고뉴클레오타이드류 또는 단백질류와 같은 거대분자를 생체막을 관통하여 전달하기 위한 다양한 방법들이 개발되었다. 이러한 방법들은 바이러스성 벡터는 물론 양이온성 지질이나 리포좀과 같은 비바이러성 전달 시스템을 포함한다. 그러나, 오늘날까지, 그러한 방법을 사용하는 것은 시험관내 적용에 또는, 예를 들어, 눈에 직접 주입하는 것 또는 폐에 직접 투입하는 것에 의한 것과 같은 생체내 국부적 투여에 대체적으로 한정되었다. 간으로 효과적으로 전달하는 것이 또한 성취되었다. 독성이 이러한 전달 방법의 일부, 예를 들어, 양이온성 지질과 관련된 것에서 주요 제한적 요인으로 나타난다. 비바이러스성 전달 시스템 중에서, 효과적이고 널리 사용된 거대분자를 시험관내에서 전달하는 방법으로 전기천공이 알려져 있다. 이러한 방법에 따르면, 외부 전기장을 세포 현탁액에 적용하여, 세포막에 하전된 타겟 분자들을 충돌시키게 하고 후속적으로 일시적 및 국소적으로 막을 불안정하게 하여, 결국 상기 거대분자들을 세포 내로 통과시키게 한다. 그러나, 상술한 바와 같이, 전기천공은 시험관 내에서 주로 사용되며, 생체 내로 그 사용을 확대하였으나, 성공율이 제한적이었고, 그리고 외부 전극을 삽입할 수 있는 특정 기관 (예, 근육, 폐)에만 실행되었다.
결론적으로, 올리고뉴클레오타이드류 또는 단백질류와 같은 거대분자들을 세포막을 관통하여 또는 혈뇌장벽, 혈액안구 장벽, 또는 혈액 태아 장벽과 같은 다른 생물학적 장벽을 관통하여 전달하는 것은 필요하나 여전히 실질적으로 충족되지 않고 있고, 또한 치료성 거대분자를 전신적으로 전달하는 것은 여전히 크고, 접근되지 않은 과제로서 남아 있다.
본 발명은 의학, 생물학 또는 농업과 같은 다양한 분야에 적용하기 위한, 막 쌍극자 전위와 관계된, 최근에 발견된 내부 막 전기장(IMEF)을 새롭고 혁신적으로 활용하는 것에 초점을 맞춘다.
본 발명의 일 관점에서, 화학적 분체(moiety)이며, 약물에 잠재적으로 접합되며, 그래서, 그 약물을 IMEF / 막 쌍극자 전위에 의존적인 방식으로 생물학적 인지질 막을 가로질러 세포내로 향상되고 개선되게 전달할 수 있는 IMEF-기질을 제공한다.
본 발명의 일 관점은 따라서 IMEF-기질에 접합된 약물을 제공하는 단계 및 생체막을 상기 IMEF에 접합된 약물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 약물을 IMEF-기질에 접합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 방법으로서, 각각은: 옥탄올/물 분배 계수 >1; 하기 모티프 중 적어도 하나로부터 선택되는 음극: 카르보닐, 에테르, 또는 불소 원자(들); 및 적어도 하나의 두 개 탄소 길이의 선형 또는 분지 지방족 탄화수소 사슬을 포함하는 양극을 가지는 하나 이상의 분체를 상기 약물에 접합시키는 단계; 및 상기 생체막을 상기 접합된 약물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 분체들은 본 명세서에서 정의되는 바와 같은, 구조 E, E', 또는 E''을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 데 사용되는 접합체를 제공하고, 이 접합체는 옥탄올/물 분배 계수 >1; 하기 모티프들의 적어도 하나로부터 선택되는 음극: 카르보닐, 에테르, 또는 불소 원자(들); 및 적어도 하나의 두개 탄소 길이의 선형 또는 분지 지방족 탄화수소 사슬을 포함하는 양극을 가지는 하나 이상의 분체들에 접합된 약물을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 분체들은 본 명세서에서 정의되는 바와 같은, 구조 E, E', 또는 E''을 가질 수 있다.
플로레틴은 IMEF를 감소시키도록 작용하는 화학적 화합물이며, 따라서, 특정 화합물의 이동에 있어서 막 쌍극자 전위 / IMEF에 대한 의존성을 산정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실행적 목적을 위해, IMEF-기질은 화학적 화합물이며 이는 조건적으로 약물에 부착되어서 플로레틴의 존재 하에서 세포막을 통과하는 전달에서 50% 이상 감소시키는 것을 명백히 나타낸다.
본 발명의 구체예에서, 상기 IMEF-기질은 신규한, 합리적으로 설계된 "분자적 나노모터 (Molecular NanoMotor (MNM))" 이며, 이것은 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 데 IMEF를 사용할 수 있게 한다. 이러한 목적을 위해, 상기 MNM들은 IMEF의 정전기적 에너지를 운동에너지로 전환할 수 있고 및 이를 이용하여 존재하는 매우 큰 에너지적 장벽들을 극복하여 인지질 막을 포함하는 생물학적 장벽을 관통하여 거대분자 약물과 같은 화학적 화합물을 전달할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 식 (I)-(XId)에 따른 분체를 포함하는 접합체들의 생체막을 통한 흡수가 상기 내부 막 전기장의 약학적 차단 (예, 플로레틴, 100-1,000 μM에 의한) 또는 작동개시 (예, 6-케토-콜레스타놀 10-100 μM의 의한)에 의해 각각 극적으로 저해되거나 증강될 수 있다는 본 발명자들의 발견에 기반한다. 이러한 것은 식 (I)-(XId)에 따른 본 발명의 접합체들의 흡수가 막 쌍극자 전위와 연관된 내부 막 전기장에 직접적으로 의존한다는 것을 나타내며, 따라서, 식 (I)- (XId)에 따른 모든 이러한 화합물을 IMEF-기질로서 정의한다.
본 발명의 구체예에 따른 MNM들은 하기 식 (II)에 설정된 것과 같은 분체 E, E' 또는 E''의 구조를 포함한다. MNM들에 의해 전달될 약물들은 소분자 약물류이거나, 또는 펩타이드류, 단백질류 또는 올리고뉴클레오타이드류 (예, 천연 또는 변형된 단일 가닥 또는 이중 가닥, RNA 또는 DNA)와 같은 거대분자류 일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 전달될 거대분자류는 유전자 사일런싱을 위한 RNA 가닥들, 즉, siRNA (소 간섭 RNA), 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드류 (ASO)로서 작용하도록 설계된 DNA 서열들을 포함한다
약물들 (예, 소분자 약물들 또는 거대분자류)과 본 발명의 구체예에 따른 MNM들과의 접합체들은 기초 연구, 농업, 화학, 또는 비임상 또는 임상 의학적 실행에 이용될 수 있다. 특히, 이상 단백질들 또는 단백질 기능 부전이 역할을 하는, 및 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 사일런싱하는 것이 이득일 수 있는 경우의 의학적 질환 치료에 사용될 수 있다. 그러한 의학적 적용은, 예를 들어, 퇴행성 질환류, 암, 독성 또는 허혈성 손상, 감염, 또는 면역 매개 질환을 치료하는 도구일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 방법으로서, 식 (I)에 설정된 구조를 가지는 접합체, 또는 식 (I)에 설정된 구조에 의해 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물의 이용을 포함하는 방법을 제공한다:
Figure pct00002
식 (I)
상기 식에서,
D 는 소분자 약물, 펩타이드, 단백질, 및 천연 또는 변형된, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, siRNA 또는 ASO로 구성되는 군으로부터 선택된, 생체막을 관통하여 전달될 약물이고; y, z 및 w는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수이며, 여기서, 상기 정수가 0일 때는, 각각의 E 분체들은 없는 것 (null)을 의미하며; y, z 또는 w 중 적어도 하나는 0이 아니며;
E, E', 또는 E" 는 같거나 상이할 수 있고, 각각은 일반식 (II)에 설정된 구조를 가지며:
(A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
식 (II)
상기 식에서, A 분체 각각은 식 (III), (IV), (V) 및 (VI)에 설정된 구조들로부터 독립적으로 선택되고:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
식 (III) 식 (IV) 식 (V) 식 (VI)
M은 없거나, -O- 또는 -CH2-로부터 선택되고; 및 g, h 및 k는 각각 개별적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 군으로부터 선택되는 정수이고; *는 -H, 또는 B 또는 다른 A 기로의 연결점이고; a는 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 정수이고; Q는 산소 또는 아민이고.
B 는:
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 티올로 치환되거나; 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14아릴 또는 헤테로아릴;
하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 각각 조건적으로 에테르, 에스테르, 아민, 또는 아미드 기에 연결되는, 콜레스테롤, 담즙산, 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트리올, 리토콜산 또는 이의 임의의 유사체로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 스테로이드 분체; 및
이의 임의의 조합으로 구성되는 하나 이상의 군으로부터 선택되고;
Q1및 Q2는 각각 독립적으로 없거나, 에스테르, 티오-에스테르, 아미드 [예, -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-], 카르바메이트 [예, -O-C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-O-], 우레아 [-NH-C(=O)-NH-], 디설파이드 [-(S-S)-], 에테르 [-O-], 아민, 이미다졸, 트리아졸, 딜락톤; 이의 킬레이트된 금속 이온을 포함하는, BAPTA 및 EGTA로부터 선택된 금속 킬레이터; 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 절단될 수 있는 기이고;
L1,L2및 L3는 각각 독립적으로 없거나 및:
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14아릴 또는 헤테로아릴;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환된 -(O-CH2-CH2)u-;각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드; 이미다졸, 아지드, 아세틸렌; 및 이의 조합; 및 상기식에서 u는 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고; 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
여기서 Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 실재하거나 및 Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 각각은 조건적으로 T 분체를 포함하며; 여기서T는개시자기 (initiator group)로서 C4,C5,C6-1,2-디티오시클로알킬 (1,2-디티오시클로-부탄; 1,2-디티오시클로-펜탄; 1,2-디티오시클로헥산; 1,2-디티오시클로헵탄); γ-락탐 (5 원자 아미드 고리), δ-락탐 (6 원자 아미드 고리) 또는 ε-락탐 (7 원자 아미드 고리); γ-부티로락톤 (5 원자 에스테르 고리), δ- 발레로락톤 (6 원자 에스테르 고리) 또는 ε- 카프로락톤 (7 원자 에스테르 고리)로부터 선택되며, 이들 각각은 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올에 의해 치환되며;
B, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 식 (I)에서 정의된 약물에 접합된다.
본 발명의 일부 구체예에서, y=1, z=o 및 w=0; 또는 y=1, z=1 및 w=0이다.
본 발명의 일부 구체예에 따른 접합체들은 일반식 (I)을 가지며 및 생체막을 관통하여 세포 내로 전달될 수 있고:
Figure pct00007
식 (I)
식 (I)에 설정된 구조에 의해 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하며, 상기 식에서:
D는 생체막을 관통하여 전달될 약물이다. D는 소분자 약물, 펩타이드, 단백질, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO) 또는 siRNA와 같은 천연 또는 변형된, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고;
y, z 및 w는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6으로부터 선택된 정수이고, 여기서, 상기 정수가 0인 것은 각 E 분체가 없는 것을 의미하며; y, z 또는 w 중 적어도 하나는 0이 아니다. 일 구체예에서, y=1, z=o 및 w=0이고; 다른 구체예에서, y=1, z=1 및 w=0이다.
E, E' 또는 E" 는 같거나 다를 수 있고, 각각은 일반식 (II)로 설정된 구조를 가진다:
(A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
식 (II)
상기 식에서, 각 A 분체는 독립적으로 식 (III), (IV), (V) 및 (VI)로 설정된 구조들로부터 선택된다:
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
식 (III) 식 (IV) 식 (V) 식 (VI)
M은 없거나, -O- 또는 -CH2-로부터 선택되고; 및 g, h 및 k는 각각 개별적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 군으로부터 선택되는 정수이고; *는 -H, 또는 B 또는 다른 A 기로의 연결점이고; a는 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 정수이고; Q는 산소 또는 아민이다.
B 는:
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,또는 C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,또는 C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,또는 C14아릴 또는 헤테로아릴;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 각각 조건적으로 에테르, 에스테르, 아민, 또는 아미드 기에 연결되는, 스테로이드 분체 (콜레스테롤, 담즙산, 에스트라디올, 에스트리올과 같은), 에스트로겐, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드; 및 이의 임의의 조합; 또는
이의 조합으로 구성되는 하나 이상의 군으로부터 선택되고;
Q1및 Q2는 각각 독립적으로 없거나, 에스테르, 티오-에스테르, 아미드 [예, -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-], 카르바메이트 [예, -O-C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-O-], 우레아 [-NH-C(=O)-NH-], 디설파이드 [-(S-S)-], 에테르 [-O-], 아민, 이미다졸, 트리아졸, 딜락톤; pH-민감성 분체, 산화환원-민감성 분체; 킬레이트된 금속 이온을 포함하는 금속 킬레이터; 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 절단될 수 있는 기이고;
L1,L2및 L3는 각각 독립적으로 없거나 및:
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14아릴 또는 헤테로아릴;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환된 -(O-CH2-CH2)u-;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올에 의해 치환되거나 에테르 기에 연결된 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드; 이미다졸, 아지드, 아세틸렌; 및 이의 임의의 조합; 및 상기식에서, u는 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이고; 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
여기서 Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 실재하거나 및 Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 각각은 조건적으로 T 분체에 의해 치환되며; 여기서T는개시자기 (initiator group)로서 C5,C6,C7,-1,2-디티오시클로알킬 (1,2-디티오시클로-부탄; 1,2-디티오시클로-펜탄; 1,2-디티오시클로-헥산; 1,2-디티오시클로-헵탄); γ-락탐 (5 원자 아미드 고리), δ-락탐 (6 원자 아미드 고리) 또는 ε-락탐 (7 원자 아미드 고리); γ-부티로락톤 (5 원자 에스테르 고리), δ- 발레로락톤 (6 원자 에스테르 고리) 또는 ε- 카프로락톤 (7 원자 에스테르 고리)로부터 선택되며, 이들 각각은 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올에 의해 치환되며; B, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 식 (I)에서 정의된 약물에 접합된다.
본 발명의 구체예에서, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 두 개는 실재하는 것을 제공한다;
본 발명의 구체예에서, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 세 개는 실재하는 것을 제공한다;
본 발명의 구체예에서, 일반식 (I)에 따른 접합체를 제공하며, E, E' 또는 E'' 중 적어도 하나는 식 (VIIIg), 또는 식 (IXc)에 설정된 구조를 가진다:
Figure pct00012
식 (VIIIg)
Figure pct00013
식 (XIc)
상기 식에서 L3 및 D 각각은 식 (I)에서와 동일한 의미를 가진다;
Figure pct00014
식 (IXc); 각 경우에 a=1, k=1; 상기 분체는 Apo-Si-G로 지정된다
상기 접합체는 식 (VIIIg) 또는 식 (XIc), 및 식 IXc로 설정된 구조로 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하고, 상기 식에서 D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이고; 및 L3은 없거나 및 C1,C2,C3,C4,C5,또는 C6알킬렌으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예는 약물을 생체 내 또는 시험관 내에서 생체막을 관통하여 세포내로 전달하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 세포를 전술한 접합체와 접촉시키는 것을 포함한다.
다른 구체예는 필요한 환자에서 의학적 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 전술한 접합체를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 의약, 예를 들어, 인간 또는 수의용 의약에서 사용하기 위한, 본 발명에서 설명된 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예는 필요한 환자에서 의학적 질환을 치료하기 위한, 본 발명에서 설명된 접합체의 제조에, 예를 들어, 식 (II) 및 본 발명에서 설정된 분체 E, E' 또는 E''의 구조를 가지는 MNM 및 약물을 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예는 필요한 환자에서 의학적 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 본 발명에서 설명한 접합체를 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 상기 의학적 질환은 암이다.
화합물 라이브러리로부터 IMEF-기질을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 플로레틴 (100-1000μM), 및/또는 6- KC (10-100μM)의 존재 하에서, 세포 또는 리포좀을 화합물 라이브러리로부터 IMEF-기질로 여겨지는 후보 화합물과 배양 처리하는 단계;
(ii) 플로레틴 및/또는 6- KC의 존재 하에서 상기 후보 화합물이 막을 관통하여 상기 세포 또는 리포좀으로 흡수되는 수준을 측정하는 단계;
(iii) 플로레틴 및/또는 6- KC (10-100μM)의 부재 하에서, 세포 또는 리포좀을 상기 후보 화합물과 배양처리하는 단계;
(iv) 플로레틴 및/또는 6- KC의 부재 하에서 상기 후보 화합물이 막을 관통하여 상기 세포 또는 리포좀으로 흡수되는 수준을 측정하는 단계; 및
(v) 플로레틴 및/또는 6- KC의 존재 및 부재 간의 상기 후보 화합물의 흡수 수준을 비교하는 단계를 포함하며; 플로레틴의 존재하에서 50 %가 넘는 흡수 감소; 또는 6-KC의 존재하에서 두 배가 넘는 흡수 증가는 상기 후보 화합물이 IMEF-기질인 것을 나타내는 방법.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 되어 있는 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면을 가지는 이러한 특허 또는 특허 출원 공개 복사본들은 요청하여 필요한 요금 지불시 특허청에서 제공될 것이다.
본 발명은 하기 예시적 도면을 참조하여 비제한적 방식으로 특정 실시예 및 구체예와 연계하여 설명되며, 이로써 더 충실히 이해 될 것이다. 도면에서:
도 1a는 본 발명의 구체예들에 따른 화합물의 추정되는 작용 기전 (Mechanism of Action (MOA)) 하에 있는, 비대칭적 극성의 원리를 나타내는 개략도이다; 분자는 음전기 원자(들), 예, 불소 원자(들)로 음극, 및 탄화수소 사슬들로 양극을 가지게 하여, 인지질 분자들의 인접 사슬들과 소수성 상호작용을 통해 서로 작용한다. 결론적으로, 상기 분자는, 전체적으로 소수성이고 하전되지 않았지만, 집중되고 구별적인 음전하를 가지며 한편으로는 반대로 부분적인 양전하는 분산되고 및 가려져 있다. 이것은 그 분자를 막 표면에서부터 막 중앙으로 움직이게 한다.
도 1b 는 식 (IXb)에 따른 화합물에서 예시되는 바와 같은, 본 발명의 분자의 구조적 모티프를 개략적으로 나타내며, 식에서 Q1는 -S-S-이고; 및 Q2는 없는 것이며; a=6 ; b=8; 및 스테로이드 분체는 리토콜산의 잔기이다.
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 접합체의 추정되는 MOA를 개략적으로 설명한다: 도 2는 막 쌍극자 전위와 관련된, 내부막 전기장에 의해 구동되는 "분자적 나노모터 (MNM)"를 나타낸다; 도 2b는 MNM에 의해 유도되는 막 표면에 거대분자가 강제적으로 부가되어, 인지질 수화 쉘을 교란시키고 및 강제적으로 인지질 헤드 기를 옆으로 이동시키는 것을 나타낸다; 도 2c는 상기 접합체가 엔도솜으로 이동함에 따라. 결론적으로 접합체의 플립플롭 및 내포작용을 유도한 것을 나타낸다; 결국, 엔도솜 막의 리플릿들 사이에 상기 접합체 플립플롭이 있게되고 리플릿 간 농도 균형을 발생시킨다; 후속적으로, 상기 접합체가 엔도솜막에서 세포질로 이동하게 되고, 이는 농도 구배에 의해서 및 본 발명에서 설명하는 바와 같이 성능향상 분체 (performance enhancing moieties (PEM))에 의해서 구동된다.
도 3은 Dicer 효소를 사용하여 MNM을 절단하고 제거하여, 세포질 내로 siRNA를 포획하는 기전을 개략적으로 나타낸다; 도 3a는 Dicer 단백질 상에서 두 개 Apo-Si MNM들에 연결된 siRNA의 도킹을 보여준다; 도 3b는 효소 중재 RNA 절단에 의한 하나의 모터를 제거하는 것을 나타낸다. 후속적으로, 헬리카제/아르고노트(Argonaute)가 RNA 가닥을 분리시켜 가이드/센스 가닥을 방출하게 되고 유전자 사일런싱을 실행하기 위해 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC)와 상호작용하며 한편으로 제 2 MNM이 여전히 부착된 패신저 가닥은 분해되는 운명이 된다.
도 4는 단백질 (비제한적 예로 Cas9) 및 식 (I)에 설정된 바와 같은 E, E', E" 분체들을 포함하는, 본 발명의 접합체의 예증적 구조를 나타낸다;
도 5a-f, 6a-c, 및 7-9는 식 (VII) 또는 식 (VIIa)에서 설정된 구조; 각각 Apo-Si-11 또는 Apo-Si-C4을 가지는 본 발명의 MNM을 포함하는, 본 발명에 따른 접합체들의 시험관내에서의 생물학적 성능을 예시한다.
도 5a-f: 3T3-세포:
■ 도 5a는 시험관에서, 29-mer, 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 포함하는 접합체가 EGFP 단백질 를 발현하는 3T3 세포 (3T3-EGFP 세포)의 생체막을 관통하여 전달되는 것을 형광현미경 방법으로 나타낸다;
■ 도 5b는 도 5a에서 설명된 바와 같은 전달을 유세포 분석 (FACS)로 정량한 것을 점 도표로 나타낸다;
■ 도 5c는 도 5a에서 설명된 바와 같은 전달을 배양 24시간에서 ELISA 판독기로 판독하여 정량한 것을 나타낸다;
■ 도 5d는 시험관에서 58-mer 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하는 접합체가 EGFP 단백질을 발현하는 3T3 세포 (3T3-EGFP 세포)의 생체막을 관통하여 전달되는 것을 형광현미경 방법으로 나타낸다;
■ 도 5e는 도 5d에서 설명되는 바와 같은 전달을 유세포분석 (FACS)에 의한 정량화 한 것을 나타낸다: (i). 점 도표는 사건들의 백분율을 나타내며; ( ii ). 막대 그래프는 용량 응답을 나타낸다;
■ 도 5f는 본 발명의 작용 기전에 따라, 도 5d에서 설명된 바와 같은 엔도솜 분획체로 전달하는 것을 공초점 현미경 방법으로 나타낸다.
도 6a-c: 쥐 흑색종 B16 세포:
■ 도 6a는 Cy3 형광단 (적색)으로 표지된 58-mer 이중 가닥 DNA을 포함하는, 본 발명의 접합체가 B16 흑색종 세포의 생체막을 시험관 내에서 관통하여 전달되는 것을 형광 현미경 방법으로 나타낸다: (I). (II). 밝은 영역, 세포 윤곽을 나타낸다; (III). MNM없이 DNA로부터 나온 형광 신호; (IV). MNM를 포함하는 접합체의 형광 신호;
■ 도 6b는 도 6a에서 설명된 전달을 유세포 분석에 의한 정량화를 나타낸다 (용량 - 응답);
■ 도 6c는 도 6a에서 설명된 전달을 공초점 현미경 방법으로 검출하여 보이며, 58-mer 이중 가닥 DNA를 포함하는 접합체가 B16 세포의 엔도솜 분획체로 전달되는 것을 나타낸다.
도 7: 쥐 C26 결장암 세포:
58-mer 이중 가닥 DNA를 포함하는, 본 발명의 접합체가 C26 세포의 생체막을 시험관 내에서 관통하여 전달되는 것의 유세포 분석.
도 8: HeLa 세포:
58-mer 이중 가닥 DNA를 포함하는, 본 발명의 접합체가 HeLa 세포의 생체막을 시험관 내에서 관통하여 전달되는 것의 유세포 분석; 용량 - 응답.
도 9는 식 (VIIIb)에 설정된 구조를 가지는 두 개 MNM에 연결된, EGFP 유전자를 사일런스하도록 특별히 고안된, siRNA인, 본 발명의 접합체에 의해, 인간 HeLa 세포에서 작동된 시험관 내 유전자 사일런싱 (EGFP 유전자)을 설명한다; 예, Apo-Si-W (평균+SEM).
도 10 a-h는 식 (XVI)에 따른 화합물의 작용 기전(MOA) 의 예를 나타내며 여기서: 도 10a는 세포외 공간에서의 온전한 접합체를 나타낸다; 도 10b는 환원적 세포질 환경에서의 디설파이드 결합의 절단을 나타낸다; 도 10c는 pKa 의존적 방식으로 티올을 티올레이트로 탈양성자화하는 것을 나타낸다; 도 10d는 아미드 기의 카르보닐 분체에 대한 티올레이트의 친핵성 공격을 나타낸다; 도 10e는 사면체 중간체의 발생을 나타낸다; 도 10f는 티오에스테르의 발생에 따라 접합체가 결론적으로 절단된 것을 나타낸다; 도 10g는 후속적인 가수분해를 나타낸다; 도 10h는 분비되는 동안 세포외 공간의 산화적 환경에서 폐환 및 디설파이드 형성을 나타낸다.
도 11 a-h는 식 XVI 에 따른 화합물의 작용 기전 (MOA)을 예시하는 것으로: 도 11a는 세포외 공간에서의 온전한 접합체를 나타낸다; 도 11b는 환원적 세포질 환경에서의 디설파이드 결합의 절단을 나타낸다; 도 11c는 pKa 의존적 방식으로 티올을 티올레이트로 탈양성자화하는 것을 나타낸다; 도 11d는 아미드 기의 카르보닐 분체에 대한 티올레이트의 친핵성 공격을 나타낸다; 도 11e는 사면체 중간체의 발생을 나타낸다; 도 11f 는 티오에스테르의 발생에 따라 접합체가 결론적으로 절단된 것을 나타낸다; 도 11g는 후속적인 가수분해를 나타낸다; 도 11g 는 후속적인 가수분해를 나타낸다; 도 11h는 분비되는 동안 세포외 공간의 산화적 환경에서 폐환 및 디설파이드 형성을 나타낸다.
도 12는 히스톤 H2A와 비공유결합 복합체로 있는 두 개 Apo-Si-C4 MNM에 연결된, EGFP 유전자를 사일런스하도록 특별히 고안된 siRNA인, 본 발명의 접합체에 의해, EGFP 유전자를 발현하는 형질전환 마우스 간세포의 일차 배양물에서 작동된 유전자 사일런싱을 설명한다 (평균+SEM).
도 13 a-h는 Apo-Si-X-1로 지정되는, 식 (VII)에 따른 화합물의 작용 기전 (MOA)을 예시하고 있고; 여기서: 도 13a는 세포외 공간에서의 온전한 접합체를 나타낸다; 도 13b 는 환원적 세포질 환경에서의 디설파이드 결합의 절단을 나타낸다; 도 13c는 pKa 의존적 방식으로 티올을 티올레이트로 탈양성자화하는 것을 나타낸다; 도 13d는 아미드 기의 카르보닐 분체에 대한 티올레이트의 친핵성 공격을 나타낸다; 도 13e는 사면체 중간체의 발생을 나타낸다; 도 13f 는 티오에스테르의 발생에 따라 접합체가 결론적으로 절단된 것을 나타낸다; 도 13g는 CO2의 방출과 함께, 후속적인 가수분해를 나타낸다; 및 도 13h는 MNM이 분비되는 동안 세포외 공간의 산화적 환경에서 만나게 되는 디설파이드기의 형성에 따른 폐환을 나타낸다.
도 14 a-c는 본 발명의 E 분체가 인지질 막과 상호작용하는 것을 분자적 역학 (Molecular Dynamics (MD)) 연구로 나타낸다; 도 14a는 Apo-Si-X-1로 치칭되는 식 (VII)에 따른 화합물; 도 14b 는 Apo-Si-X-2로 지정되는 식 (VII)에 따른 화합물; 및 도 14c는 Apo-Si-S-S로 지정되는 식 IXb에 따른 화합물:
도 15는 컴퓨터화된 분자 시뮬레이션 연구를 통해서, 역학적 양성자화의 원지를 나타낸다. MNM의 삼차 아민의 양성자화 상태에 대하여, 분자의 수용성 형태 여기서 삼차 질소는 양성자화되어 있고 (양하전된) 및 결론적으로 혈장 또는 세포질 내에서 움직일 수 있는 상태; 및 수불용성 형태 여기서 상기 질소는 하전되지 않은 상태에 있어서 세포막 환경 내에서 이동할 수 있는 상태 둘 다를 제공한다. 생체 내에서 이러한 두 가지 형태가 조화롭게 분포되어 있으면, 체내에서 상기 접합체가 크게 분포될 수 있게 된다. 도 15a는 막으로부터 배제된, 본 발명의 분자의 양성자화된, 양하전 형태를 나타낸다; 도 15b는 상기 분자의 소수성, 비양성자 형태로서, 구분되고 인지질 막의 중심으로 이동하는 것을 나타낸다.
도 16은 MNM들 중 하나를 제거함에 따라, Dicer 효소에 의해 수행된, 식 (VIIIb)에 의한 본 발명의 접합체, Apo-Si-W가 시험관 내에서 절단된 증거를 제공하는 겔 전기영동을 보여준다.
도 17은 본 발명의 E, E' 또는 E''의 각 가닥의 5' 말단에서 접합된 siRNA 듀플렉스를 포함하는 본 발명의 접합체에 의한 S16 세포에서의 PMP22 유전자의 사일런싱을 나타내는 것으로, 각 분체는 식 (IXb)에 설정된 구조를 가지며, 여기서 a=3, b=0, k=1이다. 이러한 분체는 Apo-Si-S-S로 지정된다. 미처리 세포, 및 EGFP에 대한 (및 PMP22에는 무관) siRNA로 처리한 세포는 대조군으로 사용되었다. 나타난 바와 같이, Apo-Si-S-S MNM 접합체들은 PMP22 유전자의 발현 수준을 용량 의존적 방식으로 유효하게 녹다운 (사일런싱)하였고, 미처리 세포에 비하여, 400nM의 투여량에서 57 % 사일런싱이 관측되었고, 600nM 투여량에서 66 %로 증가하였다.
도 18은 식 (VIIa) (여기서 a=2, 및 k=1, Apo-Si-C4로 지정)에 따른 본 발명의 접합체의 막관통 전달; 및 막 쌍극자 전위 / 내부 막 전기장(IMEF) 사이의 직접적인 연관을 나타내고 있다. (A). 플로레틴; 유세포 분석 : 막 쌍극자 전위를 낮추는 플로레틴으로 세포를 예비 배양하면, 그 세포에 의한 Apo-Si-C4 접합체의 흡수가 뚜렷히 감소하게 된다; (B). 6-케토-콜레스타놀 (6-KC) ; 형광 현미경술: 막 쌍극자 전위를 증가시키는6-KC로 세포를 예비 처리하게 되면, Cy3 형광에 의해 평가되는 바와 같이, 그 세포에 의해 Apo-Si-C4 접합체 흡수가 뚜렷이 증가하는 것으로 나타난다. 영역당 세포 수를 계수하는 것은 관측 효과가 세포의 각 수에서의 차이로 인한 것을 제외시킨다.
본 발명은 특히 의학, 생물학 또는 농업과 같은 다양한 분야에 적용하기 위한, 막 쌍극자 전위와 관계된, 최근에 발견된 내부 막 전기장(IMEF)을 신규하고 혁신적으로 활용하는 것에 초점을 맞춘다.
중요한 관점에서, 본 발명은 약물에 접합시, IMEF / 막 쌍극자 전위에 의존적 방식으로, 약물이 생물학적 인지질 막을 관통하여 전달되는 것을 향상시키고 개선하게 하는 화학적 분체인, IMEF-기질을 제공한다.
플로레틴은 IMEF를 낮추는 역할을 하는 화학적 화합물이고, 및 따라서 막 쌍극자 전위 / IMEF 에 대한 특정 화합물의 이동의 의존성을 평가할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 실제적 목적을 위해, IMEF-기질은 플로레틴 부재시의 전달에 비해 플로레틴 존재시의 세포막 관통 전달에서 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 감소를 나타내는 화학적 화합물이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 IMEF-기질은 신규한, 합리적으로 설계된 "분자적 나노모터 (MNM)"이고, 이는 생체막을 관통하여 약물들을 전달하는 데 IMEF을 이용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 상기 MNM들은 IMEF의 정전기적 에너지를 운동에너지로 전환 할 수 있고 및 이를 이용하여 존재하는 매우 큰 에너지적 장벽들을 극복하여 인지질 막을 포함하는 생물학적 장벽을 관통하여 거대분자 약물과 같은 화학적 화합물을 전달할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 식 (I)-(XId)에 따른 분체를 포함하는 접합체들의 생체막을 통한 흡수가 상기 내부 막 전기장의 약학적 차단 (예, 플로레틴, 100-1,000 μM에 의한) 또는 작동개시 (예, 6-케토-콜레스타놀 10-100 μM의 의한)에 의해 각각 극적으로 저해되거나 증강될 수 있다는 본 발명자들의 발견에 기반한다. 이러한 것은 식 (I)-(XId)에 따른 본 발명의 접합체들의 흡수가 막 쌍극자 전위와 연관된 내부 막 전기장에 직접적으로 의존한다는 것을 나타내며, 따라서, 식 (I)- (XId)에 따른 모든 이러한 화합물을 IMEF-기질로서 정의한다.
MNM들에 의해 전달될 약물들은 소분자 약물들이거나, 또는 펩타이드류, 단백질류 또는 올리고뉴클레오타이드류 (예, 단일 가닥 또는 이중 가닥, RNA 또는 DNA)와 같은 거대 분자들 일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 전달될 거대분자류는 유전자 사일런싱을 위한 RNA 가닥들, 즉, siRNA (소 간섭 RNA), 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드류 (ASO)로서 작용하도록 설계된 DNA 서열들을 포함한다
본 발명의 구체예는 약물을 생체막을 관통하여 세포막으로 전달하거나 또는 혈뇌장벽 (BBB), 혈액안구 장벽 (BOB), 또는 혈액 태아 장벽 (태반-혈액-장벽)과 같은 생물학적 장벽을 통과하는 전달 시스템을 포함하는 신규한 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 구체예에 따른 화합물은 막 쌍극자 전위와 관련된 정전기적 에너지를 운동에너지로 전환하고 및 이를 이용하여 존재하는 매우 큰 에너지적 장벽들을 극복하여 인지질 막과 같은 생물학적 장벽을 관통하여 거대분자 약물과 같은 화학적 화합물을 전달할 수 있게 하는 데 신규하고 합리적으로 설계된 "분자적 나노모터들 (MNMs)"을 포함한다. 특히, 그러한 이용은 막 쌍극자 전위에 의해 발생된 내부 막 전기장(IMEF)을 이용하여 인지질 막 내에서, 막 / 물 계면으로부터 막 중앙으로 화물 약물에 연결된 MNM이 이동하는 것을 포함한다. 약물에 부착되면, 상기 전달 시스템은 약물을 막 중앙으로 이동시키고, 따라서, 막관통 이동을 보조한다. 특히, 이러한 전달 시스템은 치료성 거대분자류: 단백질류 또는 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA인 올리고뉴클레오타이드류의 전달을 위해 설계되어 있다. 특히, 상기 전달 시스템은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO), siRNA 또는, 예를 들어, 비 제한적으로, Cas9 단백질, 또는 항체와 같은 치료적 단백질의 전달을 위해 설계되어 있다.
비 제한적 방식으로 제시되는 바, 본 발명의 구체예에 따른 MNM들의 구조의 기저를 이루는 주요 원칙들의 하나는 "비대칭적 극성"의 원리이다. 이러한 원리는 인지질 막 중앙 내에서, 막 표면으로부터 막 중앙으로 잠재저긍로 크고 하전된 분자를 이동가능하게 하는 도구로서 본 발명자들에 의해서 개발되었다; 이동은 연관된 에너지 장벽을 극복하기 위해 내부 막 전기장에 의해 구동된다. 본 발명은 "비대칭적 극성"의 원리를 특정 분자 구조로 번역하는 것에 관한 것이다. 이러한 분자 구조는 막 쌍극자 전위와 연관괸 정전기적 위치 에너지를 분자의 운동 에너지로 전환하고, 막 중앙내에서 움직이도록 하는 것을 목적으로 한다. 구조적으로, 이러한 분자들은 그들의 logP 에 따라서, 소수성이고 비하전되도록 합리적으로 설계되어 그들의 logP 에 따라서 생체막을 분할할 수 있게 한다 [비 제한적 예로서, logP 값 >1을 가지는 (참조 도 1a)]. "비대칭적 극성" 의 원리의 중요한 성분은 이러한 분자들이 극성이고, 이들의 부분 전하가 비균등적 방식으로 분포되는 것이다: 부분적 음전하는 매우 집중적으로 국소화되어 있는 반면 부분적 양전하는 분자내 탄화수소 사슬을 따라 퍼져있다. 인지질 막과 상호작용시, 이러한 부분적 양전하는 분자의 탄화수소 사슬과 인지질 환경의 인접 탄화수소 사슬 간에 발생하는 런던형 소수성 상호작용을 통해 가려지게 된다 (런던 분산력). "비대칭적 극성"의 이러한 특징은, 이에 따라, 분자가 소수성이지만 극성이고, 집중된 부분적 음전하를 가지며, 부분적 양전하는 분산되고 가려져 있게 되는데, 도 1a에 도시된 바와 같이, 정식적인 음전하를 운반하는 것처럼, 소수성 막 환경내에서 분자의 이동을 발생시킨다. 상기내부 막 전기장은 막/물 계면에서 음극을 가지고, 및 막 중앙에서 양극을 가지기 때문에, 따라서, 본 발명의 분자는 막 중앙을 향하여 이동하고, 및 화물 약물 (예, siRNA, ASO, 치료적 단백질, 항체, 또는 다른 약제와 같은 약물)에 부착되는 경우, 상기 화물 약물 또한 막 중앙부로 이끌리게 된다. 결론적으로, 이러한 이동은 몇 가지 방식으로 화물 분자의 막관통 이동을 수월하게 할 수 있다. 특히, 하전된 거재 분자를 인지질 헤드 기(PLHG)에 부가할 수 있게 하고, PLHG 둘레에 수화 쉘을 교반하고, 따라서 PLHG를 옆으로 이동하게 한다. 이러한 국소적 막 불안정성으로 인해 막 인지질의 내포작용 및 플립플롭이 개시되고, 이들 둘 다는 화물 약물을 세포내로 이끌게 한다 (도 2).
본 발명의 접합체들은 또한 성능 향상 분체 (PEM)를 포함할 수 있다. 그러한 분체들은 세포 내의 타겟 부위에서 약물 또는 이의 연관 활성 분체(들)의 농도를 향상시키는 역할을 하는 화학적 기 또는 기전이다.
하나의 그러한 성능 향상 접근법 (PEM)은 본 발명의 접합체의 구조 내에 내포된 절단가능한 기에 관한 것이다 [식 (I)에 정의된 Q1 및 Q2 분체]. 본 발명의 맥락에서, 용어 "절단가능한 기"는 pH의 변화, 산화환원 상태의 변화, 또는 세포 내의 다른 조건과 같은 특정 생리적 조건에서의 자연적 또는 효소-매개 절단을 경험할 수 잇는 화학적 분체에 관한 것이다. 절단가능한 기들의 예는 디설파이드, 딜락톤, 에스테르, 티오-에스테르, 아미드, 카르바메이트, pH-민감성 분체, 또는 산화환원-민감성 분체를 포함한다. 이러한 위치에서의 본 발명의 접합체를 절단은 화물 약물 (예, 고도로 음하전된 siRNA 또는 ASO, 또는 다른 약제)을 타겟 세포의 세포질에 포획하도록 작용한다. 또한, 이러한 절단으로 인하여, 상기 접합체를 연속으로 소비하게 되면, 혈액 또는 엔도솜 막을 사이에 두고 상기 접합체의 농도구배를 유지하는 데 보조할 수 있다. 본 발명의 범위 내에 있는 절단가능한 기들에 기초한 PEM 중에는 디설파이드류, 카르바메이트류, 및 딜락톤류 가 있고 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 범위 내에 있는 다른 성능 향상 분체 (PEM)들은 접합체의 투여에 관한 것이고, 여기서 D는 Dicer 효소의 기질인 이중가닥 RNA이다. 그러한 접합체들은 유전적 코드에 따라 선택되고 및 특정 타겟 유전자를 사일런싱하는 데 적합한 23-30-mer dsRNA를 포함한다. 상기 Dicer는 특정 부위에서 이중 가닥 RNA를 절단하는 독특한 뉴클레아제이고, 유전자 사일런싱을 하는 RISC 복합체와 즉시 상호 작용하는 21-23-mer 이중 가닥 RNA 분획체를 생성한다. 이러한 방식에 따라서, 하나 또는 수 개 MNM들은 그러한 올리고뉴클레오타이드 약물에, 바람직하게는 센스 ("패신저") 가닥의 3'-말단 및/또는 5'-말단, 및 / 또는 안티센스 ("가이드") 가닥의 5'-말단에서 연결할 수 있다. 상기 접합체의 투여시, MNM들은 거대 분자 약물의 막 관통 전달을 가능하게 한다. 후속적으로 세포질에서 Dicer 효소에 의한 dsRNA의 절단은 가이드 가닥의 5'-말단에서 MNM(들)을 제거하게 되고, 따라서 상기 전달 시스템으로부터 siRNA를 방출하게 된다. 많은 음전하로 인하여, 상기 siRNA는 결국에는 세포질 내에 포획되게 되며, 여기서 RISC 복합체와 상호작용하고, 타겟 유전자의 사일런싱을 결과하게 된다. 세포내 포획의 Dicer-매개 기전은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다.
중요하게는, 본 발명은 또한 "동력학적 양성자화"의 개념에 기반한 다른 혁신적인 성능 향상 접근 방법에 관한 것이다. 이러한 개념은 pKa 값이 7.0-8.5 범위이면서 염기성 기 (예, 아민)가 분자 구조 내에 위치한 것에 기반한다. 이러한 접근 방법은 염기성 분자에 대하여, 계면적 pH가 벌크에서 보다 약 1 pH 단위 낮은 것으로 알려져 있는 사실을 이용하며 및 헨더슨-하셀발크 공식을 고려하면, 이러한 특징은 두 가지 군집의 분자를 생성한다: 하나는 양성자화되고 따라서 친수성이며 혈액 또는 세포질과 같은 수성 환경에서 용해되는 것; 및 소수성이고 비양성자화된 분자로서 세포 및 엔도솜 막과 상호작용하게 하는 다른 분자 군집이다. 따라서, 본 발명의 접합체에 대하여 사용한 바와 같이, 상기 동력학적 양성자화 원리로 인하여, 본 발명의 접합체는 "양쪽성" 특징을 가질 수 있고, 및 소수성 및 친수성 환경 둘 다를 통과 이동할 수 있어서, 결론적으로, 전신적 유전자 전달을 위한 효과적인 시스템에 대해 요구되는 바와 같이, 세포막을 통해서 세포질로 진입하게 되고 및 엔도솜 분획체로부터 세포질로 탈출하게 함으로써 몸 전체를 통틀어 많은 양의 상기 접합체를 분포하게 할 수 있다 (실시예 17, 도 15). 본 발명은 (i). MNM의 음극 및 양극 사이에 위치한 아민기; 및 (ii). 상기 아민 분체 측면에 붙어 있고, 7.0-8.5 pH 단위 범위에서 pKa값을 설정하도록 작용하는 전자 끌게 기를 포함하는"동력학적 양성자화 분체"를 각각 포함하는 E, E' 또는 E'', 분체를 포함한다. 그러한 측면 전자끌게 기의 예는 카르보닐, 에테르, 에스테르 또는 플루오로카본 기이다.
용어 "개시자 기"는 본 발명의 맥락상, 자연적 또는 효소-매개 화학 반응에 처해질 때, 인접 화학 결합의 절단을 개시하는 화학적 기에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 개시자 기는 C4,C5,C6-1,2-디티오시클로알킬 (1,2-디티오시클로부탄; 1,2-디티오시클로펜탄; 1,2-디티오시클로헥산; 1,2-디티오시클로헵탄); γ-락탐 (5 원자 아미드 고리), δ-락탐 (6 원자 아미드 고리) 또는 ε-락탐 (7 원자 아미드 고리); γ-부티로락톤 (5 원자 에스테르 고리), δ- 발레로락톤 (6 원자 에스테르 고리) 또는 ε- 카프로락톤 (7 원자 에스테르 고리)으로부터 선택된다.
용어 "활성화된 에스테르"는 본 발명의 맥락 상, 카르복실산의 유도체에 관한 것으로서, 양호한 이탈기를 보유하고 있고 따라서 아민류와 상호작용하여 아미드류를 형성할 수 있다. 카르복실 산에 대한 그러한 활성화 제의 예는 N-하이드록시석신이미드 (NHS)이다.
용어 "금속 킬레이터"는 본 발명의 맥락 상, 배위를 통하여 금속 이온을 포획하는 화학적 분체에 관한 것으로서, 배위 원자는 질소, 황 또는 산소 원자로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 킬레이트된 이온(들)은 킬레이팅 분체의 질소 및 산소 원자에 의해서 배위된 칼슘(Ca+2)이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 금속 킬레이터는 BAPTA [1,2-비스 (o-아미노펜옥시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트 산], EGTA (에틸렌 글리콜 테트라아세트 산) 또는 이의 유사체이고, Mg+2와 같은 다른 이온보다 Ca+2에 대한 선택성이 우월한 것을 나타낸다. 그러한 킬레이터들은 세포외 공간과 세포 기질 사이에 있는 Ca+2의 실질적인 농도 구배를 시용할 수 있어서, 화물 약물로부터 MNM을 잠재적으로 해방시키고 및 세포질 내에서 타겟 약물을 포획하고 축적하게 한다.
용어 " 헤테로알킬, 헤테로알킬렌 또는 헤테로아릴"은 본 발명의 맥락상, 각각 탄화수소 구조에 관한 것으로서, 그 원자의 적어도 하나가 질소, 산소 또는 황 원자(들) 또는 이의 임의의 조합으로 대체된 것이다.
본 발명의 구체예 중 하나에 따라서, "화물" 또는 "화물 약물"은 세포막을 관통하여 세포 내로 전달될 siRNA, ASO, 치료적 단백질, 또는 임의의 다른 약제이다. 상기 세포는 살아있는 동물이나 인간 대상체의 체 내에 있는 세포 배양물일 수 있고, 상기 전달은 이로운 치료 효과를 목적으로 한다.
용어, "전구체"는 본 발명의 맥락상, 본 발명의 구체예에 따른 접합체의 합성에 사용된 화학 분체에 관한 것이다. 상기 전구체는 합성의 여러 단계에서 상기 접합체의 합성 중에, 예를 들어, 비제한적 예로서, 올리고뉴클레오타이드와 같은 거대분자를 본 발명의 MNM들에 부착하는 과정중에 제거될 운명의 화학기를 포함한다.
세포내 타겟용 단백질 약물 (PDIT)의 분야는 상대적으로 신규한 분야로서, 부분적으로는 인간 게놈 서열화 프로젝트를 완료한 것에서부터 유도되었고, 이는 단백질 약물의 투여, 유전자 사일런싱, RNA 또는 DNA 편집, 또는 단백질 치환 요법을 통해, 잠재적 의학적 중재를 하기 위해 수 많은 신규한 세포내 타겟들을 확인해 준다. 개념적으로, 그러한 치료 전략은 거의 임의의 의학적 질환 치료에 유용할 수 있다. PDIT 분야 내의 특이적이고, 매우 매력적인 후보 단백질은 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-연관 단백질류, 및 특히, Cas9 단백질이다. 실제적으로, Cas9는 임의의 RNA 서열에 의해 장착되고, 이는 변이된 결함 유전자와의 잠재적 연관에 따라 합리적으로 선택된, 게놈 내 임의의 부위로 특이적으로 단백질을 지시하는 데 특이성을 수반하게 된다. 다음, Cas9는 DNA의 정확한 이중 가닥 절단을 유도한다. 자연 발생적 DNA 수리 기전들이 후속적으로 사용될 수 있어서 기능이상 유전자 내의 상기 DNA 부위를 수리한다. 따라서, Cas9 및 관련 단백질들은 매우 효과적인 유전자 편집 (특정 유전자들의 서열을 첨가, 혼란, 또는 교환하는 것) 및 유전자 조절 및 수리를 가능하게 하여, 전체 종에 적용할 수 있다. 단백질 및 적절한 가이드 RNA를 세포 내로 전달함으로써, 유기체의 게놈을 임의의 위치에서 절단할 수 있고 편집 및 수리할 수 있다.
하기 예시되는 바와 같이 (실시예 4), 본 발명의 구체예는 DNA 또는 RNA 편집에 중요한 역할을 하는 Cas9 단백질에 연결된 하나 이상의 "분자적 나노모터 (MNM)"들을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예는 치환 요법으로서 투여되는 치료적 단백질에 관한 것이다. 그러한 치환 요법은 결핍 또는 변이로 인하여, 생리적으로 중요한 단백질 수준의 감소와 연계된 질환의 치료에 필요할 수 있다. 그러한 경우, 각 단백질은 약물로서 외인적으로 전달될 수 있다. 단백질은 하전된 거대분자이기 때문에, 본 발명의 MNM와 같은 전달 시스템에 접합되지 않으면, 막 관통 전달이 불가능하다.
본 발명의 구체예에 따른 MNM들은 전형적으로 소수성 [비제한적 예로서, 옥탄올 대 물 분배 계수 (logP) >1을 가지는], 쌍극성, 미하전된 화학 분체들이고, 비대칭적 극성의 원리(상기 설명된)에 따라 설계된다. 논의된 바와 같이, MNM 의 이러한 특징들의 독특한 세트 (즉, 소수성이고, 건체적으로 중성 전하이지만, 극성이고 집중적인 부분 음전하를 가지며 분포된 부분 양전하를 가지는), 내부 막 전기장에 놓여질 때 독특한 벡터적 시스템을 창출하며, 분자를 인지질 환경 내에서 막/물 계면으로부터 막 중앙으로 이동하게 한다. 약물에 부착시, 이러한 분자들은 그 약물을 막 중앙으로 끌어들인다.
도 1b에 개략적으로 도시된 바와 같이, 본 발명의 구체예에 따른 접합체는 전술한 바와 강은 "분자적 나노모터 (MNM)"들을 포함하며, 이는 E, E' 또는 E'' 분체이다 [예를 들어, 식 (VII-XIa)의 임의의 것에 따른 분체에 의해 나타나는]. 상기 "분자적 나노모터 (MNM)" 는 하기 구조적 모티프를 포함하는 소수성 분체이다 (옥탄올/물 분배 계수 >1):
(i) 음극 (분체 E, E' 또는 E''의 A 군), 일반적으로 할로겐 [예를 들어, 불소 원자(들)] 또는 산소로부터 선택되는 적어도 하나의 음전기 원자(들)을 포함하고 이들은 집중적인, 구형 (또는 구형에 가까운) 배치로 공간에 배열되어 있을 수 있다. 그러한 원자들의 전자 끌기 특성 및 공간에서의 구조적 배열로 인하여, 상기 접합체의 음극은 전자가 풍부한 지점이다. 바람직한 구체예에서, A는 노나-플루오로-터트 부탄올의 잔기이다.
(ii) 양극 (분체 E, E' 또는 E''의 B군), 탄소, 실리콘, 보론, 인 및 황으로부터 선택된 상대적으로 양전기성 원자들을 포함하며, 이들은 인지질 막에 놓이게 될 때, 바람직하게는 선형, 분지 또는 환형 사슬 또는 이들의 조합물의 지방족 또는 방향족 구조의 배치를 통해서 인접 탄화수소 사슬과 최대한 상호작용하도록 배치된다. 본 발명의 구체예에서, 상기 양극은 선형의 포화된 탄화수소 사슬(들) 또는 콜레스테롤, 담즙산, 에스트라디올, 에스트리올, 또는 이의 유도체나 조합물과 같은 스테로이드 분체를 포함한다. 조건적으로, 본 발명의 상기 접합체는 수 개의 음극 및/또는 수개의 양극 구조 모티프들, 예를 들어, 식 (I-XId) 중 임의의 것에 의해서 예시되는 바와 같이, 탄화수소 사슬에 의해 분리된, 연속적으로 배열된 퍼플루오로- 및 산소-모티프를 포함할 수 있다.
상기 "분자적 나노모터 (MNM)" 및 상기 약물 D에 더하여, 본 발명의 구체예에 따른 접합체는 본 발명의 특정 식에서 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 링커(들) (L) 및 절단가능한 기(들) (Q)을 포함할 수 있다. 약물 D를 분자적 나노모터(들)을 E, E' 또는 E''에 연결하는 것은 직접적이거나 분체 L 또는 Q을 통할 수 있다; 상기 연결은 공유 결합을 통하거나, 또는 정전기 또는 배위 결합과 강은 비공유 결합을 통할 수 있다.
상기 외에, 본 발명의 MNM은 활성 약물에 더하여 약학적 조성물의 부분으로서 사용될 수 있다. MNM에 의해 제공되는 막 상호작용의 향상으로 인해, 활성 약물의 성능은 MNM이 포함됨으로써 효능 또는 안정성 등의 측면에서, 향상될 수 있다.
본 발명의 구체예는 필요한 대상체에서 의학적 질환을 치료하기 위한, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드 (예, siRNA 또는 ASO)와 같은 치료적 유용 약물을 포함하는 본 발명에 따른 접합체의 용도에 관한 것이다. 상기 의학적 질환은, 특정 단백질(들)이 질병 원인론 또는 발병에 역할을 하는, 퇴행성 질환류, 암, 외상성, 독성 또는 허혈성 손상, 감염 또는 면역 매개 질환으로 여기에 제한되지 않고, siRNA 또는 안티센스 기전을 통한 각 유전자(들)의 발현의 변동, 또는 치료적 단백질, 또는 항체에 의한 또는 단백질 치환 요법에 의한 각 단백질의 활성의 변동은 질환 관련 과정을 저해하는 데 또는 기저에 있는 질병을 치료하는 데 유익한 효과를 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 접합체들은 안티센스 요법으로서 사용될 수 있는 데, 이는 특정 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 또는 단백질로의 번역이 발생하는 각 메신저 (mRNA)에 결합하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 (, 또는 화학적 유사체)를 투여하는 것을 포함하는 의학적 치료의 형태이다. 이러한 치료는 해당 유전자의 발현을 저해하는 작용을 하게 되고, 그에 따라 해당 단백질의 생성을 방지한다. 대안적으로, 본 발명의 접합체들은 Cas9 단백질과 같은 치료적 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "약물" 또는 "약제"는, 본 발명의 맥락에서, 질병을 앓고 있는 환자에 투여시, 그 환자에 유익한 효과를 발휘할 수 있는 화학 물질에 관한 것이다. 이러한 유익한 효과는 증상의 개선, 또는 질병 진행에 역할을 하는 제제나 물질의 효과에 반작용을 하는 것일 수 있다. 약물은, 단백질, 또는 단일- 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA와 같이, 투여하여 유전자 발현을 저해하는 소 분자 또는 거대분자를 포함할 수 있다. 특히, 상기 약물은 siRNA 또는 ASO를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약물은 퇴행성 질환류, 암, 허혈성, 감염성, 독성 손상, 또는 면역 매개 질환을 치료하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 용어 "생체막"은생물학적 시스템과 연관된 임의의 인지질 막을 가르킨다 인지질 막의 예는 세포의 원형질막, 세포간 막, 또는 혈뇌장벽 (BBB), 혈액 안구 장벽 (BOB), 또는 혈액 태아 장벽과 같은 생물학적 장벽이다.
본 발명의 구체예는 본 발명의 구체예에 따른 MNM들, 및 약물을 포함하는 접합체를 제공한다. 본 발명의 구체예는 본 발명에서 설명된 접합체들 약학적 허용 담체(들) 또는 염(들)을 포함하는 약학적 조성물(들)을 더 제공한다.
본 발명의 다른 구체예들은 필요한 환제에서 의학적 질병을 치료하는 데 사용되는 본 발명의 접합체들 또는 본 발명의 접합체들을 포함하는 약학적 조성물들을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예는 필요한 환자에서 의학적 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제조하는 데, 본 발명의 접합체가 사용되는 용도를 포함한다. 일부 구체에에서, 상기 의학적 질병은 암이다.
일부 구체예에 따라서, 본 발명의 접합체 및 약학적 조성물을 임상적 상태에서, 생체 내에서, 사용하여 치환 단백질 요법 또는 유전자 요법 [비제한적으로 예를 들어, siRNA 또는 안티센스 요법 (ASO)]의 효율적인 전달 및 효과적인 성능을 이룰 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 접합체는 세포막 또는 혈뇌장벽 (BBB)과 같은 생물학적 장벽을 통과하여 siRNA, ASO, 치료적 단백질, 또는 항체의 전달을 개선하는 데 그래서 예를 들어, 효능, 독성, 또는 약동학과 같은, 하나 이상의 관점에서 거재 분자 약물의 성능을 향상시키는 데 유리할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 약물은 siRNA, ASO 및 치료적 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 거대분자이다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 접합체 및 약학적 허용염 또는 담체를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 약물을 생물학적 세포로 전달하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 세포는 배양중이거나 살아있는 동물이나 인간 대상체에 있는 것이고; 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 접합체와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 생체막은 세포막 및 생물학적 장벽으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법으로서, 상기 생물학적 장벽은 혈뇌장벽, 혈액 안구 장벽 또는 혈액 태아 장벽으로부터 선택되는, 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 비 제한적 잠재적 작용 기전 (MOA)에서, MNM(들)에 접합된 siRNA 또는 치료적 단백질과 같은 약물을 포함하는 본 발명의 구체예에 따른 접합체들은 인지질 막과 상호 작용시 막 관통 전달을 경험한다. 이러한 작용 기전은 도 2에 개략적으로 요약되어 있다. 비대칭적 극성의 원리로 인하여, 처음에는, MNM(들)은 내부 막 전기장에 의해 구동되어 막 표면으로부터 막 중앙으로 이동한다 (도 2a). 두 번째 단계에서 (도 2b), MNM들에 연결된 거대 분자는 막 표면으로 접근하게 되고, 따라서, 화물 거대 약물과 인지질 헤드 기 둘 다의 수화 쉘을 붕괴시킨다. 결론적으로, 인지질 헤드 기가 측면 이동하고 일시적인 막 구멍이 생성되어 이를 통해서 거대분자 약물이 세포 내로 전달된다. 막이 치유되면서, 후속적으로 상기 일시적 구멍이 닫히게 되고 이는 에너지적으로 선호되는 상태이다 (도 2c).
본 발명의 구체예에 따른 접합체들은 일반식 (I)에 설정된 바와 같은 구조를 가지고, 식 (I)에 설정된 구조로 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다:
Figure pct00015
식 (I)
상기 식에서, D는 생체막을 관통하여 전달될 약물이다. D는 소분자 약물, 펩타이드, 단백질, 또는 siRNA 또는 ASO와 같은 천연 또는 변형된, 단일 가닥, 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고; y, z 및 w는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6으로부터 선택된 정수이고, 여기서, 정수가 0인 경우, 해당 E 분체는 없다는 것을 의미하고; y, z 또는 w 중 적어도 하나는 0과 다르다. 일 구체예에서, y=1, z=0 및 w=0이고; 다른 구체예에서, y=1, z=1 및 w=0이다.
E, E', 또는 E" 는 동일하거나 상이할 수 있고 각각은 일반식 (II)에 설정된 구조를 가진다:
(A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
식 (II)
상기 식에서 각 A 분체는 독립적으로 식 (III), (IV), (V) 및 (VI)에 설정된 구조들로부터 선택된다:
Figure pct00016
식 (III) 식 (IV) 식 (V) 식 (VI)
M은 없거나, -O- 또는 -CH2-로부터 선택되고; 및 g, h 및 k는 각각 개별적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 정수이고; *는 -H이거나, 또는 B, 또는 다른 A 기에 연결되는 지점이고; a는 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 정수이고; Q는 산소 또는 아민이다.
B (전술한 바와 같은 양극): 각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올 치환되거나; 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14아릴 또는 헤테로아릴; 및
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 각각 조건적으로 에테르, 에스테르, 아민, 또는 아미드 기에 연결된 하나 이상의 스테로이드 분체 (콜레스테롤, 담즙산, 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트리올, 리토콜산, 또는 이의 임의의 유사체와 같은)로 구성되는 하나 이상의 군으로부터 선택되고;
Q1및 Q2 는 각각 조건적으로 절단가능한 기로서, 독립적으로 없거나, 에스테르, 티오-에스테르, 아미드 [예, -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-], 카르바메이트 [예, -O-C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-O-], 우레아 [-NH-C(=O) -NH-], 디설파이드 [-(S-S)-], 에테르 [-O-], 아민, 이미다졸, 트리아졸, 딜락톤, pH-민감성 분체, 산화환원-민감성 분체; 킬레이트된 금속 이온을 포함하는 금속 킬레이터; 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되고;
L1,L2및 L3 은 각각 독립적으로 없거나, 및:
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14아릴 또는 헤테로아릴;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환된 -(O-CH2-CH2)u-;
각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드; 이미다졸, 아지드, 아세틸렌; 및 이의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고; 상기 식에서 u는 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고,
상기 식에서 Q1, Q2, L1,L2및 L3의 적어도 하나는 실재하고, 및 Q1, Q2, L1,L2및 L3 은 조건적으로 T 분체를 포함하고; 여기서, T는 개시자 기로서, C4,C5,C6-1,2-디티오시클로알킬 (1,2-디티오시클로-부탄; 1,2-디티오시클로-펜탄; 1,2-디티오시클로헥산; 1,2-디티오시클로헵탄); γ-락탐 (5 원자 아미드 고리), δ-락탐 (6 원자 아미드 고리) 또는 ε-락탐 (7 원자 아미드 고리); γ-부티로락톤 (5 원자 에스테르 고리), δ- 발레로락톤 (6 원자 에스테르 고리) 또는 ε- 카프로락톤 (7 원자 에스테르 고리)로부터 선택되고; 여기서 각각은 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결되며;
상기 식에서 B, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 식 (I)에서 정의된 약물 (D)에 접합되어 있다.
본 발명의 구체예에서, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 두 개는 실재하는 것을 제공한다;
본 발명의 구체예에서, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 세 개는 실재하는 것을 제공한다;
D가 분자의 다른 분체로 연결되는 것은 공유결합, 정전기적 결합 또는 배위 결합을 통할 수 있다. 공유결합인 경우, 연결은 Q1또는 Q2분체를 통할 수 있고, 각각은 에테르, 에스테르, 아미드, 티오에스테르, 티오에테르 및 카르바메이트 기로부터 구성되는 군으로부터 선택된다. 배위 결합인 경우, 이는 금속 킬레이터인 Q1또는 Q2 기를 포함할 수 있고, 및 상기 연결은 바람직하게는 칼슘이온(들)의 배위를 포함한다. 정전기적 연결의 예는 E, E' 또는 E"의 분체 L1,L2또는 L3의 아민 기 및 D의 음하전된 인산기 간의 염 다리일 수 있다. D가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 연결은 그 뉴클레오타이드의 핵 염기, 리보오스 분체 (예, 리보오스의 2', 3' 또는 5' 위치를 통하여), 또는 인산염 분체에 될 수 있다; 연결은 올리고뉴클레오타이드 사슬의 말단 또는 비 말단 뉴클레오타이드에 있을 수 있다; 연결은 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 통해 이룰 수 있다. D가 단백질인 경우, 분자의 다른 분체로의 연결은 그 단백질의 아미노산, 예를 들어, 리신, 시스테인, 글루타메이트 또는 아스파테이트의 측쇄(들)로의 연결을 통해 이룰 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오타이드" 는, 본 발명의 문맥상, DNA 또는 RNA 분자들을 포함하며, 각각은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 또는 이중 가닥 서열이다. 각 뉴클레오타이드는 질소성 염기 (핵염기), 5탄당 ( 또는 ), 및 를 포함한다. 상기 핵염기들은 퓨린류 (아데닌, 구아닌) 및 피리미딘류 (티민, 시토신, 우라실)로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 용어는 변형이 분자의 백본에서 (예, 포스포로티오에이트, 펩타이드 핵산) 또는 핵염기에서 (예, RNA의 리보오스 기의 2' 위치에서의 메틸화, 또는 그 부위에서의 불소 원자 부착) 일어날 수 있는 뉴클레오타이드의 변형 형태를 또한 지칭할 수 있다. 이러한 변형은 개선된 체액 내에서 올리고뉴클레오타이드의 안정성 또는 약동학과 같은 특성을 개선할 수 있다. 그러한 변형된 올리고-뉴클레오타이드들의 용도는 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
일 구체예에서, 시험관내 또는 생체 내에 적용가능한, 유전자 발현의 특이적 저해 방법이 개시된다. 상기 방법은 D가, 질병의 병인론 또는 발생에 역할을 하는 병원성 단백질을 암호화하는 특정 유전자의 발현을 사일런스 시키도록 설계된 siRNA 또는 ASO인 본 발명의 접합체 또는 상기 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 이용하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 구체예에 따른 접합체들은 의학적 질병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 구체예는 따라서 필요한 환자에게 본 발명의 구체예에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 의학적 처리 방법을 개시한다. 일 구체예에서, 상기 투여된 약학적 조성물은 질병 관련 단백질을 암호화하는 특정 유전자의 발현을 저해하는 데 활성적인, siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 일반식 (I)에 따른 접합체들이 제공되며, 상기식에서 E, E' 또는 E'' 분체는 일반식 (VII)에 설정된 구조 및 연관 구조들을 가지며, 일반식 (VII)에서 설정된 것과 같은 구조로 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 또는 관련된 유사체, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다:
Figure pct00017
식 (VII)
U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고; L1,L2,L3,Q1,Q2 는 식 (I)에 설명된 것과 동일한 의미를 가지며, R 및 R'은 각각 수소, 할로겐, 하이드록실 기, 메톡시 기, 및 플루오로카본 기로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 아민 (이차 또는 삼차 아민) 기로부터 선택되고; k 및 d은 각각 독립적으로 없거나, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에서 선택되는 정수를 나타내며; 및 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 바와 같이 약물이다.
본 발명의 구체예에서, R 또는 R'는 각각 독립적으로 수소 및 불소 원자로부터 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 상기 에스트라디올 분체는 다른 스테로이드 잔기로 치환된다. 상기 스테로이드 잔기는 콜레스테롤, 리토콜산, 또는 관련 유사체일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, L1,L2및 L3는 각각 개별적으로 없거나 및 조건적으로 에테르 또는 아민에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8탄화수소 사슬일 수 있고; L1,L2및 L3는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, Q1 또는 Q2는 아미드, 에스테르, 에테르, 카르바메이트 또는 디설파이드로부터 선택된 분체이다.
본 발명의 다른 구체예에서, L1, L2 또는 L3는 T 분체를 포함하며, 여기서 T는 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 조건적으로 치환되는 1,2-디티오시클로-부탄이다.
더 특정한 구체예에서, 본 발명은 일반식 (I) 또는 식 (VII)에 따른 접합체를 제공하고, 상기 식에서 E, E' 또는 E''는 식 (VIIa)에서 설정된 구조를 가지고, 식 (VIIa)에서 설정된 구조로 나타나는 화합물 또는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다:
Figure pct00018
식 (VIIa)
상기식에서 a 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타낸다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 접합체를 제공한다:
클래스 A: 식 (I), (VII)에 따른 접합체 상기 식에서 E, E' 또는 E''는 "동력학적 양성자화 분체 " 를 포함한다:
본 발명은 MNM(들)을 포함하는 일반식 (I) 또는 식 (VII)에 따른 접합체를 제공하여, 상기 식에서 E, E' 또는 E'' 분체 는 전술한 바와 같은 " 동력학적 양성자화 분체 " 를 포함할 수 있고, 이는 (i).MNM의 음극 및 양극 사이에 위치한 아민 기; 및 (ii). 상기 아민 분체 측면에 붙어 있고, 7.0-8.5 pH 단위 범위에서 아민 pKa을 설정하는 전자 끌게 기로 구성된다. 그러한 측면 전자끌게 기의 예는 카르보닐, 에테르, 에스테르 또는 플루오로카본 분체/기이다. 이러한 E, E' 또는 E'' 분체 각각은 독립적으로 식 (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), 또는 (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh)에 설정된 것과 같은 구조를 가질 수 있고, 관련된 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다; 상기 식에서 D 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이고; L3은 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지며; a, k, d는, 적용할 수 있는 경우, 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; 및 R'''은 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00019
식 (VIIIa)
Figure pct00020
식 (VIIIb); a=2 및 L3=없는 경우; Apo-Si-W로 지정
Figure pct00021
식 (VIIIc)
Figure pct00022
식 (VIIId)
Figure pct00023
식 (VIIIe)
Figure pct00024
식 (VIIIf)
Figure pct00025
식 (VIIIg)
Figure pct00026
식 (VIIIh)
클래스 B: 식 (I), (VII)에 따른 접합체, 상기 식에서 E, E' 또는 E''는 절단가능한 디설파이드 분체를 포함한다:
본 발명은 또한 일반식 (I) 또는 식 (VII)에 따른 접합체를 제공하며, 상기 식에서 E, E' 또는 E''는 디설파이드 분체인 절단가능한 기 를 포함할 수 있다. 이러한 E, E' 또는 E'' 분체들은 각각 식 (IX)에서 설정된 구조 및 식 (IXa), 식 (IXb), 식 (IXc), 식 (IXd), 식 (Xe), 식 (IXf), 식 (IXg), 및 식 (IXh)에 따른 관련 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00027
식 (IX)
상기 식에서, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고; L1,L2및 L3는 상기와 동일한 의미를 가지고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시 기, 및 플루오로카본 기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 아민 (이차 또는 삼차 아민) 기로부터 선택되고; a, b, k 및 d는 각각 독립적으로 없거나 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6로부터 선택되는 정수를 나타내고; 및 상기 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 약물이고; 상기 분체는 식 (IX)에 설정된 구조로 표시되는 화합물 또는 식 (IXa), 식 (IXb), 식 (IXc), 식 (IXd), 식 (Xe), 식 (IXf), 식 (IXg) 및 식 (IXh)에서 설정된 구조를 가지는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다:
Figure pct00028
식 (IXa)
Figure pct00029
식 (IXb): a=3, b=0 및 k=1인 경우, 상기 분체는 Apo-Si-S-S로 지정된다
Figure pct00030
식 (IXc); a=1, k=1인 경우; 상기 분체는 Apo-Si-G로 지정된다
클래스 C: 식 (I), (VII), (IX)에 따른 구조로서 절단가능한 디설파이드 분체 , 및 동력학적 양성자화 분체 를 둘 다 포함한다:
상기 식에서 L3는 상기와 동일한 의미를 가지고; b, d 는 각각 독립적으로 없거나, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택되는 정수를 나타내고; 및 R'''는 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택되고; 및 상기 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 약물이다;
Figure pct00031
식 (IXd)
Figure pct00032
식 (IXe)
Figure pct00033
식 (IXf)
Figure pct00034
식 (IXg)
Figure pct00035
식 (IXh)
클래스 D: (I),(VII),(X)에 따른 접합체로서, 상기 식에서E, E' 또는 E''는 환형 디설파이드 분체 및 카르바메이트 분체 를 포함한다:
본 발명은 또한 일반식 (X)에 따른 접합체를 제공하며, 상기 식에서 E, E' 또는 E''는 카르바메이트 기를 포함할 수 있고, 및 상기 절단가능한 디설파이드 분체는 식 (X), (Xa), (Xb) 또는 (Xc)에 따른 환형 구조 범위 내; 및 상기 디설파이드가 산화된 또는 환원된 (개환) 형태에 있을 수 있는 관련 구조 범위 내에 있다:
Figure pct00036
식 (X)
상기 식에서, a, d, k, d는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6로 구성되는 군으로부터 선택된 정수를 나타내고; h는 1, 2, 3 또는 4의 정수이고; Z는 수소, 불소, 하이드록실 및 아민 기로부터 선택되고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; L3는 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지고; G는 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W는 산소, 아미드, 에스테르 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로부터 선택되고; D는 식 (I)에서 정의한 바와 같은 약물이고; E, E' 또는 E''는 식 (X)에서 설정된 구조로 표시되는 화합물, 또는 식 (IXa), 식 (IXb), 식 (Xa), 식 (Xb), 식 (Xc)에서 설정된 구조를 가지는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다:
본 발명의 구체예에서, k=1, 및 h=1이다. 본 발명의 구체예에서, R 및 R' 중 적어도 하나는 불소 원자이고 나머지 하나는 수소 원자이다.
환형 디설파이드 분체를 포함하고 따라서 식 (X)와 관련된 본 발명의 구조는 하기와 같고:
Figure pct00037
식 (Xa)
Figure pct00038
식 (Xb)
Figure pct00039
식 (Xc)
식 (X)에서 설정된 구조로 표시되는 화합물, 또는 식 (Xa), 식 (Xb), 식 (Xc), 에서 설정된 구조를 가지는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다.
클래스 E: 식 (I), (VII), (XI)에 따른 접합체로서, 상기 식에서 E, E' 또는 E''는 절단가능한 카르바메이트 분체 , 및 동력학적 양성자화 분체 둘 다를 포함한다 :
Figure pct00040
식 (XI)
상기 식에서 L3 또는 L2는 각각 식 (I)에 따른 의미를 가지고, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이고, E, E' 또는 E''는 식 (XI)에 설정된 구조로 표시되는 화합물, 또는 식 (IXa), 식 (IXb), 식 (IXc) 또는 식 (IXd)에서 설정된 구조를 가지는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함한다:
Figure pct00041
식 (XIa)
상기 식에서, L3은 식 (I)에 따른 의미를 가지고, a, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R'', R''', RIV는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다.
Figure pct00042
식 (XIb)
상기 식에서 L3은 식 (I)에 따른 의미를 가지고; a, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R'', R''', RIV는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다.
Figure pct00043
식 (XIc)
상기식에서 L3 및 D 각각은 식 (I)에서와 동일한 의미를 가진다.
Figure pct00044
식 (XId)
상기 식에서, L3 및 D 각각은 식 (I)에서와 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 구체예에서, 접합체가 제공되며, 여기서, E, E' 또는 E''는 각각 독립적으로 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에서 설정된 구조를 가지고; 약물에 부착된다.
또한, "전구체들"로 지칭되는 분자들이 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 맥락 상, "전구체"는 본 발명의 구체예에 따른 접합체의 합성에 사용되는 화학 분체이다. 상기 전구체는 치료적 단백질, 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 거대분자가 본 발명의 MNM들에 부착하는 것과 같은 단계에서, 상기 접합체의 합성 중에 제거되거나 변형될 운명에 있는 화학 기들을 포함한다. 그러한 화학기들의 예는 포스포로아미디트, 아지드, 아세틸렌 또는 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 기이다. 본 발명은 따라서 또한 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에서 설정된 구조의 화합물이고, 상기 접합체의 합성 중에 제거되거나 변형될 운명인 화학 분체를 포함하거나 그에 부착되어 있는 그러한 전구체를 개시한다.
본 발명의 구체예에서, 제거되거나 변형될 운명의 상기 화학 분체가 포스포로아미데이트, 활성화된 에스테르, 아지드 또는 아세틸렌로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전구체를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 전구체는 식 (XII)에 설정된 구조를 가진다:
Figure pct00045
식 (XII)
상기식에서 W는 식 (I), 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에서 설정된 바와 같은, E, E' 또는 E''로부터 선택된 분체이다. 이러한 전구체는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착되기에 유용할 수 있고, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 전구체는 식 (XIII)에 따른 구조를 가진다:
Figure pct00046
식 (XIII)
상기식에서 G는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId)중 임의의 것에서 설정된 바와 같은, E, E' 또는 E''로부터 선택된 분체이다. 이러한 전구체는 특히 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 부착되기에 유용할 수 있다. DMT는 디메톡시트리틸 비스-(4-메톡시페닐) 페닐메틸이고; CPG=조절된 공극 유리.
다른 전구체는 올리고뉴클레오타이드인 D를 그 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 내부 위치에서 부착하는 데 사용될 수 있다. 이를 위해, 상기 전구체는 식 (XIV)에 따른 구조를 가진다:
Figure pct00047
식 (XIV)
상기식에서 W는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에서 설명된 바와 같은, E, E' 또는 E''로부터 선택된 분체이고; 및 PRG는 하이드록실기를 보호하는 데 적절한 임의의 보호기이다. 그러한 기의 예는: 디메톡시트리틸비스-(4-메톡시페닐) 페닐 메틸 (DMT); 아세틸; 메톡시 메틸 에테르(MOM)이고;
Y는 조건적으로 산소 또는 질소 원자(들)에 의해 치환되고, 및 조건적으로 임의의 천연 또는 변형된 RNA 또는 DNA 염기에 연결된1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 원자 길이 탄화수소 링커들로부터 선택된다. 바람직한 구체에에서, 상기 염기는 티민 또는 우라실이다.
또 다른 전구체는 E, E' 또는 E''를 단백질 약물인 D에 부착하는 데 작용한다. 상기 전구체는 하기 식 A 및 B의 구조로부터 선택된 구조를 가진다:
Figure pct00048
상기 전구체는 D의 아민 분체들에 결합하기 위한 것이고, 상기 식에서, W는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에 따른 E, E' 또는 E'로부터 선택된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 전구체는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에서 설정된 구조를 가지고; 상기 식에서 D로의 연결 지점에, 포스포로아미디트, 활성화된 에스테르, 아지드 또는 아세틸렌으로부터 선택된 화합물로의 연결이 있다. 상기 후자의 두 개 기는 "클릭 화학" (click chemistry)에 의해서, 예를 들어아지드-알킨 후이스겐 부가환화 반응 (Huisgen cyclo-addition reaction)을 통해 D에 부착하는 데 유용하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체예는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에 따른 접합체; 및 약학적 허용염 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 유전자 발현을 시험관 내 또는 생체 내에서 특이적으로 저해하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 D가 특정 유전자의 발현을 사일런스하도록 설계된 siRNA 또는 ASO인 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에 따른 접합체; 또는 해당 약학적 조성물을 이용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 유전자는 질병의 원인 또는 발생에 역할을 하는 병원성 단백질을 암호화한다. 일부 구체예에서, D는 치료적 단백질이다.
본 발명의 구체예에 따른 접합체들을 의학적 질병 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에 따른 접합체를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 의학적 치료 방법을 포함하며; 상기식에서 D는 해당 의학적 질병의 치료에 유용한 약물이다.
일 구체예에서, 상기 방법은 siRNA 또는 ASO를 사용하는 유전적 치료법으로서, 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에 따른 본 발명의 접합체를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하며; 상기 식에서, D는 특정 환자의 질병에 역할을 하는 유전자의 발현을 저해하는 데 유용한 siRNA, ASO 또는 치료적 단백질이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 단백질에 의한 질병의 의학적 치료 방법을 포함하며, 여기서 D는 생물학적 인지질 막을 관통하여 또는 혈뇌장벽과 같은 생물학적 장벽을 통과하여 세포로 전달될 단백질이다. 상기 세포는 시험관 내의 세포 배양 상태이거나 또는 생체 내의 살아있는 동물 또는 인간 대상체 내에 있는 것이다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 신생물 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 신생물 세포는 종양 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 신생물 세포는 전이 상태의 세포이다. 상기 세포는 진핵성 세포, 발암성 제제가 형질감염된 진핵성 세포, 인간 세포, 전암성 세포인 세포, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 상기 세포는 세포 배양물 내의 세포, 또는 살아있는 동물이나 인간 대상체의 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, D는 치환요법으로서 투여되는, 즉, 변이되고 기능부전 단백질을 대체하여, 생리적 필요에 접근하는 단백질이다. 다른 구체예에서, D는 DNA 또는 RNA 편집 (특정 유전자들의 서열을 첨가, 혼란, 또는 교환하는 것)에서 역할을 하는 단백질을 포함하는, 유전자 조절에 역할을 가지는 단백질이다. 일 구체예에서, 상기 단백질은CRISPR들 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 관련 단백질의 일원일 수 있다. 특히, 상기 단백질은 Cas9 단백질 (CRISPR associated ptotein 9), -안내 뉴클레아제 (-guided ) , 또는 이의 유사체들이거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 의학적 질병의 유전적 치료 방법이 설명되며, 상기 방법은 D가, 적절한 가이드 올리고뉴클레오타이드와 함께 투여되는Cas9과 같은CRISPR 단백질인 식 (I)에 따른 접합체를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 따라서, 해당 가이드 올리고뉴클레오타이드가 적재된 단백질이 세포내로 전달되는 것을 달성하게되어, 상기 세포에서는 상기 CRISPR 단백질이 그의 게놈 편집 활성을 작동할 수 있게 된다. 이와 관련하여, 가이드 올리고뉴클레오타이드은 상기 Cas9 단백질을 DNA 상의 특정 부위 (장소)로 안내하여 그 위치에서 이중 가닥 DNA 절단을 유도하고자 하는 RNA 또는 DNA의 서열이며, 결과적으로 상기 유전성 물질에서의 국소적 결함을 수리할 수 있게 한다. Cas9의 경우, 상기 가이드 올리고뉴클레오타이드는 RNA의 짧은 분절체이고, 이의 서열은 타겟 DNA 부위의 서열에 상보적이다.
따라서, 본 발명의 구체예에 따른 접합체들, 및 해당 약학적 조성물들과 방법들은 특히, 암, 독성 손상, 허혈성 질병, 감염성 질병, 단백질 저장 질병, 외상, 면역-매개 질병 또는 퇴행성 질병으로부터 선택된 의학적 질병의 치료에 특히 유익할 수 있다.
일부 구체예에 따라서, 상기 의학적 질병은 암이다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 제어되지 않는 증식, 특성화된 기능의 상실, 불멸성, 유의한 전이적 능력, 항-어팝토시스 활성의 유의한 증가, 빠른 성장과 증식 속도, 또는 특정한 특징적 형태 및 세포성 표지와 같은 암-야기 세포의 전형적인 특성을 가진 세포의 존재를 지칭한다. 전형적으로, 암 세포는 종양의 형태이고, 동물 내에서 국소적으로 존재하거나, 예를 들어, 백혈구 세포의 경우처럼 독립적 세포로서 혈류에서 순환한다.
신경 질환의 분야에서, 본 발명의 구체예에 따른 접합체는, 알츠하이머 병, 운동 뉴런질환, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 다발성 경화증, 및 크로이츠펠트 야콥 병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료에, 특히 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 이용하여 화학적 화합물을 인지질 막을 관통하여 세포 내로 전달하는 것을 향상시키는 것에 관한 것이다. 부착된 화학적 화합물 및 원하는 지시에 의존하여, 그러한 전달은 다양한 유용한 이용성을 가질 수 있다. 예를 들어, 식물에서, 그러한 전달은 특히, 식물의 유전학을 개선하거나, 또는 다양한 해충, 균 또는 진균들을 박멸함으로써 작물의 질과 양을 개선하는 데 도울 수 있다.
또한, 다른 구체예에서, 본 발명은 화합물 라이브러리로부터 IMEF-기질을 선택하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
(i) 플로레틴 (100-1000μM), 및/또는 6-KC (10-100μM)의 존재 하에서, 세포 또는 리포좀을 화합물 라이브러리로부터 IMEF-기질로 여겨지는 후보 화합물과 배양 처리하는 단계;
(ii) 플로레틴 및/또는 6- KC의 존재 하에서 상기 후보 화합물이 막을 관통하여 상기 세포 또는 리포좀으로 흡수되는 수준을 측정하는 단계;
(iii) 플로레틴 (100-1000μM) 및/또는 6- KC (10-100μM)의 부재 하에서, 세포 또는 리포좀을 상기 후보 화합물과 배양처리하는 단계;
(iv) 플로레틴 및/또는 6- KC의 부재 하에서 상기 후보 화합물이 막을 관통하여 상기 세포 또는 리포좀으로 흡수되는 수준을 측정하는 단계; 및
(v) 플로레틴 및/또는 6- KC의 존재 및 부재 간의 상기 후보 화합물의 흡수 수준을 비교하는 단계를 포함하며; 플로레틴의 존재하에서 50 %가 넘는 흡수 감소; 또는 6-KC의 존재하에서 두 배가 넘는 흡수 증가는 상기 후보 화합물이 IMEF-기질인 것을 나타내는 방법이다.
실시예
본 발명을 더 예시하기 위해 및 본 발명의 구체예들이 어떻게 실제 수행될 수 있는지를 증명하기 위해 특정 실시예들이 설명될 것이다.
하기 실시예에서, 단일 가닥에 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드에 부착된 본 발명의MNM(들)을 포함하는 접합체가 설명된다. 본 실시예들은 본 발명의 다양한 접합체에 대하여, 본 발명의 전 영역, 즉 본 발명의 MNM(들)은: (i). 성공적으로 합성되고; (ii). 성공적으로 거대 분자 (예, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA)에 접합되고; (iii). 많이 하전된 거대 분자들을 효율적으로 전달할 수 있고(소수성 인지질 막을 통과하여 세포 내로); 및 (iv). 일단 세포 내에 있게 되면, 이러한 거대 분자들을 작용 위치에 도달시키고 및 유용한 생물학적 활성을 작용시킬 수 있다 (예, 세포질 내에서 일어나는 유전자 사일런싱)는 것을 증명한다.
실시예 1: 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 구체예에 따른 접합체의 일반적 제조 방법:
먼저, 질병 원인론 또는 발병병리에서의 역할에 기반하여, 사일런스될 유전자를 선택한다. 다음, 당해 분야에 공지된 생물정보학적 방법론에 기반하여, 그 뉴클레오타이드 서열을 결정한다 (전형적으로, RISC 기질용으로는 19-21 염기쌍 이중 가닥 RNA, 또는 Dicer 기질용으로는 25-29 염기쌍 이중 가닥 RNA).
3'에서 5' 방향으로 합성을 수행한다. 보호된 2'-데옥시뉴클레오시드류 (dA, dC, dG, 및 T), 리보뉴클레오시드류 (A, C, G, 및 U), 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드류, 예를 들어. LNA (locked nucleic acids) 또는 BNA (bridged-nucleic-acids)로부터 유도된 포스포라미디트 빌딩 블록을 사용하여 고상 합성을 적용한다. 후속적으로, 상기 빌딩 블록들을 원하는 siRNA의 서열에 의해 정해진 순서대로, 생성되는 올리고뉴클레오타이드 사슬에 순차적으로 결합시킨다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 작제한 후, 본 발명의 E 분체를 상기 올리고뉴클레오타이드의 빌딩 블록 중 하나로서 부가한다. 상기 E 분체는 전술한 바와 같은 그 전구체로서 첨가된다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 상기 화합물을 연결하기 위해, 포스포라미디트 분체를 포함하는 식 (XII)에 따른 전구체를 이용한다. 상기 화합물을 상기 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 연결하기 위해, 식 (XIII)에 따른 전구체를 이용한다. 상기 화합물을 상기 올리고뉴클레오타이드의 내부 위치에 연결하기 위해, 식 (XIV)에 따른 전구체를 이용한다. 특히, 이러한 전구체는 상기 올리고뉴클레오타이드 사슬에 E 분체의 연결을 매개하기 위해 아세틸렌 또는 아지드 분체를 포함할 수 있다. 상기 과정은 완전히 자동화되어 있다. 상기 사슬의 조합이 완성되면, 그 생성물은 고체 지지체로부터 용액으로 방출되고, 탈보호되고, 및 수집된다. 다음, 원하는 접합체를 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분리하여 원하는 접합된 올리고뉴클레오타이드를 고순도로 얻는다. siRNA의 경우, 각 상보적 RNA 가닥을 별도로 합성한 후, 두 개 가닥의 어닐링을 당해 분야에 공지된 표준 조건에서 수행하여 원하는 이중 가닥 siRNA를 산출한다.
실시예 2: 본 발명의 E 분체들의 화학적 합성 (E, E' 또는 E").
출발물질인 퍼플루오로-tert-부탄올은 상업적으로 이용가능하다. 본 실시예에서, 상기 E 분체들은 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 연결되도록 설계되며, 따라서, 포스포라미디트 분체가 상기 올리고뉴클레오타이드 사슬에 접합하는 쪽으로, 합성의 마지막 단계에서 부가된다.
실시예 2a: 식 (VII)에 따른 E 분체의 합성 방법:
Apo-Si-C4로 지정되는, 식 (VIIa)에 따른 본 발명의 E 분체의 전구체 합성 방법이 예시된다. 상기 전구체는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착되기 위해 설계되었고 하기 구조를 가진다:
Figure pct00049
합성은 에스트라디올로부터 개시된다.
Figure pct00050
반응식 1
반응식 1에 따라 합성을 수행하였다. 예를 들어, 에스트라디올을 벤질기로 보호하여 화합물 11을 제공하였다. 최적화된 반응 조건하 (알릴 브로마이드, NaH, cat. 테트라-n-부틸암모늄 브로마이드 (TBAI), 데트라하이드로퓨란 (THF), 재환류, 16 h)에서 알코올(11) (25.6 g)을 알릴화시켜 흰색 고체의 알릴 에테르(24)를 수득하였다 (21.85 g, 77%) (헵탄 및 MeOH에서 연속적으로 저작하여 정제). 표준 산화 조건 (NaOH/H2O2)에서, 말단 알켄(24) (21.8 g)를 9-보라비시클로[3.3.1]노난 (9-BBN)로 위치선택적 수소붕소화시켜 알코올(22)을 제공하였다. 상기 알코올(22) (13.6 g)를 최적화된 반응 조건 [디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD), PPh3,4A분자체 (MS), THF, RT, 16h]하에서 과량의 퍼플루오로-tert-부탄올로 미추노부 반응시켜 원하는 에테르(21)을 생성하였다. 화합물(21)을 THF 및 2,2,2-(10% Pd/C, RT) (THP)-보호된 브로모부탄올을 사용하여 알킬화 시켰다올리고뉴클레오타이드 사슬의 합성의 최종 빌딩 블록으로서 포스포라미디트 기를 통해서 올리고뉴클레오타이드 사슬 5'-말단에 접합하였다.
실시예 2b: 식 (VII)에 E 분체의 합성 방법:
식 (VII)에 따른 본 발명의 E 분체의 전구체 합성 방법이 예시되며, 여기서 에스트로겐 백본은 리토콜산 잔기로 교환되었고; R 및 R'은 각각 수소 원자이고; L1,L2,Q1,Q2 은 모두 없는 것이 되고, 및 L3는 14-탄소길이의 탄화수소 링커이다; 이러한 화합물은 Apo-Si-11로 지정하고, 포스포로아미디트기에 연결된 전구체로서 하기에 나타내며, 따라서 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착하기 위해 설계되었다:
Figure pct00051
Apo-Si-11
합성은 상업적으로 이용가능한 담즙산인 리토콜산을 사용하여 시작된다. 합성은 합성 반응식 2에 따른다:
Figure pct00052
반응식 2
예를 들어, 물질(1)의 25 g을 상응하는 메틸-에스테르로 정량적 수율로 전환시켰다. 물질(2)의 25 g을 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (TBDMSCl) 29 g과 반응시켰다 (87%, NMR). 순수한 화합물(3)을 수득하였다. 화합물(3) (29 g)을 NaBH4THF/MeOH을 사용하여 (4)로 환원시키고, 검사 및 정제 후 NMR 결과 화합물 (4)가 얻어졌고 (85%), 여전히 미량의 화합물(3)이 남았다. 물질(4)를 퍼플루오로 t-부탄올을 사용하여 미추노부 반응시키고, 일련의 컬럼 크로마토그래피 및 MeOH로부터 저작한후, 33.5 g의 화합물(5) (92%)를 얻었고 다음 이를 탈보호시켜 스테로이드(6)을 생성하였다. 다음, 스테로이드(6) (2.5 g)을 THP-보호된 브로모테트라데칸올과 결합시켰다. 결합에 3일이 걸렸고, 및 완전히 전환시키는 데 4 당량의 THP-보호된 브로모테트라데칸올이 필요하였다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 보호기 (THP)를 MeOH/1,4-디옥산 (HCl, 4 N)/THF으로 제거한 후, 생성물(7)을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 불순물을 제거하였다. 생성물(7) (1.5 g, c.y. 48%)을 흰색 고체로 수득하였다. 다음, 포스포라미디트기를 부착하여 생성물(7)을 원하는 화합물(8)로 전환하였다. 이러한 생성물을 올리고뉴클레오타이드 사슬 합성의 마지막 빌딩 블록으로서 올리고뉴클레오타이드 사슬의 5'-말단에 부착하였다.
실시예 2c: 식 (Xc)에 따른 E 분체의 합성 방법:
식 (Xc)에 따른 본 발명의 E 분체의 전구체의 합성 방법이 예시되며, 하기 구조를 가진다. 상기 전구체는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착되려고 설계되었고 하기 구조를 가진다:
Figure pct00053
중간체(4)는 하기 반응식(3)에 따라 합성되었다.
Figure pct00054
반응식 3
염기 조건하에서 디티올-부틸 아민 (0.5 g)을 요오드와 반응시켜 결정성 흰색 고체의 1,2-디티안(10) (3.13 g, 90%)을 생성하였다. 중간체(11)에 상응하는 알코올은 상업적으로 이용가능하고 및 디(DMT)로 보호하였다. 다음, 이러한 전구체를 최종 빌딩 블록으로서 상기 올리고뉴클레오타이드 사슬에 사슬의 5'-말단에 접합시켰다. 산소 원자를 통해 연결이 이루어 졌다 상기 접합은 식 (Xc)에 따른 E 분체를 포함하는 원하는 접합체를 생성하였다.
실시예 2d: 본 발명의 화합물의 주요 빌딩 블록의 합성 방법 (스테로이드 (1)):
스테로이드(1)은 본 발명의 많은 구조체들의 주요 빌딩 블럭이다. 스테로이드(1)의 합성에 대한 출발 물질은 에스트라디올이다. 본 발명의 화합물들에 대하여 개발된 화학은 방향족 하이드록실기의 보호 후에, 미추노부 반응을 이용하여 퍼플루오로-tert-부탄올을 부착하는 것을 포함한다. 합성은 하기 합성 반응식에 따라 수행하였고, 반응식에서 Bn은 벤질 보호기를 의미한다; BnBr=벤질 브로마이드; TBAI=테트라부틸암모늄 아이오다이드; THF=데트라하이드로퓨란; 9-BBN=9-보라비시클로[3.3.1]노난; DIAD=디이소프로필아조디카르복실레이트
Figure pct00055
실시예 2e: 식 (IXb)에 따른 E 분체의 합성 방법
본 실시예는 식 (IXb)에 따른 E 분체용 전구체의 합성을 설명하며, 식에서 a=3; b=0, k=1이고, 전구체는 하기 구조를 가진다. 이러한 화합물은 전구체로서 Apo-Si-S-S로 지정된다:
Figure pct00056
식 (IXb): Apo-Si-S-S
합성은, 실시예 2d에서 설명된 바와 같이, 핵심 중간체(1)로부터 출발하여, 하기 반응식에 따라 합성을 수행하였다:
Figure pct00057
화합물(1) (5 g)을 (53)으로 알킬화시켜, 4.95 g의 분리된 물질을 얻었다. 이를 LiAlH4를 사용하여 환원시키고 후속적으로 메실 클로라이드 (MsCl) (메실레이트 4.56 g)으로 보호하였다. 포타슘 티오아세테이트(KSAc)를 사용하여 아세테이트(32)로 성공적으로 전환시키고, 및 정제후, 4.35 g의 (32)를 분리하였다. 피롤리딘을 사용하여 탈보호하여 화합물(33)을 얻고 후속적으로 (35)로 전환하여 조 물질 9.88 g을 얻어서 이를 정제하였다. 대부분 과량의 이미데이트 시약을 함유하는 APO-Si-SS의 조물질을 펜탄 및 MeOH으로 정제하여 이상 (two-phase) 시스템을 생성하였다. 다음 상등액을 따르고 흰색 오일을 용매로부터 분리하여 APO-Si-SS용 순수 전구체를 얻었다 (1.33 그람).
실시예 2h: 식 (VIIIb)에 따른 E 분체의 합성 방법:
식 (VIIIb)에 따른 E 분체는 하기 구조를 가지며 Apo-Si-W로 지정된다. 본 실시예는 포스포로아미디트기를 포함하고 올리고뉴클레오타이드 약물의 5'-말단에 부착되기 위한 전구체의 합성을 설명한다:
Figure pct00058
식 (VIIIb); Apo-Si-W
하기 반응식에 따라, 에스트라디올로부터 개시하여 합성을 수행하였다:
Figure pct00059
상기식에서Bn=벤질
W-2의 모든 물질을 알릴화시켰다. 많은 검사후, 화합물 W-3 (66.4 그람)을 고순도로 분리하였다. 병행하여, 하기 합성 반응식에 따라 화합물 W-6을 합성하였다:
Figure pct00060
Alloc=일릴옥시카르보닐; 고상 합성에 사용되는 시약; 미추노부 반응은 알코올을 다양한 관능기로 전환시킨다.
다음, 환원성 아민화를 수행하여 W-7를 생성한다. 다음W-7를 하기와 같이 반응시켜 D에 연결하는 지점인 포스포로아미디트기를 가진 화합물을 생성하였다:
Figure pct00061
실시예 2i: 식 (VIIIh)에 따른 E 분체의 합성 방법:
본 실시예는 하기 구조를 가지는 식 (VIIIh)에 따른 E 분체용 전구체의 합성을 설명한다:
Figure pct00062
식 (VIIIh)
하기 반응식에 따라 합성을 수행하였다. 먼저, 하기 반응식에서 설명된 B3-1를 합성하였다. 즉시 이용가능한 출발 물질들을 알킬화하여 양호한 순도와 양으로 B3-2을 얻었다. 다음 미추노부 반응을 수행하여 8.5 그람의 분리된 B3-3을 얻었다.
Figure pct00063
다음, 하기 반응식에 따라 에스트론으로부터 합성을 진행하여 원하는 화합물을 제공하였다.
Figure pct00064
상기식에서 Bz-Cl=벤질클로라이드; Bn=벤질; TsOH=토실산; TBS = tert-부틸디메틸실릴 에테르; TBAF= Tetra-n-부틸암모늄 플루오라이드
실시예 2j: 식 (IXh)에 따른 E 분체의 합성 방법:
본 실시예는 하기 구조를 가지는 식 (IXh)에 따른 E 분체용 전구체의 합성을 설명한다:
Figure pct00065
식 (IXh)
합성은 하기 나타난 바와 같이, 하이드록실-프롤린 유도 빌딩 블록으로부터 시작하였다.
Figure pct00066
NaBH4를 사용하여 프롤린 메틸 에스테르[CAS #40216-83-9]를 환원하여 상응하는 디올을 얻었다. 다음, 에틸 트리플루오로아세테이트로 처리하여 아세트아미드(3)을 제공하였다. 일차 알코올을 메실 클로라이드로 선택적 반응시켜 화합물(4)를 얻었다. 티오아세테이트와 반응시켜 화합물(5)를 얻고 이에서 아세테이트 기를 제거하였다. 하기와 같이 후속 합성 단계를 수행하여 식 (IXh)에 따른 화합물의 타겟 전구체 분자를 제공하였다.
Figure pct00067
실시예 3: MNM(들)을 올리고뉴클레오타이드 사슬에 접합시키는 예:
올리고뉴클레오타이드 사슬에 접합시 전구체 및 해당 화합물의 구조체의 예.
a. 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에서의 연결 :
전구체:
Figure pct00068
올리고뉴클레오타이드에 부착된 상태:
Figure pct00069
b. 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에서의 연결 :
전구체:
Figure pct00070
상기식에서 DMT = 디;및 CPG = 올리고뉴클레오타이드의 합성용 고체 지지체로서 제어된 공극 유리.
올리고뉴클레오타이드에 부착된 상태:
Figure pct00071
c. 올리고뉴클레오타이드 사슬 상의 내부 위치에서의 연결 :
그러한 경우, 뉴클레오타이드 (예, 티민)을 E에 부착시켜고 이는 올리고뉴클레오타이드 사슬에 고정하는 역할을 한다. 이러한 변경으로 인해 말단 위치보다는 올리고뉴클레오타이드 사슬 내에 E 분체를 부착하기 위해서 작용한다. 식 (VIIa)에 따른 구조체를 가지는 E를 사용하여 설명한다:
전구체:
Figure pct00072
올리고뉴클레오타이드에 부착
Figure pct00073
실시예 4: 본 발명의 E 분체에 접합된 단백질 (비제한적 예로, Cas9)을 포함하는, 본 발명의 접합체의 예시적 구조:
하기 개략적으로 예시되는 바와 같이, 본 발명의 구체예에 따른 MNM(들) E, E' 또는 E''을 링커 기를 통해 단백질에 부탁하였다, 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통해 단백질 표면상의 리신 곁사슬에 결합시켰다. 부착을 위해 활성 에스테르를 사용하였다. 이러한 목적을 위해, 알코올기를 활성 에스테르 (예, N-하이드록시석신이미드, NHS)로 전환하였다. 그러한 분체는 산소 (물)보다는 단백질 리신 곁사슬의 질소와 더 선호적으로 반응한다. 하기 반응식에 따라서 반응을 수행하였다:
Figure pct00074
가능한 유도화 제제는하기와 같다:
a) 포스젠: 클로로포르메이트 에스테르를 통한 연결.
b) 디석신이미딜 카르보네이트 (X = N-하이드록시석신이미드): 연결은 석신이미딜 카르보네이트를 통해 이뤄진다.
c) 카르보닐디이미다졸 (CDI, X = 이미다졸): 연결은 이미다졸릴 카르바메이트를 통해 이뤄진다.
아민없는, 약 염기 완충액 (pH=8-9)에서 이러한 기 중의 임의의 기로 단백질 표지한다. 연결 지점은 소수성이고, 따라서 단백질과의 반응이 일어나기 위해서는 조용매 [일반적으로 DMF (디 메틸포름아미드), 또는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)]를 필요로 한다. 상기 세가지 옵션 중, 카르보닐-디-이미다졸이, 산소보다 더 높은 질소 선택성으로 인하여 및 해당 합성 간결성으로 인하여 더 선호된다. 단백질 분자당 E, E' 또는 E" 분체의 수는 원하는 몰 비의 예비 설정에 따라 조절되고 결정된다.
실시예 5: 본 발명의 하나 또는 두 개 분자적 나노모터 에 접합된 DNA 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 접합체의 세포상 흡수:
도 5-9는 본 발명의 MNM(들)을 포함하는, 본 발명의 구체예에 따른 접합체의 시험 관내 다양한 세포 유형으로의 전달에 있어서 생물학적 성능을 예시하고 있다. 상기 접합체들은 식 (VIIa)에 따른 MNM(들)을 포함하고, 상기 식에서 a=2, 및 k=1이다 (실시예 2b에서 특정된 바와 같이, Apo-Si-C4; 또는 Apo-Si-11로 지정). 이러한 MNM들을 Cy3-표지된 단일 가닥 29-mer DNA 서열 (29개 음전하를 가짐), 또는 각 서열이 적색 형광단 Cy3에 의해 표지된 이중 가닥 58-mer DNA 서열 (58 음전하를 가짐)에 부착하였다. 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드들의 서열은 5'-MNM-TT-iCy3-CGGTGGTGCA GATGAACTTCAGGGTCA (서열 번호 1); 및 5'-MNM-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC GAA (서열번호 2). iCy3은 상기 서열 내부 위치에서의 형광단 Cy3을 의미한다. 이러한 서열들 (비제한적 예로, IDT, 미국 아이오와에 의해 합성된)을 무작위로 선택하고 세포내로 막관통 전달하기 위한 예로서 사용 하였다. 상기 형광단을 내포하는 것은 조사된 접합체의 위치를 검출하는 도구로서 사용된다. Apo-Si MNM에 의한 거대분자들의 막관통 전달이 일반적이며 특정 세포 유형에 한정되지 않는다는 것을 증명하기 위하여 다양한 세포 주에서 성능이 제시된다. 일반적으로, 본 발명의 모든 하기 접합체들: Apo-Si-C4, Apo-Si-11 Apo-Si-S-S, Apo-Si-G 및 Apo-Si-W가 유사한 성능 프로필을 나타내는 것은 주목할 만한 것이다.
실시예 5a: 3T3 세포:
본 발명의 MNM이 29-mer 단일 가닥 DNA (ssDNA) 올리고뉴클레오타이드를 세포내로 전달하는 능력을 평가하기 위해, 시험관내 분석을 실시하였다. 실험 하루 전, 대수증식기에서 EGFP 단백질로 안정적으로 형질감염시킨 NIH-3T3 세포 (3T3-EGFP 세포)를 항체가 없고 DMEM + 보충 성장 배지 (500 ㎕/웰)을 가진 24-웰 플레이트에 4.5x104세포/웰의 밀도로 플레이트하였다. 먼저, 5'-Apo-si-11-TT-iCy3-CGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCA (SEQ ID. No. 3)의 서열을 가진, Cy3-표지 29-mer ssDNA 올리고뉴클레오타이드를 시험하였다. 이러한 접합체의 세포 내 흡수를 Cy3를 가진 동일한 DNA 가닥으로 구성되지만, Apo-Si-11 MNM이 없는 대조군 화합물의 흡수와 비교하였다. 각 접합체를 Opti-Mem (Life technologies-Cat. 31985062, USA)의 100 ㎕/웰에 희석시키고, 상온에서 10분간 배양하고, 최종 100nM의 농도로 세포에 첨가하였다. 세포를 행크의 완충 염 용액 (HBSS 완충액; Biological Industries, 이스라엘)으로 세척 및 분석하여 대조군 대 접합체의 세포에 의한 흡수를 배양 8 시간에서 평가하였다. 수은 램프를 가진 UV 조명이 장착된 올림푸스 형광 현미경 (BX51TF; Olympus Optical, U.K.)을 사용하여 세포를 가시화하였다 (x20 배율). Cy3-형광단은 470-495 nm의 여기 파장 및 590 nm에서 방출을 이용하여 가시화되었고 EGFP 형광단은 530-550 nm의 여기파장, 및 510-550 nm에서의 방출을 이용하여 가시화되었다. 도 5a의 형광현미경 사진에서 보여지는 바와 같이, 29-mer DNA 가닥에 연결된 Apo-si-11을 포함하는 Apo-Si-11은 세포막을 관통하여 상기 3T3-EGFP 세포 내로 효율적으로 전달되는 것을 명백하게 나타냈고 반면, MNM이 없는 대조군 올리고뉴클레오타이드는 유의한 흡수가 관찰되지 않았다.
29-mer ssDNA 올리고뉴클레오타이드를 3T3-EGFP 세포로 전달할 수 있는 Apo-Si MNM의 능력을 또한 ELISA 판독기를 사용하여 정량화하였다 (도 5c). 이러한 목적을 위해, 대수 증식기에 있는 세포를 실험 하루 전에 항생제가 없고 DMEM이 첨가된 보충 성장 배지 (500 ㎕/웰)를 가진 24-웰 플레이트에 4.5x104세포/웰의 밀도로 분배하였다. 각 Cy3-표지 올리고뉴클레오타이드를 Opti-Mem의 100㎕/웰에 희석시키고 및 최종농도40nM 내지 100nM의 범위가 되도록 세포에 첨가하였다. Apo-Si MNM-접합체 대 MNM이 없는 대조군 화합물의 세포 내 축적을 배양 24시간에서 평가하였다. 이를 위해, 세포를 HBSS 완충액으로 세척하고 분석하였다. Tecan Infiniteㄾ 200 PRO 멀티모드 판독기 (여기 파장 548ㅁ4.5 nm 및 방출 580ㅁ10 nm)을 사용하여 Cy3-양성 군의 검출 및 정량화를 수행하였다. Apo-Si MNM 접합체의 흡수를 동일한 농도에서의 대조군 DNA 올리고뉴클레오타이드의 흡수와 비교하였고, 및 결과는 대조군에 대한, 백분율로 나타내었다. 도 5c에서 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 상기 접합체의 세포 내 유의한 흡수가 관찰되었다.
29-mer DNA 올리고뉴클레오타이드에 연결된 Apo-Si MNM의 세포적 흡수를 또한 유세포 분석 (FACS)으로 평가하였다. 전술한 바와 같이, 실험 하루 전에, 항체가 없는 DMEM 완전 배지를 가진 6-웰 플레이트에 대수증식기에 있는 3T3-EGFP 세포를 1.5x105세포/웰의 밀도로 분배하였다. 각Cy3-표지된 올리고뉴클레오타이드를 Opti-Mem의 500 ㎕/웰에 희석시키고, 및 1 nM 내지 40 nM 범위의 최종 농도가 되게 세포에 첨가하였다. 상기 접합체의 전달은 형질감염 후 24-72 시간에서 평가하였다. 배양 기간 후, 세포를 트립신 처리하고, 행크 완충염 용액 (HBSS buffer; Biological Industries, 이스라엘)으로 보충하고, 및 5 분간 1100 rpm에서 원심분리하였다. 다음, 세포를 행크 완충염 용액에 재현탁시키고, 및 Cell Diva 소프트웨어를 이용하는 FACSAria III 세포 분류기 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아 산호세)를 사용하여 분석하였다. 각 샘플에 대하여, 총 104건이 수집되었다. 동일한 서열을 가지지만 MNM이 없는 대조군 올리고뉴클레오타이드와 배양된 세포에 비하여, Apo-Si-11 접합체와 배양된 세포에서의 형광 강도를 측정함으로써 Cy3-양성 세포 군을 검출하고 정량화하였다.
Apo-Si MNM이 29-mer ssDNA 올리고뉴클레오타이드를 3T3-EGFP 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있다는 것을 FACS 분석으로 확인하였다. 도 5b는 점선 도표 분석을 제공하는 것으로서, Apo-Si-11 접합체와 배양된 세포 군에서, 실제적으로 모든 세포가 상기 접합체의 흡수를 명시적으로 나타내나 대조군은 그러한 흡수가 일어나지 않는다는 것을 나타내고 있다.
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 (dsDNA)을 세포막을 관통하여 전달하는 Apo-Si-11의 능력을 평가하였다. 이를 위해, cy3 형광단으로 표지된 29 bp dsDNA 올리고뉴클레오타이드의 각 5' 말단에 하나씩 두 개 Apo-Si-11 MNM을 부착하였고, 어닐하여 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 생성하였다. 상기 dsDNA의 서열은 전술한 바와 같다: 5'-Apo-si-11-TT-iCy3-CGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCA (서열번호 3); 및 5'-Apo-si-11-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGAA (서열번호 4).
실시예 3에서 예시된 바와 같이, MNM을 상기 올리고뉴클레오타이드에 부착하였다. 3T3-EGFP 세포를 상기 접합체 40nM로 처리하고, 배약 24 시간에서 형광현미경으로 세포성 흡수를 평가하고, 및 동일한 서열이지만, MNM가 없는 대조군 올리고뉴클레오타이드와 배양한 세포에 의한 흡수와 비교하였다. 도 5d에서 설명된 바와 같이, 두 개 Apo-Si-11 MNM들은 58-mer dsDNA 올리고뉴클레오타이드를 상기 3T3- EGFP 세포내로 효율적으로 전달할 수 있었다.
이러한 전달은 FACS로 또한 증명되었다. 이를 위해, 3T3-EGFP 세포를 6-웰 플레이트에 배분하고, 및 도 5c에서 설명된 바와 같이 처리하였다. 각 Cy3-표지 올리고뉴클레오타이드 (MNM들을 가지는 것과 가지지 않는 것)를 Opti-Mem의 500 ㎕/웰에 희석시키고, 세포에 40nM, 10nM 및 1nM의 최종 농도로 첨가하였다. 24 시간 배양한 후, 상기 올리고뉴클레오타이드의 전달을 FACS-Aria III 세포 분류기 (BD Biosciences, 캘리포니아 산호세)로 평가하고 및 Cell Diva 소프트웨어로 분석하였다. 각 샘플에 대하여 총104사건을 수집하였다. MNM이 없는 대조군 올리고뉴클레오타이드에 노출된 세포에 비하여, Apo-Si-11 MNM접합체와 배양된 세포에서의 형광 강도를 측정함으로써 Cy3-양성 세포 군을 검출하고 정량화하였다. 도 5e 및 도 5f에 나타난 바와 같이, 두 개의 Apo-Si MNM들이 58-mer dsDNA 올리고뉴클레오타이드를 3T3-EGFP 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있다는 것을 FACS 분석으로 확인하였다: 도 5e (좌측 및 우측)는 점 도표 분석을 나타낸 것으로서, 상기 Apo-Si-11 접합체와 배양된 세포만이 세포 내로의 DNA 흡수를 명백하게 보이면서, 실제적으로 모든 세포에서 상기 접합체가 축적되어 있는 것을 나타내고 있다; 도 5f. 막대그래프 기하평균 분석, Apo-Si MNM-접합체-처리 세포에서 뚜렷한 신호를 나타내고, 반대로 Apo-Si-11이 없는 대조군 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서는 낮은 배경 신호가 나타난다. 명백한 용량 응답이 조사된 농도에서 (40nM, 10nM, 및 1nM) 관찰되었다.
공초점 현미경을 사용하여 두 개 Apo-Si-11 MNM들에 부착된 접합체의 흡수를 또한 확인하였다. 세포를 전술한 바와 같이 준비하였다. 획스트 33258 염료로 핵 염색 (Sigma Aldrich, USA, 1:1000로 HBSS에 1 시간)하였다. 도 5g에서 나타난 바와 같이, 상기 Apo-Si 접합체는 세포막을 통한 효율적인 흡수 및 세포 내 축적을 명확히 나타내고 있다.
실시예 5b: 쥐 B16 흑색종 세포:
본 일련의 실험들의 목적은 두 개 Apo-Si-11 MNM들 (각각 가닥의 5'-말단에 부착)을 포함하는 접합체가 배양된 B16 쥐-피부 흑색종 세포 내로 흡수되는 능력을 결정하는 것이다. 이러한 목적을 위해, B16 세포들을 실시예 5A에서 설명된 바와 같이 배양하고 유지하였다. 상세히는, 5% CO2를 함유하는 습윤 배양기 내에서, 세포를10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% Pen-Strep으로 보충된 DMEM (Sigma Aldrich, USA)에서 37ㅀC로 배양하였다. 형질감염 하루 전에, 2x104B16세포를 표준 24-웰 플레이트 챔버에 플레이트 하였다. 두 개 Apo-si-11 MNM에 접합된 40nM Cy3-표지 58-mer 이중 가닥 DNA를 완전 성장 배지에서 세포에 24 시간처리하였다. Apo-Si MNM이 없는 동일한 Cy-3-표지 올리고뉴클레오타이드를 대조군으로 사용하고 동일한 시간으로 세포에 처리하였다. 각 웰을 HBSS로 두 번 세척하고 형광을 정량화하였다. 현미경 이미지를 전술한 바와 같이, Olympus BX51 현미경으로 찍었다.
B16 세포를 또한 FACS 분석하였다. 이를 위해, 형질감염 하루 전에, 16 x104B16세포를 표준 6-웰 플레이트에 심었다. 두 개 Apo-si-11 MNM에 접합된 10nM 및 40nM Cy3-표지 58-mer dsDNA를 완전 성장 배지에서 24 시간 처리하였다. MNM이 없는 Cy3-표지 58-mer DNA를 대조군으로 사용하였다. 세포를 HBSS로 세척하고, 및 전술한 바와 같이 BD FACSAria™ III를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
또한, 공초점 현미경을 사용하여, 두 개 MNM을 포함하는 Apo-Si MNM 접합체의 흡수 및 세포내 집중화를 또한 확인하였다. 세포를 전술한 바와 같이 준비하였다. 획스트 33258 염료로 핵 염색 (Sigma Aldrich, USA, 1:1000로 HBSS에 약 1 시간)하였다.
58-mer 이중 가닥 DNA를 포함하는 Apo-Si-11 접합체로 처리된 세포에서는 뚜렷한 흡수가 검출되었지만, MNM없는 동일한Cy3-표지 올리고뉴클레오타이드에 노출된 세포에서는 검출되지 않았다. 이것은 형광 현미경술 (도 6a)은 물론 FACS 분석 (도 6b)에서도 명백히 나타났다. 40nM에서, 상기 Apo-Si MNM 접합체는 세포의 98 %에 흡수되었다. 40nM 대 10nM에서의 신호 강도를 비교하면, 명백한 용량-응답이 관측된다. 공초점 현미경술 (도 6c)은 Apo-Si 접합체가 세포막을 통하여 세포 내로 효율적으로 흡수되는 것을 또한 나타낸다.
따라서, Apo-Si MNM(들)은 58-mer ds-DNA 올리고뉴클레오타이드을 B16 흑색종 세포 내로 용량 의존적 방식으로 효율적으로 전달할 수 있다.
실시예 5c: C26 쥐 결장 선암 세포.
심하게 하전된 58-mer dsDNA를 C26 결장선암 세포로 전달할 수 있는 Apo-Si MNM의 능력을 증명하기 위해, 세포를 전술한 바와 같이 배양하고 유지시켰다. 상세하게, 5% CO2를 함유하는 습윤 배양기 내에서, 세포를10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% Pen-Strep으로 보충된 DMEM (Sigma Aldrich, USA)에서 37ㅀC로 배양하였다.
세포를 FACS 분석하였다. 이를 위해, 형질감염 하루 전에, 16 x 104C26세포를 표준 6-웰 플레이트에 심었다. 각각 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에서 두 개 Apo-Si-11 MNM에 접합되고, 및 Cy3 형광단과 연결된 40nM 58-mer 이중 가닥 DNA를 완전 성장 배지에서 24 시간 처리하였다. Apo-Si MNMs이 없는 동일한 작제물을 대조군으로 사용하였다. 세포를 HBSS으로 세척하고, 및 전술한 바와 같이, BD FACSAria™ III를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 뚜렷한 Cy3 형광이 Apo-Si-11 접합체로 처리한 세포의 98 %에서 검출되었다. 그러한 흡수가 대조군 올리고뉴클레오타이드에 노출된 세포에서는 검출되지 않았다. 그러므로, 상기 Apo-Si-11 MNM들은 올리고뉴클레오타이드의 효율적인 막통과 전달을 가능하게 하였다.
실시예 5d: 인간 HeLa 세포주
본 목적은 심하게 하전된 58-mer dsDNA를 HeLa 인간 경부 상피암 세포주로 전달할 수 있는 Apo-Si-11 MNM의 능력을 증명하는 것이다. 이를 위해, 전술한 바와 같이 세포를 배양하고 유지하였다. 상세하게는, 5% CO2를 함유하는 습윤 배양기 내에서, 세포를10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% Pen-Strep으로 보충된 DMEM (Sigma Aldrich, USA)에서 37ㅀC로 배양하였다.
FACS 분석을 위해, 형질감염 하루 전에, 16 x 104HeLa세포를 표준 6-웰 플레이트에 심었다. 두 개 Apo-Si-11 MNM에 접합된 40nM Cy3-표지, 58-mer 이중 가닥 DNA을 완전 성장 배지에서 24시간 처리하였다. Cy3-표지 58-mer DNA을 대조군으로 사용하였다. 세포를 HBSS로 세척하고, 및 전술한 바와 같이, BD FACSAria™ III 시스템을 사용하여 형광 강도를 분석하였다. 두 개 Apo-Si MNM에 접합된58-mer 이중 가닥 DNA으로 처리된 세포는 배양된 거의 모든 세포에서 뚜렷한 흡수를 나타냈다 (도 8). 반대로, 그러한 흡수는 대조군 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서는 관측되지 않았다. 그러므로, 결론적으로, 58개의 음전하를 가지며 두 개 Apo-Si-11 MNM에 접합된 Cy3-표지, 58-mer 이중 가닥 DNA는 시험관 내에서 인간 HeLa 세포주로 효율적으로 전달됨이 분명하였다.
종합하면, 실시예 5에서 나타나고 및 4 개 구별되는 세포 유형: 3T3 쥐 섬유아세포 세포, 쥐 흑색종 B16 세포, 쥐 C26 결장암 세포, 및 인간 HeLa 자궁경부암 세포으로부터 얻은 결과들은 하나 또는 두 개 Apo-Si-11 MNM에 연결된 심하게 하전된 거대분자류를 효율적으로 막통과 전달 및 흡수한다는 것을 증명하고 있다. 그러한 흡수는 MNM이 없는 대조군 올리고뉴클레오타이드에서는 관측되지 않았다. 이러한 데이터는 올리고뉴클레오타이드들을 막관통 전달할 수 있도록 하는 본 발명의 MNM의 성능이 보편적이며, 특정 세포 유형에 한정되지 않는다는 것을 지지한다.
실시예 6: Dicer 기질을 포함하는 성능 향상 분체 (PEM)의 증명
본 발명의 구체예에서, 유전자 사일런싱을 위해RISC (RNA Inducible Silencing Complex)와 상호작용하기에 적합한 19-21 염기쌍의 크기에서 절단함으로써, 이중 가닥 RNA을 처리할 수 있는 엔도뉴클레아제인, 효소 Dicer의 작용에 기반하여, 효율적인 유전자 사일런싱을 위해 MNM을 제거하는 방법이 개시된다. 상기 방법은: (i). 올리고뉴클레오타이드가 Dicer 기질로서, 사일런싱될 원하는 타겟 유전자에 따라서 선택된 서열을 지니며 25 내지 30-뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 RNA로 구성되며; 및 본 발명의1-2 MNM에 접합되어 있고, 센스 (패신저) 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단에, 및/또는 안티센스 (가이드) 가닥의 5'-말단에서 부착되어 있는, 본 발명의 접합체의 투여; (ii). 상기 MNM에 의해 가능하게 되는 siRNA의 막관통 전달; (iii). 상기 Dicer 효소에 의한 dsRNA의 절단에 의한 상기 듀플렉스로부터 하나의 MNM의 제거; (iv). 후속적으로 이중나선체의 생리적 분리 (예, 아르고노트/헬리카제 효소에 의해)로 온전한 안티센스 가닥의 방출을 이끌게 되어, RISC와 상호작용하여 특정 타겟 유전자를 사일런스 시키는 것을 포함한다 (도 3).
시험관 내에서 이러한 기전을 증명하기 위해, 각 가닥이 식 (VIIIb)에 따른 하나의 Apo-Si-W MNM에 5'-말단에서 접합된25 내지 27-뉴클레오타이드 siRNA 듀플렉스 (100 pmol); 및 MNM이 없는 동일한 대조군 dsRNA를 재조합 인간 Dicer (Stratagene) 1 유닛을 함유한 20 ml의 20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2에서 24 시간 처리하였다. 다음, 각 반응물(15 pmol RNA)의 3-ml 분할물(aliquot)을 15% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, GelStar (Ambrex)로 염색하고 및 UV 여기를 사용하여 가시화하였다. 도 16에서 나타난 바와 같이, 두 개 MNM들을 포함하는 접합체는 Dicer에 의해 효율적으로 절단되었고, 상기 MNM 들 중 하나가 제거됨에 따라 더 짧은 ds-RNA 분획체들이 생성되었다. 중요한 것은, 상기 부착된 MNM들은, Apo-Si-W 변형이 없이 25-27 dsRNA절단하는 것에 비하여, Dicer-매개 절단의 효능에 대하여 임의의 유의한 간섭을 야기하지 않았다는 것이다. 도 16에서: 레인#1: 21-뉴클레오타이드 dsRNA RISC에 대하여 적합한 크기; 레인#2: Apo-Si-W NMN을 가지는 접합체의 DICER에 의한 절단, 그 결과 하나의 MNM이 제거. 두 번째 MNM은 여전히 부착되어 있고, 따라서, 겔에서 약간 느린 접합체 이동이 나타남; 레인#3: DICER 효소의 기질로서, 일부 뉴클레오타이드 상에서 메틸화된 25-27 dsiRNA; 레인#4: 두 개 Apo-Si-W MNM들을 보유하는 dsiRNA 접합체. 레인#5: DICER가 없는 25-27 dsiRNA.
분리된 효소 시스템에서의 이러한 연구는 시험관 내 생세포 시스템에서 Apo-Si-W을 포함하는 siRNA의 접합체에 의해 발휘되는 상기 EFGP 유전자의 효능적 사일런싱의 관측으로 또한 지지되었다 (실시예 7a, 7b).
실시예 7a: 시험관 내 Apo-Si-W 접합체에 의한 EGFP 유전자의 HeLa 세포 사일런싱
이러한 증명에 사용되는 생물학적 시스템은 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자를 안정적으로 발현시키는 인간 HeLa 세포였다 (NIH-HeLa EGFP 세포(. 본 발명의 투여된 접합체는 EGFP 유전자의 발현을 사일런스하도록 설계된 siRNA를 포함하였다. 보통, 형질감염 시약을 사용하지 않는 한, 그러한 RNA 작제물은 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어가서 유전자-사일런싱 활성을 발휘할 수 없다. 이러한 siRNA의 본 발명의 MNM들에의 접합으로 인하여 [비제한적 예로, 식 (VIIIb)에 설정된 구조를 가지는 E 분체 (Apo-Si-W로 지정되는 것으로, 상기식에서 a=2, 및 L3은 없는 것이다)], 유전자 사일런싱 활성이 형질 감염 시약의 필요없이 관측되었다.
Figure pct00075
식 (VIIIb); a=2 및 L3=없음; Apo-Si-W로 지정
이를 위해, EGFP 단백질 (IDT, 미국 아이오아)의 사일런싱을 위해 고안되고 식 (VIIIb)에 따른 두 개 MNM들에 연결된 siRNA를 포함하는 본 발명의 접합체로 세포를 처리하였다. 이중 가닥 RNA의 서열은 다음과 같다: 센스 서열 5'에서 3'방향: ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCG (서열번호 5); 안티센스 서열 5'에서 3'방향: CGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCA (서열번호 6). 상기 MNM 분체 연결된 해당 이중 가닥 DNA 서열은 대조군으로 작용하며 이는 그러한 DNA 작제물이 유전자-사일런싱 활성을 발휘할 수 없기 때문이다. 특히, 상기 실험 하루 전에, 대수증식기의 NIH-HeLa EGFP 세포를 DMEM 및 보충 성장 배지 (500 ㎕/웰)를 가지며 항생제가 없는 24-웰 플레이트에서 4.5 x 104세포/웰의 밀도로 플레이트 하였다. 상기 siRNA-Apo-Si-MNM 접합체를 Opti-Mem (Life technologies)의 100 ㎕/웰에 희석시키고, 및 40nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다.
Figure pct00076
식 (VIIIb); 상기식에서 a=2 및 L3은 없음;
Apo-Si-W로 지정
배양 72시간에서, 유전자 사일런싱을 평가하였다. 그 시점에서, 세포를 행크 완충염 용액 (HBSS 완충액; Biological Industries, 이스라엘)로 세척하고 및 분석하였다. Tecan Infiniteㄾ200PROMultimodeReader(여기 파장 488ㅁ4.5 nm 및 방출 535ㅁ10 nm)을 사용하는 ELISA 판독기로 EGFP-관련 형광 신호를 검출하고 정량화하였다. 도 9a에 나타난 바와 같이, Apo-Si-W MNMs에 연결된 siRNA의 접합체에 의해 효과적이고 뚜렷한 유전자 사일런싱이 관측되었다. 유전자 사일런싱은 용량 의존적 방식으로 일어났는데, 상기 접합체의 40nM에서 평균 사일런싱이 22% 였고, 300nM 및 600nM의 접합체 농도에서, 각각 51% 및 68%로 증가하였다 (p<0.001).
실시예 7b: 시험관 내 3T3-EGFP 세포에서 Apo-Si-W에 의한 EGFP 유전자의 사일런싱
방법: Apo-Si-W가 효율적으로 전달되고 및 EGFP 유전자의 발현을 사일런스하게하는 능력을 평가하기 위해, 두 개 Apo-Si-W MNM들을 해당 siRNA에 접합하였다 (각 가닥의 5'-말단에서), 및 상기 접합체를 3T3-EGFP 세포에 처리하였다. 세포를 무항생제 완전 배지가 있는 24-웰 플레이트에 심었다 (25,000 세포/웰). 세포를 처음 24시간은 무혈청 배지를 사용한 것을 제외하고는 이러한 조건에서 72 시간 Apo-Si-W-dsi-RNA로 처리하였다. 형질감염 72 시간 후, 배지를 흡입제거하고, 세포를 용해 완충액 [50 mM 트리스 (pH 8), 0.75% 트리톤 X-100, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤 및 완전 프로테이제 저해체 (Roche)])에서 용해하였다. 다음, EGFP 형광 강도를 Infinite M200 Pro Multimode Reader (Tecan)를 사용하여 정량화하였다; 여기 파장은 488nm, 및 방출 파장은 535nm였다. Apo-Si-W MNM들에 접합되지 않은 동일한 siRNA들에 노출된 세포를 대조군으로 사용하였다.
결과: 도 9b에 나타난 바와 같이, 상기 Apo-Si-W-siRNA 접합체들은 유전자 발현에서 뚜렷한 용량 의존적 감소를 나타냈고, 접합체의 600nM에서 65 %의 저해가 관측되었다 (p<0.001).
결론: 상기 Apo-Si-W 접합체는 EGFP-siRNA의 세포질로의 전달을 매개하는 데 및 시험관 내 EGFP-3T3 세포에서의 해당 유전자를 사일런싱하는 데 효과적이다.
실시예 7c: Apo-Si-S-S MNM(식 IXb) 을 포함하는 접합체에 의한 시험관 내 HeLa 세포에서의 EGFP 유전자의 유전자 사일런싱
상기 접합체는 식 (IXb)에 따른 두 개 Apo-Si-S-S MNM들을 포함하였다.
Figure pct00077
식 (IXb): a=3, b=0 및 k=1인 경우; Apo-Si-S-S로 지정:
그러므로 상기 접합체는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00078
방법: 본 발명의 접합체가 EGFP 유전자를 사일런스하게 하는 능력을 평가하기 위해, HeLa-GFP 세포를 형광 기반 분석용으로 설계된 24 웰 플레이트에 심고 (40,000 세포/웰) 및 siRNA를 포함하는 접합체로 처리하여 다음 서열의 EGFP 유전자를 사일런스하였다:
안티센스 서열: 5'-Apo-Si-S-S-CGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCA-3'(서열번호 7); 센스 서열: 5'-Apo-Si-S-S-ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCG-3'(서열번호 8).
다음 날, 세포를 행크 균형 염 용액 (HBSS)으로 세척하고, 및 배지를 무혈청-Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)으로 24 시간 교환한 후, 완전 배지에서 48 시간 배양하였다. 형질 감염 72 시간 후, 배지를 흡입 제거하고, 및 세포를 HBSS로 세척하였다. EGFP 형광 강도를 Infinite M200 Pro Multimode Reader (Tecan)를 사용하여 정량화하였다, 여기 파장 488nm; 방출 파장 535nm.
결과: Apo-Si-S-S MNM 접합체들에 의한 EGFP 유전자의 사일런싱이 도 9c에 제시되어 있다. 도시된 바와 같이, 상기 EGFP 유전자의 효율적이고 용량 의존적 사일런싱이 관찰되었다. 미처리된 대조군 세포 대비, 평균, 62% 유전자 사일런싱이 두 개 Apo-S-S MNM들을 포함하는 siRNA 접합체의 10nM에서 관찰되었고. 사일런싱은 상기 접합체의 농도가 40nM로 증가시80%로 증가하였다, p<0.001(도 9c).
결론: 두 개 Apo-Si-S-S MNM들에 연결된 siRNA를 포함하는 접합체는 HeLa 세포에서 리포터 유전자 EGFP의 강고한 사일런싱을 명확히 보여주었다.
실시예 7d:EGFP유전자를 발현하는 시험관 내 3T3 세포에서의 식 (IXb)에 따른 Apo-Si-S-S을 포함하는 본 발명의 접합체에 의한 유전자 사일런싱:
방법: 하기와 같이 변형하면서, 실시예 7c에 설명한 바와 같이, 실험을 수행하였다: EGFP 단백질을 발현하는 NIH-3T3 마우스 섬유아세포 세포주를 5% CO2를 함유하는 습윤 배양기 내에서, 세포를10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% Pen-Strep으로 보충된 DMEM (Sigma Aldrich, USA)에서 37ㅀC로 증식시키고 유지하였다. 다음, 세포를 72시간 상기 접합체의 40nM, 150 nM 및 300nM의 농도로 처리하였다. 후속적으로, EGFP 단백질 형광 강도를 ELISA 판독기를 사용하여 정량화하였다. 병행하여, 임의의 처리에 노출되지 않은 (미처리) 세포를 대조군으로 사용하였다.
결과: Apo-Si-S-S 접합체로 처리된 세포에서, 유전자 발현의 극적인 사일런싱이 관찰되었다. 관찰된 EGFP 유전자 사일런싱의 정도는 접합체의40nM, 150nM 및 300nM로 처리된 세포에서, 각각 90.0%, 91.5%, 및 92.0% (+0.1%)이었다.
결론: 본 실시예 따라서 상기 "분자적 나노모터(들) (MNMs)"이: (i). 달리 막을 통과할 수 없는 siRNA의 막관통 전달. (ii). E-RNA-E' 접합체의 세포질로의 길잡이, 및; (iii). 본 발명의 접합체를 포함하는 유전자-사일런싱 단백질 복합체의 바람직한 성능의 발휘를 가능하게 하는 것을 증명한다. 특히, 이러한 접합체는 절단가능한 기 (디설파이드 분체)에 연결된 MNM를 포함하며, 따라서, 본 발명의 접합체 내에 내포된 절단가능한 기의 성능을 증명하고 있다.
실시예 7e: Apo-Si-G MNM들을 포함하는 접합체에 의한 EGFP 리포터 유전자의 시험관 내 사일런싱
Figure pct00079
식 (IXc); a=1, k=1, L3=없는 경우; 상기 분체는 Apo-Si-G로 지정
방법: 3T3-GFP 세포에서 EGFP 유전자를 녹다운시킬 수 있는 Apo-Si-G MNM 접합체의 능력을 평가하기 위해, 세포를 형광 기반 분석용으로 설계된 24 웰 플레이트에 심고 (40,000 세포/웰) 및 Apo-Si-S-S을 포함하는 접합체로 처리하였다. 다음 날, 세포를 행크 균형 염 용액 (HBSS)으로 세척하고, 및 배지를 무혈청-Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)으로 24 시간 교환한 후, 완전 배지에서 48 시간 배양하였다. 형질 감염 72 시간 후, 배지를 흡입 제거하고, 및 세포를 HBSS로 세척하였다. EGFP 형광 강도를 Infinite M200 Pro Multimode Reader (Tecan)를 사용하여 정량화하였다, 여기 파장 488nm; 방출 파장 535nm.
결과: Apo-Si-G MNM 접합체들에 의한 EGFP 유전자의 사일런싱이 도 9d에 제시되어 있다. 도시된 바와 같이, Apo-Si-G를 포함하는 접합체는 10nM의 접합체 농도에서 평균 66% 사일런싱을 명확히 나타냈고, 40nM에서 84% 사일런싱으로 상승하였다 (p<0.001).
결론: 두 개 Apo-Si-G MNM들에 연결된 siRNA를 포함하는 접합체는 HeLa 세포에서 리포터 유전자 EGFP의 효율적인 사일런싱을 명확히 보여주었다. 유사한 결과가 또한 3T3-EGFP 및 293T-EGFP 세포주에서 관찰되었다.
종합하면, 실시예 7은 구별되는 구조를 가지지만 모두 식 (I) 및 식 (VII)에 따른 중심 구조 모티프를 공유하며 및 모두 siRNA를 세포내로 매우 효율적으로 전달하고 해당 유전자의 사일런싱을 명확히 보여주는 여러 개 의 구별되는 본 발명의 접합체를 제시한다.
실시예 8: E가 식 (VIIa)에 따르는 구조를 가지는 본 발명의 접합체의 세포막 관통 전달:
Figure pct00080
식 (VIIa): 상기식에서 a=2 및 k=1인 경우, Apo-Si-C4로 지정
3T3 세포 및 C26 세포를 상기 실시예 5에서 설명한 바와 같이 증식시키고 준비하였다. Cy3 형광단에 연결되고 및 두 개 Apo-Si-C4 분체와 연결된 58-mer 이중 가닥 (ds)DNA를 포함하는 접합체로 1, 2, 및 24 시간 세포를 처리하였다. 상기 접합체의 두 농도에서 시험하였다: 40nM 및 100nM. 실시예 5에서 설명된 바와 같이, 형광 현미경술 및 ELISA 판독기에 의한 신호 정량화로 분석하였다. E 분체에 연결되지 않은 동일한 58-mer dsDNA를 대조군으로 사용하였다.
세포 내에서의 상기 접합체의 형광 검출은 한 시간 후에 이미 가능하였다. 원하는 바, 세포질에서 신호를 얻었다. 신호 강도는 2 시간에서 크게 증가되었고, 24시간 처리시 추가로 증강되었다. 흡수는 ELISA 판독기로 매우 명확히 측정되었다: 상기 접합체 대 MNM이 없는 해당 대조군 dsDNA의 신호 강도의 비율은 40nM 및 100nM의 농도에서, C26 세포의 경우: 각각 80- 및 72-배 였고, 3T3의 경우, 104-, 및 101-배였다. 그러므로, 양 쪽 세포 유형의 경우, 본 발명의 접합체는 고도로 하전된 58-mer ds-DNA을, MNM 분체가 없는 대조군에 비하여, 매우 효율적으로 전달할 수 있었다.
실시예 9a: E, E' 또는 E'' 이 환형 디설파이드 분체 및 아미드 분체를 포함하는 본 발명의 접합체의 산화환원-민감성 절단의 기전:
Figure pct00081
상기 기전은 비제한적 방식으로 제시된다. 상기 접합체는 6-원 고리내의 디설파이드 분체를 가진다. 세포외 공간에 만연한 산화적 조건으로 인하여, 이러한 고리는 혈액 및 세포외 공간에서의 안정성을 명확히 보여준다. 반면, 세포 내에서는, 상기 접합체는 세포질 내의 높은 글루타치온 수준에 의해 제공되는 환원적 주위 조건에 처하게 된다. 결론적으로, 디설파이드 결합이 절단되고, 자유 티올기를 결과하게 된다. 다른 환형 디설파이드 분자와의 유사한 것에 기반하여, 상기 자유 티올기의 pKa 값은 약 8 및 9이다. 약 7인, 생리적 세포내 pH를 고려하면, 상기 디설파이드 결합의 절단시 생성되는 티오기의 대부분은 임의의 시간에서 자유 티올기 (-SH)이고, 및 더 친핵성으로 생각되는 해당 티올레이트 (-S-)로서 존재하지 않는다. 전략적으로, 그 아미드 카르보닐 기는 상기 티올기로부터 5 및 6 개 원자 떨어져 있다. 시스테인 프로테아제의 단백질 분해의 촉매에서의 작용이 비슷하기 때문에, 아미드 기의 카르보닐 탄소 원자에 대한 친핵성 공격이 일어나게 되고, 이는 에스트라디올 분체의 절단으로 이어진다. 이러한 작용은 따라서 세포질에서 화물 약물 (D)을 선택적으로 풀어주게 된다. D가, 예를 들어, siRNA인 경우, 이것은 고도로 음하전된 올리고뉴클레오타이드 를 세포질 내에 포획되도록하고, 즉시 RNA-유도성 사일런싱 복합체 (RISC)와 그 자리에서 상호작용하여 유전자 사일런싱 활성을 발휘하게 된다.
이러한 기전이 도 10에 설명되어 있고, 여기서A.는 세포외 공간에서의 온전한 접합체를 나타내고; B.는 환원적 세포질 환경에서의 디설파이드 결합의 절단을 나타내고; C.는 pKa 의존적 방식으로 티올이 탈양성자화되어 티올레이트를 제공하는 것을 나타내고; D.는 아미드 기의 카르보닐 분체 상에 대하여 티올레이트의 친핵성 공격을 나타내고; E.는 사면체형 중간체의 발생을 나타내고; F.는 티오에스테르가 발생됨에 따라, 상기 접합체가 결국 절단되는 것을 나타내고; G.는 후속적 가수분해를 나타내고; 및 H.는 본체로부터 MNM이 분비되는 동안, 세포외 공간에서의 산화적 환경에서 만날 수 있는 디설파이드 기의 형성에 따른 폐환을 나타낸다.
실시예 9b: E가 식 (Xc)에 따른 구조를 가지는 본 발명의 접합체의 산화환원-민감성 절단의 기전, 및 화물 약물 (D)을 세포질로 과녁화하기 위한 이의 이용:
Figure pct00082
식 (Xc)
아미드 결합을 포함하는 식 (IX)에 따른 화합물의 절단에 대하여 상기 설명된 동일한 기전이 또한 카르바메이트 기를 포함하는 식 (Xc)에 따른 화합물의 절단에 또한 적용된다. 도 11에 설명된 바와 같이: A.는 세포외 공간에서의 온전한 접합체를 나타내고; B.는 환원적 세포질 환경에서의 디설파이드 결합의 절단을 나타내고; C.는 pKa 의존적 방식으로 티올이 티올레이트로 탈양성자화되는 것을 나타내고; D.는 아미드 기의 카르보닐 분체 상에 대하여 티올레이트의 친핵성 공격을 나타내고; E.는 사면체형 중간체의 발생을 나타내고; F.는 티오에스테르가 발생됨에 따라, 상기 접합체가 결국 절단되는 것을 나타내고; G.는 후속적 가수분해와 함께 CO2 방출을 나타내고; 및 H.는 본체로부터 MNM이 분비되는 동안, 세포외 공간에서의 산화적 환경에서 만날 수 있는 디설파이드 기의 형성에 따른 폐환을 나타낸다.
실시예 10: 식 (XIa)에 따른 구조식의 안정성:
본 발명의 접합체의 합성은 합성된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기를 화학 기로 보호하는 것을 통상 포함한다. 예를 들어, 아데닌은 벤조일 보호기로 보호되고, 구아닌은 이소부티릴에 의해, 및 시토신은 아세틸에 의해 보호된다. 이러한 보호기들은 기능적 올리고뉴클레오타이드를 수득하기 위해 합성의 끝에서 제거된다. 이러한 제거는 통상 강염기 조건에서 수행된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드들의 합성 중에 상기 보호기들을 제거하기 위한 IDT (미국 아이오와)의 표준 프로토콜에 따르면, 65℃에서 2 시간 동안 수산화 암모늄으로 처리하는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물이 그러한 가혹한 조건에서 탈보호를 유지할 수 있는지를 평가하기 위해, 하기 구조를 가지는 모델 화합물 A에 기반하여 모델 시스템을 만들었다:
Figure pct00083
분자량: 339.51
모델 화합물 A
상기 화합물 2 그람을 탈보호에 사용되는 상기 표준 조건에서 처리하였다. 15분, 1시간 및 2 시간 처리 후 샘플을 꺼내고, 및 새로운 피크의 형성을 조사하고 분석하는 HPLC/MS로 평가하였다. 중요한 것은, 상기 프로토콜의 조건 하에서 화합물 A의 분해 신호가 없다는 것이다. 그러므로, 본 발명의 화합물의 유사체들도 이러한 비교적 가혹한 염기 조건에서 안정성이 있다는 것이 명백하다. 이러한 관찰이 본 발명의 접합체의 합성 중에 올리고뉴클레오타이드의 탈보호와 연관되는 것에 더하여, 이러한 관찰된 높은 안정성은 이러한 접합체들이 저장하는 동안 안정하다는 것을 또한제시한다.
실시예 11: EGFP 유전자를 발현하는 형질전환 마우스의 간세포의 일차 배양물에서 발휘된, a=2, 및 k=1 인 식 (VIIa) (Apo-Si-C4으로 지정)에 따른 본 발명의 접합체에 의한 유전자 사일런싱:
실시예 7에서 특정된 바와 같이, 이중 가닥 RNA 서열을 Apo-Si-C4로 지정된, a=2, 및 k=1인 식 (VIIa)에 따른 두 개 MNM에 부착하였다. 다음, 상기 접합체 (40 nM)를 히스톤 2A 단백질 (히스톤 H2A, Molecular Weight 14kDa; New England Biolabs, Inc.)으로 30 분간 (2:1 히스톤/RNA 비율) 처리하여 RNA+MNM+단백질 복합체를 생성하였다. 다음, 상기 복합체를 EGFP 유전자를 발현하는 형질전환 마우스의 간세포 일차 배양물의 세포에 처리하였다. 72 시간 후, 실시예 7에서 설명된 바와 같이, ELISA 판독기를 사용하여 EGFP 신호의 형광을 정량화하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, 동일한 RNA 서열 + H2A를 포함하지만, 본 발명의 MNM들이 없는 대조군 복합체로 처히한 세포의 형광 신호에 비하여, 76 %의 EGFP 신호의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. 이러한 결과들은 거대분자 구조의 막통과 전달을 가능하게 하는 데 있어서 본 발명의 MNM의 확고한 능력을 증명하고 있다: dsRNA+ H2A+두 개 Apo-Si MNM들의 복합체는
Figure pct00084
30 kDa의 분자량을 가지며, 및 이것은 많은 전기적 전하를 지니고 있다. 이러한 결과로부터 분명하게 나타나는 바와 같이, 이러한 복합체는 세포막을 효과적을 건널 수 있고 및 또한 유전자 사일런싱에서 유익한 생물학적 성능을 발휘할 수 있었다. MNM들이 없는 대조군 복합체의 성능에 비교하여, 상기 관찰된 결과들은 전적으로 본 발명의 MNM에 기인한 것일 수 있다.
실시예 12: E, E' 또는 E''이 하기 식에 따른 구조를 가지는 본 발명의 접합체의 산화환원-민감성 절단의 기전, 및 화물 약물 (D)을 세포질로 과녁하게하는 이의 이용:
Figure pct00085
식 (VII); Apo-Si-X-1
도 13에서 설명된 바와 같은 식 (VII)에 따른 예시된 화합물; Apo-Si-X-1: A.는 세포외 공간에서의 온전한 접합체를 나타내고; B.는 환원적 세포질 환경에서의 디설파이드 결합의 절단을 나타내고; C.는 pKa 의존적 방식으로 티올이 티올레이트로 탈양성자화되는 것을 나타내고; D.는 아미드 기의 카르보닐 분체 상에 대하여 티올레이트의 친핵성 공격을 나타내고; E.는 사면체형 중간체의 발생을 나타내고; F.는 티오에스테르가 발생됨에 따라, 상기 접합체가 결국 절단되는 것을 나타내고; G.는 후속적 가수분해와 함께 CO2 방출을 나타내고; 및 H.는 본체로부터 MNM이 분비되는 동안, 세포외 공간에서의 산화적 환경에서 만날 수 있는 디설파이드 기의 형성에 따른 폐환을 나타낸다.
실시예 13: 본 발명의 E 분체와 인지질 막의 상호작용을 증명하는 분자적 역동성 시뮬레이션 (MD) 연구.
이러한 증명을 위해, 세 개 화합물들을 선택하였고 이들의 구조은 하기와 같다: a. Apo-Si-X-1로 지정되는 식 (VII)에 따른 화합물; b. Apo-Si-X-2로 지정되는 식 (VII)에 따른 화합물; c. Apo-Si-S-S로 지정되는 식 (IXb)에 따른 화합물.
Figure pct00086
방법: 128개 POPC 지질 및 20Å TIP3P 수층으로 구성된 예비 평형화된 (3030K에서 400 nsec) POPC (1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세포-3-포프포콜린) 이중막은 Stockholm Lipids 웹사이트 (http://mmkluster.fos.su.se/slipids/Downloads.html)로부터 내려 받았다. AnteChamber 소프트웨어를 사용하여 Apo-Si 화합물들인 Apo-Si-X-1, Apo-Si-X-2 및 Apo-Si-S-S을 파라미터로 나타냈다. Gromacs (v. 4.5)에서 실행되는 바와 같이, AMBER12sb Force Field를 사용하여 시뮬레이션을 수행하였다. 먼저 모든 화합물들을 막과 평행한 방향에 있는 수층에 위치시켰다. 이온들을 상기 용액에 첨가하여 그 시스템이 0.15M NaCl의 농도에 전기적으로 중성이 되도록 만들었다. 상기 시스템을 먼저 최초 위치로 한정된 화합물로 최소화하고, 다음 급격한 하강의 50,000 단계를 사용하여 한정되지 않은 것으로 하였다. 다음, 상기 시스템을 평형화하였다; 먼저 NVT 조건에서 (500 psec) 및 후속적으로 NPT 조건에서 (2 nsec) 수행하였다. NVT 평형화 동안, 온도를 점차적으로 303ㅊK로 증가시켰다 (이것은 지질의 상전이 온도보다 높다). 수직 (z) 방향에 있는 지질 헤드 기는 물론 상기 화합물에 위치적 구속을 부과하였다. 상기 화합물에만 위치적 구속을 유지한 반면, NPT 평형화에는, 반등방성 압력과 연계하면서 Hose-Hoover 서모스탯을 사용하였다. 생성 MD 시뮬레이션을 NPT 조건하에서 100 ns 동안 수행하였다. 모든 시뮬레이션들은 반 데르 바알스 및 쿨롱 상호작용에 대하여 12 Å 컷오프를 사용하였다. 장기적 정전기 상호작용을 Particle Mesh Ewald Summation을 사용하여 계산하였다. 주기적 경계 조건을 적용하였다. LINCS 알고리즘을 사용하여 결합 길이를 제한하였다.
결과: 도 14에 나타난 바와 같이, 시초에는, 각 분자가 막 주변 수층에 놓였다. 중요하게는, Apo-Si-X-1 및 Apo-Si-X-2에 대하여는 30 nsec에, 및 Apo-Si-S-S에 대하여는 100 nsec에 (각각 도 14 a, b, c), 상기 분자가 이동하고, 및 물/지질 계면에서부터 막 중심으로 상기 막 탄화수소 중앙 내에서 수직으로 움직였고, 막 중심에서 각 분자는 잔류하였다. 각 화합물에 대하여, 상기 퍼플루오로-분체, 즉 해당 MNM들(흰색 화살표)의 음극은 막 중심 쪽으로 당겨지는 것을 발견하였다. 동일한 이동 패턴이 모든 조사된 세 개 화합물에서 관찰되었다.
결론: 인지질 막 힘의 장에 대하여, 분자의 에너지론을 분석하는 이러한 정교하고, 비편향적인 컴퓨터 작엄은 본 발명의 MNM들의 작용 기전 (MOA)에 대한 추가적인 비준을 제공한다. 상기 세가지 분자에 의해 명백히 나타나는 유사한 관찰들은 그 성능의 기저를 이루는 통합된 작용 기전을 지지한다. 물/탄화수소 접점으로부터 막 중앙으로의 MNM의 이동을 담당하는 MNM들의 구조/기능 특성들은 막 쌍극자 전위에 응답적인 방식으로 증명되었다.
실시예 14: 전신 투여시 본 발명의 접합체의 넓은 전신적 분포를 향상시키기 위해 분체 E 내에 "동력학적 양성자화 분체 "의 장착:
거대분자 화물 약물들을 포함하는 본 발명의 접합체의 효능적인 막통과 전달을 수행하기 위해, 분체 E는 소수성 구조를 가진다. 특징적으로는, 그러한 분체들이 혈장 단백질, 주로 알부민에 많이 결합한다. 혈장 단백질로의 이러한 강한 결합은 이러한 접합체들의 분포 부피를 실질적으로 게한하여서, 그 분포가 혈관내 특정분획칸으로 한정하게 한다. 이것은 확실히 넓게 전신적으로 분포하도록 설계되어서, 신체 전체를 통틀어 다양한 조직에 도달하게 하려는 접합체의 소망의 프로필과는 반대된다. 그러한 잠재적 제한을 풀고자, 본 발명은 아민기를 E 내부에 장착하는 것을 포함한다. 그러한 기는 식 (VIIIb, Apo-Si-W)에 따라 설정된 구조에서 예시되어 있다:
Figure pct00087
식 (VIIIb); a=2 및 L3이 없는 경우;
Apo-Si-W로 지정
형태 A (미하전 아민)
Figure pct00088
형태 B (양성자화된, 양하전된 암모늄)
아민기의 장착으로 두 개 형태의 분체가 발생하였다:
형태 A: 소수성. 이러한 형태는 아민이 그의 미하전 형태일 때 발생한다. 이러한 형태는 분자적 나노모터의 효과적인 형태로서, 이는 부착된 거대분자 약물이 세포막에 결합되게 하고 및 막 쌍극자 전위와 연관된 내부 막 전기장을 이용하여 막을 건너게 한다.
형태 B: 상대적으로 친수성. 이러한 형태는 아민이 양성자화 될 때 발생한다. 이러한 양성자화로 인하여, 7.4의 생리적 pH에서 상기 분자의 지질/물 분배 계수 (Log D)는 거의 3 지수 크기가 감소된다. 또한, E 분체의 중심에 양 전하를 도입함으로써, 이는 E 분체가 막 쌍극자 전위에 따르는 것을 저해하고, 이는 막 중앙에서 양성이고 따라서, E의 내부 막 삽입 및 이의 내부막 이동을 거부한다. 이러한 형태로 있을 때, 상기 접합체는 세포막에 또는 혈장 단백질에 덜 결합하며, 체 내의 유체 부분에서 자유롭게 이동한다: 혈장, 내부 또는 외부세포 유체. 이러한 형태는 또한 화물 약물로부터 절단 후 원하는 바, 신체로부터 E 분체의 분비를 향상시키고 및 더 신속히 처리하도록 작용한다 (소변 또는 담즙을 통해).
상기 E 분체의 A 또는 B 형태 간의 비율을 정하는 주 인자는 아민기의 pKa이다. 이러한 아민과 같은 이차 아민은 통상 약 11의 pKa 값을 가지는 반면, 본 발명의 분체 E는 Apo-Si-W로 예시되는 바와 같이, 8.5인 아민기의 pKa를 가지도록 설계되었다. 결론적으로, 임의의 주어진 시점에서 및 체내의 임의의 구획부분 내에서, 형태 A 및 형태 B의 실제적인 양이 만나게 되고, 그 분자는 이러한 형태 간에 전환할 수 있다. 이것은, 상기 접합체가 세포막을 효능적으로 막관통하는 것을 제공하는 데 있어서의 상기 분자적 나노모터의 특성과 조합하면, 체 내에서 상기 접합체를 넓게 전신적으로 분포되게 할 수 있다. 또한, 상기 시스템은 성능을 최적화시키기 위해, 상기 탄화수소 링커 및 관련 퍼플루오로 모티프의 길이를 바꿈으로써 용이하게 조정될 수 있다.
실시예 15: 식 (IXb)에 따른 본 발명의 접합체에 의한 쥐 간 Hepa 1-6 세포에서의 PCSK9 유전자 발현의 사일런싱:
Figure pct00089
식 (IXb): a=3, b=0 및 k=1인 경우, 분체는 Apo-Si-S-S으로 지정
PCSK9는 혈중 콜레스테롤 수준을 낮추는 역할을 한다: LDL 수용체에 결합하면, 그 수용체는 붕괴괴고 및 더 이상 혈액으로부터 LDL 콜레스테롤을 제거할 수 없다. 그러므로, PCSK9이 차단된다면, 더 많은 LDL 수용체들이 간의 표면에 존재하게 되어, 혈액으로부터 더 많은 LDL 콜레스테롤을 제거하는 작용을 하게되며 따라서 혈중 콜레스테롤 수준을 낮추게 된다. 본 실시예의 중요성은 본 발명의 접합체가 질병 발생 (이 경우 고콜레스테롤혈증)을 가질 수 있는 유전자를 사일런스하는 능력을 증명하는 데 있고, 여기서 각 유전자 사일런싱이 치료적 전략으로서 역할을 가질 수 있다. 또한, 본 실시예는 관련 세포, 예, 이 경우 간세포의 세포주에서의 각 유전자 사일런싱을 증명한다. 따라서, 본 발명의 접합체의 활성이 EGFP와 같은 리포터 유전자의 사일런싱을 넘어 질환 관련 유전자의 사일런싱으로 확장되는 것을 증명한다.
조사된 접합체는 두 개 E 분체들을 포함하며, 각각은 Apo-Si-S-S로 지정되는 식 (IXb)에 따른 구조를 가지고, 따라서 하기에서 설명되는 구조를 가지며 및 여기서 "E-RNA-E' 접합체"로 지칭되는, 일반식 (I)에 따른 접합체를 형성한다. E 분체들은 네덜란드에 있는 Syncom 회사에서 작제되었다. RNA에로의 접합은 미국 아이오아 소재의 IDT에 의해 수행되었다. 접합체의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00090
상기 접합체의 dsRNA 부분은 PCSK9 유전자를 사일런스하도록 특이적으로 설계되고 연결된 이중 가닥 RNA인 25-27 Dicer 기질을 포함한다. 본 발명의 접합체는, 동일한 서열이지만 상기 Apo-Si 분자적 나노 모터들이 결여된 RNA 대조군과 비교할 때, 400nM의 투여량에서 75.5% 정도까지 PCSK9 유전자의 사일런싱을 유도한다는 것이 발견되었다 (p<0.001).
본 실시예는 상기 "분자적 나노모터(들) (MNMs)이: (i). 달리 막을 통과할 수 없는 siRNA의 막관통 전달. (ii). E-RNA-E' 접합체의 세포질로의 길잡이, 및; (iii). 질병 관련 유전자의 발현을 사일런싱하는 데 있어서 바람직한 성능의 발휘를 가능하게 하는 것을 증명한다.
실시예 16: 식 (Xb)에 따른 접합체 (Apo-Si-X-2)에 의한, EGFP 유전자를 발현하는 3T3 세포에 발휘되는 유전자 사일런싱:
본 실시예에서 조사된 접합체는 E 및 E' 각각 식 (Xb)에 설정된 구조를 가지는 접합체이고, 여기서 R=F, R'=H, a=2, W=O, k=1이며, 하기 구조를 가지고 및 Apo-Si-X-2로 지정된다:
Figure pct00091
식 (Xb)
세포는 EGFP 유전자를 안정적으로 발현하는 3T3 세포였다. 세포주를 10% FCS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신 10ㅅg/ml으로 보충된 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM)에 배양하고 및 5% CO2습윤 공기를 지닌 37OC배양기에서 유지하였다. 형질 감염 하루전에, 25,000개 3T3-EGFP 세포를 24-웰 챔버에 플레이트 하였다. 하루 뒤, EGFP 유전자를 녹다운시키는 것으로 설계된 si-RNA 서열 (실시예 12에 설명된 서열)에 접합된 Apo-Si-X-2 (0.6 μM), 접합체로 세포에 형질감염시켰다, 형질 감염 72시간 후에, 배지를 흡입 제거하고, 세포를 용해시키고 및 Tecan Infiniteㄾ 200 PRO Multimode Reader를 사용하여 형광 정량화하였다. 488ㅁ5nm에서의 여기 및 535ㅁ10nm에서의 방출을 사용하여 EGFP 단백질 수준을 정량화하였다. Apo-Si 분자적 나노모터들이 없는 siRNA로 처리된 대조군과 비교하여, 본 발명의 접합체는 유전자 발현을 75%까지 명백히 녹다운시켰고, 따라서 상기 접합체의 성능을 증명하였다.
실시예 17: MNM의 양성자화에 관계되어, 수반되는 성능 향상 분체로서 본 발명에서 이용되는 동력학적 양성자화의 원리를 예시하는 분자적 시뮬레이션 연구는 혈액 또는 세포질 내에서 이돌할 수 있는 분자의 수용성 형태 및 세포막 환경 내에서 움직일 수 있는 수불용성 형태 둘 다 제공하며, 이들은 함께 상기 접합체를 넓게 분포하게 한다.
방법: Apo-Si-W의 미양성자화된 및 양성자화된 형태의 상호작용의 분자적 시뮬레이션 연구는 실시예 13에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 사용된 MNM은 식 (VIIIb)에 따른 Apo-Si-W 구조식에 대한 것으로 인산기에 연결되어 있어서 RNA의 인산기를 자극한다. Apo-Si-W의 삼차 아민의 두 개 양성자화된 상태를 실시예 14에 따라 이용하였다: 미양성자화된; 및 양성자화된 (양하전된) 상태. 각 양성자화된 상태의 구조를 인지질 막의 컴퓨터화된 분자 시뮬레이션 모델 시스템에서 수 일간 독립적으로 돌렸고 100 나노초의 시뮬레이션이 얻어질 때까지 수행되었다. 각 구조의 초기 위치는 막 표면과 평행이었다.
Figure pct00092
Apo-Si-W
결과: 도 15는 상기 100 나노초 운행의 말에 각 분자의 대표적 위치를 제공한다. 양성자화된 양하전 형태(도 15 a)는 시뮬레이션 기간 내내 막으로부터 배제된 것이 발견되었다; 반대로, 상기 분자의 소수성, 미양성자화된 형태는 인지질 막 내부로 우수하게 위치하는 것이 명백히 나타났다 (도 15b). 흥미롭게 및 중요하게, 미하전된 형태의 막 내부로의 막 위치선정은 내부 막 전기장의 극성에 따르며, MNM의 음극은 막의 중심, 즉 전기장의 양극에 도달한다.
결론: 이러한 분자 시뮬레이션 모델에서 평가되는 바와 같이, 상기 단일 동적으로 양성자화된 질소 원자의 양성자화 상태는 전체 E 모티프의 막 상호작용을 지배할 수 있었다.
실시예 18: 본 발명의 접합체에 의한 S16 세포에서의 PMP22 유전자의 사일런싱:
샤르코마리투스 병(Charcot-Marie-Tooth Disease)은 신경 섬유의 전기적 분리에 중요한 말초 신경의 수초를 구성하는 슈반 (Schwann) 세포에 영향을 주는 일반적인 신경질환이다. 상기 질환을 가진 환자에서는, 슈반 세포의 중요한 구조적 단백질인 단백질 PMP22을 암호화하는 유전자 분절체가 삼중화되어 있어서, PMP22가 과잉되게 되고 이는 슈반 세포의 해로운 대사 경로여서 이의 분해를 결과하게 된다. PMP22 유전자를 사일런스하도록 설계된 siRNA는 따라서 슈반 세포에 과부하된 단백질을 감소시키는 데 유익할 수 있고 및 질환 진행을 정지시키고 적절한 조직 재생을 이루게 할 수 있다.
방법: 본 발명의 접합체가 PMP22 유전자의 발현을 사일런스하는 능력을 증명하기 위해, 본 발명자들은 a=3, b=0, k=1인 식 (IXb)에 설정된 구조를 각각 가지는 본 발명의 E, E' 또는 E''의 각 가닥의 5' 말단에 접합된 특이적 siRNA 듀플렉스인 siRNA 서열을 사용하였다. 이러한 분체는 Apo-Si-S-S로 지정되었다:
Figure pct00093
Apo-Si-S-S
사용된 세포 시스템은 S16 세포였고 이는 래트 슈반 세포로부터 유래되었다. 세포를 6 웰 플레이트에 심었다 (800,000개 세포/웰). 다음날, 세포를 행크 균형 염 용액(HBSS)으로 세척하고, 배지를 무혈청 Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)으로 교환하였다. 세포를 400nM 및 600nM의 Apo-Si-S-S-dsi-RNA (Dicer's 기질)로 24 시간 처리하고 및 이 후 완전 배지로 추가로 24시간 처리하였다. 형질 감염 48 시간 후, 배지를 흡입 제거하고, 세포를 트리졸 시약 (Thermo Fisher Scientific)으로 용해하고 및 RNA를 제조사의 방식에 따라 퓨어링크 RNA 추출 미니키트 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출하였다. 다음, RNA를 역전사시키고 및 cDNA를 StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 qRT-PCR시켰다.
결과: Apo-Si-S-S-MNM 접합체가 PMP22의 발현을 녹다운 시키는 능력이 도 17에 나타나 있다 (평균 + SD). 미처리된 세포, 및 EGFP대항하는 (및 PMP22에 대한) siRNA로 처리된 세포를 대조군으로 사용하였다. 도시된 바와 같이, Apo-Si-S-S MNM 접합체들은 PMP22 유전자의 발현수준을 효과적으로 용량 의존적 방식으로 녹다운(사일런스)시켰고, 미처리된 세포에 비하여 400nM의 투여량에서 57% 사일런싱이 관찰되었고, 600nM 투여량에서는 66%로 증가하였다.
결론: 본 발명의 2 개의 MNM에 연결된, PMP22에 반하는 siRNA를 포함하는 본 발명의 접합체 [Apo-Si-S-S-dsi-RNA (Dicer의 기질)]은 과발현된 PMP22 단백질을 암호화하는 질병 관련 유전자의 발현을 침묵시키는 능력을 명확히 나타냄으로써 샤르코마리투스 질병에 대한 효능적 치료로서 잠재적 이용성을 명확히 보인다.
실시예 19: 식 (VIIa)에 따른 본 발명의 접합체 (a=2, 및 k=1, Apo-Si-C4로 지정)의 막관통 전달; 및 막 쌍극자 전위/내부 막 전기장(IMEF) 간의 직접적 연관 관계 증명.
플로레틴은 막 쌍극자 전위 및 관련 IMEF의 저해체이고, 6-케토-콜레스타놀 (6-KC)은 IMEF의 강력한 향상체이다. 그러므로, 쌍극자 전위 조절자인 플로레틴 또는 6-KC의 효과들과, 본 발명의 상기 접합체 (하기 서열의 dsDNA에 연결된 Apo-Si-C4 MNM를 포함: 센스:/5'-MNM/TT/iCy3/CGGTGGCAGATGAACTTCAGGGTCA (서열번호 9);
안티-센스:/5'-MNM/TGACCCTGAAGTTCATCTGCCACCGAA (서열번호 10); 여기서 Cy3는 적색 형광단)의 흡수 수준과의 잠재적 연관관계를 조사하였다.
방법:
실험 하루 전에, 대수증식기에 있는 3T3-EGFP 세포를 무항생제 DMEM 완전 배지를 가진 6-웰 플레이트에 5x105세포/웰 밀도로 플레이트 하였다. 세포를 플로레틴 750 μM으로 370C에서, 또는 6-KC 100 μM로 370C에서 1 시간 처리하였다. 다음, 6-KC를 씻어내고 반면 플로레틴은 배지에 남겼다. 전술한 바와 같은 접합체를 Opti-Mem의 500 ㎕/웰에 희석시키고, 및 상기 세포에 최종 40nM의 농도로 첨가하여 두 시간 처리하였다. 형질 감염 2 시간 후에, 상기 접합체의 전달을 평가하였다. 이 시점에서, 세포를 트립신 처리하고, 행크 완충염 용액 (HBSS 완충액; Biological Industries, 이스라엘)으로 보충한 후 5 분간1200 rpm에서 원심분리시켰다. 다음, 세포를 행크 완충염 용액에 재현탁하고, 및 Cell Diva 소프트웨어를 이용하는 FACSAria III 세포 분류기 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아 산호세)로 분석하였다. 각 샘플에 대하여, 총 104사건을 수집하였다.
결과:
FACS 분석에 의하면, 처리 2 시간에 세포의 68%가 이미 표지되어 있어서, 본 발명의 상기 접합체가 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있다는 것이 확인되었다. 반대로, 플로레틴으로 처리된 세포의 1.5% 만이 Apo-Si-C4 접합체의 결합을 확실히 보였다 (도 18 a). 6-케토-콜레스타놀은 세포에 의한 Apo-Si-C4 접합체의 흡수 증가를 유도하였다 (도 18 b): 밝은 영역 이미지에서 평가되는 바와 같이, 동일한 수의 세포가 있지만, Cy3-형광이 6-KC 세포에서 뚜렷이 더 높았고, 이는 이러한 세포들에서 뚜렷이 더 높은 흡수를 나타내는 것이다.
결론: 막 쌍극자 전위를 차단하거나 또는 개시하는 것, 및 각각의 내부 막 전기장은 본 실험에서 예증된 바와 같이, Apo-Si-MNM-작제물의 흡수를 결정하거나 이와 직접적으로 연관된다.
실시예 20: 본 발명의 분자들의 극성의 구조/기능 분석
목적: 식 (VII)-(XId)에 따른 모든 MNM들에게 공유되어 있는 비대칭적 극성의 중요성을 증명하는 것:
방법:
이 목적을 위해, 두 개 유사 접합체들을 작제하고 평가하였다:
(i). 각각 Apo-Si-C4로 지정된 식 (VIIa)에 설정된 구조를 가지는 E 및 E'에 연결된 dsDNA의 접합체:
Figure pct00094
Apo-Si-C4
(ii). E 및 E' 각각은 Apo-Si-C4 구조를 가지지만, 분자의 비대칭적 극성을 생성하는 데 중요한 기여를 하는 불소 원자들이 없는, 대조군 A로 지칭되는 변이된 유사체:
Figure pct00095
대조군 A
이러한 MNM 분체 둘 다는 Cy3-형광단으로 표지된 58-mer DNA 올리고뉴클레오타이드에 연결하였고 및 FACS 분석하였다.
실험 하루 전에, 대수증식기에 있는 3T3-EGFP 세포를 무항생제 DMEM 완전 배지를 가진 6-웰 플레이트에0.2-0.5x105세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 각 Cy3-표지 올리고뉴클레오타이드 (MNM들이 있거나 또는 없거나)를 Opti-Mem의 500 ㎕/웰에 희석시키고, 및 세포에 40 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 상기 접합체의 전달을 처리 2-24 시간에서 평가하였다. 상기 처리 기간 후, 세포를 트립신 처리하고, 행크 완충염 용액 (HBSS 완충액; Biological Industries, 이스라엘)으로 보충하고 및 5 분간 1100 rpm에서 원심분리하였다. 다음, 세포를 행크 완충염 용액에 재현탁하고, 및 Cell Diva 소프트웨어를 이용하는 FACSAria III 세포 분류기 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아 산호세)로 분석하였다. 대조군 A 접합체로 처리한 세포에 비하여 Apo-Si-4C 접합체로 처리한 세포에서의 형광 강도를 측정함으로써, Cy3-양성 세포 군을 검출하고 정량화하였다.
결과:
Apo-Si-4C 접합체로 처리된 대부분 세포는 처리 두 시간 만에 이미 강한 Cy-3 형광 신호를 확실히 나타내었다. 신호 강도는 처리 24시간에 더 증강되었다. 반면, 대조군 A 접합체로 처리된 세포는 2 시간 처리에서도 24 시간 처리에서도 임의의 유의한 Cy3 신호를 명확이 나타내지 않았다.
결론:
본 실시예는 본 발명의 MNM들의 기능을 가능하게 하는 데 있어서 비대칭적 극성의 중요성을 증명한다. 이러한 원리는 식 (VII)-(XId)에 따른 모든 화합물에 공유되며, 및 따라서 본 실시예는 막관통 전달에서의 기능을 수반하는 본 발명을 통일시키는 일반적 규칙을 증명한다.
SEQUENCE LISTING <110> Aposense LTD. ZIV, Ilan <120> COMPOUNDS AND METHODS FOR TRANS-MEMBRANE DELIVERY OF MOLECULES <130> P-79037-PC1 <150> 15/164,344 <151> 2016-05-25 <150> 15/057,813 <151> 2016-03-01 <150> 14/985,526 <151> 2015-12-31 <150> 14/872,179 <151> 2015-10-15 <150> 14/870,406 <151> 2015-09-30 <150> 14/830,799 <151> 2015-08-20 <150> PCT/IL2015/000019 <151> 2015-03-29 <150> 61/971,548 <151> 2014-03-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> C is attached to MNM-TT-iCy3 <400> 1 cggtggtgca gatgaacttc agggtca 27 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> T is attached to MNM <400> 2 tgaccctgaa gttcatctgc accaccgaa 29 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> C is attached to Apo-si-11-TT-iCy3 <400> 3 cggtggtgca gatgaacttc agggtca 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> T is attached to Apo-si-11 <400> 4 tgaccctgaa gttcatctgc accaccgaa 29 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial short sequence <400> 5 acccugaagu ucaucugcac caccg 25 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial short sequence <400> 6 cgguggugca gaugaacuuc aggguca 27 <210> 7 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial short sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> C is attached to Apo-Si-S-S <400> 7 cgguggugca gaugaacuuc aggguca 27 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial short sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> A is attached to Apo-Si-S-S <400> 8 acccugaagu ucaucugcac caccg 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> C is attached to MNM/TT/iCy3 <400> 9 cggtggcaga tgaacttcag ggtca 25 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> T is attached to MNM <400> 10 tgaccctgaa gttcatctgc caccgaa 27

Claims (49)

  1. 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 방법으로서,
    (i). 내부 막 전기장 (IMEF)-기질에 접합된 약물을 제공하는 단계; 및
    (ii). 상기 IMEF- 기질에 접합된 약물에 생체막을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약물을 상기 IMEF-기질에 접합시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 방법으로서, 각각은: (i) 옥탄올/물 분배 계수 >1; (ii) 하기 모티프 중 적어도 하나로부터 선택되는 음극: 카르보닐, 에테르, 또는 불소 원자(들); 및 (iii)적어도 두개 탄소 길이의 선형 또는 분지 지방족 탄화수소 사슬을 포함하는 양극을 가지는 하나 이상의 분체 (E, E', 또는 E'')를 상기 약물에 접합시키는 단계; 및
    상기 생체막을 상기 접합된 약물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 생체막을 관통하여 약물을 전달하는 방법으로서,
    식 (I)에 설정된 구조를 가지는 접합체, 또는 식 (I)에 설정된 구조에 의해 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 이용하는 방법:
    식 (I)
    Figure pct00096

    상기 식에서,
    D 는 소분자 약물, 펩타이드, 단백질, 및 천연 또는 변형된, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, siRNA 또는 ASO로 구성되는 군으로부터 선택된, 생체막을 관통하여 전달될 약물이고; y, z 및 w는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수이며, 여기서, 상기 정수가 0일 때는, 각각의 E 분체들은 없는 것 (null)을 의미하며; y, z 또는 w 중 적어도 하나는 0이 아니며;
    E, E', 또는 E" 는 같거나 상이할 수 있고, 각각은 일반식 (II)에 설정된 구조를 가지며:
    (A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
    식 (II)
    상기 식에서 각 A 분체는 식 (III), (IV), (V) 및 (VI)에 설정된 구조들로부터 독립적으로 선택되고:
    Figure pct00097
    식 (III) 식 (IV) 식 (V) 식 (VI)
    M은 없거나, -O- 또는 -CH2-로부터 선택되고; 및 g, h 및 k는 각각 개별적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 군으로부터 선택되는 정수이고; *는 -H, 또는 B 또는 다른 A 기로의 연결점이고; a는 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 정수이고; Q는 산소 또는 아민이고.
    B 는:
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 티올로 치환되거나; 또는 조건적으로 에테르, 에스테르, 또는 아미드 기에 연결된C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14아릴 또는 헤테로아릴;
    하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민 또는 티올로 치환되거나; 또는 각각 조건적으로 에테르, 에스테르, 아민, 또는 아미드 기에 연결되는, 콜레스테롤, 담즙산, 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트리올, 리토콜산 또는 이의 임의의 유사체로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 스테로이드 분체; 및
    이의 조합으로 구성되는 하나 이상의 군으로부터 선택되고;
    Q1및 Q2는 각각 독립적으로 없거나, 에스테르, 티오-에스테르, 아미드 [예, -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-], 카르바메이트 [예, -O-C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-O-], 우레아 [-NH-C(=O)-NH-], 디설파이드 [-(S-S)-], 에테르 [-O-], 아민, 이미다졸, 트리아졸, 딜락톤; 이의 킬레이트된 금속 이온을 포함하는, BAPTA 및 EGTA로부터 선택된 금속 킬레이터; 및 이의 조합으로부터 선택된 절단될 수 있는 기이고;
    L1,L2및 L3는 각각 독립적으로 없거나 및:
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14,알킬 또는 헤테로-알킬;
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13또는 C14아릴 또는 헤테로아릴;
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환된 -(O-CH2-CH2)u-;
    각각 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 티올로 치환되거나; 또는 에테르 기에 연결된 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드; 이미다졸, 아지드, 아세틸렌; 및 이의 임의의 조합; 및 상기식에서 u는 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고; 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    여기서 Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 실재하거나 및 Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 각각은 조건적으로 T 분체를 포함하며; 여기서T는개시자기 (initiator group)로서 C4,C5,C6-1,2-디티오시클로알킬 (1,2-디티오시클로-부탄; 1,2-디티오시클로-펜탄; 1,2-디티오시클로헥산; 1,2-디티오시클로헵탄); γ-락탐 (5 원자 아미드 고리), δ-락탐 (6 원자 아미드 고리) 또는 ε-락탐 (7 원자 아미드 고리); γ-부티로락톤 (5 원자 에스테르 고리), δ- 발레로락톤 (6 원자 에스테르 고리) 또는 ε- 카프로락톤 (7 원자 에스테르 고리)로부터 선택되며, 이들 각각은 조건적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올에 의해 치환되며;
    B, Q1, Q2, L1,L2및 L3 중 적어도 하나는 식 (I)에서 정의된 약물에 접합된다.
  5. 제4항에 있어서, y=1, z=o 및 w=0; 또는 y=1, z=1 및 w=0인, 방법.
  6. 일반식 (I)에 따른 접합체로서, E, E' 또는 E'' 분체는 일반식 (VII)에 설정된 구조 및 연관 구조들을 가지며, 일반식 (VII)에서 설정된 것과 같은 구조의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 또는 관련된 유사체, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 접합체:
    Figure pct00098

    식 (VII)
    상기식에서, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고; L1,L2,L3,Q1,Q2은 식 (I)에서 설명된 바와 동일한 의미를 가지고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 아민 (이차 또는 삼차 아민) 기로부터 선택되고; k 및 d는 각각 없거나 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수를 나타내고; 및 상기 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 약물이다.
  7. 제6항에 있어서, R 또는 R'는 각각 독립적으로 수소 및 불소 원자로부터 선택되는 접합체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 에스트라디올 분체는 에스트라디올, 리토콜산, 및 관련 유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 다른 스테로이드 잔기로 치환되는, 접합체.
  9. 제6항에 있어서, L1,L2및 L3는 각각개별적으로 없는 것이거나 및 조건적으로 에테르 또는 아민에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8탄화수소 사슬일 수 있고 ; L1,L2및 L3는 동일하거나 상이할 수 있는, 접합체.
  10. 제6항에 있어서, Q1 또는 Q2 는 아미드, 에스테르, 에테르, 카르바메이트 또는 디설파이드로부터 선택된 분체인, 접합체.
  11. 제6항에 있어서, L1, L2 또는 L3는 T 분체를 포함하며, 여기서 T는 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 조건적으로 치환되는 1,2-디티오시클로-부탄인, 접합체.
  12. 제6항에 있어서, E, E' 또는 E''는 식 (VIIa)에서 설정된 구조를 가지고, 식 (VIIa)에서 설정된 구조로 나타나는 화합물 또는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 접합체:
    Figure pct00099

    식 (VIIa)
    상기식에서 a 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타낸다.
  13. 제6항에 있어서, (i).MNM의 음극 및 양극 사이에 위치한 아민 기; 및 (ii). 상기 아민 분체 측면에 붙어 있고, 7.0-8.5 pH 단위 범위에서 아민 pKa값을 설정하는 전자 끌게 기로 구성되는, "동력학적 양성자화 분체"를 포함하는, 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 전자 끌게 기의 각각은 카르보닐, 에테르, 에스테르 및 플루오로카본 분체로부터 선택되는 군으로부터 선택되는, 접합체
  15. 제6항에 있어서, E, E' 또는 E'' 분체 각각은 독립적으로 식 (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), 또는 (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh)에 설정된 것과 같은 구조를 가질 수 있고, 관련된 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 접합체:
    Figure pct00100

    식 (VIIIa)

    Figure pct00101


    식 (VIIIb)

    Figure pct00102

    식 (VIIIc)
    Figure pct00103

    식 (VIIId)
    Figure pct00104

    식 (VIIIe)
    Figure pct00105

    식 (VIIIf)

    Figure pct00106

    식 (VIIIg)
    Figure pct00107

    식 (VIIIh)
    상기 식에서 D 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이고; L3은 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지며; a, b, k, 및 d는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; 및 R'''은 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  16. 제6항에 있어서, E, E' 또는 E''는 식 (IX)에 설정된 구조를 가지고, 식 (IX)에 설정된 구조로 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 접합체:
    Figure pct00108

    식 (IX)
    상기 식에서, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고; L1,L2및 L3는 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 아민 (이차 또는 삼차 아민) 기로부터 선택되고; d 및 e는 각각 독립적으로 없거나 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6로부터 선택되는 정수를 나타내고; 및 상기 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 약물이다.
  17. 제16항에 있어서, E, E' 또는 E''는 독립적으로 (IXa), 식 (IXb), 식 (IXc), 식 (IXd), 식 (Xe), 식 (IXf), 식 (IXg), 및 식 (IXh)에서 설정된 구조를 가지며, 약학적 허용염, 수화물, 용매화물, 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 접합체:
    Figure pct00109

    식 (IXa)
    Figure pct00110

    식 (IXb): a=3, b=0 및 k=1인 경우, 상기 분체는 Apo-Si-S-S로 지정
    Figure pct00111

    식 (IXc); a=1, k=1인 경우; 상기 분체는 Apo-Si-G로 지정


    Figure pct00112

    식 (IXd)

    Figure pct00113

    식 (IXe)
    Figure pct00114

    식 (IXf)

    Figure pct00115
    식 (IXg)

    Figure pct00116

    식 (IXh)
    상기식에서, L3는 식 (I)에서 정의된 바와 같고; W 및 G는 각각 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 이차 또는 삼차 아민기로부터 선택되고; a, b, k 및 d는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수를 나타내고; R'''는 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택되고; 및 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고; 여기서 D는 식 (I)에서 정의한 바와 같은 약물이다.
  18. 제6항에 있어서, E, E' 또는 E'' 중 하나 이상은 카르바메이트기를 가지며, 및 절단가능한 디설파이드 분체는 식 (X), 식 (Xa), 식 (Xb) 또는 식 (Xc)에 따른 환형 구조식의 범위 내에 있고; 여기서, 디설파이드는 그의 산화된 또는 환원된 (개환된) 형태일 수 있는, 접합체:
    Figure pct00117

    식 (X)
    Figure pct00118
    식 (Xa)
    Figure pct00119

    식 (Xb)
    Figure pct00120

    식 (Xc)

    상기식에서, a, b, k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6로 구성되는 군으로부터 선택된 정수이고; h는 1, 2, 3 또는 4의 정수이고; Z는 수소, 불소, 하이드록실 및 아민기로 구성되는 군으로부터 선택되고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시 기, 및 플루오로카본 기로 구성되는 군으로부터 선택되고; L3는 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지고; G는 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W는 산소, 아미드, 에스테르 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로부터 선택되고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다.
  19. 제6항에 있어서, E, E' 또는 E'' 중 적어도 하나는 절단가능한 카르바메이트 분체, 및 동력학적 양성자화 분체 둘 다를 포함하며 및 식 (XI), 식 (XIa), 식 (XIb), 식 (XIc) 또는 식 (XId)에 설정된 구조를 가지며, 이러한 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 접합체:
    Figure pct00121

    식 (XI)

    상기식에서 L3 또는 L2는 각각 (I)에 따른 의미를 가지고, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 이차 또는 삼차 아민으로 구성되는 군으로터 선택되고, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다;
    Figure pct00122
    식 (XIa)
    상기식에서 L3은 식 (I)에 따른 의미를 가지고, a, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R'', R'''은 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다;
    Figure pct00123

    식 (XIb)

    상기식에서 L3은 식 (I)에 따른 의미를 가지고; a, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R'', R''', RIV은 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다;
    Figure pct00124

    식 (XIc)
    상기식에서, L3 및 D은 각각 식 (I)에서와 동일한 의미를 가진다;
    Figure pct00125

    식 (XId)
    상기식에서 L3 및 D은 각각 식 (I)와 동일한 의미를 가진다.
  20. 제6항에 있어서, E, E' 또는 E''는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 것에서 설정된 구조를 가지며; 약물에 부착된, 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 약물은 siRNA, ASO 및 치료적 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된 거대분자인, 접합체.
  22. 제21항에 따른 접합체 및 약학적 허용염 또는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  23. 약물을 생물학적 세포로 전달하는 방법에 있어서, 상기 세포는 배양 중이거나 또는 살아있는 동물이나 인간 대상체에 있는 세포이고; 상기 방법은 상기 세포를 제20항에 따른 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  24. 의학적 질병을 치료하는 방법에 있어서, 제22항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 생체막은 세포막 및 생물학적 장벽들로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 생물학적 장벽들은 혈뇌장벽, 혈액 안구 장벽 또는 혈액 태아 장벽으로부터 선택되는, 방법.
  26. 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 식에서 설정된 구조를 가지며; 접합체의 형성 중에 제거 또는 변형되도록 설정된 화학적 분체를 포함하거나 그에 연결된 전구체.
  27. 제26항에 있어서, 제거되거나 변형되도록 설정된 상기 화학 분체는 포스포로아미데이트, 활성화된 에스테르, 아지드 또는 아세틸렌으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전구체.
  28. 제26항에 있어서, 식 (XII)에서 설정된 구조를 포함하는 전구체:
    Figure pct00126

    식 (XII)
    상기식에서, W는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 식에 따른 E, E' 또는 E''으로부터 선택되는 화학 분체이다.
  29. 제26항에 있어서, 식 (XIII)에 설정된 구조를 가지는 전구체:
    Figure pct00127

    식 (XIII)
    상기식에서 G는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 식에서 설명된 바와 같은 E, E' 또는 E''로부터 선택되는 분체이고; (DMT)는 하이드록실용 보호기이고; 및 CPG는 조절된 공극 유리이다.
  30. 제26항에 있어서,식 (XIV)에 설정된 구조를 가지는 전구체:
    Figure pct00128

    식 (XIV)
    상기식에서, PRG는 하이드록실기를 보호하는 데 적절한 임의의 보호기이다; W는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 식에 따른 E, E' 또는 E''로부터 선택되고; Y는 산소 또는 질소 원자(들)에 의해 치환되거나 및 조건적으로, 및 임의의 천연 또는 변형된 RNA 또는 DNA 염기에 연결된1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 원자 길이 탄화수소 링커들로부터 선택된다.
  31. 제30항에 있어서, PRG는 디메톡시트리틸 비스-(4-메톡시페닐) 페닐 메틸 (DMT)이고; 및 상기 염기는 티민 또는 우라실인, 전구체.
  32. 제26항에 있어서, E, E' 또는 E''를 단백질 약물인 D에 부착하기 위한 것으로서, 식 A 또는 B에 설정된 구조를 포함하며, D의 아민 분체에 결합하도록 의도된, 전구체:
    Figure pct00129

    상기식에서, W는 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 식에 따른 E, E' 또는 E''로부터 선택된다.
  33. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E'' 분체는 일반식 (VII)에 설정된 구조, 및 관련 구조들을 가지며, 식 (VII)에 설정된 구조로 표시되는 화합물 또는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 방법:
    Figure pct00130

    식 (VII)
    U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고; L1,L2,L3,Q1,Q2는 식 (I)에 대하여 설명된 바와 동일한 의미를 가지고, R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 아민 (이차 또는 삼차 아민) 기로부터 선택되고; k 및 d는 각각 독립적으로 없거나, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수를 나타내고; 및 상기 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 약물이다.
  34. 제33항에 있어서, R 또는 R'는 각각 독립적으로 수소 및 불소 원자로부터 선택되는, 방법.
  35. 제4항에 있어서, 상기 스테로이드 잔기는 에스트라디올, 리토콜산, 및 관련 유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제4항에 있어서, L1,L2및 L3은 각각 개별적으로 없거나, 및 에테르 또는 아민기에 연결된 선형, 환형 또는 분지된 C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8탄화수소 사슬로부터 선택되고; L1,L2및 L3 은 동일하거나 상이할 수 있는, 방법.
  37. 제4항에 있어서, Q1 또는 Q2은 아미드, 에스테르, 에테르, 카르바메이트 또는 디설파이드로부터 선택되는 분체인, 방법.
  38. 제4항에 있어서, L1, L2 또는 L3은 T 분체를 포함하며, T는조건적으로 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 플루오로카본, 아민, 또는 티올로 치환된 1,2-디티오시클로-부탄인, 방법.
  39. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E''는 식 (VIIa)에 설정된 구조를 가지고, 식 (VIIa)에 설정된 구조로 표시되는 화합물 또는 관련 유사체의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 방법:
    Figure pct00131

    식 (VIIa)
    상기식에서, a 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타낸다.
  40. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E'', 분체는 (i). MNM의 음극 및 양극 사이에 위치한 아민기; 및 (ii). 상기 아민 분체 측면에 붙어 있고, 7.0-8.5 pH 단위 범위에서 pKa 값을 설정하는 전자 끌게 기로 구성되는 "동력학적 양성자화 분체"를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 측면 전자 끌게 기들의 각각은 카르보닐, 에테르, 에스테르 및 플루오로카본 분체로부터 선택되는 방법.
  42. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E''은 식 (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh), 또는 (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh)에 설정된 구조를 가지고, 관련 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 방법:
    Figure pct00132

    식 (VIIIa)

    Figure pct00133


    식 (VIIIb)

    Figure pct00134


    식 (VIIIc)

    Figure pct00135

    식 (VIIId)
    Figure pct00136

    식 (VIIIe)
    Figure pct00137

    식 (VIIIf)

    Figure pct00138

    식 (VIIIg)
    Figure pct00139

    식 (VIIIh)
    상기식에서, D는 식 (I)에서 정의한 바와 같은 약물이고; L3는 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지고; a, b, k 및 d는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; 및 R'''는 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  43. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E''는 식 (IX)에 설정된 구조체를 가지고, 식 (IX)에서 설정된 구조에 의해 표시되는 화합물의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 방법:
    Figure pct00140

    식 (IX)
    상기식에서, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로 구성되는 군으로부터 선택되고; L1,L2,L3는 식 (I)에서 정의된 바와 같고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시 기, 및 플루오로카본 기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 이차 또는 삼차 아민기로부터 선택되고; d 및 e는 각각 독립적으로 없거나, 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6로부터 선택된 정수를 나타내고; R'''는 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택되고; 및 상기 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되어 있고, 여기서 D는 식 (I)에서 정의된 약물이다:
  44. 제43항에 있어서, E, E' 또는 E''는 독립적으로 식 (IXa), 식 (IXb), 식 (IXc), 식 (IXd), 식 (Xe), 식 (IXf), 식 (IXg), 및 식 (IXh)에서 설정된 구조를 가지고, 약학적 허용염, 수화물, 용매화물, 및 금속 킬레이트물, 및 용매화물, 및 상기 각 염의 수화물을 포함하는, 방법:

    식 (IXa)
    Figure pct00142

    식 (IXb): a=3, b=0 및 k=1인 경우, 상기 분체는 Apo-Si-S-S로 지정된다

    Figure pct00143

    식 (IXc); a=1, k=1인 경우; 상기 분체는 Apo-Si-G로 지정된다
    Figure pct00144

    식 (IXd)
    Figure pct00145
    식 (IXe)
    Figure pct00146

    식 (IXf)

    Figure pct00147
    식 (IXg)

    Figure pct00148

    식 (IXh)
    상기식에서, L3는 식 (I)에서 정의된 바와 같고; W 및 G는 각각 독립적으로 없거나, 산소, 에스테르, 아미드 또는 이차 또는 삼차 아민기로부터 선택되고; a, b, k 및 d는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6로부터 선택되는 정수를 나타내고; R'''는 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택되고; 및 E, E' 또는 E'' 분체는 D에 접합되고 여기서 D는 식 (I)에서 정의한 바와 같은 약물이다.
  45. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E'' 중 하나 이상이 카르바메이트기를 가지며, 및 절단가능한 디설파이드 분체 식 (X), 식 (Xa), 식 (Xb) 또는 식 (Xc)에 따른 환형 구조 범위 내에 있고; 여기서 디설파이드는 산화된 또는 환원된(개환) 형태로 있을 수 있는, 방법:
    Figure pct00149

    식 (X)
    Figure pct00150

    식 (Xa)
    Figure pct00151

    식 (Xb)
    Figure pct00152

    식 (Xc)
    상기식에서, a, b, k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6로 구성되는 군으로부터 선택되는 정수를 나타내고; h는 1, 2, 3 또는 4의 정수이고; Z는 수소, 불소, 하이드록실 및 아민기로 구성되는 군으로부터 선택되고; R 및 R'는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; L3는 식 (I)에서와 동일한 의미를 가지고; G는 수소, 할로겐, 하이드록실기, 메톡시기, 및 플루오로카본기로 구성되는 군으로부터 선택되고; W는 산소, 아미드, 에스테르 및 아민 (이차 또는 삼차 아민)으로부터 선택되고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다.
  46. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E'' 중 적어도 하나는 절단가능한 카르바메이트 분체, 및 동력학적 양성자화 분체 둘 다를 포함하고 및 식 (XI), 식 (XIa), 식 (XIb), 식 (XIc) 또는 식 (XId)에서 설정된 구조를 가지고, 이러한 화합물들의 약학적 허용염, 수화물, 용매화물 및 금속 킬레이트물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 포함하는, 방법;
    Figure pct00153

    식 (XI)

    상기식에서, L3 또는 L2는 각각 (I)에 따른 의미를 가지고, U는 없거나, -O-, 에스테르, 아미드, 및 이차 또는 삼차 아민로 구성되는 군으로부터 선택되고, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다;
    Figure pct00154
    식 (XIa)
    상기식에서 L3은 식 (I)에 따른 의미를 가지고, a, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R'', R'''는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다;
    Figure pct00155

    식 (XIb)
    상기식에서 L3은 식 (I)에 따른 의미를 가지고; a, b 및 d는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수를 나타내고; R'', R''', RIV은 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸을 나타내고; D는 식 (I)에서 정의된 바와 같은 약물이다;
    Figure pct00156

    식 (XIc)
    상기식에서 L3 및 D은 각각 식 (I)에서와 동일한 의미를 가진다;
    Figure pct00157

    식 (XId)
    상기식에서 L3 및 D는 각각 식 (I)에서와 동일한 의미를 가진다.
  47. 제4항에 있어서, E, E' 또는 E''는 각각 독립적으로 식 (I), (II); (VII), (VIIa); (VIIIa), (VIIIb), (VIIIc), (VIIId), (VIIIe), (VIIIf), (VIIIg), (VIIIh); (IX), (IXa), (IXb), (IXc), (IXd), (IXe), (IXf), (IXg), (IXh); (X), (Xa), (Xb), (Xc); (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) 중 임의의 식에서 설정된 구조를 가지고; 약물에 부착되어 있는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 약물은 siRNA, ASO 및 치료적 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된 거대분자인, 방법.
  49. 화합물 라이브러리로부터 IMEF-기질을 선택하는 방법으로서:
    (i) 플로레틴 (100-1000μM), 및/또는 6-KC (10-100μM)의 존재 하에서, 세포 또는 리포좀을 화합물 라이브러리로부터 IMEF-기질로 여겨지는 후보 화합물과 배양 처리하는 단계;
    (ii) 플로레틴 및/또는 6-KC의 존재 하에서 상기 후보 화합물이 막을 관통하여 상기 세포 또는 리포좀으로 흡수되는 수준을 측정하는 단계;
    (iii) 플로레틴 및/또는 6- KC (10-100μM)의 부재 하에서, 세포 또는 리포좀을 상기 후보 화합물과 배양처리하는 단계;
    (iv) 플로레틴 및/또는 6- KC의 부재 하에서 상기 후보 화합물이 막을 관통하여 상기 세포 또는 리포좀으로 흡수되는 수준을 측정하는 단계; 및
    (v) 플로레틴 및/또는 6- KC의 존재 및 부재 간의 상기 후보 화합물의 흡수 수준을 비교하는 단계를 포함하며; 플로레틴의 존재하에서 50 %가 넘는 흡수 감소; 또는 6-KC의 존재하에서 두 배가 넘는 흡수 증가는 상기 후보 화합물이 IMEF-기질인 것을 나타내는 방법.
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