KR101635689B1 - 제어 약물 전달을 위한 접합체 기재 시스템 - Google Patents

제어 약물 전달을 위한 접합체 기재 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물 및 제1 사카라이드를 포함하는 리간드를 포함하며, 포유동물에게 투여시에 하나 이상의 약동학 또는 약력학 특성이 제2 사카라이드의 혈청 농도에 민감성인 것을 특징으로 하는 접합체에 관한 것이다. 사용 방법 및 제제 이외에도 예시적인 접합체 및 지속 방출 제제가 제공된다.

Description

제어 약물 전달을 위한 접합체 기재 시스템 {CONJUGATE BASED SYSTEMS FOR CONTROLLED DRUG DELIVERY}
관련 출원
본 출원은 2009년 1월 28일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/147,878, 2009년 3월 12일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/159,643, 2009년 3월 20일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/162,107, 2009년 3월 25일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/163,084, 2009년 6월 24일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/219,897, 2009년 7월 7일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/223,572 및 2009년 10월 19일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/252,857을 우선권 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
선행 기술에 공지되어 있는 대다수의 "제어-방출" 약물 전달 시스템 (예를 들어, 효소적으로 불안정한 캡슐로부터의 약물 방출을 기재하고 있는 U.S. 특허 번호 4,145,410 (Sears))은 인간 신체 내에 존재하는 분자 인디케이터 (예를 들어, 대사물)의 양에 정비례하는 농도 및 간격으로 환자에게 약물을 제공할 수 있다. 따라서, 이들 선행 기술 시스템의 약물은 문자 그대로 "제어된" 것이지만, 외부 또는 내부 인자와는 독립적으로 단순히 서방성 포맷으로 제공되는 것이다.
주사가능한 인슐린을 사용하는 진성 당뇨병의 치료는 널리 공지되어 있으며, 비제어 서방성 인슐린이 바람직하지 않은 경우의 예가 연구되었다. 사실상, 호르몬의 단순한 대체는 이러한 질환과 관련된 병리학적 후유증을 방지하는데 충분하지 않다는 것이 명백하다. 이들 후유증의 발생은, 환자가 겪는 가변적인 혈액 글루코스 농도에 비례하는 외인성 인슐린을 제공할 수 없다는 것을 반영하는 것으로 여겨진다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 보다 생리학적인 인슐린 전달 시스템을 개발하기 위한 몇몇 생물학적 및 생체공학적 접근법이 제안되어 왔다 (예를 들어, U.S. 특허 번호 4,348,387 (Brownlee et al.); U.S. 특허 번호 5,830,506, 5,902,603 및 6,410,053 (Taylor et al.); 및 U.S. 특허 출원 간행물 번호 2004-0202719 (Zion et al.) 참조).
각각의 이들 시스템은 다가 글루코스 결합 분자 (예를 들어, 렉틴 Con A), 및 다가 글루코스 결합 분자에 의해 가역적으로 결합되는 당 기재 성분의 조합에 의존한다. 불행하게도, Con A 및 수많은 다른 쉽게 이용가능한 렉틴은 림프구 증식을 자극하는 잠재력을 갖는다. 특정 유형의 림프구의 표면 상의 탄수화물 수용체에 결합함으로써, 이러한 소위 "분열촉진" 렉틴은 잠재적으로 림프구의 유사분열을 유도하여, 이들의 증식을 유발할 수 있다. Con A를 비롯한 대부분의 분열촉진 렉틴은 선택적 T-세포 미토겐이다. 소수의 렉틴은 덜 선택적이며, T-세포 및 B-세포를 둘 다 자극한다. 분열촉진 렉틴에 대한 생체내 국부 또는 전신 노출은 염증, 세포독성, 대식세포 소화 및 알레르기 반응 (아나필락시스 포함)을 일으킬 수 있다. 또한, 식물 렉틴은 특히 면역원성으로써, 높은 역가의 항-렉틴 특이적 항체의 생성을 일으키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 고도의 주의로 분열촉진 렉틴의 방출을 막지 않는 한, 분열촉진 렉틴이 생체내 방법 및 장치에 그의 천연 그대로의 형태로 사용될 수 없음을 인지할 것이다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,830,506 (Taylor)에서는 Con A의 사용과 관련된 독성 위험을 강조하고, 약물 전달 장치 (글루코스 및 인슐린 분자가 장치 내외로 자유롭게 퍼지도록 하는 것을 또한 필요로 함) 내에 Con A를 함유하는 것의 중요성 및 어려움을 강조한다.
렉틴을 필요로 하지 않는 대안적 제어 약물 전달 시스템을 제공할 수 있다면 렉틴의 이러한 및 다른 생체내 사용과 관련된 위험 및 어려움은 유의하게 감소될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 사카라이드, 예컨대 글루코스의 전신 농도에 반응하는 방식으로 약물, 예컨대 인슐린의 약동학 (PK) 및/또는 약력학 (PD) 프로파일을 조절하는 방법을 제공한다. 실시예에서 논의되는 바와 같이, 상기 방법은, 특정 인슐린-접합체가 고 친화성 사카라이드 리간드를 포함하도록 변형되는 경우에, 심지어 외인성 다가 사카라이드-결합 분자, 예컨대 Con A의 부재하에서도 사카라이드 농도 변화에 반응하는 PK/PD 프로파일을 나타내도록 할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 이러한 발견은 예상치 못한 것이었고, 단순한 렉틴-무함유 사카라이드-반응성 약물 시스템을 생성하기 위한 전례없는 기회를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 예시적인 접합체 및 그의 제조 방법을 제공한다. 일반적으로, 이들 접합체는 약물, 및 각각 사카라이드를 포함하는 1개 이상의 별개의 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 내인성 사카라이드-결합 분자에 결합하기 위해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드는 Con A에 결합하기 위해 글루코스 또는 만노스와 경쟁할 수 있다. 하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 특정 실시양태에서, 리간드 및 약물은 접합체 프레임워크에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부탁될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프레임워크는 비-중합체성이다. 특정 실시양태에서, 접합체는 1의 다분산 지수 및 약 20,000 Da 미만의 MW를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 장시간 작용한다 (즉, 가용성 재조합 인간 인슐린 또는 RHI보다 지속적인 PK 프로파일을 나타냄).
하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본원에 기재된 방법, 접합체 및 제제가 인슐린의 전달을 조금도 제한하지 않으며 이들이 임의의 약물을 전달하는데 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 상기 방법이 글루코스 이외의 사카라이드에 반응하여 약물을 전달하는데 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 특히, 실시예에 논의되는 바와 같이, 예시적인 접합체는 외인성 사카라이드, 예컨대 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스에 반응하는 것으로 나타났다. 특정 실시양태에서, 이는 이들 외인성 사카라이드 중 하나의 투여에 의해 제어될 수 있는 (즉, 내인성 글루코스의 변동에 의해 제어되는 것 대신에 또는 그에 더하여) 접합체를 제조하는데 이용될 수 있다.
<정의>
명세서 전반에 걸쳐 사용된 특정 관능기, 화학적 용어 및 일반적 용어의 정의가 하기에 보다 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 화학 원소는 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.]의 표지 안쪽의 원소 주기율표 (CAS 버전)에 따라 확인하며, 특정 관능기는 일반적으로 거기에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가로, 유기 화학의 일반적 원리, 뿐만 아니라 특정 관능 잔기 및 반응성은 문헌 [Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999]; [Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001]; [Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989]; [Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다.
아실 - 본원에 사용된 용어 "아실"은 일반 화학식 -C(=O)RX1, -C(=O)ORX1, -C(=O)-O-C(=O)RX1, -C(=O)SRX1, -C(=O)N(RX1)2, -C(=S)RX1, -C(=S)N(RX1)2 및 -C(=S)S(RX1), -C(=NRX1)RX1, -C(=NRX1)ORX1, -C(=NRX1)SRX1 및 -C(=NRX1)N(RX1)2를 갖는 기를 지칭하고, 여기서 RX1은 수소; 할로겐; 치환 또는 비치환된 히드록실; 치환 또는 비치환된 티올; 치환 또는 비치환된 아미노; 치환 또는 비치환된 아실; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 알킬; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 알케닐; 치환 또는 비치환된 알키닐, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 모노- 또는 디- 지방족아미노, 모노- 또는 디- 헤테로지방족아미노, 모노- 또는 디- 알킬아미노, 모노- 또는 디- 헤테로알킬아미노, 모노- 또는 디- 아릴아미노, 또는 모노- 또는 디- 헤테로아릴아미노이거나; 또는 2개의 RX1 기는 함께 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 예시적인 아실 기에는 알데히드 (-CHO), 카르복실산 (-CO2H), 케톤, 아실 할라이드, 에스테르, 아미드, 이민, 카르보네이트, 카르바메이트 및 우레아가 포함된다. 아실 치환기에는 본원에 기재된 임의의 치환기가 포함되며 (이에 제한되지는 않음), 이는 안정한 잔기 (예를 들어, 각각이 추가로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 지방족, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로지방족, 헤테로시클릭, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 옥소, 이미노, 티오옥소, 시아노, 이소시아노, 아미노, 아지도, 니트로, 히드록실, 티올, 할로, 지방족아미노, 헤테로지방족아미노, 알킬아미노, 헤테로알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 알킬아릴, 아릴알킬, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 아실옥시 등)의 형성을 초래한다.
지방족 - 본원에 사용된 용어 "지방족" 또는 "지방족 기"는 직쇄 (즉, 비분지형), 분지형 또는 시클릭 ("카르보시클릭")일 수 있고, 완전히 포화될 수 있거나, 또는 하나 이상의 단위의 불포화를 포함할 수 있지만 방향족이 아닌 임의로 치환된 탄화수소 잔기를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 지방족 기는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 지방족 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 지방족 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고, 또 다른 실시양태에서 지방족 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 적합한 지방족 기에는 선형 또는 분지형, 알킬, 알케닐 및 알키닐 기, 및 그의 하이브리드, 예컨대 (시클로알킬)알킬, (시클로알케닐)알킬 또는 (시클로알킬)알케닐이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
알케닐 - 본원에 사용된 용어 "알케닐"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 지방족 잔기로부터 유도된 임의로 치환된 1가 기를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알케닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알케닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알케닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사용된 알케닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 알케닐 기에는, 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일 등이 포함된다.
알킬 - 본원에 사용된 용어 "알킬"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 잔기로부터 유도된 임의로 치환된 포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사용된 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소를 포함한다. 알킬 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, sec-펜틸, 이소-펜틸, tert-부틸, n-펜틸, 네오펜틸, n-헥실, sec-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-데실, n-운데실, 도데실 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
알키닐 - 본원에 사용된 용어 "알키닐"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 지방족 잔기로부터 유도된 임의로 치환된 1가 기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알키닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알키닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알키닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사용된 알키닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적 알키닐 기에는 에티닐, 2-프로피닐 (프로파르길), 1-프로피닐 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
아릴 - 본원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 잔기의 일부로서 ("아르알킬", "아르알콕시" 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이) 사용된 용어 "아릴"은 총 5 내지 10개의 고리 구성원을 갖는 임의로 치환된 모노시클릭 및 비시클릭 고리계를 지칭하며, 여기서 계 내의 하나 이상의 고리는 방향족이고, 계 내의 각각의 고리는 3 내지 7개의 고리 구성원을 함유한다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, "아릴"은 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라실 등을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 방향족 고리계를 지칭하며, 이는 1개 이상의 치환기를 가질 수 있다.
아릴알킬 - 본원에 사용된 용어 "아릴알킬"은 아릴 기 (예를 들어, 방향족 또는 헤테로방향족 기)로 치환된 알킬 기를 지칭한다.
2가 탄화수소 쇄 - 본원에 사용된 용어 "2가 탄화수소 쇄" (또한 "2가 알킬렌 기"로 지칭됨)는, 폴리메틸렌 기, 즉 -(CH2)z-이고, 여기서 z는 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 12, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 또는 2 내지 3의 양의 정수이다. 치환된 2가 탄화수소 쇄는 하나 이상의 메틸렌 수소 원자가 치환기로 대체된 폴리메틸렌 기이다. 적합한 치환기에는 치환된 지방족 기에 대해 하기 기재된 것들이 포함된다.
카르보닐 - 본원에 사용된 용어 "카르보닐"은 탄소-산소 이중 결합을 함유하는 1가 또는 2가 잔기를 지칭한다. 카르보닐 기의 비제한적 예에는 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할라이드, 무수물, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 티오에스테르, 락톤, 락탐, 히드록사메이트, 이소시아네이트 및 클로로포르메이트가 포함된다.
시클로지방족 - 본원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 잔기의 일부로서 사용된 용어 "시클로지방족", "카르보사이클" 또는 "카르보시클릭"은 3 내지 10개의 구성원을 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 임의로 치환된 포화 또는 부분 불포화 시클릭 지방족 모노시클릭 또는 비시클릭 고리계를 지칭한다. 시클로지방족 기에는 비제한적으로 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로헵테닐, 시클로옥틸, 시클로옥테닐 및 시클로옥타디에닐이 포함된다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬은 3 내지 6개의 탄소를 갖는다.
할로겐 - 본원에 사용된 용어 "할로" 및 "할로겐"은 불소 (플루오로, -F), 염소 (클로로, -Cl), 브롬 (브로모, -Br) 및 요오드 (요오도, -I)로부터 선택된 원자를 지칭한다.
헤테로지방족 - 본원에 사용된 용어 "헤테로지방족" 또는 "헤테로지방족 기"는 탄소 원자 뿐만 아니라 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는, 직쇄 (즉, 비분지형), 분지형 또는 시클릭 ("헤테로시클릭")일 수 있고, 완전히 포화될 수 있거나, 또는 하나 이상의 단위의 불포화를 함유할 수 있지만 방향족이 아닌 임의로 치환된 탄화수소 잔기를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 헤테로지방족 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하며, 여기서 1 내지 3개의 탄소 원자가 임의로 및 독립적으로 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된다. 일부 실시양태에서, 헤테로지방족 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하며, 여기서 1 내지 2개의 탄소 원자가 임의로 및 독립적으로 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 헤테로지방족 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유하며, 여기서 1개의 탄소 원자가 임의로 및 독립적으로 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자로 대체된다. 적합한 헤테로지방족 기에는 선형 또는 분지형, 헤테로알킬, 헤테로알케닐 및 헤테로알키닐 기가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
헤테로아르알킬 - 본원에 사용된 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
헤테로아릴 - 본원에 사용된 바와 같이, 단독으로 또는 더 큰 잔기의 일부로서 (예를 들어, "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아르알콕시") 사용된 용어 "헤테로아릴"은 5 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 5, 6 또는 9개의 고리 원자를 가지며, 고리 배열 내에 공유하는 6, 10 또는 14개의 π 전자를 가지며, 탄소 원자 뿐만 아니라 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 기를 지칭한다. 헤테로아릴 기에는 비제한적으로, 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐이 포함된다. 본원에 사용된 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 또한 헤테로방향족 고리가 하나 이상의 아릴, 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리에 융합되고, 여기서 라디칼 또는 부착 지점이 헤테로방향족 고리에 있는 기를 포함한다. 비 제한적인 예에는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 디벤조푸라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리지닐, 카르바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라히드로퀴놀리닐 및 테트라히드로이소퀴놀리닐이 포함된다. 헤테로아릴 기는 모노- 또는 비시클릭일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어 "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴 기" 또는 "헤테로방향족"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이들 중 임의의 용어는 임의로 치환된 고리를 포함한다.
헤테로원자 - 본원에 사용된 용어 "헤테로원자"는 질소, 산소 또는 황을 지칭하며, 질소 또는 황의 임의의 산화된 형태, 및 염기성 질소의 임의의 4급화된 형태를 포함한다. 용어 "질소"는 또한 치환된 질소를 포함한다.
헤테로시클릭 - 본원에 사용된 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릭 라디칼" 및 "헤테로시클릭 고리"는 상호교환적으로 사용되고, 상기 정의된 바와 같이 포화 또는 부분 불포화이며 탄소 원자 뿐만 아니라 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 안정한 5- 내지 7-원 모노시클릭 또는 7- 내지 10-원 비시클릭 헤테로시클릭 잔기를 지칭한다. 헤테로시클릭 고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그의 펜던트 기에 부착되어 안정한 구조를 생성할 수 있고, 임의의 고리 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로시클릭 라디칼의 예에는 비제한적으로, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐 및 퀴누클리디닐이 포함된다. 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릴 고리", "헤테로시클릭 기", "헤테로시클릭 잔기" 및 "헤테로시클릭 라디칼"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 또한 헤테로시클릴 고리가 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴 또는 카르보시클릭 고리에 융합된 기, 예컨대 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라히드로퀴놀리닐 (여기서, 라디칼 또는 부착 지점은 헤테로시클릴 고리 상에 있음)을 포함한다. 헤테로시클릴 기는 모노- 또는 비시클릭일 수 있다. 용어 "헤테로시클릴알킬"은 헤테로시클릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로시클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
불포화 - 본원에 사용된 용어 "불포화"는 잔기가 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 갖는다는 것을 의미한다.
부분 불포화 - 본원에 사용된 용어 "부분 불포화"는 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 잔기를 지칭한다. 본원에 정의된 바와 같이, 용어 "부분 불포화"는 다중 부위의 불포화를 갖는 고리를 포함하도록 의도되지만, 아릴 또는 헤테로아릴 잔기를 포함하는 것으로 의도되지는 않는다.
임의로 치환된 - 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 "임의로 치환된" 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 용어 "치환된"은, 용어 "임의로"가 앞에 있든 없든, 지정된 잔기의 1개 이상의 수소가 적합한 치환기로 대체된다는 것을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, "임의로 치환된" 기는 기의 각각의 치환가능한 위치에 적합한 치환기를 가질 수 있고, 임의의 주어진 구조 내의 하나 초과의 위치가 특정 군으로부터 선택된 1개의 초과의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 의해 계획된 치환기의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 사용가능한 화합물의 형성을 일으키는 것이다. 본원에 사용된 용어 "안정한"은 그의 생성, 검출, 특정 실시양태에서는 그의 회수, 정제, 및 하나 이상의 본원에 개시된 목적을 위한 용도가 허용되는 조건에 적용시킬 경우에 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다.
"임의로 치환된" 기의 치환가능한 탄소 원자 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0-4R○; -(CH2)0-4OR○; -O-(CH2)0-4C(O)OR○; -(CH2)0-4CH(OR○)2; -(CH2)0-4SR○; R○로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4Ph; R○로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; R○로 치환될 수 있는 -CH=CHPh; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R○)2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)R○; -N(R○)C(S)R○; -(CH2)0-4N(R○)C(O)NR○ 2; -N(R○)C(S)NR○ 2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)OR○; -N(R○)N(R○)C(O)R○; -N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2; -N(R○)N(R○)C(O)OR○; -(CH2)0-4C(O)R○; -C(S)R○; -(CH2)0-4C(O)OR○; -(CH2)0-4C(O)SR○; -(CH2)0-4C(O)OSiR○ 3; -(CH2)0-4OC(O)R○; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR○; -(CH2)0-4SC(O)R○; -(CH2)0-4C(O)NR○ 2; -C(S)NR○ 2; -C(S)SR○; -SC(S)SR○; -(CH2)0-4OC(O)NR○ 2; -C(O)N(OR○)R○; -C(O)C(O)R○; -C(O)CH2C(O)R○; -C(NOR○)R○; -(CH2)0-4SSR○; -(CH2)0-4S(O)2R○; -(CH2)0-4S(O)2OR○; -(CH2)0-4OS(O)2R○; -S(O)2NR○ 2; -(CH2)0-4S(O)R○; -N(R○)S(O)2NR○ 2; -N(R○)S(O)2R○; -N(OR○)R○; -C(NH)NR○ 2; -P(O)2R○; -P(O)R○ 2; -OP(O)R○ 2; -OP(O)(OR○)2; SiR○ 3; -(C1 -4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)O-N(R○)2; 또는 -(C1 -4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)C(O)O-N(R○)2이고, 여기서 각각의 R○는 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있고, 독립적으로 수소, C1 -6 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이며, 또는 상기 정의와 같더라도 2개의 독립적인 경우의 R○는 이들의 개재 원자(들)과 함께 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 3 내지 12원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 모노- 또는 비시클릭 고리(하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있음)를 형성한다.
R○ (또는 2개의 독립적인 경우의 R○와 이들의 개재 원자에 의해 함께 형성된 고리)에 대한 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R●, -(할로R●), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR●, -(CH2)0-2CH(OR●)2; -O(할로R●), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R●, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR●, -(CH2)0-2SR●, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR●, -(CH2)0-2NR● 2, -NO2, -SiR● 3, -OSiR● 3, -C(O)SR●, -(C1 -4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)C(O)OR●, 또는 -SSR●이고, 여기서 각각의 R●는 비치환되거나, 또는 "할로"가 앞에 있는 경우에 1개 이상의 할로겐으로만 치환되고, C1 -4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 포화, 부분 포화, 또는 아릴 고리로부터 독립적으로 선택된다. R○의 포화 탄소 원자에 대해 적합한 2가 치환기에는 =O 및 =S가 포함된다.
"임의로 치환된" 기의 포화 탄소 원자에 대해 적합한 2가 치환기에는 =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O- 또는 -S(C(R* 2))2-3S-가 포함되며; 여기서 각각의 독립적인 경우의 R*은 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1 -6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5 내지 6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 선택된다. "임의로 치환된" 기의 인접 치환가능한 탄소에 결합된 적합한 2가 치환기에는 -O(CR* 2)2-3O-가 포함되며, 여기서 각각의 독립적인 경우의 R*이 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1 -6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5 내지 6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 선택된다.
R*의 지방족 기에 대해 적합한 치환기에는 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2가 포함되고, 여기서 각각의 R●는 비치환되거나, 또는 "할로"가 앞에 있는 경우에 1개 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1 -4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
"임의로 치환된" 기의 치환가능한 질소에 대해 적합한 치환기에는 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2 또는 -N(R†)S(O)2R†가 포함되고; 여기서 각각의 R†는 독립적으로 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1 -6 지방족, 비치환된 -Oph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 5 내지 6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이거나, 또는 상기 정의와 같더라도 2개의 독립적인 경우의 R†는 이들의 개재 원자(들)과 함께 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 3 내지 12원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 모노- 또는 비시클릭 고리를 형성한다.
R†의 지방족 기에 대해 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2 또는 -NO2이고, 여기서 각각의 R●는 비치환되거나, 또는 "할로"가 앞에 있는 경우 1개 이상의 할로겐으로만 치환되고, 독립적으로 C1 -4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
적합한 보호기 - 본원에 사용된 용어 "적합한 보호기"는 화합물 내의 그의 위치 따라 달라지는 아미노 보호기 또는 히드록실 보호기를 지칭하고, 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세히 기재되어 있는 것들을 포함한다.
적합한 아미노-보호기에는 메틸 카르바메이트, 에틸 카르바메이트, 9-플루오레닐메틸 카르바메이트 (Fmoc), 9-(2-술포)플루오레닐메틸 카르바메이트, 9-(2,7-디브로모)플루오로에닐메틸 카르바메이트, 2,7-디-t-부틸-[9-(10,10-디옥소-10,10,10,10-테트라히드로티옥산틸)]메틸 카르바메이트 (DBD-Tmoc), 4-메톡시페나실 카르바메이트 (Phenoc), 2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (Troc), 2-트리메틸실릴에틸 카르바메이트 (Teoc), 2-페닐에틸 카르바메이트 (hZ), 1-(1-아다만틸)-1-메틸에틸 카르바메이트 (Adpoc), 1,1-디메틸-2-할로에틸 카르바메이트, 1,1-디메틸-2,2-디브로모에틸 카르바메이트 (DB-t-BOC), 1,1-디메틸-2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (TCBOC), 1-메틸-1-(4-비페닐릴)에틸 카르바메이트 (Bpoc), 1-(3,5-디-t-부틸페닐)-1-메틸에틸 카르바메이트 (t-Bumeoc), 2-(2'- 및 4'-피리딜)에틸 카르바메이트 (Pyoc), 2-(N,N-디시클로헥실카르복스아미도)에틸 카르바메이트, t-부틸 카르바메이트 (BOC), 1-아다만틸 카르바메이트 (Adoc), 비닐 카르바메이트 (Voc), 알릴 카르바메이트 (Alloc), 1-이소프로필알릴 카르바메이트 (Ipaoc), 신나밀 카르바메이트 (Coc), 4-니트로신나밀 카르바메이트 (Noc), 8-퀴놀릴 카르바메이트, N-히드록시피페리디닐 카르바메이트, 알킬디티오 카르바메이트, 벤질 카르바메이트 (Cbz), p-메톡시벤질 카르바메이트 (Moz), p-니트로벤질 카르바메이트, p-브로모벤질 카르바메이트, p-클로로벤질 카르바메이트, 2,4-디클로로벤질 카르바메이트, 4-메틸술피닐벤질 카르바메이트 (Msz), 9-안트릴메틸 카르바메이트, 디페닐메틸 카르바메이트, 2-메틸티오에틸 카르바메이트, 2-메틸술포닐에틸 카르바메이트, 2-(p-톨루엔술포닐)에틸 카르바메이트, [2-(1,3-디티아닐)]메틸 카르바메이트 (Dmoc), 4-메틸티오페닐 카르바메이트 (Mtpc), 2,4-디메틸티오페닐 카르바메이트 (Bmpc), 2-포스포니오에틸 카르바메이트 (Peoc), 2-트리페닐포스포니오이소프로필 카르바메이트 (Ppoc), 1,1-디메틸-2-시아노에틸 카르바메이트, m-클로로-p-아실옥시벤질 카르바메이트, p-(디히드록시보릴)벤질 카르바메이트, 5-벤즈이속사졸릴메틸 카르바메이트, 2-(트리플루오로메틸)-6-크로모닐메틸 카르바메이트 (Tcroc), m-니트로페닐 카르바메이트, 3,5-디메톡시벤질 카르바메이트, o-니트로벤질 카르바메이트, 3,4-디메톡시-6-니트로벤질 카르바메이트, 페닐(o-니트로페닐)메틸 카르바메이트, 페노티아지닐-(10)-카르보닐 유도체, N'-p-톨루엔술포닐아미노카르보닐 유도체, N'-페닐아미노티오카르보닐 유도체, t-아밀 카르바메이트, S-벤질 티오카르바메이트, p-시아노벤질 카르바메이트, 시클로부틸 카르바메이트, 시클로헥실 카르바메이트, 시클로펜틸 카르바메이트, 시클로프로필메틸 카르바메이트, p-데실옥시벤질 카르바메이트, 2,2-디메톡시카르보닐비닐 카르바메이트, o-(N,N-디메틸카르복스아미도)벤질 카르바메이트, 1,1-디메틸-3-(N,N-디메틸카르복스아미도)프로필 카르바메이트, 1,1-디메틸프로피닐 카르바메이트, 디(2-피리딜)메틸 카르바메이트, 2-푸라닐메틸 카르바메이트, 2-요오도에틸 카르바메이트, 이소보르닐 카르바메이트, 이소부틸 카르바메이트, 이소니코티닐 카르바메이트, p-(p'-메톡시페닐아조)벤질 카르바메이트, 1-메틸시클로부틸 카르바메이트, 1-메틸시클로헥실 카르바메이트, 1-메틸-1-시클로프로필메틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(3,5-디메톡시페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(p-페닐아조페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-페닐에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(4-피리딜)에틸 카르바메이트, 페닐 카르바메이트, p-(페닐아조)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리-t-부틸페닐 카르바메이트, 4-(트리메틸암모늄)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리메틸벤질 카르바메이트, 포름아미드, 아세트아미드, 클로로아세트아미드, 트리클로로아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드, 페닐아세트아미드, 3-페닐프로판아미드, 피콜린아미드, 3-피리딜카르복스아미드, N-벤조일페닐알라닐 유도체, 벤즈아미드, p-페닐벤즈아미드, o-니트로페닐아세트아미드, o-니트로페녹시아세트아미드, 아세토아세트아미드, (N'-디티오벤질옥시카르보닐아미노)아세트아미드, 3-(p-히드록시페닐)프로판아미드, 3-(o-니트로페닐)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-니트로페녹시)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-페닐아조페녹시)프로판아미드, 4-클로로부탄아미드, 3-메틸-3-니트로부탄아미드, o-니트로신나미드, N-아세틸메티오닌 유도체, o-니트로벤즈아미드, o-(벤조일옥시메틸)벤즈아미드, 4,5-디페닐-3-옥사졸린-2-온, N-프탈이미드, N-디티아숙신이미드 (Dts), N-2,3-디페닐말레이미드, N-2,5-디메틸피롤, N-1,1,4,4-테트라메틸디실릴아자시클로펜탄 부가물 (STABASE), 5-치환된 1,3-디메틸-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 5-치환된 1,3-디벤질-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 1-치환된 3,5-디니트로-4-피리돈, N-메틸아민, N-알릴아민, N-[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸아민 (SEM), N-3-아세톡시프로필아민, N-(1-이소프로필-4-니트로-2-옥소-3-프롤린-3-일)아민, 4급 암모늄 염, N-벤질아민, N-디(4-메톡시페닐)메틸아민, N-5-디벤조수베릴아민, N-트리페닐메틸아민 (Tr), N-[(4-메톡시페닐)디페닐메틸]아민 (MMTr), N-9-페닐플루오레닐아민 (PhF), N-2,7-디클로로-9-플루오레닐메틸렌아민, N-페로세닐메틸아미노 (Fcm), N-2-피콜릴아미노 N'-옥시드, N-1,1-디메틸티오메틸렌아민, N-벤질리덴아민, N-p-메톡시벤질리덴아민, N-디페닐메틸렌아민, N-[(2-피리딜)메시틸]메틸렌아민, N-(N',N'-디메틸아미노메틸렌)아민, N,N'-이소프로필리덴디아민, N-p-니트로벤질리덴아민, N-살리실리덴아민, N-5-클로로살리실리덴아민, N-(5-클로로-2-히드록시페닐)페닐메틸렌아민, N-시클로헥실리덴아민, N-(5,5-디메틸-3-옥소-1-시클로헥세닐)아민, N-보란 유도체, N-디페닐보린산 유도체, N-[페닐(펜타카르보닐크로뮴- 또는 텅스텐)카르보닐]아민, N-구리 킬레이트, N-아연 킬레이트, N-니트로아민, N-니트로소아민, 아민 N-옥시드, 디페닐포스핀아미드 (Dpp), 디메틸티오포스핀아미드 (Mpt), 디페닐티오포스핀아미드 (Ppt), 디알킬 포스포르아미데이트, 디벤질 포스포르아미데이트, 디페닐 포스포르아미데이트, 벤젠술펜아미드, o-니트로벤젠술펜아미드 (Nps), 2,4-디니트로벤젠술펜아미드, 펜타클로로벤젠술펜아미드, 2-니트로-4-메톡시벤젠술펜아미드, 트리페닐메틸술펜아미드, 3-니트로피리딘술펜아미드 (Npys), p-톨루엔술폰아미드 (Ts), 벤젠술폰아미드, 2,3,6,-트리메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mtr), 2,4,6-트리메톡시벤젠술폰아미드 (Mtb), 2,6-디메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Pme), 2,3,5,6-테트라메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mte), 4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mbs), 2,4,6-트리메틸벤젠술폰아미드 (Mts), 2,6-디메톡시-4-메틸벤젠술폰아미드 (iMds), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술폰아미드 (Pmc), 메탄술폰아미드 (Ms), β-트리메틸실릴에탄술폰아미드 (SES), 9-안트라센술폰아미드, 4-(4',8'-디메톡시나프틸메틸)벤젠술폰아미드 (DNMBS), 벤질술폰아미드, 트리플루오로메틸술폰아미드 및 페나실술폰아미드가 포함된다.
적절한 히드록실 보호기에는 메틸, 메톡실메틸 (MOM), 메틸티오메틸 (MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 (SMOM), 벤질옥시메틸 (BOM), p-메톡시벤질옥시메틸 (PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸 (p-AOM), 구아야콜메틸 (GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸 (POM), 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 (SEMOR), 테트라히드로피라닐 (THP), 3-브로모테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 1-메톡시시클로헥실, 4-메톡시테트라히드로피라닐 (MTHP), 4-메톡시테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 S,S-디옥시드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일 (CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오푸라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤즈히드릴, 5-디벤조수베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모페나실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4"-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일)비스(4',4"-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티올란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴 (TMS), 트리에틸실릴 (TES), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 디메틸이소프로필실릴 (IPDMS), 디에틸이소프로필실릴 (DEIPS), 디메틸텍실실릴, t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), t-부틸디페닐실릴 (TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-크실릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴 (DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴 (TBMPS), 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트 (레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트 (레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트 (메시토에이트), 알킬 메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트 (Fmoc), 알킬 에틸 카르보네이트, 알킬 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트 (Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트 (TMSEC), 2-(페닐술포닐) 에틸 카르보네이트 (Psec), 2-(트리페닐포스포니오) 에틸 카르보네이트 (Peoc), 알킬 이소부틸 카르보네이트, 알킬 비닐 카르보네이트 알킬 알릴 카르보네이트, 알킬 p-니트로페닐 카르보네이트, 알킬 벤질 카르보네이트, 알킬 p-메톡시벤질 카르보네이트, 알킬 3,4-디메톡시벤질 카르보네이트, 알킬 o-니트로벤질 카르보네이트, 알킬 p-니트로벤질 카르보네이트, 알킬 S-벤질 티오카르보네이트, 4-에톡시-1-나프틸 카르보네이트, 메틸 디티오카르보네이트, 2-요오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀벤젠술포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시노에이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시카르보닐)벤조에이트, α-나프토에이트, 니트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카르바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티오일, 알킬 2,4-디니트로페닐술페네이트, 술페이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 벤질술포네이트 및 토실레이트 (Ts)가 포함된다. 1,2- 또는 1,3-디올을 보호하기 위한 보호기에는 메틸렌 아세탈, 에틸리덴 아세탈, 1-t-부틸에틸리덴 케탈, 1-페닐에틸리덴 케탈, (4-메톡시페닐)에틸리덴 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸리덴 아세탈, 아세토니드, 시클로펜틸리덴 케탈, 시클로헥실리덴 케탈, 시클로헵틸리덴 케탈, 벤질리덴 아세탈, p-메톡시벤질리덴 아세탈, 2,4-디메톡시벤질리덴 케탈, 3,4-디메톡시벤질리덴 아세탈, 2-니트로벤질리덴 아세탈, 메톡시메틸렌 아세탈, 에톡시메틸렌 아세탈, 디메톡시메틸렌 오르토 에스테르, 1-메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1-에톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1,2-디메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, α-메톡시벤질리덴 오르토 에스테르, 1-(N,N-디메틸아미노)에틸리덴 유도체, α-(N,N'-디메틸아미노)벤질리덴 유도체, 2-옥사시클로펜틸리덴 오르토 에스테르, 디-t-부틸실릴렌 기 (DTBS), 1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴) 유도체 (TIPDS), 테트라-t-부톡시디실록산-1,3-디일리덴 유도체 (TBDS), 시클릭 카르보네이트, 시클릭 보로네이트, 에틸 보로네이트 및 페닐 보로네이트가 포함된다.
화학 가변기 (예를 들어, R 기)가 고리의 결합을 가로지르는 결합에 부착된 것으로 나타나는 모든 경우에, 이는 1개 이상의 이러한 가변기가 교차 결합을 갖는 고리에 임의로 부착된 것을 의미한다. 이러한 고리 상의 각각의 R 기는 임의의 적합한 위치에 부착될 수 있고, 이는 일반적으로 상기 기가 모 고리 상의 수소 원자 대신에 부착된다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 여기에는 2개의 R 기가 동일한 고리 원자에 부착될 수 있는 가능성이 포함된다. 또한, 1개 초과의 R 기가 고리 상에 존재하는 경우, 각각은 그에 부착된 다른 R 기와 동일하거나 상이할 수 있고, 각각의 기는 이들이 동일한 식별자로 표시될 수 있더라도 동일한 분자 상의 어디에든 부착될 수 있는 다른 기와 독립적으로 정의된다.
생분해성 - 본원에 사용된 용어 "생분해성"은 생리학적 또는 엔도솜 조건하에 분해되는 (즉, 그의 공유 구조 중 적어도 일부를 잃음) 분자를 지칭한다. 생분해성 분자는 반드시 가수분해적으로 분해가능한 것은 아니며, 분해되기 위해 효소적 작용을 필요로 할 수 있다.
생체분자 - 본원에 사용된 용어 "생체분자"는 자연 발생되었든 인위적으로 생성되었든 (예를 들어, 합성 또는 재조합 방법에 의해) 간에 세포 및 조직에서 일반적으로 발견되는 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리사카라이드, 당, 지질, 핵단백질, 당단백질, 지단백질, 스테로이드, 대사물 등)를 지칭한다. 생체분자의 특정 클래스에는 효소, 수용체, 신경전달물질, 호르몬, 시토카인, 세포 반응 조절자, 예컨대 성장 인자 및 화학주성 인자, 항체, 백신, 합텐, 독소, 인터페론, 리보자임, 안티센스 작용제, 플라스미드, DNA 및 RNA가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
약물 - 본원에 사용된 용어 "약물"은 생물학적 사건을 변경하고, 억제하고, 활성화시키거나, 다르게는 그에 영향을 미치는 소분자 또는 생체분자를 지칭한다. 예를 들어, 약물은 항-AIDS 물질, 항암 물질, 항생제, 항당뇨병 물질, 면역억제제, 항-바이러스성 물질, 효소 억제제, 신경독소, 오피오이드, 수면제, 항-히스타민, 윤활제, 신경안정제, 항-경련제, 근이완제 및 항-파킨슨 물질, 항-연축제 및 근육 수축제, 예를 들어 채널 차단제, 축동제 및 항-콜린제, 항-녹내장 화합물, 항-기생충 및/또는 항-원충성 화합물, 세포-세포외 매트릭스 상호작용의 조절제, 예를 들어 세포 성장 억제제 및 항-유착 분자, 혈관확장제, DNA, RNA 또는 단백질 합성의 억제제, 항-고혈압제, 진통제, 항-발열제, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제, 항혈관신생 인자, 항-분비 인자, 항응고제 및/또는 항-혈전성 작용제, 국소 마취제, 안약, 프로스타글란딘, 항우울제, 항-정신병 물질, 항-구토제 및 영상화제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 약물의 보다 완전한 목록은 문헌 ["Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999]; [the "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996] 및 [the United States Pharmacopeia-25/National Formulary-20, published by the United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville MD, 2001]에서 찾아볼 수 있다.
외인성 - 본원에 사용된 바와 같이, "외인성" 분자는 환자에게 투여되지 않는 한, 환자 내에서 유의한 수준으로 존재하지 않는 것이다. 특정 실시양태에서, 환자는 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 래트, 미니돼지 등이다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자는 환자에 대한 정상 혈청이 0.1 mM 미만의 분자를 포함하는 경우에 상기 유형의 환자에서 유의한 수준으로 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, 환자에 대한 정상 혈청은 0.08 mM 미만, 0.06 mM 미만, 또는 0.04 mM 미만의 분자를 포함할 수 있다.
초분지형 - 본원에 사용된 바와 같이, "초분지형" 구조는 하나 이상의 분지형 분지를 포함하는 공유 구조 (예를 들어, 덴드리머 구조)이다. 초분지형 구조는 중합체 및/또는 비-중합체 하위구조를 포함할 수 있다.
정상 혈청 - 본원에 사용된 바와 같이, "정상 혈청"은 5명 이상의 비-당뇨병 환자로부터의 응고된 전혈의 액체 부분의 대략 동등한 양을 수집하여 얻은 혈청이다. 비-당뇨병 인간 환자는 혈액 채취 시점에 어떠한 당뇨병 증상도 나타내지 않은 무작위로 선택된 18 내지 30세 연령이다.
중합체 - 본원에 사용된 바와 같이, "중합체" 또는 "중합체 구조"는 일련의 공유 결합 단량체를 포함하는 구조이다. 중합체는 한가지 유형의 단량체 또는 한가지 초과의 유형의 단량체로부터 만들어질 수 있다. 따라서, 용어 "중합체"는 다양한 유형의 단량체가 전체 중합체 내에서 개별적으로 배치되는 블록-공중합체를 비롯한 공중합체를 포함한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 - 본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체이다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 중합체는 천연 뉴클레오시드 (즉 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시 시티딘), 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 디히드로우리딘, 메틸슈도우리딘, 1-메틸 아데노신, 1-메틸 구아노신, N6-메틸 아데노신 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아라비노스 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 - 본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체이다. 용어 "폴리펩티드", "단백질", "올리고펩티드" 및 "펩티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
폴리펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 (즉, 자연에서 발생하지 않지만 폴리펩티드 쇄로 도입될 수 있는 화합물) 및/또는 당업계에 공지된 바와 같은 아미노산 유사체를 함유할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 중 하나 이상은, 예를 들어 화학 물질, 예컨대 탄수화물 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합, 관능화 또는 다른 변형을 위한 링커 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 펩티드의 고리화, D-아미노산의 도입 등을 포함할 수 있다.
폴리사카라이드 - 본원에 사용된 바와 같이, "폴리사카라이드"는 사카라이드의 중합체이다. 용어 "폴리사카라이드", "탄수화물" 및 "올리고사카라이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 중합체는 천연 사카라이드 (예를 들어, 아라비노스, 릭소스, 리보스, 크실로스, 리불로스, 크실룰로스, 알로스, 알트로스, 갈락토스, 글루코스, 굴로스, 이도스, 만노스, 탈로스, 프룩토스, 프시코스, 소르보스, 타가토스, 만노헵툴로스, 세도헵툴로스, 옥톨로스 및 시알로스) 및/또는 변형 사카라이드 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 2'-데옥시리보스 및 헥소스)를 포함할 수 있다. 예시적인 디사카라이드에는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 겐티오비오스, 이소말토스, 코지비오스, 라미나리비오스, 만노비오스, 멜리비오스, 니게로스, 루티노스 및 크실로비오스가 포함된다.
소분자 - 본원에 사용된 용어 "소분자"는 자연 발생되었든 인위적으로 생성되었든 (예를 들어, 화학적 합성을 통해) 간에 상대적으로 낮은 분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 소분자는 단량체이고, 약 1500 Da 미만의 분자량을 갖는다. 바람직한 소분자는 그것이 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 국부 또는 전신 효과를 생성시킨다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 소분자는 약물이다. 바람직하게는 (반드시 그러하지는 않음), 약물은 적절한 정부 기관 또는 기구에 의해 사용하기에 안전하고 효과적이라고 이미 간주된 것이다. 예를 들어, 인간 용도를 위한 약물이 FDA에 의해 21 C.F.R. §§ 330.5, 331-361 및 440-460하에 열거되어 있고; 수의학적 용도를 위한 약물이 FDA에 의해 21 C.F.R. §§ 500-589하에 열거되어 있다 (이들 모두는 본 발명에 따른 용도에 허용되는 것으로 간주함).
치료하다 - 본원에 사용된 용어 "치료하다" (또는 "치료하는", "치료된", "치료" 등)는 치료가 필요한 대상체에게 본 개시내용의 접합체를, 상태 (예를 들어, 당뇨병), 상태의 증상 또는 증상들 (예를 들어, 고혈당), 또는 상태에 대한 질병소질을 완화, 경감, 변경, 개선, 증진시키거나, 또는 그에 영향을 미치기 위한 목적으로 투여하는 것을 지칭한다.
본 개시내용은 사카라이드, 예컨대 글루코스의 전신 농도에 반응하는 방식으로 약물, 예컨대 인슐린의 약동학 (PK) 및/또는 약력학 (PD) 프로파일을 조절하는 방법을 제공한다.
도 1: (a) 스캐폴드로서의 TSAT-C6, 리간드로서의 AEM 및 약물로서의 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (접합체 I-1)을 사용하여 합성한 예시적인 접합체, 및 (b) 실시예 32에 따라 합성한 인슐린-글리코겐 접합체에 대해 얻은 RP-HPLC 크로마토그램 사이의 비교.
도 2: PBS 완충제 중에서의 접합체 I-1 (□), 접합체 I-16 (△) 및 RHI (◆)에 대한 가속 안정성 시험 (AST) 응집 검정. 접합체는 제약 등급 RHI에 비해서 매우 개선된 안정성을 입증한다.
도 3: 가속 안정성 시험 (AST) 화학 안정성 결과: (a) RP-HPLC AST 접합체 안정성 및 (b) AST 접합체에 대한 LC/MS 데이터.
도 4: 새로운 접합체 (▲) 및 72 hr AST 접합체 (○)에 대한 (n=4) 비-당뇨병의 수컷 스프라그-돌리 (SD) 래트에서의 생체내 생물활성. 72 hr AST 접합체 생물활성은 새로운 접합체의 생물활성과 구별할 수 없었다 (모든 시점에 대해 p > 0.21).
도 5: 약 20 U의 인슐린 당량/kg의 용량으로 피하 주사된 (▲) 인슐린-덱스트란 (70 K)에 대한 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 프로파일.
도 6: 약 2.5 U의 인슐린 당량/kg의 용량으로 피하 주사된 (■) 인슐린-글리코겐 (유형 II 오이스터(oyster))에 대한 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 프로파일.
도 7: 수컷 비-당뇨병 SD 래트에서의 (◆) TSAT-C6-AEM-2 인슐린 접합체 I-1 및 (□) 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)의 3.5 U 당량 인슐린/kg 피하 용량으로부터 생성된 혈액 글루코스 수준. 각각의 세트의 데이터는 n = 6 래트에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 8: 수컷 비-당뇨병 SD 래트에서의 (◆) TSAT-C6-AEM-2 인슐린 접합체 I-1 및 (□) 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)의 3.5 U 당량 인슐린/kg 피하 용량으로부터 생성된 혈청 인슐린 농도. 각각의 세트의 데이터는 n = 6 래트에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 9: 시간 0에 TSAT-C6-AEM-2 (B29-치환된) 인슐린 접합체 I-7 (5 U/kg)을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트에 피하 주사한 후의 (◆) 혈청 인슐린 및 (○) 혈액 글루코스 수준의 플롯. 데이터는 n = 3 래트에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 10: AEG, AEM, AEBM 및 AETM의 화학 구조. 이들 사카라이드 기재의 리간드의 Con A에 대한 친화성은 나타낸 바와 같이 증가한다.
도 11: 일부 예시적인 비-덴드리머 접합체 중간체의 화학 구조. 사카라이드를 포함하는 예시적인 접합체 리간드를 또한 예시 목적을 위해 나타내었다 (AEG, AEM, AEBM, AETM, AEGA 및 AEF).
도 12: 시간 0에 TSAT-C6-AEM-2 인슐린 접합체 I-1 (◆), 가용성 재조합 인간 인슐린 (○) 및 인슐린 리스프로 (△) (모두 3.5 U/kg)를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 (좌측) 및 혈액 글루코스 (우측) 수준의 플롯. 데이터는 n = 6 래트에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 13: 시간 0에 나타낸 바와 같이 상이한 리간드를 갖는 TSAT-C6 기재 인슐린 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (각각의 제제에 대해 n=3)에 피하 주사한 후의 혈액 글루코스 수준의 플롯. 리간드의 친화성이 증가할수록 글루코스 저하 반응이 감소되었다.
도 14: 시간 0에 TSAT-C6-AEM-2 접합체 I-1 (3.5 U/kg)을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 (좌측) 및 혈액 글루코스 (우측) 수준의 플롯.
도 15: 시간 0에 TSAT-C6-AEBM-2 I-3 접합체 (5 U/kg)를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 (좌측) 및 혈액 글루코스 (우측) 수준의 플롯.
도 16: 시간 0에 TSAT-C6-AEBM-1 AETM-1 접합체 I-4 (5 U/kg)를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 (좌측) 및 혈액 글루코스 (우측) 수준의 플롯.
도 17: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2 (5 U/kg)를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 (좌측) 및 혈액 글루코스 (우측) 수준의 플롯.
도 18: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AETM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 매우 유의하였다 (p<0.05).
도 19: 시간 0에 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일에 변화가 없었다 (p>>0.05).
도 20: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2 를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (각각의 실험에 대해 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (◆), L-푸코스 (■) 또는 염수 (▲)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 수준의 플롯. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스는 동일한 종류의 효과를 나타내는 것으로 보여졌다.
도 21: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 글루코스 (◆), 갈락토스 (■) 또는 염수 (▲)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 수준의 플롯. 나타낸 바와 같이, 갈락토스는 염수와 비교하여 아무런 효과를 나타내지 않았다. 글루코스는 작은 효과를 나타내는 것으로 보여졌으나; 이는 접합체로부터의 외인성 인슐린이 글루코스를 급속히 낮추는 현상에 복합된 것이며, 따라서 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스에서 관찰된 지속 효과가 발생한 것은 아니었다.
도 22: 시간 0에 (a) 1M 알파-메틸 만노스를 함유하는 완충 염수 또는 (b) 완충 염수 중에 용해된 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2 용액 (5 U/kg)을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. (a)에서, 후속으로 래트에게 15분에, 접합체 용액을 위해 이용된 부위와 다른 피하 부위에 (b)에 사용된 염수 용액과 동일한 부피로 주사하였다. (b)에서, 후속으로 래트에게 15분에, 접합체 용액을 위해 이용된 부위와 다른 피하 부위에 (a)에 사용된 1M 알파-메틸 만노스 용액과 동일한 부피로 주사하였다. 나타낸 바와 같이, 실험 (b)와 비교하여 실험 (a)에서, 혈청 인슐린 수준은 증가하지 않았고, 혈액 글루코스 수준은 감소하지 않았다.
도 23: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2 용액 (5 U/kg)을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 접합체를 주사하고 15분, 60분, 120분 또는 240분 후에, 래트에게 a-MM을 주사하였다 (4g/kg, 복강내).
도 24: 시간 0에 TSAT-C6-AEM-2 접합체 I-7을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AEM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 매우 유의하였다 (p<0.05).
도 25: 시간 0에 TSAT-C6-GA-2 접합체 I-5를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AEM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 유의하지 않았다.
도 26: 시간 0에 DSS-C6-AEM-1 접합체 I-8을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AEM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 유의하지 않았다.
도 27: 시간 0에 TSPE-AEM-3 접합체 I-9를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AEM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 유의하였다 (p<0.05).
도 28: 시간 0에 DSS-AETM-1 접합체 I-10을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AEM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 유의하였다 (p<0.05).
도 29: 시간 0에 TSPE-AETM-3 접합체 I-11을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 피하 주사하고, 이어서 15분 후에 알파-메틸 만노스 (좌측) 또는 염수 (우측)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 및 혈액 글루코스 수준의 플롯. 알파-메틸 만노스는 렉틴, 예컨대 Con A에 결합하기 위해 AEM과 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성 사카라이드이다. 나타낸 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로부터 생성된 PK/PD 프로파일의 변화는 유의하였다 (p<0.05).
도 30: 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (군 당 n=3)로의 (◆) RHI 및 (▲) TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-6의 0.4 mg/kg 정맥내 주사에 대한 시간의 함수로서의 혈청 인슐린 농도의 플롯. 데이터 (n=3의 평균)는 2-구획 이중-지수 모델을 이용하여 적합화하였다. TSAT-C6-AETM-2 접합체는 RHI보다 훨씬 빠르게 혈청으로부터 제거되었다.
도 31: 시간 0에 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 제제는 실시예 51에 기재된 바와 같이 제조하였다: (a) 1xP-1xZ, (b) 4xP-4xZ 및 (c) 10xP-4xZ.
도 32: 시간 0에 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 제제는 실시예 52에 기재된 바와 같이 제조하였다: (a) 4xP-1xZ 및 (b) 4xP-2xZ.
도 33: 시간 0에 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 제제는 실시예 52에 기재된 바와 같이 제조하였다: (a) 10xP-1xZ 및 (b) 10xP-2xZ.
도 34: 시간 0에 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 제제는 실시예 53에 기재된 바와 같이 제조하였다: (a) 크레졸 무함유 및 (b) 4x 크레졸.
도 35: 시간 0에 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 제제는 실시예 54에 기재된 바와 같이 제조하였다: (a) 염 무함유, (b) 3.3x 염 및 (c) 글리세롤.
도 36: 시간 0에 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 접합체를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 증가하는 양의 비변형 인슐린을 함유하는 제제를 실시예 55에 기재된 바와 같이 제조하였다: (a) 1/24, (b) 1/12 및 (c) 1/6.
도 37: 시간 0에 실시예 56에 따라 제조한 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-6을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯.
도 38: 시간 0에 실시예 57에 따라 제조한 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-6을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 물질을 2 내지 8 ℃에서 (a) 1주 또는 (b) 2주 동안 보관한 후에 주사하였다.
도 39: 시간 0에 실시예 57에 따라 제조한 장시간-작용 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-6을 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 물질을 실온에서 (a) 1주 또는 (b) 2주 동안 보관한 후에 주사하였다.
도 40: 시간 0에 실시예 58에 따라 제조한 장시간-작용 접합체 제제를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240 분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 접합체는 DSS-AEM-1 (I-8), DSS-AETM-1 (I-10), TSAT-C6-AEM-2 (I-7), C6-아미드-AEM-2 (I-17), TSPE-AEM-3 (I-9) 및 TSPE-AETM-3 (I-11)이었다.
도 41: 시간 0에 실시예 59에 따라 제조한 장시간-작용 접합체 제제를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240 분에 알파-메틸 만노스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯. 접합체는 (a) TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 및 (b) TSAT-C6-GA-2였다.
도 42: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 (B29-치환, PZI) 접합체 I-6을 비-당뇨병 (정상) 및 당뇨병 (DM's) 수컷 SD 래트에 피하 주사한 후의 혈액 글루코스 수준의 플롯. 접합체는 5, 10 및 20 U/kg으로 투여하였다. 나타낸 바와 같이, 당뇨병 수컷 SD 래트의 글루코스 수준은 최고 용량에서 8 시간에 걸쳐 지속된 명백한 용량 비례 반응을 나타낸 반면에, 비-당뇨병 수컷 SD 래트는 어떠한 저혈당도 나타내지 않았다.
도 43: 시간 0에 TSAT-C6-AETM-2 (B29-치환, PZI) 접합체 I-6을 비-당뇨병 (정상) 및 당뇨병 (DM's) 수컷 SD 래트에 피하 주사한 후의 24 시간에 걸친 혈액 글루코스 수준의 플롯. 접합체는 7, 14 및 28 U/kg으로 투여하였다.
도 44: 시간 0에 실시예 67에 따라 제조한 장시간-작용 접합체 I-17 제제를 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (용량 당 n=3)에 피하 주사하고, 이어서 240분에 글루코스 (4 g/kg)를 복강내 주사한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯.
도 45: 예시적인 인슐린-접합체의 구조. 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 이들 접합체는 각각 재조합 야생형 인간 인슐린을 사용하여 제조하였다 (야생형 인간 인슐린의 구조에 대해 도 63 참조). 따라서, 도 45에 나타낸 타원형 내부의 기호 "인슐린"은 우선적으로 야생형 인간 인슐린을 나타내는 것으로 의도된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용이 또한 특히 이들 버전의 접합체, 및 야생형 인간 인슐린 이외의 인슐린 분자를 포함하는 다른 접합체를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
도 46: 접합체 I-6 또는 RHI (좌측), 및 접합체 I-6 (글루코스 또는 α-메틸 만노스 없이 또는 그와 함께) (우측)의 주사 후의 시간의 함수로서의 혈청 인슐린 농도의 플롯.
도 47: 처음 두 패널은 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 RHI (3.5 mU/분) 또는 I-6 (15 mU/분)을 일정하게 정맥내 (i.v.) 주입함에 따른 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯을 나타낸다. 글루코스 (4 g/kg)의 복강내 주사는 240 분에 이루어졌다. 다음의 3개의 패널은 글루코스 (4, 2 또는 1 g/kg)의 복강내 주사가 240 분에 이루어진 경우, 비-당뇨병의 수컷 SD 래트 (n=3)에 RHI (3.5 mU/분) 또는 I-6 (15 mU/분)을 일정하게 정맥내 (i.v.) 주입한 후의 혈청 인슐린 (◆) 및 혈액 글루코스 (○) 수준의 플롯을 비교한다.
도 48: 접합체 (글루코스 또는 α-메틸 만노스 없이 또는 그와 함께)의 주사 후의 시간의 함수로서의 혈청 인슐린 농도의 플롯. 래트에게 당 용액을 t = -60 분에, 그리고 연구 전반에 걸쳐 정맥내 주입하였다. 각각의 접합체를 시간 0에 10 U/kg으로 정맥내 주사하고, 혈청 접합체 농도를 측정하였다.
도 49: 비-당뇨병 미니돼지 당-의존성 제거 반감기 연구에서 시험한 인슐린 접합체의 조성. 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 이들 접합체는 각각 재조합 야생형 인간 인슐린을 사용하여 제조하였다 (야생형 인간 인슐린의 구조에 대해 도 63 참조). 따라서, 도 49의 도식은 우선적으로 야생형 인간 인슐린을 나타내는 것으로 의도된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용이 또한 특히 이들 버전의 접합체, 및 야생형 인간 인슐린 이외의 인슐린 분자를 포함하는 다른 접합체를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
도 50: 비-당뇨병 미니돼지에서 글루코스, α-메틸 만노스 또는 염수 주입 중에 얻어진 β-기 제거 반감기.
도 51: 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병 수컷 유카탄(Yucatan) 미니돼지 (연구 당 n = 3)로의 0.1 U/kg 정맥내 (i.v.) 주사 후의 (a) 재조합 인간 인슐린 (RHI) 및 (b) 이치환-AETM-2 인슐린 접합체 II-2의 혈청 농도의 플롯. 각각의 실험에서, 동물에게 (◆) 정맥내 알파 메틸 만노스 (a-MM) 용액 (25% w/v, 80 ml/h의 일정한 속도로 주입)을 주입하거나, 또는 (▲) 아무 용액도 주입하지 않았다. 데이터를 2-구획 이중-지수 모델로부터 유도된 곡선을 이용하여 적합화하여 평균값으로서 플롯팅하였다.
도 52: (a) 정맥내 당 주입이 없는 조건 또는 (b) 정맥내 알파 메틸 만노스 (a-MM) 주입 (25% w/v, 80 ml/h의 일정한 속도로 주입) 조건하에 접합체를 0.1 U/kg으로 정맥내 주사한 후의 이중 혈관 접근 포트가 장착된 비-당뇨병 수컷 유카탄 미니돼지 (연구 당 n = 3)에서의 혈액 글루코스 저하 곡선. (■) RHI, (○) I-7, (◆) I-6, (▲) I-11 및 (●) II-2.
도 53: 시간 0에 가용성 이치환-AETM-2 인슐린 접합체 II-2를 0.25, 0.50 및 1.00 U/kg의 용량으로 피하 주사한 후의, 금식 조건 하의 (a,
Figure 112014006288597-pat00001
, 채워진 기호) 알록산-당뇨병 유카탄 미니돼지 (용량 당 n=3) 및 (b,
Figure 112014006288597-pat00002
, 속이 빈 기호) 비-당뇨병 유카탄 미니돼지 (용량 당 n=3)에서의 혈액 글루코스 수준. 데이터를 평균 값 ± 1의 표준 편차로서 플롯팅하였다. 비고: 명료성을 위하여 도 53(b)에서 스케일을 확대하였다.
도 54: 시간 0에 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)을 (▲,△) 0.063 및 (■,□) 0.125 U/kg의 용량으로 피하 주사한 후의, 금식 조건 하의 (a,
Figure 112014006288597-pat00003
, 채워진 기호) 알록산-당뇨병 유카탄 미니돼지 (용량 당 n=3) 및 (b,
Figure 112014006288597-pat00004
, 속이 빈 기호) 비-당뇨병 유카탄 미니돼지 (용량 당 n=3)에서의 혈액 글루코스 수준. 데이터를 평균 값 ± 1의 표준 편차로서 플롯팅하였다. 비고: 명료성을 위하여 도 54(b)에서 스케일을 확대하였다.
도 55: 비-당뇨병 미니돼지 당-의존성 제거 반감기 연구에 사용하기 위한 추가의 인슐린 접합체. 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 이들 접합체는 각각 재조합 야생형 인간 인슐린을 사용하여 제조하였다 (야생형 인간 인슐린의 구조에 대해 도 63 참조). 따라서, 도 55의 도식은 우선적으로 야생형 인간 인슐린을 나타내는 것으로 의도된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용이 또한 특히 이들 버전의 접합체, 및 야생형 인간 인슐린 이외의 인슐린 분자를 포함하는 다른 접합체를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
도 56: 래트 및 미니돼지에 RHI 또는 접합체 I-6을 투여한 후의 시간의 함수로서의 혈청 인슐린 농도의 플롯.
도 57: 추가의 인슐린-접합체에 대해 미니돼지에서 얻어진 정맥내 반감기의 요약.
도 58: 당뇨병 및 정상 미니돼지에 0.25, 0.5 및 1 U/kg의 인슐린 접합체 II-2를 단일 피하 주사한 후의 혈청 인슐린 수준의 플롯.
도 59: 미니돼지에 RHI, 및 접합체 I-6, II-3 및 II-2를 a-MM 주입과 함께, 그리고 a-MM 주입 없이 정맥내 주사한 후의 혈청 인슐린 농도의 플롯.
도 60: 인슐린 접합체 I-6, I-12, II-2 및 II-3의 구조, 및 미니돼지에서 대조군으로서 시험된 선택된 인슐린 접합체 (C3, C4, 및 C7)의 구조. 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 이들 접합체는 각각 재조합 야생형 인간 인슐린을 사용하여 제조하였다 (야생형 인간 인슐린의 구조에 대해 도 63 참조). 따라서, 도 60의 도식은 우선적으로 야생형 인간 인슐린을 나타내는 것으로 의도된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용이 또한 특히 이들 버전의 접합체, 및 야생형 인간 인슐린 이외의 인슐린 분자를 포함하는 다른 접합체를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
도 61: 미니돼지에 RHI, 및 인슐린 접합체 I-6, I-12, II-2 및 C3을 a-MM 주입과 함께, 그리고 a-MM 주입 없이 정맥내 주사한 후의 혈청 글루코스 수준의 플롯.
도 62: 미니돼지에 RHI, 및 인슐린 접합체 C7, C4, II-3 및 II-2를 a-MM 주입과 함께, 그리고 a-MM 주입 없이 정맥내 주사한 후의 혈청 글루코스 수준의 플롯.
도 63: 야생형 인간 인슐린의 구조.
본 출원은 특허 및 비-특허 문헌을 비롯한 수많은 문헌을 언급한다. 이들 문헌 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 사카라이드, 예컨대 글루코스의 전신 농도에 반응하는 방식으로 약물, 예컨대 인슐린의 약동학 (PK) 및/또는 약력학 (PD) 프로파일을 조절하는 방법을 제공한다. 실시예에서 논의되는 바와 같이, 상기 방법은 특정 인슐린-접합체가 고 친화성 사카라이드 리간드를 포함하도록 변형된 경우에, 이들이 심지어 외인성 다가 사카라이드-결합 분자, 예컨대 Con A의 부재하에서도 사카라이드 농도 변화에 반응하는 PK/PD 프로파일을 나타내도록 할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 이러한 발견은 예상치 못한 것이었고, 단순한 렉틴-무함유 사카라이드-반응성 약물 시스템을 생성하기 위한 전례없는 기회를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 예시적인 접합체 및 그의 제조 방법을 제공한다. 일반적으로, 이들 접합체는 약물, 및 사카라이드를 각각 포함하는 1개 이상의 별개의 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 내인성 사카라이드-결합 분자에 결합하기 위해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드는 Con A에 결합하기 위해 글루코스 또는 만노스와 경쟁할 수 있다. 하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 특정 실시양태에서, 리간드 및 약물은 접합체 프레임워크에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프레임워크는 비-중합체성이다. 특정 실시양태에서, 접합체는 1의 다분산 지수 및 약 20,000 Da 미만의 MW를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 본원에 정의되고 기재된 바와 같은 화학식 I 또는 II를 갖는다. 특정 실시양태에서, 접합체는 장시간 작용한다 (즉, 가용성 재조합 인간 인슐린 또는 RHI보다 지속적인 PK 프로파일을 나타냄).
하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본원에 기재된 방법, 접합체 및 제제가 인슐린의 전달을 조금도 제한하지 않으며 이들이 임의의 약물을 전달하는데 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 상기 방법이 글루코스 이외의 사카라이드에 반응하여 약물을 전달하는데 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 특히, 실시예에 논의되는 바와 같이, 예시적인 접합체는 외인성 사카라이드, 예컨대 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스에 반응하는 것으로 나타났다. 특정 실시양태에서, 이는 이들 외인성 사카라이드 중 하나의 투여에 의해 제어될 수 있는 (즉, 내인성 글루코스의 변동에 의해 제어되는 것 대신에 또는 그에 더하여) 접합체를 제조하는데 이용될 수 있다.
접합체
한 측면에서, 본 개시내용은 약물 및 리간드 (제1 사카라이드 포함)를 포함하는 접합체를 제공한다. 리간드 (또는 접합체가 1개 초과의 리간드를 포함하는 경우, 리간드들)는, 접합체를 포유동물에게 투여하는 경우에 접합체의 하나 이상의 약동학 또는 약력학 특성이 제2 사카라이드의 혈청 농도에 민감성이도록 한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 PK 및/또는 PD 특성은 내인성 사카라이드, 예컨대 글루코스의 혈청 농도에 민감성이다. 특정 실시양태에서, 접합체의 PK 및/또는 PD 특성은 외인성 사카라이드, 예를 들어 비제한적으로 만노스, L-푸코스, N-아세틸 글루코사민 및/또는 알파-메틸 만노스의 혈청 농도에 민감성이다.
하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 특정 실시양태에서, 리간드(들) 및 약물은 접합체 프레임워크에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다.
특정 실시양태에서, 약물 부재하의 접합체의 분자량은 약 10,000 Da 미만이다. 예를 들어, 약물 부재하의 접합체의 분자량은 약 250 내지 약 5,000 Da, 약 450 내지 약 3,500 Da, 약 750 내지 약 2,500 Da, 또는 약 900 내지 약 2,000 Da의 범위일 수 있다.
특정 실시양태에서, 약물을 포함하는 접합체의 분자량은 약 20,000 Da 미만이다. 예를 들어, 약물을 포함하는 접합체의 분자량은 약 2,000 내지 약 18,000 Da, 약 4,000 내지 약 15,000 Da, 약 5,000 내지 약 10000 Da, 또는 약 6,500 내지 약 8,000 Da의 범위일 수 있다.
특정 실시양태에서, 접합체는 유일 분자량을 갖는다 (즉, 1의 다분산 지수를 가짐).
PK 및 PD 특성
다양한 실시양태에서, 접합체 (즉, 접합된 약물 및/또는 화학적 또는 효소적 분해에 의해 접합체로부터 방출되는 약물)의 약동학 및/또는 약력학 거동은 사카라이드의 혈청 농도의 변화에 의해 변경될 수 있다.
예를 들어, 약동학 (PK) 관점으로부터, 혈청 농도 곡선은 사카라이드 (예를 들어, 글루코스)의 혈청 농도가 증가하는 경우, 또는 사카라이드의 혈청 농도가 역치에 교차되는 경우 (예를 들어, 정상 글루코스 수준보다 높음) 상향 이동될 수 있다.
특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 금식 및 고혈당 조건하의 포유동물에게 투여되는 경우에 실질적으로 상이하다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상이한"은 2개의 곡선이 스튜던트 t-검정 (p < 0.05)에 의해 측정시 실질적으로 상이함을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "금식 조건"은, 혈청 농도 곡선이 5명 이상의 금식시킨 비-당뇨병 개체로부터의 데이터를 조합함으로써 얻어진다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 금식시킨 비-당뇨병 개체는 혈액 채취 시점에 당뇨병 증상을 나타내지 않고 혈액 채취 시점의 12 시간 이내에 아무것도 먹지 않은, 무작위로 선택된 18 내지 30세의 인간이다. 본원에 사용된 용어 "고혈당 조건"은, 혈청 농도 곡선이, 접합체 및 글루코스의 동시 투여에 의해 고혈당 조건 (금식 조건하에 관찰된 평균 글루코스 농도를 초과하여 100 mg/dL 이상의 글루코스 Cmax)이 유도된 5명 이상의 금식시킨 비-당뇨병 개체로부터의 데이터를 조합함으로써 얻어진다는 것을 의미한다. 접합체 및 글루코스의 동시 투여는 단순하게, 접합체가 혈청 내에 검출가능한 수준으로 존재하는 경우의 기간 동안 글루코스 Cmax가 나타나는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 글루코스 주사 (또는 섭취)는 접합체 투여 직전에, 그와 동시에, 또는 직후에 일어나도록 시기를 조절할 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체 및 글루코스는 상이한 경로로, 또는 상이한 위치에서 투여된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 접합체는 피하로 투여되는 반면, 글루코스는 경구로 또는 정맥내로 투여된다.
특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 Cmax는 금식 조건과 비교하여 고혈당 조건하에 더 높다. 부가적으로 또는 대안적으로, 특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 곡선 아래 면적 (AUC)은 금식 조건과 비교하여 고혈당 조건하에 더 높다. 다양한 실시양태에서, 접합체의 혈청 제거 속도는 금식 조건과 비교하여 고혈당 조건하에 더 느리다. 실시예에서 논의되는 바와 같이, 본 발명자들은 특정 실시양태에서 접합체의 혈청 농도 곡선이 하나의 짧은 반감기 및 하나의 긴 반감기를 나타내는 2-구획 이중-지수 모델을 이용하여 적합화될 수 있음을 발견하였다. 긴 반감기는 글루코스 농도에 특히 민감성인 것으로 보인다. 따라서, 특정 실시양태에서, 긴 반감기는 금식 조건과 비교하여 고혈당 조건하에 더 길다. 특정 실시양태에서, 금식 조건은 100 mg/dL 미만 (예를 들어, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 포함한다. 특정 실시양태에서, 고혈당 조건은 200 mg/dL 초과 (예를 들어, 300 mg/dL, 400 mg/dL, 500 mg/dL, 600 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 포함한다. 다른 PK 파라미터, 예컨대 평균 혈청 잔류 시간 (MRT), 평균 혈청 흡수 시간 (MAT) 등이 상기 언급된 파라미터 중 임의의 것 대신에 또는 그와 함께 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
인간, 개, 고양이 및 래트에서의 글루코스의 정상 범위는 60 내지 200 mg/dL이다. 당업자는 상이한 정상 범위 (예를 들어, 소형 돼지의 정상 범위의 글루코스 농도는 40 내지 150 mg/dl임)를 갖는 종에 대해 하기 값을 추정할 수 있을 것이다. 60 mg/dL 미만의 글루코스 농도는 저혈당으로 간주한다. 200 mg/dL 초과의 글루코스 농도는 고혈당으로 간주한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 PK 특성은 글루코스 클램프 방법 (실시예 참조)을 이용하여 시험할 수 있고, 접합체의 혈청 농도 곡선은 50 및 200 mg/dL, 50 및 300 mg/dL, 50 및 400 mg/dL, 50 및 500 mg/dL, 50 및 600 mg/dL, 100 및 200 mg/dL, 100 및 300 mg/dL, 100 및 400 mg/dL, 100 및 500 mg/dL, 100 및 600 mg/dL, 200 및 300 mg/dL, 200 및 400 mg/dL, 200 및 500 mg/dL, 200 및 600 mg/dL 등의 글루코스 농도로 투여시 실질적으로 상이할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 혈청 Tmax, 혈청 Cmax, 평균 혈청 잔류 시간 (MRT), 평균 혈청 흡수 시간 (MAT) 및/또는 혈청 반감기는 두 글루코스 농도에서 실질적으로 상이할 수 있다. 하기 논의되는 바와 같이, 특정 실시양태에서, 100 mg/dL 및 300 mg/dL가 비교 글루코스 농도로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 개시내용이 비제한적으로 하기 쌍 중 임의의 하나를 비롯한 대안적 쌍의 비교 글루코스 농도를 사용하는 각각의 이들 실시양태를 포함한다는 것을 이해해야 한다: 50 및 200 mg/dL, 50 및 300 mg/dL, 50 및 400 mg/dL, 50 및 500 mg/dL, 50 및 600 mg/dL, 100 및 200 mg/dL, 100 및 400 mg/dL, 100 및 500 mg/dL, 100 및 600 mg/dL, 200 및 300 mg/dL, 200 및 400 mg/dL, 200 및 500 mg/dL, 200 및 600 mg/dL 등.
따라서, 특정 실시양태에서, 접합체의 Cmax는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 더 높다. 특정 실시양태에서, 접합체의 Cmax는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 50% 이상 (예를 들어, 100% 이상, 200% 이상 또는 400% 이상) 더 높다.
특정 실시양태에서, 접합체의 AUC는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 더 크다. 특정 실시양태에서, 접합체의 AUC는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 50% 이상 (예를 들어, 100% 이상, 200% 이상 또는 400% 이상) 더 크다.
특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 제거 속도는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 더 느리다. 특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 제거 속도는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 100 대 300 mg/dL 글루코스) 중 더 낮은 농도로 투여하는 경우에 25% 이상 (예를 들어, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상 또는 400% 이상) 빠르다.
실시예에서 논의되는 바와 같이, 본 발명자들은 특정 실시양태에서 접합체의 혈청 농도 곡선이 하나의 짧은 반감기 및 하나의 긴 반감기를 나타내는 2-구획 이중-지수 모델을 이용하여 적합화될 수 있다는 것을 발견하였다. 긴 반감기는 글루코스 농도에 특히 민감성인 것으로 보여졌다. 따라서, 특정 실시양태에서, 긴 반감기는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 더 길다. 특정 실시양태에서, 긴 반감기는 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 50% 이상 (예를 들어, 100% 이상, 200% 이상 또는 400% 이상) 더 길다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 접합체의 혈청 농도 곡선을 2개의 상이한 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스)에서 얻는 방법을 제공하며; 두 곡선은 하나의 짧은 반감기 및 하나의 긴 반감기를 나타내는 2-구획 이중-지수 모델을 이용하여 적합화하였고; 2개의 글루코스 농도하에 얻은 긴 반감기를 비교하였다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 1개 이상의 접합체의 글루코스 민감도를 시험하거나 비교하기 위한 검정으로서 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 접합된 약물 (예를 들어, 본 개시내용의 인슐린 접합체) 및 비접합된 버전의 약물 (예를 들어, RHI)의 혈청 농도 곡선을 동일한 조건 (예를 들어, 금식 조건)하에 얻는 방법을 제공하며; 두 곡선은 하나의 짧은 반감기 및 하나의 긴 반감기를 나타내는 2-구획 이중-지수 모델을 이용하여 적합화하였고; 접합된 약물 및 비접합된 약물에 대해 얻은 긴 반감기를 비교하였다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 비접합된 약물보다 신속하게 제거되는 접합체를 확인하기 위한 검정으로서 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 고혈당 조건하의 포유동물에게 투여하는 경우에 비접합된 버전의 약물의 혈청 농도 곡선과 실질적으로 동일하다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 스튜던트 t-검정 (p > 0.05)에 의한 측정시 두 곡선 사이에 유의한 차이가 없음을 의미한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 금식 조건하에 투여되는 경우에 비접합된 버전의 약물의 혈청 농도 곡선과 실질적으로 상이하다. 특정 실시양태에서, 접합체의 혈청 농도 곡선은 고혈당 조건하에 투여시 비접합된 버전의 약물의 혈청 농도 곡선과 실질적으로 동일하고, 금식 조건하에 투여시 실질적으로 상이하다. 특정 실시양태에서, 고혈당 조건은 200 mg/dL 초과 (예를 들어, 300 mg/dL, 400 mg/dL, 500 mg/dL, 600 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 포함한다. 특정 실시양태에서, 금식 조건은 100 mg/dL 미만 (예를 들어, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 포함한다. 상기 언급된 PK 파라미터, 예컨대 혈청 Tmax, 혈청 Cmax, AUC, 평균 혈청 잔류 시간 (MRT), 평균 혈청 흡수 시간 (MAT) 및/또는 혈청 반감기 중 임의의 것이 비교될 수 있음을 인지할 것이다.
약력학 (PD) 관점으로부터, 접합체의 생물활성은 글루코스 농도가 증가하는 경우, 또는 글루코스 농도가 역치에 교차되는 경우 (예를 들어, 정상 글루코스 수준보다 높음) 증가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체의 생물활성은 고혈당 조건과 비교하여 금식 조건하에 투여하는 경우에 더 낮다. 특정 실시양태에서, 금식 조건은 100 mg/dL 미만 (예를 들어, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 포함한다. 특정 실시양태에서, 고혈당 조건은 200 mg/dL 초과 (예를 들어, 300 mg/dL, 400 mg/dL, 500 mg/dL, 600 mg/dL 등)의 글루코스 Cmax를 포함한다.
특정 실시양태에서, 접합체의 PD 특성은 일정한 글루코스 농도를 유지하는데 요구되는 글루코스 주입 속도 (GIR)를 측정함으로써 시험할 수 있다. 이러한 실시양태에 따라서, 접합체의 생물활성은 50 및 200 mg/dL, 50 및 300 mg/dL, 50 및 400 mg/dL, 50 및 500 mg/dL, 50 및 600 mg/dL, 100 및 200 mg/dL, 100 및 300 mg/dL, 100 및 400 mg/dL, 100 및 500 mg/dL, 100 및 600 mg/dL, 200 및 300 mg/dL, 200 및 400 mg/dL, 200 및 500 mg/dL, 200 및 600 mg/dL 등의 글루코스 농도로 투여하는 경우에 실질적으로 상이할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 접합체의 생물활성은 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 더 높다. 특정 실시양태에서, 접합체의 생물활성은 포유동물에게 두 글루코스 농도 (예를 들어, 300 대 100 mg/dL 글루코스) 중 더 높은 농도로 투여하는 경우에 25% 이상 (예를 들어, 50% 이상 또는 100% 이상) 더 높다.
특정 실시양태에서, 접합체는 약물로서 인슐린 분자를 포함한다. 이러한 실시양태에 따라, 인슐린의 PD 거동은 최소 혈액 글루코스 농도 (Tnadir)에 도달하는 시간, 혈액 글루코스 수준이 초기 값의 특정 백분율 미만 (예를 들어, 초기 값의 70% 또는 T70 % BGL)으로 남아있는 지속기간 등을 비교하여 관찰할 수 있다.
일반적으로, 본 섹션에서 논의된 PK 및 PD 특징화 중 어느 것은 발표되어 있는 다양한 약동학 및 약력학 방법 중 임의의 것에 따라 측정할 수 있음을 인지할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Baudys et al., Bioconjugate Chem. 9: 176-183, 1998 for methods suitable for subcutaneous delivery] 참조). 또한, PK 및/또는 PD 특성이 임의의 포유동물 (예를 들어, 인간, 래트, 고양이, 미니돼지, 개 등)에서 측정될 수 있음을 이해해야 한다. 특정 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 인간에서 측정된다. 특정 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 래트에서 측정된다. 특정 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 미니돼지에서 측정된다. 특정 실시양태에서, PK 및/또는 PD 특성은 개에서 측정된다.
또한, 상기 내용이 글루코스-반응성 접합체의 문맥에 기재되어 있지만, 동일한 특성 및 검정이 다른 사카라이드, 예를 들어 외인성 사카라이드, 예를 들어 만노스, L-푸코스, N-아세틸 글루코사민, 알파-메틸 만노스 등에 반응성인 접합체에 적용됨을 인지할 것이다. 하기 및 실시예에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 금식 및 고혈당 조건하의 PK 및/또는 PD 특성을 비교하는 것 대신에, PK 및/또는 PD 특성을 금식 조건하의 외인성 사카라이드의 투여 경우 및 비투여 경우를 비교할 수 있다. 접합체가 주어진 외인성 사카라이드의 상이한 Cmax 값에 반응하도록 설계될 수 있음을 이해해야 한다.
리간드 (들)
일반적으로, 접합체는 1개 이상의 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체는 단일 리간드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체는 2개 이상의 별개의 리간드, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 리간드를 포함한다. 1개 초과의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 동일하거나 상이한 화학 구조를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 리간드는 내인성 사카라이드-결합 분자 (예를 들어, 비제한적으로 계면활성제 단백질 A 및 D, 또는 셀렉틴 패밀리의 구성원)에 결합하기 위해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드는 세포-표면 당 수용체 (예를 들어, 비제한적으로 대식세포 만노스 수용체, 글루코스 수송체 리간드, 내피 세포 당 수용체 또는 간세포 당 수용체)에 결합하기 위해 사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 만노스)와 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드는 내인성 글루코스-결합 분자 (예를 들어, 비제한적으로 계면활성제 단백질 A 및 D, 또는 셀렉틴 패밀리의 구성원)에 결합하기 위해 글루코스와 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드는 비-인간 렉틴 (예를 들어, Con A)에 결합하기 위해 사카라이드와 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드는 비-인간 렉틴 (예를 들어, Con A)에 결합하기 위해 글루코스 또는 만노스와 경쟁할 수 있다. 예시적인 글루코스-결합 렉틴에는 칼넥신, 칼레티쿨린, N-아세틸글루코사민 수용체, 셀렉틴, 아시알로당단백질 수용체, 콜렉틴 (만노스-결합 렉틴), 만노스 수용체, 아그레칸, 베르시칸, 피숨 사티붐 응집소 (PSA), 비시아 파바 렉틴, 렌즈 쿨리나리스 렉틴, 대두 렉틴, 땅콩 렉틴, 라티루스 오크루스 렉틴, 잠두 렉틴, 소포라 자포니카 렉틴, 보우링기아 밀브라에디이 렉틴, 콘카나발린 A (Con A) 및 미국자리공 미토겐이 포함된다.
특정 실시양태에서, 리간드는 하기 화학식 IIIa 또는 IIIb를 갖는다.
<화학식 IIIa>
Figure 112014006288597-pat00005
<화학식 IIIb>
Figure 112014006288597-pat00006
상기 식에서,
각각의 R1은 독립적으로 수소, -ORy, -N(Ry)2, -SRy, -O-Y, -G-Z 또는 -CH2Rx이고;
각각의 Rx는 독립적으로 수소, -ORy, -N(Ry)2, -SRy 또는 -O-Y이고;
각각의 Ry는 독립적으로 -R2, -SO2R2, -S(O)R2, -P(O)(OR2)2, -C(O)R2, -CO2R2 또는 -C(O)N(R2)2 이고;
각각의 Y는 독립적으로 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 트리사카라이드이고;
각각의 G는 독립적으로 공유 결합 또는 임의로 치환된 C1 -9 알킬렌이고, 여기서 G의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -O-, -S-, -N(R2)-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)N(R2)-, -N(R2)C(O)-, -N(R2)C(O)N(R2)-, -SO2-, -SO2N(R2)-, -N(R2)SO2- 또는 -N(R2)SO2N(R2)-에 의해 임의로 대체되고;
각각의 Z는 독립적으로 할로겐, -N(R2)2, -OR2, -SR2, -N3, -C≡CR2, -CO2R2, -C(O)R2 또는 -OSO2R2이고;
각각의 R2는 독립적으로 수소; 또는 C1 -6 지방족, 페닐, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 4 내지 7원 헤테로시클릭 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 모노시클릭 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이다.
특정 실시양태에서, 화학식 IIIa 또는 IIIb의 리간드는 모노사카라이드이다. 특정 실시양태에서, 리간드는 디사카라이드이다. 특정 실시양태에서, 리간드는 트리사카라이드이다. 특정 실시양태에서, 리간드는 테트라사카라이드이다. 특정 실시양태에서, 리간드는 총 4개 이하의 모노사카라이드 잔기를 포함한다.
상기 일반적으로 정의된 바와 같이, 각각의 R1은 독립적으로 수소, -ORy, -N(Ry)2, -SRy, -O-Y, -G-Z 또는 -CH2Rx이다. 특정 실시양태에서, R1은 수소이다. 특정 실시양태에서, R1은 -OH이다. 다른 실시양태에서, R1은 -NHC(O)CH3이다. 특정 실시양태에서, R1은 -O-Y이다. 다른 특정 실시양태에서, R1은 -G-Z이다. 일부 실시양태에서, R1은 -CH2OH이다. 다른 실시양태에서, R1은 -CH2-O-Y이다. 또 다른 실시양태에서, R1은 -NH2이다. 당업자는 화학식 IIIa 또는 IIIb 내의 각각의 R1 치환기가 (R) 또는 (S) 입체화학으로 존재할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 일반적으로 정의된 바와 같이, 각각의 Rx는 독립적으로 수소, -ORy, -N(Ry)2, -SRy 또는 -O-Y이다. 일부 실시양태에서, Rx는 수소이다. 특정 실시양태에서, Rx는 -OH이다. 다른 실시양태에서, Rx는 -O-Y이다.
상기 일반적으로 정의된 바와 같이, 각각의 Ry는 독립적으로 -R2, -SO2R2, -S(O)R2, -P(O)(OR2)2, -C(O)R2, -CO2R2 또는 -C(O)N(R2)2 이다. 일부 실시양태에서, Ry는 수소이다. 다른 실시양태에서, Ry는 -R2이다. 일부 실시양태에서, Ry는 -C(O)R2이다. 특정 실시양태에서, Ry는 아세틸이다. 다른 실시양태에서, Ry는 -SO2R2, -S(O)R2, -P(O)(OR2)2, -CO2R2 또는 -C(O)N(R2)2이다.
상기 일반적으로 정의된 바와 같이, Y는 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 트리사카라이드이다. 특정 실시양태에서, Y는 모노사카라이드이다. 일부 실시양태에서, Y는 디사카라이드이다. 다른 실시양태에서, Y는 트리사카라이드이다. 일부 실시양태에서, Y는 만노스, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 람노스 또는 크실로피라노스이다. 일부 실시양태에서, Y는 수크로스, 말토스, 투라노스, 트레할로스, 셀로비오스 또는 락토스이다. 특정 실시양태에서, Y는 만노스이다. 특정 실시양태에서, Y는 D-만노스이다. 당업자는 사카라이드 Y가 아노머 탄소를 통해 -O-Y의 산소 기에 부착되어 글리코시드 결합을 형성함을 인지할 것이다. 글리코시드 결합은 알파 또는 베타 배위로 존재할 수 있다.
상기 일반적으로 정의된 바와 같이, 각각의 G는 독립적으로 공유 결합 또는 임의로 치환된 C1 -9 알킬렌이며, 여기서 G의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -O-, -S-, -N(R2)-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)N(R2)-, -N(R2)C(O)-, -N(R2)C(O)N(R2)-, -SO2-, -SO2N(R2)-, -N(R2)SO2- 또는 -N(R2)SO2N(R2)-에 의해 임의로 대체된다. 일부 실시양태에서, G는 공유 결합이다. 특정 실시양태에서, G는 -O-C1 -8 알킬렌이다. 특정 실시양태에서, G는 -OCH2CH2-이다.
상기 일반적으로 정의된 바와 같이, 각각의 Z는 독립적으로 할로겐, -N(R2)2, -OR2, -SR2, -N3, -C≡CR2, -CO2R2, -C(O)R2 또는 -OSO2R2이다. 일부 실시양태에서, Z는 할로겐 또는 -OSO2R2이다. 다른 실시양태에서, Z는 -N3 또는 -C≡CR2이다. 특정 실시양태에서, Z는 -N(R2)2, -OR2 또는 -SR2이다. 특정 실시양태에서, Z는 -SH이다. 특정 실시양태에서, Z는 -NH2이다. 특정 실시양태에서, -G-Z는 -OCH2CH2NH2이다.
일부 실시양태에서, 화학식 IIIa의 C1 탄소 상의 R1 치환기는 -G-Z이다 (하기 화학식 IIIa-i의 화합물을 제공함).
<화학식 IIIa-i>
Figure 112014006288597-pat00007
상기 식에서, R1, G 및 Z는 본원에 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 리간드는 하기 화학식 IIIa-ii를 갖는다.
<화학식 IIIa-ii>
Figure 112014006288597-pat00008
상기 식에서, R1, Rx, G 및 Z는 본원에 정의되고 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 리간드(들)은 글루코스로서 동일한 화학 구조를 가질 수 있거나, 또는 글루코스의 화학적으로 관련된 종일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 리간드(들)이 글루코스와 상이한 화학 구조를 갖는 것이, 예를 들어 접합체의 글루코스 반응을 미세 조정하기 위하여 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 글루코스, 만노스, L-푸코스, 또는 이들의 유도체 (예를 들어, 알파-L-푸코피라노시드, 만노사민, 베타-연결된 N-아세틸 만노사민, 메틸글루코스, 메틸만노스, 에틸글루코스, 에틸만노스, 프로필글루코스, 프로필만노스 등) 및/또는 이들의 고급 조합물 (예를 들어, 비만노스, 선형 및/또는 분지형 트리만노스 등)를 포함하는 것이 리간드로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 리간드는 모노사카라이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 디사카라이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 트리사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 사카라이드 및 1개 이상의 아민 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 사카라이드 및 아민 기는 C1-C6 알킬 기, 예를 들어 C1-C3 알킬 기에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸글루코스 (AEG)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸만노스 (AEM)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸비만노스 (AEBM)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸트리만노스 (AETM)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA)이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 아미노에틸푸코스 (AEF)이다. 특정 실시양태에서, 사카라이드 리간드는 "D" 배위로 존재한다. 다른 실시양태에서, 사카라이드 리간드는 "L" 배위로 존재한다. 본 발명자들은 하기에 이들 예시적인 리간드의 구조를 나타내었다. 다른 예시적인 리간드는 당업자에 의해 인식될 것이다.
Figure 112014006288597-pat00009
일반적으로, 리간드는 약물에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다 (즉, 링커 또는 프레임워크를 통해). 하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 리간드는 접합체 프레임워크 내에 (예를 들어, 중합체 주쇄의 일부로서 또는 단량체의 측기로서) 자연적으로 존재할 수 있다. 대안적으로 (또는 부가적으로), 리간드는 접합체 프레임워크에 인위적으로 도입될 수 있다 (예를 들어, 접합체 프레임워크에 합성적으로 첨가된 화학 기의 형태로). 특정 실시양태에서, 접합체는 5개 이상, 10개 이상 또는 20개 이상의 리간드를 포함하는 프레임워크를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 단지 1, 2, 3, 4 또는 5개의 별개의 리간드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 2개 이상의 별개의 리간드는 상이한 접합 지점을 통해 약물에 접합된다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 별개의 리간드는 약물에도 접합되는 단일 접합체 프레임워크에 접합된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 리간드, 예컨대 AETM, AEG, AEM, AEBM, AEGA 또는 AEF는 1개의 인슐린 분자에 접합된다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 AETM 리간드는 1개의 인슐린 분자에 접합된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 리간드, 예컨대 AETM, AEG, AEM, AEBM, AEGA 또는 AEF는 1개의 접합 지점 또는 다중 접합 지점을 통해 1개의 인슐린 분자에 접합된다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 리간드는 동일한 리간드가 아니다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 리간드는 동일한 리간드이다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 AETM 리간드는 1개의 접합 지점 또는 다중 접합 지점을 통해 1개의 인슐린 분자에 접합된다. 하기 예시적인 특정 접합체 프레임워크의 문맥에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 특정 실시양태에서 별개의 리간드 및 약물 (예를 들어, 인슐린 분자)은 각각 분지형 접합체 프레임워크의 별개의 분지에 위치할 수 있다. 예를 들어, 리간드 및 약물은 이들 분지의 말단에 위치할 수 있다. 특정 실시양태에서, 초분지형 접합체가 사용될 수 있다. 중합체성 및 비-중합체성 접합체 프레임워크가 둘 다 포함된다.
접합체 프레임워크에 리간드를 접합시키는 방법은 하기에서 보다 상세히 논의하고 있다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 리간드 내의 사카라이드는 C1, C2 또는 C6 위치를 통해 접합된다 (링커에 의해 직접적으로 또는 간접적으로). 특정 실시양태에서, 접합은 C1 위치를 포함한다. 사카라이드의 C1 위치는 또한 아노머 탄소로서 지칭되며, 알파 또는 베타 입체구조로 약물 또는 접합체 프레임워크에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, C1 위치는 알파 아노머로서 배열된다. 다른 실시양태에서, C1 위치는 베타 아노머로서 배열된다.
약물
접합체가 임의의 약물을 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 접합체는 동일 약물을 1개 초과의 카피로 포함할 수 있고/있거나 1개 초과의 유형의 약물을 포함할 수 있다. 접합체는 임의의 특정 약물로 제한되지 않고, 소분자 약물 또는 생체분자 약물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 사용되는 약물(들)은 치료할 질환 또는 장애에 따라 달라질 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약물"은 염 및 비-염 형태의 약물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "인슐린 분자"는 모든 염 및 비-염 형태의 인슐린 분자를 포함한다. 염 형태가 약물에 따라 음이온성일 수도 있고 양이온성일 수도 있다는 것을 알 것이다.
예를 들어, 다양한 실시양태에서, 접합체는 하기 약물 중 임의의 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: 디클로페낙, 니페디핀, 리바스티그민, 메틸페니데이트, 플루오르옥세틴, 로시글리타존, 프레드니손, 프레드니솔론, 코데인, 에틸모르핀, 덱스트로메토르판, 노스카핀, 펜톡시베린, 아세틸시스테인, 브롬헥신, 에피네프린, 이소프레날린, 오르시프레날린, 에페드린, 페노테롤, 리미테롤, 이프라트로퓸, 콜린테오필리네이트, 프록시필린, 베클로메타손, 부데소니드, 데슬라노시드, 디곡신, 디기톡신, 디소피라미드, 프로실라리딘, 키니딘, 프로카인아미드, 멕실레틴, 플레카이니드, 알프레놀롤, 프로프로아놀롤, 나돌롤, 핀돌롤, 옥스프레놀롤, 라베탈롤, 티르놀롤, 아테놀롤, 펜타에리트리틸테트라니트레이트, 이소소르비드디니트레이트, 이소소르비드모노니트레이트, 니페디핀, 페닐아민, 베라파밀, 딜티아젬, 시클란델라르, 니코티닐알콜홀, 이노시톨니코티네이트, 알프로스타트딜, 에틸에프린, 프레날테롤, 도부타민, 도파민, 디히드로에르고타민, 구아네티딘, 베타니딘, 메틸도파, 레세르핀, 구안파신, 트리메타판, 히드랄라진, 디히드랄라진, 프라조신, 디아족시드, 카프토프릴, 니페디핀, 에날라프릴, 니트로프루시드, 벤드로플루메티아지드, 히드로클로르티아지드, 메티클로티아지드, 폴리티아지드, 클로르탈리돈, 시네타존, 클로파미드, 메프루시드, 메톨라존, 부메타니드, 에타크리나시드, 스피로놀락톤, 아밀로리드, 클로피브레이트, 니코틴산, 니세리트롤, 브롬페니라민, 신나리진, 덱스클로르페니라민, 클레마스틴, 안타졸린, 시프로헵타딘, 프로에타진, 시메티딘, 라니티딘, 수크랄페이트, 파파베린, 목사베린, 아트로핀, 부틸스코폴라민, 에메프론, 글루코피론, 히오스시아민, 메펜솔라르, 메틸스코폴라민, 옥시펜시클리민, 프로반텔린, 테로딜린, 센나글리코시드, 사그라다 추출물, 단트론, 비스아코딜, 소듐피코술페이트, 에툴로스, 디페녹실레이트, 로페라미드, 살라조술파피리딘, 피르빈, 메벤다졸, 디메티콘, 페로푸마레이트, 페로숙시네이트, 페라이트테트라세미소듐, 시아노코발라민, 엽산 헤파린, 헤파린 보조인자, 디쿨마롤, 와파린, 스트렙토키나제, 유로키나제, 인자 VIII, 인자 IX, 비타민 K, 티오페타, 부술판, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜파란, 카르무스틴, 메르카토퓨린, 티오구아닌, 아자티오프린, 시타라빈, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 프로카르바진, 다카르바진, 로무스틴, 에스트라무스틴, 테니포시드, 에토포시드, 시스플라틴, 암사크린, 아미노글루테티미드, 포스페스트롤, 메드록시프로게스테론, 히드록시프로게스테론, 메게스테롤, 노르에티스테론, 타목시펜, 시클로스포린, 술포소미딘, 베니실페니실린, 페녹시메틸페니실린, 디클록사실린, 클록사실린, 플루콕사실린, 암피실린, 아목시실린, 피밤피실린, 바캄피실린, 피페라실린, 메지오실린, 메실리남, 피브메실리남, 세팔로틴, 세팔렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파클로르, 세푸록심, 세포탁심, 세프타지딤, 세폭시틴, 아즈트레오남, 이미페넴, 실라스타틴, 테트라시클린, 리메시클린, 데메클로시클린, 메타시클린, 옥시테트라시클린, 독시시클린, 클로람페니콜, 스피라마이신, 푸시드산, 린코마이신, 클린다마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 암포테리신 B, 그리세오풀빈, 니스타틴, 반코마이신, 메트로니다졸, 티니다졸, 트리메토프림, 노르플록사신, 살라조술파피리딘, 아미노살릴, 이소니아지드, 에탐부톨, 니트로푸란토인, 날리딕스산, 메타나민, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 티니다졸, 케토코나졸, 아시클로비르, 인터페론 이독수리딘, 레티날, 티아민, 덱스판테놀, 피리독신, 엽산, 아스코르브산, 토코페롤, 피토미나디온, 펜플루라민, 코르티코트로핀, 테트라코삭티드, 티로트로핀, 소마토토프린, 소마트렘, 바소프레신, 리프레신, 데스모프레신, 옥시토신, 클로리온고나도트로핀, 코르티손, 히드로코르티손, 플루오드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 플루옥시메스테론, 메스테롤론, 난드롤론, 스타노졸롤, 옥시메톨론, 시프로테론, 레보티록신, 리오티로닌, 프로필티오우라실, 카르비마졸, 티아마졸, 디히드로타키스테롤, 알파칼시돌, 칼시트롤, 인슐린, 톨부타미드, 클로르프로파미드, 톨라자미드, 글리피지드, 길벤클라미드, 페노바르비탈, 메티프릴론, 피리티이디온, 메프로바메이트, 클로디아제폭시드, 디아제팜, 니트라제팜, 바클로펜, 옥사제팜, 디칼륨클로라제페이트, 로라제팜, 플루니트라제팜, 알프라졸람, 미다졸람, 히드록시진, 단트롤렌, 클로메티아졸, 프로피온마진, 알리메마진, 클로르프로마진, 레보메프로마진, 아세토페나진, 플루페나진, 페르페나진, 프로클로르페라진, 트리플루오페라진, 딕시라진, 티오디라진, 페리시아진, 클로프로틱센, 티자니딘, 잘레플론, 주클로펜티졸, 플루펜티졸, 티틱센, 할로페리돌, 트리미프라민, 오피프라몰, 클로미프라민, 데시프라민, 로페프라민, 아미트립틸린, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 마프트로틸린, 카페인, 신나리진, 시클리진, 디멘히디네이트, 메클로진, 프로메타진, 티에틸페라진, 메토클로프라미드, 스코폴라민, 페노바르비탈, 페니토인, 에토숙시미드, 프리미돈, 카르바마제핀, 클로나제팜, 오르페나드린, 아트로핀, 벤사트로핀, 비페리덴, 메틱센, 프로실리딘, 레보도파, 브로모크립틴, 아만타딘, 암베논, 피리도스티그민, 신스티그민, 디술피람, 모르핀, 코데인, 펜타조신, 부프레노르핀, 페티딘, 페노페리딘, 펜타닐, 메타돈, 피리트라미드, 덱스트로프로폭시펜, 케토베미돈, 아세틸살리실산, 셀레콕십, 페나존, 페닐부타존, 아자프로파존, 피록시캄, 에르고타민, 디히드로에르고타민, 시프로헵타딘, 피지티펜, 플루메드록손, 알로퓨리놀, 프로베네시드, 소듐아우로티오말레이트 오우로노핀, 페니실라민, 에스트라디올, 에스트라디올발레리아네이트, 에스트리올, 에티닐에스트라디올, 디히드로게스테론, 리네스트레놀, 메드록시프로게스테론, 노르에티스테론, 시클로페닐, 클로미펜, 레보노르게스트렐, 메스트라놀, 오르니다졸, 티니다졸, 에코나졸, 클로트리마졸, 나타마이신, 미코나졸, 술벤틴, 메틸에르고타민, 디노프로스트, 디노프로스톤, 게메프로스트, 브로모크립틴, 페닐프로판올아민, 소듐크로모글리케이트, 아제타솔라미드, 디클로페나미드, 베타카로텐, 날록손, 칼슘폴리네이트, 특히 클로니딘, 테필린, 디피라다몰, 히드로클로티아자드, 스코폴라민, 인도메타신, 푸로세미드, 염화칼륨, 모르핀, 이부프로펜, 살부타몰, 테르부탈린, 칼시토닌, 등. 이 목록은 예시적인 것이며, 임의의 약물은 그것이 공지되어 있든지 추후 발견되는 것이든 간에 본 개시내용의 접합체에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 펩티드계 또는 비-펩티드계일 수 있는 호르몬 약물, 예를 들어 아드레날린, 노르아드레날린, 안지오텐신, 아트리오펩틴, 알도스테론, 데히드로에피안드로스테론, 안드로스텐디온, 테스토스테론, 디히드로테스토스테론, 칼시토닌, 칼시트리올, 칼시디올, 코르티코트로핀, 코르티솔, 도파민, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 에리트로포이에틴, 여포-자극 호르몬, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 고나도트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 인간 융모성 고나도트로핀, 히스타민, 인간 태반 락토겐, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 인히빈, 렙틴, 류코트리엔, 리포트로핀, 멜라토닌, 오렉신, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, 프로게스테론, 프로락틴, 프로락틴-방출 호르몬, 프로스타글란딘, 레닌, 세로토닌, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선-자극 호르몬, 티로트로핀-방출 호르몬 (또는 티로트로핀), 티로트로핀-방출 호르몬, 티록신, 트리요오도티로닌, 바소프레신 등을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 호르몬은 글루카곤, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 렙틴, 갑상선-자극 호르몬, 티로트로핀-방출 호르몬 (또는 티로트로핀), 티로트로핀-방출 호르몬, 티록신 및 트리요오도티로닌으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약물은 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1)이다. 이 목록은 예시적인 것이며, 임의의 호르몬 약물은 그것이 공지되어 있든지 추후 발견되는 것이든 간에 본 개시내용의 접합체에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 갑상선 호르몬을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 항당뇨성 약물 (즉, 당뇨병으로 고통받는 환자에게 유익한 효과를 갖는 약물)을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 인슐린 분자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인슐린" 또는 "인슐린 분자"는 모든 염 및 비-염 형태의 인슐린 분자를 포함한다. 염 형태가 인슐린 분자에 따라 음이온성일 수도 있고 양이온성일 수도 있다는 것을 알 것이다. 본 발명자들은 "인슐린" 또는 "인슐린 분자"에 야생형 인슐린과 변형된 형태의 인슐린 둘다를 이것들이 생물활성인 한은 (즉, 생체내 투여시에 검출가능한 글루코스 감소를 야기할 수 있음) 포함시키고자 한다. 야생형 인슐린은 정제된 형태, 합성 형태 또는 재조합 형태이든 간에 임의의 종으로부터의 인슐린 (예를 들어, 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 소 인슐린, 토끼 인슐린, 양 인슐린 등)을 포함한다. 이것들 중 많은 것들이 시판되며, 예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스)에서 시판된다. 다양한 변형된 형태의 인슐린은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crotty and Reynolds, Pediatr. Emerg. Care. 23:903-905, 2007] 및 [Gerich, Am. J. Med. 113:308-16, 2002] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌 참조). 변형된 형태의 인슐린은 화학적으로 변형 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 화학적 잔기, 예컨대 PEG 기 또는 지방 아실 쇄의 부가에 의함)될 수도 있고/있거나 돌연변이될 수도 있다 (즉, 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의함).
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 1-10 (예를 들어, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-9, 6-8, 6-7, 7-9, 7-8, 8-9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1)개의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 야생형 인슐린과 상이할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 오직 아미노산 치환에 의해서만 야생형 인슐린과 상이할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 오직 아미노산 부가에 의해서만 야생형 인슐린과 상이할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 아미노산 치환과 부가 둘다에 의해 야생형 인슐린과 상이할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 아미노산 치환과 결실 둘다에 의해 야생형 인슐린과 상이할 것이다.
특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 관여하는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에 있어서의 유사성을 기초로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환은 보존적일 수 있고, 즉, 1개의 아미노산이 유사한 형태 및 전하의 아미노산으로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있고, 전형적으로 하기 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라진, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 티로신, 페닐알라닌. 특정 실시양태에서, 적합한 돌연변이 선택시에 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 폴리펩티드에 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해된다. 대안적으로, 유사 아미노산의 치환은 친수성을 기초로 하여 효과적으로 이루어질 수 있다. 폴리펩티드의 상호작용하는 생물학적 기능 부여에 있어서 친수성의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해된다. 폴리펩티드 디자인에 있어서 소수성 지수 또는 친수성의 용도는 미국 특허 번호 5,691,198에서 추가로 논의된다.
인간 인슐린 (A-쇄 및 B-쇄)의 야생형 서열을 하기 및 도 63에 나타냈다.
Figure 112014006288597-pat00010
인간 인슐린은 토끼, 돼지, 소 및 양의 인슐린과 오직 아미노산 A8, A9, A10 및 B30에서만 상이하다 (하기 표 참조).
Figure 112014006288597-pat00011
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 B-펩티드 서열의 B28 및/또는 B29 위치에서 돌연변이된다. 예를 들어, 인슐린 리스프로 (휴말로그(HUMALOG)®)는 B-펩티드의 C-말단의 끝에서 두번째 리신 및 프롤린 잔기가 역전된 (LysB28ProB29-인간 인슐린), 신속하게 작용하는 인슐린 돌연변이체이다. 이러한 변형은 인슐린 다량체의 형성을 차단한다. 인슐린 아스파르트 (노볼로그(NOVOLOG)®)는 위치 B28의 프롤린이 아스파르트산으로 치환된 (AspB28-인간 인슐린), 또 다른 신속하게 작용하는 인슐린 돌연변이체이다. 이 돌연변이체 역시 다량체의 형성을 방지한다. 일부 실시양태에서, 위치 B28 및/또는 B29에서의 돌연변이는 인슐린 폴리펩티드 내 다른 부위에서의 1개 이상의 돌연변이를 수반한다. 예를 들어, 인슐린 글루리신 (아피드라(APIDRA)®)은 위치 B3에서의 아스파르트산이 리신 잔기로 대체되고 위치 B29에서의 리신이 글루탐산 잔기로 대체된 (LysB3GluB29-인간 인슐린), 또 다른 신속하게 작용하는 인슐린 돌연변이체이다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 인간 인슐린에 비해 이동된 등전점을 갖는다. 일부 실시양태에서, 등전점의 이동은 1개 이상의 아르기닌 잔기를 인슐린 A-펩티드의 N-말단 및/또는 인슐린 B-펩티드의 C-말단에 부가하여 달성된다. 이러한 인슐린 폴리펩티드의 예는 ArgA0-인간 인슐린, ArgB31ArgB32-인간 인슐린, GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, ArgA0ArgB31ArgB32-인간 인슐린, 및 ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린을 포함한다. 추가의 예로서, 인슐린 글라진 (란투스(LANTUS)®)은 AspA21이 글리신으로 대체되고 2개의 아르기닌 잔기가 B-펩티드의 C-말단에 부가된 예시적인 장시간 작용 인슐린 돌연변이체이다. 이러한 변화의 효과는 등전점의 이동이며, 이에 따라 pH 4에서 완벽하게 가용성인 용액을 생성한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 A21이 Gly인 A-펩티드 서열 및 B31 및 B32가 Arg-Arg인 B-펩티드 서열을 포함한다. 본 개시내용은 이들 돌연변이 및 본원에 기재된 임의의 다른 돌연변이의 모든 단일 및 다중 조합 (예를 들어, GlyA21-인간 인슐린, GlyA21ArgB31-인간 인슐린, ArgB31ArgB32-인간 인슐린, ArgB31-인간 인슐린)을 포함한다는 것을 이해해야 한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 말단절단형이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 폴리펩티드의 B-펩티드 서열에는 B1, B2, B3, B26, B27, B28, B29 및/또는 B30이 결실되어 있다. 특정 실시양태에서, 잔기들의 조합이 본 개시내용의 인슐린 폴리펩티드의 B-펩티드 서열에서 결실된다. 예를 들어, B-펩티드 서열에서 잔기 B(1-2), B(1-3), B(29-30), B(28-30), B(27-30) 및/또는 B(26-30)이 결실될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 결실 및/또는 말단절단은 임의의 상기 언급된 인슐린 분자에 적용된다 (예를 들어, des(B30)-인슐린 리스프로, des(B30)-인슐린 아스파르트, des(B30)-인슐린 글루리신, des(B30)-인슐린 글라진 등을 생성하지만 이에 제한되지 않음).
일부 실시양태에서, 인슐린 분자는 A 또는 B-펩티드 서열의 N- 또는 C-말단에 추가의 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 A0, A21, B0 및/또는 B31에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 A0에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 A21에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 B0에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 위치 B31에 위치한다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A0, A21, B0 또는 B31에서 임의의 추가의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 1개 이상의 아미드화 아미노산이 산성 형태로 대체되도록 돌연변이된다. 예를 들어, 아스파라진은 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 글루타민은 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체될 수 있다. 특히, AsnA18, AsnA21 또는 AsnB3 또는 이들 잔기의 임의의 조합이 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체될 수 있다. GlnA15 또는 GlnB4 또는 이것들 둘다 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A21에서 아스파르트산을 가질 수도 있고 위치 B3에서 아스파르트산을 가질 수도 있으며 둘다 가질 수도 있다.
당업자는 인슐린 분자 내의 다른 아미노산을 돌연변이시키면서도 생물학적 활성은 유지시키는 것이 가능함을 인식할 것이다. 예를 들어, 하기하는 변형이 또한 당업계에서 널리 수용되지만 이에 제한되지 않는다: 위치 B10의 히스티딘 잔기의 아스파르트산으로의 대체 (HisB10→AspB10), 위치 B1의 페닐알라닌 잔기의 아스파르트산으로의 대체 (PheB1→AspB1), 위치 B30의 트레오닌 잔기의 알라닌으로의 대체 (ThrB30→AlaB30), 위치 B26의 티로신 잔기의 알라닌으로의 대체 (TyrB26→AlaB26), 및 위치 B9의 세린 잔기의 아스파르트산으로의 대체 (SerB9→AspB9).
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 연장된 작용 프로파일을 갖는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 지방산으로 아실화될 수 있다. 즉, 아미드 결합이 인슐린 분자의 아미노 기와 지방산의 카르복실산 기 사이에 형성된다. 아미노 기는 인슐린 분자의 N-말단 아미노산의 알파-아미노 기일 수도 있고, 또는 인슐린 분자의 리신 잔기의 엡실론-아미노 기일 수도 있다. 본 개시내용의 인슐린 분자는 야생형 인간 인슐린에 존재하는 3개의 아미노 기 중 1개 이상에서 아실화될 수도 있고, 또는 야생형 인간 인슐린 서열에 도입된 리신 잔기에서 아실화될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 B1에서 아실화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 B29에서 아실화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 지방산은 미리스트산 (C14), 펜타데실산 (C15), 팔미트산 (C16), 헵타데실산 (C17) 및 스테아르산 (C18)으로부터 선택된다. 예를 들어, 인슐린 데테미르 (레베미르(LEVEMIR)®)는 ThrB30이 결실되고 C14 지방산 쇄 (미리스트산)가 LysB29에 부착된 장시간 작용 인슐린 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, A-펩티드의 N-말단, B-펩티드의 N-말단, 위치 B29의 Lys의 엡실론-아미노 기 또는 본 개시내용의 인슐린 분자의 임의의 다른 이용가능한 아미노 기는 하기 일반식의 지방산 잔기에 공유 연결된다:
Figure 112014006288597-pat00012
(여기서, RF는 수소 또는 C1 -30 알킬 기임). 일부 실시양태에서, RF는 C1 -20 알킬 기, C3 -19 알킬 기, C5-18 알킬 기, C6 -17 알킬 기, C8 -16 알킬 기, C10 -15 알킬 기 또는 C12 -14 알킬 기이다. 특정 실시양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 A1 위치의 잔기에서 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 B1 위치의 잔기에서 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 위치 B29의 Lys의 엡실론-아미노 기의 잔기에서 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자의 위치 B28은 Lys이고 LysB28의 엡실론-아미노 기가 지방산 잔기에 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자의 위치 B3은 Lys이고 LysB3의 엡실론-아미노 기가 지방산 잔기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 지방산 쇄는 8개 내지 20개 탄소 길이이다. 일부 실시양태에서, 지방산은 옥탄산 (C8), 노난산 (C9), 데칸산 (C10), 운데칸산 (C11), 도데칸산 (C12) 또는 트리데칸산 (C13)이다. 특정 실시양태에서, 지방산은 미리스트산 (C14), 펜타데칸산 (C15), 팔미트산 (C16), 헵타데칸산 (C17), 스테아르산 (C18), 노나데칸산 (C19) 또는 아라키드산 (C20)이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: LysB28ProB29-인간 인슐린 (인슐린 리스프로), AspB28-인간 인슐린 (인슐린 아스파르트), LysB3GluB29-인간 인슐린 (인슐린 글루리신), ArgB31ArgB32-인간 인슐린 (인슐린 글라진), NεB29-미리스토일-des(B30)-인간 인슐린 (인슐린 데테미르), AlaB26-인간 인슐린, AspB1-인간 인슐린, ArgA0-인간 인슐린, AspB1GluB13-인간 인슐린, GlyA21-인간 인슐린, GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, ArgA0ArgB31ArgB32-인간 인슐린, ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, des(B30)-인간 인슐린, des(B27)-인간 인슐린, des(B28-B30)-인간 인슐린, des(B1)-인간 인슐린, des(B1-B3)-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-팔미토일-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-인간 인슐린, NεB28-팔미토일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-팔미토일-des(B30)-인간 인슐린, NεB30-미리스토일-ThrB29LysB30-인간 인슐린, NεB30-팔미토일-ThrB29LysB30-인간 인슐린, NεB29-(N-팔미토일-γ-글루타밀)-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-(N-리토콜릴-γ-글루타밀)-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-(ω-카르복시헵타데카노일)-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-(ω-카르복시헵타데카노일)-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-옥타노일-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-GlyA21ArgB31ArgB31-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-ArgA0GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-ArgA0GlyA21AspB3ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-미리스토일-ArgA0ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-ArgA0GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-ArgB0GlyA21AspB3ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-ArgA0ArgB31ArgB32-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 폴리펩티드 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-미리스토일-GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-GlyA21GlnB3LysB28ProB30ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-ArgA0GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-ArgA0GlyA21GlnB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-ArgA0GlyA21AspB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-미리스토일-ArgA0LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-옥타노일-GlyA21GlnB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-ArgA0GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-ArgA0GlyA21GlnB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-ArgA0GlyA21AspB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-ArgA0LysB28ProB29ArgB31ArgB32-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-데카노일-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-GlyA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlyA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlyA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlyA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-GlyA21GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlyA21GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlyA21-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlyA21-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-AlaA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-AlaA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-데카노일-AlaA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-AlaA21-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-AlaA21-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-AlaA21GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-데카노일-AlaA21GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-AlaA21GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlnB3-des(B30)-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-AlaA21-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-AlaA21-인간 인슐린, NεB29-데카노일-AlaA21-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-AlaA21-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GlyA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlyA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlyA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlyA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-AlaA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-AlaA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-데카노일-AlaA21GlnB3-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-AlaA21GlnB3-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GlnB3-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlnB3-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlnB3-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlnB3-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GluB30-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GluB30-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GluB30-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GluB30-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GlyA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlyA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlyA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlyA21GluB30-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GlyA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlyA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlyA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlyA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-AlaA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-AlaA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-데카노일-AlaA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-AlaA21GluB30-인간 인슐린, NεB29-트리데카노일-AlaA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-AlaA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-데카노일-AlaA21GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-AlaA21GlnB3GluB30-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-트리데카노일-GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-테트라데카노일-GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-데카노일-GlnB3GluB30-인간 인슐린, NεB29-도데카노일-GlnB3GluB30-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-포르밀-인간 인슐린, NαB1-포르밀-인간 인슐린, NαA1-포르밀-인간 인슐린, NεB29-포르밀-NαB1-포르밀-인간 인슐린, NεB29-포르밀-NαA1-포르밀-인간 인슐린, NαA1-포르밀-NαB1-포르밀-인간 인슐린, NεB29-포르밀-NαA1-포르밀-NαB1-포르밀-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-아세틸-인간 인슐린, NαB1-아세틸-인간 인슐린, NαA1-아세틸-인간 인슐린, NεB29-아세틸-NαB1-아세틸-인간 인슐린, NεB29-아세틸-NαA1-아세틸-인간 인슐린, NαA1-아세틸-NαB1-아세틸-인간 인슐린, NεB29-아세틸-NαA1-아세틸-NαB1-아세틸-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-프로피오닐-인간 인슐린, NαB1-프로피오닐-인간 인슐린, NαA1-프로피오닐-인간 인슐린, NεB29-아세틸-NαB1-프로피오닐-인간 인슐린, NεB29-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-인간 인슐린, NαA1-프로피오닐-NαB1-프로피오닐-인간 인슐린, NεB29-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-NαB1-프로피오닐-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-부티릴-인간 인슐린, NαB1-부티릴-인간 인슐린, NαA1-부티릴-인간 인슐린, NεB29-부티릴-NαB1-부티릴-인간 인슐린, NεB29-부티릴-NαA1-부티릴-인간 인슐린, NαA1-부티릴-NαB1-부티릴-인간 인슐린, NεB29-부티릴-NαA1-부티릴-NαB1-부티릴-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-펜타노일-인간 인슐린, NαB1-펜타노일-인간 인슐린, NαA1-펜타노일-인간 인슐린, NεB29-펜타노일-NαB1-펜타노일-인간 인슐린, NεB29-펜타노일-NαA1-펜타노일-인간 인슐린, NαA1-펜타노일-NαB1-펜타노일-인간 인슐린, NεB29-펜타노일-NαA1-펜타노일-NαB1-펜타노일-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-헥사노일-인간 인슐린, NαB1-헥사노일-인간 인슐린, NαA1-헥사노일-인간 인슐린, NεB29-헥사노일-NαB1-헥사노일-인간 인슐린, NεB29-헥사노일-NαA1-헥사노일-인간 인슐린, NαA1-헥사노일-NαB1-헥사노일-인간 인슐린, NεB29-헥사노일-NαA1-헥사노일-NαB1-헥사노일-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-헵타노일-인간 인슐린, NαB1-헵타노일-인간 인슐린, NαA1-헵타노일-인간 인슐린, NεB29-헵타노일-NαB1-헵타노일-인간 인슐린, NεB29-헵타노일-NαA1-헵타노일-인간 인슐린, NαA1-헵타노일-NαB1-헵타노일-인간 인슐린, NεB29-헵타노일-NαA1-헵타노일-NαB1-헵타노일-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NαB1-옥타노일-인간 인슐린, NαA1-옥타노일-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-NαB1-옥타노일-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-NαA1-옥타노일-인간 인슐린, NαA1-옥타노일-NαB1-옥타노일-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-NαA1-옥타노일-NαB1-옥타노일-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-노나노일-인간 인슐린, NαB1-노나노일-인간 인슐린, NαA1-노나노일-인간 인슐린, NεB29-노나노일-NαB1-노나노일-인간 인슐린, NεB29-노나노일-NαA1-노나노일-인간 인슐린, NαA1-노나노일-NαB1-노나노일-인간 인슐린, NεB29-노나노일-NαA1-노나노일-NαB1-노나노일-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-데카노일-인간 인슐린, NαB1-데카노일-인간 인슐린, NαA1-데카노일-인간 인슐린, NεB29-데카노일-NαB1-데카노일-인간 인슐린, NεB29-데카노일-NαA1-데카노일-인간 인슐린, NαA1-데카노일-NαB1-데카노일-인간 인슐린, NεB29-데카노일-NαA1-데카노일-NαB1-데카노일-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-포르밀-NαB1-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-포르밀-NαA1-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-포르밀-NαB1-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-포르밀-NαA1-포르밀-NαB1-포르밀-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB29-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-아세틸-NαB1-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-아세틸-NαA1-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-아세틸-NαB1-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-아세틸-NαA1-아세틸-NαB1-아세틸-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-프로피오닐-NαB1-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-프로피오닐-NαB1-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-NαB1-프로피오닐-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-부티릴-NαB1-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-부티릴-NαA1-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-부티릴-NαB1-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-부티릴-NαA1-부티릴-NαB1-부티릴-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-펜타노일-NαB1-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-펜타노일-NαA1-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-펜타노일-NαB1-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-펜타노일-NαA1-펜타노일-NαB1-펜타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-헥사노일-NαB1-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-헥사노일-NαA1-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-헥사노일-NαB1-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-헥사노일-NαA1-헥사노일-NαB1-헥사노일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-헵타노일-NαB1-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-헵타노일-NαA1-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-헵타노일-NαB1-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-헵타노일-NαA1-헵타노일-NαB1-헵타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-NαB1-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-NαA1-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-옥타노일-NαB1-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-옥타노일-NαA1-옥타노일-NαB1-옥타노일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-노나노일-NαB1-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-노나노일-NαA1-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-노나노일-NαB1-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-노나노일-NαA1-노나노일-NαB1-노나노일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB28-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαB1-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-데카노일-NαB1-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-데카노일-NαA1-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NαA1-데카노일-NαB1-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린, NεB28-데카노일-NαA1-데카노일-NαB1-데카노일-LysB28ProB29-인간 인슐린.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 하기하는 인슐린 분자 중 하나의 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체를 포함한다: NεB29-펜타노일-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NαB1-헥사노일-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NαA1-헵타노일-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-NαB1-옥타노일-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NαA1-아세틸-NαB1-아세틸-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-포르밀-NαA1-포르밀-NαB1-포르밀-GlyA21ArgB31ArgB32-인간 인슐린, NεB29-포르밀-des(B26)-인간 인슐린, NαB1-아세틸-AspB28-인간 인슐린, NεB29-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-NαB1-프로피오닐-AspB1AspB3AspB21-인간 인슐린, NεB29-펜타노일-GlyA21-인간 인슐린, NαB1-헥사노일-GlyA21-인간 인슐린, NαA1-헵타노일-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-옥타노일-NαB1-옥타노일-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-프로피오닐-NαA1-프로피오닐-GlyA21-인간 인슐린, NαA1-아세틸-NαB1-아세틸-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-포르밀-NαA1-포르밀-NαB1-포르밀-GlyA21-인간 인슐린, NεB29-부티릴-des(B30)-인간 인슐린, NαB1-부티릴-des(B30)-인간 인슐린, NαA1-부티릴-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-부티릴-NαB1-부티릴-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-부티릴-NαA1-부티릴-des(B30)-인간 인슐린, NαA1-부티릴-NαB1-부티릴-des(B30)-인간 인슐린, NεB29-부티릴-NαA1-부티릴-NαB1-부티릴-des(B30)-인간 인슐린.
본 개시내용은 또한 상기 언급된 돌연변이체 및/또는 화학적 변형체 중 임의의 것을 포함하는 변형된 형태의 비-인간 인슐린 (예를 들어, 돼지 인슐린, 소 인슐린, 토끼 인슐린, 양 인슐린 등)을 포함한다.
이들 및 기타 변형된 인슐린 분자는 하기 문헌에 상세하게 기재되어 있다 (이들 문헌의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함됨):
Figure 112014006288597-pat00013
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 인슐린 분자는 3개의 야생형 디술피드 브릿지 (즉, A-쇄의 위치 7과 B-쇄의 위치 7 사이에 하나, A-쇄의 위치 20과 B-쇄의 위치 19 사이에 하나, 및 A-쇄의 위치 6과 위치 11 사이에 하나)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인슐린 분자는 인슐린 수용체에 대한 그의 친화도가 감소되도록 변형 및/또는 돌연변이된다. 특정 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 변형 (예를 들어, 아실화) 또는 돌연변이를 통해 인슐린 분자의 수용체 친화도를 감쇠시키는 것이 인슐린 분자가 혈청으로부터 제거되는 속도를 감소시킬 수 있다고 여겨진다. 일부 실시양태에서, 인슐린 접합체의 시험관내 감소된 인슐린 수용체 친화도는 보다 우수한 생체내 활성으로 해석된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자를 돌연변이시켜서 돌연변이 부위가 접합 지점으로 사용되도록 하고, 돌연변이된 부위에서의 접합은 인슐린 수용체에 대한 결합을 감소시킨다 (예를 들어, LysA3). 다른 특정 실시양태에서, 기존 야생형 아미노산 또는 말단에서의 접합은 인슐린 수용체에 대한 결합을 감소시킨다 (예를 들어, GlyA1). 일부 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A4, A5, A8, A9 또는 B30에서 접합된다. 특정 실시양태에서, 위치 A4, A5, A8, A9 또는 B30에서의 접합은 야생형 아미노산 측쇄를 통해 일어난다 (예를 들어, GluA4). 다른 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 위치 A4, A5, A8, A9 또는 B30에서 돌연변이되어 접합 부위를 제공한다 (예를 들어, LysA4, LysA5, LysA8, LysA9 또는 LysB30).
인슐린 분자를 비롯한 약물을 접합시키는 방법을 하기 기재한다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 리간드 또는 접합체 프레임워크에 접합된다. 특정 실시양태에서, A1 아미노산 잔기는 글리신이다. 그러나, 본 개시내용이 N-말단 접합으로 제한되지 않으며 특정 실시양태에서는 인슐린 분자가 비-말단 A-쇄 아미노산 잔기를 통해 접합될 수 있음을 이해해야 한다. 특히, 본 개시내용은 A-쇄의 임의의 위치에 존재하는 리신 잔기 (야생형 또는 부위-지정 돌연변이유발로 도입됨)의 엡실론-아민 기를 통한 접합을 포함한다. A-쇄에서의 상이한 접합 위치가 인슐린 활성의 상이한 감소를 야기할 수 있음을 알 것이다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합체 프레임워크에 접합된다. 특정 실시양태에서, B1 아미노산 잔기는 페닐알라닌이다. 그러나, 본 개시내용이 N-말단 접합으로 제한되지 않으며 특정 실시양태에서는 인슐린 분자가 비-말단 B-쇄 아미노산 잔기를 통해 접합될 수 있음을 이해해야 한다. 특히, 본 개시내용은 B-쇄의 임의의 위치에 존재하는 리신 잔기 (야생형 또는 부위-지정 돌연변이유발로 도입됨)의 엡실론-아민 기를 통한 접합을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 B29 리신 잔기를 통해 접합될 수 있다. 인슐린 글루리신의 경우, B3 리신 잔기를 통한 적어도 1개의 리간드에 대한 접합이 사용될 수 있다. B-쇄에서의 상이한 접합 위치가 인슐린 활성의 상이한 감소를 야기할 수 있음을 알 것이다.
특정 실시양태에서, 리간드는 약물, 예컨대 인슐린 분자상의 1개 초과의 접합 지점에 접합된다. 예를 들어, 인슐린 분자는 A1 N-말단과 B29 리신 둘다에서 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미드 접합이 카르보네이트 완충제 중에서 일어나서 B29 및 A1 위치에서 접합되지만 B1 위치에서는 접합되지 않는다. 다른 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 N-말단, B1 N-말단 및 B29 리신에서 접합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 보호기가 사용되어 접합이 B1 및 B29 또는 B1 및 A1 위치에서 일어난다. 인슐린 분자상의 접합 지점의 임의의 조합이 사용될 수 있음을 알 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 접합 지점이 돌연변이된 리신 잔기, 예를 들어 LysA3이다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 인슐린 감작제 (즉, 인슐린의 작용을 강화시키는 약물)를 포함할 수 있다. 인슐린의 효과를 강화시키는 약물은 비구아니드 (예를 들어, 메트포르민) 및 글리타존을 포함한다. 최초의 글리타존 약물은 중증의 부작용을 갖는 것으로 밝혀진 트로글리타존이었다. 제2 세대 글리타존은 보다 잘 허용되는 피오글리타존 및 로시글리타존을 포함하지만, 로시글리타존은 특정 실험에서 유해한 심혈관 사건과 관련이 있었다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 인슐린 분비촉진제 (즉, 췌장 베타 세포에 의한 인슐린 분비를 자극하는 약물)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 접합체는 술포닐우레아를 포함할 수 있다. 술포닐우레아는 췌장 베타 세포를 글루코스 작용에 대해 감작화하여 췌장 베타 세포에 의한 인슐린 분비를 자극한다. 추가로, 술포닐우레아는 글루카곤 분비를 억제하고 표적 조직이 인슐린의 작용에 감수성을 갖게 할 수 있다. 제1 세대 술포닐우레아는 톨부타미드, 클로르프로파미드 및 카르부타미드를 포함한다. 더 낮은 용량에서 활성인 제2 세대 술포닐우레아는 글리피지드, 글리벤클라미드, 글리클라지드, 글리보르누라이드 및 글리메피리드를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 접합체는 메글리티니드를 포함할 수 있다. 적합한 메글리티니드는 나테글리니드, 미티글리니드 및 레파글리니드를 포함한다. 이것들의 저혈당 작용은 술포닐우레아의 저혈당 작용보다 더 신속하고 더 짧다. 다른 인슐린 분비촉진제는 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1) 및 GLP-1 유사체 (즉, 1개 내지 10개 아미노산의 치환, 부가 또는 결실 및/또는 화학적 변형에 의해 GLP-1과 상이한, GLP-1 유사 생물활성을 갖는 펩티드)를 포함한다. GLP-1은 중추 작용을 통해 위 공복을 억제하고 포만감을 증가시키고 글루카곤 분비를 저해하여 음식물 섭취를 감소시킨다. GLP-1은 췌장 도세포 증식을 증가시켜서 혈장 글루코스 수준을 저하시키고 음식물 섭취 후 인슐린 생성을 증가시킨다. GLP-1의 생체내 반감기를 연장시키기 위해서는 리라글루티드에서와 같이 예를 들어 지질 접합에 의해 GLP-1을 화학적으로 변형시킬 수 있다. 다른 인슐린 분비촉진제는 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유사체 (즉, 1개 내지 10개 아미노산의 치환, 부가 또는 결실 및/또는 화학적 변형에 의해 엑센딘-4와 상이한, 엑센딘-4 유사 생물활성을 갖는 펩티드)를 포함한다. 엑센딘-4는 미국 독도마뱀의 독에서 발견되며, GLP-1 유사 생물활성을 나타낸다. 엑센딘-4는 GLP-1과는 달리 GLP-1보다 훨씬 더 긴 반감기를 가지며, N-말단에서 8개의 아미노산 잔기가 생물활성의 손실 없이 말단절단될 수 있다. GLP-1 및 엑센딘-4의 N-말단 영역은 거의 동일하며, 유의한 차이는 두번째 아미노산 잔기로서 GLP-1에서는 알라닌이고 엑센딘-4에서는 글리신이며, 이것이 엑센딘-4에 생체내 소화에 대한 내성을 제공한다. 엑센딘-4는 또한 GLP-1과 비교할 때 C-말단에 여분의 9개 아미노산 잔기를 갖는다. 문헌 [Mann et al., Biochem. Soc. Trans. 35:713-716, 2007] 및 [Runge et al., Biochemistry 46:5830-5840, 2007]은 본 개시내용의 접합체에서 사용될 수 있는 다양한 GLP-1 및 엑센딘-4 유사체를 기재한다. GLP-1의 짧은 반감기는 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의한 효소 소화로 인한다. 특정 실시양태에서, 내인성 GLP-1의 효과는 DPP-IV 억제제 (예를 들어, 빌다글립틴, 시타글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴 또는 알로글립틴)의 투여에 의해 증진될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 접합체는 아밀린 또는 아밀린 유사체 (즉, 1개 내지 10개 아미노산의 치환, 부가 또는 결실 및/또는 화학적 변형에 의해 아밀린과 상이한, 아밀린 유사 생물활성을 갖는 펩티드)를 포함할 수 있다. 아밀린은 글루코스 조절에 있어서 중요한 역할을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Edelman and Weyer, Diabetes Technol. Ther. 4:175-189, 2002] 참조). 아밀린은 음식물 섭취에 대한 반응으로 췌장 베타 세포에 의해 인슐린과 동시 분비되는 신경내분비 호르몬이다. 인슐린은 혈류로부터의 글루코스 제거를 조절하는 기능을 하지만, 아밀린은 위 및 간으로부터 혈류로 글루코스가 진입하는 것의 조절을 돕는 기능을 한다. 프람린티드 아세테이트 (심린(SYMLIN)®)는 예시적인 아밀린 유사체이다. 천연 인간 아밀린은 아밀로이드생성 성질을 갖기 때문에, 프람린티드를 디자인하는 전략은 특정 잔기를 아밀로이드생성 성질을 갖지 않는 래트 아밀린의 잔기로 치환하는 것을 수반하였다. 특히, 프롤린 잔기가 구조-파괴 잔기인 것으로 공지되어 있어서, 이것을 래트 서열로부터 인간 서열로 직접 이식하였다. Glu-10 또한 아스파라진으로 치환시켰다.
다양한 실시양태에서, 사전 접합된 약물은 1개 이상의 반응성 잔기 (예를 들어, 카르복실 또는 반응성 에스테르, 아민, 히드록실, 알데히드, 술피드릴, 말레이미딜, 알키닐, 아지도 등의 잔기)를 함유할 수 있다. 하기 논의된 바와 같이, 이들 반응성 잔기는 특정 실시양태에서 접합 과정을 용이하게 할 수 있다. 구체적인 예는 알파-말단 아민 및/또는 엡실론-아민 리신 기를 보유하는 펩티드계 약물을 포함한다. 임의의 이들 반응성 잔기가 공지의 약물에 존재하지 않는다면 이것을 인공적으로 부가할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 펩티드계 약물의 경우, 적합한 아미노산 (예를 들어, 리신)을 아미노산 서열에 부가하거나 치환시킬 수 있다. 추가로, 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 접합 과정은 접합 이전에 특정 반응성 잔기를 선택적으로 차단하여 제어될 수 있음을 알 것이다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체를 이용하여 글루코스와 인슐린 사이의 천연 피드백 메카니즘 (글루코스 수준이 증가함에 따라 인슐린 수준이 증가하고, 인슐린 수준이 증가함에 따라 글루코스 수준이 감소됨)을 조절할 수 있다. 대안적으로, 다양한 실시양태에서, 약물은 (a) 인슐린과 동일한 기능 (예를 들어, 글루코스 수준을 감소시킴)을 갖고/갖거나, (b) 인슐린의 생성을 자극하고/하거나, (c) 인슐린의 효과(들)을 증진시키는 분자일 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 인슐린 대신에 인슐린 분비촉진제 또는 인슐린 감작제를 약물로서 사용할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 글루코스와 직접적으로 관련이 없는 기능을 갖는 약물을 포함하는 접합체가 사용될 수 있다. 비-제한적으로, 글루코스에 반응하는 접합체가 사용되어 약물의 장기간의 식사시간 투여를 제공할 수 있다. 정기적으로 및/또는 식사와 함께 투여될 필요가 있는 임의의 약물이 이러한 전달 시스템으로 인해 이로울 것이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 많은 통상적인 약물이 음식과 함께 또는 식사시간에 투여될 필요가 있다. 예를 들어, 지방 흡수를 억제하는 약물 (예를 들어, 오를리스타트)은 식사시간 동안 존재하는 것이 유리하다. 유사하게, 지질 수준을 저하시키는 약물, 예를 들어 로바스타틴, 아토르바스타틴 또는 심바스타틴, 또는 트리글리세리드 수준을 저하시키는 약물, 예를 들어 겜피브로질 역시 식사시간에 방출되는 것이 유리할 수 있다.
예시적인 인슐린 접합체
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA) 및 아미노에틸푸코스 (AEF)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1종 이상의 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1개 이상의 아미노에틸글루코스 (AEG) 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1개 이상의 아미노에틸만노스 (AEM) 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1개 이상의 아미노에틸비만노스 (AEBM) 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1개 이상의 아미노에틸트리만노스 (AETM) 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1개 이상의 β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA) 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1개 이상의 아미노에틸푸코스 (AEF) 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 2개 이상의 별개의 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 2개의 별개의 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 3개의 별개의 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 4개의 별개의 리간드에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 아미노에틸글루코스 (AEG)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 아미노에틸만노스 (AEM)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 아미노에틸비만노스 (AEBM)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 아미노에틸트리만노스 (AETM)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 아미노에틸푸코스 (AEF)이다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 인슐린 분자에도 접합된 단일 접합체 프레임워크에 접합된 2개 이상의 별개의 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드 및 인슐린 분자는 단일 분지형 접합체 프레임워크의 별개의 분지에 각각 위치한다. 일부 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드 및 인슐린 분자는 단일 분지형 접합체 프레임워크의 별개의 분지의 말단에 각각 위치한다. 일부 실시양태에서, 이러한 접합체의 2개 이상의 별개의 리간드는 2개 이상의 상이한 접합 지점을 통해 인슐린 분자에 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 1개 이상의 별개의 리간드에 각각 접합된 2개의 별개의 접합체 프레임워크에 접합된다. 다른 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 1개의 리간드에 각각 접합된 2개의 별개의 접합체 프레임워크에 접합된다. 다른 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 2개의 리간드에 각각 접합된 2개의 별개의 분지형 접합체 프레임워크에 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 리간드는 분지형 접합체 프레임워크의 별개의 분지에 위치한다. 다른 이러한 실시양태에서, 리간드는 분지형 접합체 프레임워크의 별개의 분지의 말단에 위치한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 아미노에틸글루코스 (AEG)에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 아미노에틸만노스 (AEM)에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 아미노에틸비만노스 (AEBM)에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 아미노에틸트리만노스 (AETM)에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA)에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 아미노에틸푸코스 (AEF)에 접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 B1 아미노산 잔기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 LysB3의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된 인슐린 글루리신이다. 특정 이러한 실시양태에서, 인슐린 분자는 A1 아미노산 잔기 및 LysB29의 엡실론-아미노 기를 통해 접합된다.
접합체 프레임워크
본 섹션은 일부 예시적인 접합체 프레임워크를 기재한다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 하기 화학식 I을 가질 수 있다:
<화학식 I>
Figure 112014006288597-pat00014
상기 식에서,
각 경우의
Figure 112014006288597-pat00015
는 접합체 내의 잠재적 분지를 나타내고,
각 경우의
Figure 112014006288597-pat00016
는 접합체 분지 내의 잠재적 반복부를 나타내고,
각 경우의
Figure 112014006288597-pat00017
는 독립적으로 공유 결합, 탄소 원자, 헤테로원자, 또는 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이고,
각 경우의 T는 독립적으로 공유 결합 또는 2가의 직쇄형 또는 분지형의 포화 또는 불포화의 임의로 치환된 C1 -30 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기 또는 헤테로아릴 기에 의해 임의로 및 독립적으로 대체되고,
각 경우의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 아실 잔기, 아릴알킬 잔기, 지방족 잔기, 아릴 잔기, 헤테로아릴 잔기 또는 헤테로지방족 잔기이고,
-B는 -T-LB-X이고,
각 경우의 X는 독립적으로 리간드이고,
각 경우의 LB는 독립적으로 공유 결합, 또는 T와 X의 공유 접합으로부터 유도된 기이고,
-D는 -T-LD-W이고,
각 경우의 W는 독립적으로 약물이고,
각 경우의 LD는 독립적으로 공유 결합, 또는 T와 W의 공유 접합으로부터 유도된 기이고,
k는 1 내지 12의 정수이고,
q는 1 내지 4의 정수이고,
각 경우의 p는 독립적으로 1 내지 5의 정수이고,
각 경우의 n은 독립적으로 0 내지 5의 정수이고,
각 경우의 m은 독립적으로 1 내지 5의 정수이고,
각 경우의 v는 독립적으로 0 내지 5의 정수이지만,
단, 각각의 k-분지 내에서 적어도 1개 경우의 n은 ≥ 1이고 적어도 1개 경우의 v는 ≥ 1이다.
화학식 I (및 본원의 다른 화학식)이 명백하게 모두 수소를 나타내는 것은 아님을 이해해야 한다. 예를 들어, 중앙의
Figure 112014006288597-pat00018
가 C6 아릴 기이고 k + q < 6인 경우에는 상기 C6 아릴 고리의 비어있는 위치(들)이 수소를 포함한다는 것을 알 것이다.
일반적으로, 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00019
가 잠재적인 분지점을 나타내고, 각 분지점에서의 분지 수는 중앙의
Figure 112014006288597-pat00020
의 경우에는 k 값에 따라, 중앙의 것이 아닌
Figure 112014006288597-pat00021
의 경우에는 n의 값에 따라 결정된다는 것을 알 것이다. 당업자는 각 경우의 n이 0 내지 5의 정수일 수 있기 때문에 본 개시내용이 이들 접합체의 직쇄형, 분지형 및 초분지형 (예를 들어, 덴드리머-유사) 실시양태를 고려한다는 것을 알 것이다. 각각의 k-분지 내에서 적어도 1개 경우의 n은 ≥ 1이고 적어도 1개 경우의 v는 ≥ 1일 것을 요구하는 조건부는, 모든 접합체가 적어도 1개의 B (즉, 리간드)를 포함하게 한다.
특정 실시양태에서, p-괄호 표시된 잔기 내 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00022
는 n ≥ 1의 값에 상응하는 수의 n-괄호 표시된 잔기로 치환된다. 예를 들어, k = 2이고 2개의 k-분지 모두에서 p = 2인 경우에 상기 접합체는 하기 화학식 Ia를 가질 수 있다:
<화학식 Ia>
Figure 112014006288597-pat00023
다른 실시양태에서, p-괄호 표시된 잔기 내에서 오직 말단의
Figure 112014006288597-pat00024
만이 n ≥ 1의 값에 상응하는 수의 n-괄호 표시된 잔기로 치환된다. 예를 들어, k = 2이고 2개의 k-분지 모두에서 p = 2 (및 2개의 k-분지 모두에서 제1 p-괄호 표시된 잔기는 n = 0)인 경우에 상기 접합체는 하기 화학식 Ib를 가질 수 있다:
<화학식 Ib>
Figure 112014006288597-pat00025
특정 실시양태에서, m-괄호 표시된 잔기 내 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00026
는 v ≥ 1의 값에 상응하는 수의 B 잔기로 치환된다. 예를 들어, k = 2, 각 경우의 p = 1, 및 각 경우의 m = 2인 경우에 상기 접합체는 하기 화학식 Ic를 가질 수 있다:
<화학식 Ic>
Figure 112014006288597-pat00027
다른 실시양태에서, m-괄호 표시된 잔기 내에서 오직 말단의
Figure 112014006288597-pat00028
만이 v ≥ 1의 값에 상응하는 수의 B 잔기로 치환된다. 예를 들어, k = 2, 각 경우의 p = 1, 및 각 경우의 m = 2 (및 각각의 n-분지에서 제1 m-괄호 표시된 잔기는 v = 0)인 경우에 상기 접합체는 하기 화학식 Id를 가질 수 있다:
<화학식 Id>
Figure 112014006288597-pat00029
추가의 예로서, q = 1이고 상기 화학식의 2개의 k-분지 모두에서 n = 1인 경우에 상기 접합체는 하기 화학식 Ie를 가질 수 있다:
<화학식 Ie>
Figure 112014006288597-pat00030
대안적으로, q = 1이고 상기 화학식의 2개의 k-분지 모두에서 n = 2인 경우에 상기 접합체는 하기 화학식 If를 가질 수 있다:
<화학식 If>
Figure 112014006288597-pat00031
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 접합체 프레임워크에 비공유 결합된 리간드 및/또는 약물을 포함하는 접합체를 제공한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은
각각의
Figure 112014006288597-pat00032
, T, D, k, q, p, n, m 및 v가 상기 및 본원에서 기재된 바와 같이 정의되고,
-B가 -T-LRPB-X이고,
각 경우의 X가 독립적으로 리간드이고,
각 경우의 LRPB가 독립적으로 T 및 X 사이에서 인간 혈청 중에서의 해리 상수 1 pmol/L 미만의 비공유 결합을 형성하는 리간드-수용체 쌍인
임의의 상기 화학식의 접합체를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은
각각의
Figure 112014006288597-pat00033
, T, B, k, q, p, n, m 및 v가 상기 및 본원에서 기재된 바와 같이 정의되고,
-D가 -T-LRPD-W이고,
각 경우의 W는 독립적으로 약물이고,
각 경우의 LRPD가 독립적으로 T 및 W 사이에서 인간 혈청 중에서의 해리 상수 1 pmol/L 미만의 비공유 결합을 형성하는 리간드-수용체 쌍인
임의의 상기 화학식의 접합체를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은
각각의
Figure 112014006288597-pat00034
, T, k, q, p, n, m 및 v가 상기 및 본원에서 기재된 바와 같이 정의되고,
-B가 -T-LRPB-X이고,
각 경우의 X가 독립적으로 리간드이고,
각 경우의 LRPB가 독립적으로 T 및 X 사이에서 인간 혈청 중에서의 해리 상수 1 pmol/L 미만의 비공유 결합을 형성하는 리간드-수용체 쌍이고,
-D가 -T-LRPD-W이고,
각 경우의 W가 독립적으로 약물이고,
각 경우의 LRPD가 독립적으로 T 및 W 사이에서 인간 혈청 중에서의 해리 상수 1 pmol/L 미만의 비공유 결합을 형성하는 리간드-수용체 쌍인
임의의 상기 화학식의 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 하기 화학식 II를 가질 수 있다:
<화학식 II>
Figure 112014006288597-pat00035
상기 식에서,
Figure 112014006288597-pat00036
, B, T, D, v, m, n, p 및 k는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같고, j는 1 내지 4의 정수이다. 화학식 II의 접합체는 약물에 대한 리간드의 다중 접합 부위를 가질 수 있다 (즉, 2개 이상의 리간드가 약물상의 상이한 부위, 예를 들어 생체분자 약물 내 상이한 아미노산을 통해 단일 약물 분자에 접합됨). q가 1인 경우에는 상기 기재된 하위군 (즉, 화학식 Ia 내지 If)이 j가 1인 화학식 II의 접합체에 적용된다는 것을 알 것이다. 마찬가지로, 당업자는 j가 2, 3 또는 4인 접합체의 경우에 유사한 하위군을 고려할 수 있다.
예시하고 혼동을 피하기 위해서, 화학식 II의 접합체에서
Figure 112014006288597-pat00037
인 경우 (즉, j가 2인 경우)가
Figure 112014006288597-pat00038
(약물이 접합체 프레임워크에 공유 결합된 경우) 또는
Figure 112014006288597-pat00039
(약물이 접합체 프레임워크에 비공유 결합된 경우)로 표시될 수 있음을 이해해야 한다.
예시적인 기에 대한 설명
Figure 112014006288597-pat00040
(분지점)
특정 실시양태에서, 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00041
는 독립적으로 아실, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의로 치환된 기이다. 일부 실시양태에서, 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00042
는 동일하다. 일부 실시양태에서, 중앙의
Figure 112014006288597-pat00043
는 모든 다른 경우의
Figure 112014006288597-pat00044
와 상이하다. 특정 실시양태에서, 중앙의
Figure 112014006288597-pat00045
를 제외한 모든 경우의
Figure 112014006288597-pat00046
는 동일하다.
일부 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00047
는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기이다. 일부 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00048
는 6원 아릴이다. 특정 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00049
는 페닐이다.
특정 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00050
는 N, O 또는 S로부터 선택된 헤테로원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00051
는 질소 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00052
는 산소 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00053
는 황 원자이다. 일부 실시양태에서,
Figure 112014006288597-pat00054
는 탄소 원자이다.
T ( 스페이서 )
특정 실시양태에서, 각 경우의 T는 독립적으로 2가의 직쇄형 또는 분지형의 포화 또는 불포화의 임의로 치환된 C1 -20 탄화수소 쇄이고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기 또는 헤테로아릴 기에 의해 임의로 및 독립적으로 대체된다. 특정 실시양태에서, T의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 메틸렌 단위가 임의로 및 독립적으로 대체된다. 특정 실시양태에서, T는 C1 -10, C1 -8, C1 -6, C1 -4, C2 -12, C4 -12, C6 -12, C8 -12 또는 C10 -12 탄화수소 쇄로부터 구축되고, 여기서 T의 1개 이상의 메틸렌 단위는 -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, -SO2N(R)-, 헤테로시클릭 기, 아릴 기 또는 헤테로아릴 기에 의해 임의로 및 독립적으로 대체된다. 일부 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위가 헤테로시클릭 기에 의해 대체된다. 일부 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위가 트리아졸 잔기에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위가 -C(O)-에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위가 -C(O)N(R)-에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, T의 1개 이상의 메틸렌 단위가 -O-에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, T는
Figure 112014006288597-pat00055
이다.
일부 실시양태에서, T는
Figure 112014006288597-pat00056
이다.
일부 실시양태에서, T는
Figure 112014006288597-pat00057
이다.
일부 실시양태에서, T는
Figure 112014006288597-pat00058
이다.
일부 실시양태에서, T는
Figure 112014006288597-pat00059
이다.
일부 실시양태에서, T는
Figure 112014006288597-pat00060
이다.
특정 실시양태에서, 각 경우의 T는 동일하다.
특정 실시양태에서, 각 경우의 T (기 B 및 D 외부의 T)는 공유 결합이고, 접합체는 하기 화학식 IV 또는 V를 갖는다:
<화학식 IV>
Figure 112014006288597-pat00061
<화학식 V>
Figure 112014006288597-pat00062
상기 식에서,
Figure 112014006288597-pat00063
, B, D, v, m, n, p, k 및 j는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
화학식 IV 및 V의 특정 실시양태에서, 중앙의
Figure 112014006288597-pat00064
를 제외한 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00065
는 공유 결합이고, 각 경우의 v = 1이며, 접합체는 하기 화학식 VI 또는 VII를 갖는다:
<화학식 VI>
Figure 112014006288597-pat00066
<화학식 VII>
Figure 112014006288597-pat00067
상기 식에서,
Figure 112014006288597-pat00068
, B, D, q, k 및 j는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
화학식 VI의 특정 이러한 실시양태에서, k = 1 및 q = 1이다.
다른 실시양태에서, k = 2 및 q = 1이다.
다른 실시양태에서, k = 3 및 q = 1이다.
다른 실시양태에서, k = 1 및 q = 2이다.
다른 실시양태에서, k = 2 및 q = 2이다.
화학식 VII의 특정 이러한 실시양태에서, k = 1 및 j = 2이다.
다른 실시양태에서, k = 2 및 j = 2이다.
다른 실시양태에서, k = 3 및 j = 2이다.
다른 실시양태에서, k = 1 및 j = 1이다.
다른 실시양태에서, k = 2 및 j = 1이다.
다른 실시양태에서, k = 3 및 j = 1이다.
다른 실시양태에서, k = 1 및 j = 3이다.
다른 실시양태에서, k = 2 및 j = 3이다.
다른 실시양태에서, k = 3 및 j = 3이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 VIa의 접합체를 제공한다:
<화학식 VIa>
Figure 112014006288597-pat00069
상기 식에서, B 및 D는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00070
상기 식에서, W 및 X는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 VIb의 접합체를 제공한다:
<화학식 VIb>
Figure 112014006288597-pat00071
상기 식에서, B 및 D는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00072
상기 식에서, W 및 X는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00073
상기 식에서, W 및 X는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 VIc의 접합체를 제공한다:
<화학식 VIc>
Figure 112014006288597-pat00074
상기 식에서, B 및 D는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00075
상기 식에서, W 및 X는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 VId 또는 VIe의 접합체를 제공한다:
<화학식 VId>
Figure 112014006288597-pat00076
<화학식 VIe>
Figure 112014006288597-pat00077
상기 식에서, B 및 D는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00078
상기 식에서, W 및 X는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
화학식 VIa, VIb, VIc, VId 및 VIe의 하위군 및 그의 부류가 j가 1인 화학식 VII의 접합체에 적용된다는 것을 알 것이다. 마찬가지로, 당업자는 j가 2, 3 또는 4인 화학식 VII의 접합체의 경우에 유사한 하위군 및 부류를 고려할 수 있다. 예를 들어, j가 2인 경우에, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00079
상기 식에서, B 및 D는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00080
상기 식에서, W, X 및 j는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 하기 화학식 VIII을 가질 수 있다:
<화학식 VIII>
Figure 112014006288597-pat00081
상기 식에서,
Figure 112014006288597-pat00082
, T, D, v, m 및 n은 화학식 I의 접합체에 대해 정의되고 기재된 바와 같고, B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00083
상기 식에서, W 및 X는 화학식 I의 접합체에 대해 정의되고 기재된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 접합체 스캐폴드는 화학식 I 또는 II가 아니라 거대고리이다. 일부 실시양태에서, 거대고리는 폴리아민 거대고리이다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 하기 화학식 IX를 가질 수 있다:
<화학식 IX>
Figure 112014006288597-pat00084
상기 식에서, D는 화학식 I의 접합체에 대해 정의되고 기재된 바와 같고, B는 -T-LB-X이고, 여기서 각 경우의 X는 독립적으로 사카라이드를 포함하는 리간드이다.
B ( 리간드 )
특정 실시양태에서, -B는 -T-LB-X (여기서, X는 리간드이고, LB는 공유 결합, 또는 X와 T의 공유 접합으로부터 유도된 기임)이다. 예시적인 리간드 및 그의 사카라이드 성분은 상기 기재되어 있다.
D (약물)
특정 실시양태에서, -D는 -T-LD-W (여기서, W는 약물이고, LD는 공유 결합, 또는 W와 T의 공유 접합으로부터 유도된 기임)이다. 예시적인 약물은 상기 기재되어 있다.
L B 및 L D (공유 접합)
당업자는 다양한 접합 화학을 이용하여 X를 T와 및/또는 W를 T와 (일반적으로 "성분들"을) 공유 접합시킬 수 있음을 알 것이다. 이러한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예시적인 기술은 하기에서 논의된다. 성분들은 직접 결합될 수도 있고 (즉, 개입하는 화학적 기 없이), 또는 스페이서 (예를 들어, 접합된 요소와 접합체 프레임워크의 나머지 부분 사이에 약간의 물리적 분리를 제공하는 커플링제 또는 공유 쇄)를 통해 간접적으로 결합될 수도 있다. 성분들이 임의의 수의 화학적 결합, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 아미드, 아민, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이소우레아, 이민 등의 결합을 통해 접합체 프레임워크에 공유 결합될 수 있음을 이해해야 한다. 특정 실시양태에서, LB 및/또는 LD (일반적으로, 본 섹션의 목적상 "L")는 공유 결합이다. 일부 실시양태에서, L은 T의 임의로 치환된 카르보닐-반응성, 티올-반응성, 아민-반응성 또는 히드록실-반응성 잔기를 X 또는 W의 카르복실, 티올, 아민 또는 히드록실 기와 접합시키는 것으로부터 유도된 임의로 치환된 잔기이다. 일부 실시양태에서, L은 X 또는 W의 임의로 치환된 카르복실-반응성, 티올-반응성, 아민-반응성 또는 히드록실-반응성 잔기를 T의 카르복실, 티올, 아민 또는 히드록실 기와 접합시키는 것으로부터 유도된 임의로 치환된 잔기이다. 일부 실시양태에서, L은
Figure 112014006288597-pat00085
이다. 일부 실시양태에서, L은 숙신이미드 잔기이다.
다양한 실시양태에서, 성분들은 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 "클릭 화학" 반응을 이용하여 접합체 프레임워크에 공유 결합될 수 있다. 이것은 예를 들어 고리화첨가 반응, 친핵성 개환 반응, 및 탄소-탄소 다중 결합으로의 부가를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kolb and Sharpless, Drug Discovery Today 8:1128-1137, 2003] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌, 및 또한 문헌 [Dondoni, Chem. Asian J. 2:700-708, 2007] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌 참조). 상기 논의된 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 성분들은 자연적인 또는 화학적으로 부가된 팬던트 기를 통해 접합체 프레임워크에 결합될 수 있다. 일반적으로, 반응성 기의 쌍의 제1 및 제2 구성원 (예를 들어, 반응하여 아미드 결합을 생성하는 카르복실 기 및 아민 기)이 성분 및 프레임워크 중 하나에 존재할 수 있음을 알 것이다 (즉, 2개 구성원의 상대적인 위치는 이것들이 반응하여 접합체를 생성하는 한은 상관 없음). 예시적인 연결부는 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
다양한 실시양태에서, 카르복실 (또는 반응성 에스테르) 보유 성분이 문헌 [Kim et al., Biomaterials 24:4843-4851 (2003)]에 약술된 절차를 이용하여 -OH 보유 프레임워크 (OBF)에 접합될 수 있다. 간략하게 설명하면, OBF를 카르복실 보유 성분과 함께 DMSO 중에 용해하고 N',N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)을 촉매로 사용하여 무수 분위기하에 반응시킨다. 카르복실 보유 성분을 -NH2 보유 프레임워크 (NBF)에 카르보디이미드 (EDAC) 커플링 절차를 이용하여 접합시킬 수 있다. 이 절차를 이용하여, 카르복실 보유 성분을 pH 5 완충제 중 EDAC와의 반응 및 NBF의 첨가로 관능화시킨다. 이러한 경우 중 임의의 것 (및 임의의 하기 경우)에서, 생성된 생성물은 당업자에게 이용가능한 임의의 수의 수단, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 실리카 겔 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 한외여과, 및 선택적 침전에 의해 정제될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 아민 보유 성분을 -COOH 보유 프레임워크 (CBF)에 커플링시킬 수 있다. CBF는 활성화된 에스테르 잔기를 이용한다 (예를 들어, 문헌 [Hermanson in Bioconjugate Techniques, 2nd edition, Academic Press, 2008] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌 참조). 간략하게 설명하면, 말단 활성화된 카르복실산 에스테르, 예컨대 -NHS, -SSC, -NPC 등을 갖는 CBF를 무수 유기 용매, 예컨대 DMSO 또는 DMF 중에 용해한다. 이후, 원하는 당량수의 아민 보유 성분을 첨가하고, 수시간 동안 실온에서 혼합한다. 문헌 [Baudys et al., Bioconj. Chem. 9:176-183, 1998]에 기재된 바와 같이, 아민 보유 성분은 또한 CBF에 접합되어 안정적인 아미드 결합을 생성할 수도 있다. 이 반응은 트리부틸아민 (TBA) 및 이소부틸클로로포르메이트를 디메틸술폭시드 (DMSO) 중 CBF 및 아민 보유 성분의 용액에 무수 조건하에 첨가하여 달성될 수 있다. 대안적으로, 아민 보유 성분은 브롬화시아노겐 (CNBr), N-시아노트리에틸암모늄 테트라플루오로보레이트 (CTEA), 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디늄 테트라플루오르보레이트 (CDAP) 및 p-니트로페닐시아네이트 (pNPC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시약을 이용한 시안화를 통해 OBF에 커플링될 수 있다. CNBr 반응은 수용액 중에서 온화하게 염기성인 pH에서 수행될 수 있다. CDAP 반응은 DMSO 및 물의 혼합물 중에서 온화하게 염기성인 pH에서 트리에틸아민 (TEA)을 촉매로서 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 아민 보유 성분은 예를 들어 피리딘을 함유하는 수성 완충 용액 중에서의 글루타르알데히드 커플링 및 이후 글리신을 사용한 켄칭(quenching)을 통해 NBF에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아민 보유 성분은 쉬프 염기 커플링 절차 및 이후 환원을 이용하여 알데히드 보유 프레임워크에 접합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hermanson in Bioconjugate Techniques, 2nd edition, Academic Press, 2008] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌, 및 또한 문헌 [Mei et al., in Pharm. Res. 16: 1680-1686, 1999] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌 참조). 간략하게 설명하면, 말단 활성화된 알데히드 (예를 들어, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부티르알데히드 등)를 갖는 프레임워크를 중성 또는 산성 pH의 수성 완충제 중에 용해하여 원치않는 알데히드 가수분해를 방지한다. 이후, 원하는 당량수의 아민 보유 성분을 첨가하여 실온에서 혼합한 후에 과량의 적합한 환원제 (예를 들어, 수소화붕소나트륨, 시아노수소화붕소나트륨, 트리아세톡시수소화붕소나트륨 피리딘 보란, 트리에틸아민 보란 등)를 첨가한다.
다양한 실시양태에서, 히드록실 보유 성분을 디비닐술폰 (DVS) 절차에 따라 OBF에 접합시킬 수 있다. 이 절차를 이용하여, OBF를 pH 11.4의 비카르보네이트 완충제에 첨가하고, DVS로 활성화한 후에 히드록실 보유 성분을 첨가하고, 이후에 글리신을 첨가하여 반응물을 중화시키고 켄칭시킨다. 히드록실 보유 성분은 또한 상기 기재된 바와 같이 활성화된 에스테르 잔기를 사용하여 OBF에 커플링되어 에스테르 결합을 생성할 수도 있다.
다양한 실시양태에서, 술피드릴 보유 성분을 비교적 온화한 절차를 이용하여 말레이미드 보유 프레임워크 (MBF)에 커플링시켜서 티오에테르 결합을 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hermanson in Bioconjugate Techniques, 2nd edition, Academic Press, 2008] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌 참조). 말레이미드 기는 활성화된 에스테르보다 가수분해에 대한 감수성이 훨씬 덜하기 때문에, 상기 반응은 수성 조건하에 수행될 수 있다. 간략하게 설명하면, MBF를 pH 6.5 내지 7.5의 완충 수용액 중에 용해한 후에 원하는 당량수의 술피드릴 보유 성분을 첨가한다. 실온에서 수시간 동안 혼합한 후, 티오에테르 커플링된 접합체를 정제할 수 있다. 술피드릴 보유 성분은 또한 문헌 [Thoma et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5919-5929, 1999]에 기재된 방법에 따라 NBF에 접합될 수도 있다. 이 반응은 NBF를 무수 디메틸포름아미드 (DMF) 중에 현탁시킨 후에 2,6-루티딘 및 산 무수물을 첨가하고 이후에 반응성 중간체를 정제하는 것을 포함한다. 이후, 술피드릴 보유 성분을 DMF 중 상기 중간체의 용액에 트리에틸아민과 함께 첨가한다.
다양한 실시양태에서, 아지드 보유 성분을 휘스겐(Huisgen)-유형 아지드-알킨 고리화첨가의 구리(I)-촉매된 최신 버전을 이용하여 알킨 보유 프레임워크 (ABF)에 커플링시켜서 1,4-이치환된 1,2,3-트리아졸을 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dondoni, Chem. Asian J. 2:700-708, 2007] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌, 및 또한 문헌 [Dedola et al., Org. Biomol. Chem. 5: 1006-1017, 2007] 참조). 통상적으로 "클릭" 반응이라 지칭되는 상기 반응은 예를 들어 촉매 시스템으로서 N,N-디이소프로필에틸아민 및 Cu(PPh3)3Br을 사용하여 순수(neat) THF 중에서 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wu et al., Chem. Commun. 5775-5777, 2005] 참조). 상기 반응은 또한 촉매 시스템으로서 나트륨 아스코르베이트 및 CuSO4·5H2O를 사용하여 3:1 (THF:물) 혼합물 중에서 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wu et al., 상기 문헌] 참조). 어떠한 경우에서든지, 아지드 보유 성분을 원하는 당량수의 ABF에 첨가한 후에 12시간 내지 48시간 동안 실온에서 혼합한다. 대안적으로, 알킨 보유 성분을 상기와 정확하게 동일한 조건을 이용하여 아지드 보유 프레임워크에 접합시킬 수 있다.
특정 성분들은 자연적으로 1개 초과의 동일한 화학적 반응성 잔기를 보유할 수 있다. 일부 예에서, 성분을 오직 해당 부위 중 1개에서만 선택적으로 반응시키기 위한 화학적 반응 유형 및 조건을 선택하는 것이 가능하다. 예를 들어, 인슐린이 반응성 아민을 통해 접합되는 경우에 특정 실시양태에서는 인슐린 생물활성 보존에 N-말단 α-Phe-B1이 N-말단 α-Gly-A1 및 ε-Lys-B29보다 바람직한 부착 부위이다 (예를 들어, 문헌 [Mei et al., Pharm. Res. 16: 1680-1686, 1999] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌, 및 또한 문헌 [Tsai et al., J. Pharm. Sci. 86: 1264-1268, 1997] 참조). 인슐린과 헥사데세날 (알데히드-종결 분자) 사이의 예시적인 반응에서, 연구가들은 상기 2개 성분을 54% 이소프로판올을 함유하는 1.5 M pH 6.8 나트륨 살리실레이트 수용액 중에서 1:6 (인슐린:알데히드 mol/mol)의 비율로 시아노수소화붕소나트륨의 존재하에 밤새 혼합하면 단일-치환된 Phe-B1 2급 아민-접합된 생성물로의 80% 초과의 전환이 달성됨을 발견하였다 ([Mei et al., Pharm. Res. 16: 1680-1686, 1999]). 이들의 연구는 용매, pH, 및 인슐린:알데히드 비율의 선택 모두가 반응의 선택성 및 수율에 영향을 미쳤다는 것을 보여주었다. 그러나, 대부분의 경우, 화학적 반응 조건을 선택하여 선택성을 달성하는 것은 어려운 일이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 성분 (예를 들어, 인슐린)을 원하는 반응 부위 이외의 모든 다른 부위에서는 선택적으로 보호한 후에 해당 물질이 반응하여 정제된 후에는 탈보호 단계를 수행하는 것이 이로울 수 있다. 예를 들어, 문헌에는 산성 (BOC), 약간 산성 (시트라콘산 무수물) 및 염기성 (MSC) 조건하에 탈보호될 수 있는 것들을 포함하는, 인슐린 아민 기의 선택적 보호에 관한 수많은 이용가능한 예가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Tsai et al., J. Pharm. Sci. 86: 1264-1268, 1997], [Dixon et al., Biochem. J. 109: 312-314, 1968] 및 [Schuettler et al., D. Brandenburg Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 360: 1721, 1979] 참조). 한 예에서, Gly-A1 및 Lys-B29 아민은 tert-부톡시카르보닐 (BOC) 기로 선택적으로 보호될 수 있고, 이것은 이후에 90% 트리플루오로아세트산 (TFA)/10% 아니솔 용액 중 4℃에서 1시간 동안의 인큐베이션에 의한 접합 후에 제거된다. 한 실시양태에서, 인슐린의 건조 분말을 무수 DMSO 중에 용해한 후에 과량의 트리에틸아민을 첨가한다. 이 용액에, THF 중 대략 2 당량의 디-tert-부틸 디카르보네이트 용액을 서서히 첨가하고, 상기 용액이 30분 내지 60분 동안 혼합되게 한다. 반응 후에, 조 용액을 과량의 아세톤에 부은 후에 묽은 HCl을 적가하여 반응된 인슐린을 침전시킨다. 침전된 물질을 원심분리하여 아세톤으로 세척하고 진공하에 완전히 건조시킨다. 정제용 역상 HPLC 또는 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 원하는 디-BOC 보호된 생성물을 미반응 인슐린, 원치않는 디-BOC 이성질체, 및 모노-BOC 및 트리-BOC 부산물로부터 분리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tsai et al., J. Pharm. Sci. 86: 1264-1268, 1997] 참조). 역상 HPLC의 경우, 0.1% TFA를 함유하는 70% 물/30% 아세토니트릴 중 조 생성물의 용액을 C8 컬럼에 로딩하고, 증가하는 아세토니트릴 구배로 용출시킨다. 원하는 디-BOC 피크를 수집하고 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜서 순수한 생성물을 수득한다.
LRP B 및 LRP D ( 비공유 접합)
당업자는 다양한 접합 화학을 이용하여 X를 T와 및/또는 W를 T와 (일반적으로 "성분들"을) 공유 접합시킬 수 있음을 알 것이다. 이러한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예시적인 기술은 하기에서 논의된다. 특정 실시양태에서, 인간 혈청 중 비공유 연결부의 해리 상수 (Kd)는 1 pmol/L 미만이다. 예를 들어, 성분은 당업계에 공지된 바와 같이 비공유 리간드-수용체 쌍 (예를 들어 (이에 제한되지 않음), 비오틴-아비딘 기재의 쌍)을 통해 접합체 프레임워크에 비공유 결합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 리간드 수용체-쌍의 한 구성원은 성분에 공유 결합되고, 상기 쌍의 다른 구성원은 접합체 프레임워크에 공유 결합된다. 성분 및 접합체 프레임워크가 조합되는 경우, 리간드와 그의 수용체 사이의 강력한 비공유 상호작용이 상기 성분을 접합체 프레임워크에 비공유 결합되게 한다. 전형적인 리간드/수용체 쌍은 단백질/보조인자 및 효소/기질 쌍을 포함한다. 통상적으로 사용되는 비오틴/아비딘 쌍 이외에도, 이것들은 비오틴/스트렙타비딘, 디곡시게닌/항-디곡시게닌, FK506/FK506-결합 단백질 (FKBP), 라파마이신/FKBP, 시클로필린/시클로스포린 및 글루타티온/글루타티온 트랜스퍼라제 쌍을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 다른 적합한 리간드/수용체 쌍을 인식할 것이고, 예를 들어 에피토프 태그, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), c-myc, 플래그(FLAG)® 및 추가로는 문헌 [Kessler pp. 105-152 of "Advances in Mutagenesis" Ed. by Kessler, Springer-Verlag, 1990], ["Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)" Ed. by Pascal Baillon, Humana Press, 2000] 및 ["Immobilized Affinity Ligand Techniques" by Hermanson et al., Academic Press, 1992]에 기재된 것들과 쌍을 이룬 모노클로날 항체가 있다.
k 및 q
k는 1 내지 12의 정수이다. 특정 실시양태에서, k = 1 내지 6, 예를 들어 1, 2 또는 3이다. q는 1 내지 4의 정수이고, 중앙의
Figure 112014006288597-pat00086
기에 결합된 D 기의 수를 한정한다. 특정 실시양태에서, q = 1이다. 일부 실시양태에서, q = 2이다. 특정 실시양태에서, k + q는 2 내지 6의 정수이다. 특정 실시양태에서, k + q = 2, 3 또는 4이다.
p 및 m
각 경우의 p는 독립적으로 1 내지 5의 정수이다. 특정 실시양태에서, 각 경우의 p는 동일하다. 특정 실시양태에서, p = 1, 2 또는 3이다. 특정 실시양태에서, p = 1이다.
각 경우의 m은 독립적으로 1 내지 5의 정수이다. 특정 실시양태에서, 각 경우의 m은 동일하다. 특정 실시양태에서, m = 1, 2 또는 3이다. 특정 실시양태에서, m = 1이다.
n 및 v
각 경우의 n은 독립적으로 0 내지 5의 정수이지만, 단, 각각의 k-분지 내에서 적어도 1개 경우의 n은 ≥ 1이다. 주어진 k-분지 내의 분지는 본원에서 n-분지로 지칭된다.
특정 실시양태에서, p-괄호 표시된 잔기 내 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00087
는 n ≥ 1의 값에 상응하는 수의 n-괄호 표시된 잔기로 치환되며, 예를 들어 상기 화학식 Ia를 참조한다. 일부 이러한 실시양태에서, 접합체 내 각 경우의 n은 동일하다. 이러한 실시양태의 일부에서, n = 1 또는 2이다.
다른 실시양태에서, p-괄호 표시된 잔기 내에서 오직 말단의
Figure 112014006288597-pat00088
만이 n ≥ 1의 값에 상응하는 수의 n-괄호 표시된 잔기로 치환되며, 예를 들어 상기 화학식 Ib를 참조한다. 특정 실시양태에서, 각각의 k-분지는 단지 1개 경우의 n ≥ 1을 포함한다 (즉, 모든 다른 경우에는 n = 0). 일부 이러한 실시양태에서, 접합체 내 각 경우의 n은 동일하다. 이러한 실시양태의 일부에서, n = 1 또는 2이다.
각 경우의 v는 독립적으로 0 내지 5의 정수이지만, 단, 각각의 k-분지 내에서 적어도 1개 경우의 v는 ≥ 1이다.
특정 실시양태에서, m-괄호 표시된 잔기 내 각 경우의
Figure 112014006288597-pat00089
는 v ≥ 1의 값에 상응하는 수의 B 잔기로 치환되며, 예를 들어 상기 화학식 Ic를 참조한다. 일부 이러한 실시양태에서, 접합체 내 각 경우의 v는 동일하다. 이러한 실시양태의 일부에서, v = 1 또는 2이다.
다른 실시양태에서, m-괄호 표시된 잔기 내에서 오직 말단의
Figure 112014006288597-pat00090
만이 v ≥ 1의 값에 상응하는 수의 B 잔기로 치환되며, 예를 들어 상기 화학식 Id를 참조한다. 특정 실시양태에서, 각각의 k-분지는 단지 1개 경우의 v ≥ 1을 포함한다 (즉, 모든 다른 경우에는 v = 0). 일부 이러한 실시양태에서, 접합체 내 각 경우의 v는 동일하다. 이러한 실시양태의 일부에서, v = 1 또는 2이다. 특정 실시양태에서, 각각의 n-분지는 적어도 1개 경우의 v ≥ 1을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 n-분지는 단지 1개 경우의 v ≥ 1을 포함한다 (즉, 모든 다른 경우에는 v = 0). 일부 이러한 실시양태에서, 접합체 내 각 경우의 v는 동일하다. 이러한 실시양태의 일부에서, v = 1 또는 2이다.
j
화학식 II의 j는 1 내지4의 정수이고, D 기에 대한 접합의 수를 한정한다. 특정 실시양태에서, j = 1이다. 특정 실시양태에서, j = 2이다. 일부 실시양태에서, j = 3이다. 다른 실시양태에서, j = 4이다.
약물 로딩
일반적으로, 접합체에 로딩되는 약물의 양은 접합체 프레임워크의 분자량 및/또는 화학적 활성화의 수준 (즉, 팬던트 기가 프레임워크에 부가되는 경우)을 조정하여 제어될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 약물 로딩 수준은 접합체에 대하여 약물 5% 내지 99% w/w의 범위일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 50% 내지 99%의 더 좁은 범위 내, 예를 들어 80% 내지 99% 범위 내의 로딩 수준이 사용될 수 있다.
기타
이전 섹션이 접합체 성분들 (예를 들어, 리간드, 약물, 프레임워크)을 별개의 소제목하에 기재하지만, 본 개시내용은 임의의 및 모든 개시된 리간드, 약물 및 프레임워크로 이루어진 접합체를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
접합체를 제조하기 위한 중간체
한 측면에서, 본 개시내용은 접합체를 제조하기 위한 시약을 제공한다. 따라서, 다양한 실시양태에서,
각각의
Figure 112014006288597-pat00091
, T, D, k, q, k + q, p, n, m 및 v가 상기 및 본원에서 기재된 바와 같이 정의되고,
-B가 -T-LB'이고,
각 경우의 LB'가 독립적으로 수소, 알킨-함유 잔기, 아지드-함유 잔기, 또는 임의로 치환된 카르보닐-반응성, 티올-반응성, 아민-반응성 또는 히드록실-반응성 잔기인
화학식 I의 화합물이 제공된다.
다른 실시양태에서,
각각의
Figure 112014006288597-pat00092
, T, B, k, q, k + q, p, n, m 및 v가 상기 및 본원에서 기재된 바와 같이 정의되고,
-D가 -T-LD'이고,
각 경우의 LD'가 독립적으로 수소, 알킨-함유 잔기, 아지드-함유 잔기, 또는 임의로 치환된 카르보닐-반응성, 티올-반응성, 아민-반응성 또는 히드록실-반응성 잔기인
화학식 I의 화합물이 제공된다.
인슐린 접합체의 제조 방법
실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 예시적인 약물로서 인슐린을 사용하고 예시적인 리간드로서 아미노에틸글루코스 (AEG), 아미노에틸만노스 (AEM), 아미노에틸비만노스 (AEBM), 아미노에틸트리만노스 (AETM), 아미노에틸푸코스 (AEF) 및/또는 β-아미노에틸-N-아세틸글루코사민 (AEGA)을 사용하여 상기 언급된 접합체를 제조하는 방법을 예시하였다. 비-제한적으로, 접합 부위 1개 당 2개의 리간드를 가지며 모든 프레임워크 성분들 사이의 거리가 짧은 접합체는 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 (Tris), 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트 (TSAT), 트리스-숙신이미딜-1,3,5-벤젠트리카르복실레이트 (TSB) 및 벤젠-1,3,5-트리카르복시-(N-4-부티르산-NHS-에스테르)아미드 (TSB-C4)를 접합체 프레임워크로서 사용하여 제조될 수 있다. 프레임워크 성분들 사이에 더 많은 공간을 원한다면, 숙신이미딜 (6-아미노카프로일)아미노트리아세테이트 (TSAT-C6), 숙신이미딜 (6-아미노(PEO-6))아미노트리아세테이트 (TSAT-PEO-6), 벤젠-1,3,5-트리카르복시-(N-6-아미노카프로산-NHS 에스테르)아미드 (TSB-C6) 및 벤젠-1,3,5-트리카르복시-(N-10-아미노데칸산-NHS 에스테르)아미드 (TSB-C10)를 사용할 수 있다. TSAT-C6 스페이서 아암 화학은 TSAT-PEO-6보다 접합체에 보다 높은 소수성 특징을 부여한다.
예를 들어, 예시 목적을 위해, 한 실시양태에서, 리간드 (예를 들어, AEG, AEM, AEMB 및 AETM)와 인슐린 둘다 말단 활성화된 에스테르를 통해 TSAT-C6 프레임워크와 반응하여 인슐린-TSAT-C6-AEG-2, 인슐린-TSAT-C6-AEM-2, 인슐린-TSAT-C6-AEMB-2 및 인슐린-TSAT-C6-AETM-2 접합체를 생성할 수 있다. 다양한 리간드는 실시예에서 논의된 바와 같이 사전에 합성된다. 일부 실시양태에서, 인슐린의 A1 및 B29 아미노 기는 실시예에 기재된 바와 같이 BOC-보호되어 각각의 인슐린은 오직 Phe-B1 α-아미노 기에서 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인슐린의 B1 및 B29 아미노 기는 실시예에 기재된 바와 같이 BOC-보호되어 각각의 인슐린은 오직 Gly-A1 α-아미노 기에서 반응할 수 있다. DMSO 중 40 내지 50 mg/mL 용액으로서의 대략 1 당량의 BOC-인슐린을 과량의 트리에틸아민을 함유하는 DMSO 중 TSAT-C6의 50 mg/mL 용액에 실온에서 첨가하고 대략 1시간 동안 반응시킨다. 다음으로, DMSO 중 100 mg/mL 용액으로서의 과량의 AEG, AEM, AEBM 및/또는 AETM (2 내지 10 당량)을 첨가하고, 2시간 더 반응시킨다. 반응 후, 상기 DMSO 용액을 pH 5 염수 완충제에 10배 과다희석하고, 이후에 pH를 8.0으로 조정하고, 상기 용액을 바이오겔(Biogel) P2 컬럼에 통과시켜서 저분자량의 반응물 및 염을 제거한다. 공극 분획으로 용출된 물질을 3K 한외여과 장치로 농축시킨 후에 이것을 정제 스케일의 역상 HPLC 컬럼 (C8, 아세토니트릴/물 이동 상 (0.1% TFA 함유))에 주입하여 원하는 생성물을 미반응 BOC2-인슐린으로부터 정제한다. 원하는 용출 피크를 수집하여 모으고 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거한 후에 동결건조시켜서 건조 분말을 수득한다. 마지막으로, 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해시킨 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 HEPES pH 8.2 완충제에 10배 과다희석하여 BOC 보호기를 제거한다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0과 8.0 사이로 조정한 후, 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC, 및 임의의 다른 오염시키는 염을 제거한다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 원하는 수준으로 농축시키고, 필요시까지 4℃에서 저장한다.
또 다른 측면에서, 반응은 카르보네이트 완충제 중 보호되지 않은 인슐린을 사용하여 B29 엡실론-아미노 기에서 일어날 수 있는데, 이는 이러한 조건하에서는 B29 아미노 기가 야생형 인슐린에 존재하는 3개의 아미노 기 중 가장 반응성이기 때문이다. 예시적인 합성에서, N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 무수 DMSO 중에 60 mM로 용해한 후에 트리에틸아민 (TEA)을 첨가한다. 상기 용액을 10분 동안 실온에서 신속하게 교반한다. 이와 대등하게, 448 mM 리간드 용액을 적절한 부피의 무수 DMSO 중에서 제조한다. 일단 용해되면, 충분한 리간드 용액을 10분의 기간에 걸쳐 적가하여 프레임워크상의 활성화된 에스테르 기의 수인 N에서 1을 감한 값의 1.5배에 해당하는 수의 반응성 당량을 제공한다. 예를 들어, 프레임워크 1개 당 N = 3의 초기 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (3×(3-1)×60 mM/370 mM) = 0.973 mL의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 1개 당 N = 4의 초기 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (3×(4-1)×60 mM/370 mM) = 1.46 mL의 리간드 용액을 첨가하는 식이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 상기 용액을 1시간 동안 실온에서 교반한다.
이후, 아민-보유 약물을 탄산나트륨 완충제 (0.1 M, pH 11) 중에 17.2 mM로 별도로 용해한 후에 1.0 N 수산화나트륨으로 pH를 10.8이 되도록 조정한다. 일단 용해되면, 전체 프레임워크/DMSO/리간드/TEA 용액을 75분의 기간에 걸쳐 약물/카르보네이트 완충제 용액에 적가한다. 적가하는 동안, 생성된 혼합물의 pH를 필요한 경우에는 묽은 HCl 또는 NaOH를 사용하여 5분 마다 10.8로 조정한다. 적가 후에 상기 용액을 15분 더 교반하여 반응이 완료되도록 한다.
이어서, 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액에 10배 과다희석한 후에 묽은 HCl을 사용하여 최종 pH 8.0이 될 때까지 pH를 조정한다. 상기 수용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 우선 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성한다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 40 mL가 되도록 농축시킨다. 이 용액을 정제용 역상 HPLC로 추가로 정제하여 원하는 생성물을 수득한다. 일단 수집되면, 상기 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜서 순수한 접합체를 수득한다.
추가로, 카르보네이트 완충제 조건하에서, A1 아미노 기는 야생형 인슐린에서 두번째로 높은 반응성의 아미노 기이다. 따라서, 특정 실시양태에서, A1,B29-이치환된 인슐린 접합체는 B29-일치환된 인슐린 접합체 합성과 비교하여 인슐린 분자 1개 당 대략 10배 양의 다가 활성 에스테르 프레임워크 및 리간드를 사용하여 상기 기재된 조건하에 합성된다.
또 다른 측면에서, B29-일치환 인슐린 접합체를 미국 특허 번호 7,402,565에서 보고된 것과 유사한 방법을 이용하여 N-말단 보호 아미노산 서열을 사용하여 합성한다. 구체적으로, N-말단 펩티드 서열을 인슐린 A-쇄 및 B-쇄로 조작하여 상기 보호 아미노산 서열이 ArgA0 및 ArgB0을 함유하여 인슐린 중간체를 생성하게 한다. 접합을 인슐린 중간체의 LysB29에서 수행하면서 N-말단을 접합 부산물로부터 보호한다. 접합된 인슐린 중간체를 트립신으로 처리하여 N-말단 보호 아미노산 서열을 절단하여 오직 LysB29만이 접합된 인슐린 접합체를 수득한다. 일부 실시양태에서, 인슐린 중간체는 미국 특허 번호 7,402,565에 기재된 바와 같이 단일 쇄 인슐린 전구체로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 인슐린 중간체는 LysB29 이외의 접합 부위를 함유하는 돌연변이체이고, LysB29에 대해 기재된 것과 유사한 합성법이 수행된다.
하기 기재된 바와 같이, 이러한 예시적인 절차를 이용하여 TSAT-C6 프레임워크를 상이한 프레임워크로 치환시키면 상이한 리간드 및 약물, 상이한 접합 화학, 프레임워크 성분들 사이의 상이한 분리, 및/또는 상이한 결합가를 갖는 다른 접합체가 생성될 수 있다는 것을 알 것이다.
예를 들어, 프레임워크 성분들 사이에 보다 먼 거리가 필요하고/하거나 접합 부위에 보존된 전하가 필요한 경우에는 적절한 크기의 아민-보유 디에틸 아세탈 (예를 들어, 아미노프로피온알데히드 디에틸 아세탈 (APDA) 또는 아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 (ABDA))이 본원에 기재된 프레임워크상의 반응성 기 중 하나와 접합된 후에 나머지 반응성 기와 관심 리간드 (예를 들어, AEM, AEBM 또는 AETM)의 반응이 완료될 수 있다. 이후, 반응성 알데히드 기는 산성 조건하에서 디에틸 아세탈로부터 노출될 수 있고, 이후에 인슐린과의 환원적 아미노화로 약물 접합 단계가 완료된 후에 ABDA-TSAT, ABDA-LCTSAT 등이 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, 테트라키스-(N-숙신이미딜 카르복시프로필)펜타에리트리톨 (TSPE)이 다중결합가 증가를 위해서 접합 부위 1개 당 3개의 리간드를 부착시키는데 사용될 수 있다. 또한, 당업자는 상기 중 임의의 교시내용을 이용하여 훨씬 더 높은 차수의 결합가를 갖는 초분지형 (예를 들어, 덴드리머-유사) 접합체를 생성할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 뢰켄도르프(Roeckendorf) 및 린드호르스트(Lindhorst)는 문헌 [Topics in Current Chemistry. 217: 202-238, 2001]에서 초분지형 구조를 생성하는 최근의 접근법에 관한 포괄적인 검토를 제공한다.
추가로, 소정의 정도의 다중결합가를 이미 함유하는 리간드를 상기 기재된 절차에 따라 다시 반응시켜서 훨씬 더 높은 차수의 리간드 다중도를 생성할 수 있다. 예를 들어, 말단 반응성 아민을 함유하는 2가 AEM-2, AEBM-2 또는 AETM-2 분자는 각각의 리간드 2개를 반응성 아민이 또한 접합된 적합한 프레임워크에 접합시켜 제조될 수 있다. 말단 반응성 아민을 함유하는 3가 AEM-3, AEBM-3 또는 AETM-3 분자는 각각의 리간드 3개를 반응성 아민이 또한 접합된 적합한 프레임워크에 접합시켜 제조될 수 있다. NH2-2가 사카라이드는 상기 기재된 것과 동일한 프레임워크와 반응시켜서 약물 분자 1개 당 4개 및 6개의 리간드를 갖는 약물 접합체를 생성시킬 수 있다. NH2-3가 사카라이드는 상기 기재된 것과 동일한 프레임워크와 반응시켜서 약물 분자 1개 당 6개 및 9개의 리간드를 갖는 약물 접합체를 생성시킬 수 있다.
모든 경우에서, 프레임워크 화학, 결합가, 및 리간드:프레임워크 화학량론을 조정함으로써 상이한 리간드의 혼합물이 다중결합가의 프레임워크를 통해 동일 약물에 접합될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 인슐린-AEM-1-AEBM-1, 인슐린-AEBM-1-AETM-1, 인슐린-AEM-2-AETM-2 및 인슐린-AEM-1-AETM-2는 모두가 이러한 혼합 리간드 방법에 따라 합성될 수 있다.
일부 경우에서, 약물 이외의 다른 수단을 통해 리간드를 프레임워크에 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 2가 말레이미드/1가 활성화 에스테르 관능화된 프레임워크 (예를 들어, 숙신이미딜-3,5-디말레이미도페닐 벤조에이트 (SDMB))를 사용하여 2개의 술피드릴 관능화된 리간드 및 1개의 아민-관능화된 약물을 별개의 단계에서 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 인슐린 또는 또 다른 아민-함유 약물을 본원에 기재된 방법을 이용하여 프레임워크의 활성화된 에스테르 부분에 접합시킬 수 있다. 별개의 단계에서, 아미노에틸 사카라이드 (AEM, AEBM, AETM)는 4-이미노티올란과의 반응을 통해 말단 술피드릴-보유 리간드로 전환시킬 수 있다. 마지막으로, 프레임워크-디-말레이미드-인슐린 접합체를 과량의 술피드릴-관능화된 사카라이드와 혼합하여 2가-리간드-인슐린 접합체를 생성할 수 있다.
지속 방출 제제
실시예에서 논의된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 접합체를 지속적인 방식으로 (즉, 가용성 재조합 인간 인슐린보다 더 지속적인 흡수 프로파일을 나타내는 형태로) 투여하는 것이 이로울 수 있다. 이것은 전형적인 글루코스 변동 기간에 보다 밀접한 관련이 있는 시간 척도 (즉, 분이 아닌 시간)로 글루코스 변동에 반응할 수 있는 지속적인 수준의 접합체를 제공할 것이다. 특정 실시양태에서, 지속 방출 제제는 비-고혈당 조건 (즉, 금식 조건)하에 포유동물에게 투여되는 경우에 접합체의 0차 방출을 나타낼 수 있다.
지속적인 흡수 프로파일을 제공하는 임의의 제제가 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 특정 실시양태에서, 이것은 접합체를 이것이 전신 순환되게 하는 방출 특성을 저속화하는 다른 성분과 조합하여 달성될 수 있다. 예를 들어, PZI (프로타민 아연 인슐린) 제제가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 특정 실시양태에서는 본 개시내용의 접합체를 사용하여 제조된 PZI 제제의 흡수 프로파일 및 안정성이 제제 내에 포함된 프로타민 및 아연의 절대적 및 상대적 양에 민감하다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 시판 PZI 및 NPH (중성 프로타민 하게도른(Hagedorn)) 인슐린 제제는 흡수 프로파일을 효과적으로 지속시키기 위해서 인슐린 1 mg 당 단지 약 0.05 내지 약 0.2 mg의 프로타민만이 필요하지만, 일부 PZI-접합체 제제는 접합체 1 mg 당 약 1 내지 약 5 mg의 프로타민이 필요하다. 추가로, 시판 프로타민 인슐린 제제는 인슐린 1 mg 당 약 0.006 mg의 아연을 함유하지만, 본 발명자들은 아연 농도를 프로타민 농도와 함께 증가시키면 특정 실시양태에서 보다 더 안정적인 쉽게 분산가능한 제제가 생성될 수 있음을 알아냈다. 일부 경우에, 아연 함량은 접합체 1 mg 당 약 0.05 내지 약 0.5 mg 아연의 범위이다. 추가로, 본 발명자들은 또한 예상치못하게도 특정 실시양태에서 방출 프로파일을 효과적으로 지속시키기 위해서는 B1-아민 기에서 치환된 인슐린 접합체가 B29-아민 기에서 치환된 인슐린 접합체에 비해 보다 많은 프로타민 및 아연을 필요로 한다는 것을 알아냈다. 본 개시내용은 무정형 및 결정질 형태의 이들 PZI 제제를 포함한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 접합체 1 mg 당 약 0.05 내지 약 10 mg 프로타민을 포함한다. 예를 들어, 접합체 1 mg 당 약 0.2 내지 약 10 mg 프로타민, 예를 들어 접합체 1 mg 당 약 1 내지 약 5 mg 프로타민을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 접합체 1 mg 당 약 0.006 내지 약 0.5 mg 아연을 포함한다. 예를 들어, 접합체 1 mg 당 약 0.05 내지 약 0.5 mg 아연, 예를 들어 접합체 1 mg 당 약 0.1 내지 약 0.25 mg 아연을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 약 100:1 내지 약 5:1, 예를 들어 약 50:1 내지 약 5:1, 예를 들어 약 40:1 내지 약 10:1 범위 비율 (w/w)의 프로타민 및 아연을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 PZI 제제는 약 20:1 내지 약 5:1, 예를 들어 약 20:1 내지 약 10:1, 약 20:1 내지 약 15:1, 약 15:1 내지 약 5:1, 약 10:1 내지 약 5:1, 약 10:1 내지 약 15:1 범위 비율 (w/w)의 프로타민 및 아연을 포함한다.
실시예는 또한 1종 이상의 하기 성분을 PZI 제제에 포함시키는 이점을 기재한다: 항미생물 보존제, 등장화제 및/또는 비접합 인슐린 분자.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 항미생물 보존제 (예를 들어, m-크레졸, 페놀, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항미생물 보존제는 m-크레졸이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.1% 내지 약 1.0% v/v m-크레졸을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 0.5% v/v m-크레졸, 예를 들어 약 0.15% 내지 약 0.35% v/v m-크레졸을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 등장화제로서 폴리올 (예를 들어, 만니톨, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 등장화제는 글리세롤이다. 특정 실시양태에서, 등장화제는 염, 예를 들어 NaCl이다. 예를 들어, 제제는 약 0.05 내지 약 0.5 M NaCl, 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.25 M NaCl 또는 약 0.1 내지 약 0.2 M NaCl을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 소정량의 비접합 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 접합된 인슐린 분자:비접합 인슐린 분자 몰비 약 100:1 내지 1:1, 예를 들어 약 50:1 내지 2:1 또는 약 25:1 내지 2:1 범위의 접합된 인슐린 분자 및 비접합 인슐린 분자를 포함한다.
본 개시내용은 또한 당업계에 공지된 소분자 제제의 표준 지속 방출 제제 (또한, 연장 방출 제제라 불리기도 함)의 용도를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995] 참조). 본 개시내용은 또한 접합체를 점진적으로 전달하기 위해서 펌프 또는 제한적 확산에 의존하는 장치를 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 장시간 작용 제제는 변형된 인슐린 분자를 사용함으로써 (추가로 또는 대안적으로) 제공될 수 있다. 예를 들어, 접합체 제조시에 야생형 인간 인슐린 대신 인슐린 글라진 (란투스®) 또는 인슐린 데테미르 (레베미르®)를 사용할 수 있다. 인슐린 글라진은 Asp-A21이 글리신으로 대체되고 2개의 아르기닌이 B-쇄의 C-말단에 부가된 예시적인 장시간 작용 인슐린 유사체이다. 이러한 변화의 효과는 등전점의 이동이며, 이에 따라 pH 4에서 완벽하게 가용성인 용액을 생성한다. 인슐린 데테미르는 Thr-B30이 결실되고 C14 지방산 쇄가 Lys-B29에 부착된 또 다른 장시간 작용 인슐린 유사체이다.
접합체의 용도
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 접합체의 사용 방법을 제공한다. 일반적으로, 접합체를 사용하여 사카라이드 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 글루코스 또는 외인성 사카라이드, 예컨대 만노스, 알파-메틸 만노스, L-푸코스 등)에 대한 반응으로 생물활성 약물을 제어가능하게 제공할 수 있다. 본 개시내용은 본 개시내용의 접합체를 투여하여 질환 또는 상태를 치료하는 것을 포함한다. 접합체는 임의의 환자 (예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 마우스 등) 치료에 사용될 수 있지만, 가장 바람직하게는 인간의 치료에 사용된다. 접합체는 환자에게 임의의 경로로 투여될 수 있다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 치료할 질환 또는 상태의 성질, 약물의 성질, 환자의 상태 등과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 본 개시내용은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피하, 심실내, 경피, 직장, 질내, 복강내, 국소 (산제, 연고제 또는 점적제에 의함), 협측 투여되거나 또는 경구 또는 비측 분무제 또는 에어로졸제로 투여되는 것을 포함한다. 이러한 다양한 경로를 위한 제약 조성물의 제제화 및 제조에 있어서의 일반적인 고려사항은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에서 찾을 수 있다. 다양한 실시양태에서, 접합체를 예를 들어 주사에 의해 피하 투여할 수 있다. 접합체는 전달의 용이성을 위해 담체 중에 용해될 수 있다. 예를 들어, 담체는 멸균수, 염수 또는 완충 염수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수용액일 수 있다.
일반적으로, 접합체 형태의 치료 유효량의 약물이 투여될 것이다. 약물의 "치료 유효량"은, 약물의 효능 및 독성이 균형을 이루는 것을 포함하는 합리적인 이익/위험 비율로 질환 또는 상태를 치료하는데 충분한 접합체의 양을 의미한다. 일반적으로, 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약리 절차, 예를 들어 ED50 (처치 대상체의 50%에서 치료상 효과적인 용량) 및 LD50 (처치 대상체의 50%에게 치명적인 용량)을 계산하여 결정될 수 있다. ED50/LD50은 약물의 치료 지수를 나타낸다. 당업계에 공지된 바와 같이 일반적으로 높은 치료 지수를 갖는 약물이 바람직하지만, 중증의 질환 또는 상태의 경우, 특히 대안적으로 선택할 수 있는 치료법이 없는 경우에는 더 낮은 치료 지수가 허용될 수 있다. 인간에게 투여할 적절한 용량 범위의 궁극적 선택은 임상 시험 동안에 결정된다.
다양한 실시양태에서, 약물은 인슐린이고, 인슐린의 평균 1일 용량은 10 내지 200 U, 예를 들어 25 내지 100 U의 범위이다 (여기서, 인슐린 1 유닛은 약 0.04 mg임). 특정 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량을 갖는 양의 접합체가 1일 단위로 투여된다. 특정 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량의 5배 내지 10배를 갖는 양의 접합체가 주 단위로 투여된다. 특정 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량의 10배 내지 20배를 갖는 양의 접합체가 격주 단위로 투여된다. 특정 실시양태에서, 이러한 인슐린 용량의 20배 내지 40배를 갖는 양의 접합체가 월 단위로 투여된다. 당업자는 상기한 동일 접근법이 공지의 용량 범위를 갖는 다른 승인된 약물, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 승인된 인슐린 감작제 및 인슐린 분비촉진제로 추론될 수 있음을 인식할 것이다. 전형적으로, 접합된 약물의 용량은 비접합 약물의 통상적인 용량보다 더 높다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 환자 (예를 들어, 포유동물 환자)에서 고혈당증을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자는 당뇨병 환자이다. 그러나, 본 발명의 방법은 당뇨 환자의 치료로 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 접합체는 혈당 조절 장애와 관련이 있는 감염을 갖는 환자에서 고혈당증을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체 또는 제제 (약물로서 인슐린 분자를 사용함)가 환자 (예를 들어, 포유동물 환자)에게 투여되는 경우, 이것은 비접합 버전의 인슐린 분자보다 저혈당증을 덜 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제 (약물로서 인슐린 분자를 포함하는 접합체를 사용함)는 환자 (예를 들어, 포유동물 환자)에서 비접합 버전의 인슐린 분자를 포함하는 제제보다 더 낮은 HbA1c 값을 유도한다. 특정 실시양태에서, 제제는 비접합 버전의 인슐린 분자를 포함하는 제제보다 적어도 10% 더 낮은 (예를 들어, 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 30% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 50% 더 낮음) HbA1c 값을 유도한다. 특정 실시양태에서, 제제는 7% 미만, 예를 들어 약 4% 내지 약 6% 범위의 HbA1c 값을 유도한다. 특정 실시양태에서, 비접합 버전의 인슐린 분자를 포함하는 제제는 7% 초과, 예를 들어 약 8% 내지 약 12%의 HbA1c 값을 유도한다.
임의의 주어진 환자에게 제공되는 약물의 총 1일 사용량은 분별있는 의학적 판단 범위 내에서 담당 의사에 의해 결정된다는 것을 이해할 것이다. 임의의 특정 환자에 대해 구체적인 치료 유효량은 치료할 질환 또는 상태, 사용되는 특정 약물의 활성, 사용되는 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단, 사용되는 특정 약물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도, 처치 기간, 사용되는 특정 약물과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 및 의학 분야에 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1회 초과로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 접합체를 피하 주사로 환자에게 연속 스케줄 (예를 들어, 1일 당 1회, 2일마다 1회, 1주 당 1회, 2주 마다 1회, 1개월 당 1회 등)로 투여하는 방법을 구체적으로 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 1종 이상의 추가의 요법제를 투여받고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 요법제는 투여되는 접합체와 동일한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 요법제는 1차 약물의 부작용을 치료하기 위한 것이다. 2종 이상의 요법제는 환자가 이들 요법으로 유익한 기간이 존재하는 한은 동일하거나 중첩되거나 중첩되지 않는 시간을 두고 투여될 수 있다. 2종 이상의 요법제는 환자가 이들 요법으로 유익한 기간이 존재하는 한은 동일하거나 상이한 스케줄로 투여될 수 있다. 2종 이상의 요법제는 환자가 이들 요법으로 유익한 기간이 존재하는 한은 동일하거나 상이한 제제 내에서 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 접합체는 동일 질환 또는 장애 치료를 위한 1종 초과의 약물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동일 질환 또는 장애 치료를 위한 상이한 약물을 포함하는 본 개시내용의 2종 이상의 별개의 접합체가 투여될 수 있다 (혼합물로서 투여되거나 별도로 투여됨). 특정 실시양태에서, 비접합 2차 약물이 본 개시내용의 접합체와 혼합될 수 있다 (즉, 상기 약물은 접합체 제제와 단순히 혼합되는 것이며 접합체에 공유 결합되는 것이 아님). 예를 들어, 특정 실시양태에서, 임의의 이러한 접근법이 1종 초과의 항당뇨성 약물을 대상체에게 투여하는데 이용될 수 있다. 이러한 접근법의 특정 예시적인 실시양태를 하기에서 인슐린-관련 요법과 관련하여 보다 상세하게 기재하였지만, 전술한 기재로부터 다른 요법이 이러한 조합 접근법으로 유익할 것임을 알 것이다.
인슐린 감작제 (예를 들어, 비구아니드, 예컨대 메트포르민, 글리타존)는 주어진 양의 인슐린에 대한 환자 반응을 증가시켜 작용한다. 따라서, 인슐린 감작제를 투여받는 환자는 이것을 투여받지 않는 동일 환자보다 본 개시내용의 인슐린 접합체가 보다 낮은 용량으로 필요할 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 인슐린 접합체는 인슐린 감작제도 처치받고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 접합체는 인슐린 감작제가 없는 경우에 필요한 일반적인 용량의 최대 75%로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 일반적인 용량의 최대 50%, 40%, 30% 또는 20%가 투여될 수 있다.
인슐린 내성은 정상적인 양의 인슐린이 정상적인 인슐린 반응을 유발하는데 적절치 않은 장애이다. 예를 들어, 인슐린-내성 환자에게는 이러한 내성을 극복하고 충분한 글루코스-저하 효과가 제공되도록 고용량의 인슐린이 필요할 수 있다. 이러한 경우, 내성이 덜한 환자에서는 일반적으로 저혈당증을 유도하는 인슐린 용량이 고도로 내성인 환자에서는 글루코스-저하 효과를 발휘하지 못한다. 유사하게, 본 개시내용의 인슐린 접합체는 적합한 기간 내에 높은 수준의 생물활성 인슐린을 제공하는 경우에만 이러한 하위부류의 환자에게 효과적이다. 특정 실시양태에서, 이러한 하위부류의 환자의 치료는 2가지 접근법을 조합하여 용이해질 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 통상의 인슐린-기재의 요법을 이용하여 기저 수준의 인슐린을 제공하고, 환자에게 필요한 경우에는 본 발명의 접합체를 투여하여 생물활성 인슐린을 제어하며 보충한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 인슐린 접합체는 인슐린 처치도 받고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 인슐린은 본 개시내용의 접합체 부재하에 필요한 일반적인 용량의 최대 75%로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 일반적인 용량의 최대 50%, 40%, 30% 또는 20%가 투여될 수 있다. 이러한 조합 접근법은 또한 인슐린 분비촉진제 (예를 들어, 술포닐우레아, GLP-1, 엑센딘-4 등) 및/또는 인슐린 감작제 (예를 들어, 비구아니드, 예컨대 메트포르민, 글리타존)를 투여받고 있는 인슐린 내성 환자에게도 사용될 수 있음을 알 것이다.
외인성 촉발
앞서 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 방법, 접합체 및 조성물은 글루코스 반응성-접합체로 제한되지 않는다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 여러가지 예시적 글루코스-반응성 접합체는 또한 외인성 사카라이드, 예컨대 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스에도 반응성이었다. 따라서, 특정 실시양태에서는 접합체가 글루코스 이외의 사카라이드, 예컨대 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스, 또는 접합체의 PK 또는 PD 특성을 변경시킬 수 있는 임의의 다른 사카라이드의 외인성 투여에 의해 촉발될 수 있다는 것을 알 것이다.
상기 기재된 바와 같이 접합체가 일단 투여되면 (예를 들어, 지속 방출 제제로서 투여되면), 이것은 적합한 외인성 사카라이드의 투여에 의해 촉발될 수 있다. 특정 실시양태에서, 촉발량의 외인성 사카라이드가 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 외인성 사카라이드의 "촉발량"은 접합체의 적어도 하나의 PK 및/또는 PD 특성 (예를 들어, 앞서 논의된 바와 같은 Cmax, AUC, 반감기 등)에 변화를 야기하기에 충분한 양이다. 접합체에 관한 임의의 상기 언급된 투여 방법이 외인성 사카라이드에도 동등하게 적용된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 접합체 및 외인성 사카라이드의 투여 방법은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 다양한 실시양태에서, 투여 방법은 상이하다 (예를 들어, 예시의 목적으로 언급하자면, 접합체는 1주 단위로 피하 주사 투여될 수 있고, 외인성 사카라이드는 1일 단위로 경구 투여됨). 외인성 사카라이드의 경구 투여는 이것이 환자 순응도를 용이하게 하기 때문에 특히 유용하다. 일반적으로, 접합체의 PK 및 PD 특성이 외인성 사카라이드의 PK 프로파일과 관련이 있을 것임을 알 것이다. 따라서, 접합체의 PK 및 PD 특성은 외인성 사카라이드의 PK 프로파일을 제어함으로써 조절될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 외인성 사카라이드의 PK 프로파일은 사용되는 용량, 경로, 빈도 및 제제를 기초로 조절될 수 있다. 예를 들어, 접합체의 단기간의 강력한 활성화를 원하는 경우에는 경구용의 즉시 방출 제제가 사용될 수 있다. 반대로, 접합체의 보다 장기간의 덜 강력한 활성화를 원하는 경우에는 대신에 경구용의 연장 방출 제제가 사용될 수 있다. 즉시 및 연장 방출 제제의 제제화 및 제조시의 일반적인 고려사항은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에서 찾을 수 있다.
또한, 본 개시내용의 접합체 및 외인성 사카라이드의 상대적인 투여 빈도는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있음을 알 것이다. 특정 실시양태에서, 외인성 사카라이드는 접합체보다 더 빈번하게 투여된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 외인성 사카라이드는 1일 1회 초과로 투여되는 반면에 접합체는 매일 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 외인성 사카라이드는 매일 투여되는 반면에 접합체는 매주 2회, 매주 1회, 격주 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 매월 투여되고 외인성 사카라이드는 매주 2회, 매주 1회 또는 격주로 투여된다. 당업자는 이러한 방식에 있어서의 다른 변동을 인식할 것이고, 이러한 변동은 사용되는 접합체 및 제제의 성질에 따라 달라질 것이다.
실시예
실시예에서 기재되고 사용된 예시적인 접합체 I-1 내지 I-17 및 II-1 내지 II-7의 구조를 도 45에 나타냈다.
I. 예시적인 접합체의 제조 방법
본 제1 세트의 실시예는 예시적인 접합체를 제조하는 다양한 방법을 기재한다. 본 실시예는 또한 출발 성분 및 최종 생성물을 정제하고 검정하기 위한 검정을 포함한다. 이러한 방법은 본 발명의 범위 내에 속하는 다른 접합체 제조를 위해 변형될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1 - 아지도에틸글루코스 ( AzEG )의 합성
a. 브로모에틸글루코스의 합성
도웩스(DOWEX) 50Wx4 수지 (알파-애사르(Alfa-Aesar), 미국 매사추세츠주 와드 힐)를 탈이온수로 세척하여 색상을 제거하였다. D-글루코스 225 g (1.25 mol, 1 당량, 알파-애사르) 및 도웩스 50Wx4 140 g의 혼합물을 2-브로모에탄올 2.2 L (30.5 mol, 25 당량, 124.97 g/mol, 1.762 g/mL, BP = 150℃; 알파-애사르)로 처리하고, 교반된 혼합물을 4시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응을 TLC (20% 메탄올/디클로로메탄 (DCM))로 모니터링하였다. 약 4시간 후에 반응이 완료되었고, 이것을 실온으로 냉각시켰다. 상기 용액을 여과하여 수지를 제거하고, 상기 수지를 에틸 아세테이트 및 DCM으로 세척하였다. 생성된 여액을 회전 증발기에서 스트립핑(stripping)하여 호박색 오일을 수득하였다. 스트립핑 후에 총 400 g을 수득하였다.
상기 호박색 오일을 실리카 겔 (DCM 중에 팩킹된 4 kg 실리카)에서 하기 방식으로 정제하였다. 상기 조 물질을 DCM 중에 용해하여 컬럼에 로딩한 후에 2×4 L 10% 메탄올/DCM, 2×4 L 15% 메탄올/DCM, 및 3×4 L 20% 메탄올/DCM으로 용출시켰다. 생성물 함유 분획 (TLC를 기초로 함)을 수집하여 건조될 때까지 스트립핑시켜서 1-α-브로모에틸-글루코스 152 g (42%)을 수득하였다.
b. 브로모에틸글루코스의 아지도에틸글루코스 ( AzEM )로의 전환
가열 맨틀, 오버헤드 교반기 및 온도계가 장착된 5 L 둥근 바닥 3구 플라스크에 브로모에틸글루코스 150 g (525 mmol)을 충전하였다. 상기 오일을 물 2 L 중에 용해하고, 아지드화나트륨 68.3 g (1.05 mol, 2 당량, 65 g/mol, 알파-애사르) 및 이후 요오드화나트륨 7.9 g (52.5 mmol, 0.08 당량, 149.89 g/mol, 알파-애사르)으로 처리하고, 상기 용액을 50℃로 가온하고 밤새 교반하였다. 상기 용액을 실온으로 냉각시키고 건조될 때까지 회전증발기에서 농축시켰다. 고체 잔류물을 3×500 mL의 5:1 vol. CHCl3:MeOH로 40℃에서 소화시켰다. 합한 유기 부분을 여과하고 건조될 때까지 증발시켜서 아지도에틸글루코스 (86 g)를 회백색 고체로서 수득하였다. TLC (20% MeOH/DCM; H2SO4 함유 차르(char)): 출발 물질과 구별되지 않는 단일 스팟.
c. 아지도에틸글루코스의 재정제
아지도에틸글루코스 32 g을 물 100 mL에 취하였다. 상기 혼탁한 용액을 유리 미세섬유 필터 (왓트만(Whatman) GF/B)를 통해 여과하였다. 금빛 여액을 회전 증발기에서 고체로 증발시켰다. 상기 고체를 메탄올 (100 mL)에 취하고, 상기 혼탁한 용액을 유리 미세섬유 필터를 통해 다시 여과하였다. 생성된 옅은 황색 여액을 진공하에 스트립핑하여 고체를 수득하였다.
상기 고체를 최소량의 메탄올 (50 mL)에 취하고, 교반하에 에틸 아세테이트 (150 mL)를 서서히 첨가하였다. 농후한 슬러리를 냉각시키고 여과하였다. 상기 고체를 공기 건조 (흡습성)시키고, 60℃ 오븐에 밤새 두었다. TLC에서는 원래의 물질은 거의 없는 것으로 나타났다. 15.4 g을 수득하였다. 모액을 진공하에 증발시켜 황색 고무를 수득하였다. 이와 동시에 상기 물질을 추가로 정제하는 시도는 행하지 않았다.
실시예 2 - 아지도에틸만노스 ( AzEM )의 합성
a. 브로모에틸만노스의 합성
도웩스 50Wx4 수지 (알파-애사르, 미국 매사추세츠주 와드 힐)를 탈이온수로 세척하여 색상을 제거하였다. D-만노스 225 g (1.25 mol, 1 당량, 알파-애사르) 및 도웩스 50Wx4 140 g의 혼합물을 2-브로모에탄올 2.2 L (30.5 mol, 25 당량, 124.97 g/mol, 1.762 g/mL, BP = 150℃; 알파-애사르)로 처리하고, 교반된 혼합물을 80℃로 4시간 동안 가열하였다. 반응을 TLC (20% 메탄올/디클로로메탄 (DCM))로 모니터링하였다. 약 4시간 후에 반응이 완료되었고, 이후에 이것을 실온으로 냉각시켰다. 상기 용액을 여과하여 수지를 제거하고, 상기 수지를 에틸 아세테이트 및 DCM으로 세척하였다. 생성된 여액을 회전 증발기에서 스트립핑하여 호박색 오일을 수득하였다.
상기 호박색 오일을 실리카 겔 (DCM 중에 팩킹된 4 kg 실리카)에서 하기 방식으로 정제하였다. 상기 조 물질을 DCM 중에 용해하여 컬럼에 로딩한 후에 2×4 L 10% 메탄올/DCM, 2×4 L 15% 메탄올/DCM, 및 3×4 L 20% 메탄올/DCM으로 용출시켰다. 생성물 함유 분획 (TLC를 기초로 함)을 수집하여 건조될 때까지 스트립핑시켜서 1-α-브로모에틸-만노스 152 g (42%)을 수득하였다.
b. 브로모에틸만노스의 아지도에틸만노스 ( AzEM )로의 전환
가열 맨틀, 오버헤드 교반기 및 온도계가 장착된 5 L 둥근 바닥 3구 플라스크에 브로모에틸만노스 150 g (525 mmol)을 충전하였다. 상기 오일을 물 2 L 중에 용해하고, 아지드화나트륨 68.3 g (1.05 mol, 2 당량, 65 g/mol, 알파-애사르) 및 이후 요오드화나트륨 7.9 g (52.5 mmol, 0.08 당량, 149.89 g/mol, 알파-애사르)으로 처리하고, 상기 용액을 50℃로 가온하고 밤새 교반하였다. 상기 용액을 실온으로 냉각시키고 건조될 때까지 회전증발기에서 농축시켰다. 고체 잔류물을 3×500 mL의 5:1 vol. CHCl3:MeOH로 40℃에서 소화시켰다. 합한 유기 부분을 여과하고 건조될 때까지 증발시켜서 아지도에틸만노스를 회백색 고체로서 수득하였다.
c. 아지도에틸만노스의 재정제
아지도에틸만노스 32 g을 물 100 mL에 취하였다. 상기 혼탁한 용액을 유리 미세섬유 필터 (왓트만 GF/B)를 통해 여과하였다. 여액을 회전 증발기에서 고체로 증발시켰다. 상기 고체를 메탄올 (100 mL)에 취하고, 상기 혼탁한 용액을 유리 미세섬유 필터를 통해 다시 여과하였다. 생성된 옅은 황색 여액을 진공하에 스트립핑하여 고체를 수득하였다.
상기 고체를 최소량의 메탄올 (50 mL)에 취하고, 교반하에 에틸 아세테이트 (150 mL)를 서서히 첨가하였다. 농후한 슬러리를 냉각시키고 여과하였다. 상기 고체를 공기 건조 (흡습성)시키고, 60℃ 오븐에 밤새 두었다. 모액을 진공하에 증발시켜 황색 고무를 수득하였다.
실시예 3 - 아지도에틸만노비오스 ( AzEBM )의 합성
실시예 2의 AzEM 화합물을 벤젠 디메틸 에테르로 선택적으로 보호하고 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후에 벤질 브로마이드와 반응시켜서 1-α-(2-아지도에틸)-4,6-벤즈알데히드 디아세탈-3-벤질-만노피라노시드를 수득하였다. 이후, 상기 생성물을 은 트리플레이트 화학을 이용하여 철저한 무수 조건하에 1-α-브로모-2,3,4,6-테트라벤조일만노피라노시드로 글리코실화하여 보호된-아지도에틸만노비오스 생성물을 수득하였다. 이어서, 상기 중간체 생성물을 탈보호하여 벤조일 기를 제거함으로써 AzEBM을 수득하였다.
실시예 4 - 아지도에틸만노트리오스 ( AzETM )의 합성
a. 1-α- 브로모 -2,3,4,6- 테트라벤조일 - 만노스
교반 막대 및 질소 유입구를 갖는 500 mL 3 구 플라스크에 펜타벤조일만노스 40 g (60.9 mmol) 및 메틸렌 클로라이드 80 mL를 첨가하였다. 생성된 용액을 빙조에서 < 5℃로 냉각시키고, 33% HBr-아세트산 용액 80 mL를 반응 온도 < 10℃가 유지되는 속도로 첨가 깔때기를 통해 첨가하였다. 첨가 완료시 (약 30분)에 빙조를 치우고, 3시간 동안 계속 교반하였다.
상기 반응 용액을 동일 부피 (160 mL)의 DCM으로 희석하여 물 (2×500 mL), 포화 비카르보네이트 (2×50 mL) 및 염수 (1×50 mL)로 연속적으로 추출하고, 황산마그네슘에서 건조시키고 용매를 증발시켜서 고체 발포체 41 g을 수득 (이론적 수율 40.1 g)하였고, 이것을 N2하에 냉장고에 저장하였다. 이 물질을 추가의 정제 없이 사용하였다. 상기 반응을 TLC로 모니터링하였다: 실리카 겔 (헥산/에틸 아세테이트, 7/3) 출발 물질 Rf 0.65, 생성물 Rf 0.8, UV 가시화.
Figure 112014006288597-pat00093
b. 1- 아지도에틸 -2,4- 디벤조일만노스
교반 막대, 질소 유입구 및 무수 아세토니트릴 300 mL를 함유하는 1.0 L 3구 플라스크에 1-아지도에틸만노스 25 g (100.4 mmol) 및 트리에틸 오르토벤조에이트 50 mL (220 mmol, 2.2 당량)를 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 교반하고, 트리플루오로아세트산 (TFA) 0.8 mL (10 mmol)를 순수한 상태로 첨가하였다. 상기 용액은 10분 이내에 투명해졌고, 2시간 더 계속 교반한 후에 10% 수성 TFA 25 mL를 첨가하고, 2시간 더 계속 교반하여 중간체를 에스테르 이성질체로 가수분해하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 점성 오일을 수득하였고, 이것을 DCM 50 mL로 연화처리(trituration)하고 다시 증발시켜 점성 오일을 수득하였다. 톨루엔 (70 mL)을 상기 잔류물에 첨가하고, 상기 점성 용액에 2,4-디벤조일아지도에틸만노스를 접종하였다. 미세한 침전물이 15분 이내에 형성되었고, 밤새 실온에서 계속 교반하였다. 생성된 농후한 현탁액을 냉장고에 2시간 내지 4시간 동안 두었다가 여과하고, 고체를 빙냉 톨루엔 (2×10 mL)으로 세척하였다. 상기 고체를 일정 중량으로 공기 건조시켜서 약 95% 이성질체 순도의 21 g (TY 22.85 g, 50% 이성질체 순도)을 수득하였다. 상기 생성물을 톨루엔 40 mL에 취하여 1시간 동안 교반한 후에 2시간 더 냉장고에 두었다. 고체를 여과하여 빙냉 톨루엔 (2×10 mL)으로 세척하고 일정 중량으로 공기 건조시켜서 단일 이성질체 생성물 2,4-디벤조일아지도에틸만노스 18.5 g을 83% 수율로 수득하였다. 모액은 원치않는 이성질체 및 소량의 원하는 이성질체를 함유하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다: SG (헥산/에틸 아세테이트 7/3) 출발 물질 Rf 0.0, 오르토에스테르 중간체 Rf 0.9. (헥산/에틸 아세테이트: 8/2) SM Rf 0.8, 원하는 이성질체 Rf 0.4, 원치않는 이성질체 Rf 0.2.
Figure 112014006288597-pat00094
c. 퍼벤조일화 - man (α-1,3)- man (α-1.6)-α-1- 아지도에틸만노피라노시드
교반 막대 및 질소 유입구가 장착된 1.0 L 3구 플라스크에 DCM 185 mL 중 조 1-브로모-테트라벤조일만노스 41 g (60.9 mmol, 약 2.5 당량)을 첨가하였다. 여기에 2,4-디벤조일아지도에틸만노스 11.2 g (24.5 mmol)을 첨가한 후에 4Å 체 11.2 g을 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 10분 동안 교반하고 메탄올/빙조에서 -15℃로 냉각시켰다.
별개의 어두운 색상의 용기에서 톨루엔 190 mL 및 이후 은-트리플루오로메탄술포네이트 (AgOTf) 15.1 g (58.8 mmol, 2.4 당량)을 상기 용액에 첨가하고, 암실에서 교반하였다. 상기 용액을 대형 첨가 깔때기로 옮기고, 반응을 광으로부터 보호하면서 교반 중인 현탁액에 적가하였다. 반응 온도는 AgOTf 첨가 속도를 조정하여 < -10℃로 유지하였다. 첨가 완료시 (약 30분)에 빙조를 치우고, TLC (SG, 헥산/에틸 아세테이트: 7/3, 브로모 Rf 0.9, 아지도 Rf 0.4, 트리오스 생성물 Rf 0.5, uv 가시화)에서 단일 생성물이 남은 것으로 확인될 때까지 반응물을 2시간 더 교반하였다.
트리에틸아민 (7 mL, 5.0 당량)을 첨가한 후에 DCM 200 mL를 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실리카 겔 패드 및 셀라이트를 통해 여과하고, 2×75 mL DCM으로 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트로 취하여 물 (2×100 mL), 비카르보네이트 (2×50 mL) 및 염수 (1×75 mL)로 순차적으로 세척하고 황산마그네슘에서 건조시켰다. 용매를 진공하에 증발시켜서 고체 발포체 39 g (TY 39.5 g)을 수득하였다.
Figure 112014006288597-pat00095
d. man (α-1,3)- man (α-1.6)-α-1- 아지도에틸만노피라노시드
메탄올 40 mL 중 퍼벤조일화-man(α-1,3)-man(α-1.6)-α-1-아지도에틸만노피라노시드 (1.86 mmol) 3.0 g의 교반 중인 현탁액에 메탄올 중 4.28 M 나트륨 메톡시드 0.2 mL를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 20시간 동안 실온에서 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. 반응의 완료를 TLC로 모니터링하였다 (SG, 헥산/에틸 아세테이트: 8/2 SM Rf 0.4, 생성물 Rf 0.0).
메탄올을 진공하에 증발시켜 유성 반-고체를 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 취하고 3시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하여 신선한 에틸 아세테이트 (2×20 mL)로 세척하고 일정 중량으로 공기 건조시켜서 생성물 1.09 g (TY 1.07 g)을 수득하였다. 모액은 잔류 메틸 벤조에이트, 탈보호 부산물을 함유하였다.
실시예 5 - 아지도에틸 - 사카라이드 ( AzEG , AzEM , AzEBM , AzETM )로부터 아미노에틸-사카라이드 (AEG, AEM, AEBM, AETM)의 합성
실시예 1 내지 4의 아지도-종결된 화합물은 팔라듐/탄소 촉매, 소량의 아세트산 및 에탄올 (용매)의 사용으로 실온에서 쉽게 수소화되어 상응하는 아민-종결된 화합물을 제공한다. 도 10은 AEG, AEM, AEBM, AETM의 화학적 구조를 보여준다. 이 과정은 하기에서 AETM에 대해 기재된 것과 동일하지만, 당업자는 시약, 용매 등의 양은 수소화할 사카라이드-리간드의 몰수에 따라 달라져야 한다는 것을 이해할 것이다.
a. man (α-1,3)- man (α-1.6)-α-1- 아미노에틸만노피라노시드 (" 아미노에틸트리만노스", AETM)
물 100 mL 및 에탄올 50 mL 중 man(α-1,3)-man(α-1.6)-α-1-아지도에틸만노피라노시드 5.3 g (9.25 mmol)의 용액에 5% Pd/C 0.8 g을 첨가하였다. 격렬하게 교반 중인 현탁액을 30 내지 40 psi에서 48시간 동안 또는 TLC에서 출발 물질이 나타나지 않을 때까지 (SG, 메탄올, SM Rf 0.75, Pdt Rf 0.0, PMA vis.) 수소화하였다. 상기 현탁액을 셀라이트에서 여과하고, 이것을 에탄올 (2×50 mL)로 헹구고 여액을 진공하에 농축시켰다.
상기 물질의 HPLC (C18, 3% 아세토니트릴/97% 0.1% H3PO4, 220 nm, 2 mL/분)는 주입 컬럼 공극 물질의 uv 흡착을 제공하여 (Rt 2.5분) 벤조에이트 에스테르임을 나타냈다.
여액을 물 70 mL 및 1 N NaOH 12 mL로 희석하고, 상기 용액을 실온에서 밤새 교반하였다 (HPLC: 컬럼 공극에서는 uv 물질 없음 (Rt 2.5분), 벤조산과 동시 용출되는 uv 물질 있음 (Rt 10.5분)). 탈색용 목탄 2 g을 첨가하고, 교반 중인 현탁액을 80℃로 가열했다가 실온으로 냉각시키고 셀라이트에서 여과하였다. 여액의 pH를 2 N HCl을 사용하여 8.0으로 조정하고, 무색의 용액을 진공하에 약 50% 부피로 농축시켰다.
상기 용액을 수지 컬럼 (도웩스 50W, 50 g)에 로딩하고, 용출 분획이 중성 pH가 될 때까지 물 (6×75 mL)로 세척하여 임의의 잔류 산 부산물을 제거하였다. 아민 생성물을 0.25 N 수산화암모늄 (6×75 mL)을 사용하여 컬럼으로부터 세척해 내고, 아민 생성물을 함유하는 분획들 (닌히드린 검출)을 합하고 진공하에 25 내지 30 mL로 농축시켰다. 상기 농축된 용액을 교반 중인 에탄올 300 mL에 적가하고, 2시간 더 계속 교반하였다. 생성물을 여과하여 신선한 에탄올 (2×50 mL)로 세척하고 일정 중량으로 공기 건조시켰다. 생성된 백색 무정형 고체를 80℃의 진공 오븐에서 5시간 동안 추가로 건조시켜서 백색 과립상 고체 4.1 g (TY 5.1 g)을 수득하였다. NMR에는 임의의 방향족 양성자가 없었다.
Figure 112014006288597-pat00096
실시예 6 - 디프로파르길 사카라이드 합성 및 AE - 리간드의 생성
a. 디에틸 디프로파르길말로네이트의 합성
디에틸말로네이트 (122.5 g, 0.7648 mol)를 나트륨 에톡시드 (나트륨 금속으로부터 제조됨, 38.5 g, 1.67 mol)를 함유하는 무수 에탄올 (800 mL)에 첨가하였다. 30분 후에, 프로파르길 브로마이드 (200 g, 1.68 mol)를 상기 교반된 현탁액에 서서히 첨가하면서, 온도는 60℃ 아래로 유지시켰다. 상기 혼합물을 밤새 (15시간) 환류시켰다. 침전된 염을 여과로 제거하고 에탄올로 세척하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 물로 희석하고 에탄올 (2×200 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 MgSO4에서 건조시켜 여과하고 Et2O로 세척하고, 용매를 진공하에 제거하여 금빛 색상의 오일을 수득하였다. 상기 오일을 고진공 (40℃)하에 3시간 동안 방치하였다. 고체가 결정화되기 시작하여 유성 고체를 형성하였다. 밤새 (16시간) 방치하였다. 시클로헥산을 상기 플라스크에 충전하고 고체를 분쇄하여 여과하고 시클로헥산으로 세척하여 백색 결정질 생성물 (81 g, 44.8% 수율)을 수득하였다. 반응을 GC로 확인하였다.
b. 디프로파르길말론산의 합성
디에틸 디프로파르길 말로네이트 (80 g, 0.339 mol)를 10% 알콜성 수산화칼륨 600 mL 중에서 밤새 (15시간) 환류시켰다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 3 N HCl로 산성화하였다. 잔류물을 Et2O (2×300 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 MgSO4에서 건조시켜 여과하고 Et2O로 세척하고 진공하에 오일로 농축시켰다. 고진공 (40℃)하에 2시간 동안 방치하여 디프로파르길말론산을 오일로서 수득하였다 (46 g, 75.4% 수율). 반응을 GC로 확인하였다.
c. 디프로파르길아세트산의 합성
디프로파르길말론산 (26 g, 0.443 mol)을 135℃에서 순수한 상태로 CO2 발생이 멈출 때까지 가열하였다. 이어서, 이것이 오일로 냉각되도록 하였다. 상기 오일을 0.5 psi에서 증류시켰다. 증류 플라스크 내의 나머지 유성 잔류물과 고체를 합하고 (15.7 g, 79.9% 수율), 이것을 다음 단계에서 그대로 사용하였다.
d. [2-(3- 프로프 -2- 이닐 - 헥스 -5- 이노일아미노 )-에틸]- 카르밤산 t-부틸 에스테르의 합성
CH3CN 50 mL 중 N-boc-에틸렌디아민 (18.3 g, 0.1143 mol)을 CH3CN 300 mL 중 디프로파르길아세트산 (15.56 g, 0.1143 mol), TBTU (36.74 g, 0.114 mol) 및 DIPEA (29.6 g, 0.229 mol)를 함유하는 교반된 용액에 0℃에서 첨가 깔때기를 통해 서서히 첨가하였다. 침전이 발생하였다. 빙조를 치우고, 생성물을 주위 온도에서 밤새 (16시간) 교반하였다. 이 시점에서 반응물은 전체적으로 균질하였다. 상기 용액을 진공하에 농축시키고, 잔류물을 물 800 mL로 희석하였다. 생성된 고체를 여과하여 물로 철저하게 세척하고 진공 건조시켜서 조 생성물 14.3 g을 수득하였다. DCM으로부터 재결정화 (2×)시켜 여과하고 헥산으로 세척하여 생성물을 수득하였다 (9.85 g, 31% 수율, 98% 순도 (HPLC (214 nm))).
e. 아지도사카라이드의 [2-(3- 프로프 -2- 이닐 - 헥스 -5- 이노일아미노 )-에틸]- 카르밤산 t-부틸 에스테르로의 클릭 반응
DCM (20 mL) 중 1,1-디프로파르길-아세틸-(-1N,2N-BOC-1,2-디아미노에틸)아미드 (DP, 418 mg, 1.5 mmol)에 TFA (4 mL)를 5분에 걸쳐 0℃에서 적가하였다. 어두운 색상이 된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물질을 감압하에 증발시켰다. 톨루엔 (20 mL)을 잔류물에 첨가하고 감압하에 2회 스트립핑하였다. 생성된 어두운 색상의 오일을 추가의 정제 없이 사용하였다.
이 잔류물에 THF (20 mL) 및 물 (20 mL)을 첨가하며 15분 동안 교반하였다. 황산구리 (225 mg, 0.9 mmol)를 첨가한 후에 나트륨 아스코르베이트 (180 mg, 0.9 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 6시간 동안 55℃ 내지 60℃로 가열한 후에 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 감압하에 대략 절반 부피로 증발시켜서 미세섬유 유리 필터로 여과하였다. 생성된 투명한 용액을 수지 컬럼 (도웩스 50X-2)에 넣고, 중성 pH가 될 때까지 물 (6×75 mL)로 세척한 후에 10% NH4OH (8×75 mL)로 세척하였다. 닌히드린에 양성으로 염색된 분획들을 합하고 감압하에 유리질 고체로 증발시켰다. 유리 잔류물을 물 (250 mL)에 취하여 목탄 0.5 g으로 처리하고 환류시까지 가열하였다. 냉각된 슬러리를 셀라이트 및 미세섬유 필터에서 여과하였다. 생성된 옅은 황색 용액을 감압하에 유리질 고체로 증발시키고, 메탄올을 첨가하고 증발 (2×)시켜서 회백색 발포체를 수득하였다 (0.9 g, TY 1.0 g).
실시예 7 - 트리프로파르길 사카라이드 합성 및 AE - 리간드의 생성
a. 2-(2- BOC - 아미노에틸 ) 티오아세트아미드 -트리스[( 프로파르길옥시 ) 메틸 ] 아미노메탄
에탄올 (5 mL) 중 t-부틸 N-(2-메르캅토에틸)카르바메이트 (프론트룬 오르가닉스(Frontrun Organix), 미국 매사추세츠주 이프스위치, 177.26 mg, 1 mmol)의 용액을 실온에서 교반하며 NaOH (1.1 mmol)를 첨가하였다. 이 용액에 2-브로모아세트아미드-트리스[(프로파르길옥시)메틸]아미노메탄 (356 mg, 1.0 mmol, 문헌 [J. Org. Chem. 73, 5602, 2008] 참조)을 첨가하고, 20시간 동안 계속 교반하였다 (TLC SG 8/2 헥산/에틸 아세테이트, pdt Rf 0.4). 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (40 mL) 중에 취하여 물 (25 mL), 0.5 N NaOH (25 mL) 및 염수 (25 mL)로 연속적으로 세척하여 Na2SO4에서 건조시켜 여과하고 오일로 농축시켰다 (360 mg, TY 452.3 mg).
Figure 112014006288597-pat00097
b. 2-(2- 아미노에틸 ) 티오아세트아미드 -트리스[( 트리아졸로 -1-(2- 에틸만노스 ) 4-메톡시)메틸] 아미노메탄
DCM (40 mL) 중 2-(2-BOC-아미노에틸)티오아세트아미드-트리스[(프로파르길옥시)메틸] 아미노메탄 (1 g, 2.21 mmol)의 교반 중인 용액에 실온에서 TFA (4 mL)를 적가하였다. 생성된 용액을 밤새 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 톨루엔 (15 mL)에 취하여 건조될 때까지 증발시켰다.
잔류물을 THF (40 mL) 및 물 (40 mL)에 취하여 상기 용액을 교반하였다. 아지도에틸만노스 (3.75 당량, 2.0 g, 8.3 mmol)를 첨가한 후에 황산구리 (500 mg, 2.0 mmol) 및 나트륨 아스코르베이트 (400 mg, 2.0 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 55℃ 내지 60℃ (오일조)에서 6시간 동안 교반하여 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공하에 절반 부피로 농축시켜서 마이크로-유리 필터를 통해 여과하였다. 여액을 수지 컬럼 (도웩스 50W 50x4-100)에 로딩하고, 중성이 될 때까지 물 (6×75 mL)로 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 15% 수산화암모늄 (10×75 mL)으로 용출시키고, 닌히드린에 양성인 분획들을 모아 유리질 발포체로 농축시켰다 (1.29 g, TY (MW 1099 g/mol), 53% (2개 단계)).
실시예 8 - NH 2 -B1- BOC2 (A1,B29)-인슐린의 합성
전형적인 합성에서, 분말형 인슐린 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스) 4 g을 무수 DMSO 100 mL 중에 실온에서 용해한 후에 트리에틸아민 (TEA) 4 mL를 첨가하였다. 상기 용액을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 다음으로, 디-tert-부틸-디카르보네이트/THF 용액 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스) 1.79 mL (2.6 당량)를 상기 인슐린-TEA 용액에 서서히 첨가하고, 대략 1시간 동안 혼합하였다. 상기 반응물을 DMSO 5 mL 중 에탄올아민 250 ㎕를 함유하는 원액 4 mL의 첨가로 켄칭시킨 후에 5분 동안 혼합하였다. 켄칭 후, 전체 용액을 아세톤 1600 mL에 붓고, 스패튤라로 잠시 혼합하였다. 다음으로, 18.9% HCl:물 용액 8×400 ㎕의 분취액을 상기 혼합물의 표면에 적가하여 반응된 인슐린을 침전시켰다. 이어서, 침전된 물질을 원심분리하고, 상등액을 제2 비커로 경사분리하여 침전물 케이크는 따로 보관하였다. 상기 상등액 용액에, 18.9% HCl:물 용액의 또 다른 8×400 ㎕의 분취액을 상기 혼합물의 표면에 적가하여 반응된 인슐린의 제2 침전물을 수득하였다. 이러한 제2 침전물을 원심분리하고, 상등액은 버렸다. 2개의 침전 단계로부터 합한 원심분리 케이크를 아세톤으로 1회 세척한 후에 진공하에 실온에서 건조시켜서 조 분말을 수득하였고, 이것은 전형적으로 60%의 원하는 BOC2 생성물 및 40%의 BOC3 물질을 함유하였다.
정제용 역상 HPLC 방법을 이용하여 조 분말로부터 순수한 BOC2-인슐린을 단리하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 조 분말을 70% A/30% B 혼합물 중에 25 mg/mL로 용해하고, 시린지 여과한 후에 컬럼에 주입하였다. 정제 전에, 상기 컬럼 (워터스(Waters) 심메트리프렙(SymmetryPrep) C18, 7 ㎛, 19×150 mm)을 워터스 델트라프렙(DeltraPrep) 600 시스템을 사용하여 70% A/30% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 분말 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 5분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 3.5분의 기간에 걸쳐 70% A/30% B → 62% A/38% B의 선형 구배를 사용하고, 이대로 2.5분 더 유지하였다. 이 방법을 이용하여, 원하는 BOC2 피크가 대략 10.6분에서 용출된 후에 바로 BOC3 피크가 용출되었다. 일단 수집한 후, 상기 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜 순수한 BOC2-인슐린 분말을 수득하였다. 정체성(identity)은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈(HT Laboratories), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증하였고, 접합 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티칼(Western Analytical), 미국 미주리주 세인트 루이스)으로 결정하였다.
실시예 9 - 벤젠-1,3,5- 트리카르복시 -(N-ω-아미노산- NHS 에스테르) 아미드 프레임워크의 합성
디클로로메탄 (DCM) (5 mL) 중 1,3,5-벤젠트리카르보닐 클로라이드 (1 g, 3.8 mmol)의 용액을 1 N NaOH (25 mL) 중 ω-아미노산 (3.1 당량)의 격렬하게 교반 중인 용액에 빙조에서 적가하였다. 빙조를 치우고, 4시간 동안 실온에서 계속 교반하였다. 2 N HCl (약 15 mL)을 대략 pH 2까지 적가하고, 생성된 슬러리를 2시간 더 교반하였다. 침전물을 여과하여 냉수 (2×20 mL)로 세척하고 공기 중에 진공하에 건조시킨 후에 60℃ 오븐에서 밤새 건조시켰다. 생성된 백색 고체를 추가의 정제 없이 사용하였다. 각각의 ω-아미노산을 수득하였다 (4-아미노부티르산: 수율 1.6 g, 91%; 6-아미노카프로산: 수율 1.9 g, 92%).
상기 물질을 N-히드록시숙신이미드 (3.1 mmol, 3.1 당량)를 함유하는 DMSO (5 mL)에 취하고, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 (EDCI, 3.6 mmol, 3.6 당량)를 실온에서 첨가하였다. 생성된 용액을 24시간 동안 교반하여 물 (125 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트 (3×50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물 (2×50 mL) 및 염수 (1×50 mL)로 세척하여 MgSO4에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 반-고체 잔류물을 아세토니트릴 (10 mL)로 연화처리하였다. 고체를 여과하고, 차가운 용매로 세척하여 공기 중에 진공하에 건조시킨 후에 60℃ 오븐에서 밤새 건조시켰다. 생성물에는 우레아 부산물이 없었다. 벤젠-1,3,5-트리카르복시-(N-6-아미노카프로산-NHS 에스테르)아미드 (TSB-C6): 304 mg, 36%, mp 140-142℃. 벤젠-1,3,5-트리카르복시-(N-4-부티르산-NHS-에스테르)아미드 (TSB-C4): 245 mg, 45%, mp 182-184℃.
실시예 10 - 수지상 프레임워크 합성
a. 니트로 기 함유, 알킨 -말단 관능화 덴드론의 수소화
n = 2개, 4개 또는 8개의 말단 알킨 및 니트로프로피온산 코어를 함유하는 덴드론을 구하여 (예를 들어, 스웨덴 소재의 폴리머 팩토리(Polymer Factory)에서 구함) 추가의 정제 없이 사용하였다. 덴드론을 DCM 및 에탄올의 50:50 vol. 혼합물 100 mL 중에 용해하고 5% Pd/C 0.8 g을 첨가하였다. 격렬하게 교반 중인 현탁액을 30 내지 40 psi에서 48시간 동안 또는 TLC에 의해 출발 물질이 더이상 존재하지 않는 것으로 확인될 때까지 수소화하였다. 상기 현탁액을 셀라이트에서 여과하고, 이것을 에탄올 (2×50 mL)로 헹구고 여액을 진공하에 농축시켰다.
여액을 물 70 mL 및 1 N NaOH 12 mL로 희석하고, 상기 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 탈색용 목탄 2 g을 첨가하고, 교반 중인 현탁액을 80℃로 가열하여 실온으로 냉각시키고 셀라이트에서 여과하였다. 2 N HCl을 사용하여 여액의 pH를 8.0으로 조정하고, 무색의 용액을 진공하에 약 50% 부피로 농축시켰다.
상기 용액을 수지 컬럼 (도웩스 50W, 50 g)에 로딩하고, 용출된 분획들이 중성 pH가 될 때까지 물 (6×75 mL)로 세척하면서 임의의 잔류 산 부산물을 제거하였다. 0.25 N 수산화암모늄 (6×75 mL)을 사용하여 아민 생성물을 컬럼으로부터 세척해 내고, 아민 생성물을 함유하는 분획들 (닌히드린 검출)을 합하고 회전 증발기를 사용하여 진공하에 증발시켰다.
b. 덴드론 (아민, 알킨 -4)과 아지도에틸 만노스의 반응
수소화 후에 수득된 아미노 코어 및 4개의 말단 알킨 기 함유 덴드론 생성물 (8.3 mmol)을 THF (40 mL) 및 물 (40 mL)에 취하고 상기 용액을 교반하였다. 아지도에틸만노스 (4.75 당량, 2.53 g, 10.51 mmol)를 첨가한 후에 황산구리 (500 mg, 2.0 mmol) 및 나트륨 아스코르베이트 (400 mg, 2.0 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 55℃ 내지 60℃ (오일조)에서 6시간 동안 교반하여 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공하에 절반 부피로 농축시켜서 마이크로-유리 필터를 통해 여과하였다. 여액을 수지 컬럼 (도웩스 50W 50x4-100)에 로딩하고, 중성이 될 때까지 물 (6×75 mL)로 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 15% 수산화암모늄 (10×75 mL)으로 용출시키고, 닌히드린에 양성인 분획들을 모아 유리질 발포체로 농축시켰다.
실시예 11 - 유기 용매 중 다가 활성화된 에스테르를 갖는 아민- 관능화된 약물 접합 (약물이 먼저 첨가됨)
N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 무수 DMSO 1.0 mL 중에 60 mM로 용해한 후에 400 ㎕ (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 상기 용액을 신속하게 10분 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 아민-보유 약물을 DMSO 7.9 mL 중에 7.4 mM의 농도로 별도로 용해하였다. 일단 용해한 후, 전체 약물 용액을 10분의 기간에 걸쳐 프레임워크/DMSO/TEA 용액에 적가한 후에 2시간 동안 실온에서 혼합하였다. 이어서, 나머지 활성화된 에스테르를 다음과 같은 방식으로 아민-관능화 리간드와 반응시켰다. 370 mM의 리간드 용액을 적절한 부피의 무수 DMSO 중에 제조하였다. 일단 용해한 후, 충분한 용액을 첨가하여 초기 활성화된 에스테르 기의 수인 N에서 1을 감한 값의 3배에 해당하는 수의 반응성 당량을 제공하였다. 예를 들어, 프레임워크 1개 당 N = 3의 초기 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (3×(3-1)×60 mM/370 mM) = 0.973 mL의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 1개 당 N = 4의 초기 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (3×(4-1)×60 mM/370 mM) = 1.46 mL의 리간드 용액을 첨가하는 식이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 상기 용액을 1시간 더 실온에서 교반하여 반응이 완료되게 하였다.
이어서, 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액에 10배 과다희석한 후에 묽은 HCl을 사용하여 최종 pH 8.0이 될 때까지 pH를 조정하였다. 상기 수용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 우선 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성하였다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 10 mL가 되도록 농축시켰다. 이 용액을 워터스 C8, 7 ㎛, 19×150 mm 컬럼에서의 정제용 역상 HPLC로 추가로 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 정제 전에, 상기 컬럼을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 80% A/20% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 2분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 5분에 걸쳐 80% A/20% B → 75% A/25% B의 선형 구배를 사용한 다음에 이후 22분에 걸쳐 75% A/25% B → 62% A/38% B의 더 느린 선형 구배를 사용하였다. 원하는 피크의 체류 시간은 사용된 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집한 후, 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜서 순수한 접합체를 수득하였고, 이것의 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증할 수 있었다.
실시예 12 - 다가 사카라이드 -균일 리간드를 갖는 B1-인슐린 접합체
실시예 11에 기재된 방법 및 실시예 8의 아민-보유 약물, NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 사용하여, 다음과 같은 프레임워크 및 리간드를 갖는 인슐린 접합체를 제조하였다. 트리스-숙신이미딜-1,3,5-벤젠트리카르복실레이트 (TSB), 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트 (TSAT), 트리스-숙신이미딜 (6-아미노카프로일)아미노트리아세테이트 (TSAT-C6) 및 테트라키스-(N-숙신이미딜 카르복시프로필)펜타에리트리톨 TSPE 활성화된 에스테르 프레임워크를 몰레큘라 바이오사이언시즈(Molecular Biosciences) (미국 콜로라도주 보울더)로부터 구입하여 추가의 정제 없이 사용하였다. TSB-C4 및 TSB-C6 프레임워크는 실시예 9에 따라 합성하였다. AEM, AEBM 및 AETM 리간드는 실시예 1 내지 5에 따라 합성하였다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다.
모든 경우에서, BOC 보호기는 실시예 11에 따라 수득된 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘(Amicon) 3K 막 (밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 대략 58 U의 인슐린/mL (A280 측정치를 기초로 함)로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, N-말단 서열분석에 의해 각각의 탈보호된 최종 생성물에서 입증되는 바와 같이 Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였다.
하기 표 (및 실시예의 이와 유사한 다른 부분)에서, 프레임워크 MW 값은 프레임워크의 활성화된 에스테르에 대한 것이다. 따라서, 상기 반응 혼합물에 첨가될 활성화된 에스테르 프레임워크의 질량을 즉시 계산할 수 있다. 일단 반응하면, 프레임워크는 활성화된 에스테르를 소실하기 때문에 최종 생성물에서의 MW 값은 훨씬 낮다.
Figure 112014006288597-pat00098
실시예 13 - 다가 사카라이드 -혼합 리간드를 갖는 B1-인슐린 접합체
실시예 11에 기재된 방법 및 실시예 8의 아민-보유 약물, NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 사용하여, 프레임워크에 연결된 사카라이드 리간드의 혼합물을 보유하는 인슐린 접합체를 제조하였다.
TSAT-C6 및 TSPE 활성화된 에스테르 프레임워크를 몰레큘라 바이오사이언시즈 (미국 콜로라도주 보울더)로부터 구입하여 추가의 정제 없이 사용하였다. AEM, AEBM 및 AETM은 실시예 1 내지 5에 따라 합성하였다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다.
모든 경우에서, BOC 보호기는 실시예 11에 따라 수득된 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 원하는 수준으로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, N-말단 서열분석에 의해 각각의 탈보호된 최종 생성물에서 입증되는 바와 같이 Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였다.
Figure 112014006288597-pat00099
실시예 14 - 사전 제조된 다가 사카라이드를 사용한, 다가 사카라이드를 갖는 B1-인슐린 접합체
실시예 11에 기재된 방법 및 실시예 8의 아민-보유 약물, NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 사용하여, 사전 합성된 다가 아민-함유 리간드로부터 하기하는 인슐린 접합체를 제조하였다. 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS) 및 TSAT-C6 활성화된 에스테르 프레임워크를 몰레큘라 바이오사이언시즈 (미국 콜로라도주 보울더)로부터 구입하여 추가의 정제 없이 사용하였다. 말단 반응성 아민을 함유하는 2가 AEM-2, AEBM-2 및 AETM-2 분자는 각각의 리간드 2개를 반응성 아민이 또한 접합된 적합한 프레임워크에 접합시켜 제조하였다. 말단 반응성 아민을 함유하는 3가 AEM-3, AEBM-3 및 AETM-3 분자는 각각의 리간드 3개를 반응성 아민이 또한 접합된 적합한 프레임워크에 접합시켜 제조하였다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다.
모든 경우에서, BOC 보호기는 실시예 11에 따라 수득된 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 원하는 수준으로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, N-말단 서열분석에 의해 각각의 탈보호된 최종 생성물에서 입증되는 바와 같이 Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였다.
Figure 112014006288597-pat00100
실시예 15 - 수지상 프레임워크 -균일 리간드를 사용한, 다가 사카라이드를 갖는 B1-인슐린 접합체
실시예 10b에서 제조된 아미노 코어 및 4개의 말단 알킨 기 함유 덴드론 0.1 g (0.098 mmol)을 무수 DMSO 중에 100 mg/mL로 용해하였다. 상기 용액을 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS, 몰레큘라 바이오사이언시즈, 0.098 mmol) 및 트리에틸아민 (400 ㎕)을 함유하는 용액에 적가하고, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이어서, 상기 혼합물을 실시예 8의 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 함유하는 50 mg/mL 용액 (0.588 g, 0.098 mmol)에 적가하고 2시간 동안 반응시켰다.
생성된 접합체를 물 중에 과다희석하고, pH를 8.0으로 조정하였다. 상기 용액을 바이오겔 P2로 탈염시킨 후에 아미콘 3K 한외여과 장치로 농축시켰다. 생성된 용액을 역상 크로마토그래피로 정제하고 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켰다. BOC 보호기는 상기 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 원하는 수준으로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였고, 이것은 N-말단 서열분석에 의해 각각의 탈보호된 최종 생성물에서 입증되었다.
실시예 16 - NH 2 -B29- BOC2 (A1,B1)-인슐린의 합성
a. Fmoc1 -(B29)-인슐린
전형적인 합성에서, 분말형 인슐린 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스) 4 g을 무수 DMSO 100 mL 중에 실온에서 용해한 후에 트리에틸아민 (TEA) 4 mL를 첨가하였다. 상기 용액을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 다음으로, 1.2 당량의 9-플루오레닐메틸 N-숙신이미딜 카르보네이트 (Fmoc-NHS) (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)를 THF 중 1.0 M Fmoc-NHS 용액으로서 상기 인슐린-TEA 용액에 서서히 첨가하였다. 상기 반응물을 대략 1시간 동안 혼합하였다. 상기 반응물을 DMSO 5 mL 중 에탄올아민 250 ㎕를 함유하는 원액 4 mL의 첨가로 켄칭시킨 후에 5분 동안 혼합하였다. 켄칭 후, 전체 용액을 아세톤 1600 mL에 붓고, 스패튤라로 잠시 혼합하였다. 다음으로, 18.9% HCl:물 용액 8×400 ㎕의 분취액을 상기 혼합물의 표면에 적가하여 반응된 인슐린을 침전시켰다. 이어서, 침전된 물질을 원심분리하고, 상등액을 제2 비커로 경사분리하여 침전물 케이크는 따로 보관하였다. 상기 상등액 용액에, 18.9% HCl:물 용액의 또 다른 8×400 ㎕의 분취액을 상기 혼합물의 표면에 적가하여 반응된 인슐린의 제2 침전물을 수득하였다. 이러한 제2 침전물을 원심분리하고, 상등액은 버렸다. 2개의 침전 단계로부터 합한 원심분리 케이크를 아세톤으로 1회 세척한 후에 진공하에 실온에서 건조시켜서 조 분말을 수득하였고, 이것은 전형적으로 20%의 Fmoc1 생성물, 65%의 Fmoc2 생성물, 및 15%의 미반응 인슐린을 함유하였다.
정제용 역상 HPLC 방법을 이용하여 조 분말로부터 순수한 원하는 Fmoc1-인슐린을 단리하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 조 분말을 70% A/30% B 혼합물 중에 25 mg/mL로 용해하고, 시린지 여과한 후에 컬럼에 주입하였다. 정제 전에, 상기 컬럼 (워터스 심메트리프렙 C18, 7 ㎛, 19×150 mm)을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 70% A/30% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 분말 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 5분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 3.5분의 기간에 걸쳐 70% A/30% B → 62% A/38% B의 선형 구배를 사용하고, 이대로 2.5분 더 유지하였다. 이 방법을 이용하여, 원하는 Fmoc1 피크가 미반응 RHI 피크 이후 대략 3분에서 용출된 후에 바로 Fmoc2-인슐린 피크가 용출되었다. 일단 수집한 후, 상기 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜 순수한 Fmoc1-인슐린 분말을 수득하였다. 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증하였고, 접합 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티칼, 미국 미주리주 세인트 루이스)으로 결정하였다.
b. BOC2 (A1,B1)- Fmoc -(B29)-인슐린
전형적인 합성에서, Fmoc1-(B29)-인슐린 1 g을 무수 DMSO 25 mL 중에 실온에서 용해한 후에 트리에틸아민 (TEA) 1 mL를 첨가하였다. 상기 용액을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 다음으로, 디-tert-부틸-디카르보네이트/THF 용액 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스) 0.379 mL (2.2 당량)를 상기 인슐린-TEA 용액에 서서히 첨가하고, 대략 1시간 동안 혼합하였다. 상기 반응물을 DMSO 5 mL 중 에탄올아민 250 ㎕를 함유하는 원액 1 mL의 첨가로 켄칭시킨 후에 5분 동안 혼합하였다. 켄칭 후, 전체 용액을 아세톤 400 mL에 붓고, 스패튤라로 잠시 혼합하였다. 다음으로, 18.9% HCl:물 용액 8×100 ㎕의 분취액을 상기 혼합물의 표면에 적가하여 반응된 인슐린을 침전시켰다. 이어서, 침전된 물질을 원심분리하고, 상등액을 제2 비커로 경사분리하여 침전물 케이크는 따로 보관하였다. 상기 상등액 용액에, 18.9% HCl:물 용액의 또 다른 8×100 ㎕의 분취액을 상기 혼합물의 표면에 적가하여 반응된 인슐린의 제2 침전물을 수득하였다. 이러한 제2 침전물을 원심분리하고, 상등액은 버렸다. 2개의 침전 단계로부터 합한 원심분리 케이크를 아세톤으로 1회 세척한 후에 진공하에 실온에서 건조시켜서 조 분말을 수득하였고, 이것은 전형적으로 90% 초과의 원하는 BOC2-Fmoc1 생성물을 함유하였다.
정제용 역상 HPLC 방법을 이용하여 조 분말로부터 순수한 BOC2-Fmoc1-인슐린을 단리하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 조 분말을 70% A/30% B 혼합물 중에 25 mg/mL로 용해하고, 시린지 여과한 후에 컬럼에 주입하였다. 정제 전에, 상기 컬럼 (워터스 심메트리프렙 C18, 7 ㎛, 19×150 mm)을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 70% A/30% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 분말 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 5분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 3.5분의 기간에 걸쳐 70% A/30% B → 62% A/38% B의 선형 구배를 사용하고, 이대로 2.5분 더 유지하였다. 이 방법을 이용하여, 원하는 BOC2-Fmoc1 피크가 Fmoc1-인슐린 출발 물질 이후 대략 5분에서 용출되었다. 일단 수집한 후, 상기 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜 순수한 BOC2(A1,B1)-Fmoc(B29)-인슐린 분말을 수득하였다. 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증하였고, 접합 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티칼, 미국 미주리주 세인트 루이스)으로 결정하였다.
c. NH 2 -(B29)- BOC2 (A1,B1)-인슐린
이전 단계에 따라 수득된 동결건조된 분말을 디메틸포름아미드 (DMF) 중 20% 피페리딘에 30분 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 BOC2(A1,B1)-Fmoc(B29)의 Fmoc 보호기를 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 Fmoc, DMF, 및 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. NH2-(B29)-BOC2(A1,B1)-인슐린을 필요한 경우에는 분말로 동결건조시키거나, 원한다면 수용액 중에 바로 사용하였다.
실시예 17 - NH 2 -B29- BOC2 (A1,B1)-인슐린 접합체의 합성
실시예 16의 NH2-B29-BOC2(A1,B1)-인슐린 대신에 실시예 8의 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 사용하여 이전 실시예에 기재된 모든 다가-리간드-약물 접합체를 제조할 수 있었다. 모든 생성된 접합체는 동일한 MW 및 동일한 정도의 치환 특징을 갖지만, 인슐린 분자에 대한 접합 부위는 엡실론 B29 아미노 기에 존재하며 N-말단 Phe-B1이 아니다. 이것은 N-말단 서열분석으로 확인할 수 있었다.
실시예 18 - 유기 용매 중 다가 활성화된 에스테르를 갖는 아민- 관능화된 약물 접합 (약물이 나중에 첨가됨)
본 실시예는 약물이 리간드(들)보다 먼저 프레임워크에 첨가되는 실시예 11 기재 방법에 대한 대안책을 기재한다. 본 실시예에서는 리간드(들)이 약물보다 먼저 프레임워크에 첨가되었다.
N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 무수 DMSO 1 mL 중에 60 mM로 용해한 후에 400 ㎕ (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 상기 용액을 신속하게 10분 동안 실온에서 교반하였다. 이와 대등하게, 122 mM 리간드 용액을 적절한 부피의 무수 DMSO 중에서 제조하였다. 일단 용해한 후, 충분한 리간드 용액을 10분의 기간에 걸쳐 적가하여 프레임워크상의 활성화된 에스테르 기의 수인 N에서 1을 감한 값에 정확하게 해당되는 수의 반응성 당량을 제공하였다. 예를 들어, 프레임워크상에 N = 3의 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (1×(3-1)×60 mM/122 mM) = 0.98 mL의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크상에 N = 4의 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (1×(4-1)×60 mM/122 mM) = 1.5 mL의 리간드 용액을 첨가하는 식이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 상기 용액을 2시간 더 실온에서 교반하였다.
이어서, 아민-보유 약물을 무수 DMSO 7.5 mL 중에 8.1 mM의 농도로 별도로 용해하였다. 일단 용해한 후, 전체 약물 용액을 1분의 기간에 걸쳐 프레임워크/DMSO/리간드/TEA 용액에 첨가한 후에 2시간 더 실온에서 혼합하여 반응이 완료되게 하였다.
이어서, 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액에 10배 과다희석한 후에 묽은 HCl을 사용하여 최종 pH 8.0이 될 때까지 pH를 조정하였다. 상기 수용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 우선 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성하였다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 10 mL가 되도록 농축시켰다. 이 용액을 워터스 심메트리프렙 C18, 7 ㎛ 컬럼, 19×150 mm에서의 정제용 역상 HPLC로 추가로 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 정제 전에, 상기 컬럼을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 80% A/20% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 2분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 5분에 걸쳐 80% A/20% B → 75% A/25% B의 선형 구배를 사용한 다음에 이후 22분에 걸쳐 75% A/25% B → 62% A/38% B의 더 느린 선형 구배를 사용하였다. 원하는 피크의 체류 시간은 사용된 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집한 후, 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜서 순수한 접합체를 수득하였고, 이것의 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증할 수 있었다.
실시예 19 - 미보호 인슐린으로부터 유기 용매 중에서 제조된, 다가 사카라이드를 갖는 B29-인슐린 접합체
본 실시예는 미보호 인슐린에서는 Lys-B29 엡실론-아미노 잔기가 가장 반응성인 아민이고 그 다음은 A1이며 그 다음은 B1이라는 사실을 이용하였다. 따라서, 미보호 인슐린이 아민-함유 약물로 사용되는 경우에는 생성된 접합체가 Lys-B29 위치에서 우세하게 치환되어 있다. 실시예 18에 기재된 방법 및 아민-함유 약물로서의 재조합 인간 인슐린 (MW = 5808 Da, 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여, 하기하는 인슐린 접합체를 몰레큘라 바이오사이언시즈 (미국 콜로라도주 보울더)로부터 구입한 TSAT-C6 활성화된 에스테르 프레임워크를 사용하여 제조하였다. AEM 및 AETM은 앞서 기재된 바와 같이 합성하였다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kDa이었다.
Figure 112014006288597-pat00101
N-말단 서열분석에 따르면, 대략 85%의 AEM-함유 프레임워크가 Lys-B29를 통해 인슐린에 접합되고, 대략 87%의 AETM-함유 프레임워크가 Lys-B29를 통해 인슐린에 접합되었다.
실시예 20 - 수성 용매 중 다가 활성화된 에스테르를 갖는 아민- 관능화된 약물 접합 (약물이 나중에 첨가됨)
본 실시예는 실시예 18 기재 방법에 대한 대안책을 기재하며, 반응이 유기 용매 대신에 수성 용매 중에서 수행되었다.
N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 무수 DMSO 6.25 mL 중에 60 mM로 용해한 후에 2 mL (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 상기 용액을 신속하게 10분 동안 실온에서 교반하였다. 이와 대등하게, 448 mM 리간드 용액을 적절한 부피의 무수 DMSO 중에서 제조하였다. 일단 용해한 후, 충분한 리간드 용액을 10분의 기간에 걸쳐 적가하여 프레임워크상의 활성화된 에스테르 기의 수인 N에서 1을 감한 값의 1.5배에 해당하는 수의 반응성 당량을 제공하였다. 예를 들어, 프레임워크상에 N = 3의 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (1.5×(3-1)×60 mM/448 mM)×6.25 mL = 2.5 mL의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크상에 N = 4의 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (1.5×(4-1)×60 mM/448 mM)×6.25 mL = 3.8 mL의 리간드 용액을 첨가하는 식이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 상기 용액을 1시간 동안 실온에서 교반하였다.
이어서, 아민-보유 약물을 0.1 M, pH 11 탄산나트륨 완충제 2.67 mL 중에 17.2 mM로 별도로 용해한 후에 pH를 1.0 N 수산화나트륨으로 10.8이 되도록 조정하였다. 일단 용해한 후, 전체 프레임워크/DMSO/리간드/TEA 용액을 75분의 기간에 걸쳐 약물/카르보네이트 완충 용액에 적가하였다. 적가하는 동안, 생성된 혼합물의 pH를 필요한 경우에는 묽은 HCl 또는 NaOH를 사용하여 5분 마다 10.8로 조정하였다. 적가 후에 상기 용액을 15분 더 교반하여 반응이 완료되도록 하였다.
이어서, 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액에 10배 과다희석한 후에 묽은 HCl을 사용하여 최종 pH 8.0이 될 때까지 pH를 조정하였다. 상기 수용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 우선 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성하였다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 40 mL가 되도록 농축시켰다. 이 용액을 워터스 심메트리프렙 C18, 7 ㎛, 19×150 mm 컬럼에서의 정제용 역상 HPLC로 추가로 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 정제 전에, 상기 컬럼을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 80% A/20% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 2분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 5분에 걸쳐 80% A/20% B → 75% A/25% B의 선형 구배를 사용한 다음에 이후 22분에 걸쳐 75% A/25% B → 62% A/38% B의 더 느린 선형 구배를 사용하였다. 원하는 피크의 체류 시간은 사용된 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집한 후, 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜서 순수한 접합체를 수득하였고, 이것의 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증할 수 있었다.
실시예 21 - 미보호 인슐린으로부터 수성 용매 중에서 합성된 B29- AEM -2-인슐린 접합체
본 실시예는 미보호 인슐린에서는 Lys-B29 엡실론-아미노 잔기가 가장 반응성인 아민이고 그 다음은 A1이며 그 다음은 B1이라는 사실을 이용하였다. 따라서, 미보호 인슐린이 아민-함유 약물로 사용되는 경우에는 생성된 접합체가 Lys-B29 위치에서 우세하게 치환되어 있다. 실시예 20에 기재된 방법 및 아민-함유 약물로서의 재조합 인간 인슐린 (MW = 5808, 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여, AEM-2 인슐린 접합체를 몰레큘라 바이오사이언시즈 (미국 콜로라도주 보울더)로부터 구입한 TSAT-C6 활성화된 에스테르 프레임워크를 사용하여 제조하였다. 인슐린 유사체로서 사용된 AEM은 앞서 기재된 바와 같이 합성하였다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다. 최종 생성물 (HPLC에 따르면 95% 순수함)은 6729 g/mol (LC-MS)의 원하는 MW를 갖는 것으로 확인되었고, 이는 인슐린 1개 당 총 2.0개의 AEM 분자가 접합되었음을 나타내고, 85% 초과의 접합체 분자가 Lys-B29 부위에서 접합되었다 (N-말단 서열분석).
실시예 22 - 알데히드-함유 프레임워크를 갖는 일반화된 아민- 관능화된 약물 접합
a. 1개 초과의 리간드 및 1개의 말단 알데히드로 관능화된 프레임워크
우선, N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 무수 DMSO 27.0 mL 중에 60 mM로 용해한 후에 800 ㎕ (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 상기 용액을 신속하게 10분 동안 실온에서 교반하였다. 아민-보유 디에틸 아세탈의 원액은 무수 DMSO 5 mL 중에 580 mM로 제조되었다. 일단 용해한 후, 디에틸 아세탈 용액 2.9 mL를 프레임워크/DMSO/TEA 용액에 5분의 기간에 걸쳐 적가한 후에 실온에서 15분 더 혼합하였다. 이어서, 나머지 활성화된 에스테르를 다음과 같은 방식으로 아민-관능화 리간드와 반응시켰다. 370 mM 리간드 용액을 적절한 부피의 무수 DMSO 중에 제조하였다. 일단 용해한 후, 충분한 리간드 용액을 첨가하여 초기 활성화된 에스테르 기의 수인 N에서 1을 감한 값의 1.5배에 해당하는 수의 반응성 당량을 제공하였다. 예를 들어, 프레임워크 1개 당 N = 3의 초기 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (1.5×(3-1)×60 mM×27/370 mM) = 13 mL의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 1개 당 N = 4의 초기 활성화된 에스테르 기가 존재한다면 (1.5×(4-1)×60 mM×27/370 mM) = 20 mL의 리간드 용액을 첨가하는 식이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 상기 용액을 1시간 45분 더 실온에서 교반하여 반응이 완료되게 하였다. 반응 후, 전체 용액을 디에틸 에테르로 10배 희석하여 격렬하게 혼합하고 원심분리하여 원하는 물질을 함유하는 농후한 바닥의 상을 상등액으로부터 분리하였다. 상등액을 버린 후에 동일 부피의 에탄올을 첨가하여 고체 침전 덩어리를 생성시켰다. 원심분리하고 상등액을 버린 후, 상기 물질을 에탄올 및 에테르로 철저하게 세척한 후에 진공하에 건조시켜서 여러개의 리간드 및 디에틸 아세탈 기를 함유하는 조 프레임워크를 수득하였다.
b. 아민- 관능화된 약물과 말단 알데히드의 접합
일단 건조시킨 후, 상기 수집된 물질을 탈이온수 60 mL 중에 용해하면서 용액의 pH를 1.0으로 조정하여 디에틸 아세탈로부터 알데히드 기를 생성시켰다. 상기 용액을 30분 동안 혼합한 후에 1.5 M NaCl을 함유하는 200 mM HEPES pH 8.2 완충제 6 mL를 첨가하고, 묽은 NaOH 용액을 사용하여 상기 용액의 pH를 6.5로 조정하였다. 48 mmol의 아민 함유 약물을 상기 용액에 첨가하고, 필요한 경우에는 pH를 6.5로 재조정하였다. 별도로, 시아노수소화붕소나트륨 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스) 1.5 g을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM HEPES pH 7.0 완충제 15 mL 중에 용해하고 묽은 HCl 용액을 사용하여 pH를 6.5로 조심스럽게 조정하여 환원제의 원액을 제조하였다. 시아노보로수소화물 원액 13 mL를 약물/프레임워크/알데히드 용액에 첨가하고, 밤새 실온에서 반응시켰다.
생성된 수용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 우선 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성하였다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 10 mL가 되도록 농축시켰다. 이 용액을 워터스 심메트리프렙 C18, 7 ㎛ 컬럼, 19×150 mm에서의 정제용 역상 HPLC로 추가로 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 정제 전에, 상기 컬럼을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 80% A/20% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 2분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 5분에 걸쳐 80% A/20% B → 75% A/25% B의 선형 구배를 사용한 다음에 이후 22분에 걸쳐 75% A/25% B → 62% A/38% B의 더 느린 선형 구배를 사용하였다. 원하는 피크의 체류 시간은 사용된 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집한 후, 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜서 순수한 접합체를 수득하였고, 이것의 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증할 수 있었다.
실시예 23 - 말단 반응성 알데히드 기를 함유하는 AEM -2- 프레임워크 및 이후 B1에서의 인슐린 접합
a. 2개의 AEM 및 1개의 아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 ( ABDA )로 관능화된 TSAT
이 물질은 다가 활성화된 에스테르 프레임워크로서 TSAT (몰레큘라 바이오사이언시즈, 미국 콜로라도주 보울더)를 사용하고 아민-보유 디에틸 아세탈로서 4-아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 실시예 22a에 기재된 방법에 따라 합성하였다. 앞서 기재된 바와 같이 합성된 AEM (MW = 223 g/mol)은 리간드로서 사용되었다.
b. TSAT - AEM -2- ABDA 와 NH 2 -B1- BOC2 (A1,B29)-인슐린의 접합
이 물질은 실시예 22b에 기재된 방법 및 상기 (a)에서 제조된 TSAT-AEM-2-ABDA 및 실시예 8에 따라 합성된 아민-보유 약물, NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 사용하여 합성되었다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였다. BOC 보호기는 상기 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 원하는 수준으로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다.
최종 생성물 (HPLC에 따르면 95% 순수함)은 6462 g/mol (LC-MS)의 원하는 MW를 갖는 것으로 확인되었고, 이는 인슐린 1개 당 총 2.0개의 AEM 분자가 접합되었음을 나타내고, 이것의 99%는 Phe-B1 부위에서 접합되었다 (N-말단 서열분석).
실시예 24 - 말단 반응성 알데히드 기를 함유하는 AEM -3- 프레임워크 및 이후 B1에서의 인슐린 접합
a. 3개의 AEM 및 1개의 아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 ( ABDA )로 관능화된 TSPE
이 물질은 다가 활성화된 에스테르 프레임워크로서 TSPE (몰레큘라 바이오사이언시즈, 미국 콜로라도주 보울더)를 사용하고 아민-보유 디에틸 아세탈로서 4-아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 실시예 22a에 기재된 방법에 따라 합성하였다. 앞서 기재된 바와 같이 합성된 AEM (MW = 223 g/mol)은 리간드로서 사용되었다.
b. TSPE - AEM -3- ABDA 와 NH 2 -B1- BOC2 (A1,B29)-인슐린의 접합
이 물질은 실시예 22b에 기재된 방법 및 상기 (a)에서 제조된 TSPE-AEM-3-ABDA 및 실시예 8에 따라 합성된 아민-보유 약물, NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 사용하여 합성되었다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였다. BOC 보호기는 상기 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 원하는 수준으로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다.
최종 생성물 (HPLC에 따르면 95% 순수함)은 6897 g/mol (LC-MS)의 원하는 MW를 갖는 것으로 확인되었고, 이는 인슐린 1개 당 총 3.0개의 AEM 분자가 접합되었음을 나타내고, 이것의 99%는 Phe-B1 부위에서 접합되었다 (N-말단 서열분석).
실시예 25 - 말단 반응성 알데히드 기를 함유하는 AEM -3- 스캐폴드 및 이후 미보호 인슐린을 사용한 B1에서의 인슐린 접합
a. 3개의 AEM 및 1개의 아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 ( ABDA )로 관능화된 TSPE
이 물질은 다가 활성화된 에스테르 스캐폴드로서 TSPE (몰레큘라 바이오사이언시즈, 미국 콜로라도주 보울더)를 사용하고 아민-보유 디에틸 아세탈로서 4-아미노부티르알데히드 디에틸 아세탈 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 실시예 22a에 기재된 방법에 따라 합성하였다. 앞서 기재된 바와 같이 합성된 AEM (MW = 223 g/mol)은 리간드로서 사용되었다.
b. TSPE - AEM -3- ABDA 와 NH 2 -B1- BOC2 (A1,B29)-인슐린의 접합
이 물질은 실시예 22b에 기재된 방법 및 상기 (a)에서 제조된 TSPE-AEM-3-ABDA 및 아민-보유 약물, 미변형 인슐린 (MW = 5,808 g/mol, 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 합성되었다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다. 출발 미보호 인슐린 물질은 3개의 유리 아민 기를 보유하지만, Phe-B1 (pKa 약 6.8)이 pH 6.5에서 가장 반응성인 아민이라는 사실로 인해 Phe-B1이 상기 스캐폴드에 대한 인슐린 접합의 우세한 부위이다. 동결건조된 분말을 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 용해하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 원하는 수준으로 농축시키고 필요시까지 4℃에서 저장하였다.
최종 생성물 (HPLC에 따르면 95% 순수함)은 6897 g/mol (LC-MS)의 원하는 MW를 갖는 것으로 확인되었고, 이는 인슐린 1개 당 총 3.0개의 AEM 분자가 접합되었음을 나타내고, 이것의 >85%는 Phe-B1 부위에서 접합되었다 (N-말단 서열분석).
실시예 26 - 혼합 프레임워크 화학, 및 약물과 리간드의 상응하는 별도의 접합
숙신이미딜-3,5-디말레이미도페닐 벤조에이트 (SDMB)를 몰레큘라 바이오사이언시즈 (미국 콜로라도주 보울더)로부터 구입하고 추가의 정제 없이 하기 예에서 사용할 수 있다. SDMB를 무수 DMSO 1.0 mL 중에 60 mM로 용해한 후에 400 ㎕ (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 상기 용액을 신속하게 10분 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 아민-보유 약물을 무수 DMSO 7.5 mL 중에 8.1 mM의 농도로 별도로 용해하였다. 일단 용해한 후, 전체 SDMB 용액을 10분의 기간에 걸쳐 상기 DMSO-약물 용액에 적가한 후에 2시간 더 실온에서 혼합하여 반응이 완료되도록 하였다.
이어서, 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액에 10배 과다희석한 후에 묽은 HCl을 사용하여 최종 pH 8.0이 될 때까지 pH를 조정하였다. 상기 수용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 우선 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성하였다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 10 mL가 되도록 농축시켰다.
별도로, 6.0 mmol의 아민-함유 리간드를 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 8.2 HEPES 완충 염수 용액 중에 450 mM의 농도로 용해하였다. 이 용액에 6.6 mmol의 이미노티올란 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 첨가하고, pH 8.2에서 30분 동안 실온에서 반응되게 하여 아민-말단 기를 말단 술피드릴 기로 전환시켰다. 생성된 물질을 이전 단계에서 제조된 약물-프레임워크-디-말레이미드 접합체의 10 mL 용액과 혼합하였다. 말레이미드 기를 지시자-유사 술피드릴 기와 pH 8.2에서 2시간 동안 반응시켜 반응이 완료되도록 하였다. 이어서, 생성된 용액을 적절한 고체 상을 사용한 크기 배제로 정제하여 접합 물질 및 비접합 물질의 원하는 분리를 달성하였다. 이후, 컬럼 공극 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막으로 대략 10 mL가 되도록 농축시켰다.
마지막으로, 이 용액을 워터스 심메트리프렙 C18, 7 ㎛ 컬럼, 19×150 mm에서의 정제용 역상 HPLC를 사용하여 추가로 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1% TFA를 함유하는 탈이온수였고, 완충제 B는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 정제 전에, 상기 컬럼을 워터스 델트라프렙 600 시스템을 사용하여 80% A/20% B 이동 상으로 15 mL/분으로 평형화하였다. 조 용액 대략 5 mL를 상기 컬럼에 15 mL/분의 유속으로 2분의 기간에 걸쳐 주입한 후에 이후 5분에 걸쳐 80% A/20% B → 75% A/25% B의 선형 구배를 사용한 다음에 이후 22분에 걸쳐 75% A/25% B → 62% A/38% B의 더 느린 선형 구배를 사용하였다. 원하는 피크의 체류 시간은 사용된 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집한 후, 용액을 회전증발시켜서 아세토니트릴을 제거하고 동결건조시켜서 순수한 접합체를 수득하였고, 이것의 정체성은 LC-MS (에이치티 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 입증할 수 있었다.
실시예 27 - 혼합 프레임워크 화학을 이용하여 아미노에틸 사카라이드에 접합된 인슐린
실시예 26에 기재된 방법 및 실시예 8에 따라 합성된 아민-보유 약물, NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (MW = 6,008 g/mol)을 사용하여, 하기하는 특정 약물 접합체를 수득하였다. AEM (MW = 223 g/mol), AEBM (MW = 385 g/mol) 및 AETM (MW = 547 g/mol)은 앞서 기재된 바와 같이 합성하였고, 합성시의 리간드로 사용되었다. 적절한 크기의 크기 배제 매질은 바이오겔 P2 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)였고, 적절한 크기의 한외여과 막 분자량 컷오프는 3 kD이었다.
모든 경우에서, BOC 보호기는 실시예 26에 따라 수득된 동결건조된 분말을 90% TFA/10% 아니솔 중에 1시간 동안 4℃에서 용해한 후에 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에 10배 과다희석하여 제거하였다. NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.0 내지 8.0 사이로 조정한 후에 상기 물질을 바이오겔 P2 컬럼에 통과시켜서 아니솔, BOC 및 탈보호의 기타 저분자량 부산물, 및 또한 임의의 다른 오염시키는 염을 제거하였다. 이어서, 탈보호된 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)을 사용하여 대략 58 U의 인슐린/mL (A280 측정치를 기초로 함)로 농축시키고, 필요시까지 4℃에서 저장하였다. 출발 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 물질은 오직 Phe-B1 말단에만 1개의 유리 아민 기를 보유하기 때문에, Phe-B1이 프레임워크로의 유일한 인슐린 접합 부위였다. 이것은 각각의 탈보호된 최종 생성물에서 N-말단 서열분석으로 입증할 수 있었다.
Figure 112014006288597-pat00102
실시예 28 - 상보적 프레임워크와의 약물 접합을 위한 일반화된 클릭 화학
적어도 1개의 아미노 관능기 및 1개 이상의 말단 알킨 기를 함유하는 프레임워크 (8.3 mmol)를 THF (40 mL) 및 물 (40 mL) 중에 취하고, 상기 용액을 교반하였다. 아지도에틸 기-보유 약물 (10.51 mmol)을 첨가한 후에 황산구리 (500 mg, 2.0 mmol) 및 나트륨 아스코르베이트 (400 mg, 2.0 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 55℃ 내지 60℃ (오일조)에서 6시간 동안 교반하여 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하고 진공하에 절반 부피로 농축시켜서 마이크로-유리 필터를 통해 여과하였다. 여액을 수지 컬럼 (도웩스 50W 50x4-100)에 로딩하고, 중성이 될 때까지 물 (6×75 mL)로 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 15% 수산화암모늄 (10×75 mL)으로 용출시키고, 닌히드린에 양성인 분획들을 모아 유리질 발포체로 농축시켰다.
실시예 29 - 다른 종, 예컨대 소 및 돼지의 천연 인슐린을 사용하여 제조된 접합체
적어도 1개의 반응성 아민 관능기를 함유하는 다른 종의 인슐린 (예를 들어, 소 및 돼지 인슐린)을 인간 인슐린 접합에 이용된 임의의 방법으로 커플링시킬 수 있었다. 당업자는 소 또는 돼지 인슐린으로부터 제조된 접합체의 분자량이 인간 인슐린으로부터 제조된 것과는 하기 표에 기재된 양만큼 차이가 있다는 것을 알 것이다.
Figure 112014006288597-pat00103
당업자는 또한 소 또는 돼지 인슐린으로부터 제조된 접합체가 인간 인슐린으로부터 제조된 접합체와는 이들 인슐린 사이의 구조에 있어서의 작은 차이로 인해 크로마토그래피 피크 체류 시간에 약간 차이가 있을 수 있음을 알 것이다.
실시예 30 - 인슐린 유사체, 예컨대 리스프로, 아스파르트 , 글루리신 , 글라진 및 데테미르를 사용하여 제조된 접합체
적어도 1개의 반응성 아민 관능기를 함유하는 모든 공지의 인슐린 유사체 (예를 들어, 리스프로, 아스파르트, 글루리신, 글라진 및 데테미르)를 인간 인슐린 접합에 이용된 임의의 방법으로 커플링시킬 수 있었다. 당업자는 인슐린 유사체로부터 제조된 접합체의 분자량이 인간 인슐린으로부터 제조된 것과는 하기 표에 기재된 양만큼 차이가 있다는 것을 알 것이다.
Figure 112014006288597-pat00104
당업자는 또한 인슐린 유사체로부터 제조된 접합체가 인간 인슐린으로부터 제조된 접합체와는 이들 인슐린 사이의 구조에 있어서의 작은 차이로 인해 크로마토그래피 피크 체류 시간에 약간 차이가 있을 수 있음을 알 것이다.
인슐린 글루리신 (B29 리신은 함유하지 않지만 대신에 B3 리신을 함유함)의 사용은 미보호 인슐린 글루리신 사용시에 B3 접합체를 우세하게 제공할 것이다. 그러나, B1-인슐린 글루리신 접합체를 원하는 경우에는 실시예 8에 기재된 바와 같이 BOC-(A1,B29)-인간 인슐린과 동일한 프로토콜을 이용하여 BOC-(A1,B3)-인슐린 글루리신을 먼저 합성한다.
실시예 31 - 펩티드성 인슐린 분비촉진제 접합체와 함께 제조된 접합체
인슐린을 접합시키는데 사용되는 임의의 방법을 이용하여 N-말단 아민 관능기를 함유하는 펩티드성 인슐린 분비촉진제 (예를 들어, 비제한적으로 GLP-1 또는 GLP-1 유사체 엑세나티드)를 커플링시킬 수 있다.
II . 예시적인 접합체의 시험관내 검정
본 제2 세트의 실시예는 몇몇 예시적인 접합체의 시험관내 특성을 조사하는 다양한 실험을 기재한다.
실시예 32 - 인슐린-글리코겐 접합체의 합성
본 비교 실시예는 미국 특허 출원 공개공보 번호 20070099820에 따른 인슐린-글리코겐 접합체의 합성에 대해 기재한다. 간략하게, 시판하는 비정제된 굴 글리코겐 (유형 II, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스 소재) 1 g을 탈이온 수에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 생성된 용액에 고체 CNBr을 CNBr 대 글리코겐 질량비 0.68로 첨가하고, 3 N 수산화나트륨 (NaOH) 용액을 이용하여 pH를 10.7 +/- 0.2로 일정하게 유지시켰다. 15 분 동안 교반한 후, 또 다른 동일한 질량의 동일한 고체 CNBr을 첨가하고, pH를 10.7 +/- 0.2로 일정하게 유지시키면서 45 분 동안 교반하였다. 이어서, 용액에 인슐린을 인슐린 대 글리코겐 질량비 0.60으로 첨가하고, 고체 중탄산나트륨을 이용하여 pH를 9.15로 조정하였다. 용액을 밤새 교반하고, 50 kDa MWCO 폴리에테르술폰 디스크 막 필터 (밀리포어(Millipore), 메사추세츠주 베드포드 소재)를 이용하여 탈이온수에 대해 철저하게 한외여과하고, 동결건조시켰다. 이어서, 슈퍼덱스(Superdex)™ 30 하이로드(HiLoad) 16/60 (아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 충전 칼럼 상에서 1 M 아세트산 이동상을 이용하는 겔 여과 HPLC (워터스(Waters), 메사추세츠주 밀리포드 소재)에 의해 생성된 분말을 비접합된 인슐린으로부터 정제하였다. 이어서, 인슐린 글리코겐 분획을 동결건조시켜 접합체를 순수한 백색 분말로서 수득하였다. 생성된 정제 물질은 아미노산 분석 (UCLA 바이오폴리머스 래보러토리(UCLA Biopolymers Laboratory), 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)을 이용하여 측정했을때 인슐린-글리코겐 접합체 당 인슐린을 1.0 중량％ 함유하였다.
실시예 33 - 액체 크로마토그래피 분석
본 실시예는 실시예 32에 따라 합성된 인슐린-글리코겐 및 본 발명에 따라 합성된 예시적인 접합체의 RP-HPLC 프로파일 사이의 차이를 기재한다. 실시예 32에 따라 합성된 인슐린-글리코겐의 5 mg/ml 용액 100 ㎕ 및 예시적인 접합체의 1 mg/ml 용액 100 ㎕를 별도로 워터스 시메트리(Waters Symmetry) C8 5 ㎛ 칼럼 (4.6 mm x 250 mm)에 주입하고, 80％ 물/20％ 아세토니트릴 (CH3CN) 이동상 (각각 0.1％ TFA 함유)으로 평형화하였다. 본 연구에서 사용된 예시적인 접합체는 프레임워크로서 TSAT-C6, 리간드로서 AEM, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 이용하여 합성하였다.
하기 구배 방법을 이용하여 샘플을 1.0 ml/분으로 용리시켰다: 0-5 분 - 일정한 80％ 물/20％ CH3CN, 5-35 분 - 50％ 물/50％ CH3CN으로 선형 구배. 도 1의 용리 프로파일은 예시적인 접합체의 경우 단일의 화학적으로 특유한 종을 나타내는 단일 스파이크를 나타내었는데, 이는 인슐린-글리코겐 접합체의 경우의 다양한 화학 및/또는 분자량 독립체의 광범위한 분포를 나타내는 광범위하고 이질적인 용리 프로파일과 비교된다.
실시예 34 - 분자량 분포 분석
본 실시예는 실시예 32에 따라 합성된 인슐린-글리코겐 및 동일한 예시적인 접합체 사이의 MW 및 MW 분포에 있어서의 차이를 기재한다. 인슐린-글리코겐 접합체의 MW 및 MW 분포는 pH 7 HEPES 완충 염수 중의 25 mg/ml 용액 1 ml를 HEPES 완충 염수에 의해 평형화된 울드라히드로겔(Ultrahydrogel) 크기 배제 칼럼 (워터스 코포레이션, 메사추세츠주 밀리포드 소재)에 주입하여 결정하였다. 칼럼을 30 분 동안 분당 0.5 ml로 용리하고, 280 nm에서의 흡수로서 용리 프로파일을 측정하였다. 동일한 프로토콜을 이용한 별개의 실험에서, 덱스트란 MW 표준물질 1000, 5000, 12000, 25000, 50000, 80000, 150000, 270000, 및 410000 g/mol (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 주입하여 MW 대 체류 시간의 검량선을 확립하였다. 검량선 및 인슐린-글리코겐 접합체의 용리 프로파일에 기초하여, 평균 MW가 500,000 g/mol인 것으로 결정되었다 (분포의 67％가 250,000 내지 1,000,000 g/mol로 넓은 범위에 걸쳐 용리됨) (데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, 예시적인 접합체는 LC/MS (HT 래보러토리즈(HT Laboratories), 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 결정된 바와 같이 정확하게 6,730 g/mol의 단일 MW 만을 갖는 것으로 결정되었다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 35 - 접합체의 화학적 및 물리적 안정성
본 실시예에서는 문헌 [Hinds et al., (Bioconj. Chem. 11: 195-201, 2000)]에 기재된 방법에 따른 가속 조건하에서 37℃ 및 150 스트로크/분의 기계적 교반 속도에서의 예시적 접합체의 안정성을 비접합된 인슐린의 안정성과 비교한다. 제약 등급의 재조합 인간 인슐린 (RHI)을 가속 안정성 연구를 위한 대조군으로서 선택하였다. 문헌 [Holcombe et al., (Diabetes Care 27:1241-1242, 2004)]에는 비가속 조건하에서 RHI 안정성이 실온 (RT)에서 적어도 30 일 동안 유지되며, 냉장보관할 경우 상당히 더 길게 유지되는 것으로 기재되어 있다. 도 2는 pH 7.4 인산염 완충 염수 (PBS) 중에서 50 U/ml의 RHI 및 2 종의 예시적인 접합체에 대한 응집 안정성 검정의 결과를 보여준다. 모든 사례에서, 용액 중의 잔류 ％는 용액을 주어진 시점에서 원심분리하고 (4500 x g, 5 분), 상청액의 A280을 측정하고, 상청액의 A280을 본래 출발 용액의 A280으로 나누어 결정하였다. 접합체 I-1 (도 45 참조)은 프레임워크로서 TSAT-C6, 리간드로서 AEM, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 이용하여 합성하였다. 접합체 I-16 (도 45 참조)은 프레임워크로서 TSPE, 리간드로서 AEM, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 이용하여 합성하였다.
37℃에서 계속해서 48 시간 교반한 후에, 6％ 미만의 RHI가 용액 중에 안정하게 잔류하였고, 대부분의 RHI가 불용성 응집체로서 침전되었다. 동일한 시간이 지난 후에, 접합체는 96％- 99％가 PBS 용액 중에서 무손상 및 가용성 상태로 잔류하여, 접합체는 둘 모두 실질적으로 더 안정하게 잔류하였다. 최종적으로 데이터는 접합체가 이러한 조건하에서 RHI 보다 현저하게 더 안정함을 보여주었다.
접합체의 화학적 안정성을 평가하기 위해 RP-HPLC를 사용하였다 (도 3a 참조). 가속 안정성 48 시간 후에, 접합체 용액을 물-아세토니트릴 용리 구배를 이용한 C8-역상 칼럼에 의해 분석하였다. 전- 및 후-안정성 접합체 샘플의 체류 시간을 생성된 LC 흔적에서 발견된 비접합된 (유리) 인슐린 및 데스아미도 인슐린의 백분율과 함께 나타내었다. 유리 인슐린 또는 데스아미도는 어떤 검출가능한 양도 관찰되지 않았는데, 이는 (i) 사카라이드 및 인슐린 분자 사이의 공유적 연결이 안정하며, (ii) 가속 안정성 시험 (AST) 동안 어떤 현저한 접합체의 화학적 분해도 발생하지 않음을 나타낸다. AST 이전 및 AST와 병행하여, 접합체에 대해 또한 매일 4℃ 내지 RT 사이의 열 주기를 포함하는 90일 비-가속 안정성 시험을 수행하였다. 병행 연구의 마지막에서, RP-HPLC는 접합체가 여전히 화학적으로 및 물리적으로 안정함을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
HEPES 완충제 중에서의 접합체 화학적 안정성의 추가의 확인은 접합체를 AST 하기 전 및 후에 수득한 LC-MS 데이터로부터 제공되었다. 흥미롭게도, PBS 중의 48 시간 AST 접합체 샘플은 실질적인 분해가 일어났음을 나타낸 반면, HEPES 완충제 중의 48 시간 AST 접합체 샘플은 완전하게 무손상되었고 안정하였다 (도 3b 참조). HEPES 중에서 보관한 접합체 I-7은 AST 전후의 MW가 6730 Da이었는데, 이는 둘 모두의 만노스 잔기, 접합체 프레임워크, 및 인슐린이 모두 화학적으로 변화되지 않았고 매우 안정함을 나타낸다. 접합체 안정성을 보장하기 위해, 보관, 시험관내 시험, 및 생체내 시험에 사용된 모든 완충제는 완충제로서 HEPES를 함유하였다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 HEPES 완충제 중에 본 발명의 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
LC-MS 시험은 접합체의 화학적 동일성 검정으로서 쉽게 작용할 수 있기 때문에, LC-MS 데이터는 FDA 제조 규정 준수를 매우 향상시킨다. 약물 (예를 들어, 인슐린), 접합체 프레임워크, 및 접합체 모두는 별개의 분자량을 갖기 때문에, 생성되는 리간드 비는 접합체 MW로부터 접합체 프레임워크 MW를 빼서 사카라이드 기로 인한 잔여 질량을 수득함으로써 쉽게 계산할 수 있다. 접합체 I-7의 경우, 만노스:인슐린 몰비는 정확하게 2.0으로 계산되었다.
실시예 36 - 접합체의 기능적 안정성
접합체가 화학적 및 물리적으로 안정함을 입증한 후, 72 시간 AST 접합체를 새로운 접합체에 대한 그의 생체내 피하 생물활성에 대해 스프라그-돌리 래트를 이용하여 5 U/kg으로 평가하였다 (도 4 참조).
72 시간 HEPES AST 접합체 데이터의 분석 결과 글루코스 최하점에 이르는 시간 (Tnadir)은 60 분이었고, 공복 혈당값의 70％로 회복되는 시간 (T7O ％ BG)은 128 ± 15 분 미만인 것으로 나타났다. 새로운 접합체 대 72 시간 AST 접합체 생물활성 곡선을 스튜던트 t-검정을 이용하여 각 시점에서 비교한 것은 (각 그룹당 n=4) 현저한 차이를 보이지 않았다 (모든 p 값 > 0.21). 이러한 결과는 제제에 대해 명시된 표적 내에 있으며, 이는 보존된 접합체 화학적 안정성이 보존된 생체내 기능적 성능으로 옮겨갔음을 나타낸다.
III . 예시적인 접합체의 생체내 검정
본 제3 세트의 실시예는 몇몇 예시적인 접합체의 생체내 특성을 조사하는 다양한 실험을 기재한다.
실시예 37 - RHI 및 덱스트란 또는 글리코겐 접합체 대 접합체 생물활성
(a) 인슐린- 덱스트란 생물활성
본 비교 실시예에서는 피하 투여된 인슐린-덱스트란 (시그마-알드리치, MW 약 70K)의 생체내 약력학 프로파일을 평가하였다. 이하에 관찰되는 바와 같이, 미국 특허 공개공보 번호 20040202719에 따라 합성한 인슐린-덱스트란 접합체는 피하 주사 이후에 비교적 천천히 작용하였는데, 이는 접합체 중합체의 높은 MW가 체순환으로의 흡수 속도를 현저하게 방해하기 때문이다. 인슐린-덱스트란은 변형된 시아노겐 브로마이드 (CNBr) 커플링 반응을 이용하여 합성하였다. 간략하게, 500 mg의 덱스트란 (MW = 7OK, 시그마-알드리치)을 탈이온수 50 ml에 용해시켰다. 56 mg의 고체 CNBr을 생성된 용액에 첨가하고, 5 N NaOH 용액을 이용하여 pH를 10.7 ± 0.2로 유지시켰다. 15 분 동안 교반한 후에, 또 다른 56 mg의 고체 CNBr을 첨가하고, pH를 10.7 ± 0.2로 유지시키면서 45 분 동안 교반하였다. 이어서 300 mg의 재조합 인간 인슐린 (RHI)을 용액에 첨가하고, 고체 중탄산나트륨을 이용하여 pH를 9.15로 조정하였다. 용액을 밤새 교반하고, 10 K MWCO 폴리에테르술폰 디스크 막 필터 (밀리포어, 메사추세츠주 베드포드 소재)를 이용하여 탈이온수에 대해 철저하게 한외여과하고, 동결건조시켰다. 이어서, 슈퍼덱스™ 75 충전 칼럼 (아머샴 바이오사이언시스, 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 1 M 아세트산 이동상을 이용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (워터스, 메사추세츠주 밀리포드 소재)에 의해 생성된 분말을 비접합된 인슐린으로부터 정제하였다. 이어서, 인슐린-덱스트란 분획을 동결건조시켜 접합체를 순수한 백색 분말로서 수득하였다. 인슐린 접합의 정도는 아미노산 분석 (UCLA 바이오폴리머스 래보러토리, 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)을 이용하여 측정했을때 10％ (w/w)였다.
인슐린-덱스트란의 피하 주사는 멸균된 1x PBS 용액을 0.25 ml (20 U 당량 인슐린/ml) 이용하여 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 200-250 g, n = 4)의 목 뒷쪽에 투여하였다. 혈액 샘플은 -15 및 0 분, 및 주사 후 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300 및 360 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라(Precision Xtra), 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 도 5에 관찰되는 바와 같이, 글루코스 최하 농도에 이르는 시간 (Tnadir)은 주사 후 약 3 시간인 것으로 확인되었고, 혈청 글루코스 수준은 주사 후 적어도 5 시간 동안 저하된 상태로 유지되었다.
(b) 인슐린-글리코겐 생물활성
본 실시예에서는 피하 투여된 인슐린-글리코겐의 생체내 약력학 프로파일을 평가하였다. 인슐린-글리코겐 접합체는 실시예 32에 따라 합성하였다. 인슐린-글리코겐 접합체의 생물활성은 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 200-250 g, n = 4)의 목 뒷쪽에 2.5 당량 U의 인슐린/kg 용량을 주사하여 평가하였다. 혈액 샘플은 -15 및 0 분, 및 주사 후 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300 및 360 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 상기의 인슐린-덱스트란 접합체와 비교하여, 높은 MW의 인슐린-글리코겐 접합체는 글루코스 수준을 훨씬 신속하고 더 큰 정도로 강하시켰다 (도 6 참조). 이러한 신속한 작용 및 제거 프로파일은 피하 주사 이후에 높은 MW의 글리코겐 중합체 사슬의 신속한 효소적 소화로 인한 것이다.
(c) 예시적 접합체 및 RHI 생물활성
본 실시예에서는 피하 투여된 예시적인 접합체 및 재조합 인간 인슐린 (RHI)의 생체내 약력학 프로파일을 평가하고 비교하였다. 도 45의 예시적인 접합체, I-1은 스캐폴드로서 TSAT-C6, 지표 유사체로서 AEM, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 이용하여 합성하였다. 각 사례에서, 접합체 또는 RHI는 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 6)의 목 뒷쪽에 3.5 U/kg으로 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 주사 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 도 7에 관찰되는 바와 같이, RHI 및 예시적인 접합체의 글루코스 저하 프로파일은 예시적인 접합체가 생체내에서 효소적으로 소화될 수 없음에도 불구하고 거의 동일하였다. 접합체의 신속한 작용 및 제거 프로파일은 아마도, 접합체가 RHI에 비해 단지 14％ 클 뿐이어서 약력학 특성 면에서 증가된 MW의 임의의 효과를 거의 무시할 수 있다는 사실에 의한 것이다.
실시예 38 - RHI 와의 PK 비교
본 실시예는 피하 투여한 예시적인 접합체 및 재조합 인간 인슐린 (RHI)에 대해 수득한 혈청 인슐린 프로파일을 기재하고 비교한다. 도 45의 예시적인 접합체, I-1은 프레임워크로서 TSAT-C6, 리간드로서 AEM, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 사용하여 합성하였다. 각각의 사례에서, 접합체 또는 RHI를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 6)의 목 뒷쪽에 3.5 U/kg으로 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 주사 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서, 시판하는 ELISA 키트 (휴먼 인슐린 ELISA, 메르코디아(Mercodia), 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 접합체에 대한 약동학 프로파일은 RHI의 그것과 통계적으로 구별되지 않았는데, 이는 이러한 접합체가 피하 주사 이후에 신속하게 흡수되고 혈청으로부터 제거됨을 나타낸다.
실시예 39 - AEM -2- TSAT - C6 -인슐린 접합체의 B29-치환된 버전의 PK 및 생물활성
본 실시예는 피하 투여한 예시적 접합체에 대해 수득한 혈청 인슐린 및 혈당 저하 프로파일을 기재한다. 도 45의 예시적 접합체, I-7은 프레임워크로서 TSAT-C6, 리간드로서 AEM, 및 약물로서 재조합 인간 인슐린을 이용하여 합성하였다 (실시예 37 및 38에서와 같은 B1-치환된 접합체 대신 B29-치환된 접합체를 생성하기 위한 것임). 이 사례에서, 접합체를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 3)의 목 뒷쪽에 5 U/kg으로 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 주사 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (휴먼 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, B29-치환된 접합체에 대한 약동학 프로파일은 RHI 뿐만 아니라 실시예 38의 B1-치환된 접합체의 그것과 통계적으로 구별되지 않았는데, 이는 이러한 접합체도 또한 피하 주사 이후에 신속하게 흡수되고 혈청으로부터 제거됨을 나타낸다.
실시예 40 - 리스프로와의 PK 및 생물활성 비교
본 실시예에서는 피하 투여한 예시적 접합체 및 인슐린 리스프로에 대해 수득한 혈청 인슐린 및 혈당 프로파일을 비교한다. 인슐린 리스프로 (휴마로그(HUMALOG)®)는 B 쇄의 C 말단 상의 끝에서 두번째의 리신 및 프롤린 잔기가 뒤바뀐 신속 작용 인슐린 유사체이다. 이러한 변형은 인슐린 다량체의 형성을 차단한다. 비교를 위해 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)으로부터의 데이터를 또한 제공한다 (실시예 38 및 도 8 참조).
도 45의 예시적인 접합체, I-1은 프레임워크로서 TSAT-C6, 리간드로서 AEM, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 이용하여 합성하였다. 각 사례에서, 접합체 또는 인슐린 리스프로를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 6)의 목 뒷쪽에 3.5 U/kg으로 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 주사 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (휴먼 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 접합체의 약동학 프로파일은 인슐린 리스프로의 그것과 통계적으로 구별되지 않았다.
실시예 41 - 생물활성에 대한 리간드의 효과
본 실시예에서는 일련의 피하 투여한 예시적인 접합체에 대해 수득한 혈당 프로파일을 비교한다. 예시적인 접합체는 프레임워크로서 TSAT-C6, 및 약물로서 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린을 이용하여 합성하였다. 리간드 조성은 접합체에 따라 다르게 하여, 다양한 친화성을 커버하였다: AEM-2, AEBM-2, AETM-1-AEBM-1 및 AETM-2 (가장 저 친화성으로부터 가장 고 친화성으로). 인슐린 접합체를 도 45에 I-1, I-2, I-3, 및 I-4로 나타낸다. 각 사례에서, 접합체를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 6)의 목 뒷쪽에 5 U/kg (AEM-2의 경우 3.5 U/kg)으로 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 주사 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (휴먼 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다.
도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 글루코스 강하 반응은 리간드의 친화성이 증가됨에 따라 감소되었다. 이러한 데이터는 리간드의 성질이 접합체의 생물활성에 영향을 미칠 수 있다는 첫번째 암시를 제공하였다. 도 14-16은 시험한 4종의 접합체 각각에 대한 혈당 수준을 혈청 인슐린 수준과 함께 보여준다. 이들 결과는 보다 고 친화성 리간드를 갖는 접합체에 대한 감소된 글루코스 반응이 접합체의 감소된 PK 프로파일로 인한 것임을 매우 분명하게 보여주었다 (AEM-2에 대한 도 14와 AETM-2에 대한 도 17을 비교).
실시예 42 - PK 및 생물활성에 대한 외인성 억제제의 효과
실시예 41에 기재된 데이터를 고려하여, 본 발명자들은 리간드를 보다 많이 가진 접합체에서 관찰되는 감소된 PK 프로파일 및 생물활성이 내인성 사카라이드 결합 분자에 보다 강력하게 결합하기 때문일 수 있다는 가설을 세웠다. 예를 들어, 임의의 특정 이론에 제한되기를 바라지 않으며, 본 발명자들은 내인성 "렉틴-유사" 단백질, 예컨대 계면활성제 단백질 A 및 D 또는 셀렉틴 패밀리의 구성원에 대한 결합이 이들 접합체를 보다 저 친화성 리간드를 갖는 접합체에 비해 보다 신속하게 소실되도록 할 수 있다는 가설을 세웠다.
이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 외인성 리간드가 이와 같이 제안되는 내인성 사카라이드 결합 분자에 결합하는 것과 경쟁하여, 투여 이후 접합체의 PK 프로파일을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위한 한 세트의 실험을 실시하였다. 고 친화성 AETM-2 접합체 I-2를 모든 실험에 사용하였다. 각 사례에서, 동일한 용량의 접합체를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 6)의 목 뒷쪽에 주사하였다. 15 분 지체한 후, 외인성 리간드 용량을 IP 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 처음 접합체를 주사한 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (휴먼 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 15 분 후에 외인성 리간드 대신 염수를 주사하여 대조군을 생성하였다.
도 18은 알파-메틸 만노스를 투여한 경우의 결과를 보여준다. 알파-메틸 만노스는 AETM과 렉틴, 예컨대 Con A에의 결합을 경쟁할 수 있는 매우 고 친화성의 사카라이드이다. 관찰되는 바와 같이, 알파-메틸 만노스의 주사로 인한 PK/PD 프로파일에서의 변화는 매우 현저하였다 (p<0.05).
도 19는 최초의 주사에 AETM-2 접합체 대신 가용성 재조합 인간 인슐린 (RHI)을 사용한 대조군 실험이다. 관찰되는 바와 같이, 알파-메틸 만노스를 주사한 경우에 PK/PD 프로파일에 있어서 어떤 변화도 없었다 (p≫0.05).
내인성 막-결합 렉틴 (MBL)은 다음과 같은 상대적 친화성으로 사카라이드에 결합하는 것으로 알려져 있다: D-만노스, L-푸코스 > D-글루코스, N-아세틸-D-글루코사민 ≫ D-갈락토스. 따라서 본 발명자들은 AETM-2 접합체의 PK/PD 프로파일에 대한 L-푸코스 (고 친화성 리간드), D-글루코스 (중간 친화성 리간드) 및 D-갈락토스 (저 친화성 리간드)의 효과를 비교하기 위해 2 가지의 실험을 실시하기로 결정하였다. L-푸코스에 의한 결과를 알파-메틸 만노스로 수득한 결과와 도 20에서 비교하였다. 관찰되는 바와 같이, 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스는 동일한 종류의 효과를 나타내는 것으로 보인다. D-글루코스 및 D-갈락토스에 의한 결과는 도 21에서 비교하였다. 갈락토스는 염수와 비교하여 어떤 효과도 나타내지 않았다. 글루코스는 작은 효과를 나타내는 것으로 보였지만; 접합체로부터의 외인성 인슐린이 글루코스를 신속하게 강하시킨다는 사실에 의해 혼동되었고, 알파-메틸 만노스 및 L-푸코스에서 관찰되었던 지속 효과는 일어나지 않았다.
실시예 43 - 국부 주사 부위에서의 외인성 억제제의 효과
실시예 42에 기재된 데이터를 고려하여, 본 발명자들은 알파-메틸 만노스 (a-MM)가 혈청 접합체 농도의 증가를 유도하고, 생물활성이 피하 주사 부위로부터 증가된 흡수 속도의 결과인지 여부를 결정하는 것에 착수하였다. 고 친화성 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2를 본 실험에 사용하였다. 먼저, 1 M a-MM을 함유하는 완충 염수 용액 또는 완충 염수 용액을 이용하여 접합체를 5 U/ml (0.2 mg/ml 인슐린 당량)의 농도로 희석시켰다. 각각의 용액을 세 마리의 비-당뇨, 수컷 SD 래트 각각의 목 뒷쪽에 5 U/kg의 용량으로 시간 0에 피하 주사하고, 0 분 및 주사 후 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 혈액 샘플을 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 본 실험에서, a-MM 접합체 용액을 수여한 래트에 또한 완충 염수 용액 주사를 별개의 후사분체 주사 부위에 15 분에 피하로 수여하였다. 염수 접합체 용액을 수여한 래트에는 또한 a-MM 용액 주사를 별개의 후사분체 주사 부위에 15 분에 피하로 수여하였다. 이러한 15 분 지체된 주사는 접합체 용액과 함께 피하 주사된 a-MM의 양이 a-MM의 전신 농도를 도 18에 나타낸 a-MM 유도된 효과의 유형을 야기하는데 충분히 높게 상승시키지 않도록 하기 위함이다.
도 22에 나타낸 결과는 실험 오차 내에서, 접합체 PK 및 생물활성 프로파일이 의도적으로 고 농도의 a-MM 억제제를 접합체와 함께 공동주사하는 것에 의해 전혀 향상되지 않음을 보여주었다. 이러한 결과는 흡수 프로파일을 주사 부위로부터 체순환으로 변화시키는 것에 의해 외인성 사카라이드가 접합체에 작용하지 않는다는 가설과 일치하였다.
실시예 44 - 처음 접합체를 주사한 후 외인성 억제제 주사를 지체한 효과
도 22의 결과에 기초하면, a-MM-향상된 PK 및 생물활성 결과가 증가된 주사 부위 흡수에 의해 설명될 수 없고, 오히려 접합체가 흡수된 후 일어나는 전신 효과의 결과이어야 한다. 다음의 2 가지 가설은 그러한 거동을 설명할 수 있다: (a) 접합체가 경쟁적 사카라이드에 의해 방해될 수 있는 렉틴 의존적 메카니즘을 통해 신체로부터 제거되거나 또는 (b) 접합체가 체내에서 렉틴에 결합하고, 경쟁적 사카라이드의 존재하에서만 순환으로 방출된다. (b)의 경우에, 누군가는 접합체가 피하 데포로부터 완전히 흡수된 후 동물에의 a-MM의 도입이 흡수된 접합체를 체내 렉틴 부위로부터 방출시켜 그의 혈청 농도 및 생물활성을 증가시킨다고 예상할 것이다. 그러나, 제거 메카니즘이 (a)에 기재된 바와 같이 작용할 경우, 접합체가 피하 데포로부터 완전히 흡수된 후에 a-MM을 주사하는 것은 혈청 농도 또는 생물활성에 있어서 임의의 증가를 야기하지 않을 것인데, 이는 접합체가 이미 신체에서 완전히 제거되었을 것이기 때문이다.
가능성 있는 메카니즘을 결정하기 위해, 고 친화성 TSAT-C6-AETM-2 접합체 I-2를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, 그룹 당 n = 3)의 목 뒷쪽에 5 U/kg으로 주사하였다. 4가지의 상이한 지체 시간 (15 분, 60 분, 120 분, 및 240 분) 경과 후, 4 g/kg 용량의 a-MM 용액을 IP 주사하였다. 혈액 샘플을 각 실험에 대해 0 분 및 다음과 같은 간격으로 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다:
Figure 112014006288597-pat00105
혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다.
도 23에서 관찰되는 바와 같이, IP a-MM 주사로 인한 혈청 접합체 농도 및 생물활성의 증가는 낮았고, 접합체 주사와 IP a-MM 주사 사이의 지체 시간이 길수록 덜 우세하였다. 예를 들어, 240 분 후에는 혈청 접합체 농도에 있어서 어떤 증가도 관찰되지 않았는데, 이는 완전한 접합체 흡수 이후에 체내에 존재하는 접합체의 어떤 렉틴-결합 데포도 존재하지 않음을 나타낸다. 이러한 결과는 제안된 메카니즘 (a)와 일치하였고, 제안된 메카니즘 (b)와는 불일치하였다. 본 발명자들이 메카니즘 (a)가 본 개시내용의 접합체에 의해 관찰되는 PK 특성과 관련이 있다고 가설을 세웠지만, 본원에서 제시하는 특허청구범위는 어떤 방식으로든 특정 작용 메카니즘으로 한정되지 않음을 이해한다.
실시예 45 - 리간드 친화성의 함수로서 PK 및 생물활성에 대한 a- MM 의 효과
실시예 42에 기재된 데이터를 고려하여, 본 발명자들은 실시예 42에 사용된 AETM 리간드 이외의 다양한 사카라이드 리간드를 이용하여 합성한 접합체의 약동학 및 약력학 거동을 결정하는 것에 착수하였다. 본 실시예에서는 TSAT-C6 프레임워크를 사용하였고, 실시예 20에서 기재한 방법에 따라 하기 접합체를 합성하였다 (주: 글루코사민-HCl 또는 GA-HCl은 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스 소재) 사에서 구입하였고, 추가의 정제없이 사용하였다):
Figure 112014006288597-pat00106
N-말단 서열분석에 따르면, 각각의 사카라이드-함유 프레임워크의 대략 90％가 Lys-B29를 통해 인슐린에 접합되었다. TSAT-C6-AEM-2 (B29) 및 TSAT-C6-GA-2 (B29)를 각각 접합체 I-7 및 I-5로서 도 45에 나타내었다.
상기 표에 기재한 접합체에 대해 실시예 42에 기재된 것과 동일한 유형의 실험을 반복하였다. 각 사례에서, 동일한 용량의 접합체 (5 U/kg)를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 3)의 목 뒷쪽에 주사하였다. 15 분 지체한 후, 4 g/kg 용량의 a-MM을 IP 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 처음 접합체를 주사한 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (ISO 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 15 분 후에 a-MM 대신 염수를 주사하여 대조군을 생성하였다.
도 24 및 25는 I-7 및 I-5를 각각 피하 주사하고 15 분 후에 a-MM을 IP 주사에 의해 투여한 경우의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, a-MM 주사로 인한 PK/PD 프로파일의 증가는 염수를 주사한 대조군 그룹과 비교했을때 접합체 I-7의 경우 매우 현저하였다 (p<0.05). 그러나, 혈청 접합체 농도에서 a-MM-유도된 증가의 정도는 실시예 42의 AETM-2 접합체에 대해 수득된 값 미만이었다. I-5 접합체 프로파일은 도 19에서의 RHI에 대해 수득한 결과와 같이 a-MM 주사에 의해 영향을 받지 않았다. 종합하면, 이들 데이터는 만노스-유래의 접합체 (AEM-2 및 AETM-2)가 둘 모두 a-MM-향상된 PK/PD 프로파일을 나타내는 반면, 저 친화성의 글루코사민 유래 접합체는 그렇지 않음을 보여준다. 또한, 저 친화성 AEM-2 접합체의 경우 PK 프로파일에 있어서의 상대적인 변화는 고 친화성 AETM-2 접합체에 대해 관찰되는 변화보다 더 작았다.
실시예 46 - 리간드 원자가의 함수로서 PK 및 생물활성에 대한 a- MM 의 효과
본 실시예에서, 본 발명자들은 예시적인 사카라이드 리간드가 증가되는 개수로 공유적으로 부착된 접합체의 약동학 및 약력학 거동을 결정하는 것에 착수하였다. 모든 접합체는 하기에서 상술하는 프레임워크 및 사카라이드 리간드를 사용하여 실시예 20에서 기재한 방법에 따라 합성하였다:
Figure 112014006288597-pat00107
N-말단 서열분석에 따르면, 각각의 사카라이드-함유 프레임워크의 대략 90％가 Lys-B29를 통해 인슐린에 접합되었다. 접합체를 도 45에 I-8, I-9, I-10, 및 I-11로서 나타내었다.
상기 표에서 기재한 접합체에 대해 실시예 45에서 기재한 것과 동일한 유형의 실험을 반복하였다. 각 사례에서, 동일한 용량의 접합체 (5 U/kg)를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 3)의 목 뒷쪽에 주사하였다. 15 분 지체한 후, 4 g/kg 용량의 a-MM을 IP 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 처음 접합체를 주사한 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (ISO 인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 15 분 후에 a-MM 대신 염수를 주사하여 대조군을 생성하였다.
도 26 및 27은 I-8 및 I-9를 각각 피하 주사하고 15 분 후에 a-MM을 IP 주사에 의해 투여한 경우의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, a-MM 주사로 인한 PK/PD 프로파일의 증가는 염수를 주사한 대조군 그룹과 비교했을때 I-9의 경우는 매우 현저하였고 (p<0.05), I-8의 경우에는 덜 현저하였다. 또한, I-9 접합체는 실시예 42로부터의 I-2 접합체와 대략 동일한 a-MM-유도된 PK 프로파일을 나타내었고, 이들은 둘 모두 I-8로부터 수득한 것보다 훨씬 더 확연하였다.
도 28 및 29는 I-10 및 I-11을 각각 피하 주사하고 15 분 후에 a-MM을 IP 주사에 의해 투여한 경우의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, a-MM 주사로 인한 PK/PD 프로파일의 증가는 염수를 주사한 대조군 그룹과 비교했을때 I-11의 경우는 매우 현저하였고 (p<0.05), I-10의 경우에는 약간 덜 현저하였다. 또한, I-11 접합체는 실시예 42로부터의의 I-2 접합체와 대략 동일한 a-MM-유도된 PK 프로파일을 나타내었고, 이들은 둘 모두 I-10으로부터 수득한 것보다 약간 더 확연하였다.
실시예 47 - 생체내 반감기/제거 속도 비교
실시예 44에서 수득한 결과는 경쟁적 사카라이드의 존재에 의해 방해받을 수 있는 렉틴 의존적 메카니즘을 통해 신체로부터 제거되는 예시적인 접합체와 일치하였다. 이러한 메카니즘을 보다 상세하게 연구하기 위해, 본 발명자들은 예시적인 접합체에 대해 다음과 같은 실험을 행하여 비접합된 인슐린과 비교하여 이들이 생체내에서 혈청으로부터 소실되는 속도를 결정하였다. 본 연구에 사용된 모든 접합체는 실시예 20에서 기재한 일반적인 방법에 따라 합성하였다.
각 사례에서 가용성 접합체를 이중으로 경정맥 삽관한 수컷 스프라그-돌리 래트 (타코닉(Taconic), JV/JV, 350-400 g, n=3)에 0.4 mg 접합체/체중 kg으로 투약하였다. 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 하나의 JV 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 제2 캐뉼라는 t = 0 (투여 전), 및 투여 후 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하는데 사용하였다.
혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 또는 혈청 접합체 농도를 측정하였다.
도 30은 정맥내 주사 이후 시간의 함수로서, RHI 또는 도 45에 I-6으로 나타낸 TSAT-C6-AETM-2 접합체의 혈청 농도를 나타낸다. 분명하게, I-6은 RHI보다 혈청으로부터 훨씬 더 빨리 제거되었다. 데이터를 하기 일반식을 이용하는 2구획 이중지수 모델을 이용하여 최적으로 적합시켰다: C(t) = AOEXP(-at) + BOEXP(-bt), 여기서 t는 시간이고, C(t)는 시간의 함수로서 혈청내 농도이고, AO는 제1 구획 농도 상수이고, a는 제1 구획 지수 시간 상수이고, BO는 제2 구획 농도 상수이고, b는 제2 구획 지수 시간 상수이다. 각 구획과 관련하여 제거 반감기 (분 단위)는 t1/2(a) = 0.693/a 및 t1/2(b) = 0.693/b이었다. 도 30에서, RHI의 경우 t1/2(a) = 0.76 및 t1/2(b) = 11.46이었고, I-6의 경우 t1/2(a) = 0.47 및 t1/2(b) = 2.87이었다. 즉, I-6의 t1/2(b)는 RHI의 t1/2(b)에 비해 약 4 배 더 짧았다.
아래 표에서는 상기에서 기재한 것과 완전히 동일한 절차를 이용하여 시험한 다수의 접합체에 대한 t1/2 파라미터를 요약하였다 (구조는 도 45에 나타내었음):
Figure 112014006288597-pat00108
이러한 데이터는 예시적인 접합체가 비접합된 인슐린에 비해 혈청으로부터 보다 신속하게 제거되며, 그 정도는 내인성 렉틴에 대한 특정 접합체의 친화성 및 접합체 당 치환된 리간드의 수에 의해 지배된다는 가설과 일치하였다. 또한, 실시예 42 및 44-46에서 입증된 PK/PD 프로파일에 있어서의 a-MM 유도된 증가는 시험한 접합체 각각에 대한 상 b 반감기의 감소와 큰 관련이 있었다.
실시예 48 - 글루코스 주입 하에서의 생체내 반감기/제거 속도
본 실시예에서는, 예시적인 접합체의 소실 속도가 생리학적 농도의 글루코스의 존재에 의해 억제될 수 있다는 추가의 가설을 세웠다. 고혈당 조건 하에 접합체가 생체내에서 혈청으로부터 소실되는 속도를 결정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 각 사례에서, 이중으로 경정맥 삽관한 수컷 스프라그-돌리 래트 (타코닉, JV/JV, 350-400 g, n=3)에 I-7을 0.4 mg 접합체/체중 kg으로 투약하였다.
실험을 시작하기 1 시간 전에, 하나의 래트 캐뉼라를 멸균 50％ w/v 글루코스 용액을 함유하는 주사기 주입 펌프에 연결하였다. 펌프 주입 속도는 동물의 혈당 수준이 실험 동안 모든 시점에서 300 mg/dL을 초과하여 유지되도록 실험자가 조정하였다. 혈당은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 전형적인 실험법으로, 동물에서 300 mg/dL을 초과하여 유지시키는데 요구되는 주입 펌프 속도가 전형적으로 85 ㎕/분을 초과하는 것으로 확인되었다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 제2 래트 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 헤파린-염수로 캐뉼라 라인을 추가로 플러싱한 후에, 제2 캐뉼라를 사용하여 투약 후 t = 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하였다.
각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하고, 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 또는 혈청 접합체 농도를 측정하였다. 인슐린 또는 접합체 혈청 농도 대 시간 데이터를 2구획 모델에 따라 2개의 독립적인 소멸 지수의 합 (C(t) = a exp(-kat) + b exp(-kbt))으로 최적으로 적합시켰고, 여기서 t1/2(a) = (ln 2)/ka이고 t1/2(b) = (ln 2)/kb이다. 하기 표에서는 글루코스를 주입한 경우 및 주입하지 않은 경우의 I-7에 대한 t1/2 파라미터를 실시예 47로부터 RHI에 대해 수득한 것과 함께 요약하였다:
Figure 112014006288597-pat00109
본 발명자들은 이들 데이터로부터 글루코스가 접합체에 대한 가속화된 혈청 제거를 억제하여 상 b의 제거 반감기를 2.77 분으로부터 5.11 분으로 배가시킬 수 있다고 결론내릴 수 있었다.
실시예 49 - a- MM 주입 하에서의 생체내 반감기/제거 속도
본 실시예에서는, 인슐린-사카라이드 접합체의 소실 속도가 임의의 고 농도의 글루코스 이외의 억제 사카라이드, 예컨대 α-메틸-만노스 (a-MM)의 존재에 의해 억제될 수 있다는 추가의 가설을 세웠다. a-MM의 존재하에 예시적인 접합체가 생체내에서 혈청으로부터 소실되는 속도를 결정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 각 사례에서, 이중으로 경정맥 삽관한 수컷 스프라그-돌리 래트 (타코닉, JV/JV, 350-400 g, n=3)에 가용성 접합체를 0.4 mg 접합체/체중 kg으로 투약하였다.
실험을 시작하기 1 시간 전에, 하나의 래트 캐뉼라를 멸균 25％ w/v a-MM 용액을 함유하는 주사기 주입 펌프에 연결하였다. 펌프 주입 속도는 실험자가 조정하였지만, 전형적으로 85 ㎕/분으로 설정하였다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 제2 래트 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 헤파린-염수로 캐뉼라 라인을 추가로 플러싱한 후에, 제2 캐뉼라를 사용하여 투약 후 t = 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하였다.
또한, 혈당은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하고, 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 또는 혈청 접합체 농도를 측정하였다. 인슐린 또는 접합체 혈청 농도 대 시간 데이터를 2구획 모델에 따라 2개의 독립적인 소멸 지수의 합 (C(t) = a exp(-kat) + b exp(-kbt))으로 최적으로 적합시켰고, 여기서 t1/2(a) = (ln 2)/ka이고 t1/2(b) = (ln 2)/kb이다. 하기 표에서는 a-MM을 주입한 경우 및 주입하지 않은 경우의 TSAT-C6-AEM-2 접합체에 대한 t1/2 파라미터를, 실시예 48로부터 글루코스를 주입하여 수득한 것 및 실시예 47로부터 사카라이드의 주입없이 RHI에 대해 수득한 것과 함께 요약하였다:
Figure 112014006288597-pat00110
본 발명자들은 이들 데이터로부터 a-MM이 접합체에 대한 가속화된 혈청 제거를 억제할 뿐만 아니라, 글루코스보다 더 큰 정도로 억제한다고 결론내릴 수 있었다. 본 사례에서, 상 b 제거 반감기는 2.77 분으로부터 10.09 분으로 거의 4배가 되었다.
IV . 그 밖의 실시예
본 제4 세트의 실시예는 몇몇 예시적인 접합체의 합성, 제제 및 특성을 조사하는 다양한 실험을 기재한다.
실시예 50 - 프로타민 , 아연, 및 기타 부형제를 이용한 장시간 작용 인슐린 접합체
상기 실시예로부터의 데이터가 사카라이드-의존적 혈청 제거 메카니즘과 일치한다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 피하 주사 부위로부터 꾸준하고 지속적인 흡수 속도를 제공하는 접합체의 제제를 개발하는 것에 착수하였다. 꾸준한 흡수 속도에서, 임의의 시점에서의 혈청 접합체 농도는 주로 사카라이드-의존적 제거 속도에 의해 지배될 것이다. 그러한 방식으로, 본 발명자들은 사카라이드-반응성 PK 프로파일을 나타내는 장시간 작용, 지속 방출 인슐린을 제제화할 수 있다.
장시간 작용 접합체를 생성하기 위해, 본 발명자들은 접합체 용액으로부터 PZI (프로타민 아연 인슐린) 제제를 제조하였다. B1-말단에서 인슐린으로 치환된 접합체는 무정형 또는 결정질 PZI 제제를 쉽게 형성하지 않으므로, 본 발명자들은 실시예 20의 방법에 기초하여 제조한 B29-치환된 접합체를 사용하였다. 이러한 제제에 사용된 부형제에는 프로타민, 아연, m-크레졸, 및 염 (모두 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스 소재) 사로부터 상업적으로 수득한 것)이 포함된다. 이들 성분의 농도는 최적으로 편평하고 지속적인 흡수 속도를 수득하기 위해 변경될 수 있다. 또한, 일부 사례에서는 소량의 비변형된 인슐린을 첨가하는 것이 제제를 안정화하는데 도움이 되는 것으로 밝혀졌다. 이들 사례에서, 샘플에 함유되는 비변형된 인슐린의 농도는 최적으로 고르고 지속적인 흡수 속도를 수득하기 위해 변경하였다. 시험한 모든 제제에서, 다음과 같은 레시피를 이용하였다:
Figure 112014006288597-pat00111
달리 명시하지 않는 한, 상기 표에서 기재한 순서로 성분을 첨가한 후에 제제가 제조되면, 이를 생체내에서 시험하기 이전에 30 분 동안 부드럽게 혼합하였다.
해당 제제에 대해 지속 방출 프로파일 뿐만 아니라 글루코스-반응성 PK 프로파일을 시험하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 제제를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 3)의 목 뒷쪽에 예정된 용량 (달리 명시되지 않는 한 대부분의 사례에서 약 15 U/kg)으로 주사하였다. 240 분 지체한 후, 글루코스 용량 (4 g/kg)을 IP 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 처음 접합체를 주사한 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 제조사의 검정 상세설명에 따르면, Iso-인슐린 ELISA는 래트 인슐린과 71％ 교차 반응성을 갖는다. 각각의 샘플에서 검출되는 내인성 래트 인슐린의 양을 최소화하되 래트 인슐린 검출 가능성이 완전히 배제될 수는 없도록 혈청 샘플을 10배 희석시켰다. 따라서, 결과는 일반적으로 실험별로 접합체 또는 RHI에 더하여 약간의 내인성 래트 인슐린으로 이루어질 수 있는 "측정된 인슐린"으로서 보고한다. 그럼에도 불구하고, 하기 각각의 실시예에서 수집된 모든 샘플은 동일하게 처리하였고, 성능상 차이를 직접 비교할 수 있었다.
실시예 51 - 장시간 작용 인슐린 접합체 성능에 대한 프로타민 농도의 효과
본 실시예의 목적은 예시적인 접합체의 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일에 대한 프로타민 농도의 효과를 입증하기 위한 것이다. 본 실시예에서는, 실시예 20에 기재된 방법에 따라 합성한 I-6을 이용하여 일반화된 제제 및 실시예 50에 기재되어 있는 생체내 프로토콜로 시험하였다:
Figure 112014006288597-pat00112
Figure 112014006288597-pat00113
상기에서 기재한 3 가지의 제제를 각각 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 31a-c에서 관찰되는 결과는 제제 내의 프로타민 농도가 증가됨에 따라 생성된 제제가 더 지속적이고, 4 시간 글루코스 주사후에 혈청 인슐린 프로파일에서 측정되는 증가가 더 확연한 것으로 나타났다. 1xP-1xZ 제제는 주사 직후에 짧은 시간에 걸쳐 현저한 분량의 인슐린 접합체 페이로드를 방출하여, IP 글루코스 투여 이후에 매우 작은 신호가 검출되었다. 한편, 10xP-4xZ 제제는 처음 4 시간에 걸쳐 저혈당증없이 낮은 기저량의 인슐린을 방출하였고, 후속하여 IP 글루코스를 주사한 직후에 측정한 인슐린 농도는 4x를 초과하여 증가하였다.
실시예 52 - 장시간 작용 인슐린 접합체 성능에 대한 아연 농도의 효과
본 실시예의 목적은 예시적인 접합체의 제제 안정성, 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일에 대한 아연 농도의 효과를 입증하기 위한 것이다. 본 실시예에서는, 실시예 20에 기재된 방법에 따라 합성한 I-6을 이용하여 일반화된 제제 및 실시예 50에 기재되어 있는 생체내 프로토콜로 시험하였다:
Figure 112014006288597-pat00114
Figure 112014006288597-pat00115
상기에서 기재한 4 가지의 제제를 각각 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 32a-b 및 33a-b에서 관찰되는 결과는 실험 오차 내에서, 아연의 농도가 제제의 전체적인 지속 방출 성질 또는 글루코스-반응성 프로파일에 현저한 영향을 갖지 않는 것으로 나타났다. 모든 사례에서, 측정된 인슐린 농도에서 통계적으로 현저한 증가는 IP 글루코스를 주사한 이후에 관찰되었다. 실시예 51에서 증명된 바와 같이, 프로타민이 보다 높은 (10xP) 제제는 아연 농도와 관계없이 프로타민이 보다 낮은 (4xP) 제제 보다 시간에 걸쳐 접합체를 덜 방출하였다. 그러나, 24 시간을 초과하여 제제를 실온에 방치한 경우, 10xP 제제는 둘 모두 쉽게 분산되는 미립자 용액에서 끈끈하고 덩어리진 2상 용액으로 변형되었다. 이는 상응하는 10xP-4xZ 제제에서는 일어나지 않았다. 유사하게, 4xP-1xZ 제제는 10xP-1xZ 제제와 같은 방식으로 변형되는 것으로 확인된 반면, 4xP-2xZ는 수주 동안 실온에서 비교적 안정하였다. 따라서, 주어진 프로타민 농도에 대한 아연 농도는 장기간에 걸쳐 안정한, 쉽게 분산되는 제제를 제조하기 위해 조정할 수 있다.
실시예 53 - 장시간 작용 인슐린 접합체 성능에 대한 m-크레졸 농도의 효과
본 실시예의 목적은 예시적인 접합체의 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일에 대한 m-크레졸 농도의 효과를 입증하기 위한 것이다. 본 실시예에서는, 실시예 20에 기재된 방법에 따라 합성한 I-6을 이용하여 일반화된 제제 및 실시예 50에 기재되어 있는 생체내 프로토콜로 시험하였다:
Figure 112014006288597-pat00116
상기에서 기재한 2 가지의 제제를 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 34a-b에서 관찰되는 결과는 m-크레졸의 존재가 제제를 보다 지속적으로 유지시키는 것으로 나타났다. 크레졸 무함유 제제는 주사 직후에 짧은 시간에 걸쳐 현저한 분량의 인슐린 접합체 페이로드를 방출하여, IP 글루코스를 투여한 경우 측정한 인슐린 농도에서 매우 작은 증가가 관찰되었다. 한편, 4x 크레졸 제제는 처음 4 시간에 걸쳐 저혈당증없이 낮은 기저량의 인슐린을 방출하였고, 후속하여 IP 글루코스를 주사한 직후에 측정한 인슐린 농도는 3-4x 증가하였다.
실시예 54 - 장시간 작용 인슐린 접합체 성능에 대한 염/ 등장화제 농도의 효과
본 실시예의 목적은 예시적인 접합체의 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일에 대한 염 농도 및 등장화제 선택의 효과를 입증하기 위한 것이다. 본 실시예에서는, 실시예 20에 기재된 방법에 따라 합성한 I-6을 이용하여 일반화된 제제 및 실시예 50에 기재되어 있는 생체내 프로토콜로 시험하였다:
Figure 112014006288597-pat00117
상기에서 기재한 3 가지의 제제를 각각 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 35a-c에서 관찰되는 결과는 제제내의 염의 존재가 제제를 보다 지속적으로 유지시키는 것으로 나타났다. 염 무함유 제제는 실험의 초기 4 시간에 걸쳐 현저한 분량의 인슐린 접합체 페이로드를 방출하여, IP 글루코스를 투여한 경우 측정한 인슐린 농도에서 매우 작은 증가가 관찰되었다. 한편, 3.3x 염 제제는 처음 4 시간에 걸쳐 저혈당증없이 낮은 기저량의 접합체를 방출하였고, 후속하여 IP 글루코스를 주사한 직후에 측정한 인슐린 농도는 약 4x 증가하였다. 이러한 성능은 3.3x 염 제제와 정확하게 동일하지만 대략 1/3 염 농도 (5.0 M와 비교하여 1.5 M)를 함유하는 실시예 51의 10xP-4xZ 제제로 수득한 것과 유사하였다. 마지막으로, 등장화제로서 NaCl을 글리세롤로 치환한 것은 제제의 지속성에 악영향을 미치는 것으로 보이지 않았다.
실시예 55 - 장시간 작용 인슐린 접합체 성능에 대한 비변형된 인슐린 농도의 효과
본 실시예의 목적은 예시적인 접합체의 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일에 대한 상이한 농도의 비변형된 인슐린을 포함하는 효과를 입증하기 위한 것이다. 본 실시예에서는, 실시예 20에 기재된 방법에 따라 합성한 I-6을 이용하여 일반화된 제제 및 실시예 50에 기재되어 있는 생체내 프로토콜로 시험하였다:
Figure 112014006288597-pat00118
상기에서 기재한 3 가지의 제제를 각각 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 36a-c에서 관찰되는 결과는 제제내에 비변형된 인슐린이 존재하는 것이 IP 글루코스를 주사한 이후에 측정한 인슐린 농도가 실질적으로 증가되는, 보다 지속적인 제제를 유익하게 생성시키는 것으로 나타났다. 또한, 비변형된 인슐린의 존재는 수주간의 실온 인큐베이션 이후에도 제제의 성능을 보존시키는데 도움이 된다 (하기 실시예 57 참조).
실시예 56 - 장시간 작용 인슐린 접합체 - 용량 반응 효과
본 실시예에서, 본 발명자들은 장시간 작용 예시적 접합체의 특정 제제의 용량 반응 효과를 평가하였다. 실시예 20에 기재된 방법에 따라 합성한 접합체 I-6을 이용하여 일반화된 제제 및 실시예 50에 기재되어 있는 생체내 프로토콜로 시험하였다:
Figure 112014006288597-pat00119
상기에서 기재한 제제를 5 또는 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다.
도 37에서 관찰되는 바와 같이, 접합체는 글루코스를 주사할 때까지 편평한 PK 프로파일을 나타내었다. IP 글루코스를 투여한 후에 측정한 인슐린 농도의 증가는 극적이었고 용량 의존적이었다 (접합체 5 U/kg (좌측) 및 15 U/kg (우측) 용량으로 수득한 데이터 비교). 초기 또는 후기 시점에서 저혈당증은 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 57 - 예시적인 장시간 작용, 글루코스 -반응성 접합체의 안정성
본 실시예에서, 본 발명자들은 실시예 56으로부터의 장시간 작용 제제와 정확하게 동일한 제제를 2x 규모로 합성하였다. 물질의 반은 2-8℃에서 보관하고, 나머지 반은 실온에서 1 주 또는 2 주 동안 보관하였다. 규정된 보관 기간이 지난 후, 물질을 재분산시키고, 실시예 56에 기재된 것과 동일한 4 시간 IP 글루코스 주사 프로토콜을 이용하여 15 U/kg 용량 (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터))으로 시험하였다. 도 38-39에서 관찰되는 바와 같이, 이러한 제제는 적어도 2 주 동안 냉장 (도 38) 또는 실온 (도 39)에서 보관한 이후에도 유사한 성능을 나타내었다.
실시예 58 - 다양한 리간드 친화성 및 다원자가를 갖는 접합체로부터 제조된 장시간 작용 접합체의 성능
본 실시예에서, 본 발명자들은 상이한 리간드 유형 및 수로 구축된 접합체의 장시간 작용 제제의 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일을 결정하는 것에 착수하였다. 본 실시예를 위한 모든 접합체는 이하에서 상술하는 프레임워크 및 사카라이드 리간드를 사용하여 실시예 20에 기재한 방법에 따라 합성하였다:
Figure 112014006288597-pat00120
각각의 접합체에 대해 다음과 같은 장시간 작용 제제를 사용하였다:
Figure 112014006288597-pat00121
상기에서 기재한 접합체를 각각 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 40a-e에서 관찰되는 바와 같이, 모든 접합체는 지속적인 흡수 프로파일을 나타내었고, 4 시간 글루코스 주사 이후에 측정한 혈청 인슐린 농도에서 일부 성분이 증가한 것으로 나타났다. 장시간 작용 TSPE-AETM-3 접합체 I-11을 주사하고 처음 4 시간 이내에 일부 현저한 접합체 흡수가 존재하는 것으로 보인다. 그러나, 다른 모든 접합체는 TSAT-C6-AETM-2 접합체에서 관찰된 것과 유사한 편평한 흡수 프로파일을 나타내었다. 이러한 결과는 이들 접합체의 반감기가 실시예 47-48에 기재되어 있는 바와 같이 비변형된 인슐린에 비해 모두 낮고, 이들 각각이 실시예 45-46에 기재되어 있는 바와 같이 PK/PD 프로파일에서 a-MM-유도된 증가를 보인다는 사실과 상당한 관련이 있다.
실시예 59 - IP a- MM 시험 조건하에서의 장시간 작용 접합체의 성능
본 실시예에서, 본 발명자들은 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 및 TSAT-C6-GA-2 (I-5) 접합체로부터 구축된 접합체의 장시간 작용 제제의 a-MM-반응성 프로파일을 시험하였다. 접합체는 둘 모두 실시예 20에서 기재한 일반적인 방법에 따라 제조하였다. 또한, 각각의 접합체에 대해 다음과 같은 장시간 작용 제제를 사용하였다:
Figure 112014006288597-pat00122
제제의 지속 방출 성질 뿐만 아니라 a-MM-반응성 PK 프로파일을 시험하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 제제를 공복상태인 정상 비-당뇨 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 3)의 목 뒷쪽에 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터))으로 주사하였다. 240 분 지체한 후, a-MM 용량 (4 g/kg)을 IP 주사하였다. 혈액 샘플은 0 분 및 처음 접합체를 주사한 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 및 300 분에 꼬리 정맥을 통해 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 또한, 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다.
도 41a에서 관찰되는 바와 같이, 장시간 작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 제제의 경우 IP a-MM 주사 이후 피크:기준선 혈청 농도 비율은 a-MM을 글루코스로 치환한 동일한 제제에서 관찰되는 것보다 훨씬 높았다. 또한, TSAT-C6-GA-2 (I-5) 제제 (도 41b)는 a-MM 투여 이후에 혈청 접합체 농도에 있어서 어떤 증가도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 TSAT-C6-GA-2 (I-5) 접합체의 제거 반감기가 비변형된 인슐린과 거의 동일하며 (실시예 47), PK에서 어떤 a-MM-유도된 변화도 나타내지 않는다는 사실 (실시예 45)과 상당한 관련이 있다.
실시예 60 - 당뇨병 및 비당뇨병에서의 장시간 작용 접합체
장시간 작용 TSAT-C6-AETM-2 (I-6) 제제의 생체내 유용성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 이를 (5, 10 및 20 U/kg) 정상 및 STZ-유도된 당뇨병 래트 (수컷 스프라그-돌리, 400-500 g, n = 6)에 투여하였다. 제제는 다음과 같은 절차를 이용하여 제조하였다:
Figure 112014006288597-pat00123
접합체의 생물활성을 촉발하는데 어떤 외부적 IP 글루코스 주사는 이용하지 않았다. 그 대신 본 발명자들은 래트 내의 내인성 글루코스 수준에 의존하여 접합체 제제의 PK 및 PD 프로파일을 제어하였다. 혈액 샘플은 처음 접합체를 주사한 후의 다양한 시점에 꼬리 정맥으로부터 출혈시켜 수집하였다. 혈당값은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 도 42에서 관찰되는 바와 같이, 정상 또는 당뇨병 래트에서 초기 또는 후기 시점에 저혈당증은 관찰되지 않았다. 당뇨병 래트에서 관찰된 글루코스 프로파일은 극적이었고, 접합체가 보다 높은 글루코스 농도에 의해 활성화되며, 장기간에 걸쳐 (최고 용량에서 8 시간에 걸쳐) 용량 비례적인 방식으로 글루코스 강하 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
상이한 용량 (7, 14 및 28 U/kg)을 이용하고 보다 긴 시간 (24 시간) 동안 실험을 반복하였다. 이러한 실험으로부터의 결과를 도 43에 나타낸다.
실시예 61 - 장시간 작용 제제를 생성하기 위한 지방산 에스테르를 갖는 접합체
본 발명자들은 예시적인 접합체의 장시간 작용 형태를 제조하기 위해, 프로타민 아연 인슐린에 대한 별법적 접근법을 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 장쇄 지방산을 갖는 B29-엡실론-아민 기를 공유적으로 변형시키는 것에 의해 B1-치환된 인슐린 접합체를 장시간 작용 제제로 전환시키는 방법을 보여준다. 미국 특허 제6,869,930호에 기재되어 있는 바와 같이, 예를 들어 C14-미리스트산에 의한 인슐린 아실화는 편평하고 지속적인 시간 작용 프로파일을 갖는 가용성 물질이 생성되게 한다. B1-치환된 TSAT-C6-AETM-2 (I-2)는 실시예 12의 방법에 따라 합성하였다. 이어서 이 물질을 건조 분말로 동결건조시키고, 이하의 절차의 출발 물질로서 사용할 수 있다.
미리스트산-NHS 에스테르를 1 ml의 무수 DMSO에 60 mM로 용해시킨 후, 400 ㎕ (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 용액을 10 분 동안 실온에서 신속하게 교반하였다. 이어서 접합체 I-2를 별개로 7.5 ml의 무수 DMSO에 8.1 mM의 농도로 용해시켰다. 일단 용해되면, 전체 용액을 1 분 동안 미리스트산-NHS 에스테르 용액에 첨가한 후, 추가로 2 시간 동안 실온에서 혼합하여 완전하게 반응되게 하였다.
이어서 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액으로 10배 초희석한 후 pH를 연한 HCl로 최종 pH 8.0으로 조정하였다. 수용액을 먼저 목적하는 접합 및 비접합 물질의 분리를 위해 적절한 고체상을 이용한 크기 배제에 의해 정제하였다. 이어서 칼럼 공간 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막을 이용하여 대략 10 ml로 농축시켰다. 이 용액을 추가로 정제용 역상 HPLC를 이용하여 워터스 시메트리프레프(Waters SymmetryPrep) C18, 7 ㎛ 칼럼, 19 x 150 mm 상에서 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1％ TFA를 함유하는 탈이온수이고, 완충제 B는 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 정제하기 전에, 칼럼을 워터스 델트라프레프(Waters DeltraPrep) 600 시스템을 이용하여 80％A/20％B 이동상으로 15 ml/분으로 평형화하였다. 대략 5 ml의 조 용액을 2 분 동안 15 ml/분의 유속으로 칼럼에 주입하고, 이후 다음 5 분 동안 80％A/20％B → 75％A/25％B의 선형 구배를 이용한 후, 다음 22 분 동안은 75％A/25％B → 62％A/38％B의 더 느린 선형 구배를 이용하였다. 목적하는 피크의 체류 시간은 사용한 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집되면, 용액을 회전증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 순수한 접합체를 수득하였고, 그 정체는 LC-MS (HT 래보러토리즈, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 확인할 수 있다. 이어서 생성된 접합체의 지속적이고 사카라이드-반응성 PK/PD 프로파일은 실시예 50 및 59에 기재된 4 시간 IP 글루코스 또는 a-MM 조건을 이용하여 평가할 수 있다.
실시예 62 - 중성 등전점을 보유하는 인슐린을 갖는 장시간 작용 접합체
본 발명자들이 접합체의 장시간 작용 형태를 제조하기 위해, 프로타민 아연 인슐린에 대한 또 다른 별법적 접근법을 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 접합체를 제조하는데 예를 들어 야생형 인간 인슐린 대신 인슐린 글라진 (란투스(LANTUS)®)으로 치환하는 것에 의해 장시간 작용 접합체를 합성하는 방법을 보여준다. 인슐린 글라진-접합체를 형성하는데 앞선 실시예에서 기재한 임의의 및 모든 합성 방법을 사용할 수 있다. 인슐린 글라진은 Asp-A21이 글리신으로 대체되고, 2 개의 아르기닌이 B 쇄의 C 말단에 첨가된 예시적인 장시간 작용 인슐린 유사체이다. 이러한 변화의 효과는 등전점을 이동시켜, pH 4에서는 완전하게 용해되지만 생리학적 pH에서는 불용성인 용액이 생성되게 한다. 일단 합성 및 정제되면, 생성된 접합체의 지속적이고 사카라이드-반응성인 PK/PD 프로파일을 실시예 50 및 59에 기재된 4 시간 IP 글루코스 또는 a-MM 조건을 이용하여 평가할 수 있다.
실시예 63 - 펌프 전달 시스템에서의 가용성 접합체의 사용
사카라이드-반응성 접합체를 장시간 작용 제제로 제제화하는 대신, 펌프 전달 시스템을 이용하여 각각을 정맥내, 피하, 또는 복강내로 연속 주입할 수 있다. 접합체의 멸균 용액을 공지된 농도 (전형적으로 25-100 U/ml)로 펌프 저장소에 로딩하고, 선택한 구획에 꾸준한 속도로 연속적으로 전달하였다. 이러한 속도는 대상체에서 저혈당증이 관찰되지 않는 최대 수준으로 조정하였다. 이어서, 실시예 50 및 59에 기재된 4 시간 IP 글루코스 또는 a-MM 조건을 이용하여, 글루코스-반응성 PK/PD 프로파일을 평가할 수 있다. 펌프 방법은 접합체를 꾸준한 주입 및 흡수 속도로 제공하는데 어떤 부형제도 요구되지 않는다는 점에서 유익하다. 다양한 인슐린 펌프가 당업계에 기재되어 있고, 본 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 각각이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,435,173호, 동 제4,498,843호, 동 제4,923,375호, 동 제5,062,841호, 동 제6,650,951호, 동 제6,744,350호, 동 제6,852,104호, 동 제7,377,907호, 및 동 제7,515,060호, 및 미국 특허 공개공보 번호 20080172028, 20090005726, 20090112165, 20090137957, 20090177142, 20090177154, 및 20100004598에 기재되어 있는 어느 하나의 펌프를 참조한다.
실시예 64 - C6 -아미드- AEM -2 중간체의 합성
본 실시예는 하기 화학 구조를 갖는 ZC-AEM-2 중간체를 제조하는 합성 과정을 기재한다:
Figure 112014006288597-pat00124
a. 중간체 Z2A
제1 단계 과정은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 시약 Z1A 및 Z1B를 합하여 중간체 Z2A를 생성하는 것을 포함한다:
Figure 112014006288597-pat00125
이는 다음과 같이 달성하였다. 250 mL 2구 플라스크에 화합물 Z1B (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 13.9 g), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 11.0 g) 및 디메틸포름아미드 (DMF, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 실온에서 질소하에 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 후, 화합물 Z1A (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 9.5 mL) 및 디-이소프로필카르보디이미드 (DIC, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 9.8 ml)를 질소하에 혼합물에 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 36 시간 후에, (디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 7.71 g)을 첨가하고, 48 시간 후에 반응 혼합물을 부흐너 깔대기로 여과하였다. 여과물을 4℃에서 밤새 정치시키고, 다음날 후처리하였다.
여과물을 증발시키고, 생성된 잔류물을 120 mL의 에틸 아세테이트에 녹이고, 10％ 수성 HCl 용액 (3 x 30 mL), 포화 수성 NaHCO3 용액 (3 x 30 mL), 염수 (3 x 20 mL)로 연속 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 건고상태로 농축시켜 생성물을 수득하였고, 이것을 추가의 정제없이 사용할 수 있다.
b. 중간체 Z3A
제2 단계 과정은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 중간체 Z2A를 중간체 Z3A로 전환시키는 것을 포함한다:
Figure 112014006288597-pat00126
화합물 Z2A (16.0 g)를 메탄올 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 85 mL)에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨의 10％ 수용액 (19 mL)을 적가하고, 반응물을 0℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 최소량의 물 (15 mL)로 용해시켰다. 이 용액에 앰버라이트(Amberlite) IR-120 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, H+ 형태)을 15 x 2 g의 분취량으로 0℃에서 첨가하였다. 비드 현탁액을 0.5 시간 동안 교반하여, pH 약 5의 용액을 생성하였다. 생성된 혼합물을 여과하여 앰버라이트 비드를 제거하고, 여과물을 농축하고, 진공하에 건조시켜 백색-적색 고체를 13.O g 수율로 수득하였다.
c. 중간체 Z4A
제3 단계 과정은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 중간체 Z3A를 시약 Z3B와 합하여 중간체 Z4A를 생성하는 것을 포함한다:
Figure 112014006288597-pat00127
화합물 Z3B (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 19.0 g)를 DMF (50 mL)에 용해시켰다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 그 후 트리에틸아민 (15.0 mL)을 용액에 첨가하였다. 용액의 온도는 0.75 시간 동안 0℃로 유지시켰다. 다음으로, 0℃에서 용액을 DMF (24 mL) 중에 용해된 화합물 Z3A (13.0 g)의 용액으로 채운 후, HOBT (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 15.9 g), DMF (50 mL), 및 DIC (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 15.0 mL)로 채웠다. 생성된 용액을 추가로 1 시간 동안 0℃에서 교반한 다음, 실온으로 가온되게 하고, 추가로 18 시간 동안 밤새 반응시켰다.
다음으로 반응물을 0℃로 재냉각시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 15 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 용액의 pH가 대략 9.0이 될 때까지 0.5 시간 동안 교반하였다. 무수 메틸렌 클로라이드 (25 mL) 및 DIC (3.5 mL)을 첨가하고, 또 다른 10 시간 동안 교반을 계속하였다. 화합물 Z3B를 더 첨가하고 (유리 염기, 2.5 g), 실온에서 질소 분위기 하에 추가로 50 시간 동안 반응이 진행되게 하였다.
마지막으로, 반응 혼합물을 여과하고, 회전식 증발을 통해 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 메틸렌 클로라이드 (CH2Cl2, 400 mL)에 용해시키고, 유기상을 5％ HCl 용액으로 세척하였다 (3 x 200 mL). 유기층을 0℃로 냉각시키고, 포화 중탄산나트륨 용액 (3 x 100 mL) 및 염수 (2 x 200 mL)로 중화시켰다. 유기 용액을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 이어서 이것을 여과에 의해 분리하고 회전식 증발을 이용하여 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (용리액 상: 메틸렌 클로라이드/메탄올 50:1 → 5:1)에 의해 정제하였다. 칼럼 분획을 농축시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다. 백색 고체를 Z4A로서 수득하였다 (18.9 g, 수율 81％).
d. 중간체 Z5A
제4 단계 과정은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 중간체 Z4A를 중간체 Z5A로 전환시키는 것을 포함한다:
Figure 112014006288597-pat00128
에스테르 Z4A (2.27 g)를 메탄올 (10 mL)에 용해시키고, 이 용액에 5.0 mL의 1.0 M 수산화나트륨 용액을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 38 시간 동안 교반하였다. 이 시간 말미에, 추가의 2.0 M 수성 수산화나트륨 용액을 1.5 mL 첨가하고, 혼합물을 또 다른 14 시간 동안 실온에서 교반하였다.
다음으로, 반응 혼합물을 HCl의 10％ 수용액으로 0℃에서 산성화하였다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 25 mL). 합한 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 진공하에 밤새 건고상태로 농축시켜, Z5A를 백색 고체로서 수득하였다 (2.2 g).
e. 중간체 Z6A
제5 단계 과정은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 중간체 Z5A를 아미노에틸만노스 (AEM)와 합하여 중간체 Z6A를 생성하는 것을 포함한다:
Figure 112014006288597-pat00129
2산 화합물 Z5A (2.0 g), 아미노에틸만노스 (1.46 g), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 2.7 g)를 질소하에 0℃에서 무수 DMF (80 mL)에 용해시켰다. DIPEA (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 3.0 mL)를 혼합물에 0℃에서 질소 분위기 하에 적가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 0℃에서 교반한 다음 추가로 4 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이때, 또다른 분취량의 아미노에틸만노스 (0.5 g) 및 HATU (0.52 g)를 반응 용액에 실온에서 첨가하고, 용액을 또 다른 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 회전식 증발을 통해 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (메틸렌 클로라이드/메탄올 20:1에 이어, 6:1에서 1:1로 용리). 분획을 수집하고, 진공하에 증발시켜, 정제된 생성물을 수득하였다 (TLC: 상부 스폿, Rf 0.6, 메틸렌 클로라이드:메탄올 1:3).
중간체 Z5A를 중간체 Z6A로 전환시킬때 AEM을 또 다른 아민 함유 시약 (예를 들어, 비제한적으로 AEG, AEBM, AETM 등)으로 대체하여 이러한 전체 과정을 반복하여 상이한 리간드를 갖는 접합체를 수득할 수 있음을 인식할 것이다.
f. 중간체 Z7A
제6 단계 과정은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 중간체 Z6A를 중간체 Z7A로 전환시키는 것을 포함한다:
Figure 112014006288597-pat00130
화합물 Z6A (1.43 g)를 무수 메탄올 (100 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1.00 g 탄소상 팔라듐 (Pd/C)을 첨가하고, 용액을 수소 기체로 버블링하여 보호기를 환원시켜, 상응하는 아민을 수득하였다. 대략 9 시간 반응 이후에, 반응물이 완전하게 전환되는 것으로 확인되었다.
반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과물을 농축시키고 진공하에 건조시켰다. 화합물 Z7A는 갈색 고체로 수득되었다 (1.16 g, 수율 94％).
g. 중간체 Z8A
하기 반응식은 커플링제 Z8A를 제조하는 방법을 보여준다:
Figure 112014006288597-pat00131
무수 CH2Cl2 (65 mL) 중의 N-히드로시숙신이미드 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, NHS, 7.0 g)의 냉각된 용액에 0℃에서 트리에틸아민 (9.5 mL) 및 아디포일 클로라이드 (3.97 mL, 5.0 g)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2 시간 동안 0℃에서 교반하였다. 혼합물을 NaCl의 포화 수용액으로 세척하고 (3 x 30 mL), 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 진공하에 농축시킨 다음, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하여, 생성물 Z8A로서 백색 고체 (6.6 g)를 수득하였다.
h. 중간체 Z9A
하기 반응식은 커플링제 Z8A를 중간체 Z7A와 합하여 중간체 Z9A를 생성하는 방법을 보여준다:
Figure 112014006288597-pat00132
화합물 Z7A (0.256 g)를 무수 DMF에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 무수 DMF (15 mL) 중의 Z8A (0.710 g) 용액을 질소 분위기하에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2 시간 동안 교반하였다.
용액 부피를 1/3로 농축시키고, 과량의 미반응 DSS를 여과해내었다. 여과물을 추가로 대략 3 mL의 칼럼으로 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: 메틸렌 클로라이드/메탄올 20:1 → 4:1에 이어, 3:1 → 1:1)에 의해 정제하였다. 수집한 분획을 농축시키고, 진공하에 건조시켜, 151 mg의 정제된 생성물을 수득하였다.
Figure 112014006288597-pat00133
실시예 65 - C6 -아미드- AEM -2 (B1) 접합체의 합성
본 실시예는 실시예 64의 중간체 Z9A로부터 B1-접합된 인슐린을 제조하는 방법을 기재한다. 화합물 Z9A를 다음과 같이 인슐린에 접합시켰다. 실시예 8에 따라 합성한 NH2-B1-BOC2(A1,B29)-인슐린 (0.167 g)을 무수 DMSO (3 mL)에 실온에서 질소하에 용해시키고, 실온에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 무수 트리에틸아민 (0.013 mL)을 실온에서 질소하에 첨가하였다. 무수 DMSO (1.5 mL) 중의 화합물 Z9A (0.177 g)를 주사 펌프를 통해 4.2 ㎕/분의 속도로 인슐린-트리에틸아민 혼합물에 실온에서 첨가하였다 (교반 속도 80 rpm). 반응물 전환은 분석용 HPLC에 의해 모니터링하였다. 4 시간 후에, 또 다른 3 당량의 TEA (0.010 mL)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 총 10.5 시간 후에, 반응을 중단시키고 -20℃의 동결기 내에 밤새 두었다.
다음날, 반응 혼합물을 해동시키고, 이온 교환 비드의 소형 충전 칼럼 (SP 세파덱스 비즈(SP Sephadex beads), 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 등용매 조건) 상에 놓았다. 칼럼을 1000 x g에서 4 분 동안 간단히 원심분리하여 인슐린 접합체를 정제하였다 (분석용 HPLC로 평가함). 이온 교환 칼럼으로부터 수집된 분획 (6 mL)을 무수 아세톤 (30 mL)에 140 rpm에서 교반하면서 10 분 동안 적가하였다. 생성된 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브에 붓고, 이것을 3500 x g에서 10 분 동안 회전시켰다. 맑은 상청액을 튜브에서 제거하고, 케이크를 유지시켜 한쪽으로 치워 두었다. 상청액을 또 다른 30 mL의 아세톤에 첨가하여 제2 침전물 집단을 수득하였고 (5 N HCl을 몇 방울 첨가한 후), 이어서 이것을 3500 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 제2 원심분리 케이크를 수득하였다.
합한 케이크를 진공하에서 1 시간 동안 건조시켜, 분석용 HPLC에 의할때 98％를 초과하는 순도로 백색 고체를 수득하였다 (197 mg, 92％ 수율). 인슐린 접합체 BOC 기를 실시예 12에서 언급한 절차에 의해 제거하여, 생물학적으로 활성인 인슐린 접합체를 수득하였다.
본 실시예에서 기재한 과정은 역상 HPLC의 필요없이 고수율의 고순도 인슐린 접합체를 생성하는데 유익하다.
실시예 66 - I-17: C6 -아미드- AEM -2 (B29) 접합체의 합성
본 실시예는 실시예 64의 중간체 Z9A로부터 B29-접합된 인슐린을 제조하는 한가지 방법을 기재한다. 화합물 Z9A를 다음과 같이 인슐린에 접합시켰다. 실시예 16에 따라 합성한 NH2-B29-BOC2(A1,B1)-인슐린 (0.167 g)을 무수 DMSO (3 mL)에 실온에서 질소하에 용해시키고, 실온에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 무수 트리에틸아민 (0.013 mL)을 실온에서 질소하에 첨가하였다. 무수 DMSO (1.5 mL) 중의 화합물 Z9A (0.177 g)를 주사 펌프를 통해 4.2 ㎕/분의 속도로 인슐린-트리에틸아민 혼합물에 실온에서 첨가하였다 (교반 속도 80 rpm). 반응물 전환은 분석용 HPLC에 의해 모니터링하였다. 4 시간 후에, 또 다른 3 당량의 TEA (0.010 mL)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 총 10.5 시간 후에, 반응을 중단시키고 -20℃의 동결기 내에 밤새 두었다.
다음날, 반응 혼합물을 해동시키고, 이온 교환 비드의 소형 충전 칼럼 (SP 세파덱스 비즈, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재, 등용매 조건) 상에 놓았다. 칼럼을 1000 x g에서 4 분 동안 간단히 원심분리하여 인슐린 접합체를 정제하였다 (분석용 HPLC로 평가함). 이온 교환 칼럼으로부터 수집된 분획 (6 mL)을 무수 아세톤 (30 mL)에 140 rpm에서 교반하면서 10 분 동안 적가하였다. 생성된 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브에 붓고, 이것을 3500 x g에서 10 분 동안 회전시켰다. 맑은 상청액을 튜브에서 제거하고, 케이크를 유지시켜 한쪽으로 치워 두었다. 상청액을 또 다른 30 mL의 아세톤에 첨가하여 제2 침전물 집단을 수득하였고 (5 N HCl을 몇 방울 첨가한 후), 이어서 이것을 3500 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 제2 원심분리 케이크를 수득하였다.
합한 케이크를 진공하에서 1 시간 동안 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 인슐린 접합체 BOC 기를 실시예 12에서 언급한 절차에 의해 제거하여, 생물학적으로 활성인 인슐린 접합체를 수득하였다.
실시예 67 - I-17: C6 -아미드- AEM -2 (B29) 접합체의 별법적 합성
본 실시예는 실시예 64의 중간체 Z9A로부터 B29-접합된 인슐린을 제조하는 또 다른 방법을 기재한다. 구체적으로, 이러한 별법적 방법은 화합물 Z9A를 비보호된 인슐린에 B29 엡실론 아미노 기에서 직접 커플링시키는 것을 포함한다. 화합물 Z9A를 1.0 ml의 무수 DMSO에 53 mM로 용해시킨 후, 0.4 ml (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 용액을 5 분 동안 실온에서 신속하게 교반하였다. 이어서 재조합 인간 인슐린 (RHI) 분말을 별개로 1 ml의 0.1 M, pH 11 탄산나트륨 완충제 중에 17.2 mM로 용해시키고, 후속하여 1.0 N 수산화나트륨을 이용하여 pH를 10.8로 조정하였다. 일단 용해되면, 화합물 Z9A의 전체 용액을 인슐린/카르보네이트 완충제 용액에 10 분 동안 적가하였다. 적가한 후 용액을 추가로 15 분 동안 교반하여 완벽하게 반응되게 하였다.
이어서 생성된 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액으로 10배 초희석한 후, pH를 연한 HCl로 최종 pH 8.0으로 조정하였다. 수용액을 먼저 목적하는 접합 및 비접합 물질의 분리를 위해 바이오겔 P2 (바이오-래드(Bio-Rad) 래보러토리즈, 캘리포티아주 헤라클레스 소재)를 이용한 크기 배제에 의해 정제하였다. 이어서 칼럼 공간 부피를 통과한 용액을 3 kDa의 한외여과 막을 이용하여 대략 15 ml로 농축시켰다. 이 용액을 추가로 정제용 역상 HPLC를 이용하여 워터스 시메트리프레프 C18, 7 ㎛, 19 x 150 mm 칼럼 상에서 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1％ TFA를 함유하는 탈이온수이고, 완충제 B는 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 정제하기 전에, 칼럼을 워터스 델트라프레프 600 시스템을 이용하여 80％A/20％B 이동상으로 15 ml/분으로 평형화하였다. 대략 5 ml의 조 용액을 2 분 동안 15 ml/분의 유속으로 칼럼에 주입하고, 이후 다음 5 분 동안 80％A/20％B → 75％A/25％B의 선형 구배를 이용한 후, 다음 22 분 동안은 75％A/25％B → 62％A/38％B의 더 느린 선형 구배를 이용하였다. 목적하는 분획이 수집되면, 용액을 회전증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 순수한 접합체를 수득하였고, 그 정체는 LC-MS (HT 래보러토리즈, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 확인하였다. 최종 생성물 (HPLC에 의하면 95％ 순수)은 6744 g/mol의 목적하는 MW를 가지는 것으로 확인되었는데 (LC-MS), 이는 인슐린 당 총 2.0 AEM 분자가 접합되었음을 나타내고, 85％를 초과한 접합체 분자가 Lys-B29 위치에서 접합된 것으로 나타났다 (N-말단 서열분석에 의해 결정됨).
실시예 68 - 장시간 작용 I-17 접합체
본 실시예에서, 본 발명자들은 실시예 64의 화합물 Z9A로부터 구축된 접합체의 장시간 작용 제제의 시간 작용 및 글루코스-반응성 PK 프로파일을 결정하는 것에 착수하였다. 본 실시예를 위한 접합체는 실시예 67에 기재되어 있는 방법에 따라 합성하였다. 이 접합체에 대해 다음과 같은 장시간 작용 제제를 사용하였다:
Figure 112014006288597-pat00134
상기에서 기재한 제제를 15 U/kg (체중 (그램)/1.87 = 주사 부피 (마이크로리터)) 투약하여 4 시간 IP 글루코스 주사 (4 g/kg) 실험을 수행하였다. 도 44에서 관찰되는 바와 같이, 접합체는 지속적인 흡수 프로파일을 나타내었고, 4 시간 글루코스 주사 이후에 측정한 혈청 인슐린 농도에서 현저한 증가를 나타내었다.
실시예 69 - 2- 아미노에틸 알파-L- 푸코피라노시드 및 2- 아미노에틸 N-아세틸-베타-D-글루코사민으로부터 제조된 접합체 및 평가
실시예 42로부터의 데이터는 L-푸코스가 예시적인 접합체의 PK 프로파일을 증가시키는 추정 렉틴 경로를 억제할 수 있음을 보여준다. 또한, 베타-연결된 N-아세틸 글루코사민이 또한 만노스 및 푸코스가 억제제인 경로를 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Haurum et al., in Biochem. J. 293:873-878, 1993] 참조). 본 실시예는 상기에 기재된 것과 같은 인슐린 접합체를 2-아미노에틸 알파-L-푸코피라노시드 또는 2-아미노에틸 N-아세틸-베타-D-글루코사민 리간드를 이용하여 어떻게 합성할 수 있는지를 기재한다. 2-아미노에틸 알파-L-푸코피라노시드 (MW = 207 g/mol)는 문헌 [Ni et al., in Bioconjugate Chem. 14:232-238, 2003]의 방법에 따라 제조하였다. 2-아미노에틸 N-아세틸-베타-D-글루코사민 (MW = 264 g/mol)은 문헌 [Cai et al., in Organic Letters 7:4021-4024, 2005]의 방법에 따라 합성하였다. 상기의 실시예 11-13, 15, 17-27, 및 29-31에 기재되어 있는 임의의 접합체 합성 방법에서 아미노-관능화된 당 리간드를 이들 리간드 중 어느 하나로 쉽게 치환시킬 수 있다.
생성된 접합체의 PK를, 실시예 42에 기재되어 있는 방법에 따라 래트에 피하 주사한 후 생체내에서 PK/PD 프로파일에 있어서의 a-MM, L-푸코스, 또는 글루코스-유도된 증가에 대해 시험하였다. 접합체는 또한 실시예 50-55의 방법에 따라 지속 방출 제제로서 제제화할 수 있고, 이어서 같은 실시예에서 개략한 4 시간 IP 글루코스 주사 프로토콜에 따라 그의 지속적이고 글루코스-반응성인 약동학을 평가할 수 있다. 실시예 61-63에서 기재한 바와 같은, 이들 접합체의 방출을 지속화시키는 별법적 방법을 이용할 수 있다.
실시예 70 - 화학식 VIb -3의 예시적 접합체
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 화학식 VIb-3의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00135
상기 식에서:
W는 인슐린 분자이고;
각 경우의 -X는
Figure 112014006288597-pat00136
이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 인간 인슐린, 돼지 인슐린 및 소 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 인슐린 글라진 또는 인슐린 데테미르이다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 3개의 디술피드 브릿지를 포함한다.
실시예 71 - 예시적 접합체 I-6
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 접합체 I-6을 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00137
실시예 72 - 화학식 VIc -2의 예시적 접합체
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 화학식 VIc-2의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00138
.
상기 식에서:
W는 인슐린 분자이고;
각 경우의 -X는
Figure 112014006288597-pat00139
이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 인간 인슐린, 돼지 인슐린 및 소 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 인슐린 글라진 또는 인슐린 데테미르이다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 3개의 디술피드 브릿지를 포함한다.
실시예 73 - 화학식 VId -1의 예시적 접합체
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 화학식 VId-1의 접합체를 제공한다:
Figure 112014006288597-pat00140
.
상기 식에서:
W는 인슐린 분자이고;
-X는
Figure 112014006288597-pat00141
이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 인간 인슐린, 돼지 인슐린 및 소 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 인슐린 글라진 또는 인슐린 데테미르이다. 특정 실시양태에서, 인슐린 분자는 3개의 디술피드 브릿지를 포함한다.
실시예 74 - 예시적 제제
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 접합체를 포함하는 지속 방출 제제를 제공하며, 이때 제제는 프로타민 및 아연을 포함한다. 본 개시내용은 본원에서 기재한 접합체 중 임의의 하나 (예를 들어, 비제한적으로, 도 45, 49, 55, 60, 61, 또는 62의 접합체 중 임의의 하나)를 포함하는 지속 방출 제제를 포함하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, 제제는 약 1 내지 약 5 mg 프로타민/mg 접합체; 및 약 0.1 내지 약 0.25 mg 아연/mg 접합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 프로타민 및 아연을 약 40:1 내지 약 10:1 범위의 비율 (w/w)로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 추가로 상당한 양의 비접합된 인슐린 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 접합된 인슐린 분자를 비접합된 인슐린 분자에 대해 약 25:1 내지 약 2:1의 몰비로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 추가로 항미생물성 보존제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항미생물성 보존제는 m-크레졸이다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.15 내지 약 0.35％ v/v m-크레졸을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 추가로 등장화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 등장화제는 글리세롤이다. 특정 실시양태에서, 등장화제는 NaCl이다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.1 내지 약 0.2 M NaCl을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 다음을 포함한다:
프로타민 및 아연을 약 40:1 내지 약 10:1 범위의 비 (w/w)로;
접합된 인슐린 분자를 비접합된 인슐린 분자에 대해 약 25:1 내지 약 2:1 범위의 몰비로;
약 0.15 내지 약 0.35％ v/v m-크레졸; 및
글리세롤 또는 약 0.1 내지 약 0.2 M NaCl.
특정 실시양태에서, 제제는 다음을 포함한다:
약 3.6 mg 프로타민/mg 접합체; 및
약 0.2 mg 아연/mg 접합체.
특정 실시양태에서, 제제는 다음을 포함한다:
약 3.6 mg 프로타민/mg 접합체;
약 0.2 mg 아연/mg 접합체; 및
접합된 인슐린 분자를 비접합된 인슐린 분자에 대해 약 5:1의 몰비로.
특정 실시양태에서, 제제는 다음을 포함한다:
약 3.6 mg 프로타민/mg 접합체;
약 0.2 mg 아연/mg 접합체;
접합된 인슐린 분자를 비접합된 인슐린 분자에 대해 약 5:1의 몰비로; 및
약 0.2％ v/v m-크레졸.
특정 실시양태에서, 제제는 다음을 포함한다:
약 3.6 mg 프로타민/mg 접합체;
약 0.2 mg 아연/mg 접합체;
접합된 인슐린 분자를 비접합된 인슐린 분자에 대해 약 5:1의 몰비로;
약 0.2％ v/v m-크레졸; 및
글리세롤 또는 약 0.15 M NaCl.
실시예 75 - A1-치환된 인슐린 접합체를 생성하기 위한 유기 용매 중에서의 다가 활성화된 에스테르와의 인슐린 접합 (처음 첨가되는 약물) - 일반적인 절차
단계 1
인슐린을 100 mM 탄산나트륨 완충제 (pH 11) 및 아세토니트릴의 66:37 vol:vol 혼합물에 14.7 mM의 농도로 용해시켰다. 별도로, 1관능성 보호기-활성화된 에스테르 (예를 들어, BOC-NHS)를 아세토니트릴에 467 mM로 용해시켰다. 일단 인슐린이 용해되면, 작은 분취량의 1관능성 보호기-활성화된 에스테르 (예를 들어, BOC-NHS)를 인슐린 용액에 첨가하였다. 과정 전반에 걸쳐 pH를 모니터링하고, 0.1 M 수산화나트륨을 첨가하는 것을 통해 10.2-11.0으로 유지시켰다. 반응은 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. HPLC 크로마토그램이 비변형된 모든 인슐린이 반응하였고 실질적인 분량의 반응 혼합물이 B29-보호된 인슐린으로 전환되었음을 나타낼 때까지, 1관능성 보호기-활성화된 에스테르의 분취량을 첨가하였다. 전형적으로, 보호기는 사실상 더욱 소수성일 것이고, 일단 인슐린과 반응하면 비변형된 인슐린 보다 긴 HPLC 체류 시간에 용리될 것이다.
단계 2
별도로, N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 1.267 ml의 무수 DMSO 중에 174 mM로 용해시킨 후, 100 ㎕ (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 용액을 10 분 동안 실온에서 신속하게 교반하였다. 또 다른 바이알에서, 적절한 부피의 무수 DMSO 중의 370 mM 리간드 용액을 제조하였다. 일단 용해되면, 최초 활성화된 에스테르 기의 수, N, -1의 3배와 동일한 다수의 반응 당량이 생성되도록 충분한 용액을 첨가하였다. 예를 들어, 프레임워크 당 N=3 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(3-1)x60 mM/370 mM)=0.973 ml의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 당 N=4 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(4-1)x60 mM/370 mM)=1.46 ml의 리간드 용액을 첨가하는 등이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 용액을 1 시간 더 실온에서 교반하여 반응이 완료되게 하였다.
단계 3
인슐린이 단계 1에서 기재한 바와 같이 보호기와 충분히 반응하고, 그 후 단계 2에서 프레임워크 및 리간드 사이에 충분한 반응이 일어나면, 단계 2로부터의 프레임워크-리간드 용액을 인슐린 용액에 분취량으로 적가하였다. 생성된 반응물을 HPLC로 모니터링하였다. 분취량은 B29-보호된 인슐린이 충분히 반응하여 목적하는 B29-보호된, A1-프레임워크/리간드, 인슐린 접합체를 생성할 때까지 첨가하였다. 리간드-프레임워크는 종종 인슐린 보다 더 친수성이기 때문에, 목적하는 생성물의 출현은 B29-인슐린 (단계 1로부터의 것)에 비해 더 짧은 HPLC 체류 시간으로 뚜렷하게 이동되어 신호를 나타낸다. 목적하는 수준의 반응이 달성되면, 반응 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액으로 10배 초희석한 후 pH를 연한 HCl로 최종 pH 8.0으로 조정하였다. 수용액을 먼저 목적하는 접합 및 비접합 물질의 분리를 위해 적절한 고체상을 이용한 크기 배제에 의해 정제하였다. 이어서 칼럼 공간 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막을 이용하여 대략 10 ml로 농축시켰다. 이 용액을 추가로 정제용 역상 HPLC를 이용하여 워터스 C8, 7 ㎛, 19 x 150 mm 칼럼 상에서 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1％ TFA를 함유하는 탈이온수이고, 완충제 B는 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 정제하기 전에, 칼럼을 워터스 델트라프레프 600 시스템을 이용하여 80％A/20％B 이동상으로 15 ml/분으로 평형화하였다. 대략 5 ml의 조 용액을 2 분 동안 15 ml/분의 유속으로 칼럼에 주입하고, 이후 다음 5 분 동안 80％A/20％B → 75％A/25％B의 선형 구배를 이용한 후, 다음 22 분 동안은 75％A/25％B → 62％A/38％B의 더 느린 선형 구배를 이용하였다. 목적하는 피크의 체류 시간은 사용한 인슐린, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집되면, 용액을 회전증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 순수한 1보호된 인슐린 접합체를 수득하였다.
단계 4
모든 사례에서, 후속하여 인슐린 접합체로부터 보호기를 제거하였다. 단계 1에서 BOC 보호기를 사용한 경우, BOC 기는 실시예 3에 따라 수득한 동결건조된 분말을 90％ TFA/10％ 아니솔에 1 시간 동안 4℃에서 용해시켜 제거하고, 이후 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에서 10배 초희석하였다. (BOC 이외의 보호기가 아민-보유 약물 상에 존재하는 경우, TFA/아니솔 대신 적절한 탈보호 조건을 이용한다. 보호제 및 탈보호 조건 목록은 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에서 찾아볼 수 있다 (정의 섹션에 기재되어 있음).) pH는 NaOH 용액을 이용하여 7.0 내지 8.0으로 조정하고, 이후 물질을 바이오겔 P2 칼럼을 통해 통과시켜 아니솔, BOC 및 기타 저 MW 탈보호 부산물, 뿐만 아니라 임의의 다른 오염 염을 제거하였다. 이어서 탈보호되고 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘(Amicon) 3K 막 (밀리포어, 메사추세츠주 빌레리카 소재)을 이용하여 대략 66U 인슐린/ml (A280 측정치 기준)로 농축시키고, 필요시까지 4℃에서 보관하였다. 최종 접합체의 정체는 LC-MS (HT 래보러토리즈, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 확인하였다. 접합체의 A1 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티컬(Western Analytical), 미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 확인하였고, 리간드-함유 프레임워크에 의한 GlyA1의 치환으로 인해 Phe-B1-쇄 말단이 95％를 초과하여 존재하며, GlyA1-쇄 말단은 5％ 미만으로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
당업자는 실시예 75에서 기재한 것과 유사한 절차를 이용하여 그 밖의 아민-관능화된 약물을 리간드-함유 프레임워크에 접합시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 실시예 75가 야생형 인슐린 뿐만 아니라, 본원에서 기재하는 인슐린 돌연변이체에도 적절함을 인식할 것이다.
하기 인슐린 접합체는 보호 시약으로서 BOC-NHS를 사용하여 실시예 75의 절차에 따라 제조하였다.
Figure 112014006288597-pat00142
하기 인슐린 접합체는 실시예 75의 절차에 따라 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인슐린 접합체는 보호 시약으로서 BOC-NHS를 사용하여 제조하였다.
Figure 112014006288597-pat00143
실시예 76 - A1,B29-치환된 인슐린 접합체를 생성하기 위한 유기 용매 중에서의 다가 활성화된 에스테르와의 인슐린 접합 (처음 첨가되는 약물) - 일반적인 절차
단계 1
N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 2.5 ml의 무수 DMSO 중에 147 mM로 용해시킨 후, 1.0 mL (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 용액을 10 분 동안 실온에서 신속하게 교반하였다. 또 다른 바이알에서, 적절한 부피의 무수 DMSO 중의 272 mM 리간드 용액을 제조하였다. 일단 용해되면, 최초 활성화된 에스테르 기의 수, N, -1의 3배와 동일한 다수의 반응 당량이 생성되도록 충분한 용액을 첨가하였다. 예를 들어, 프레임워크 당 N=3 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(3-1)x60 mM/370 mM)=0.973 ml의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 당 N=4 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(4-1)x60 mM/370 mM)=1.46 ml의 리간드 용액을 첨가하는 등이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 용액을 1 시간 더 실온에서 교반하여 반응이 완료되게 하였다.
단계 2
인슐린을 1.5 mL의 100 mM 탄산나트륨 완충제 (pH 11) 중에 17.2 mM의 농도로 용해시켰다. 필요에 따라 0.1 M NaOH를 첨가하여 용액 pH를 약 11로 유지시켰다. 인슐린이 용해되면, 작은 분취량의 프레임워크-리간드 용액을 인슐린 용액에 첨가하였다. 과정 전반에 걸쳐 pH를 모니터링하고, 0.1 M 수산화나트륨을 첨가하는 것을 통해 10.2-11.0으로 유지시켰다. 반응은 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. HPLC 크로마토그램이, 실질적으로 모든 비변형된 인슐린이 반응하였고, 실질적인 분량의 반응 혼합물이 작은 분량의 1반응된 인슐린/프레임워크/리간드 접합체로 전환되었으며 주요 생성물이 2반응된 인슐린/프레임워크/리간드 접합체임을 나타낼 때까지, 프레임워크-리간드 용액의 분취량을 첨가하였다. 전형적으로, 프레임워크-리간드 구축물은 비변형된 인슐린에 비해 더 친수성일 것이어서, 1 및 2반응된 아민-보유 약물 생성물이 비변형된 인슐린의 그것보다 더 짧은 HPLC 체류 시간에 용리될 것이다. 마찬가지로, 목적하는 생성물, 2치환된 인슐린 접합체의 HPLC 피크는 1치환된 인슐린 접합체의 그것보다 더 짧은 체류 시간에 출현할 것이다.
단계 3
인슐린이 단계 2에서 기재한 바와 같이 프레임워크 리간드와 충분히 반응하였으면, 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액으로 10배 초희석한 후 pH를 연한 HCl로 최종 pH 8.0으로 조정하였다. 수용액을 먼저 목적하는 접합 및 비접합 물질의 분리를 위해 적절한 고체상을 이용한 크기 배제에 의해 정제하였다. 이어서 칼럼 공간 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막을 이용하여 대략 10 ml로 농축시켰다. 이 용액을 추가로 정제용 역상 HPLC를 이용하여 워터스 C8, 7 ㎛, 19 x 150 mm 칼럼 상에서 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1％ TFA를 함유하는 탈이온수이고, 완충제 B는 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 정제하기 전에, 칼럼을 워터스 델트라프레프 600 시스템을 이용하여 80％A/20％B 이동상으로 15 ml/분으로 평형화하였다. 대략 5 ml의 조 용액을 2 분 동안 15 ml/분의 유속으로 칼럼에 주입하고, 이후 다음 5 분 동안 80％A/20％B → 75％A/25％B의 선형 구배를 이용한 후, 다음 22 분 동안은 75％A/25％B → 62％A/38％B의 더 느린 선형 구배를 이용하였다. 목적하는 피크의 체류 시간은 사용한 인슐린, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집되면, 용액을 회전증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 순수한 접합체를 수득하였다. 최종 접합체의 정체는 LC-MS (HT 래보러토리즈, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 확인하였다. 접합체의 A1,B29 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티컬, 미주리주 세인트 루이스 소재)으로 확인하였고, 리간드-함유 프레임워크에 의한 GlyA1의 치환으로 인해 Phe-B1-쇄 말단이 95％를 초과하여 존재하며, GlyA1-쇄 말단은 5％ 미만으로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
당업자는 실시예 76에서 기재한 것과 유사한 절차를 이용하여 그 밖의 아민-관능화된 약물을 리간드-함유 프레임워크에 접합시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 실시예 76이 야생형 인슐린 뿐만 아니라, 본원에서 기재하는 인슐린 돌연변이체에도 적절함을 인식할 것이다.
하기 인슐린 접합체를 실시예 76의 절차에 따라 제조하였다.
Figure 112014006288597-pat00144
하기 인슐린 접합체는 실시예 76의 절차에 따라 제조할 수 있다.
Figure 112014006288597-pat00145
실시예 77 - A1,B1-치환된 인슐린 접합체를 생성하기 위한 유기 용매 중에서의 다가 활성화된 에스테르와의 인슐린 접합 (처음 첨가되는 약물)
단계 1
N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 2.5 ml의 무수 DMSO 중에 147 mM로 용해시킨 후, 1.0 mL (과량)의 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하였다. 용액을 10 분 동안 실온에서 신속하게 교반하였다. 또 다른 바이알에서, 적절한 부피의 무수 DMSO 중의 272 mM 리간드 용액을 제조하였다. 일단 용해되면, 최초 활성화된 에스테르 기의 수, N, -1의 3배와 동일한 다수의 반응 당량이 생성되도록 충분한 용액을 첨가하였다. 예를 들어, 프레임워크 당 N=3 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(3-1)x60 mM/370 mM)=0.973 ml의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 당 N=4 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(4-1)x60 mM/370 mM)=1.46 ml의 리간드 용액을 첨가하는 등이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 용액을 1 시간 더 실온에서 교반하여 반응이 완료되게 하였다.
단계 2
가장 높은 pKa 아민 기 (예를 들어, LysB29)에서 1관능성 보호기-활성화된 에스테르 (예를 들어, BOC-NHS)에 의해 미리 1보호된, 각각 구분되는 pKa (예를 들어, 야생형 인슐린의 경우, pKa GlyA1 = 8.0, PheB1 = 6.7, LysεB29 = 11.2; 문헌 [Mei et al., Pharm. Res. 16:1680-1686, 1999] 참조)를 갖는 3개의 반응성 아민 기를 함유하는 인슐린을 1.5 mL의 DMSO 중에 17.2 mM의 농도로 용해시켰다. B29-BOC-인슐린을 용해시키고, 작은 분취량의 프레임워크-리간드 용액을 B29-BOC-인슐린 용액에 첨가하였다. 반응은 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. HPLC 크로마토그램이, 실질적으로 모든 B29-BOC-인슐린이 반응하였고, 실질적인 분량의 반응 혼합물이 작은 분량의 1반응된 B29-BOC-인슐린/프레임워크/리간드 접합체로 전환되었으며 주요 생성물이 2반응된 B29-BOC-인슐린/프레임워크/리간드 접합체임을 나타낼 때까지, 프레임워크-리간드 용액의 분취량을 첨가하였다. 전형적으로, 프레임워크-리간드 구축물은 B29-BOC-인슐린에 비해 더 친수성일 것이어서, 1접합 및 2접합된 B29-BOC-인슐린 접합체가 비변형된 B29-BOC-인슐린의 그것보다 더 짧은 HPLC 체류 시간에 용리될 것이다. 마찬가지로, 목적하는 생성물, 2치환된 B29-BOC-인슐린 접합체의 HPLC 피크는 1치환된 B29-BOC-인슐린 접합체의 그것보다 더 짧은 체류 시간에 출현할 것이다.
단계 3
B29-BOC-인슐린이 단계 2에서 기재한 바와 같이 리간드-함유 프레임워크와 충분히 반응하였으면, 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액으로 10배 초희석한 후 pH를 연한 HCl로 최종 pH 8.0으로 조정하였다. 수용액을 먼저 목적하는 접합 및 비접합 물질의 분리를 위해 적절한 고체상을 이용한 크기 배제에 의해 정제하였다. 이어서 칼럼 공간 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막을 이용하여 대략 10 ml로 농축시켰다. 이 용액을 추가로 정제용 역상 HPLC를 이용하여 워터스 C8, 7 ㎛, 19 x 150 mm 칼럼 상에서 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1％ TFA를 함유하는 탈이온수이고, 완충제 B는 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 정제하기 전에, 칼럼을 워터스 델트라프레프 600 시스템을 이용하여 80％A/20％B 이동상으로 15 ml/분으로 평형화하였다. 대략 5 ml의 조 용액을 2 분 동안 15 ml/분의 유속으로 칼럼에 주입하고, 이후 다음 5 분 동안 80％A/20％B → 75％A/25％B의 선형 구배를 이용한 후, 다음 22 분 동안은 75％A/25％B → 62％A/38％B의 더 느린 선형 구배를 이용하였다. 목적하는 피크의 체류 시간은 사용한 인슐린, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집되면, 용액을 회전증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 순수한 접합체를 수득하였다.
단계 4
모든 사례에서, 후속하여 접합체로부터 보호기를 제거하였다. 단계 1에서 BOC 보호기를 사용한 경우, BOC 기는 실시예 3에 따라 수득한 동결건조된 분말을 90％ TFA/10％ 아니솔에 1 시간 동안 4℃에서 용해시켜 제거하고, 이후 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에서 10배 초희석하였다. (BOC 이외의 보호기가 아민-보유 약물 상에 존재하는 경우, TFA/아니솔 대신 적절한 탈보호 조건을 이용한다. 보호제 및 탈보호 조건 목록은 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에서 찾아볼 수 있다 (정의 섹션에 기재되어 있음).) pH는 NaOH 용액을 이용하여 7.0 내지 8.0으로 조정하고, 이후 물질을 바이오겔 P2 칼럼을 통해 통과시켜 아니솔, BOC 및 기타 저 MW 탈보호 부산물, 뿐만 아니라 임의의 다른 오염 염을 제거하였다. 이어서 탈보호되고 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 메사추세츠주 빌레리카 소재)을 이용하여 대략 66U 인슐린/ml (A280 측정치 기준)로 농축시키고, 필요시까지 4℃에서 보관하였다. 최종 접합체의 정체는 LC-MS (HT 래보러토리즈, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 확인하였다. 접합체의 A1, B1 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티컬, 미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 확인하였고, 리간드-함유 프레임워크에 의한 양 말단에서의 치환으로 인해 Phe-B1-쇄 말단이 본질적으로 존재하지 않으며, Gly-A1-쇄 말단이 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다.
당업자는 실시예 77에서 기재한 것과 유사한 절차를 이용하여 그 밖의 아민-관능화된 약물을 리간드-함유 프레임워크에 접합시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 실시예 77이 야생형 인슐린 뿐만 아니라, 본원에서 기재하는 인슐린 돌연변이체에도 적절함을 인식할 것이다.
접합체 II-5는 보호 시약으로서 BOC-NHS를 이용하여 실시예 77의 절차에 따라 제조하였다.
Figure 112014006288597-pat00146
하기 인슐린 접합체는 실시예 77의 절차에 따라 제조할 수 있다.
Figure 112014006288597-pat00147
실시예 78 - B1,B29-치환된 인슐린 접합체를 생성하기 위한 유기 용매 중에서의 다가 활성화된 에스테르와의 인슐린 접합 (처음 첨가되는 약물)
단계 1
N-말단 활성화된 에스테르를 함유하는 프레임워크를 2.5 ml의 무수 DMSO 중에 147 mM로 용해시켰다. 상기 실시예와 대조적으로 염기는 첨가하지 않았다. 용액을 10 분 동안 실온에서 신속하게 교반하였다. 또 다른 바이알에서, 적절한 부피의 무수 DMSO 중의 272 mM 리간드 용액을 제조하였다. 일단 용해되면, 최초 활성화된 에스테르 기의 수, N, -1의 3배와 동일한 다수의 반응 당량이 생성되도록 충분한 용액을 첨가하였다. 예를 들어, 프레임워크 당 N=3 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(3-1)x60 mM/370 mM)=0.973 ml의 리간드 용액을 첨가한다. 프레임워크 당 N=4 최초 활성화된 에스테르 기가 존재하는 경우, (3x(4-1)x60 mM/370 mM)=1.46 ml의 리간드 용액을 첨가하는 등이다. 리간드 용액을 첨가한 후, 용액을 1 시간 더 실온에서 교반하여 반응이 완료되게 하였다.
단계 2
중간 pKa를 갖는 아민 기 (예를 들어, 야생형 인슐린의 경우 GlyA1)에서 1관능성 보호기-활성화된 에스테르 (예를 들어, BOC-NHS)에 의해 미리 1보호된, 각각 구분되는 pKa (예를 들어, 야생형 인슐린의 경우, pKa GlyA1 = 8.0, PheB1 = 6.7, LysεB29 = 11.2; 문헌 [Mei et al., Pharm. Res. 16:1680-1686, 1999] 참조)를 갖는 3개의 반응성 아민 기를 함유하는 인슐린을 1.5 mL의 DMSO 중에 17.2 mM의 농도로 용해시켰다. (A1-BOC-인슐린은 실시예 8의 절차를 이용하여 제조하되, A1,B29-디BOC-인슐린, A1-BOC-인슐린, 및 B29-BOC-인슐린 생성물의 분포를 생성하기 위해 더 적은 당량의 BOC 시약과 반응시킬 수 있다. A1-BOC-인슐린은 RP-HPLC로 단리할 수 있고, N-말단 서열분석으로 확인할 수 있다.) A1-BOC-인슐린이 용해되면, 작은 분취량의 프레임워크-리간드 용액을 A1-BOC-인슐린 용액에 첨가하였다. 반응은 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. HPLC 크로마토그램이, 실질적으로 모든 비변형된 A1-BOC-인슐린이 반응하였고, 실질적인 분량의 반응 혼합물이 작은 분량의 1접합된 A1-BOC-인슐린/프레임워크/리간드 접합체로 전환되었으며 주요 생성물이 2접합된 A1-BOC-인슐린/프레임워크/리간드 접합체임을 나타낼 때까지, 프레임워크-리간드 용액의 분취량을 첨가하였다. 전형적으로, 프레임워크-리간드 구축물은 A1-BOC-인슐린에 비해 더 친수성일 것이어서, 1 및 2치환된 A1-BOC-인슐린 접합체가 비변형된 A1-BOC-인슐린의 그것보다 더 짧은 HPLC 체류 시간에 용리될 것이다. 마찬가지로, 목적하는 생성물, 2-치환된 A1-BOC-인슐린 접합체의 HPLC 피크는 1치환된 A1-BOC-인슐린 접합체의 그것보다 더 짧은 체류 시간에 출현할 것이다.
단계 3
A1-BOC-인슐린이 단계 2에서 기재한 바와 같이 프레임워크 리간드와 충분히 반응하였으면, 용액을 0.150 M NaCl을 함유하는 20 mM pH 5.0 HEPES 완충 염수 용액으로 10배 초희석한 후 pH를 연한 HCl로 최종 pH 8.0으로 조정하였다. 수용액을 먼저 목적하는 접합 및 비접합 물질의 분리를 위해 적절한 고체상을 이용한 크기 배제에 의해 정제하였다. 이어서 칼럼 공간 부피를 통과한 용액을 적절한 크기의 한외여과 막을 이용하여 대략 10 ml로 농축시켰다. 이 용액을 추가로 정제용 역상 HPLC를 이용하여 워터스 C8, 7 ㎛, 19 x 150 mm 칼럼 상에서 정제하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 완충제 A는 0.1％ TFA를 함유하는 탈이온수이고, 완충제 B는 0.1％ TFA를 함유하는 아세토니트릴이다. 정제하기 전에, 칼럼을 워터스 델트라프레프 600 시스템을 이용하여 80％A/20％B 이동상으로 15 ml/분으로 평형화하였다. 대략 5 ml의 조 용액을 2 분 동안 15 ml/분의 유속으로 칼럼에 주입하고, 이후 다음 5 분 동안 80％A/20％B → 75％A/25％B의 선형 구배를 이용한 후, 다음 22 분 동안은 75％A/25％B → 62％A/38％B의 더 느린 선형 구배를 이용하였다. 목적하는 피크의 체류 시간은 사용한 약물, 프레임워크 및 리간드에 따라 달라질 것이다. 일단 수집되면, 용액을 회전증발시켜 아세토니트릴을 제거하고, 동결건조시켜 순수한 접합체를 수득하였다.
단계 4
모든 사례에서, 후속하여 접합체로부터 보호기를 제거하였다. 단계 1에서 BOC 보호기를 사용한 경우, BOC 기는 실시예 3에 따라 수득한 동결건조된 분말을 90％ TFA/10％ 아니솔에 1 시간 동안 4℃에서 용해시켜 제거하였다. BOC 이외의 보호기가 아민-보유 약물 상에 존재하는 경우, TFA/아니솔 대신 적절한 탈보호 조건을 이용한다. 보호제 및 탈보호 조건 목록은 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에서 찾아볼 수 있다 (정의 섹션에 기재되어 있음). 탈보호 단계에 이어, 0.150 M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES pH 8.2 완충제 중에서 10배 초희석하였다. pH는 NaOH 용액을 이용하여 7.0 내지 8.0으로 조정하고, 이후 물질을 바이오겔 P2 칼럼을 통해 통과시켜 아니솔, BOC 및 기타 저 MW 탈보호 부산물, 뿐만 아니라 임의의 다른 오염 염을 제거하였다. 이어서 탈보호되고 정제된 수성 접합체 용액을 아미콘 3K 막 (밀리포어, 메사추세츠주 빌레리카 소재)을 이용하여 대략 66U 인슐린/ml (A280 측정치 기준)로 농축시키고, 필요시까지 4℃에서 보관하였다. 최종 접합체의 정체는 LC-MS (HT 래보러토리즈, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 확인하였다. 접합체의 B1 부위는 N-말단 서열분석 (웨스턴 애널리티컬, 미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 확인하였고, 리간드-함유 프레임워크에 의한 Phe-B1의 치환으로 인해 Gly-A1-쇄 말단이 95％를 초과하여 존재하며, Phe-B1-쇄 말단은 5％ 미만으로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
당업자는 실시예 78에서 기재한 것과 유사한 절차를 이용하여 그 밖의 아민-관능화된 약물을 리간드-함유 프레임워크에 접합시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 실시예 78이 야생형 인슐린 뿐만 아니라, 본원에서 기재하는 인슐린 돌연변이체에도 적절함을 인식할 것이다.
하기 인슐린 접합체를 실시예 78의 절차에 따라 제조할 수 있다.
Figure 112014006288597-pat00148
실시예 79 - 생체내 반감기/제거 속도 비교
I-6 접합체가 글루코스 또는 a-MM과 같은 억제성 당의 존재 또는 부재하에서 생체내에서 혈청으로부터 소실되는 속도를 결정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 각각의 사례에서, 가용성 접합체 (또는 대조군으로서 RHI)를 이중으로 경정맥 삽관한 수컷 스프라그-돌리 래트 (타코닉, JV/JV, 350-400 g, n=3)에 0.4 mg 접합체/체중 kg으로 투약하였다.
상승된 글루코스 수준의 존재하에서의 제거 속도를 결정하기 위해, 실험을 시작하기 1 시간 전에 하나의 래트 캐뉼라를 멸균 50％ w/v 글루코스 용액을 함유하는 주사기 주입 펌프에 연결하였다. 펌프 주입 속도는 동물의 혈당 수준이 실험 동안 모든 시점에서 300 mg/dL을 초과하여 유지되도록 실험자가 조정하였다. 혈당은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 전형적인 실험법으로, 동물에서 300 mg/dL을 초과하여 유지시키는데 요구되는 주입 펌프 속도가 전형적으로 85 ㎕/분을 초과하는 것으로 확인되었다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 제2 래트 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 헤파린-염수로 캐뉼라 라인을 추가로 플러싱한 후에, 제2 캐뉼라를 사용하여 투약 후 t = 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하였다.
a-MM의 존재하에서의 제거 속도를 결정하기 위해, 실험을 시작하기 1 시간 전에 하나의 래트 캐뉼라를 멸균 25％ w/v a-MM 용액을 함유하는 주사기 주입 펌프에 연결하였다. 펌프 주입 속도는 실험자가 조정하였지만, 전형적으로 85 ㎕/분으로 설정하였다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 제2 래트 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 헤파린-염수로 캐뉼라 라인을 추가로 플러싱한 후에, 제2 캐뉼라를 사용하여 투약 후 t = 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하였다.
실험 전반에 걸쳐, 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하고, 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 또는 혈청 접합체 농도를 측정하였다. 인슐린 또는 접합체 혈청 농도 대 시간 데이터를 2구획 모델에 따라 2개의 독립적인 소멸 지수의 합 (C(t) = a exp(-kat) + b exp(-kbt))으로 최적으로 적합시켰고, 여기서 t1/2(a) = (ln 2)/ka이고 t1/2(b) = (ln 2)/kb이다. 결과를 도 46에 나타내었다. 좌측 패널은 a-MM 또는 글루코스의 부재하에서 I-6 접합체 대 RHI의 제거 속도가 현저하게 높음 (> 5x)을 보여준다. 우측 패널은 글루코스의 존재하에서 (G400 주입) 제거 속도가 다소 감소하며 (약 50％), a-MM의 존재하에서 (a-MM 주입) 매우 실질적으로 감소함 (약 400％)을 보여준다.
실시예 80 - I-6 i.v. 주입의 경우 글루코스 -반응성 PK
본 실시예에서는, 실시예 79에서 기재한 i.v. 제거 속도 실험을 0.4 mg 접합체/체중 kg의 단일 i.v. 볼루스에서 연속 i.v. 주입으로 변형하였다. 본 실험의 목표는 6 시간 동안 접합체 (또는 대조군으로서 RHI)의 주입 속도를 일정하게 유지시켜 (글루코스의 i.p. 주사는 4 시간 시점에 투여함) 혈청 접합체 (또는 RHI) 농도에 대한 효과를 결정하는 것이었다. 각 실험에서 이중으로 경정맥 삽관한 수컷 스프라그-돌리 래트 (타코닉, JV/JV, 350-400 g, n=3)를 사용하여, 하나의 경정맥 라인은 접합체 또는 RHI 주입용으로, 다른 것은 혈액 수집용으로 사용하였다.
RHI의 경우, 0.2 ㎛ 여과 막을 통해 50 mU/ml 용액을 멸균 여과하고, 0.07 ml/분으로 주입하여 전체 6 시간의 실험 동안 3.5 mU/분의 일정한 주입 속도를 제공하였다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 일정한 i.v. 주입을 개시하였다. 제2 캐뉼라를 사용하여 t = 30, 60, 120, 180 및 240 분에 혈액 샘플을 수집하였다. t = 240 분에, i.p. 주사를 통해 4 g/kg 용량의 글루코스를 투여한 후, t = 255, 270, 300, 330 및 360 분에 혈액을 수집하였다.
I-6 접합체의 경우, 0.2 ㎛ 여과 막을 통해 150 mU/ml 용액을 멸균 여과하고, 0.10 ml/분으로 주입하여 전체 6 시간 실험 동안 15 mU/분의 일정한 주입 속도를 제공하였다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 일정한 i.v. 주입을 개시하였다. 제2 캐뉼라를 사용하여 t = 30, 60, 120, 180 및 240 분에 혈액 샘플을 수집하였다. t = 240 분에, i.p. 주사를 통해 1, 2, 또는 4 g/kg 용량의 글루코스를 투여한 후, t = 255, 270, 300, 330 및 360 분에 혈액을 수집하였다.
실험 전반에 걸쳐, 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하고, 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 또는 혈청 접합체 농도를 측정하였다.
도 47의 첫번째 2개의 패널은 4 g/kg i.p. 글루코스 주사 전후에 RHI를 3.5 mU/분 주입한 경우 및 I-6을 15 mU/분 주입한 경우의 혈당 및 혈청 인슐린/접합체 농도 프로파일을 비교한 것이다. RHI 주입은 I-6 주입과 비교하여 글루코스 주사 이전에 상당한 저혈당증을 야기하였다. i.p. 글루코스 주사 이후에, I-6의 측정된 혈청 인슐린 농도는 혈당 농도가 증가함에 따라 즉시 300％를 초과하여 증가되었고, 이후 글루코스 농도가 감소됨에 따라 신속하게 기준선 수준으로 되돌아갔다. 한편, 동일한 실험 조건하에서 RHI의 경우에는, i.p. 글루코스 주사 이후에 측정된 혈청 인슐린 농도에서 어떤 현저한 변화도 없었다. 도 47의 다음 3개의 패널은 i.p. 글루코스 주사 동안 측정된 인슐린 농도의 증가 정도가 투여한 글루코스 용량 및 결과적인 혈당 수준과 직접적인 관련이 있음을 보여준다. 예를 들어, 혈청 인슐린 농도에서 기준선 변화 대비 단지 50％ 피크가 1 g/kg 글루코스를 주사한 경우에 관찰된 반면, 기준선 변화 대비 300％ 피크가 4 g/kg 용량의 경우에 관찰되었다.
실시예 81 - 당 존재 및 부존재하에서의 인슐린 접합체의 생체내 제거 속도
I-9 접합체가 글루코스 또는 a-MM과 같은 억제성 당의 존재 또는 부재하에서 생체내에서 혈청으로부터 소실되는 속도를 결정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 각각의 사례에서, 가용성 접합체 (또는 대조군으로서 RHI)를 이중으로 경정맥 삽관한 수컷 스프라그-돌리 래트 (타코닉, JV/JV, 350-400 g, n=3)에 0.4 mg 접합체/체중 kg으로 투약하였다.
상승된 글루코스 수준의 존재하에서의 제거 속도를 결정하기 위해, 실험을 시작하기 1 시간 전에 하나의 래트 캐뉼라를 멸균 50％ w/v 글루코스 용액을 함유하는 주사기 주입 펌프에 연결하였다. 펌프 주입 속도는 동물의 혈당 수준이 실험 동안 모든 시점에서 300 mg/dL을 초과하여 유지되도록 실험자가 조정하였다. 혈당은 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 측정하였다. 전형적인 실험법으로, 동물에서 300 mg/dL을 초과하여 유지시키는데 요구되는 주입 펌프 속도가 전형적으로 85 ㎕/분을 초과하는 것으로 확인되었다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 제2 래트 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 헤파린-염수로 캐뉼라 라인을 추가로 플러싱한 후에, 제2 캐뉼라를 사용하여 투약 후 t = 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하였다.
a-MM의 존재하에서의 제거 속도를 결정하기 위해, 실험을 시작하기 1 시간 전에 하나의 래트 캐뉼라를 멸균 25％ w/v a-MM 용액을 함유하는 주사기 주입 펌프에 연결하였다. 펌프 주입 속도는 실험자가 조정하였지만, 전형적으로 85 ㎕/분으로 설정하였다. 혈액 샘플을 t = 0 분에 채취하고, 그 후에 멸균 접합체 용액 또는 대조군 인슐린을 제2 래트 캐뉼라를 통해 정맥내 주사하고, 그 직후에 헤파린-염수의 추적 용액을 주사하여 모든 접합체 용량이 확실하게 동물에 투여되도록 하였다. 헤파린-염수로 캐뉼라 라인을 추가로 플러싱한 후에, 제2 캐뉼라를 사용하여 투약 후 t = 1, 2, 4, 8, 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 혈액 샘플을 수집하였다.
실험 전반에 걸쳐, 시판하는 시험띠 (프리시젼 엑스트라, 애보트 래보러토리즈, 일리노이주 애보트 파크 소재)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 각 시점으로부터의 혈액을 4℃에서 원심분리하여 혈청을 수집하고, 이어서 시판하는 ELISA 키트 (Iso-인슐린 ELISA, 메르코디아, 스웨덴 웁살라 소재)를 이용하여 혈청 인슐린 또는 혈청 접합체 농도를 측정하였다. 인슐린 또는 접합체 혈청 농도 대 시간 데이터를 2구획 모델에 따라 2개의 독립적인 소멸 지수의 합 (C(t) = a exp(-kat) + b exp(-kbt))으로 최적으로 적합시켰고, 여기서 t1/2(a) = (ln 2)/ka이고 t1/2(b) = (ln 2)/kb이다. 도 48의 첫번째 패널은 비변형된 인슐린의 제거 속도가 당 (글루코스 G400 또는 a-MM)의 존재에 영향을 받지 않음을 보여준다. 비교를 위해, 접합체 I-6을 당과 함께 주입한 것을 나타내는 도 48의 마지막 패널을 실시예 79의 결과로부터 재플롯팅하였다. 접합체 I-9를 당과 함께 주입한 것을 나타내는 도 48의 가운데 패널은 글루코스 (G400 주입)의 존재하에서 제거 속도가 I-6 접합체에 비해 훨씬 더 확연하게 감소됨을 보여준다 (약 350％ 대 약 50％). 접합체 I-9는 또한 a-MM (a-MM 주입)의 존재하에서 제거 속도가 I-6 접합체에 비해 보다 현저하게 감소됨을 보여준다 (약 700％ 대 약 400％).
실시예 82 - 소형 돼지에서의 메카니즘 확인 및 글루코스 -반응성 성능
상기에서 기재한 글루코스-반응성 인슐린 접합체 결과들이 래트를 넘어서서 다른 종으로 확대될 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 본원에서 "미니피그"라고도 칭하는 인간 대신의, 비-당뇨병 수컷 소형 돼지 (유카탄(Yucatan) 계통)에서 당-의존적 생체내 제거 속도를 조사하는데 초점을 맞추었다. 먼저 당-의존적 제거 속도에 대한 당 친화성 및 다원자가의 효과를 결정하기 위해 도 49에서 요약한 하위세트의 인슐린 접합체를 시험하였다. 접합체는 I-7, I-6, I-11, 및 II-2로서 도 45에 나타내었다. 본 연구에 사용된 모든 접합체는 실시예 20에 기재된 일반적인 방법에 따라 합성하였다. A1,B29-2치환된 AETM-2 인슐린 접합체 II-2를 생성하기 위해, B29-1치환된 AETM-2 인슐린 접합체 (I-6) 합성과 비교하여 인슐린 분자 당 대략 10 배 양의 다가 활성 에스테르 프레임워크 및 AETM 리간드를 사용하였다.
각 실험에서, 인슐린 접합체를 비-당뇨병, 이중-혈관 접근 포트를 갖는 미니피그에 0.1 U/kg으로 i.v. 투약하고, 주사후 빈번한 시간 간격으로 혈액을 수집하였다. 글루코스 존재하에서의 혈청 제거 속도를 결정하기 위해, 인슐린 접합체를 투여하기 1 시간 전에 주사기 펌프를 이용하여 하나의 포트로 멸균 50％ w/v 글루코스 용액을 i.v. 주입하고, 실험 전반에 걸쳐 동물의 혈당 수준이 400 mg/dl 또는 그 가까이 유지되도록 속도를 조정하였다 (전형적으로 80-150 ml/h). a-MM의 존재하에서의 혈청 제거 속도를 결정하기 위해, 글루코스 용액을 멸균 25％ w/v a-MM 용액으로 대체하고, 펌프 주입 속도는 실험 전반에 걸쳐 80 ml/h로 일정하게 유지시켰다. 각 사례에서, 생성된 인슐린 접합체 농도 대 시간 데이터를 2구획 모델에 따라 2개의 독립적인 소멸 지수의 합 (C(t) = α exp(-kαt) + β exp(-kβt))으로 적합시켰다.
400 mg/dl에서, 고 수준의 내인성 글루코스-유도된 돼지 인슐린이 본 발명자들의 인슐린 접합체 면역검정과 교차 반응하였다. 이에 따라, 글루코스 주입 실험으로부터의 PK 결과에서 특히 데이터의 "잡음" 세트를 야기하는 돼지 인슐린-단독 검정으로부터 수득한 값을 차감할 것이 요구된다. a-MM는 내인성 돼지 인슐린 분비를 유도하지 않기 때문에, a-MM 주입 연구로부터의 데이터를 인슐린 접합체 반감기에서의 당-반응성 변화의 기본 지표로서 사용하였다. 흥미롭게도, 돼지에서 AETM-2 인슐린 접합체 (I-6)는 a-MM의 존재하에서 t1 /2이 단지 중등도의 1.7x 증가를 나타내었고, 이는 래트에서의 4.Ox 증가와 비교되었다 (도 56). 그러나, 돼지에서 A1,B29-2치환된 AETM-2 인슐린 접합체 (II-2)는 a-MM의 존재하에서 t1 /2이 거의 10 배 증가된 것으로 나타났다 (도 50 및 51). 표로 도식한 다른 접합체들에 대한 결과를 도 57에 나타낸다.
a-MM의 존재하에서 2치환된 AETM-2 인슐린 접합체 (II-2)의 i.v. 용량에 대한 글루코스 강하 곡선 상의 영역은 당이 부재할 때보다 대략 2.6x 더 컸다 (도 52). 도 59는 RHI, I-6, 및 II-2 (2치환된 AETM-2 인슐린 접합체), 및 II-3 사이의 생물활성에서의 차이를 비교한 것이다. 모든 3종의 인슐린 접합체는 고 친화성 AETM 당 리간드를 함유하였다. 이러한 선택된 인슐린 접합체 세트에서, 당 의존적 반감기 및 생물활성 사이에는 어떤 관련도 없었다.
접합체 II-2를 가용성 용액으로서 비-당뇨병 정상혈당 및 알록산 당뇨병, 고혈당 미니피그 둘 모두에 0.25, 0.50, 및 1.00 U/kg 용량으로 피하 주사하여, 비-당뇨병 동물에서 저혈당증을 유도하지 않으면서 당뇨병에서 글루코스를 강하시키는 능력을 결정하였다. 인슐린 접합체는 당뇨병자의 혈당 수준에서, 저혈당증이 전혀 없이 현저한 용량 의존적 감소를 나타내거나, 또는 비-당뇨병자에서 글루코스-강하 징조를 나타내었다 (도 53). 비교해보면, 0.063 및 0.125 U/kg으로 주사한 RHI는 당뇨병 동물에서 뚜렷한 저혈당증을 유도함과 함께 현저하게 글루코스를 강하시켰고, 비-당뇨병 동물에서는 현저한 글루코스 강하 및 저혈당증을 유도하였다 (도 54). 이러한 예비 결과에 기초하여, 가용성 인슐린 접합체 II-2를 대략 0.5 U/kg으로 단일 주사하면 당뇨병 미니피그에서 6-8 시간 동안 저혈당증이 없는 글루코스 조절이 제공되었다. 피하 주사된 II-2의 혈청 제거 속도를 당뇨병 및 정상 미니피그에서 결정하였다 (도 58). 모든 용량에서 유사한 PK 프로파일이 당뇨병 및 정상 사이에서 관찰되었다.
종합하면, 이러한 초기 결과는 내인성 렉틴-기반 메카니즘이 미니피그에 존재하며, 당 친화성 및 다원자가의 선택을 통해 이용될 수 있음을 보여준다. 고 친화성 및 다원자가를 갖는 인슐린 접합체는 래트와 비교하여 미니피그에서 개선된, 저혈당증이 없는 혈당 조절을 제공하는 것으로 보인다.
실시예 83 - 소형 돼지에서의 최적화 연구
도 49에서의 II-2 대 다른 접합체의 성능상 극명한 차이에 기초하여, 당 친화성 및 원자가의 효과로부터 인슐린 접합 부위 (A1 대 B29)의 효과를 구분하고 측량하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명자들은 도 49의 인슐린 접합체를 생성하는데 사용된 것과 유사한 접합 기술을 사용하여, 도 55에 열거된 인슐린 접합체 집합 (도 45에 I-12, I-13, I-14, I-15, II-1, II-3, 및 II-4로 나타냄), 뿐만 아니라 도 60에 나타낸 대조군 화합물을 합성하였다. 본 연구에서 사용된 모든 2치환된 접합체는 실시예 20에 기재한 일반적인 방법에 따라 합성하였다. A1,B29-2치환된 인슐린 접합체를 생성하기 위해, B29-1치환된 인슐린 접합체 합성과 비교하여 인슐린 분자 당 대략 10 배 양의 다가 활성 에스테르 프레임워크 및 당 친화성 리간드를 사용하였다. 또한 A1 단독 치환된 물질은 실시예 20에 기재된 일반적인 방법에 따라 제조하였다. 그러나 이 사례에서는, 디-tert-부틸-디카르보네이트 당량 수의 1/2을 사용하여 실시예 8에 기재된 BOC 보호 합성으로부터 단리한 B29-1-BOC 보호된 인슐린을 사용하였다. 일단 정제되면, 실시예 12에 기재된 TFA/아니솔 방법을 이용하여 접합체로부터 BOC 기를 제거하였다.
일반적으로, 이들 인슐린 접합체 각각의 당-반응성 반감기 및 글루코스-강하 효과는 다음과 같이 결정하였다. 상기에서 기재한 바와 같이, 각각의 인슐린 접합체를 비-당뇨병, 이중-혈관 접근 포트를 갖는 미니피그에 0.1 U/kg으로 i.v. 투약하고, 주사후 빈번한 시간 간격으로 혈액을 수집하였다. a-MM의 존재하에서의 혈청 제거 속도를 결정하기 위해, 인슐린 접합체를 투여하기 1 시간 전에 주사기 펌프를 이용하여 하나의 포트로 멸균 25％ w/v a-MM 용액을 i.v. 주입하고 (80 ml/h), 실험 전반에 걸쳐 속도를 일정하게 유지시켰다. 각 사례에서, 생성된 인슐린 접합체 농도 대 시간 데이터를 2구획 모델에 따라 2개의 독립적인 소멸 지수의 합 (C(t) = α exp(-kαt) + β exp(-kβt))으로 적합시켰다. a-MM을 주입한 경우 및 주입하지 않은 경우의 β-기 제거 속도를 비교하여 적합한 접합체를 확인하였다.
도 61은 다양한 인슐린 접합체를 미니피그에 i.v. 주사한 경우의 글루코스 수준을 비교한 것을 나타낸다. 접합체 I-12 (AETM-2에 의한 A1 치환)는 접합체 I-6 (AETM-2에 의한 B29 치환)에 비해 글루코스 강하에 있어서 약간 더 효과적이었다. A1 위치에서 폴리에틸렌 옥시드로 접합체 I-6을 치환시켜 접합체 C3을 생성한 것은 전반적인 생물활성을 감소시켰지만, a-MM 유도된 생물활성은 증가시키지 않았다. A1 위치에서 또 다른 TSAT-C6-AETM-2 스캐폴드로 접합체 I-6을 치환시켜 접합체 II-2를 생성한 것은 전반적인 생물활성을 감소시켰지만, a-MM 유도된 생물활성은 증가시켰다.
도 62는 다양한 A1,B29 2치환된 인슐린 접합체를 미니피그에 i.v. 주사한 경우의 글루코스 수준을 비교한 것을 나타낸다. 인슐린의 아세틸 (접합체 C7) 또는 PEO (접합체 C4) 기에 의한 A1,B29 2치환은 전반적인 생물활성을 실질적으로 감소시키지 않았다. 또한, C7 및 C4 접합체는 구별가능한 a-MM-유도된 생물활성 효과를 나타내지 않았다. 접합체 II-3은 접합체 C7 및 C4에 비해 실질적으로 감소된 생물활성을 가졌지만, 그의 생물활성은 a-MM의 존재하에서 사실상 복원되었다.
다른 실시양태
본 발명의 다른 실시양태는 본원에서 개시하는 본 발명의 상세한 설명 및 실시를 고려할때 당업자에게 분명할 것이다. 상세한 설명 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 본 발명의 실질적인 범주 및 취지는 하기하는 특허청구범위에 의해 나타내어지는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Lancaster, Thomas M. Zion, Todd C. <120> Insulin-Conjugates <130> 2005700-0040 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

Claims (21)

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  18. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 포함하는 접합체.
    <화학식 I-1>
    Figure 112015089741403-pat00278

    <화학식 I-2>
    Figure 112015089741403-pat00279

    <화학식 I-3>
    Figure 112015089741403-pat00280

    <화학식 I-4>
    Figure 112015089741403-pat00281

    <화학식 I-5>
    Figure 112015089741403-pat00282

    <화학식 I-6>
    Figure 112015089741403-pat00283

    <화학식 I-7>
    Figure 112015089741403-pat00284

    <화학식 I-8>
    Figure 112015089741403-pat00285

    <화학식 I-9>
    Figure 112015089741403-pat00286

    <화학식 I-10>
    Figure 112015089741403-pat00287

    <화학식 I-11>
    Figure 112015089741403-pat00288

    <화학식 I-12>
    Figure 112015089741403-pat00289

    <화학식 I-13>
    Figure 112015089741403-pat00290

    <화학식 I-14>
    Figure 112015089741403-pat00291

    <화학식 I-15>
    Figure 112015089741403-pat00292

    <화학식 I-16>
    Figure 112015089741403-pat00293

    <화학식 I-17>
    Figure 112015089741403-pat00294

    <화학식 II-1>
    Figure 112015089741403-pat00295

    <화학식 II-2>
    Figure 112015089741403-pat00296

    <화학식 II-3>
    Figure 112015089741403-pat00297

    <화학식 II-4>
    Figure 112015089741403-pat00298

    <화학식 II-5>
    Figure 112015089741403-pat00299

    <화학식 II-6>
    Figure 112015089741403-pat00300

    <화학식 II-7>
    Figure 112015089741403-pat00301
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