JP2012516338A - 結合部位が修飾されたレクチンおよびその使用 - Google Patents

結合部位が修飾されたレクチンおよびその使用 Download PDF

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Abstract

一態様において、本開示により、グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンと、コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートとを含む架橋物質体であって、該レクチンは、共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含み、該リガンドは、グルコースと、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関して競合し得、該２つ以上の親和性リガンドは、グルコースと、前記結合部位での該レクチンとの結合に関して競合し、異なるコンジュゲート上の該レクチンと親和性リガンド間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、架橋物質体を提供する。このような物質体は、所望のグルコース濃度に応答した量の該コンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および／または検出可能な標識を含むものであり得る。

Description

政府実施許諾権
米国政府は、本発明において支払い済みの実施許諾を有し、米国国立衛生研究所によって与えられたＤＫ０７９４８２およびＤＫ０８０５６５の条件によって示される合理的な条件で他者に実施許諾を行なうことを特許権所有者に要求する権利を限定された状況において有する。
関連出願
本出願は、２００９年１月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／１４７，８７８号、２００９年３月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／１５９，６４３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，１０７号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０５３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０５８号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，１０５号、２００９年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／１６３，０８４号、２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／２１９，８９７号、２００９年７月７日に出願された米国特許仮出願第６１／２２３，５７２号、および２００９年１０月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／２５２，８５７号に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
先行技術（例えば、Ｓｅａｒｓに対する米国特許第４，１４５，４１０号、これには、酵素的に不安定なカプセル剤からの薬物放出が記載されている）において知られた「制御放出」薬物送達系の大部分は、薬物を、ヒト体内に存在する分子インジケータ（例えば、代謝産物）の量に正比例する間隔および濃度で放出することができない。したがって、このような先行技術の系での薬物の送達または放出は、文字通りの「制御された」ものでなく、外的または内的要因とは無関係の単なる低速放出である。
インスリン注射による真性糖尿病の処置は、インスリンの制御されていない低速放出が望ましくない場合の周知の充分研究された一例である。実際、ホルモンの単純な補充は、この疾患と関連する病的続発症の予防に充分でないことが明らかである。このような続発症の発生は、患者体内での血中グルコースの濃度変動に合わせて外因性インスリンを提供できていないことを反映していると考えられる。この問題を解決するため、より生理学的なインスリン送達系を開発するためのいくつかの生物学的なバイオエンジニアリングアプローチが提案されている（例えば、Ｂｒｏｗｎｌｅｅらに対する米国特許第４，３４８，３８７号；Ｔａｙｌｏｒらに対する米国特許第５，８３０，５０６号、同第５，９０２，６０３号、および同第６，４１０，０５３号、ならびにＺｉｏｎに対する米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９号を参照のこと）。
Ｚｉｏｎの系の一部の特定の実施形態では、多価のグルコース結合分子を、グリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートと合わせる。このグリコシル化ポリマーは多数の糖結合基を含み、グルコース結合分子の存在下で不溶のヒドロゲルまたは粒子を形成する。このゲルは、グルコース濃度の増大に応答してグリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートを放出するＺｉｏｎの系では、例示的な多価グルコース結合分子としてレクチンコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）の使用が示されている。残念ながら、Ｃｏｎ Ａおよびその他の容易に入手可能なレクチンの多くは、リンパ球の増殖を刺激する可能性を有する。特定の型のリンパ球の表面上の炭水化物受容体に結合することにより、このようないわゆる「マイトジェン」レクチンは、リンパ球の有糸分裂を誘発し、それによりリンパ球の増殖を引き起こし得る可能性がある。Ｃｏｎ Ａを含むほとんどのマイトジェンレクチンは、選択的Ｔ細胞マイトジェンである。いくつかのレクチンは選択性が低く、Ｔ細胞とＢ細胞の両方を刺激する。マイトジェンレクチンに対する局所的または全身的インビボ曝露により、炎症、細胞傷害、マクロファージ消化、およびアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）がもたらされ得る。また、植物レクチンは、特に免疫原性であり、高力価の抗レクチン特異的抗体の生成をもたらすことがわかっている。したがって、マイトジェンレクチンは、その放出が抑制されるように充分配慮しない限り、天然形態ではインビボでの方法およびデバイスに使用できないことが認識されよう。例えば、米国特許第５，８３０，５０６号において、Ｔａｙｌｏｒは、Ｃｏｎ Ａの使用に関わる毒性リスクを明らかにし、グルコースとインスリン分子がデバイス内外で自由に拡散することも同時に求められる薬物送達デバイスにＣｏｎ Ａを含めることの重要性と困難さを強調している。
レクチンのこれらおよび他のインビボ使用に関わるリスクと困難さは、Ｚｉｏｎの系内で、有用なグルコース濃度に応答する架橋剤としての機能を果たすレクチンの能力を妨げることなく、そのマイトジェン活性を低減させる方法が存在していれば、回避され得る。
一態様において、本開示により、グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンと、コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートとを含む架橋物質体であって、該レクチンは、共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含み、該リガンドは、グルコースと、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関して競合し得、該２つ以上の親和性リガンドは、グルコースと、前記結合部位での該レクチンとの結合に関して競合し、異なるコンジュゲート上の該レクチンと親和性リガンド間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、架橋物質体を提供する。このような物質体は、所望のグルコース濃度に応答した量の該コンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および／または検出可能な標識を含むものであり得る。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。また、本開示により、このような物質体の使用方法およびこのような物質体の作製方法を提供する。別の態様では、本開示により、天然レクチン（Ｃｏｎ Ａなど）の代わりにグルコース応答性物質体に使用するための例示的な化学修飾レクチンを提供する。
定義
本明細書全体を通して用いる具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本発明の解釈上、化学元素は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版の内表紙記載の元素周期表（ＣＡＳ版）に従って特定されるものであり、具体的な官能基は上記文献に概ね定義されている。さらに、有機化学の一般原則ならびに具体的な官能性部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、，１９９９；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７に記載されている。
アシル−本明細書で用いる場合、用語「アシル」は、一般式−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸ１）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸ１）２、および−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸ１）、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＳＲＸ１、および−Ｃ（＝ＮＲＸ１）Ｎ（ＲＸ１）２（式中、ＲＸ１は水素；ハロゲン；置換もしくは非置換のヒドロキシル；置換もしくは非置換のチオール；置換もしくは非置換のアミノ；置換もしくは非置換のアシル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐の脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のヘテロ脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルキル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルケニル；置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ−もしくはジ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジヘテロ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ−もしくはジヘテロアルキルアミノ、モノ−もしくはジアリールアミノ、またはモノ−もしくはジヘテロアリールアミノであるか；または２つのＲＸ１基が一緒になって５〜６員の複素環式の環を形成している）を有する基をいう。例示的なアシル基としては、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメート、および尿素が挙げられる。アシル置換基としては、限定されないが、安定な部分（例えば、脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環式、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、これらは各々、さらに置換されていてもよく、そうでなくてもよい）の形成をもたらす本明細書に記載の任意の置換基が挙げられる。
脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、直鎖（すなわち、非分岐）、分岐または環式（「炭素環式」）であり得、完全飽和であってもよく、または１つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、脂肪族基は１〜１２個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含むものであり、また他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含む。好適な脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにそのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられる。
アルケニル−本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている一価の基を表す。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜６個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜５個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜４個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルケニル基は２〜３個の炭素原子を含む。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。
アルキル−本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含む脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素原子団をいう。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキル基は１〜５個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキル基は１〜４個の炭素原子を含む。さらに他の実施形態では、アルキル基は１〜３個の炭素原子を含む。また別の実施形態では、アルキル基は１〜２個の炭素を含む。アルキル原子団の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシルなどが挙げられる。
アルキニル−本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される任意選択で置換されている一価の基をいう。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜６個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜５個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜４個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキニル基は２〜３個の炭素原子を含む。代表的なアルキニル基としては、限定されないが、エチニル、２−プロピニル（プロパギル）、１−プロピニルなどが挙げられる。
アリール−本明細書で用いる場合、単独または、「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」などのより大きな部分の一部として使用される用語「アリール」は、合計５〜１０個の環構成員を有し、系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、系内の各環は３〜７個の環構成員を含む、任意選択で置換されている単環式および二環式の環系をいう。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に用いていることがあり得る。本発明の一部の特定の実施形態では、「アリール」は、限定されないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが挙げられ、１つ以上の置換基を有していてもよい芳香族環系をいう。
アリールアルキル−本明細書で用いる場合、用語「アリールアルキル」は、アリール基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基）で置換されているアルキル基をいう。
二価の炭化水素鎖−本明細書で用いる場合、用語「二価の炭化水素鎖」（「二価のアルキレン基」ともいう）は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）Ｚ−であり、式中、ｚは、１〜３０、１〜２０、１〜１２、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３の正の整数である。好適な置換基としては、置換されている脂肪族基について後述するものが挙げられる。
カルボニル−本明細書で用いる場合、用語「カルボニル」は、炭素−酸素二重結合を含む一価または二価の部分をいう。カルボニル基の非限定的な例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネート、およびクロロホルメートが挙げられる。
脂環式−本明細書で用いる場合、用語「脂環式」、「炭素環」、または「炭素環式」は、単独またはより大きな部分の一部として使用され、３〜１０員を有する本明細書に記載の、任意選択で置換されている飽和または部分不飽和の、環式の脂肪族の単環式または二環式の環系をいう。脂環式基としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、およびシクロオクタジエニルが挙げられる。一部の実施形態では、シクロアルキルは３〜６個の炭素を有する。
ハロゲン−本明細書で用いる場合、用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ，−Ｆ）、塩素（クロロ，−Ｃｌ）、臭素（ブロモ，−Ｂｒ）、およびヨウ素（ヨード，−Ｉ）から選択される原子をいう。
ヘテロ脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」は、炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有し、直鎖（すなわち、非分岐）であっても、分岐であっても環式（「複素環式」）であってもよく、完全飽和であってもよく、１つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、ヘテロ脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含み、１〜３個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。一部の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含み、１〜２個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。また他の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含み、１個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。好適なヘテロ脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、およびヘテロアルキニル基が挙げられる。
ヘテロアラルキル−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロアリール部分は、独立して、任意選択で置換されている。
ヘテロアリール−本明細書で用いる場合、単独または、例えば、「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアラルコキシ」など、より大きな部分の一部として使用される用語「ヘテロアリール」は、５〜１０個の環内原子、好ましくは５、６または９個の環内原子を有し；環式アレイ内で共有される６、１０または１４個のπ原子を有し；炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する、任意選択で置換されている基をいう。ヘテロアリール基としては、限定されないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。また、用語「ヘテロアリール」および「ヘテロアル（ｈｅｔｅｒｏａｒ−）」には、本明細書で用いる場合、ヘテロ芳香族環が１つ以上のアリール、炭素環式または複素環式の環に縮合され、その結合原子団または結合点が該ヘテロ芳香族環上にある基が包含される。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、およびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」（これらの用語はいずれも任意選択で置換されている環を包含する）と互換的に用いることがある。
ヘテロ原子−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ原子」は窒素、酸素またはイオウをいい、窒素またはイオウの任意の酸化形態、および塩基性窒素の任意の第４級化形態を包含する。また、用語「窒素」は、置換されている窒素を包含する。
複素環式−本明細書で用いる場合、用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式の原子団」、および「複素環式の環」は互換的に用い、任意選択で置換されている、安定な５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて１つ以上の上記に定義したヘテロ原子を有するものをいう。複素環式の環は、その懸垂基に、安定な構造がもたらされる任意のヘテロ原子または炭素原子で結合され得、任意の環内原子は任意選択で置換されていてもよい。かかる飽和または部分不飽和の複素環式の原子団の例としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式の原子団」は、本明細書において互換的に用い、また、ヘテロシクリル環が１つ以上のアリール、ヘテロアリールまたは炭素環式の環（インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなど）に縮合されており、その結合原子団または結合点が該ヘテロシクリル環上にある基を包含する。ヘテロシクリル基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロシクリルアルキル」はヘテロシクリルで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロシクリル部分は、独立して、任意選択で置換されている。
不飽和−本明細書で用いる場合、用語「不飽和」は、ある部分が１つ以上の二重結合または三重結合を有することを意味する。
部分不飽和−本明細書で用いる場合、用語「部分不飽和」は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分をいう。用語「部分不飽和」は、多数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義したアリール部分またはヘテロアリール部分を含むことは意図しない。
任意選択で置換されている（置換されていてもよい）−本明細書に記載のように、本発明の化合物は、「任意選択で置換されている」部分を含んでいてもよい。一般に、用語「置換されている」は、前に用語「任意選択で」があってもなくても、表示された部分の１つ以上の水素が適当な置換基で置き換えられていることを意味する。特に記載のない限り、「任意選択で置換されている」基は、該基の各置換可能な位置に適当な置換基を有していてもよく、任意の所与の構造内の１つより多くの位置が、指定された群から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、該置換基は、１つ１つの位置において同じであるか、異なるかのいずれかであり得る。本発明で想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定な、または化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」は、本明細書で用いる場合、生成、検出、ならびに一部の特定の実施形態では回収、精製、および本明細書に開示した目的の１つ以上のための使用を可能にする条件に供されたときに、実質的に改変されない化合物をいう。
「任意選択で置換されている」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０−４Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＲ°；−Ｏ−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＣＨ（ＯＲｏ）２；−（ＣＨ２）０−４ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）０Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ°３；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）Ｒ°；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０−４ＳＲ−、−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＳＣ（Ｏ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ°；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°、−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（ＮＯＲ°）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４ＳＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｎ（０Ｒ°）Ｒ°；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ°２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｐ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ°）２；ＳｉＲ°３；−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２；または−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２であり、式中、各Ｒ°は、以下に定義するとおりに置換されていてもよく、独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−０（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義に関わらず、独立して存在する２つのＲ°が、その介在原子（１つもしくは複数）を一緒になって、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有し、以下に定義するとおりに置換されていてもよい、３〜１２員の飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式の環を形成している。
Ｒ°（または２つの独立して存在するＲ°がその介在原子と一緒になって形成される環）上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０−２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０−２ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＨ、−（ＣＨ２）０−２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＮＲ● ２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ● ３、−ＯＳｉＲ● ３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−０（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。Ｒ°の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、＝０および＝Ｓが挙げられる。
「任意選択で置換されている」基の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、以下のもの：＝０、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊ ２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）０Ｒ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝Ｎ０Ｒ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊ ２））２−３０−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊ ２））２−３Ｓ−が挙げられ、ここで、独立して存在するＲ＊は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。「任意選択で置換されている」基の置換可能なビシナル炭素に結合された好適な二価の置換基としては：−０（ＣＲ＊ ２）２−３Ｏ−（式中、独立して存在するＲ＊は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される）が挙げられる。
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基は、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ● ２、または−ＮＯ２（式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である）である。
「任意選択で置換されている」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、ＮＲ† ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ† ２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ† ２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（０）２Ｒ†が挙げられ；式中、各Ｒ†は、独立して、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、非置換の−ＯＰｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義に関わらず、独立して存在する２つのＲ†が、その介在原子（１つもしくは複数）と一緒になって、独立して窒素、酸素またはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の３〜１２員の飽和、部分不飽和またはアリールの単環式または二環式の環を形成している。
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ● ２、または−ＮＯ２（式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である）である。
好適な保護基−本明細書で用いる場合、用語「適当な保護基」は、化合物内の位置に応じたアミノ保護基またはヒドロキシル保護基をいい、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９９に詳細に記載されているものが挙げられる。
好適なアミノ保護基としては、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェンアシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルｙｌ）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバメート、チオカルバミン酸Ｓ−ベンジルカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（ｂｏｒｙｎｌ）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリメチルベンジルカルバメート、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン（ｐｙｒｏｏｌｉｎ）−３−イル）アミン、第４級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Νｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Νｐｙｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’、８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤΝＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、ならびにフェンアシルスルホンアミドが挙げられる。
好適なヒドロキシル保護基としては、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−Ａ０Ｍ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル，ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェンアシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾル−１−イル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシネート（ｓｕｃｃｉｎｏａｔｅ）、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ナイトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）が挙げられる。１，２−または１，３−ジオールを保護するには、保護基として、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４−ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリジンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環式のカーボネート、環式のボロネート、エチルボロネート、およびフェニルボロネートが挙げられる。
凝集された−２つ以上の細胞が本明細書に記載の架橋剤によって「凝集された」場合、該細胞は、各々、架橋剤と、細胞−薬剤−細胞複合体の状態で物理的に会合している。典型的には、凝集は、架橋剤の濃度が一旦閾値濃度に達したときしか起こらない。この濃度を最小凝集濃度（ＭＡＣ）と称する。所与の架橋剤のＭＡＣは、一般的には、溶液中での吸光度の変化を定量することができる分光測光プレートリーダーを用いて測定される。
会合している−本明細書で用いる場合、２つの存在体は、直接的な非共有結合性相互作用によって結合している場合、互いに物理的に「会合している」。望ましい非共有結合性相互作用としては、免疫グロブリン分子と該免疫グロブリンに特異的な抗原との間で生じる型のもの、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的会合の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に換算して表示され得、ここで、Ｋｄが小さいほど大きな親和性を表す。例えば、選択された架橋剤と標的分子との会合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量され得る。
生物分解性の−本明細書で用いる場合、用語「生物分解性の」は、生理学的条件下またはエンドソーム条件下で分解される（すなわち、その共有結合性の構造の少なくとも一部が失われる）分子をいう。生物分解性の分子は、必ずしも加水分解的に分解可能である必要はなく、分解に酵素の作用を必要としてもよい。
生体分子−本明細書で用いる場合、用語「生体分子」は、天然に存在するものであっても人工的に作出されたものであっても（例えば、合成もしくは組換えによる方法）、細胞内および組織内に一般的に見られる分子（例えば、ポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド類、代謝産物など）をいう。生体分子の具体的な類型としては、限定されないが、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子（増殖因子および化学走化性因子など）、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられる。
薬物−本明細書で用いる場合、用語「薬物」は、生物学的事象を改変するか、阻害するか、活性化させるか、あるいは影響を及ぼす小分子または生体分子をいう。例えば、薬物としては、限定されないが、抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑薬（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、精神安定薬、鎮痙薬、筋弛緩薬ならびに抗パーキンソン物質、鎮痙薬および筋肉収縮剤（ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔａｎｔ）（チャネル遮断薬、縮瞳薬および抗コリン作用薬など）、抗緑内障化合物、抗寄生虫および／または抗原虫化合物、細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節薬（細胞増殖阻害薬および抗接着分子など）、血管拡張剤、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の合成阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管形成因子、抗分泌因子、抗凝固薬および／または抗血栓剤、局所麻酔薬、眼科用薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病物質、制吐薬、ならびにイメージング剤が挙げられ得る。本発明における使用に適した例示的な薬物のより完全な列挙は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｘｅｌ ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ Ｅｎｇｅｌによる）、Ｔｈｉｅｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９９；「Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」、Ｓｕｓａｎ Ｂｕｄａｖａｒｉら編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６、およびＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．出版、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ、２００１を見るとよい。
超分岐−本明細書で用いる場合、「超分岐」構造は、少なくとも１つの分岐した分岐を含む共有結合性の構造（例えば、デンドリマー構造）である。超分岐構造は、ポリマー基礎構造および／または非ポリマー基礎構造を含むものであり得る。
レクチン−本明細書で用いる場合、「レクチン」は、糖質および多糖類に特異性を伴って結合するタンパク質である。レクチンは、任意の起源（例えば、植物、動物または他のもの）であり得る。一部の特定の実施形態では、レクチンは、天然供給源から単離されたものであり得る。他の実施形態では、レクチンは、合成または組換えにより作製されたものであり得る。レクチンは、生理学的条件下において１つ以上のサブユニットで構成されたものであり得る。好ましい実施形態では、レクチンは、生理学的条件下において２つ以上のサブユニット（例えば、４つのサブユニット）で構成されている。サブユニットは同じであっても異なっていてもよい。
マイトジェンレクチン−「マイトジェンレクチン」は、１名以上の健常患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたチミジン取込みアッセイによる測定時、Ｔ細胞の増殖を刺激するレクチンである。一般的に、マイトジェンレクチンは、１ｕｇ／ｍｌの濃度で検出可能なレベルのチミジン取込みをもたらす。例示的なマイトジェンレクチンとしては、限定されないが、ジャカリン（ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）凝集素（Ｊａｃａｌｉｎ）、ムラサキモクワンジュ（ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）凝集素（ＢＰＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、スクシニル−コンカナバリンＡ（ｓ−Ｃｏｎ Ａ）、サンゴシドウ（ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｏｒａｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）凝集素（ＥＣｏｒＡ）、セイヨウマユミ（ｅｕｏｎｙｍｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＥＥＡ）、ダイズ（ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬｃＨ）、イヌエンジュ（ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）凝集素（ＭＡＡ）、インゲンマメ（ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）凝集素（ＰＨＡ）、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）マイトジェン（ＰＷＭ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、およびソラマメ（ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）凝集素（ＶＦＡ）（これらはすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）が挙げられる。用語「マイトジェンレクチン」には、Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を保持している天然レクチンの誘導体（例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加を含む誘導体）が包含されることは理解されよう。例示的な誘導体は、アミノ酸残基が部位特異的変異誘発によって導入（ｉｎｔｏｒｏｄｕｃｅ）されたものである（例えば、化学修飾のためのさらなる反応性基を提供するため）。一般的に、好適な誘導体は、当該技術分野で既知の標準的な方法を用いて（例えば、デフォルト設定したＢｌａｓｔを用いて）測定したとき、天然レクチンと少なくとも９０％配列相同性を有するものである。好ましくは、該誘導体は、天然レクチンと少なくとも９５％配列相同性、より好ましくは９９％配列相同性を有する。限定されないが、例示的な誘導体は、その天然対応物の少なくとも９０％のレベルのＴ細胞増殖を誘導し得るものである。より好ましくは、該レベルは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。
天然レクチン−本明細書で用いる場合、「天然レクチン」は、天然に見られるレクチンの化学組成を有するタンパク質である。
パーセント相同性−本明細書で用いる場合、用語「パーセント相同性」は、本開示において定義する最適アラインメント後の２つの配列間の配列同一性の割合をいう。例えば、２つのヌクレオチド配列は、以下に論考するように一致が最大となるようにアラインメントしたときに該２つの配列内のヌクレオチドの配列が同じである場合、「同一」であるという。２つのヌクレオチド配列間の配列の比較は、典型的には、２つの最適にアラインメントされた配列の配列を、領域または「比較域」において比較し、配列が類似している領域を特定および比較することにより行なわれる。比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、このようなアルゴリズムのコンピュータでの実行、または目視検査によって行なわれ得る。
配列同一性の割合−「配列同一性の割合」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較域において比較することにより判定され、この場合、ヌクレオチド配列の比較域内の部分には、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較したとき、付加または欠失（すなわち、ギャップ）が含まれ得る。この割合は、両方の配列に同一のヌクレオチド残基が存在している位置の数を求め、マッチングした位置の数を得、マッチングした位置の数を比較域内の位置の総数で除算し、結果に１００を乗算して配列同一性の割合を得ることにより計算される。上記に示すこの配列同一性の定義は、当業者によって使用され得る定義である。この定義自体に、アルゴリズムの補助はなんら必要とされない。アルゴリズムは、配列同一性を計算するものではなく、配列の最適アラインメントを容易にするのに役立つものにすぎない。この定義から、２つの比較対象配列間の配列同一性には明確な１つだけの値が存在することになり、この値は、最適アラインメントで得られる値に対応する。
生理学的条件−本明細書で用いる場合、「生理学的条件」は、典型的な患者の動脈血において見られる条件である。一般的に、患者は哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、マウスなどである。ヒト患者において、生理学的条件下におけるｐＨは、典型的には約７．３５〜約７．４５（好ましくは約７．４０）である。ヒトの生理学的温度は約３６．４〜約３７．４Ｃの範囲（好ましくは約３６．９Ｃ）である。
ポリマー−本明細書で用いる場合、「ポリマー」または「ポリマー構造」は、共有結合された一連のモノマーを含む構造である。ポリマーは、１つの型のモノマーで構成されたものであってもよく、１種類より多くの型のモノマーで構成されたものであってもよい。したがって、用語「ポリマー」は、コポリマー（例えば、ポリマー全体において異なる型のモノマーが個々の集団で存在しているブロックコポリマー）を包含する。ポリマーは線状であっても分岐型であってもよい。
ポリヌクレオチド−本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドのポリマーである。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いていることがあり得る。該ポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的に修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、介在＜ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ＞塩基、修飾糖類（例えば、Ｔ−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）を含むものであり得る。
ポリペプチド−本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーである。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「オリゴペプチド」、および「ペプチド」は、互換的に用いていることがあり得る。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る化合物）および／または当該技術分野で知られているようなアミノ酸類似体を含むものであり得る。また、ポリペプチドのアミノ酸残基の１つ以上が、例えば、糖鎖基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学的存在体の付加によって修飾されていてもよい。このような修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組込みなどが挙げられ得る。
多糖−本明細書で用いる場合、「多糖」は、糖質のポリマーである。用語「多糖」、「糖鎖」、および「オリゴ糖」は、互換的に用いていることがあり得る。該ポリマーは、天然糖質（例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクツロース（ｏｃｔｏｌｏｓｅ）、およびシアロース（ｓｉａｌｏｓｅ））および／または修飾糖質（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、およびヘキソース）を含むものであり得る。例示的な二糖としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コージビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノース、およびキシロビオースが挙げられる。
小分子−本明細書で用いる場合、用語「小分子」は、天然に存在するものであろうと、人工的に作出されたものであろうと（例えば、化学合成によって）、比較的低い分子量を有する分子をいう。典型的には、小分子は単量体であり、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて局所性または全身性効果をもたらすという点で生物学的に活性なものである。一部の特定の好ましい実施形態では、小分子は薬物である。好ましくは（必ずしもそうでないが）、薬物は、適切な政府機関または行政団体によって、既に使用が安全かつ有効であるとみなされているものである。例えば、ＦＤＡによって２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§ ３３０．５，３３１〜３６１、および４４０〜４６０にリストアップされたヒトに使用するための薬物；ＦＤＡによって２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§ ５００〜５８９にリストアップされた獣医学的使用のための薬物はすべて、本発明による使用に許容され得るとみなす。
処置する−本明細書で用いる場合、用語「処置する」（または「処置すること」、「処置された」、「処置」など）は、病状（例えば、糖尿病）、病状の症状（１つまたは複数）（例えば、高血糖症）、病状に対する素因を軽減する、緩和する、改変する、改善する、好転させる、または影響を及ぼす目的で、処置を必要とする被検体への本開示の物質体の投与をいう。
図１は、（ａ）骨格としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した例示的なコンジュゲート、および（ｂ）実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンコンジュゲートで得られたＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較である。 図２は、ＰＢＳ緩衝液中のコンジュゲート１（□）、コンジュゲート２（△）、およびＲＨＩ（◆）に対する促進安定性試験（ＡＳＴ）での凝集アッセイである。コンジュゲートは、医薬等級のＲＨＩよりも大きく増強された安定性を示す。 図３（ａ）は、促進安定性試験（ＡＳＴ）での化学安定性の結果である。（ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣによるＡＳＴコンジュゲートの安定性。 図３（ｂ）は、促進安定性試験（ＡＳＴ）での化学安定性の結果である。（ｂ）ＡＳＴコンジュゲートに関するＬＣ／ＭＳデータ。 図４は、新鮮コンジュゲート（▲）および７２時間ＡＳＴコンジュゲート（○）の（ｎ＝４）非糖尿病の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにおけるインビボ生理活性である。７２時間ＡＳＴコンジュゲートの生理活性は、新鮮コンジュゲートのものと識別不能である（全時間点でｐ≧０．２１）。 図５は、約２０Ｕインスリン当量／ｋｇの用量で皮下注射された（▲）インスリン−デキストラン（７０Ｋ）の非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における血中グルコース抑制プロフィールである。 図６は、約２．５Ｕインスリン当量／ｋｇの用量で皮下注射された（■）インスリン−グリコゲン（ＩＩ型 牡蠣由来）の非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における血中グルコース抑制プロフィールである。 図７は、雄の非糖尿病ＳＤラットにおいて、３．５Ｕ当量のインスリン／ｋｇの皮下用量の（◆）ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートおよび（□）可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）で得られた血中グルコースレベルである。各データセットは、ｎ＝６ラットの平均および標準偏差を表す。 図８は、雄の非糖尿病ＳＤラットにおいて、３．５Ｕ当量のインスリン／ｋｇの皮下用量の（◆）ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートおよび（□）可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）で得られた血清インスリン濃度である。各データセットは、ｎ＝６ラットの平均および標準偏差を表す。 図９は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９−置換され）インスリンコンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンレベルおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。データは、ｎ＝３ラットの平均および標準偏差を表す。 図１０は、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよびＡＥＴＭの化学構造である。これらの糖類を主体とする親和性リガンドのＣｏｎ Ａに対する親和性は、図示のとおりに増大する。 図１１は、一部の例示的な非デンドリマーコンジュゲートの化学構造である。 図１２は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲート（◆）、可溶性組換えヒトインスリン、（○）およびインスリンリスプロ（△）（すべて３．５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。データは、ｎ＝６ラットの平均および標準偏差を表す。 図１３は、図示のとおりの異なる親和性リガンドを有するＴＳＡＴ−Ｃ６系インスリンコンジュゲートでの、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（各製剤に対してｎ＝３）時間点０における血中グルコースレベルのプロットである。血糖降下性応答は、親和性リガンドの親和性が増大するにつれて、減少する。 図１４は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２コンジュゲート（３．５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（ｎ＝３）時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。 図１５は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−２コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（ｎ＝３）時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。 図１６は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−１ ＡＥＴＭ−１コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（ｎ＝３）時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。 図１７は、種々の親和性リガンドで修飾したレクチンの最小凝集濃度（ＭＡＣ）の比較である。 図１８は、（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−２−インスリン／ＤＥＭ−光親和性修飾Ｃｏｎ Ａ）グルコース応答性物質体での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。 図１８は、（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２−インスリン／ＤＥＭ−光親和性修飾Ｃｏｎ Ａ）グルコース応答性物質体での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。 図２０は、（◆）ブタ血清、（■）ヒト血清、（▲）ラット血清、および（ラ）１ラＰＢＳ緩衝液の存在下、３７℃で６時間のインキュベーション後の、グルコース濃度の関数としての、不溶性のままであるグルコース応答性インスリン−グリコゲン系物質体の量である。 図２１は、比色分析シグナル（Ａ４０５）の生成によって測定したときの、（ａ）アミラーゼ活性（４−ニトロフェニルα−Ｄ−ペンタ−（ｌ→４）−グルコピラノシドレポーター）および（ｂ）グルコシダーゼ活性（４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシドレポーター）の、ブタ（実線）、ラット（長い点線）およびヒト（短い点線）の血清の１：８希釈物（ＰＢＳ中）の消化活性である。 図２２は、左：グルコース濃度に応じて１時間沈殿させた後の撮影画像、右：該コンジュゲートと修飾レクチンを１時間混合した後、グルコース濃度に応じて４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）によって測定した、各ウェルによって遮断された光の量のプロットである。 図２３は、（◆）ブタ血清、（■）ヒト血清、（▲）ラット血清、および（ラ）１ラＰＢＳ緩衝液の存在下、３７℃で６時間のインキュベーション後の、グルコース濃度の関数としての、残留不溶物として不溶性のままとなるように構築された（例示的なインスリンコンジュゲートを使用）グルコース応答性物質体の量である。 図２４は、（ａ）例示的なコンジュゲートＸとＡＣＡで構築したグルコース応答性物質体を非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。（ｂ）＊で示した１２０分の時点で投与したグルコースのｉ．ｐ．注射に応答した時間に応じて、例示的なコンジュゲートＸとＡＣＡで構築した（◆）グルコース応答性物質体および（○）内因性ラット膵臓インスリンの血清インスリンプロットである。各データセットは、ｎ＝３ラットの平均および標準偏差を表す。 図２５は、組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。 図２６は、ｎ＝４の非糖尿病ラットにおける、例示的なグルコース応答性物質体（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２−インスリン／ＡＣＡ）の皮下注射後の、グルコースクランプ試験による（υ）血清インスリンおよび（□）血中グルコース濃度のプロットである。注射後、グルコースのｉ．ｖ．注入を用いてグルコースレベルを１００ｍｇ／ｄｌに１２０分間維持した後、グルコースレベルを４００ｍｇ／ｄｌまで直線的に漸増させ、最後の１２０分間は４００ｍｇ／ｄｌに維持した。データは、ｎ＝４ラットの平均および標準偏差を示す。 図２７は、ｎ＝４の非糖尿病ブタにおける、例示的なグルコース応答性物質体（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２−インスリン／ＡＣＡ）の皮下注射後の、グルコースクランプ試験による（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコース濃度のプロットである。注射後、グルコースのｉ．ｖ．注入を用いてグルコースレベルを６５ｍｇ／ｄｌに１２０分間維持した後、グルコースレベルを４００ｍｇ／ｄｌまで直線的に漸増させ、最後の１２０分間は４００ｍｇ／ｄｌに維持した。データは、ｎ＝４ブタの平均および標準偏差を示す。 図２８は、グルコースに対する結合部位３０を少なくとも２つ有する多価レクチン２０であって、グルコースと、前記結合部位３０の少なくとも１つに対する結合に関して競合し得る共有結合された親和性リガンド４０を少なくとも１つ含むレクチン２０の模式図である。 図２９は、図２８の多価レクチン２０（簡単にするため、グルコースと、前記結合部位３０の少なくとも１つに対する結合に関して競合し得る少なくとも１つの共有結合された親和性リガンド４０は、図２９の主模式図には示していない）と、コンジュゲート枠組構造７０に結合された個別の親和性リガンド６０を２つ以上含むコンジュゲート５０とを含む架橋物質体であって、２つ以上の親和性リガンド６０は、グルコースと、前記結合部位３０でのレクチン２０との結合に関して競合し、異なるコンジュゲート５０上のレクチン２０と親和性リガンド６０間の非共有結合性相互作用の結果、物質体１０内でコンジュゲート５０が架橋される、架橋物質体１０の模式図である。 図３０は、野生型ヒトインスリンの構造である。
種々の実施形態の詳細説明
本出願書類では、特許文献および非特許文献を含むいくつかの文献に言及している。これらの各文献は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
一態様において、ならびに図２８および２９に示すように、本開示により、グルコースに対する結合部位３０を少なくとも２つ有する多価レクチン２０と、コンジュゲート枠組構造７０に結合された個別の親和性リガンド６０を２つ以上含むコンジュゲート５０とを含む架橋物質体１０であって、レクチン２０は、共有結合された親和性リガンド４０を少なくとも１つ含み、該リガンドは、グルコースと、前記結合部位３０の少なくとも１つに対する結合に関して競合し得、該２つ以上の親和性リガンド６０は、グルコースと、前記結合部位３０でのレクチン２０との結合に関して競合し、異なるコンジュゲート５０上のレクチン２０と親和性リガンド６０間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体１０内でコンジュゲート５０が架橋される、架橋物質体１０を提供する。このような物質体は、所望のグルコース濃度に応答した量の該コンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および／または検出可能な標識を含むものであり得る。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドはコンジュゲートの枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。また、本開示により、このような物質体の使用方法およびこのような物質体の作製方法を提供する。別の態様では、本開示により、天然レクチン（Ｃｏｎ Ａなど）の代わりにグルコース応答性物質体に使用するための例示的な化学修飾レクチンを提供する。
本開示のレクチンはグルコースに結合し、多価である。該コンジュゲートは、個別の親和性リガンドを２つ以上有するコンジュゲート枠組構造を含み、該リガンドは、グルコースと、レクチンとの結合に関して競合する。レクチンとコンジュゲートを、グルコースの非存在下で合わせた場合、非共有結合性の架橋物質体が形成される。該物質体を遊離グルコースの存在下に入れると、これらは、レクチンと該コンジュゲート間の相互作用に関して競合する。遊離グルコースがある一定濃度より多くなると、コンジュゲートが放出されることにより、該物質体が分解され始めるような競合レベルになる。その結果、コンジュゲートは該物質体から、グルコースの局所濃度に直接関連する様式で放出される。
多価レクチン
本開示の架橋物質体のレクチンは、グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ含む（すなわち、多価である）。また、該レクチンは、このような結合部位の１つと会合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含む。種々の実施形態において、レクチンは、共有結合された親和性リガンドを１つしか含まないものであり得る。種々の実施形態において、該レクチンは、結合部位１つあたり１つの共有結合された親和性リガンドを含むものであり得る。典型的には、多価レクチンは２つまたは４つの結合部位を含むもの（例えば、一価のレクチンの二量体または四量体）であるが、本開示はまた、３つ、５つまたはそれ以上の結合部位を有するレクチンも包含する。また、本開示は、結合部位１つあたり１つより多くの共有結合された親和性リガンドを有するレクチンも包含する。さらに、本開示は、異なる数の共有結合された親和性リガンドを含むレクチン、および／または未修飾レクチンを含むレクチンの混合物を含む物質体を包含する。
レクチン
本開示の方法は、任意のレクチンに適用され得る。レクチンは、さまざまな天然供給源、例えば、種子、根、樹皮、真菌、細菌、海草、海綿、軟体類、魚卵、無脊椎動物および下等脊椎動物の体液、ならびに哺乳動物細胞膜から単離されている（例えば、Ｔｈｅ Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｉｅｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６を参照のこと）。また、いくつかのレクチンが組換え産生されている（例えば、ＳｔｒｅｉｃｈｅｒおよびＳｈａｒｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６３：４７−７７、２００３ならびに米国特許公開公報第２００６０２４７１５４号を参照のこと）。上記のように、レクチンは糖質および多糖類に、高い特異性度合で結合する。例えば、一部のレクチンはマンノース残基またはグルコース残基のみに結合するが、別の一部のものは、ガラクトース残基のみを認識する。一部のレクチンは、特定の残基が末端位置に存在することを要するが、別の一部のものは、多糖鎖内部の残基に結合する。一部のレクチンは特定のアノマー構造を必要とし、また別のものは、特定の糖鎖配列を認識する。レクチンの構造および性質は文献に広く記載されている。最近の概説およびレクチンの一覧については、Ｌｅｃｔｉｎｓ、ＳｈａｒｏｎおよびＬｉｓ編、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００３；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ編，Ｗｉｌｅｙ、２０００；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅら編、Ｗｉｌｅｙ、１９９８を参照のこと。例示的なグルコース結合レクチンとしては、カルネキシン、カルレチクリン、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、セレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、コレクチン（マンノース結合レクチン）、マンノース受容体、アグリカン、バーシカン、エンドウ（ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、ソラマメレクチン、レンズマメレクチン、ダイズレクチン、ピーナッツレクチン、ヒゲレンリソウ（ｌａｔｈｙｒｕｓ ｏｃｈｒｕｓ）レクチン、イガマメ（ｓａｉｎｆｏｉｎ）レクチン、エンジュ（ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）レクチン、ｂｏｗｒｉｎｇｉａ ｍｉｌｂｒａｅｄｉｉ由来レクチン、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、およびヤマゴボウマイトジェンが挙げられる。種々の実施形態において、植物レクチンのヒト類似体が使用され得る。このようなものとしては、限定されないが、ヒトマンナン結合タンパク質（ＭＢＰ、マンナン結合レクチンとも称される、Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１：７８９−７９４（１９９４）；Ｄｕｍｅｓｔｒｅ−Ｐｅｒａｒｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３９：４６５−４７３（２００２））、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ、Ａｌｌｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６７：４５６３−４５６９（１９９９））、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ、Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５：５７５５−５７６０（１９９０））、ＣＬ−４３（ヒト血清タンパク質）、ならびにコングルチニンが挙げられる。
多価架橋剤の作製
一部のレクチンは、例えば、生理学的条件下で多量体が形成される結果、多価となる。また、多価レクチンは、２つ以上の一価のレクチンを共有結合または非共有結合により連結し、単一の構築物にすることにより作製されるものであってもよい。典型的には、２つ以上のレクチン（同じ配列を有するものであっても異なる配列を有するものであってもよい）は、互いに直接連結され得るか（例えば、カップリング剤によって）、または枠組構造を介して間接的に連結され得る。種々の実施形態において、２、３、４個またはそれ以上の一価のレクチンが単一の構築物に結合され得る。種々の実施形態において、該２、３、４個またはそれ以上の一価のレクチンは、同じ配列を有するものであり得る。このようなアプローチのいずれか１つにおいて、カップリング前に、レクチンを化学修飾することが必要な場合があり得る（例えば、反応性懸垂基を含めるため）ことは認識されよう。また、本開示の多価架橋剤は、特定のカップリング反応または枠組構造に限定されない（例えば、該多価架橋剤は、ポリマー構造および／または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製されるものであってもよい）ことも認識されよう。さらに、枠組構造は線状、分岐、樹枝状および／またはこれらの組合せであり得ることが認識されよう。例示的な枠組構造およびカップリング化学反応を、以下に、該コンジュゲートとの関連において記載する。
種々の実施形態において、一価のレクチンが互いに、または枠組構造に共有結合される。かかる実施形態において、該レクチンは、直接連結されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、またはスペーサー（例えば、該レクチン同士、または該レクチンと枠組構造との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に連結されていてもよい。以下に、該コンジュゲートとの関連において論考するように、該レクチンは互いに、または枠組構造に、任意の数の化学結合、例えば限定されないが、アミド、エステル、エーテル、イソ尿素およびイミン結合によって共有結合され得ることは理解されよう。
種々の実施形態において、２つ以上の一価のレクチンが互いに、または枠組構造に非共有結合され得る。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、レクチンは互いに、または枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が一方のレクチンに共有結合され、該ペアの他方の構成員が他方のレクチンまたは枠組構造に共有結合される。レクチン（またはレクチンと枠組構造）を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、レクチンが互いに（または枠組構造に）非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎら、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載のものなどのエピトープタグとのペアによるモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
親和性リガンド
一度レクチンに共有結合されたら、該レクチンの結合部位と会合し得るものであれば、いかなる親和性リガンドでも使用され得る。典型的には、親和性リガンドは認識エレメントを含み、認識エレメントは、一旦結合部位内に結合したら、レクチン結合部位および反応性リンカー（これは、親和性リガンドがレクチンに共有結合されるのを可能にする）と相互作用する。
認識エレメント
レクチンのコグネートリガンド（例えば、Ｃｏｎ Ａの場合は、グルコースまたはマンノース）との結合に関して競合し得る任意の認識エレメントが本開示の親和性リガンドに使用され得る。種々の実施形態において、認識エレメントは糖質を含むものである。一部の特定の実施形態では、糖質は天然糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、キシロースなど）である。一部の特定の実施形態では、糖質は、修飾糖質（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ヘキソースなど）である。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは、グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはこれらの高次の組合せ（例えば、ビマンノース、線状および／または分岐のトリマンノースなど）である。他の例示的な糖質は当業者に認識されよう。特に、適用用途に応じて、該コンジュゲートの親和性リガンドとの関連において後述する糖質のいずれか１つ（例えば、式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂの糖質のいずれか１つ）が使用され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは単糖を含むものである。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは二糖を含むものである。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは三糖を含むものである。一部の実施形態では、認識エレメントは糖質と１つ以上のアミン基を含むものである。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態では、認識エレメントはＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。
種々の実施形態において、認識エレメントは、多糖、糖ペプチドまたは糖脂質を含むものである。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは、２〜１０個の糖質部分、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の該部分を含む。多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および／または内部残基は、対象のレクチンの糖特異性に基づいて選択され得る（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３１７：５００−５０４、１９７３およびＬｉｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３５−６７、１９８６を参照のこと）。
当該技術分野でよく知られているように、特定の多糖類は、合成により調製され得る（例えば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１９９−２０２、１９８３を参照のこと）。また、多糖類は、天然供給源（例えば、他の多糖類、糖タンパク質、糖脂質など）からも調製され得る。例えば、一部の特定の実施形態では、多糖類は、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨおよび／またはＮ−エンドグリコシダーゼＦ（Ｎ−グリガナーゼとも称される）などのエンドグリコシダーゼを使用し、糖タンパク質の酵素的切断によって調製され得る（例えば、Ｈｉｒａｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：４８５−４９２、１９８７を参照のこと）。エンドグリコシダーゼは、市販供給源（例えば、ＱＡ−Ｂｉｏ、ＰｒｏＺｙｍｅ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｇｌｙｋｏなど）を含む任意の供給源から得られ得る。択一的または付加的に、エンドグリコシダーゼは、細胞供給源（例えば、細菌、酵母、植物など）から単離および／または精製したものであってもよい。アルカンボロヒドリド不安定結合（Ｏ−グリコシド結合）によって糖タンパク質に連結された多糖類を、当該糖タンパク質から、０．１Ｎ ＮａＯＨ含有０．８Ｍ ＮａＢＨ４で３７Ｃにて６８時間、Ｓｐｉｒｏらによる、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５７０４−５７１７，１９７４の方法に従って処理することによって切断してもよい。また、Ｔａｋａｓａｋｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３：２６３−２６８、１９８２に記載の標準的な化学的方法を用いた加水分解によって、多糖類を放出させることもできる。
また、このような多糖類はいずれも、糖タンパク質からの切断前または切断後において、１種類またはそれ以上のエキソグリコシダーゼ（例えば、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、およびマンノシダーゼ）を用いて、さらにトリミングしてもよいことは認識されよう。当業者は、種々のレクチンに適切な所望の末端糖質部分を顕在化させるために、所望でない末端糖質部分の除去のための手順を容易に決定することができよう。あるいはまた、一部の特定の実施形態では、所望の末端糖質部分を酵素的に付加させることが好都合な場合があり得る。例えば、限定されないが、酵素ＵＤＰ−ガラクトース：Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースのガラクトースを、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンまたは末端Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを有する他の多糖類に転移させ得る。また、多糖類に対するガラクトースまたは他の糖質残基の付加も、例えば、Ｌｅｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：４２４−４２９、１９８７に記載のようにして合成的に行なわれ得る。
種々の実施形態において、特定のレクチン／グルコースの組合せに対する認識エレメントは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、１つ以上の認識エレメントが、グルコースと比較したときのレクチンに対する相対結合親和性に基づいてスクリーニングされる。一部の特定の実施形態では、糖質および／または多糖類のライブラリーが、この様式でスクリーニングされる。適当な認識エレメントは、グルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、レクチンとグルコース間の結合を完全に妨げるほど強くは競合しないものである。一部の特定の実施形態では、異なる認識エレメントが、該当するレクチンの特性に対する種々の親和性リガンドの効果を試験することにより（例えば、凝集を抑止する能力、および／またはその物質セットポイント（以下、および各実施例においてより詳細に論考する）に基づいて）スクリーニングされ得る。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは、修飾レクチンと合わされるコンジュゲートを考慮して（例えば、該コンジュゲートが認識エレメントを結合部位から移動させ、それにより、架橋物質体を形成することができるように）選択される。
反応性リンカー
親和性リガンドは、レクチンに任意の様式で共有結合され得る。ほとんどの方法は、リガンドの認識エレメントをレクチン結合部位と会合させること、次いで、反応性リンカーをレクチンと反応させることを伴う。一部の特定の実施形態では、反応性リンカーは認識エレメントに、認識エレメントの結合特性に実質的に支障がない位置で結合され得る。例えば、認識エレメントが糖質または多糖である場合、リンカーは、末端の糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位に結合され得る。一部の特定の実施形態では、リンカーはＣ１位に結合され得る。Ｃ１位は、アノマー炭素とも称され、リンカーに、αまたはβコンホメーションで連結され得る。一部の特定の実施形態では、リンカーはＣ１位にαアノマーとして結合される。
一部の特定の実施形態では、光励起性リンカーが使用され得る。例えば、Ｂｅｐｐｕら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８：１０１３−１０１９、１９７５では、紫外光を用いてアリールアジドリンカーを活性化させ、コンカナバリンＡと結合部位内の糖類誘導体間に二重結合を形成させる方法が報告された。スクシニル化コンカナバリンＡを用いたＦｒａｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７３：７９０−７９４、１９７６でも同様の結果が記録された。また、リシンおよびＨｏｕｓｔｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：７２０８−７２１２、１９８３に記載のガラクトースの光励起性誘導体を使用し、同様の手順が使用された。また、レクチンに対して糖質および二糖よりも高い親和性を有する複雑な糖ペプチドリガンドの光励起性誘導体が、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４４２１−４４２５、１９８２によって報告されている。このような誘導体は、光励起性基を糖ペプチドリガンドのペプチド部分に共有結合することにより作製された。
一般に、アリール、プリン、ピリミジン、またはアルキルアジド、ジアゾもしくはジアジリン基、ベンゾフェノン、またはニトロベンゼンなどの任意の光励起性リンカーが使用され得る。 潜在的に有用な光励起性リンカーのより包括的な一覧は、Ｆｌｅｍｉｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１：１２４７９−１２５２０、１９９５ならびにＢｒｕｎｎｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４８３−５１４、１９９３およびＷｏｎｇ、Ｓ．Ｓ．「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」、（１９９３）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１６８−１９４（これらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。種々の実施形態において、光励起性リンカーはジアジリン基を含むものであり得る。
紫外（ＵＶ）光でのジアジリン基の光励起により、反応性カルベン中間体が生成されるが、この反応性カルベン中間体は、リンカーの範囲内の任意のアミノ酸側鎖またはペプチド主鎖との付加反応によって二重結合を形成し得るものである。ジアジリンの活性化には、長波長ＵＶ光（約３２０〜３７０ｎｍ、好ましくは約３４５ｎｍ）が典型的に使用される（例えば、Ｓｕｃｈａｎｅｋら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：２６１−２６８，２００５を参照のこと）。
種々の実施形態において、光励起性リンカーはアリールアジド基を含むものであり得る。アリールアジド基をＵＶ光に曝露すると、ナイトレン基が形成されるが、このナイトレン基は、二重結合との付加反応、Ｃ−Ｈ部位およびＮ−Ｈ部位内への挿入、または後続の環拡大を開始させ、求核試薬として第１級アミンと反応し得るものである。後者の反応経路は、試料中に第１級アミンが存在する場合、優勢となる。限定されないが、置換型アリールアジド（例えば、ヒドロキシまたはニトロ基を有する）では、長波長ＵＶ光（約３２０〜３７０ｎｍ、好ましくは約３６６ｎｍ）が非常に効率的であると考えられるが、非置換のアリールアジドでは、短波長が非常に効率的であると考えられる。好適なＵＶ光源は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから市販されている。
例えば、種々の実施形態において、親和性リガンドは、一般式（Ｉ）：Ｒｅ−Ｌ１のものであり得、式中、Ｒｅは認識エレメントであり、−Ｌ１は反応性リンカーである。一部の特定の実施形態では、Ｒｅは糖質部分である。一部の特定の実施形態では、Ｒｅは、リンカーにＣ１位で共有結合されたグルコースまたはマンノース部分である。
一部の特定の実施形態では、−Ｌ１は、一般式（ＩＩａ）：
Figure 2012516338
（式中：
Ｒ３は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＮＯ２、およびハロゲン（例えば、ＦまたはＣｌ）からなる群より選択され；
ＸＬは共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位Ｌは、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられており；
存在するＲ’は各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分である）
を有するものであり得る。
化学可変部が環の結合と交差している結合に結合されて表示されている場合（例えば、上記のＲ３で示している場合）はいずれも、これは、１つ以上のかかる可変部が、該交差している結合を有する環に任意選択で結合されていることを意味する。かかる環上の各Ｒ３基は任意の適当な位置に結合され得、これは、該基が、親環上の水素原子の代わりに結合されていることを意味すると一般的に理解されたい。これは、２つのＲ３基が同じ環内原子に結合され得る可能性を含む。さらに、１つより多くのＲ３基が環上に存在する場合、各々は同じであってもよく、結合されている他のＲ３基と異なっていてもよく、各基は、同じ識別名で表され得る場合であっても、同じ分子の別の箇所に結合され得る他の基とは独立して定義される。
一部の特定の実施形態では、−Ｎ３基はメタ位である。一部の特定の実施形態では、−Ｎ３基はオルト位である。一部の特定の実施形態では、−Ｎ３基はパラ位である。
一部の特定の実施形態では、ＸＬの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬは、Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２、またはＣ１０−１２炭化水素鎖で構築されており、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ０２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている。
一部の実施形態では、ＸＬは
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、ＸＬは
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、ＸＬは
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、ＸＬは
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、ＸＬは
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、ＸＬは
Figure 2012516338
である。
一部の特定の実施形態では、−Ｌ１は、一般式（ＩＩｂ）：
Figure 2012516338
（式中、ＸＬは、式ＶＩＩａで上記に定義したとおりであり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−ＣＦ３である。）
のものであり得る。
一部の特定の実施形態では、非光励起性リンカーが使用され得る。例えば、米国特許第５，２３９，０６２号および同第５，３９５，９２４号には、ｐＨまたは温度の変化によって活性化され得るリンカーが記載されている。論考された例示的な反応性リンカーとしては、シアヌル酸（Ｋａｙら、Ｎａｔｕｒｅ ２１６：５１４−５１５、１９６７）またはジクロロ−Ｓ−トリアジン（２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｓ−トリアジンなど（Ｋａｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９８：２７６−２８５、１９７０））および２，４−ジクロロ−６−メトキシ−Ｓ−トリアジン（Ｌａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ １：２１８９−２１９４、１９７７）などの試薬を用いて親和性リガンドに導入され得るものが挙げられる。また、主に末端アミン（リジンに見られるものなど）と反応し得るＮＨＳ−エステルまたはアルデヒドを有する反応性リンカーも使用され得る。
種々の実施形態において、特定のレクチン／標的分子の組合せに対する反応性リンカーは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、同じ認識エレメントと異なるリンカー（例えば、長さが異なるリンカー、反応性基が異なるリンカー、疎水性が異なるリンカーなど）を有するいくつかの親和性リガンドが、該当するレクチンの特性に対する効果に基づいて（例えば、凝集および／または物質セットポイント（以下、および本実施例においてより詳細に論考する）を抑止する能力に基づいて）スクリーニングされる。
修飾レクチンの精製
種々の実施形態において、修飾レクチンは、その特性を改善するために、さらに処理を施してもよい。したがって、一部の特定の実施形態では、多価レクチンを含む組成物は、タンパク質断片、非修飾成分などを除去するために精製され得る。一般に、このような分離は、物理的特性（例えば、電荷；分子量；および／またはサイズ）および／または化学的特性（例えば、グルコースもしくはマンノースに対する結合親和性）に基づいて行なわれ得る。一部の特定の実施形態では、最適な除去は、このような特性の違いに依存する方法を２つ以上組み合わせることにより行なわれ得る。一実施形態において、このような分離は変性条件下で行なわれる。例えば、非修飾または一部修飾レクチンは、その正味電荷に基づいてイオン交換クロマトグラフィーによって除去され得る。ゲル濾過クロマトグラフィーを使用すると、差次的に修飾されたレクチンが、サイズに基づいて識別され得る。アフィニティクロマトグラフィーは、非修飾または一部修飾レクチンを除去するために使用され得る別の方法である。このアプローチは、特定の標的分子（例えば、グルコースまたはマンノース）に対する修飾レクチン、一部修飾レクチンおよび非修飾レクチンの結合親和性の違いを利用したものである。
修飾レクチンの特性評価
種々の実施形態において、修飾レクチンは、その特性を確認または特性評価するために、スクリーニングまたはさらなる試験を行なってもよい。代表的なアッセイとしては、親和性アッセイ、凝集アッセイ、Ｔ細胞マイトジェン活性アッセイ、Ｔ細胞バイアビリティアッセイ、抗原性アッセイなどが挙げられる。
親和性アッセイは、修飾レクチンをアフィニティカラム（例えば、標的分子を伴うレジン）に通すこと、および該レクチンをカラムから除去するのに必要とされる溶出条件を決定することを伴うものであり得る。また、平衡透析を当該技術分野で知られているとおりに使用することもできる。また、修飾レクチンを１種類以上の本開示のコンジュゲートと合わせ、次いで種々の濃度のグルコースと接触させるセットポイントアッセイを使用してもよい。好ましくは、修飾レクチンの結合親和性は、非修飾レクチンのものの少なくとも７５％である。より好ましくは、該結合親和性は、非修飾レクチンのものの少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９５％である。
一部の特定の実施形態では、凝集アッセイを用いて修飾レクチンの最小凝集濃度（ＭＡＣ）が測定され得る。例えば、一部の特定の実施形態では、ＭＡＣは、ＵＳ２００７−０１１０８１１に記載されているように、ウサギ赤血球を用いて測定され得る。本発明者らは、修飾レクチンの場合、高いＭＡＣ値は低いマイトジェン活性と強く相関していることを見い出した。一部の特定の実施形態では、修飾レクチンは、非修飾レクチンよりも高いＭＡＣを有するものであり得る。好ましくは、該ＭＡＣは、非修飾レクチンのＭＡＣの２５倍である。より好ましくは、該ＭＡＣは、非修飾レクチンのものの５０倍、さらにより好ましくは１００倍超である。一部の特定の実施形態では、修飾レクチンは、ホルムアルデヒド安定化ウサギ赤血球の２％ｖ／ｖ懸濁液で、４ｕｇ／ｍｌより大きいＭＡＣを示す。好ましくは、ＭＡＣは６ｕｇ／ｍｌより大きく、より好ましくは１０ｕｇ／ｍｌより大きく、さらにより好ましくは２５ｕｇ／ｍｌより大きい。
マイトジェン活性アッセイは、典型的には、対象の組成物をＴ細胞培養物（例えば、ＰＢＭＣ細胞）と、ある期間接触させること、次いで、Ｔ細胞増殖レベルを測定することを伴う。細胞増殖を測定するための種々の方法が知られている。一実施形態では、細胞密度が４５０ｎｍで分光測光的に測定され得る。別の実施形態では、５７０ｎｍにおけるＭＴＴの低減を検出することにより、間接測定値が得られ得る（例えば、Ｏｈｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：１９９−２０３、１９９１を参照のこと）。好ましい実施形態では、細胞増殖レベルは、トリチウム標識チミジン取込みアッセイを用いて測定される。当業者には、他の適当な方法も使用され得ること、および本発明は、なんら特定の増殖アッセイに限定されないことが認識されよう。一部の特定の実施形態では、修飾レクチンのＴ細胞マイトジェン活性は、非修飾レクチンのＴ細胞マイトジェン活性の５０％未満である。Ｔ細胞マイトジェン活性の低下は、一連の架橋剤濃度（例えば、０．０１、０．１、１、１０、１００および１０００ｕｇ／ｍｌ）全体について相対（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ）チミジン取込みアッセイを行なうことにより評価され得る。好ましい実施形態では、チミジン取込みアッセイは、ほぼ５００，０００個のＰＢＭＣを含む試料で行なわれる。次いで、試験組成物（例えば、修飾組成物）のマイトジェン活性を、最大非修飾マイトジェン活性に対する％で表示する。最大非修飾マイトジェン活性に対する％は、測定した全濃度での試験組成物の最大ＣＰＭ（カウント毎分）値を、測定した全濃度での非修飾組成物の最大ＣＰＭ値で除算することにより得られる。好ましくは、マイトジェン活性の低下を伴う試験組成物は、非修飾組成物よりも少なくとも５０％低いＴ細胞増殖レベルを誘導する。より好ましくは、該レベルは、少なくとも７５％低く、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％または９９％低い。
Ｔ細胞バイアビリティは、同様の実験を使用し、トリパンブルーをＴ細胞培養物に添加し、該細胞の代表的な試料を計数すること（トリパンを取り込むか、または依然としてトリパンを排除するかのいずれかであるもの、すなわち、青色になったものと、そうでないものに注目すること）により測定され得る。次いで、トリパンを排除した細胞（「青色でない」生細胞）の数を、計数された細胞総数（「青色」の死細胞＋「青色でない」生細胞）で除算することにより、バイアビリティ％を計算する。当業者には、他の適当な方法も使用され得ること、および本発明は、なんら特定のバイアビリティアッセイに限定されないことが認識されよう。一部の特定の実施形態では、修飾レクチンは、１００ｕｇ／ｍｌで、５００，０００細胞／ｍｌの濃度のＰＢＭＣを用いてアッセイしたとき、１０％より高い細胞バイアビリティパーセントを示す。好ましくは、細胞バイアビリティパーセントは２５％より高く、より好ましくは５０％より高く、さらにより好ましくは９０％より高い。
コンジュゲート
該コンジュゲートは、コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含む。該２つ以上の個別の親和性リガンドは、標的分子と、修飾レクチンとの結合に関して競合する。また、最終適用用途に応じて、該コンジュゲートは、薬物および／または検出可能な標識を含むものであってもよい。親和性リガンド、薬物、および／または検出可能な標識は、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。
親和性リガンド
２つ以上の個別の親和性リガンドは、同じ化学構造を有するものであっても、異なる化学構造を有するものであってもよい。２つ以上の個別の親和性リガンドは、標的分子それ自体と同じ化学構造を有するものであってもよく、標的分子の化学的に関連している種であってもよい。唯一の要件は、該リガンドが、標的分子と、修飾レクチンとの結合に関して競合することである。一部の特定の実施形態では、該コンジュゲートおよび標的分子の修飾レクチンに対する相対親和性は、１：１〜１００：１の範囲である（この場合、１００：１の相対親和性は、コンジュゲート、標的分子および修飾レクチンの平衡混合物において（ｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中、３７Ｃで）、標的分子の濃度がコンジュゲートの濃度の１００倍である場合、修飾レクチンが、ほぼ等モル量のコンジュゲートと標的分子に結合することを意味する）。一部の特定の実施形態では、この相対親和性は１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜５：１または１：１〜２：１の範囲である。種々の実施形態において、例えば、該コンジュゲートおよび標的分子に対する修飾レクチンの相対親和性を微調整するために、親和性リガンドが標的分子と異なる化学構造を有することが好都合な場合があり得る。例えば、標的分子がグルコースである場合、１つ以上の該親和性リガンドとして糖質または多糖が使用され得る。例えば、標的分子がグルコースである場合、親和性リガンドとしては、糖が挙げられ得る。したがって、一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、グルコースと、多価のグルコース結合分子（例えば、限定されないが、Ｃｏｎ Ａ、マンナン結合レクチンまたはＭＢＬなど）に対する結合に関して競合し得るものである。
一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
Figure 2012516338
（式中：
各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚ、または−ＣＨ２Ｒｘであり；
各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、または−Ｏ−Ｙであり；
各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２であり；
各Ｙは、独立して、単糖、二糖または三糖であり；
各Ｇは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−、または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられており；
各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＯＳＯ２Ｒ２であり；
各Ｒ２は、独立して、水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくはイオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜７員の複素環式の環、または窒素、酸素もしくはイオウから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換されている基である）のものである。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の親和性リガンドは単糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは二糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは四糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、４個以下の糖質部分を含むものである。
上記に一般的に定義したように、各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚ、または−ＣＨ２Ｒｘである。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は−Ｏ−Ｙである。一部の特定の他の実施形態では、Ｒ１は−Ｇ−Ｚである。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２−Ｏ−Ｙである。また他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨ２である。当業者には、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）における各Ｒ１置換基が（Ｒ）または（Ｓ）の立体化学構造であり得ることが認識されよう。
上記に一般的に定義したように、各Ｒｘは、独立して、水素、−０Ｒｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、または−Ｏ−Ｙである。一部の実施形態では、Ｒｘは水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒｘは−Ｏ−Ｙである。
上記に一般的に定義したように、各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。一部の実施形態では、Ｒｙは水素である。他の実施形態では、Ｒｙは−Ｒ２である。一部の実施形態では、Ｒｙは−Ｃ（Ｏ）Ｒ２である。一部の特定の実施形態では、Ｒｙはアセチルである。他の実施形態では、Ｒｙは、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。
上記に一般的に定義したように、Ｙは単糖、二糖または三糖である。一部の特定の実施形態では、Ｙは単糖である。一部の実施形態では、Ｙは二糖である。他の実施形態では、Ｙは三糖である。一部の実施形態では、Ｙは、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース、またはキシロピラノースである。一部の実施形態では、Ｙは、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオース、またはラクトースである。一部の特定の実施形態では、Ｙはマンノースである。一部の特定の実施形態では、ＹはＤ−マンノースである。当業者には、糖Ｙが、−Ｏ−Ｙの酸素基にアノマー炭素を介して結合され、グリコシド結合を形成していることが認識されよう。グリコシド結合は、α立体配置であってもβ立体配置であってもよい。
上記に一般的に定義したように、各Ｇは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｇは二重結合である。一部の特定の実施形態では、Ｇは−Ｏ−Ｃ１−８アルキレンである。一部の特定の実施形態では、Ｇは−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
上記に全般的に定義したように、各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＯＳＯ２Ｒ２である。一部の実施形態では、Ｚは、ハロゲンまたは−ＯＳＯ２Ｒ２である。他の実施形態では、Ｚは、−Ｎ３または−Ｃ≡ＣＲ２である。一部の特定の実施形態では、Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、または−ＳＲ２である。一部の特定の実施形態では、Ｚは−ＳＨである。一部の特定の実施形態では、Ｚは−ＮＨ２である。一部の特定の実施形態では、−Ｇ−Ｚは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩａ）のＣ１炭素上のＲ１置換基は−Ｇ−Ｚであり、式（ＩＩＩａ−ｉ）：
Figure 2012516338
（式中、Ｒ１、ＧおよびＺは、本明細書において定義および記載のとおりである）の化合物が得られる。
一部の実施形態では、リガンドは、式（ＩＩＩａ−ｉｉ）：
Figure 2012516338
（式中、Ｒ１、Ｒｘ、ＧおよびＺは、本明細書において定義および記載のとおりである）のものである。
標的分子がグルコースである一部の特定の実施形態では、例えば、グルコース応答性物質体の応答を微調整するために、親和性リガンドがグルコースと異なる化学構造を有することが好都合な場合があり得る。例えば、一部の特定の実施形態では、以下：グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはこれらの高次の組合せ（例えば、ビマンノース、線状および／または分岐のトリマンノースなど）の１種類以上を含む親和性リガンドが使用され得る。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは単糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンド二糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは多糖を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドは糖と１つ以上のアミン基を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態では、親和性リガンドはＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。一部の特定の実施形態では、糖リガンドは「Ｄ」立体配置のものである。他の実施形態では、糖リガンドは「Ｌ」立体配置のものである。以下に、本発明らは、これらの例示的な親和性リガンドの構造を示す。他の例示的な親和性リガンドは、当業者に認識されよう。
Figure 2012516338
種々の実施形態において、該親和性リガンドは、多糖、糖ペプチドまたは糖脂質である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、２〜１０個の糖質部分、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の該部分を含む。多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および／または内部残基は、対象のレクチンの糖特異性に基づいて選択され得る（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３１７：５００−５０４、１９７３およびＬｉｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３５−６７、１９８６を参照のこと）。
種々の実施形態において、特定のコンジュゲート／修飾レクチンの組合せに対する親和性リガンドは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、１つ以上の親和性リガンドが、グルコースと比較したときの修飾レクチンに対する相対結合親和性に基づいてスクリーニングされる。一部の特定の実施形態では、糖質および／または多糖類のライブラリーが、この様式でスクリーニングされる。適当な親和性リガンドは、グルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、修飾レクチンとグルコース間の結合を完全に妨げるほど強くは競合しないものである。
他の例示的な標的分子／親和性リガンドの組合せは当業者に認識されよう。一般に、親和性リガンドは、標的分子自体を用いて、および／または標的分子の誘導体を作製することにより（例えば、標的分子に対して化学修飾および／または立体化学修飾を行ない、次いで、得られた誘導体を、対象の修飾レクチンに対する相対親和性に関してスクリーニングすることにより）、任意の標的分子に対して作製され得る。
より詳細に以下に論考するように、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に天然に存在するものであってもよい（例えば、ポリマー主鎖の一部として、またはモノマーの側鎖基として）。択一的に（または付加的に）、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に人工的に組み込まれたものであってもよい（例えば、コンジュゲートの枠組構造に合成的に付加された化学基の形態で）。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、または１００個以上の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜２５、２〜５０または２〜１００個の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、２、３または４個程度の少ない個別の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。
親和性リガンドをコンジュゲート枠組構造にコンジュゲートさせるための方法は、より詳細に以下に論考する。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドが糖を含む場合、コンジュゲーション（直接であれ間接的であれ）には、糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位が関与する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションはＣ１位が関与するものである。Ｃ１位は、アノマー炭素とも称され、コンジュゲートの枠組構造に、αまたはβコンホメーションで連結され得る。一部の特定の実施形態では、Ｃ１位はαアノマーとして構成される。他の実施形態では、Ｃ１位はβアノマーとして構成される。
薬物
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは薬物を含むものであり得る。例えば、薬物は、該物質体が治療目的に使用される場合、例えば、薬物を患者に制御可能に送達するために含まれ得る。コンジュゲートには任意の薬物が含まれ得ることは理解されよう。コンジュゲートは、１コピーより多くの同じ薬物を含むものであり得、および／または１種類より多くの型の薬物を含むものであり得る。コンジュゲートは、なんら特定の薬物に限定されず、小分子薬物または生体分子薬物を含むものであってよい。一般に、使用される薬物（１種類または複数種）は、処置対象の疾患または障害に依存する。
例えば、限定されないが、種々の実施形態において、コンジュゲートは、以下の薬物：ジクロフェナク、ニフェジピン、リバスチグミン、メチルフェニデート、フルオキセチン、ロシグリタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、コデイン、エチルモルヒネ、デキストロメトルファン、ノスカピン、ペントキシベリン（ｐｅｎｔｏｘｉｖｅｒｉｎｅ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、エピネフリン、イソプレナリン、オルシプレナリン、エフェドリン、フェノテロール、リミテロール、イプラトロピウム、コリンテオフィリネート、プロキシフィリン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デスラノシド、ジゴキシン、ジギトキシン、ジソピラミド、プロスシラリジン、キニジン、プロカインアミド、メキシレチン、フレカイニド、アルプレノロール、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒｏａｎｏｌｏｌ）、ナドロール、ピンドロール、オクスプレノロール、ラベタロール、チモロール（ｔｉｒｎｏｌｏｌ）、アテノロール、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、イソソルビドモノニトラート、ニフェジピン、フェニルアミン、ベラパミル、ジルチアゼム、シクランデラール（ｃｙｃｌａｎｄｅｌａｒ）、ニコチニルアルコール、ニコチン酸イノシトール、アルプロスタジル（ａｌｐｒｏｓｔａｔｄｉｌ）、エチレフリン、プレナルテロール、ドブタミン、ドパミン、ジヒドロエルゴタミン、グアネチジン、ベタニジン、メチルドパ、レセルピン、グアンファシン、トリメタファン、ヒドララジン、ジヒドララジン、プラゾシン、ジアゾキサイド、カプトプリル、ニフェジピン、エナラプリル、ニトロプルシド、ベンドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、クロルタリドン、シネタゾン、クロパミド、メフルシド、メトラゾン、ブメタニド、エタクリナシド、スピロノラクトン、アミロリド、クロフィブラート、ニコチン酸、ニケリトロール（ｎｉｃｈｅｒｉｔｒｏｌ）、ブロモフェニルアミン、シンナリジン、デキシクロルフェニラミン、クレマスチン、アンタリン、シプロヘプタジン、プロメタジン（ｐｒｏｅｔｈａｚｉｎｅ）、シメチジン、ラニチジン、スクラルファート、パパベリン、モキサベリン、アトロピン、ブチルスコポラミン、エメプロン、グルコピロン、ヒヨスチアミン、メペンソラール、メチルスコポラミン、オキシフェンサイクリミン、プロバンテリン、テロジリン、センナグリコシド、サグラダエキストラクト、ダントロン、ビサコジル、ピコスルファートナトリウム、エチュロス、ジフェノキシレート（ｄｉｐｈｅｎｏｌｘｙｌａｔｅ）、ロペラミド、サラゾスルファピリジン、ピルヴィン、メベンダゾール、ジメチコン、フェロフマレート、フェロサクシネート、フェリテトラセミナトリウム、シアノコバラミン、葉酸ヘパリン、ヘパリン補因子、ジクルマロール、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビタミンＫ、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、シタラビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、プロカルバジン、ダカルバジン、ロムスチン、エストラムスチン、テニポシド、エトポシド、シスプラチン、アムサクリン、アミノグルテチミド、ホスフェストロール、メドロキシプログレステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、メゲステロール、ノレチステロン、タモキシフェン、シクロスポリン、スルフィソミジン（ｓｕｌｆｏｓｏｍｉｄｉｎｅ）、ベンシルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、ジクロキサシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、ピバンピシリン、バカンピシリン、ピペラシリン、メジオシリン、メシリナム、ピブメシリナム、セファロチン、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セフロキシム、セフォタキシム、セフタジジム、セフォキシチン、アズトレオナム、イミペネム、シラスタチン、テトラサイクリン、リメサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロルアンフェニコール、スピラマイシン、フシジン酸、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、アンフォテリシンＢ、グリセオフルビン、ニスタチン、バンコマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、トリメトプリム、ノルフロキサシン、サラゾスルファピリジン、アミノサリル、イソニアジド、エタンブトール（ｅｔａｍｂｕｔｏｌ）、ニトロフラントイン、ナリジクス酸、メテナミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、チニダゾール、ケトコナゾール、アシクロビル、インターフェロンイドクスウリジン、レチノール、チアミン、デキスパンテノール、ピリドキシン、葉酸、アスコルビン酸、トコフェロール、フィトミナジオン、フェンフルナミン、コルチコトロピン、テトラコサクチド、チロトロピン、ソマトトロピン、ソマトレム、バソプレシン、リプレシン、デスモプレシン、オキシトシン、クロリオンゴナドトロピン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルオキシメステロン、メステロロン、ナンドロロン、スタノゾロール、オキシメトロン、シプロテロン、レボチロキシン、リオチロニン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、チアマゾール、ジヒドロタキステロール、アルファカルシドール、カルシチロール、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミド、トラズアミド、グリピジド、グリベンクラミド、フェノバルビタール、メチプリロン、ピリチルジオン、メプロバメート、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、ニトラゼパム、バクロフェン、オキサゼパム、クロラゼプ酸二カリウム（ｄｉｋａｌｉｕｍｃｌｏｒａｚｅｐａｔ）、ロラゼパム、フルニトラゼパム、アルプラゾラム、ミダゾラム、ヒドロキシジン、ダントロレン、クロメチアゾール、プロピオンマジン、アリメマジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、アセトフェナジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペナジン、トリフルオペラジン、ジキシラジン、チオリダジン（ｔｈｉｏｄｉｒａｚｉｎｅ）、ペリシアジン、クロプロチキセン（ｃｈｌｏｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）、チザニジン、ザレプロン、ズクロペンチゾール、フルペンチゾール、チチキセン、ハロペリドール、トリミプラミン、オピプラモール、クロミプラミン、デシプラミン、ロフェプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、マプトロチリン、カフェイン、シンナリジン、サイクリジン、メンヒドリナート（ｄｉｍｅｎｈｙｄｉｎａｔｅ）、メクロジン、プロメタジン、チエチルペラジン、メトクロプラミド、スコポラミン、フェノバルビタール、フェニトイン、エトスクシミド、プリミドン、カルバマゼピン、クロナゼパム、オルフェナドリン、アトロピン、ベンサトロピン、ビペリデン、メチキセン、プロシリジン、レボドパ、ブロモクリプチン、アマンタジン、アンベノン、ピリドスチグミン、シンスチグミン、ジスルフィラム、モルヒネ、コデイン、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、ペチジン、フェノペリジン、フェンタニル、メタドン、ピリトラミド、デキストロプロポキシフェン、ケトベミドン、アセチルサリチル酸、セレコキシブ、フェナゾン、フェニルブタゾン、アザプロパゾン、ピロキシカム、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、シプロヘプタジン、ピジチフェン、フルメドロキソン、アロプリノール、プロベネシド、金チオリンゴ酸ナトリウム、アウラノフィン（ａｕｒｏｎｏｆｉｎ）、ペニシラミン、エストロジオール、吉草酸エストラジオール、エストリオール、エチニルエストラジオール、ジヒドロゲステロン、リネストレノール、メドロキシプログレステロン、ノルエチステロン、シクロフェニル、クロミフェン、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール、クロトリマゾール、ナタマイシン、ミコナゾール、スルベンチン、メチルエルゴタミン、ジノプロスト、ジノプロストン、ゲメプロスト、ブロモクリプチン、フェニルプロパノールアミン、クロモグリク酸ナトリウム、アセタゾラミド、ジクロフェナミド、ベータカロテン、ナロキソン、ホリナートカルシウム、特にクロニジン、テオフィリン、ジピラダモール、ヒドロクロルチアジド、スコポルアミン、インドメタシン、フロセミド、塩化カリウム、モルヒネ、イブプロフェン、サルブタモール、テルブタリンカルシトニンなどのいずれか１つを含むものであり得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものものであれ、任意の薬物が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ホルモン薬（ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい）、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどを含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、ホルモンは、グルカゴン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、およびトリヨードサイロニンから選択され得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものであれ、任意のホルモン薬が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
種々の実施形態において、コンジュゲートは甲状腺ホルモンを含むものであり得る。
種々の実施形態において、コンジュゲートは抗糖尿病薬（すなわち、糖尿病に苦しむ患者に対して有益な効果を有する薬物）を含むものであり得る。
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分子を含むものであり得る。「インスリン分子」により、本発明者らは、生理活性である（すなわち、インビボで投与したとき、検出可能なグルコースの低減を引き起こし得る）限り、野生型インスリンおよび修飾型インスリンのどちらも包含することを意図する。野生型インスリンとしては、精製型であれ、合成型であれ、組換え型であれ、任意の種由来のインスリンが挙げられる（例えば、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）。これらのいくつかは市販されており、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である。さまざまな修飾型インスリンが当該技術分野で知られている（例えば、ＣｒｏｔｔｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５、２００７、ならびにＧｅｒｉｃｈ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８〜１６，２００２、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。修飾型インスリンは、化学修飾されたもの（例えば、ＰＥＧ基もしくは後述する脂肪族アシル鎖などの化学部分の付加によって）および／または変異されたもの（すなわち、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によって）であり得る。一般に、生理活性のある変異型形態のインスリンは、典型的には、野生型インスリンと１〜１０（例えば、１〜５または１〜２）個のアミノ酸の置換、付加または欠失により異なる。ヒトインスリンの野生型配列（Ａ鎖およびＢ鎖）を、以下および図３０に示す。
Ａ鎖（配列番号：１）：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
Ｂ鎖（配列番号：２）：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジインスリンとアミノ酸Ａ８、Ａ９、Ａ１０、およびＢ３０のみが異なる（以下の表を参照のこと）。
Figure 2012516338
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、Ｂペプチド配列のＢ２８位および／またはＢ２９位が変異されたものである。 例えば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、ＢペプチドのＣ末端の最後から２番目のリジンとプロリン残基が逆転した速効性インスリン変異型（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））は、Ｂ２８位のプロリンがアスパラギン酸で置換された別の速効性インスリン変異型（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。この変異型も多量体の形成を抑制する。一部の実施形態では、Ｂ２８位および／またはＢ２９位の変異は、インスリンポリペプチド内の別の箇所に１つ以上の変異を伴う。例えば、インスリングルリジン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））は、Ｂ３位のアスパラギン酸がリジン残基で置き換えられ、Ｂ２９位のリジンがグルタミン酸残基で置き換えられた、また別の速効性インスリン変異型（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）である。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンと比べてシフトした等電点を有する。一部の実施形態では、等電点のシフトは、インスリンＡペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢペプチドのＣ末端に１つ以上のアルギニン残基を付加することによりなされる。かかるインスリンポリペプチドの例としては、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、およびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる一例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、ＡｓｐＡ２１がグリシンで置き換えられ、２つのアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端に付加された例示的な長期作用性インスリン変異型である。 これらの変更の効果は、等電点がシフトしてｐＨ４で完全に可溶性の溶液が得られることである。したがって、一部の実施形態では、本開示のインスリン分子は、Ａ２１がＧｌｙであるＡペプチド配列と、Ｂ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢペプチド配列とを含むものである。本開示は、本明細書に記載したこれらの変異および任意の他の変異（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）の単独および多くの組合せをすべて包含することは理解されよう。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は切断型である。例えば、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢペプチド配列は、Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９および／またはＢ３０がないものである。一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢペプチド配列に残基の組合せがない。例えば、Ｂペプチド配列は、残基Ｂ（１〜２）、Ｂ（１〜３）、Ｂ（２９〜３０）、Ｂ（２８〜３０）、Ｂ（２７〜３０）および／またはＢ（２６〜３０）がないものであり得る。一部の実施形態では、これらの欠失および／または切断は、前記の任意のインスリン分子に適用される（例えば、限定されないが、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンリスプロ、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンアスパルト、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングルリジン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングラルギンなどを作製するため）。
一部の実施形態では、インスリン分子は、ＡまたはＢペプチド配列のＮ−またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０および／またはＢ３１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ａ０位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ａ２１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ｂ０位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ｂ３１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０またはＢ３１位に、さらなるアミノ酸残基を全く含まない。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、１つ以上のアミド化アミノ酸が酸性形態で置き換えられるように変異されている。例えば、アスパラギンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。同様に、グルタミンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１、またはＡｓｎＢ３、またはこれらの残基の任意の組合せが、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。ＧｌｎＡ１５またはＧｌｎＢ４または両方が、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、Ａ２１位にアスパラギン酸、またはＢ３位にアスパラギン酸、またはこれら両方を有する。
当業者には、生物学的活性を保持したまま、インスリン分子内のまた別のアミノ酸を変異させることも可能であることが認識されよう。例えば、限定されないが、以下の修飾：Ｂ１０位のヒスチジン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）；Ｂｌ位のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）；Ｂ３０位のトレオニン残基のアラニンでの置き換え（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）；Ｂ２６位のチロシン残基のアラニンでの置き換え（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）；およびＢ９位のセリン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）も当該技術分野で広く認められている。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、持続性の作用プロフィールを有するものである。したがって、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、脂肪酸でアシル化されたものであり得る。すなわち、インスリン分子上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成される。アミノ基は、インスリン分子のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基であってもよく、インスリン分子のリジン残基のε−アミノ基であってもよい。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の１つ以上がアシル化されたものであり得るか、または野生型配列に導入されたリジン残基がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ１位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ２９位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用性インスリン変異型である。
一部の実施形態では、ＡペプチドのＮ末端、ＢペプチドのＮ末端、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基、または本開示のインスリン分子内の任意の他の利用可能なアミノ基が、一般式：
Figure 2012516338
（式中、ＲＦは、水素またはＣ１−３０アルキル基である）の脂肪酸部分に共有結合される。一部の実施形態では、ＲＦは、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基、またはＣ１２−１４アルキル基である。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ａ１位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ｂ１位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のＢ２８位がＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のＢ３位がＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、脂肪酸鎖は８〜２０炭素長である。一部の実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）、またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）、またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用性インスリン変異型である。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリジン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル（ｍｙｒｉｓｏｔｙｌ）−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリンポリペプチド：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１ −アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
また、本開示は、前記の変異および／または化学修飾のいずれか１つを含む非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾型も包含する。
これらおよび他の修飾インスリン分子は、米国特許第６，９０６，０２８号；同第６，５５１，９９２号；同第６，４６５，４２６号；同第６，４４４，６４１号；同第６，３３５，３１６号；同第６，２６８，３３５号；同第６，０５１，５５１号；同第６，０３４，０５４号；同第５，９５２，２９７号；同第５，９２２，６７５号；同第５，７４７，６４２号；同第５，６９３，６０９号；同第５，６５０，４８６号；同第５，５４７，９２９号；同第５，５０４，１８８号；同第５，４７４，９７８号；同第５，４６１，０３１号；および同第４，４２１，６８５号；ならびに米国特許第７，３８７，９９６号；同第６，８６９，９３０号；同第６，１７４，８５６号；同第６，０１１，００７号；同第５，８６６，５３８号；および同第５，７５０，４９７号に詳細に記載されており、その全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、３つの野生型ジスルフィド結合（すなわち、Ａ鎖の７位とＢ鎖の７位間に１つ、Ａ鎖の２０位とＢ鎖の１９位間に２つ目、およびＡ鎖の６位と１１位間に３つ目）を含む。
インスリン分子を含む薬物をコンジュゲートさせるための方法を以下に記載する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、Ａ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、Ａ１アミノ酸残基はグリシンである。しかしながら、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端Ａ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、Ａ鎖内の任意の位置に存在するリジン残基（野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの）のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。Ａ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、Ｂ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、Ｂ１アミノ酸残基はフェニルアラニンである。しかしながら、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端Ｂ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、Ｂ鎖内の任意の位置に存在するリジン残基（野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの）のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。例えば、一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ２９リジン残基を介してコンジュゲートされ得る。インスリングルリジンの場合では、Ｂ３リジン残基を介したコンジュゲートの枠組構造に対するコンジュゲーションが使用され得る。Ｂ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。
一部の特定の実施形態では、リガンドは、インスリン分子などの薬物１つより多くのコンジュゲーション点にコンジュゲートされる。例えば、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端とＢ２９リジンの両方にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、炭酸緩衝液中でアミドコンジュゲーションが起こり、Ｂ２９位とＡｌ位にコンジュゲートされるが、Ｂ１位にはコンジュゲートされない。他の実施形態では、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端、Ｂ１のＮ末端、およびＢ２９リジンにコンジュゲートされ得る。また他の実施形態では、保護基が、コンジュゲーションがＢ１位とＢ２９位またはＢｌ位とＡｌ位で起こるように使用される。インスリン分子上のコンジュゲーション点の任意の組合せが使用され得ることは認識されよう。一部の実施形態では、コンジュゲーション点の少なくとも１つは変異リジン残基、例えばＬｙｓＡ３である。
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン感受性改善薬（すなわち、インスリンの作用を増強する薬物）を含むものであり得る。インスリンの効果を増強する薬物としては、ビグアニド（例えば、メトホルミン）およびグリタゾンが挙げられる。最初のグリタゾン薬はトログリタゾンであったが、これは重度の副作用を有することが判明した。第２世代のグリタゾンとしてはピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが挙げられ、これらは耐容性がより良好であるが、ロシグリタゾンは、一部の治験において有害な心血管事象と関連していた。
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分泌促進薬（すなわち、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を刺激する薬物）を含むものであり得る。例えば、種々の実施形態において、コンジュゲートはスルホニル尿素を含むものであり得る。スルホニル尿素は、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を、該細胞をグルコースの作用に対して感作することにより刺激する。さらに、スルホニル尿素はグルカゴンの分泌を抑止し、標的組織をインスリンの作用に対して感作し得る。第１世代のスルホニル尿素としては、トルブタミド、クロルプロパミドおよびカルブタミドが挙げられる。より低い用量で活性な第２世代のスルホニル尿素としては、グリピジド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリボルヌリドおよびグリメピリドが挙げられる。種々の実施形態において、コンジュゲートはメグリチニドを含むものであり得る。好適なメグリチニドとしては、ナテグリニド、ミチグリニドおよびレパグリニドが挙げられる。これらの血糖降下作用は、スルホニル尿素のものより速いが短い。他のインスリン分泌促進薬としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−１類似体（すなわち、ＧＬＰ−１様生理活性を有し、ＧＬＰ−１とは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）が挙げられる。ＧＬＰ−１は、中枢作用によって胃内容物排出を抑止して満腹感を増大させることにより、およびグルカゴンの放出を抑制することにより食物摂取量を低減させる。ＧＬＰ−１は、膵島細胞の増殖を増大させ、摂食後のインスリン生成を増大させることにより血漿グルコースレベルを低下させる。ＧＬＰ−１は、例えば、そのインビボ半減期を長くするため、リラグルチドの場合のように脂質のコンジュゲーションによって化学修飾され得る。また他のインスリン分泌促進薬としては、エキセンジン−４およびエキセンジン−４類似体（すなわち、エキセンジン−４様生理活性を有し、エキセンジン−４とは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）が挙げられる。エキセンジン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ Ｍｏｎｓｔｅｒ）に毒中に見られ、ＧＬＰ−１様生理活性を示す。これは、ＧＬＰ−１よりもずっと長い半減期を有し、ＧＬＰ−１とは異なり、生理活性を失うことなく、Ｎ末端の８個のアミノ酸残基が切断され得る。ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４のＮ末端領域は、ほぼ同一であり、有意な差は２番目のアミノ酸残基、ＧＬＰ−１ではアラニン、エキセンジン−４ではグリシンであり、これにより、エキセンジン−４に、インビボ消化に対する抵抗性が付与される。 また、エキセンジン−４はＧＬＰ−１と比較すると、Ｃ末端に、さらに９個のアミノ酸残基も有する。Ｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：７１３−７１６，２００７およびＲｕｎｇｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：５８３０−５８４０，２００７には、本開示のコンジュゲートに使用され得るさまざまなＧＬＰ−１およびエキセンジン−４類似体が記載されている。ＧＬＰ−１の短い半減期は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による酵素的消化に起因する。一部の特定の実施形態では、内因性ＧＬＰ−１の効果は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬（例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチンまたはアログリプチン）の投与によって増強され得る。
種々の実施形態において、コンジュゲートはアミリンまたはアミリン類似体（すなわち、アミリン様生理活性を有し、アミリンとは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）を含むものであり得る。アミリンは、グルコースの調節に重要な役割を果たしている（例えば、ＥｄｅｌｍａｎおよびＷｅｙｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１７５〜１８９、２００２を参照のこと）。アミリンは、食物摂取量に応答して膵臓のβ細胞によってインスリンとともに共分泌される神経内分泌ホルモンである。インスリンは血流からのグルコースの消失を調節する働きをするが、アミリンは、胃および肝臓から血流中へのグルコースの出現の調節を補助する働きをする。酢酸プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））は例示的なアミリン類似体である。天然ヒトアミリンはアミロイド形成性であるため、プラムリンチドを設計するためのストラテジーは、ある特定の残基を、アミロイド形成性でないラットアミリン由来の残基で置換することを伴うものであった。特に、プロリン残基は構造破壊性残基であることがわかっており、そのため、該残基は、ラット配列からヒト配列に直接グラフトされた。また、Ｇｌｕ−１０もアスパラギンで置換された。
種々の実施形態において、プレコンジュゲート薬物は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド薬が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の薬物に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド薬の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
上記に論考したように、本開示は、なんら特定の薬物／標的分子の組合せに限定されない。
種々の実施形態において、本開示の物質体は、天然のフィードバック機構を操作するために利用され得る。例えば、２種類の内因性物質のレベル相互に関連している（例えば、グルコースおよびインスリン、この場合、グルコースレベルが増大するにつれてインスリンレベルが増大し、インスリンレベルが増大するにつれてグルコースレベルが減少する）多くの天然フィードバック機構が存在する（例えば、ほとんどのホルモン性制御機構）。かかる実施形態では、内因性物質の一方が標的分子（例えば、グルコース）となり得、他方が薬物（例えば、インスリン）となる。あるいはまた、種々の実施形態において、薬物は、（ａ）他方の内因性物質と同じ機能を有する（例えば、グルコースレベルを低減させる）、（ｂ）他方の内因性物質の生成を刺激する、および／または（ｃ）他方の内因性物質の効果（１つもしくは複数）を増強する分子であり得る。例えば、グルコースが標的分子である場合、薬物としてインスリンの代わりに、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬を使用してもよい。
人工的なフィードバック系の他の非限定的な例としては、高レベルのインスリンに応答してグルカゴンコンジュゲートを放出する物質体、血栓症インジケータに応答して抗凝固薬コンジュゲート（例えば、クマリン（ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモンおよびフェニンジオンなど）、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤（アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびダビガトランなど）など）を放出する物質体；乳酸レベルの増大に応答して乳酸降下性薬物コンジュゲート（例えば、ジクロロアセテート）を放出する物質体；などが挙げられる。
種々の実施形態において、該物質体は、標的分子に直接関係しない機能を有する薬物を含むコンジュゲートを放出するように設計され得る。限定されないが、食後に濃度が増大する標的分子（例えば、グルコース）に応答する物質体は、食事中に長期間の薬物投薬をもたらすために使用され得る。定期的に、および／または食物とともに投与する必要がある任意の薬物が、かかる送達系の恩恵を被り得る。当該技術分野で周知のように、多くの従来の薬物は、食物とともに、または食事の際に投与される必要があるものである。例えば、脂肪の吸収を抑止する薬物（例えば、オルリスタット）は、食事中に存在するのが好都合である。同様に、脂質レベルを降下させる薬物（例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、もしくはシンバスタチン）、またはトリグリセリドレベルを降下させる薬物（例えば、ゲムフィブロジル）も、食事の際に放出されるのが好都合であり得る。
検出可能な標識
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは、検出可能な標識を含むものであり得る。例えば、コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内の該コンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることを理解されたい。コンジュゲートは、１コピーより多くの同じ標識を含むものであり得る、および／または１種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識（１種類または複数種）は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の１種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー（例えば、抗体またはアプタマー）に対して強い親和性を有する標識である。
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
コンジュゲートの枠組構造
コンジュゲートは、親和性リガンドを天然に含む枠組構造から調製され得るもの（例えば、グリコゲンおよびデキストランなどの多糖類は、グルコース親和性リガンドを天然に含む）、および／または親和性リガンドを、天然もしくは合成の枠組構造内に人工的に組み込むことにより調製され得るものである。本開示のコンジュゲートは特定の枠組構造に限定されないことを理解されたい。例えば、コンジュゲートは、ポリマー構造および／または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製され得る。また、コンジュゲートの枠組構造は、線状、分岐、超分岐型および／またはこれらの組合せであり得ることも理解されたい。以下のセクションに、いくつかの例示的なコンジュゲート枠組構造を示す。
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ポリマー構造を含む枠組構造から調製され得る。例えば、反応性懸垂基（例えば、カルボキシルまたは反応性のエステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなど）を有するポリマーが使用され得る。異なる懸垂基が単一の枠組構造内で混合されてよいことは認識されよう（例えば、適切なモノマーを所望の比率で共重合させることにより、ポリマー枠組構造を得る）。以下に論考するように、このような反応性基は、親和性リガンド、薬物および／または検出可能な標識を枠組構造に結合させるために使用され得る。また、異なる枠組構造のコポリマー、混合物および付加物も使用され得る。かかる組合せは、物質体の機械的および化学的特性を最適化するのに有用であり得る。
種々の実施形態において、カルボキシル（または反応性のエステル）懸垂基を有する枠組構造（−ＣＯＯＨ含有枠組構造、またはＣＢＦ）が使用され得る。かかる枠組構造は、カルボキシル基を天然に含むものであってもよく、カルボキシル基を含むように修飾されたものであってもよい。例示的なポリマーＣＢＦとしては、限定されないが、カルボキシル化多糖類（ＣＰＳ）、例えば、アルギネート（Ａｇ）、カルボキシメチル化−Ｄ−マンノ−Ｄ−グルカン（ＣＭＭＧ，Ｄａｉｉｃｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤｅｘ）、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣｈ，Ｋａｔａｋｕｒａ Ｃｈｉｋｋａｌｉｎ Ｃｏ．から入手可能）、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−アセチル化ヘパリン（ＤＳＨ）、およびヒアルロン酸（ＨＡ）などが挙げられる。ＤＳＨおよびＣＭＤｅｘは、Ｓｕｇａｈａｒａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，２４，５３５−５４３（２００１）に従って合成され得る。一般に、ヒドロキシル化枠組構造は、塩基性条件下でのクロロ酢酸との反応によってカルボキシル化され得る。ポリマー枠組構造の場合、モノマーに対するカルボキシル置換の度合は、１〜１００ｍｏｌ％の間で異なり得る。天然に存在するカルボキシル化ポリマーとしては、限定されないが、ポリ−Ｌ−グルタメートおよびポリ−Ｌ−アスパルテートなどのカルボキシル化ポリ（アミノ酸）（ＣＰＡＡ）が挙げられる。カルボキシレート含有量は、カルボキシル化アミノ酸（例えば、ポリマー主鎖の一部となるカルボキシル基に加えてカルボキシル基を有するアミノ酸）と、非カルボキシル化アミノ酸（例えば、カルボキシル基のみがポリマー主鎖の一部となるアミノ酸）を共重合させることにより、１〜１００％ｍｏｌ ＣＯＯＨ／ｍｏｌ ＡＡ残基の間で変動させ得る。
種々の実施形態において、アミン懸垂基を有する枠組構造（−ＮＨ２含有枠組構造、またはＮＢＦ）が使用され得る。かかる枠組構造は天然に存在するものであってもよく、第１級アミンを含むように化学修飾されたものであってもよい。後者としては、限定されないが、ポリマー枠組構造、例えば、アミン懸垂多糖類（ＮＰＳ）（脱アセチル化キトサン（Ｃｈ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）など）およびジエチルアミノエチルエーテルデキストラン（ＤＥＡＥＤｅｘ）、ＭＷ ５００，０００ｇ／ｍｏｌ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐａ．）が挙げられる。かかるポリマー枠組構造の場合、モノマーに対するアミン置換の度合は、１〜１００ｍｏｌ％の間で異なり得る。他の好適なＮＢＦとしては、限定されないが、２’位がプリン塩基の１つ以上でアミン基で誘導体化されたポリヌクレオチドが挙げられる。天然に存在するアミン化ポリマーとしては、限定されないが、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびそのエナンチオマーなどのポリ（アミノ酸）が挙げられる。アミン含有量は、アミン化アミノ酸（例えば、最終的にポリマー主鎖の一部となるアミン基に加えてアミンを有するアミノ酸）と、非アミン化アミノ酸（例えば、アミンのみが最終的にポリマー主鎖の一部となるアミノ酸）を共重合させることにより、１〜１００％ｍｏｌ ＮＨ２／ｍｏｌ アミノ酸残基の間で変動させ得る。
種々の実施形態において、ヒドロキシル懸垂基を有するポリマー（−ＯＨ含有枠組構造、またはＯＢＦ）が使用され得る。かかる枠組構造は、天然にヒドロキシル化されたものであってもよく、ヒドロキシル基を含むように化学修飾されたものであってもよい。デキストランに加えて、天然に存在するポリマーＯＢＦとしては、限定されないが、酵母マンナン（Ｍｎ）、プルラン（Ｐｌ）、アミロース（Ａｍ）、アミロペクチン（ＡｍＰ）、グリコゲン（Ｇｌ）、セルロース（Ｃｌ）、ヒアルロネート（Ｈｙ）、コンドロイチン（ＣｈＤ）、およびデキストリン（Ｄｘ）（これらはすべて、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販品として入手され得る）などの多糖類が挙げられる。また、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）、ポリ（チロシン）、およびポリ（４−ヒドロキシプロリン）などのポリ（アミノ酸）も、ヒドロキシル化ポリマーとして使用され得る。ポリ（アミノ酸）のヒドロキシル含有量は、ヒドロキシル化アミノ酸を非ヒドロキシル化アミノ酸と共重合させることにより、１〜１００％ｍｏｌ −ＯＨ／ｍｏｌ アミノ酸残基の間で変動させ得る。もちろん、カルボキシル（または反応性のエステル）、アミノ、およびヒドロキシル懸垂基は、適切なアミノ酸を所望の比率で共重合させることにより、単一のポリマー内で混合してもよい。
種々の実施形態において、スルフヒドリル懸垂基を有する枠組構造（−ＳＨ含有枠組構造、またはＳＢＦ）が使用され得る。ＳＢＦは、天然にスルフヒドリル化されたものであってもよく、スルフヒドリル基を含むように標準的な有機化学手法を用いて化学修飾されたものであってもよい。他の実施形態では、アルデヒド、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの懸垂基を有する枠組構造が使用され得る。
前述の類型の枠組構造に加えて、使用され得る一部の例示的なポリマーとしては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＧＡコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフマレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアセタール、生物分解性ポリシアノアクリレートおよび生物分解性ポリウレタンが挙げられる。
種々の実施形態において、下記一般式（ＩＶ）のコンジュゲートが使用され得る。
Figure 2012516338
式（ＩＶ）のコンジュゲートの種々の実施形態を実施例５７に詳細に記載するが、一般に、
Ｒｘは、水素または任意選択で置換されているＣ１−６アルキルであり；
Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２、３、４または５個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられており、式中、Ｒａは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
存在するＸ１は各々、独立して、−ＯＲＣまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、式中、Ｒｃは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するＸ１の少なくとも２つは親和性リガンドを含むものとし；
Ｙ１は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、式中、Ｒｅは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
ｒは、５〜２５（両端を含む）の整数であり；
Ｗ１は、薬物または検出可能な標識であり；
Figure 2012516338
は、共有結合性の単結合または二重結合に相当する
ことを理解されたい。
種々の実施形態において、下記の一般式（Ｖ）のコンジュゲートが使用され得る：
Figure 2012516338
（式中：
[(Ａ−Ｔ)]は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
(Ａ−Ｔ)は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
−Ａ−は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり；
存在するＴは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
存在するＲは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
存在するＬＢは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
存在するＬＤは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
存在するｐは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
存在するｎは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
存在するｍは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
存在するｖは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、存在する少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）。
一般式（Ｖ）（および本明細書における他の式）には、１つ１つの水素を明示していないことは理解されよう。例えば、中央の
−Ａ−がＣ６アリール基であり、ｋ＋ｑ＜６である場合、Ｃ６アリール環上の空き位置（１つまたは複数）には水素が含まれることは認識されよう。
一般に、−Ａ−は各々、存在し得る分岐節を表すこと、ならびに各節の分岐の数は、中央の−Ａ−のｋと、存在する中央でない−Ａ−のｎの値によって決定されることは認識されよう。ｋ≧２であるため、該コンジュゲートは常に少なくとも２つのｋ−分岐部を含む。当業者には、各ｎの存在が０〜５の整数であり得るため、本開示において、このようなコンジュゲートでは、分岐実施形態と超分岐（例えば、デンドリマー様）実施形態の両方が想定されることが認識されよう。各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎが≧１であり、存在する少なくとも１つのｖが≧１であることを必要とする条件により、どのコンジュゲートも、Ｂ（すなわち、親和性リガンド）の存在を伴う少なくとも２つの個別のｋ−分岐部を含むことが確実になる。
一部の特定の実施形態では、ｐ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている。例えば、両方のｋ−分岐部においてｋ＝２およびｐ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（Ｖａ）：
Figure 2012516338
のものであり得る。
他の実施形態では、ｐ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている。例えば、両方のｋ−分岐部においてｋ＝２およびｐ＝２である（ならびに両方のｋ−分岐部内の最初のｐ−括弧部分はｎ＝０である）場合、該コンジュゲートは、式（Ｖｂ）：
Figure 2012516338
のものであり得る。
一部の特定の実施形態では、ｍ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている。例えば、ｋ＝２、存在する各ｐ＝１、および存在する各ｍ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（Ｖｃ）：
Figure 2012516338
のものであり得る。
他の実施形態では、ｍ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている。例えば、ｋ＝２、存在する各ｐ＝１、および存在する各ｍ＝２である（ならびに各ｎ−分岐部内の第１のｍ−括弧部分についてｖ＝０である）場合、該コンジュゲートは、式（Ｖｄ）：
Figure 2012516338
のものであり得る。
さらなる一例として、先の式の両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝１である場合、該コンジュゲートは、式（Ｖｅ）：
Figure 2012516338
あるいはまた、先の式の両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（Ｖｆ）：
Figure 2012516338
種々の実施形態において、本開示により、また、コンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された親和性リガンドおよび／または薬物もしくは検出可能な標識を含むコンジュゲートが提供される。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式中：−Ａ−、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり；
存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
存在するＬＲＰＢは各々、独立して、ＴとＸ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
前述の任意の式のコンジュゲートが提供される。
また他の実施形態では、本開示により、式中：−Ａ−、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり；
存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
存在するＬＲＰＤは各々、独立して、ＴとＷ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
前述の任意の式のコンジュゲートが提供される。
他の実施形態では、本開示により、式中：−Ａ−、Ｔ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり；
存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
存在するＬＲＰＢは各々、独立して、ＴとＸ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
−Ｄは、−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり；
存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
存在するＬＲＰＤは各々、独立して、ＴとＷ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
前述の任意の式のコンジュゲートが提供される。
種々の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式（ＶＩ）：
Figure 2012516338
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｔ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎおよびｐは本明細書において定義および記載のとおりであり、ｋは、１〜１１（両端を含む）の整数であり、ｊは１〜４である。）を有するものであり得る。式（ＶＩ）のコンジュゲートは、薬物に対するリガンドのコンジュゲーション部位を多数有するものであってもよい。ｑが１である場合、ｊを１とした場合の式（ＶＩ）のコンジュゲートに対して、上記の亜属（式Ｖａ〜Ｖｆ）が適用されることは当業者に認識されよう。同様に、式中、ｊが２、３または４であるコンジュゲートに対して、類似した亜属が想定され得ることは当業者に認識されよう。
例示の目的で、および混乱の回避のため、式（ＶＩ）のコンジュゲート内に存在する−Ａ−Ｄ−Ａ−（すなわち、ｊが２である場合）を、−Ａ−Ｔ−ＬＤ−Ｗ−ＬＤ−Ｔ−Ａ−（薬物がコンジュゲートの枠組構造に共有結合されている場合）または−Ａ−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗ−ＬＲＰＤ−Ｔ−Ａ−（薬物がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合されている場合）で表し得ることを理解されたい。
例示的な基の説明
−Ａ（節）−
一部の特定の実施形態では、−Ａ−は各々、独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される、任意選択で置換されている基である。一部の実施形態では、各−Ａ−は同じである。一部の実施形態では、中央の−Ａ−は、存在する他のすべての−Ａ−と異なる。一部の特定の実施形態では、存在する−Ａ−はすべて、中央の−Ａ−以外、同じである。一部の実施形態では、−Ａ−は、任意選択で置換されているアリールまたはヘテロアリール基である。一部の実施形態では、−Ａ−は６員のアリールである。一部の特定の実施形態では、−Ａ−はフェニルである。一部の特定の実施形態では、−Ａ−は、Ｎ、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子である。一部の実施形態では、−Ａ−は窒素原子である。一部の実施形態では、−Ａ−は酸素原子である。一部の実施形態では、−Ａ−はイオウ原子である。一部の実施形態では、−Ａ−は炭素原子である。
Ｔ（スペーサー）
一部の特定の実施形態では、存在するＴは各々、独立して、二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔは、Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２、またはＣ１０−１２炭化水素鎖で構築されており、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている。
一部の実施形態では、Ｔが
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、Ｔが
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、Ｔが
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、Ｔが
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、Ｔが
Figure 2012516338
である。
一部の実施形態では、Ｔは
Figure 2012516338
である。
一部の特定の実施形態では、存在する各Ｔは同じである。
一部の特定の実施形態では、存在する各Ｔ（Ｂ基とＤ基の外側）が二重結合であり、該コンジュゲートは、一般式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）：
Figure 2012516338
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎ、ｐ、ｋおよびｊは、それぞれ、式（Ｖ）または（ＶＩ）で定義および記載のとおりである）のものである。
一般式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の一部の特定の実施形態では、−Ａ−は各々、中央の−Ａ−以外は二重結合であり、各ｖは１であり、該コンジュゲートは式（ＩＸ）または（Ｘ）：
Figure 2012516338
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｄ、ｑ、ｋおよびｊは、それぞれ、式（Ｖ）または（ＶＩ）で定義および記載のとおりである）のものである。
式（ＩＸ）の一部の特定のかかる実施形態では、ｋ＝２およびｑ＝１である。
他の実施形態では、ｋ＝３およびｑ＝１である。
他の実施形態では、ｋ＝２およびｑ＝２である。
式（Ｘ）の一部の特定のかかる実施形態では、ｋ＝１およびｊ＝２である。
他の実施形態では、ｋ＝２およびｊ＝２である。
他の実施形態では、ｋ＝３およびｊ＝２である。
他の実施形態では、ｋ＝１およびｊ＝３である。
他の実施形態では、ｋ＝２およびｊ＝３である。
他の実施形態では、ｋ＝３およびｊ＝３である。
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＸａ）：
Figure 2012516338
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
Figure 2012516338
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＸｂ）：
Figure 2012516338
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
Figure 2012516338
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＸｃ）：
Figure 2012516338
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
Figure 2012516338
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
式中、ｊが２、３または４である式（ＶＩＩＩ）のコンジュゲートに対して、当業者には、式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）および（ＶＩＩｃ）の亜属ならびにその一種に類似した亜属が想定され得ることは認識されよう。例えば、ｊが２である場合、一部の特定の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
一部の特定の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
Figure 2012516338
（式中、Ｗ、Ｘおよびｊは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
Ｂ（リガンド）
種々の実施形態において、−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり、式中、Ｘはリガンドであり；ＬＢは、共有結合であるか、またはＸとＴとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的なリガンドは上記のとおりであった。
Ｄ（薬物）
種々の実施形態において、−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり、式中、Ｗは薬物であり、ＬＤは共有結合であるか、またはＷとＴとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的な薬物は上記のとおりであった。
Ｄ（検出可能な標識）
上記のように、種々の実施形態において、Ｄ内のＷは検出可能な標識である。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、１コピーより多くの同じ標識を含むものであり得る、および／または１種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識（１種類または複数種）は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の１種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー（例えば、抗体またはアプタマー）に対して強い親和性を有する標識である。
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
ＬＢおよびＬＤ（共有結合性コンジュゲーション）
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、ＸとＴおよび／またはＷとＴ（包括的には、「構成要素」）の共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。該構成要素は、直接結合されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、スペーサー（例えば、コンジュゲート要素とコンジュゲートの枠組構造の残部との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に結合されていてもよい。該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、任意の数の化学結合（例えば、限定されないが、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなどの結合）によって共有結合され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、ＬＢおよび／またはＬＤ（一般的に、このセクションでの解釈上では「Ｌ」）は二重結合である。一部の実施形態では、Ｌは、Ｔの任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、ＸまたはＷのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Ｌは、ＸまたはＷの任意選択で置換されているカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、Ｔのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Ｌは、
Figure 2012516338
である。一部の実施形態では、Ｌはスクシンイミド部分である。
種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野で知られた「クリックケミストリー」反応を用いて共有結合され得る。該反応としては、例えば、付加環化反応、求核性開環反応、および炭素−炭素多重結合に対する付加が挙げられる（例えば、ＫｏｌｂおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ８：１１２８−１１３７、２００３ならびにそこに挙げられた参考文献ならびにＤｏｎｄｏｎｉ、Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ Ｊ．２：７００−７０８、２００７、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。上記に論考したように、種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、天然の、または化学的に付加した懸垂基を介して結合され得る。一般に、１対の反応性基の第１と第２の構成員（例えば、反応してアミド結合をもたらすカルボキシル基とアミン基）は、該構成要素と枠組構造のいずれか一方に存在し得る（すなわち、２つの構成員の相対位置は、これらが反応してコンジュゲートが得られる限り重要でない）ことは認識されよう。例示的な結合は、より詳細に以下に論考する。種々の実施形態において、カルボキシル（または反応性エステル）含有構成要素が、−ＯＨ含有枠組構造（ＯＢＦ）に、ＫｉｍらによるＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：４８４３−４８５１（２００３）に概要が示された手順を用いてコンジュゲートされ得る。簡単には、ＯＢＦをＤＭＳＯに、カルボキシル含有構成要素とともに溶解させ、触媒としてのＮ’，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）によって、乾燥雰囲気下で反応させる。カルボキシル含有構成要素は、−ＮＨ２含有枠組構造（ＮＢＦ）に、カルボジイミド（ＥＤＡＣ）カップリング手順を用いてコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、カルボキシル含有構成要素を、ｐＨ５の緩衝液中、ＥＤＡＣとの反応によって官能化した後、ＮＢＦに付加する。このような場合（および以下の任意の場合）ではいずれも、得られた生成物は、当業者に利用可能な任意の数の手段によって、例えば限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、および選択的沈殿によって精製され得る。
種々の実施形態において、アミン含有構成要素は−ＣＯＯＨ含有枠組構造（ＣＢＦ）にカップリングされ得る。ＣＢＦには、活性化型エステル部分が使用されている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。簡単には、末端活性化カルボン酸エステル（例えば、−ＮＨＳ、−ＳＳＣ、−ＮＰＣなど）を有するＣＢＦを、無水有機溶媒（ＤＭＳＯまたはＤＭＦなど）に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で数時間混合する。また、アミン含有構成要素は、Ｂａｕｄｙｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３、１９９８に記載のように、安定なアミド結合を得るためにＣＢＦにコンジュゲートされ得る。この反応は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）とクロロギ酸イソブチルを、ＣＢＦとアミン含有構成要素のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に、無水条件下で添加することにより行なわれ得る。あるいはまた、アミン含有構成要素をＯＢＦに、限定されないが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ｆｌｕｏｒｂｏｒａｔｅ）（ＣＤＡＰ）、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）などの試薬を用いるシアノ化（ｃｙａｎａｌａｔｉｏｎ）によってカップリングさせてもよい。ＣＮＢｒ反応は、水溶液中で弱塩基性ｐＨにて行なわれ得る。ＣＤＡＰ反応は、ＤＭＳＯと水の混合物中で弱塩基性ｐＨにて、触媒としてトリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いて行なわれる。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はＮＢＦに、例えば、ピリジンを含む水性緩衝溶液中でのグルタルアルデヒドカップリング後、グリシンでのクエンチングによってコンジュゲートされ得る。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はアルデヒド含有枠組構造に、シッフ塩基カップリング手順の使用後、還元することによりコンジュゲートされ得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＭｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。簡単には、末端活性化型アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなど）を有する枠組構造を、中性またはそれより低いｐＨを有する（好ましくないアルデヒドの加水分解を抑制するため）水性緩衝液に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で混合した後、過剰の適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ナトリウムシアノボロヒドリド、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドピリジンボラン、トリエチルアミンボランなど）を添加する。
種々の実施形態において、ヒドロキシル含有構成要素はＯＢＦに、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）手順に従ってコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、ＯＢＦをｐＨ１１．４の重炭酸緩衝液に添加し、ＤＶＳで活性化させ、続いてヒドロキシル含有構成要素を添加した後、グリシンを添加して反応液を中和およびクエンチする。また、ヒドロキシル含有構成要素をＯＢＦに、エステル結合をもたらす上記の活性化型エステル部分を用いてカップリングさせてもよい。
種々の実施形態において、スルフヒドリル含有構成要素がマレイミド含有枠組構造（ＭＢＦ）に、チオエーテル結合をもたらす比較的穏和な手順を用いてカップリングされ得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。マレイミド基は活性化型エステルよりもはるかに加水分解されにくいため、反応を水性条件下で行なってもよい。簡単には、ＭＢＦをｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液に溶解させた後、所望の当量数のスルフヒドリル含有構成要素を溶解させる。室温で数時間混合した後、チオエーテルカップリングコンジュゲートは精製され得る。スルフヒドリル含有構成要素を、Ｔｈｏｍａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５９１９−５９２９、１９９９に記載の方法に従ってＮＢＦにコンジュゲートさせてもよい。この反応は、ＮＢＦを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させた後、２，６−ルチジンと酸無水物を添加し、続いて反応性の中間体を精製することを伴う。次いで、スルフヒドリル含有構成要素を該中間体のＤＭＦ溶液（トリエチルアミンを含む）に添加する。
種々の実施形態において、アジド含有構成要素をアルキン含有枠組構造（ＡＢＦ）に、銅（Ｉ）触媒型の現代版Ｈｕｉｓｇｅｎ型アジド−アルキン付加環化を用いてカップリングさせると、１，４−ジ−置換１，２，３−トリアゾールを得ることができる（例えば、Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ Ｊ．２：７００−７０８，２００７およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＤｅｄｏｌａら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．５：１００６−１０１７、２００７を参照のこと）。この反応は、一般的に「クリック」反応と称され、例えば、無希釈ＴＨＦ中で、触媒系としてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとＣｕ（ＰＰｈＳ）３Ｂｒを用いて行なわれ得る（例えば、Ｗｕら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５７７５−５７７７、２００５を参照のこと）。また、この反応は、３：１（ＴＨＦ：水）混合物中、触媒系としてアスコルビン酸ナトリウムとＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを用いて行なわれ得る（例えば、Ｗｕら、上掲を参照のこと）。いずれの場合も、アジド含有構成要素をＡＢＦに所望の当量数で添加した後、室温で１２〜４８時間混合する。あるいはまた、アルキン含有構成要素をアジド含有枠組構造に、上記のものと厳密に同じ条件を用いてコンジュゲートさせてもよい。
一部の特定の該構成要素は、天然で、１つより多くの同じ化学反応性部分を有するものであり得る。一部の例では、該構成要素が該部位のうちの唯一の部位で選択的に反応するように化学反応型および条件を選択することが可能である。例えば、インスリンが反応性アミンを介してコンジュゲートされている場合、一部の特定の実施形態では、Ｎ末端α−Ｐｈｅ−Ｂ１は、インスリン生理活性を保持するのに、Ｎ末端α−Ｇｌｙ−Ａ１およびε−Ｌｙｓ−Ｂ２９よりも好ましい結合部位である（例えば、Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＴｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８、１９９７を参照のこと）。インスリンとヘキサデセナール（末端がアルデヒドの分子）との例示的な反応において、研究者らにより、この２つの構成要素を、ナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、５４％イソプロパノールを含む１．５ＭのｐＨ６．８のサリチル酸ナトリウム水溶液中で、１：６（インスリン：アルデヒドｍｏｌ／ｍｏｌ）の比で一晩混合すると、単一置換Ｐｈｅ−Ｂ１第２級アミンコンジュゲート生成物への８０％を超える変換がもたらされることが見出された（Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９）。彼らの研究により、溶媒、ｐＨ、およびインスリン：アルデヒド比の選択はすべて、反応の選択性および収率に影響を及ぼすことが示された。しかしながら、ほとんどの場合、化学反応条件の選択によって選択性を得ることは困難である。したがって、一部の特定の実施形態では、反応に所望される１つの部位以外すべての部位の該構成要素（例えば、インスリン）を選択的に保護し、続いて、物質体を反応させ、精製した後、脱保護工程を行なうことが好都合な場合があり得る。例えば、文献にて入手可能なインスリンのアミン基の選択的保護の例は数多くあり、酸性（ＢＯＣ）、弱酸性（無水シトラコン酸）、および塩基性（ＭＳＣ）条件下で脱保護され得るものが挙げられる（例えば、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８、１９９７；Ｄｉｘｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２−３１４、１９６８；およびＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒら、Ｄ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６０：１７２１，１９７９を参照のこと）。一例では、Ｇｌｙ−Ａ１とＬｙｓ−Ｂ２９のアミンがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基で選択的に保護され得、次いで、この基は、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％アニソールの溶液中、４Ｃで１時間のインキュベーションによるコンジュゲーション後に除去される。一実施形態では、インスリンの乾燥粉末を無水ＤＭＳＯに溶解させた後、過剰のトリエチルアミンを溶解させる。この溶液に、ほぼ２当量の重炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル溶液（ＴＨＦ中）をゆっくり添加し、溶液を３０〜６０分間混合する。反応後、粗製溶液を過剰のアセトンに注入した後、希ＨＣｌを滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。この沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄し、真空下で完全に乾燥させる。所望のジ−ＢＯＣ保護生成物は、未反応インスリン、所望でないジ−ＢＯＣ異性体、ならびにモノ−ＢＯＣおよびトリ−ＢＯＣ副生成物から、分取用逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離され得る（例えば、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８、１９９７を参照のこと）。 逆相ＨＰＬＣの場合、粗製生成物の７０％水／３０％アセトニトリル溶液（０．１％のＴＦＡ含有）をＣ８カラムに負荷し、アセトニトリル漸増勾配により溶出させる。所望のジ−ＢＯＣピークを収集し、回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋な生成物を得る。
ＬＲＰＢおよびＬＲＰＤ（非共有結合性コンジュゲーション）
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、ＸとＴおよび／またはＷとＴ（包括的には、「構成要素」）の非共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が該構成要素に共有結合され、該ペアの他方の構成員がコンジュゲートの枠組構造に共有結合される。該構成要素とコンジュゲート枠組構造を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、該構成要素がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。 他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎらによる「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
ｋおよびｑ
一般式（Ｖ）のコンジュゲートでは、ｋは２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定する。一部の特定の実施形態では、ｋ＝２または３である。ｑは１〜４（両端を含む）の整数であり、中央の−Ａ−基に結合されたＤ基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｑ＝１である。一部の実施形態では、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋ＋ｑ＝３または４である。
一般式（ＶＩ）のコンジュゲートでは、ｊが２、３または４のとき、ｋは、１〜１１（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋは１、２または３である。ｑは１〜４（両端を含む）の整数であり、中央の−Ａ−基に結合されたＤ基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｑ＝１である。一部の実施形態では、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋ＋ｑ＝３または４である。
ｐおよびｍ
存在するｐは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各ｐは同じである。一部の特定の実施形態では、ｐ＝１、２または３である。一部の特定の実施形態では、ｐ＝１である。
存在するｍは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各ｍは同じである。一部の特定の実施形態では、ｍ＝１、２または３である。一部の特定の実施形態では、ｍ＝１である。
ｎおよびｖ
存在するｎは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在するｎの少なくとも１つは≧１であるものとする。所与のｋ−分岐部内の分岐を、本明細書ではｎ−分岐部と称する。
一部の特定の実施形態では、ｐ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている（例えば、上記式（Ｖａ）を参照のこと）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｎは同じである。このような実施形態の一部において、ｎ＝１または２である。
他の実施形態では、ｐ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている（例えば、上記の式（Ｖｂ）を参照のこと）。一部の特定の実施形態では、各ｋ−分岐部に含まれるｎ≧１の存在は１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｎ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｎは同じである。このような実施形態の一部において、ｎ＝１または２である。
存在するｖは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在するｖの少なくとも１つは≧１であるものとする。
一部の特定の実施形態では、ｍ−括弧部分内に存在する−Ａ−各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている（例えば、上記式（Ｖｃ）を参照のこと）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。
他の実施形態では、ｍ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている（例えば、上記式（Ｖｄ）を参照のこと）。一部の特定の実施形態では、各ｋ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｖ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。一部の特定の実施形態では、各ｎ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が少なくとも１つである。一部の特定の実施形態では、各ｎ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｖ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。
ｊ
式（ＶＩ）のｊは１〜４（両端を含む）の整数であり、Ｄ基へのコンジュゲーションの数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｊ＝１である。一部の特定の実施形態では、ｊ＝２である。一部の実施形態では、ｊ＝３である。他の実施形態では、ｊ＝４である。
負荷レベル
一般に、コンジュゲートに負荷される薬物（または検出可能な標識）の数は、該薬物の分子量に依存し、コンジュゲートの枠組構造の分子量および／または化学的活性化（すなわち、懸垂基を枠組構造に付加した場合）のレベルを調整することにより制御され得る。種々の実施形態において、薬物および／または検出可能な標識の負荷レベルは、コンジュゲート（例えば、薬物など）に対して薬物および／または検出可能な標識が５〜９９％ｗ／ｗの範囲であり得る。種々の実施形態において、５０〜９９％のより狭い範囲内（例えば、８０〜９９％の範囲）の負荷レベルが使用され得る。
その他
種々の実施形態において、生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、例えば、生物分解性が適用用途に関係がない場合、および／または得られた枠組構造もしくはコンジュゲートが充分に良好に排出され、生物分解性が必要でない場合は、非生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、コンジュゲートの枠組構造（または存在する場合はスペーサー（例えば、薬物と枠組構造の間））は、酵素による消化に感受性である。種々の実施形態において、酵素は投与部位に存在する。当業者には、コンジュゲート枠組構造を切断し得るいくつかの酵素が患者に存在することが認識されよう。限定されないが、このようなものとしては、サッカリダーゼ、ペプチダーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。例示的なサッカリダーゼとしては、限定されないが、マルターゼ、スクラーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、およびデキストラナーゼが挙げられる。例示的なペプチダーゼとしては、限定されないが、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびグリシルグリシンジペプチダーゼが挙げられる。例示的なヌクレアーゼとしては、限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｅｌａｓｅ）Ｔ１、およびヌクレアーゼＳｌが挙げられる。
また、当業者には、酵素の選択によっては、酵素的切断に感受性が高いコンジュゲート枠組構造がいくつか存在することが認識されよう。例えば、サッカリダーゼ分解が所望される場合、多糖類を含む枠組構造が使用され得る（例えば、限定されないが、１，４−結合α−Ｄ−グルコース残基の反復鎖を含む多糖を含むコンジュゲートは、α−アミラーゼによって分解される）。限定されないが、好適な多糖類としては、任意の数の供給源、例えば限定されないが、スイートコーン、牡蠣、肝臓（ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、ウマ）、筋肉（ウサギ脚部、ウサギ腹部、魚、ラット）、ウサギの毛、フナガイ（ｓｌｉｐｐｅｒ ｌｉｍｐｅｔ）、パン酵母、および真菌由来のグリコゲンおよび部分消化グリコゲンが挙げられる。使用され得る他の多糖ポリマーおよびスペーサーとしては、カルボキシル化多糖類、−ＮＨ２懸垂多糖類、ヒドロキシル化多糖類、アルギネート、コラーゲン−グリコサミノグリカン、コラーゲン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、セルロース、ヒアルロネート、コンドロイチン、デキストリン、キトサンなどが挙げられる。ペプチダーゼ切断が所望される場合、切断酵素によって認識されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが使用され得る（例えば、限定されないが、［−グリシン−プロリン−］配列を含むコンジュゲートは、プロリダーゼによって分解される）。一部の特定の実施形態では、アミン化アミノ酸と非アミン化アミノ酸のコポリマー、ヒドロキシル化アミノ酸と非ヒドロキシル化アミノ酸のコポリマー、カルボキシル化アミノ酸と非カルボキシル化アミノ酸のコポリマー、上記のもののコポリマーまたは上記のものの付加物が使用され得る。ヌクレアーゼ分解が所望される場合、ポリヌクレオチドが使用され得る（例えば、限定されないが、連続アデノシン残基のオリゴマーを含むポリヌクレオチドを含むコンジュゲートは、リボヌクレアーゼＡによって分解される）。
種々の実施形態において、コンジュゲート（すなわち、コンジュゲート型薬物および／または化学的もしくは酵素的分解によってコンジュゲートから放出された薬物）の薬物動態的および／または薬力学的挙動は、対応する非コンジュゲート薬物と実質的に同じであり得る（例えば、ともに、皮下投与した場合）。例えば、薬物動態的（ＰＫ）見地から、血清濃度曲線は、同量の非コンジュゲート薬物を投与した場合と実質的に同じであり得る。付加的または択一的に、血清Ｔ最大、血清Ｃ最大、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期は、非コンジュゲート薬物を投与した場合と実質的に同じであり得る。薬力学的（ＰＤ）見地からは、該コンジュゲートは、体内物質に対して、非コンジュゲート薬物と実質的に同様に作用し得る。例えば、インスリンコンジュゲートの場合、該コンジュゲートは、血中グルコースレベルに対して非コンジュゲートインスリンと実質的に同様の影響を及ぼし得る。この場合、実質的に同様の薬力学的挙動は、最小血中グルコース濃度（Ｔ底）に達するまでの時間、血中グルコースレベルが初期値の一定の割合より下（例えば、初期値の７０％またはＴ７０％ ＢＧＬ）の状態に維持される持続時間などを比較することにより観察され得る。このようなＰＫおよびＰＤ特性は、公開された任意のさまざまな薬物動態的および薬力学的方法に従って測定され得ることは認識されよう（例えば、皮下送達に適した方法については、Ｂａｕｄｙｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３、１９９８を参照のこと）。
一実施形態において、コンジュゲート（すなわち、修飾レクチンなしの単離された形態）では、非コンジュゲート薬物で測定される値の４０％以内である薬物動態的（ＰＫ）パラメータ（最大血清薬物濃度に達する時間（Ｔ最大）、平均薬物滞留時間（ＭＲＴ）、血清半減期、および平均薬物吸収時間（ＭＡＴ）など）が得られる。種々の実施形態において、コンジュゲートでは、非コンジュゲート薬物で得られるものの３５％、３０％、２５％、２０％、１５％以内、あるいはさらに１０％以内であるＰＫパラメータが得られる。一部の実施形態では、コンジュゲートでは、非コンジュゲート薬物で得られるものの２０％以内であるＰＫパラメータが得られる。例えば、皮下送達のためのインスリンコンジュゲートに関する実施形態では、１５〜３０分のインスリンＴ最大、５０分未満の平均インスリン滞留時間（ＭＲＴ）、または４０分未満の平均インスリン吸収時間（ＭＡＴ）が得られ得、これらはすべて、ヒト組換えインスリン処置群で測定される値の２０％以内である。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、２０〜２５分のインスリンＴ最大、４５分未満の平均インスリン滞留時間（ＭＲＴ）、および３５分未満の平均インスリン吸収時間（ＭＡＴ）が得られ得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、１２０分未満、例えば、１００分未満の血清半減期が得られ得る。
一実施形態において、本発明のコンジュゲートでは、物質の最小／最大血中濃度に達する時間（Ｔ底／Ｔ最大）または物質の血中レベルが初期値の７０％より下／１３０％より上の状態に維持される持続時間（Ｔ７０％ＢＬ／Ｔ１３０％ＡＬ）などの薬力学的（ＰＤ）パラメータが得られる。例えば、皮下送達のためのインスリンコンジュゲートに関する実施形態では、コンジュゲートで、４５〜６０分のグルコースＴ底および１８０分未満のグルコースＴ７０％ＢＧＬが得られ得、これらはどちらも、ヒト組換えインスリン処置群で測定される値の２０％以内である。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、５０〜５５分のグルコースＴ底および１６０分未満のグルコースＴ７０％ＢＧＬが得られ得る。種々の実施形態において、コンジュゲートで、非コンジュゲート薬物で得られるものの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％以内、あるいはさらに１０％以内であるＰＤパラメータが得られる。一部の実施形態では、コンジュゲートで、非コンジュゲート薬物で得られるものの２０％以内であるＰＤパラメータが得られる。
コンジュゲートの調製のための中間体
一態様において、本発明は、本開示のコンジュゲートを調製するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態において、一般式（Ｖ）：
（式中、−Ａ−、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；Ｂは、−Ｔ−ＬＢ’であり；
存在するＬＢ’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である）の化合物が提供される。
他の実施形態では、一般式（Ｖ）：
（式中、−Ａ−、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
Ｄは、−Ｔ−ＬＤ’であり；
存在するＬＤ’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である）の化合物が提供される。
コンジュゲートの調製方法
本発明者らは、例示的な薬物としてインスリン、ならびに例示的な親和性リガンドとしてアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）、および／またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を使用し、前記コンジュゲートの調製方法の例を示した。限定されないが、２つの親和性リガンドと１つの薬物分子を有し、すべての枠組構造の構成要素間の距離が短いコンジュゲートは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、ｔｒｉｓ−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（ＴＳＢ）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）をコンジュゲート枠組構造として用いて調製され得る。枠組構造の構成要素間にさらなる間隔が所望される場合は、スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、スクシンイミジル（６−アミノ（ＰＥＯ−６））アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６）、ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−１０−アミノデカン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ１０）が使用され得る。ＴＳＡＴ−Ｃ６スペーサーアームの化学的性質はＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６と比べ、該コンジュゲートに対して、より疎水性の性質を付与する。例えば、例示の目的で、一実施形態において、親和性リガンド（例えば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＭＢおよびＡＥＴＭ）とインスリンの両方を、ＴＳＡＴ−Ｃ６枠組構造に対して、末端活性化型エステルを介して反応させると、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＧ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭＢ−２、およびインスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２コンジュゲートが得られ得る。本実施例に論考しているように、種々の親和性リガンドを事前に合成する。また、インスリンのＡ１およびＢ２９アミノ基は、本実施例に記載のようにして、各インスリンがＰｈｅ−Ｂ１ α−アミノ基でのみ反応し得るようにＢＯＣ−保護する。ほぼ１当量のＢＯＣ−インスリンを、４０〜５０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として、室温で、過剰のトリエチルアミンを含有する５０ｍｇ／ｍｌのＴＳＡＴ−Ｃ６のＤＭＳＯ溶液に添加し、ほぼ１時間反応させる。次に、過剰のＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよび／またはＡＥＴＭ（２〜１０当量）を１００ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として添加し、さらに２時間反応させる。 反応後、このＤＭＳＯ溶液をｐＨ５の生理食塩水緩衝液中で１０倍に超希釈した後、ｐＨを８．０に調整し、溶液をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通して低分子量反応体および塩類を除去する。ボイド画分中に溶出された物質を、３Ｋ限外濾過装置を用いて濃縮した後、これを、分取規模の逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ８，０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル／水移動相）にインジェクションし、所望の生成物を未反応ＢＯＣ２−インスリンから精製する。所望の溶出ピークを収集し、プールし、回転濃縮してアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得る。最後に、この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０Ｍ ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍超希釈することにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、この物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通して、アニソール、ＢＯＣ、および他の混入塩を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。
この例示的な手順を使用し、ＴＳＡＴ−Ｃ６枠組構造を異なる枠組構造（後述）で置き換えることにより、親和性リガンドと薬物が異なる、コンジュゲーション化学反応が異なる、枠組構造の構成要素間の間隔が異なる、および／または結合価が異なる他のコンジュゲートが作製され得ることは認識されよう。
例えば、枠組構造の構成要素間にさらなる距離が必要とされる場合、および／またはコンジュゲーション部位に保存電荷が必要とされる場合は、適切なサイズのアミン含有ジエチルアセタール（例えば、アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（ＡＰＤＡ）またはアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ））を、本明細書に記載の該枠組構造上の反応性基の１つにコンジュゲートさせた後、残りの反応性基と対象の親和性リガンド（例えば、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、またはＡＥＴＭ）との反応を完了させてもよい。次いで、酸性条件下で該ジエチルアセタールから反応性アルデヒド基を顕在化させた後、インスリンとの還元的アミノ化を行なうと、薬物コンジュゲーション工程が完了し得、次いで、ＡＢＤＡ−ＴＳＡＴ、ＡＢＤＡ−ＬＣＴＳＡＴなどが使用され得る。また別の例では、テトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトール（ＴＳＰＥ）を使用し、多価性の増大のために３つの親和性リガンドと１つ薬物分子が結合され得る。また、上記のいずれかの教示を用いて、さらに高次の結合価を有する超分岐（例えば、デンドリマー様）コンジュゲートが作製され得ることは当業者に認識されよう。例えば、ＲｏｅｃｋｅｎｄｏｒｆおよびＬｉｎｄｈｏｒｓｔにより、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２１７：２０２−２３８、２００１に、超分岐構造を作製するための現行のアプローチの包括的な概説が示されている。
さらに、既に所定の多価性度合を含むリガンドを、上記の手順に従って再度反応させ、さらに高次のリガンド多重性を得てもよい。例えば、反応性末端アミンを含む二価のＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、またはＡＥＴＭ−２分子は、２つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。反応性末端アミンを含む三価のＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３、またはＡＥＴＭ−３分子は、３つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。ＮＨ２−二価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子１つあたり４〜６個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。ＮＨ２−三価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子１つあたり６〜９個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。
すべての場合において、異なるリガンドの混合物は同じ薬物に、多価枠組構造の化学的性質、結合価、およびリガンド：該枠組構造の化学量論性を調整することにより該枠組構造を介してコンジュゲートされ得ることを認識されたい。例えば、インスリン−ＡＥＭ−１−ＡＥＢＭ−１、インスリン−ＡＥＢＭ−１−ＡＥＴＭ−１、インスリンＡＥＭ−２−ＡＥＴＭ−２、およびインスリンＡＥＭ−１−ＡＥＴＭ−２はすべて、この混合型リガンド法に従って合成され得る。
最後に、一部の場合では、親和性リガンドを枠組構造に、薬物とは異なる手段によってコンジュゲートさせることが望ましい場合があり得る。例えば、二価マレイミド／活性（ａｃｔｉｖａｔｅ）一価エステル官能化枠組構造（例えば、スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾエート（ＳＤＭＢ））は、２つのスルフヒドリル官能化親和性リガンドと、１つのアミン官能化薬物を個別の工程でコンジュゲートさせるために使用され得る。例えば、インスリンまたは別のアミン含有薬物が枠組構造の活性化型エステル部分に、本明細書に記載の方法を用いてコンジュゲートされ得る。別工程で、アミノエチル糖類（ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を、４−イミノチオランを用いた反応によって、末端スルフヒドリル含有リガンドに変換させてもよい。最後に、枠組構造−ジ−マレイミド−インスリンコンジュゲートを、過剰のスルフヒドリル官能化糖類と混合すると、二価糖類−インスリンコンジュゲートの生成がもたらされ得る。
架橋物質体
コンジュゲートと架橋剤を標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は、水溶液中で、架橋剤とコンジュゲートの溶液を混合することにより自己集合によって調製され得る。種々の実施形態において、逆乳化によって該物質体の粒子が調製され得る。より詳細に米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９に記載されているように、これは、前記水溶液を、疎水性液と界面活性剤の混合物に添加し、混合物を撹拌することにより行なわれ得る。
架橋物質体は、形成されたら、さまざまな適用用途に使用され得る。該物質体を遊離標的分子の存在下に入れると、該分子は、架橋剤とコンジュゲート間の相互作用に関して競合する。遊離標的分子がある一定濃度より多くなると、該物質体は、コンジュゲートを表面から放出することにより分解され始めるような競合レベルになる。種々の実施形態において、放出の程度および／または速度は、標的分子の濃度が増大するにつれて増大する。その結果、コンジュゲートは該物質体から、標的分子の局所濃度に直接関連する様式で放出される。
一般に、該物質体の放出特性は、架橋剤、コンジュゲート、標的分子の性質および条件（例えば、ｐＨ、温度など）に依存する。架橋剤の親和性が、標的分子に対するよりもコンジュゲートに対する方がずっと大きい場合、該物質体は、高い標的分子濃度でコンジュゲートのみを放出する。コンジュゲートに対する架橋剤の相対親和性が減少するにつれて、該物質体からのコンジュゲートの放出は、より低い標的分子濃度で起こる。また、該物質体の放出特性は、コンジュゲートに対する架橋剤の相対量を変更することにより調整され得る。コンジュゲートに対する架橋剤の比率が高いほど、より高い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。コンジュゲートに対する架橋剤の比率が低いほど、より低い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。適用用途に応じて、このような変更により、多種多様な標的分子濃度に応答する物質体を作製することが可能なことは認識されよう。
種々の実施形態において、架橋物質体は、３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ）に入れたとき不溶性である。種々の実施形態において、標的分子を該緩衝液に、セットポイントと称される閾値濃度まで添加したとき、架橋物質体は実質的に不溶性のままである。セットポイントより上では、架橋物質体は、コンジュゲートの放出の程度および速度の増大を示す。この遷移は、急激に起こることもあり、セットポイント近くの一連の濃度にわたって緩徐に起こり得ることは認識されよう。一般に、所望のセットポイントおよび遷移は、標的分子の性質および該物質体の意図される適用用途に依存する。特に、該物質体を、特定の標的分子のレベルの増大に応答するように設計した場合、所望のセットポイントは、標的分子の通常の生理学的濃度範囲に基づいて決定される。患者内に存在する標的分子の量は、内的および／または外的要因に基づいて変動し得ることは理解されよう。例えば、一部の特定の実施形態では、標的分子の量は、例えば、ホルモン性サイクルまたは代謝経路の変化（耐久事象の際に増大する乳酸など）に応答して経時的に自然に変動し得る。一部の特定の実施形態では、該変動は、外的事象、例えば、食後のグルコースの増大に起因するものであり得る。種々の実施形態において、外的要因は、本開示の物質体からのコンジュゲートの放出を人工的に誘発するために使用され得る。例えば、コンジュゲートの放出がグルコースの増加に感受性である場合、コンジュゲートは、高グルコース飲料の摂取により、短期間で人工的に放出され得る。
種々の実施形態において、標的分子はグルコースである。ヒトの通常のグルコースの生理学的濃度範囲は６０〜２００ｍｇ／ｄＬである。６０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度を低血糖とみなす。２００ｍｇ／ｄＬより高いグルコース濃度を高血糖とみなす。種々の実施形態において、本開示の物質体は、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、実質的に不溶性のままであり得る。種々の実施形態において、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、溶解する物質体は１、２、４、６、８または１０％未満である。種々の実施形態において、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、本開示の物質体の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％が溶解する。
以下の表に、他の例示的な標的分子の通常の生理学的範囲を示す。
Figure 2012516338
これらおよび他の標的分子に対する所望のセットポイントは、さまざまな異なる適用用途に対して容易に決定され得ることは認識されよう。また、セットポイントは、特定の患者（例えば、患者の性別、患者が有する標的分子レベルが異常に低いか、高いかなどに基づいて）または適用用途（例えば、より高い頻度基準で放出するように設計された薬物送達系に必要とされ得る閾値濃度は、より低い頻度で放出するように設計された系よりも低い）に対して調整する必要があり得ることも認識されよう。
所望のセットポイントを有する物質体は、本明細書に記載の材料および方法を用いて、常套的な実験手法によって作製され得ることは認識されよう。例えば、同じ架橋剤とコンジュゲートを組み合わせて、コンジュゲートに対する架橋剤の比（ｗ／ｗ）を漸増させた一連の物質体を作製することができる。このような物質体は、ある範囲のセットポイントをカバーする。適当なセットポイントを有するリード物質体が特定されたら、最適化物質体を得るために、より精密な解像を用いて該プロセスを繰り返してもよい。択一的に（または付加的に）、同じコンジュゲートを、該コンジュゲートに対して親和性を漸増させた複数の異なる架橋剤と組み合わせてもよい。これにより、ある範囲のセットポイントを有する複数の物質体が得られ、これを、さらに精密化してもよい（例えば、コンジュゲートに対する架橋剤のｗ／ｗ比を変更することにより）。あるいはまた、同じ架橋剤を複数の異なるコンジュゲートと組み合わせることにより該プロセスを開始してもよい。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、該架橋剤に対して種々の親和性を有するものであり得る（例えば、異なる親和性リガンドを含めた結果として）。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、同じ親和性リガンドを含むが、異なる分子量を有するものであり得る（例えば、コンジュゲート枠組構造が異なる結果として）。
使用
別の態様では、本開示により、該物質体の使用方法を提供する。一般に、該物質体は、標的分子に応答して該コンジュゲートを制御可能に放出させるために使用され得る。以下に論考するように、該物質体は標的分子と、インビトロで接触させてもよく、インビボで接触させてもよい。
種々の実施形態において、該物質体は、インビトロまたはインビボ化学センサーの構成要素として使用され得る。この態様を以下に、グルコースセンサーとの関連において説明するが、前述のことから、単に異なる標的分子を使用することで、他の化学センサーが作製され得ることは認識されよう。
例えば、種々の実施形態において、本開示の物質体は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づいたグルコースセンサーに使用され得る。ＦＲＥＴは、２種類の異なるフルオロフォアが互いに近づくと、これにより、この２種類のフルオロフォア間でのエネルギー転移が可能になり、一方または両方のフルオロフォアの蛍光の減少（蛍光の消光と称される）がもたらされることに基づいている（Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ３４５：２０３−２１２、１９９７）。例えば、一部の特定の実施形態において、グルコースの非存在下では、蛍光標識架橋剤と蛍光標識コンジュゲートの混合物が不溶性の架橋物質体を形成し、近隣のフルオロフォアがＦＲＥＴを受ける。グルコースの存在下では、蛍光標識架橋剤と蛍光標識コンジュゲート間の平均距離が増大して、ＦＲＥＴレベルの減少が引き起こされ、それにより、個々の蛍光シグナルの増大がもたらされる。そのため、蛍光レベルはグルコースレベルと直接相関し得る蛍光標識ペアの代わりに、近接すると測定可能な応答をもたらす択一的な標識ペアを使用してもよいことは理解されよう。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明は、（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンであって、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関してグルコースと競合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含み、また、第１の標識を含む多価レクチンと、（ｂ）親和性リガンドおよび第２の標識を含むコンジュゲートとを混合する工程、ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす；（ＩＩ）試料を、該多価レクチンと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該レクチンと、該多価レクチンに対する親和性結合によって架橋物質体を形成して測定可能な応答をもたらし、（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該多価レクチン上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される；ならびに（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程を含む方法を提供する。一部の特定の実施形態では、第１および第２の標識は蛍光標識であり、応答は蛍光シグナルである。
一部の特定の実施形態では、２つの標識（例えば、蛍光標識）は、同じ多価レクチンに結合することにより近接する異なる分子上に配置され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明は、（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンであって、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関してグルコースと競合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含む多価レクチンと、（ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群と、（ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群とを混合する工程、ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、（ＩＩ）試料を、該多価レクチンと第１の分子群および第２の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、第１の分子群および第２の分子群の構成員は、該多価レクチンに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第１および第２の分子と、該多価レクチン上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される；ならびに（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程を含む方法を提供する。一部の特定の実施形態では、第１および第２の標識は蛍光標識であり、応答は蛍光シグナルである。
他の例示的な実施形態において、本開示の物質体は、粘度系グルコースセンサーに使用され得る（例えば、米国特許第６，２６７，００２号；同第６，４７７，８９１号；および同第６，９３８，４６３号を参照のこと）。この場合も、該コンジュゲートと該架橋剤を合わせると架橋物質体が形成される。次に、該物質体にグルコースを添加すると、測定可能な（例えば、円錐平板型構造のマイクロビスコメータ機構を使用し、剪断速度の関数として）粘度の濃度依存的低下が引き起こされる。そのため、試料の粘度は、グルコースレベルと直接相関し得る。これらの２つの例示的なグルコースセンサーは、該コンジュゲート内になんら薬物の存在を必要としないことは認識されよう。また、該粘度系センサーは、該コンジュゲート内に検出可能な標識の存在を必要としないことも認識されよう。
一部の特定の実施形態では、本発明は、（Ｉ）（ａ）複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、（ｂ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンであって、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関してグルコースと競合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含む多価レクチンを準備する工程；（ＩＩ）該コンジュゲートと該レクチンを混合する工程、ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該レクチン間の結合によるものである；（ＩＩＩ）該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、これにより、該コンジュゲートが該レクチンから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる；ならびに（ＩＶ）生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程を含む方法を提供する。
種々の実施形態において、該物質体は、患者に薬物を制御可能に送達するために使用され得る。本発明は、本開示の物質体を投与することによる疾患または病状の処置を包含する。該物質体は、任意の患者（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど）の処置に使用され得るが、ヒトの処置に最も好ましく使用される。該物質体は、患者に任意の経路によって投与され得る。一般に、最も適切な投与経路は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状の性質、薬物の性質、標的分子の性質、患者の体調などに依存する。一般に、本開示は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、脳室内、経皮、経直腸、膣内、腹腔内、経表面（粉剤、軟膏もしくは滴剤により）、口腔内による投与、または経口もしくは経鼻スプレー剤もしくはエーロゾル剤としての投与を包含する。このような種々の経路のための医薬組成物の製剤化および製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５に記載されている。
種々の実施形態において、該物質体は、例えば注射によって皮下投与され得る。該物質体を、送達を容易にするための担体に溶解させてもよい。例えば、担体は、水溶液、限定されないが、例えば滅菌水、生理食塩水または緩衝生理食塩水であり得る。一般に、コンジュゲート形態の薬物の治療有効量が投与される。薬物の「治療有効量」により、妥当な便益／リスク比（これに、薬物の有効性と毒性の均衡が関与する）で疾患または病状を処置するのに（例えば、その症状が改善される、進行が遅延される、再発が抑制される、発症が遅延されるなどに）充分な薬物の量を意図する。一般に、治療有効性と毒性は、標準的な薬理学的手順によって、細胞培養物において、または実験動物を用いて、例えば、ＥＤ５０（処置した被検体の５０％において治療上有効である用量）およびＬＤ５０（処置した被検体の５０％に対して致死性の用量）を計算することにより判定され得る。ＥＤ５０／ＬＤ５０は薬物の治療指数を表す。一般に、当該技術分野で周知のように、大きな治療指数を有する薬物が好ましいが、重篤な疾患または病状の場合、特に、択一的な治療選択肢がない場合は、小さい治療指数が許容され得る。ヒトに対する投与のための適切な最終選択用量範囲は、臨床試験の過程で決定される。
種々の実施形態において、薬物はインスリンであり、インスリンの平均日用量は１０〜２００Ｕ、例えば、２５〜１００Ｕの範囲である（ここで、インスリン１単位は約０．０４ｍｇである）。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量を伴う量の該物質体が、１日単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の５〜１０倍の用量を伴う量の該物質体が、１週間単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の１０〜２０倍の用量を伴う量の該物質体が、隔週単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の２０〜４０倍の用量を伴う量の該物質体が、月単位で投与される。当業者には、この同じアプローチを、用量範囲が既知の承認された他の薬物（例えば、本明細書に記載の承認されたインスリン感受性改善薬およびインスリン分泌促進薬のいずれか）に当てはめてもよいことは認識されよう。
任意の所与の患者に対する薬物の１日の総使用量は、担当医師によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状；使用される具体的な薬物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；使用される具体的な薬物の投与期間、投与経路および排出速度；処置の持続時間；使用される具体的な薬物と併用して、または同時に使用されている薬物；ならびに医学分野で周知の同様の要素に依存する。種々の実施形態において、本開示の物質体は、１回より多くの場合で投与され得る。例えば、本開示は、具体的に、該物質体が患者に皮下注射によって、連続的スケジュール（例えば、１日１回、２日に１回、週１回、２週間に１回、月１回など）で投与される方法を包含する。
一部の特定の実施形態では、本開示の物質体は、患者（例えば、哺乳動物患者）の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、患者は糖尿病である。しかしながら、本発明の方法は糖尿病患者の処置に限定されない。例えば、一部の特定の実施形態では、該物質体は、血糖コントロールの障害に関連する感染を有する患者の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、該物質体は糖尿病を処置するために使用され得る。
種々の実施形態において、本開示の物質体は、少なくとも１種類のさらなる治療薬を受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、該少なくとも１種類のさらなる治療法は、投与される該物質体と同じ疾患または障害の処置を意図するものである。種々の実施形態において、該少なくとも１種類のさらなる治療法は、主薬の副作用の処置を意図するものである。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療法の恩恵を受けている間中、同じ時間枠で投与しても、重複する時間枠で投与しても、重複しない時間枠で投与してもよい。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療薬の恩恵を受けている間中、同じスケジュールで投与しても、異なるスケジュールで投与してもよい。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療薬の恩恵を受けている間中、同じ製剤にて投与しても、異なる製剤にて投与してもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の単独の物質体は、同じ疾患または障害を処置するための薬物を１種類より多く含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、同じ疾患または障害を処置するための異なる薬物を含む本開示の２種類以上の別個の物質体が投与され得る（混合物として、または別々に）。一部の特定の実施形態では、非コンジュゲート型の二次薬物を本開示の物質体に含めてもよい（すなわち、該物質体の成分と単に混合されるだけで、該架橋物質体に共有結合されない薬物）。例えば、一部の特定の実施形態では、このようなアプローチのいずれかを用いて、１種類より多くの抗糖尿病薬が被検体に投与され得る。このアプローチの一部の特定の例示的な実施形態をインスリン関連治療との関連において、より詳細に以下に記載するが、前述のことから、他の治療法のかかる併用アプローチの恩恵を受けることは認識されよう。
インスリン感受性改善薬（例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド）は、所与の量のインスリンに対する患者の応答を増大させることにより作用する。したがって、インスリン感受性改善薬を受けている患者に必要とされる、本開示のインスリン系物質体の用量は、該改善薬を受けていない同一の患者よりも少ない。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む該物質体が、インスリン感受性改善薬での処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、本開示の物質体は、インスリン感受性改善薬の非存在下で必要とされる通常の用量の７５％までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の５０、４０、３０または２０％までが投与され得る。
インスリン抵抗性は、通常のインスリン量が、正常なインスリン応答をもたらすのに不充分な障害である。例えば、インスリン抵抗性患者には、その抵抗性を克服し、充分なグルコース降下効果をもたらすために、高用量のインスリンが必要とされ得る。このような場合、抵抗性が低い患者において通常、低血糖が誘導され得るインスリン用量では、高度に抵抗性の患者において同等のグルコース降下効果は奏されない。同様に、本開示の物質体は、適当な時間枠で高レベルのインスリン−コンジュゲートが放出される場合、このサブクラスの患者に対してのみ有効である。一部の特定の実施形態では、このサブクラスの患者の処置は、該２つのアプローチを併用することにより助長され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、従来のインスリン系治療剤を用いてインスリンのベースラインレベルを得、患者の必要時に、本発明の物質体を投与してインスリン補充の制御をもたらす。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む物質体が、インスリンでの処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、インスリンは、本開示の物質体の非存在下で必要とされる通常の用量の７５％までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の５０、４０、３０または２０％までが投与され得る。この併用アプローチは、インスリン分泌促進薬（例えば、スルホニル尿素、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４など）および／またはインスリン感受性改善薬（例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド）を受けているインスリン抵抗性患者でも使用され得ることは認識されよう。
キット
別の態様において、本開示により、修飾レクチンとコンジュゲートと、物質体を調製するための他の試薬とを含むキットを提供する。例えば、キットは、複数のコンジュゲートおよび複数の修飾レクチンを内包する個別の容器を含むものであり得る。キットのコンジュゲートと修飾レクチンを混合すると、架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は皮下送達用に設計され、キットはシリンジまたはペンを含む。種々の実施形態において、キットは、架橋物質体が予め充填されたシリンジまたはペンを含むものであり得る。また、キットに、該コンジュゲートと修飾レクチンを混合して架橋物質体を得るための使用説明書を含めてもよい。
また別の態様において、本開示により、コンジュゲートおよび／または修飾レクチンのライブラリーを提供する。このようなライブラリーは、所望のセットポイントを有する物質体の作製に特に有用であり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じコンジュゲートで異なるセットポイントをもたらす複数の修飾レクチンを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内の修飾レクチンと架橋物質体を形成する１種類以上のコンジュゲートを含むものであり得る。ライブラリーが１種類より多くのかかるコンジュゲートを含む場合、異なるコンジュゲートは、異なる分子量、コンジュゲート分子１つあたり異なる数の親和性リガンドおよび／または異なる親和性リガンドを有するものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、１種類より多くの型の親和性リガンドを含むコンジュゲートを１つ以上含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じ修飾レクチンで異なるセットポイントをもたらす複数のコンジュゲートを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内でコンジュゲートとともに架橋物質体を形成する１種類以上の修飾レクチンを含むものであり得る。
また別の態様において、本開示により、（ａ）第１の標識を含む修飾レクチンを含む第１容器と、（ｂ）第２の標識を含むコンジュゲートを含む第２容器を備えており、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらすキットを提供する。
また別の態様において、本開示により、（ａ）修飾レクチンを含む第１容器と、（ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群を含む第２容器と、（ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群を含む第３容器とを備えており、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらすキットを提供する。一部の特定の実施形態では、第１および第２の分子は同じ容器内に存在している。
実施例
Ｉ．例示的コンジュゲートの作製方法
この第１の組の実施例では、例示的コンジュゲートを作製するための種々の方法を記載する。また、この実施例は、出発成分および最終生成物を精製およびアッセイするためのアッセイも含む。これらの方法は、本発明の範囲に含まれる他のコンジュゲートを作製するために変形してもよいことは理解されよう。
実施例１−アジドエチルグルコース（ＡｚＥＧ）の合成
ａ．ブロモエチル（ｅｔｈｙｌｅ）グルコースの合成
ＤＯＷＥＸ ５０Ｗｘ４レジン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を脱イオン水で洗浄して脱色した。２２５ｇのＤ−グルコース（１．２５ｍｏｌ；１当量、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）と１４０ｇのＤＯＷＥＸ ５０Ｗｘ４の混合物を、２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ、２５当量；１２４．９７ｇ／ｍｏｌ；１．７６２ｇ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０Ｃ；Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で処理し、この撹拌混合物を８０Ｃまで４時間加熱した。反応を、ＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によってモニタリングした。約４時間後に反応が終了し、室温まで放冷した。この溶液を濾過してレジンを除去し、レジンを酢酸エチルとＤＣＭとで洗浄した。 得られた濾液を回転式エバポレータ内でストリッピングすると、琥珀色の油状物となった。ストリッピング後の合計４００ｇ。
この琥珀色の油状物をシリカゲル（４ｋｇのシリカ充填ＤＣＭ）で、以下のようにして精製した。粗製物をＤＣＭに溶解させ、カラムに負荷し、次いで、２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭを用いて溶出させた。生成物含有画分（ＴＬＣに基づいて）をプールし、ストリッピングして乾固させ、１５２ｇの１−α−ブロモエチル−グルコース（４２％）を得た。
ｂ．ブロモエチルグルコースのアジドエチルグルコース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を取り付けた５Ｌ容の丸底３つ口フラスコに、１５０ｇのブロモエチルグルコース（５２５ｍｍｏｌ）を仕込んだ。この油状物を２Ｌの水に溶解させ、６８．３ｇのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理した後、７．９ｇのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、この溶液を５０Ｃまで昇温させ、一晩撹拌した。この溶液を室温まで冷却させ、回転式エバポレータにて濃縮乾固した。固形残渣を、３×５００ｍＬの５：１（容量比）ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを用いて４０Ｃで温浸させた。合わせた有機部分を濾過し、蒸発乾固し、アジドエチルグルコース（８６ｇ）をオフホワイト色固形物として得た。ＴＬＣ（２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；Ｈ２ＳＯ４を含む炭化物）：単一スポット、出発材料と識別不能。
ｃ．アジドエチルグルコースの再精製
３２ｇのアジドエチルグルコースを１００ｍＬの水中に入れた。混濁した溶液を、ガラスマイクロファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂ）に通して濾過した。金色の濾液を回転式エバポレータにてエバポレートすると固形物になった。この固形物をメタノール（１００ｍＬ）中に入れ、混濁した溶液を、再度、ガラスマイクロファイバーフィルターに通して濾過した。得られた薄黄色の濾液を固形物になるまで真空下でストリッピングした。
この固形物を最小限のメタノール（５０ｍＬ）中に入れ、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を、撹拌下でゆっくり添加した。重質スラリーを冷却させ、濾過した。この固形物を風乾させ（吸湿性）、６０Ｃの炉内に一晩入れた。ＴＬＣでは、起源物質はほとんどない。収量１５．４ｇ。母液を真空下でエバポレートすると、黄色のゴム状物となった。この時点で、この物質をさらに精製する試みは行なわなかった。
実施例２−アジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）の合成
ａ．ブロモエチルマンノースの合成
ＤＯＷＥＸ ５０Ｗｘ４レジン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を脱イオン水で洗浄して脱色する。２２５ｇのＤ−マンノース（１．２５ｍｏｌ；１当量、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）と１４０ｇのＤＯＷＥＸ ５０Ｗｘ４の混合物を、２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ，２５当量；１２４．９７ｇ／ｍｏｌ；１．７６２ｇ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０Ｃ；Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で処理し、この撹拌混合物を８０Ｃまで４時間加熱する。反応を、ＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によってモニタリングする。約４時間後に反応が終了し、次いで、室温まで放冷する。この溶液を濾過してレジンを除去し、レジンを酢酸エチルとＤＣＭとで洗浄する。得られた濾液を回転式エバポレータ内でストリッピングすると、琥珀色の油状物となる。
この琥珀色の油状物をシリカゲル（４ｋｇのシリカ充填ＤＣＭ）で、以下のようにして精製する。粗製物をＤＣＭに溶解させ、カラムに負荷し、次いで、２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭを用いて溶出させる。生成物含有画分（ＴＬＣに基づいて）をプールし、ストリッピングして乾固させ、１５２ｇの１−α−ブロモエチル−グルコース（４２％）を得る。
ｂ．ブロモエチルマンノースのアジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を取り付けた５Ｌ容の丸底３つ口フラスコに、１５０ｇのブロモエチルマンノース（５２５ｍｍｏｌ）を仕込む。この油状物を２Ｌの水に溶解させ、６８．３ｇのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理した後、７．９ｇのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、この溶液を５０Ｃまで昇温させ、一晩撹拌する。この溶液を室温まで冷却させ、回転式エバポレータにて濃縮乾固する。固形残渣を、３×５００ｍＬの５：１（容量比）ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを用いて４０Ｃで温浸させる。合わせた有機部分を濾過し、蒸発乾固し、アジドエチルマンノースをオフホワイト色固形物として得る。
ｃ．アジドエチルマンノースの再精製
３２ｇのアジドエチルグルコースを１００ｍＬの水中に入れる。混濁した溶液を、ガラスマイクロファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂ）に通して濾過する。濾液を回転式エバポレータにてエバポレートすると固形物になる。この固形物をメタノール（１００ｍＬ）中に入れ、混濁した溶液を、再度、ガラスマイクロファイバーフィルターに通して濾過する。得られた薄黄色の濾液を真空下でストリッピングすると固形物になる。
この固形物を最小限のメタノール（５０ｍＬ）中に入れ、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を、撹拌下でゆっくり添加する。重質スラリーを冷却させ、濾過する。この固形物を風乾させ（吸湿性）、６０Ｃの炉内に一晩入れる。母液を真空下でエバポレートすると、黄色のゴム状物となる。
実施例３−アジドエチルマンノビオース（ＡｚＥＢＭ）の合成
実施例２のＡｚＥＭ化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを用いて選択的に保護し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、続いて臭化ベンジルと反応させ、１−α−（２−アジドエチル）−４，６−ベンズアルデヒドジアセタール−３−ベンジル−マンノピラノシドを得る。続いて、厳格な無水条件下でのトリフレート銀化学反応を用いて、この生成物を１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイルマンノピラノシドでグリコシル化し、保護型アジドエチルマンノビオース生成物を得る。次いで、この中間生成物を脱保護してベンゾイル基を除去し、ＡｚＥＢＭを得る。
実施例４−アジドエチルマンノトリオース（ＡｚＥＴＭ）の合成
ａ．１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイル−マンノース
撹拌バーと窒素供給口を含む５００ｍＬ容３つ口フラスコに、４０ｇ（６０．９ｍｍｏｌ）のペンタベンゾイルマンノースと８０ｍＬの塩化メチレンを添加した。得られた溶液を氷浴中で＜５Ｃまで冷却させ、８０ｍＬの３３％ＨＢｒ−酢酸溶液を、滴下漏斗から、反応温度が＜１０Ｃに維持されるような速度で添加した。添加が終了したら（約３０分間）、氷浴を除き、撹拌を３時間継続した。
反応液を等容量（１６０ｍＬ）のＤＣＭで希釈し、水（２×５００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で逐次抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒をエバポレートし、４１ｇの固形泡状物を得（理論収量４０．１ｇ）、Ｎ２下で冷凍庫内に保存した。この物質は、さらに精製せずに使用した。反応を、ＴＬＣ：シリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル，７／３）によってモニタリングした。出発材料のＲｆ ０．６５、生成物のＲｆ ０．８ ＵＶ可視化。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．１ ｌ（ｄ，２Ｈ）、８．０１（ｍ，４Ｈ）、７．８４（ｄ，２Ｈ）、７．５８（ｍ，４Ｈ）、７．４１（ｍ，６Ｈ）、７．２８（ｔ，２Ｈ）、６．５８（ｓ，ＩＨ）、６．２８（ｍ，２Ｈ）、５．８（ｍ，ＩＨ）、４．７５（ｄｄ，ＩＨ）４．６８（ｄｄ，ＩＨ）４．５（ｄｄ，ＩＨ）。
ｂ．１−アジドエチル−２，４−ジベンゾイルマンノース
撹拌バー、窒素供給口および３００ｍＬの無水アセトニトリルを含む１．０Ｌ容３つ口フラスコに、２５ｇの１−アジドエチルマンノース（１００．４ｍｍｏｌ）と、５０ｍＬのオルト安息香酸トリエチル（２２０ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加した。得られたスラリーを室温で撹拌し、０．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を未希釈で添加した。溶液は１０分以内に透明になり、撹拌をさらに２時間継続し、次いで、２５ｍＬの１０％ＴＦＡ水溶液を添加し、撹拌をさらに２時間継続して中間体をエステル異性体に加水分解させた。溶媒を真空下でエバポレートすると粘性油状物となり、これを、５０ｍＬのＤＣＭを用いて摩砕し、再度エバポレートすると粘性油状物となった。
トルエン（７０ｍＬ）を残渣に添加し、その粘性溶液に２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースをシード添加した。１５分以内に微細な沈殿物が形成され、撹拌を室温で一晩継続した。得られた重質懸濁液を、冷凍庫内に２〜４時間置き、次いで濾過し、固形物を氷冷トルエンで洗浄した（２×１０ｍＬ）。この固形物を、重量が一定になるまで風乾させ、２１ｇ（５０％異性体純度でＴＹ ２２．８５ｇ）の約９５％異性体純度を得た。生成物を４０ｍＬのトルエンに入れ、１時間撹拌し、次いで、さらに２時間、冷凍庫内に置いた。この固形物を濾過し、氷冷トルエンで洗浄し（２×１０ｍＬ）、重量が一定になるまで風乾させ、１８．５ｇの単独異性体生成物２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを８３％の収率で得た。母液には所望でない異性体と少量の所望の異性体が含まれていた。反応は、ＴＬＣ：ＳＧによってモニタリングした。（ヘキサン／酢酸エチル ７／３）出発材料のＲｆ ０．０、オルトエステル中間体のＲｆ ０．９。（ヘキサン／酢酸エチル：８／２）ＳＭのＲｆ ０．８、所望の異性体のＲｆ ０．４、所望でない異性体のＲｆ ０．２。１Ｈ ＮＭＲ ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ ８．１２（ｔ，４Ｈ）、７．６６（ｔ，２Ｈ）、７．５（ｍ，４Ｈ）、５．５６（ｔ，ＩＨ）、５．４８（ｍ，ＩＨ）、５．１４（ｍ，ＩＨ）、４．５（ｄｄ，ＩＨ）、４．０（ｍ，２Ｈ）、３．８（ｍ，３Ｈ）、３．５６（ｍ，ＩＨ）、３．４４（ｍ，ＩＨ）。
ｃ．過ベンゾイル化マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
撹拌バー、窒素供給口を備えた１．０Ｌ容の３つ口フラスコに、４１ｇの粗製１−ブロモ−テトラベンゾル（ｂｅｎｚｏｙ）マンノース（６０．９ｍｍｏｌ、約２．５当量）（１８５ｍＬのＤＣＭ中）を添加した。これに、１１．２ｇの２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノース（２４．５ｍｍｏｌ）を添加した後、１１．２ｇの４Ａシーブスを添加した。スラリーを室温で１０分間撹拌し、メタノール／氷浴中で−１５℃まで冷却させた。別の暗色槽内に、暗所にて、１９０ｍＬのトルエンを添加した後、１５．１ｇのトリフルオロ（ｆｌｌｕｏｒｏ）メタンスルホン酸銀（ＡｇＯＴｆ）（５８．８ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加し、撹拌して溶液にした。この溶液を大型滴下漏斗に移し、反応を光から保護しながら撹拌懸濁液に滴下した。ＡｇＯＴｆの添加速度を調整することにより、反応温度を＜−１０Ｃに維持した。添加が終了したら（約３０分間）、冷浴を除き、ＴＬＣにより残留する生成物が１種類になるまで、反応液をさらに２時間撹拌した（ＳＧ、ヘキサン／酢酸エチル：７／３、ブロモのＲｆ０．９、アジドのＲｆ０．４、トリオース生成物のＲｆ０．５，ｕｖ可視化）。
トリエチルアミン（７ｍＬ、５．０当量）を添加した後、２００ｍＬのＤＣＭを添加した。得られたスラリーをシリカゲルパッドおよびセライトに通して濾過し、２×７５ｍＬのＤＣＭで洗浄した。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣を酢酸エチルに入れ、水（２×１００ｍＬ）、重炭酸塩溶液（ｂｉｃａｒｂ）（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×７５ｍＬ）で逐次洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下でエバポレートし、３９ｇの固形泡状物を得た（ＴＹ ３９．５ｇ）。１Ｈ ＮＭＲ ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ ８．３（ｄ，２Ｈ）、８．２（ｍ，８Ｈ）、７．８５（ｄ，４Ｈ）、７．７５（ｄｄ，４Ｈ）、７．３−７．６５（ｍ，３０Ｈ）、７．２（ｔ，２Ｈ）、６．０５（ｍ，４Ｈ）、５．９（ｔ，２Ｈ）、５．６３（ｍ，２Ｈ）、５．３８（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｄ，ＩＨ）、４．６５（ｍ，４Ｈ）、４．５（ｍ，２Ｈ）、４．３５（ｍ，４Ｈ）、３，８（ｍ，２Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）。
ｄ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
３．０ｇの過ベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド（１．８６ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）撹拌懸濁液に、０．２ｍＬの４．２８Ｍナトリウムメトキシド（メタノール中）を添加した。得られた懸濁液を室温で２０時間撹拌すると、透明な溶液が得られた。反応の終了はＴＬＣによってモニタリングした（ＳＧ、ヘキサン／酢酸エチル：８／２ ＳＭのＲｆ０．４、生成物のＲｆ０．０）。
メタノールを真空下でエバポレートすると、油性の半固形物が得られた。この残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）中に入れ、３時間撹拌した。この固形物を濾過し、新鮮酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、重量が一定になるまで風乾させ、１．０９ｇ（ＴＹ １．０７ｇ）の生成物を得た。母液には、脱保護副生成物である残留メチルベンゾエートが含まれていた。
実施例５−アジドエチル−糖類（ＡｚＥＧ、ＡｚＥＭ、ＡｚＥＢＭ、ＡｚＥＴＭ）からのアミノエチル−糖類（ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）の合成
実施例１〜４のアジド末端化合物は、パラジウム／炭素触媒、少量の酢酸、および溶媒としてエタノールを使用することにより、室温で容易に水素化され、対応するアミン末端化合物が得られる。図１０は、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭの化学構造を示す。プロセスは、ＡＥＴＭに関して以下に記載するものと同一であるが、試薬、溶媒などの量を、水素化対象の糖類−リガンドをモル数に応じて増減すべきであることは、当業者に理解されよう。
ａ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アミノエチルマンノピラノシド（「アミノエチルトリマンノース」、ＡＥＴＭ）
５．３ｇ（９．２５ｍｍｏｌ）マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシドの１００ｍＬの水／５０ｍＬのエタノールの溶液に、０．８ｇの５％Ｐｄ／Ｃを添加した。激しく撹拌したこの懸濁液を、３０〜４０ｐｓｉで４８時間、またはＴＬＣで出発材料が見られなくなるまで水素化した（ＳＧ、メタノール、ＳＭのＲｆ０．７５、ＰｄｔのＲｆ０．０、ＰＭＡｖｉｓ。）。この懸濁液をセライトにて濾過し、これをエタノール（２×５０ｍＬ）ですすぎ洗浄し、濾液を真空濃縮した。この懸濁液をセライトにて濾過し、これをエタノール（２×５０ｍＬ）ですすぎ洗浄し、濾液を真空濃縮した。
この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８，３％アセトニトリル／９７％０．１％Ｈ３ＰＯ４、２２０ｎｍ、２ｍｌ／分）では、注入カラムボイド物質のｕｖ吸着、Ｒｔ ２．５分が得られ、ベンゾエートエステルが示された。
濾液を、７０ｍＬの水と１２ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨで希釈し、この溶液を室温で一晩撹拌した。（ＨＰＬＣ：カラムボイドＲｔ２．５分におけるｕｖ物質なし、Ｒｔ１０．５分におけるｕｖ物質は安息香酸とともに共溶出）。２ｇの脱色用活性炭を添加し、撹拌懸濁液を８０Ｃまで加熱し、室温まで冷却させ、セライトにて濾過した。濾液のｐＨを２Ｎ ＨＣｌで８．０に調整し、無色の溶液を約５０％容量まで真空濃縮した。
この溶液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ、５０ｇ）に負荷し、溶出画分が中性ｐＨになるまで（６×７５ｍＬ）水で洗浄し、残留する酸副生成物（あれば）を除去した。アミン生成物をカラムから、０．２５Ｎ水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）で洗い出し、アミン生成物−ニンヒドリン検出を含む画分を合わせ、２５〜３０ｍＬまで真空濃縮した。この濃縮溶液を３００ｍＬの撹拌エタノールに滴下し、撹拌をさらに２時間継続した。生成物を濾過し、新鮮エタノールで洗浄し（２×５０ｍＬ）、重量が一定になるまで風乾させた。得られた白色の非晶質固形物を、真空炉内で８０Ｃにて５時間さらに乾燥させ、４．１ｇの白色の粒状固形物を得た（ＴＹ ５．１ｇ）。ＮＭＲでは、芳香族プロトンはなかった。１Ｈ ＮＭＲ ３００ ＭＨｚ（Ｄ２Ｏ）δ ５．０８（ｓ，１Ｈ）、４．８７（ｓ，１Ｈ）、４．８１（ｓ，１Ｈ）、４．８−３．６（ｍ，１８Ｈ）、２．９（ｍ，２Ｈ）。
実施例６−ジプロパルギル糖類の合成およびＡＥ−リガンドの作製
ａ．マロン酸ジエチルジプロパルギルの合成
マロン酸ジエチル（１２２．５ｇ、０．７６４８ｍｏｌ）を、ナトリウムエトキシド（金属ナトリウムから調製、３８．５ｇ、１．６７ｍｏｌ）を含む無水エタノール（８００ｍｌ）に添加した。３０分後、温度を６０Ｃより下に維持しながら、臭化プロパルギル（２００ｇ、１．６８ｍｏｌ）を撹拌懸濁液にゆっくり添加した。混合物を一晩（１５時間）還流した。沈殿した塩を濾過によって除去し、エタノールで洗浄した。溶媒を真空除去し、残渣を水で希釈し、エタノール（２×２００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、Ｅｔ２０で洗浄し、溶媒を真空除去すると、金色の油状物が得られた。この油状物を高真空下（４０Ｃ）に３時間置き、放置した。固形物は結晶化し始め、油性固形物が形成された。一晩（１６時間）放置した。シクロヘキサンをフラスコに仕込み、固形物を分解させ、濾過し、シクロヘキサンで洗浄し、白色の結晶性生成物を得た（８１ｇ、４４．８％収率）。反応はＧＣによって追跡した。
ｂ．マロン酸ジプロパルギルの合成
マロン酸ジエチルジプロパルギル（８０ｇ、０．３３９ｍｏｌ）を、６００ｍｌの１０％アルコール性水酸化カリウム中で一晩（１５時間）還流した。溶媒を真空除去し、残渣を３Ｎ ＨＣｌで酸性化した。この残渣をＥｔ２Ｏ（２×３００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、真空濃縮すると油状物になった。高真空下（４０Ｃ）に２時間置き、放置すると、マロン酸ジプロパルギルが油状物として得られた（４６ｇ、７５．４％収率）。反応はＧＣによって追跡した。
ｃ．酢酸ジプロパルギルの合成
マロン酸ジプロパルギル（２６ｇ、０．４４３ｍｏｌ）を未希釈で１３５Ｃにて、ＣＯ２が発生しなくなるまで加熱した。次いで、これを放冷すると油状物になった。この油状物を０．５ｐｓｉで蒸留した。蒸留フラスコ内の残留油性残渣と固形物を合わせ（１５．７ｇ、７９．９％収率）、そのままで次の工程で使用した。
ｄ．［２−（３−プロプ−２−イニル−ヘキス−５−イノイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸ｔ−ブチルエステルの合成
Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（１８．３ｇ、０．１１４３ｍｏｌ）（５０ｍｌのＣＨ３ＣＮ中）を滴下漏斗から、酢酸ジプロパルギル（１５．５６ｇ、０．１１４３ｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３６．７４ｇ、０．１１４ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２９．６ｇ、０．２２９ｍｏｌ）を３００ｍｌのＣＨ３ＣＮ中に含む撹拌溶液に、０Ｃでゆっくり添加した。氷浴を除き、生成物を周囲温度で一晩（１６時間）撹拌した。すると、反応液は完全に均質になった。この溶液を真空濃縮し、残渣を８００ｍｌの水で希釈した。得られた固形物を濾過し、水で充分に洗浄し、真空乾燥させ、１４．３ｇの粗製生成物を得た。ＤＣＭからの再結晶（２×）、濾過およびヘキサンでの洗浄により、生成物を得た（９．８５ｇ、３１％収率、ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）による９８％純度）。
ｅ．［２−（３−プロプ−２−イニル−ヘキス−５−イノイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸ｔ−ブチルエステルへのアジド糖のクリック反応
１，１ジプロパルギル−アセチル−（−１Ｎ，２Ｎ−ＢＯＣ−１，２−ジアミノエチル）アミド（ＤＰ、４１８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）（ＤＣＭ（２０ｍＬ）中）に、ＴＦＡ（４ｍＬ）を０Ｃで５分間かけて滴下した。揮発物質を減圧下でエバポレートした。トルエン（２０ｍＬ）を残渣に添加し、減圧下で２回ストリッピングした。得られた暗色油状物を、さらに精製せずに使用した。
この残渣にＴＨＦ（２０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）を、撹拌しながら、１５分間添加した。硫酸銅（２２５ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加した後、アスコルビン酸ナトリウム（１８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を５５〜６０Ｃまで６時間加熱し、次いで室温で１８時間撹拌した。この溶液を減圧下で、ほぼ半分の容量になるまでエバポレートし、マイクロファイバーガラスフィルターに通して濾過した。得られた透明な溶液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｘ−２）上に配置し、これを、中性ｐＨになるまで水で洗浄し（６×７５ｍＬ）、次いで、１０％ＮＨ４ＯＨで洗浄した（８×７５ｍＬ）。ニンヒドリンで陽性染色された画分を合わせ、減圧下でエバポレートすると、ガラス状の固形物になった。このガラス状残渣を水（２５０ｍＬ）中に入れ、０．５ｇの活性炭で処理し、還流加熱した。冷却したスラリーをセライトとマイクロファイバーフィルターにて濾過した。得られた薄黄色の溶液を減圧下でエバポレートするとガラス状の固形物になり、メタノールを添加し、エバポレートし（２×）、オフホワイト色の泡状物を得た（０．９ｇ、ＴＹ １．０ｇ）。
実施例７−トリプロパルギル糖類の合成およびＡＥ−リガンドの作製
ａ．２−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（プロパルギルオキシ）メチル］アミノメタン
Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルバミン酸ｔ−ブチル（Ｆｒｏｎｔｒｕｎ Ｏｒｇａｎｉｘ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；１７７．２６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ＮａＯＨ（１．１ｍｍｏｌ）を撹拌しながら室温で添加した。この溶液に、２−ブロモアセトアミド−トリス［（プロパルギルオキシ）メチル］アミノメタン（３５６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７３，５６０２、２００８参照）を添加し、撹拌を２０時間継続した（ＴＬＣ ＳＧ ８／２ ヘキサン／酢酸エチル、ｐｄｔのＲｆ ０．４）。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）中に入れ、水（２５ｍＬ）、０．５Ｎ ＮａＯＨ（２５ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で連続して洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると油状物になった（３６０ｍｇ、ＴＹ ４５２．３ｍｇ）。ＮＭＲ ＣＤＣｌ３、（ｐｐｍ）：７．０５（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；５．２５（（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；４．８５（ｓ，６Ｈ）；３．８５（ｓ，６Ｈ）；３．３（ｍ，２Ｈ）；３．１５（ｓ，２Ｈ）；２．７（ｍ，２Ｈ）；２．４２（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，９Ｈ）。
ｂ．２−（２−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（トリアゾロ−１−（２−エチルマンノース）４−メトキシ）メチル］アミノメタン
２−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（プロパルギルオキシ）メチル］アミノメタン（１ｇ、２．２１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４０ｍＬ）撹拌溶液に、室温で、ＴＦＡ（４ｍＬ）を滴下した。得られた溶液を一晩撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣をトルエン（１５ｍＬ）中に入れ、蒸発乾固させた。
この残渣をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）中に入れ、撹拌して溶液にした。アジドエチルマンノース（３．７５当量、２．０ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を添加した後、硫酸銅（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を５５〜６０Ｃ（油浴）で６時間撹拌し、室温まで冷却させ、一晩撹拌した。得られた混合物を２分の１の容量になるまで真空濃縮し、マイクロガラスフィルターに通して濾過した。濾液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ ５０ｗ ５０ｘ４−１００）に負荷し、中性になるまで水を用いて溶出させた（６×７５ｍＬ）。次いで、カラムを１５％水酸化アンモニウムで溶出させ（１０×７５ｍＬ）、ニンヒドリン陽性画分をプールし、濃縮すると、ガラス状の泡状物になった（１．２９ｇ、ＴＹ（ＭＷ １０９９ｇ／ｍｏｌ）、２工程で５３％）。
実施例８−ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンの合成
典型的な合成において、４ｇの粉末化インスリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解させた後、４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を室温で３０分間撹拌する。次に、１．７９ｍｌ（２．６当量）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり添加し、ほぼ１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含む４ｍｌのストック溶液を添加した後、５分間混合することによって、反応液をクエンチする。クエンチ後、溶液を全部、１６００ｍｌのアセトンに注入し、スパチュラで軽く混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の８×４００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を遠心分離し、上清みを第２のビーカー内にデカンテーションし、一方、沈殿物ケークは確保する。上清み液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる８×４００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２の沈殿物を遠心分離し、上清みを廃棄する。２回の沈殿工程の合わせた遠心ケークをアセトンで１回洗浄した後、室温で真空乾燥させて粗製粉末を得る。これは、典型的には、６０％の所望のＢＯＣ２生成物と、４０％のＢＯＣ３物質を含む。
分取用逆相ＨＰＬＣ法を使用し、純粋なＢ０Ｃ２−インスリンを粗製粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。粗製粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂの混合物に溶解させ、シリンジ濾過した後、カラムに注入する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化させる。ほぼ５ｍｌの粗製粉末溶液を、１５ｍｌ／分の流速で５分間かけてカラムに注入した後、次の３．５分間では、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの線状勾配を使用し、この状態でさらに２．５分間保持する。この方法を使用すると、所望のＢＯＣ２ピークはほぼ１０．６分に溶出され、直後にＢＯＣ３ピークが溶出される。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なＢＯＣ２−インスリン粉末を得る。具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認し、コンジュゲーション部位は、Ｎ末端配列決定法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって調べる。
実施例９−ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−ω−アミノ酸−ＮＨＳエステル）アミド枠組構造の合成
１，３，５−ベンゼントリカルボニルクロリド（１ｇ、３．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（５ｍＬ）溶液を、ω−アミノ酸（３．１当量）の１Ｎ ＮａＯＨ（２５ｍＬ）の激しく撹拌した溶液に、氷浴中で滴下する。氷浴を除き、撹拌を室温で４時間継続する。２Ｎ ＨＣｌ（約１５ｍＬ）を、ほぼｐＨ２になるまで滴下し、得られたスラリーをさらに２時間撹拌する。沈殿物を濾過し、冷水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、真空下で風乾させ、次いで、６０Ｃの炉内で一晩乾燥させる。得られた白色固形物を、さらに精製せずに使用する。各ω−アミノ酸の収量（４−アミノ酪酸：収量１．６ｇ、９１％；６−アミノカプロン酸：収量１．９ｇ、９２％）。
上記の物質を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．１ｍｍｏｌ、３．１当量）を含むＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に入れ、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ、３．６ｍｍｏｌ、３．６当量）を室温で添加する。得られた溶液を２４時間撹拌し、水（１２５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させる。溶媒をエバポレートし、半固形残渣をアセトニトリル（１０ｍＬ）を用いて摩砕する。固形物を濾過し、冷溶媒で洗浄し、真空下で風乾させ、次いで、６０Ｃの炉内で一晩乾燥させる。生成物は、尿素副生成物を含まない。 ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）：３０４ｍｇ、３６％、ｍｐ １４０〜１４２Ｃ。ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）：２４５ｍｇ、４５％、ｍｐ １８２〜１８４Ｃ。
実施例１０−樹枝状枠組構造の合成
ａ．ニトロ基含有アルキン末端官能化デンドロンの水素化
ｎ＝２、４または８いずれかの末端アルキンとニトロプロピオン酸コアを含有するデンドロンを入手し（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆａｃｔｏｒｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）、さらに精製せずに使用する。このデンドロンを、ＤＣＭとエタノールの１００ｍＬの５０：５０（容量比）混合物に溶解させ、０．８ｇの５％Ｐｄ／Ｃを添加する。激しく撹拌した懸濁液を３０〜４０ｐｓｉで４８時間、またはＴＬＣで出発材料が見られなくなるまで水素化する。懸濁液をセライトにて濾過し、これを、エタノールですすぎ洗浄し（２×５０ｍＬ）、濾液を真空濃縮する。
濾液を、７０ｍＬの水と１２ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨで希釈し、この溶液を室温で一晩撹拌する。２ｇの脱色用活性炭を添加し、撹拌懸濁液を、８０Ｃまで加熱し、室温まで冷却させ、セライトにて濾過する。濾液のｐＨを２Ｎ ＨＣｌで８．０に調整し、無色の溶液を約５０％容量まで真空濃縮する。
この溶液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ、５０ｇ）に負荷し、溶出画分が中性ｐＨになるまで（６×７５ｍＬ）水で洗浄し、残留する酸副生成物（あれば）を除去する。アミン生成物をカラムから、０．２５Ｎ水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）で洗い出し、アミン生成物（ニンヒドリン検出）を含む画分を合わせ、回転式エバポレータを用いて真空下でエバポレートする。
ｂ．デンドロン（アミン、アルキン−４）とアジドエチルマンノースとの反応
水素化後に得られたアミノコアと４つの末端アルキン基を含有するこのデンドロン生成物（８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）に入れ、撹拌して溶液にする。アジドエチルマンノース（４．７５当量、２．５３ｇ、１０．５１ｍｍｏｌ）を添加した後、硫酸銅（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を５５〜６０Ｃ（油浴）で６時間撹拌し、室温まで冷却させ、一晩撹拌する。得られた混合物を２分の１の容量になるまで真空濃縮し、マイクロガラスフィルターに通して濾過する。濾液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ ５０ｗ ５０ｘ４−１００）に負荷し、中性になるまで水を用いて溶出させる（６×７５ｍＬ）。次いで、カラムを、１５％水酸化アンモニウム（１０×７５ｍＬ）を用いて溶出させ、ニンヒドリン陽性画分をプールし、濃縮すると、ガラス状の泡状物になる。
実施例１１−有機溶媒中での多価活性化エステルとのアミン官能化薬物コンジュゲーション（最初に薬物付加）
Ｎ末端活性化エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、１．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。次いで、アミン含有薬物を、別途、７．９ｍｌのＤＭＳＯに７．４ｍＭの濃度で溶解させる。溶解したら、薬物溶液を全部、１０分間かけて枠組構造／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に滴下した後、室温で２時間混合する。次いで、残留した活性化型エステルを、アミン官能化親和性リガンドと以下のようにして反応させる。親和性リガンドの３７０ｍＭ溶液を、適切な容量の乾燥ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な溶液を添加して、初期活性化型エステル基の数Ｎ−１の３倍に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造１つあたりＮ＝３の初期活性化型エステル基が存在するならば、（３×（３−１）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝０．９７３ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造１つあたりＮ＝４の初期活性化型エステル基が存在するならば、（３×（４−１）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝１．４６ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温でさらに１時間撹拌し、反応の終了を確実にする。
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍカラム上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
実施例１２−多価糖類とのＢ１−インスリンコンジュゲート−均質なリガンド
実施例１１に記載の方法と、実施例８のアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、以下の枠組構造と親和性リガンドを有する薬物コンジュゲートを調製した。Ｔｒｉｓ−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（ＴＳＢ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、およびテトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトールＴＳＰＥ活性化型エステル枠組構造は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入し、さらに精製せずに使用したＴＳＢ−Ｃ４およびＴＳＢ−Ｃ６枠組構造は、実施例９に従って合成した。ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、およびＡＥＴＭ親和性リガンドは、実施例１〜４に従って合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
すべての場合において、ＢＯＣ保護基は、実施例１１に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去した。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ５８Ｕインスリン／ｍｌ（Ａ２８０測定に基づく）まで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存した。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認されるように、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。
Figure 2012516338
実施例１３−Ｂ１−多価糖類とのインスリンコンジュゲート−混合型リガンド
実施例１１に記載の方法と、実施例８のアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、枠組構造に連結された糖類親和性リガンドの混合物を有するインスリンコンジュゲートを調製した。ＴＳＡＴ−Ｃ６およびＴＳＰＥ活性化型エステル枠組構造は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入し、さらに精製せずに使用した。ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、およびＡＥＴＭは、実施例１〜４に従って合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
すべての場合において、ＢＯＣ保護基は、実施例１１に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去した。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去した。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存した。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認されるように、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。
Figure 2012516338
実施例１４−Ｂ１−事前に作製した多価糖類を用いた多価糖類とのインスリンコンジュゲート
実施例１１に記載の方法と、実施例８のアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、以下のインスリンコンジュゲートが、事前に合成した多価アミン含有親和性リガンドから調製される。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）とＴＳＡＴ−Ｃ６活性化型エステル枠組構造をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入し、さらに精製せずに使用する。反応性末端アミンを含有する二価のＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、およびＡＥＴＭ−２分子は、２つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製される。反応性末端アミンを含有する三価のＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３、およびＡＥＴＭ−３分子は、３つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製される。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
すべての場合において、ＢＯＣ保護基は、実施例１１に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去した。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認されるように、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。
Figure 2012516338
実施例１５−樹枝状枠組構造を用いたＢ１−多価糖類とのインスリンコンジュゲート−均質なリガンド
実施例１０ｂで調製したアミノコアと４個の末端アルキン基を含有する０．１ｇ（０．０９８ｍｍｏｌ）のデンドロンを、１００ｍｇ／ｍｌで無水ＤＭＳＯに溶解させる。この溶液を、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．０９８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４００ｕＬ）を含む溶液に滴下し、室温で１時間反応させる。次いで、この混合物を、実施例８のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）（０．５８８ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍｇ／ｍｌ溶液に滴下し、２時間反応させる。
得られたコンジュゲートを水中で超希釈し、ｐＨを８．０に調整する。この溶液を、ＢｉｏＧｅｌ Ｐ２を用いて脱塩した後、Ａｍｉｃｏｎ ３ｋ限外濾過デバイスを用いて濃縮する。得られた溶液を逆相クロマトグラフィーによって精製し、回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させる。この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、２５ｍＭ ０．１５０ＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位であり、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認される。
実施例１６−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンの合成
ａ．Ｆｍｏｃ−１−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成において、４ｇの粉末化インスリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解させた後、４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を室温で３０分間撹拌する。次に、１．２当量の９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をゆっくりと、ＴＨＦ中Ｆｍｏｃ−ＮＨＳの１．０Ｍ溶液としてのインスリン−ＴＥＡ溶液に添加する。反応液を、ほぼ１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含む４ｍｌのストック溶液を添加した後、５分間混合することによって、反応液をクエンチする。クエンチ後、溶液を全部、１６００ｍｌのアセトンに注入し、スパチュラで軽く混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の８×４００μｌのアリコートを、混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を遠心分離し、上清みを第２のビーカー内にデカンテーションし、一方、沈殿物ケークは確保する。上清み液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる８×４００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２の沈殿物を遠心分離し、上清みを廃棄する。２回の沈殿工程の合わせた遠心ケークをアセトンで１回洗浄した後、室温で真空乾燥させて粗製粉末を得る。これは、典型的には、２０％のＦｍｏｃ１生成物、６５％のＦｍｏｃ２生成物、および１５％の未反応インスリンを含む。
分取用逆相ＨＰＬＣ法を使用し、純粋な所望のＦｍｏｃ１−インスリンを粗製粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。粗製粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂの混合物に溶解させ、シリンジ濾過した後、カラムに注入する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化させる。ほぼ５ｍｌの粗製粉末溶液を、１５ｍｌ／分の流速で５分間かけてカラムに注入した後、次の３．５分間では、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの線状勾配を使用し、この状態でさらに２．５分間保持する。この方法を使用すると、所望のＦｍｏｃ１ピークは、未反応ＲＨＩピークのほぼ３分後に溶出され、直後にＦｍｏｃ２−インスリンピークが溶出される。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なＦｍｏｃ１−インスリン粉末を得る。具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認し、コンジュゲーション部位は、Ｎ末端配列決定法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって調べる。
ｂ．ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成において、１ｇのＦｍｏｃ１−（Ｂ２９）−インスリンを室温で２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、１ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を室温で３０分間撹拌する。次に、０．３７９ｍｌ（２．２当量）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり添加し、ほぼ１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含む１ｍｌのストック溶液を添加した後、５分間混合することによって、反応液をクエンチする。クエンチ後、溶液を全部、４００ｍｌのアセトンに注入し、スパチュラで軽く混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の８×１００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を遠心分離し、上清みを第２のビーカー内にデカンテーションし、一方、沈殿物ケークは確保する。上清み液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる８×１００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２の沈殿物を遠心分離し、上清みを廃棄する。２回の沈殿工程の合わせた遠心ケークアセトンで１回洗浄した後、室温で真空乾燥させて粗製粉末を得る。これは、典型的には、９０％より多くの所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１生成物を含む。
分取用逆相ＨＰＬＣ法を使用し、純粋なＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１−インスリンを粗製粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。粗製粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂの混合物に溶解させ、シリンジ濾過した後、カラムに注入する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化させる。ほぼ５ｍｌの粗製粉末溶液を、１５ｍｌ／分の流速で５分間かけてカラムに注入した後、次の３．５分間では、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの線状勾配を使用し、この状態でさらに２．５分間保持する。この方法を使用すると、所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１ピークは、Ｆｍｏｃ１−インスリン出発材料のほぼ５分後に溶出される。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）−インスリン粉末を得る。具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認し、コンジュゲーション部位は、Ｎ末端配列決定法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって調べる。
ｃ．ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリン
ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）のＦｍｏｃ保護基は、先の工程に従って得られた凍結乾燥粉末を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％のピペリジンに４Ｃで３０分間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去される。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、Ｆｍｏｃ、ＤＭＦ、および他の混入塩（あれば）を除去する。ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンは、必要であれば凍結乾燥して粉末にするか、または所望により水溶液に直接使用する。
実施例１７−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンコンジュゲートの合成
実施例８のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いた先の実施例に記載の多価親和性リガンド−薬物コンジュゲートはすべて、代わりに、実施例１６のＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンを用いて調製され得る。得られるコンジュゲートはすべて、同じＭＷおよび置換特性度合を有するが、インスリン分子に対するコンジュゲーション部位は、εＢ２９アミノ基であり、Ｎ末端Ｐｈｅ−Ｂ１ではない。これは、Ｎ末端配列決定法によって確認され得る。
実施例１８−有機溶媒中での多価活性化エステルとのアミン官能化薬物コンジュゲーション（最後に薬物付加）
この実施例では、薬物を枠組構造に、親和性リガンド（１つまたは複数）の前に付加する、実施例１１に記載の方法の代替法を記載する。この実施例では、親和性リガンド（１つまたは複数）を枠組構造に、薬物の前に付加する。
Ｎ末端活性化型エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。並行して、親和性リガンドの１２２ｍＭ溶液を、適切な容量の無水ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な親和性リガンド溶液を１０分間かけて滴下し、枠組構造上の活性化型エステル基の正確な数Ｎ−１に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造上にＮ＝３の活性化型エステル基が存在するならば、（１×（３−ｌ）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝０．９８ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造上にＮ＝４の活性化型エステル基が存在するならば、（１×（４−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝１．５ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温で２時間撹拌する。
次いで、アミン含有薬物を別途、７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに８．１ｍＭの濃度で溶解させる。溶解したら、薬物溶液を全部、１分間かけて枠組構造／ＤＭＳＯ／親和性リガンド／ＴＥＡ溶液に添加した後、室温でさらに２時間混合し、反応の終了を確実にする。
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍ上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
実施例１９−有機溶媒中で非保護インスリンから作製される多価糖類とのＢ２９−インスリンコンジュゲート
この実施例は、非保護インスリンの場合、Ｌｙｓ−Ｂ２９のε−アミノ部分が最も反応性のアミンであり、続いてＡ１、次いでＢ１であることを利用するものである。したがって、非保護インスリンをアミン含有薬物として使用した場合、得られるコンジュゲートは、主に、Ｌｙｓ−Ｂ２９位置が置換されているはずである。実施例１８に記載の方法、およびアミン含有薬物として組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８Ｄａ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用し、以下のインスリンコンジュゲートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化型エステル枠組構造を用いて調製した。ＡＥＭおよびＡＥＴＭは、先に記載のようにして合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤａであった。
Figure 2012516338
Ｎ末端配列決定法によれば、ＡＥＭ含有枠組構造のほぼ８５％がインスリンに、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してコンジュゲートされており、ＡＥＴＭ含有枠組構造のほぼ８７％がインスリンに、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してコンジュゲートされていた。
実施例２０−水性溶媒中での多価活性化エステルとのアミン官能化薬物コンジュゲーション（最後に薬物付加）
この実施例では、反応を有機溶媒中でなく水性溶媒中で行なう、実施例１８に記載の方法の代替法を記載する。Ｎ末端活性化型エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、６．２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、２ｍｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。並行して、親和性リガンドの４４８ｍＭ溶液を、適切な容量の無水ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な親和性リガンド溶液を１０分間かけて滴下し、枠組構造上の活性化型エステル基の数Ｎ−１の１．５倍に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造にＮ＝３の活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（３−ｌ）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝２．５ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造にＮ＝４の活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（４−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝３．８ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温で１時間撹拌する。
次いで、アミン含有薬物を別途、１７．２ｍＭで２．６７ｍｌの０．１Ｍ（ｐＨ１１）の炭酸ナトリウム緩衝液に溶解させ、続いて、１．０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１０．８に調整する。溶解したら、枠組構造／ＤＭＳＯ／親和性リガンド／ＴＥＡ溶液を全部、７５分間かけて薬物／炭酸緩衝液溶液に滴下する。添加中、得られる混合物のｐＨを、５分毎に、必要であれば希ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて１０．８に調整する。滴下後、この溶液をさらに１５分間撹拌し、反応の終了を確実にする。
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ４０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍカラム上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
実施例２１−水性溶媒中で非保護インスリンから合成されたＢ２９−ＡＥＭ−２−インスリンコンジュゲート
この実施例は、非保護インスリンの場合、Ｌｙｓ−Ｂ２９のε−アミノ部分が最も反応性のアミンであり、続いてＡ１、次いでＢ１であることを利用するものである。したがって、非保護インスリンをアミン含有薬物として使用した場合、得られるコンジュゲートは、主に、Ｌｙｓ−Ｂ２９位置が置換されているはずである。実施例２０に記載の方法、およびアミン含有薬物として組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用し、ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化型エステル枠組構造を用いて調製した。インスリン類似体として使用したＡＥＭは、先に記載のようにして合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤであった。最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６７２９ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計２．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、コンジュゲート分子の８５％より多くがＬｙｓ−Ｂ２９部位でコンジュゲートされている（Ｎ末端配列決定法）。
実施例２２−アルデヒド含有枠組構造との一般的なアミン官能化薬物コンジュゲーション
ａ．１つより多くの親和性リガンドと１つの末端アルデヒドで官能化された枠組構造
まず、Ｎ末端活性化型エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、２７．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、８００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。アミン含有ジエチルアセタールのストック溶液を、５ｍｌの無水ＤＭＳＯ中５８０ｍＭで調製する。溶解したら、２．９ｍｌのジエチルアセタール溶液を、５分間かけて枠組構造／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に滴下した後、室温でさらに１５分間混合する。次いで、残留した活性化型エステルを、アミン官能化親和性リガンドと以下のようにして反応させる。親和性リガンドの３７０ｍＭ溶液を、適切な容量の乾燥ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な溶液を添加して、初期活性化型エステル基の数Ｎ−１の１．５倍に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造１つあたりＮ＝３の初期活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（３−ｌ）×６０ｍＭｘ２７／３７０ｍＭ）＝１３ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造１つあたりＮ＝４の初期活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（４−１）×６０ｍＭｘ２７／３７０ｍＭ）＝２０ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温でさらに１時間４５分撹拌し、反応の終了を確実にする。反応後、溶液を全部、ジエチルエーテルで１０倍に希釈し、激しく混合し、遠心分離し、所望の物質を含む底部の濃密相を上清みから分離する。上清みを廃棄後、同容量のエタノールを添加すると、固形沈殿塊が生成する。遠心分離および上清みの廃棄後、物質をエタノールとエーテルで充分に洗浄し、次いで真空乾燥させると、多数の親和性リガンドとジエチルアセタール基を含む粗製枠組構造が得られる。
ｂ．アミン官能化薬物と末端アルデヒドとのコンジュゲーション
乾燥させたら、収集した物質を６０ｍｌのＤＩ水に溶解させ、この溶液のｐＨを１．０に調整することにより、ジエチルアセタールからアルデヒド基を生成させる。この溶液を３０分間混合した後、１．５ＭのＮａＣｌを含む６ｍｌの２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し、希ＮａＯＨ溶液を用いて溶液のｐＨを６．５に調整する。この溶液に４８ｍｍｏｌのアミン含有薬物を添加し、必要であれば、ｐＨを６．５に再調整する。別途、還元剤のストック溶液を、１．５ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む１５ｍｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）の緩衝液に溶解させることにより調製し、ｐＨを、希ＨＣｌ溶液で注意深く６．５に調整する。１３ｍｌのシアノ水素化ホウ素ストック溶液を薬物／枠組構造／アルデヒド溶液に添加し、室温で一晩反応させる。
得られた水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍ上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
実施例２３−末端反応性アルデヒド基を含むＡＥＭ−２−枠組構造および後続のＢ１でのインスリンコンジュゲーション
ａ．２つのＡＥＭと１つのアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能化されたＴＳＡＴ
この物質は、実施例２２ａに記載の方法に従い、ＴＳＡＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を多価活性化エステル枠組構造として、および４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をアミン含有ジエチルアセタールとして用いて合成される。先に記載のようにして合成されるＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を親和性リガンドとして使用した。
ｂ．ＴＳＡＴ−ＡＥＭ−２−ＡＢＤＡとＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのコンジュゲーション
この物質は、実施例２２ｂに記載の方法を使用し、上記（ａ）で作製したＴＳＡＴ−ＡＥＭ−２−ＡＢＤＡを、実施例８に従って合成したアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）とともに用いて合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。
最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６４６２ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計２．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、その９９％がＰｈｅ−Ｂ１部位でコンジュゲートされていた（Ｎ末端配列決定法）。
実施例２４−末端反応性アルデヒド基を含むＡＥＭ−３−枠組構造および後続のＢ１でのインスリンコンジュゲーション
ａ．３つのＡＥＭと１つのアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能化されたＴＳＰＥ
この物質は、実施例２２ａに記載の方法に従い、ＴＳＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を多価活性化エステル枠組構造として、および４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をアミン含有ジエチルアセタールとして用いて合成される。先に記載のようにして合成されるＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を親和性リガンドとして使用した。
ｂ．ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡとＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのコンジュゲーション
この物質は、実施例２２ｂに記載の方法を使用し、上記（ａ）で作製したＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡを、実施例８に従って合成したアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）とともに用いて合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。
最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６８９７ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計３．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、その９９％がＰｈｅ−Ｂ１部位でコンジュゲートされていた（Ｎ末端配列決定法）。
実施例２５−末端反応性アルデヒド基を含むＡＥＭ−３−骨格および非保護インスリンを用いた後続のＢ１でのインスリンコンジュゲーション
ａ．３つのＡＥＭと１つのアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能化されたＴＳＰＥ
この物質は、実施例２２ａに記載の方法に従い、ＴＳＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を多価活性化エステル骨格として、および４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をアミン含有ジエチルアセタールとして用いて合成される。先に記載のようにして合成されるＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を、インジケータ類似体として使用した。
ｂ．ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡとＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのコンジュゲーション
この物質は、実施例２２ｂに記載の方法を使用し、上記（ａ）で作製したＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡを、アミン含有薬物の非修飾インスリン（ＭＷ＝５，８０８ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに用いて合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発材料の非保護インスリンは３個の遊離アミン基を有するが、Ｐｈｅ−Ｂ１（ｐＫａ約６．８）がｐＨ６．５で最も反応性のアミンであるため、Ｐｈｅ−Ｂ１は骨格に対する主要インスリンコンジュゲーション部位である。凍結乾燥粉末を０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解させる。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、この物質を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。
最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６８９７ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計３．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、その＞８５％がＰｈｅ−Ｂ１部位でコンジュゲートされていた（Ｎ末端配列決定法）。
実施例２６−混合型枠組構造の化学的性質、および薬物と親和性リガンドとの対応する個々のコンジュゲーション
スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾエート（ＳＤＭＢ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入することができ、以下の実施例において、さらに精製せずに使用することができる。ＳＤＭＢを６０ｍＭで１．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。次いで、アミン含有薬物を別途、７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに８．１ｍＭの濃度で溶解させる。溶解したら、ＳＤＭＢ溶液を全部、１０分間かけてＤＭＳＯ−薬物溶液に滴下した後、室温でさらに２時間混合し、反応の終了を確実にする。
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。
別途、６．０ｍｍｏｌのアミン含有親和性リガンドを、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ８．２）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に、４５０ｍＭの濃度で溶解させる。この溶液に、６．６ｍｍｏｌのイミノチオラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、ｐＨ８．２で室温にて３０分間反応させ、アミン末端基を末端スルフヒドリル基に変換させる。得られた物質を、先の工程で作製した薬物−枠組構造−ジ−マレイミドコンジュゲートの溶液１０ｍｌと混合する。マレイミド基を、インジケータ類似体のスルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基と、ｐＨ８．２で２時間反応させ、反応の終了を確実にする。次いで、得られた溶液を、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。
最後に、この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍ上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
実施例２７−混合型枠組構造の化学的性質を用いたアミノエチル糖類に対するインスリンコンジュゲーション
実施例２６に記載の方法を使用し、実施例８に従って合成したアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を用いて、以下の具体的な薬物コンジュゲートが得られる。ＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）、ＡＥＢＭ（ＭＷ＝３８５ｇ／ｍｏｌ）、およびＡＥＴＭ（ＭＷ＝５４７ｇ／ｍｏｌ）を先に記載のようにして合成し、合成において親和性リガンドとして使用した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
すべての場合において、実施例２６に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ５８Ｕインスリン／ｍｌ（Ａ２８０測定に基づく）まで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。これは、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認され得る。
Figure 2012516338
実施例２８−補足的枠組構造との薬物コンジュゲーションのための一般的なクリックケミストリー
少なくとも１つのアミノ官能基と１つ以上の末端アルキン基を含む枠組構造（８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）に入れ、撹拌して溶液にする。アジドエチル基含有薬物（１０．５１ｍｍｏｌ）を添加した後、硫酸銅（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を５５〜６０Ｃ（油浴）で６時間撹拌し、室温まで冷却させ、一晩撹拌し、２分の１の容量になるまで真空濃縮し、マイクロガラスフィルターに通して濾過する。濾液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ ５０ｗ ５０ｘ４−１００）に負荷し、中性になるまで水を用いて溶出させる（６×７５ｍＬ）。次いで、カラムを、１５％水酸化アンモニウム（１０×７５ｍＬ）を用いて溶出させ、ニンヒドリン陽性画分をプールし、濃縮すると、ガラス状の泡状物になる。
実施例２９−ウシおよびブタなどの他の種に由来する天然インスリンを用いて調製されるコンジュゲート
少なくとも１つの反応性アミン官能基を含む他の種に由来するインスリン（例えば、ウシおよびブタインスリン）は、組換えヒトインスリンをコンジュゲートさせるのに使用される任意の方法を用いてカップリングさせ得る。当業者には、ウシまたはブタインスリンからの作製によって得られるコンジュゲートの分子量が、組換えヒトインスリンから作製されるものと、以下の表に示す量だけ異なることは認識されよう。
Figure 2012516338
当業者には、インスリン間の構造のわずかな違いのため、ウシまたはブタインスリンからの作製によって得られるコンジュゲートが、ヒトインスリンからの作製によるコンジュゲートとわずかに異なるクロマトフラフィーピーク保持時間を有することがあり得ることは認識されよう。
実施例３０−リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミルなどのインスリン類似体を用いて調製されるコンジュゲート
少なくとも１つの反応性アミン官能基を含む既知のインスリン類似体（例えば、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギン、およびデテミル）はすべて、組換えヒトインスリンをコンジュゲートさせるのに使用される任意の方法を用いてカップリングさせ得る。当業者には、インスリン類似体からの作製によって得られるコンジュゲートの分子量が、組換えヒトインスリンから作製されるものと、以下の表に示す量だけ異なることは認識されよう。
Figure 2012516338
当業者には、インスリン間の構造のわずかな違いのため、インスリン類似体からの作製によって得られるコンジュゲートが、ヒトインスリンからの作製によるコンジュゲートとわずかに異なるクロマトフラフィーピーク保持時間を有することがあり得ることは認識されよう。
インスリングルリジン（Ｂ２９リジンを含まない代わりに、Ｂ３リジンを含む）の使用により、非保護インスリングルリジンを用いた場合、主に、Ｂ３コンジュゲートが得られる。しかしながら、Ｂ１−インスリングルリジンコンジュゲートが所望される場合は、実施例８に記載のＢＯＣ−（Ａ１，Ｂ２９）−ヒトインスリンと同じプロトコルを使用し、まず、ＢＯＣ−（Ａ１，Ｂ３）−インスリングルリジンを合成する。
実施例３１−ペプチド系インスリン分泌促進薬コンジュゲートを用いて調製されるコンジュゲート
Ｎ末端アミン官能基を含むペプチド系インスリン分泌促進薬（例えば限定されないが、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体エクセナチド（ｅｘａｎｉｔｉｄｅ））は、インスリンをコンジュゲートさせるために使用される任意の方法を用いてカップリングさせ得る。
ＩＩ．例示的コンジュゲートのインビトロアッセイ
この第２の組の実施例では、一部の例示的コンジュゲートのインビトロ特性を調べる種々の実験を記載する。
実施例３２−インスリン−グリコゲンコンジュゲートの合成
この比較例では、米国特許出願公開公報第２００７００９９８２０号によるインスリン−グリコゲンコンジュゲートの合成を記載する。簡単には、１ｇの市販の未精製牡蠣グリコゲン（ＩＩ型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、脱イオン水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させる。得られた溶液に固体ＣＮＢｒを、グリコゲンに対するＣＮＢｒの質量比０．６８で添加し、ｐＨを、３Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液で１０．７＋／−０．２の一定に維持する。１５分間撹拌後、さらに等質量の固体ＣＮＢｒを添加し、撹拌しながら４５分間、ｐＨを１０．７ ＋／−０．２の一定に維持する。次いで、この溶液にインスリンを、グリコゲンに対するインスリンの質量比０．６０で添加し、固体重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを９．１５に調整する。この溶液を一晩撹拌し、５０ｋＤａ ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させる。次いで、得られた粉末を非コンジュゲートインスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０ ＨｉＬｏａｄ １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）充填カラムでのゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって精製する。次いで、インスリングリコゲン画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。得られた精製物質には、インスリン−グリコゲンコンジュゲート１分子あたり１．０ｗｔ％のインスリンが含まれていた（アミノ酸解析（ＵＣＬＡ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定）。
実施例３３−液体クロマトグラフィー解析
この実施例では、実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンと、本発明に従って合成される例示的コンジュゲートとのＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールの違いを記載する。実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンの１００ｕｌの５ｍｇ／ｍｌ溶液、および例示的コンジュゲートの１００ｕｌの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、別々に、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ８ ５ｕｍカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に注入し、８０％水／２０％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）移動相（各々、０．１％のＴＦＡを含む）で平衡化した。この試験で使用した例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。
試料は１．０ｍｌ／分で、以下の勾配法：０〜５分−８０％水／２０％ＣＨ３ＣＮで一定、５〜３５分−５０％水／５０％ＣＨ３ＣＮまでの線形勾配を用いて溶出させた。図１の溶出プロフィールは、例示的コンジュゲートで単一の急上昇を示し、化学的に相違する種が単一であることを示すのに対し、インスリン−グリコゲンコンジュゲートでは、広くて不均一な溶出プロフィールを示し、化学的におよび／または分子量が異なる存在体の分布が広いことを示す。
実施例３４−分子量分布解析
この実施例では、実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンと、同じ例示的コンジュゲートとのＭＷおよびＭＷ分布の違いを記載する。インスリン−グリコゲンコンジュゲートのＭＷおよびＭＷ分布は、１ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で平衡化したＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に注入することにより測定した。カラムは、０．５ｍｌ／分で３０分間かけて溶出させ、溶出プロフィールは、２８０ｎｍにおける吸光度として測定した。同じプロトコルを用いた別個の実験において、１０００、５０００、１２０００、２５０００、５００００、８００００、１５００００、２７００００、および４１００００ｇ／ｍｏｌのデキストランＭＷ標準品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を注入し、保持時間に対するＭＷの較正曲線を作成した。較正曲線とインスリン−グリコゲンコンジュゲートの溶出プロフィールに基づき、平均ＭＷは５００，０００ｇ／ｍｏｌであると求められ、分布の６７％は、２５０，０００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌの広範囲にわたって溶出された（データ表示せず）。対照的に、例示的な本発明のコンジュゲートは、ＬＣ／ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）での測定時、厳密に６，７３０ｇ／ｍｏｌのＭＷを１つだけ有することが測定された（データ表示せず）。
実施例３５−コンジュゲートの化学的および物理的安定性
この実施例では、例示的な本発明のコンジュゲートの安定性を、非コンジュゲート型インスリンのものと、Ｈｉｎｄｓら（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１：１９５−２０１，２０００）に記載の方法による促進条件下、３７Ｃで、１５０ストローク／分の機械的撹拌速度で比較する。医薬等級の組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を、促進安定性試験の対照として選択した。Ｈｏｌｃｏｍｂｅら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２７：１２４１−１２４２，２００４）には、非促進条件下では、ＲＨＩ安定性は、室温で（ＲＴ）少なくとも３０日間維持され、冷蔵した場合はかなり長くなると記載されている。図２は、ＲＨＩおよび２つの例示的コンジュゲートの、ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５０Ｕ／ｍｌでの凝集安定性アッセイの結果を示す。すべての場合において、溶液中の残留％は、この溶液を所与の時間点で遠心分離し（４５００×ｇ、５分）、上清みのＡ２８０を測定し、上清みのＡ２８０を最初の出発溶液のもので除算することにより求めた。コンジュゲート１は、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。コンジュゲート２は、枠組構造としてＴＳＰＥ、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。
３７Ｃで４８時間の連続撹拌後、ＲＨＩの６％未満は溶液中で安定なままであったが、ＲＨＩの大部分は不溶性の凝集物として沈殿した。同じ時間量の後では、ＩＰＣのうち９６％〜９９％はＰＢＳ溶液中でインタクトで可溶性のままであったため、どちらのコンジュゲートも、実質的により安定なままであった。これらのデータは、このような条件下では、コンジュゲートはＲＨＩよりも有意に安定であることを決定的に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣを使用し、コンジュゲートの化学安定性を評価した（図３ａ参照）。４８時間の促進安定後、Ｃ８逆相カラム（水−アセトニトリル溶出勾配を使用）を用いて、コンジュゲート溶液を解析した。安定前および安定後のコンジュゲート試料の保持時間を、得られたＬＣ図に見られた非コンジュゲート（遊離）インスリンおよびデスアミドインスリンの割合とともに示す。検出可能な量の遊離インスリンまたはデスアミド型は観察されず、（ｉ）糖類とインスリン分子間の共有結合は安定であること、および（ｉｉ）促進安定性試験（ＡＳＴ）中、コンジュゲートの有意な化学分解は起こらないことを示す。また、ＡＳＴの前およびＡＳＴと並行して、コンジュゲートを、４℃〜ＲＴでの毎日の熱サイクルを含む９０日間の非促進安定性試験に供した。パラレル試験の結論として、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、コンジュゲートは、依然として化学的および物理的に安定であることが示された（データ表示せず）。
ＨＥＰＥＳ緩衝液中でのコンジュゲートの化学安定性のさらなる確認は、コンジュゲートをＡＳＴに供する前と後で得られるＬＣ−ＭＳデータからもたらされる。興味深いことに、ＰＢＳ中での４８時間ＡＳＴコンジュゲート試料では、相当な分解が起こったことが示されたが、ＨＥＰＥＳ緩衝液中での４８時間ＡＳＴコンジュゲート試料は完全にインタクトで安定であった（図３ｂ参照）。ＨＥＰＥＳ中に保存したコンジュゲートＨＳ−１−６０−１はＡＳＴの前後で６７３０ＤａのＭＷを有し、これは、マンノース残基（多量体骨格）およびインスリンはともに、すべて化学的に変化せず、かなり安定であることを示す。コンジュゲートの安定性を確実にするため、保存、インビトロ試験およびインビボ試験に使用される緩衝液には、すべて、緩衝剤としてＨＥＰＥＳを含める。
ＬＣ−ＭＳ試験は、コンジュゲートの化学的確認アッセイとしての機能が容易に果たされ得るため、ＬＣ−ＭＳデータによってＦＤＡの製造上の規制の順守が大きく増強される。薬物（例えば、インスリン）、法多量体骨格、およびコンジュゲートはすべて、別々の分子量を有するため、得られる親和性リガンド比は、該コンジュゲートのＭＷから骨格のＭＷを減算することにより糖類基による残りの質量が得られ、容易に計算され得る。コンジュゲートＨＳ−１−６０−１の場合、マンノース：インスリンのモル比は厳密に２．０と計算される。
実施例３６−コンジュゲートの機能的安定性
コンジュゲートが化学的および物理的に安定であることが示された後、７２時間ＡＳＴコンジュゲートを、その皮下生理活性に関して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用し、５Ｕ／ｋｇで、インビボ対新鮮コンジュゲートで評価した（図４参照）。
７２時間ＨＥＰＥＳ ＡＳＴコンジュゲートデータの解析により、グルコース底に達する時間（Ｔ底）は６０分であり、空腹時血中グルコース値の７０％に戻るまでの時間（Ｔ７Ｏ％ＢＧ）は１２８＋１５分未満であることが示された。スチューデントのｔ−検定（各群ｎ＝４）を用いた各時間点における新鮮コンジュゲート対７２時間ＡＳＴコンジュゲートの生理活性曲線の比較では、有意差は示されなかった（すべてｐ値＞０．２１）。この結果は、その製剤の指定の目標値の範囲内であり、コンジュゲート化学安定性の保持がインビボでの機能的能力の保持に変形されることを示す。
ＩＩＩ．例示的コンジュゲートのインビボアッセイ
この第３の組の実施例では、一部の例示的コンジュゲートのインビボ特性を調べる種々の実験を記載する。
実施例３７−ＲＨＩとデキストランまたはグリコゲンのコンジュゲートでのコンジュゲート生理活性の対比
ａ．インスリン−デキストランの生理活性
この比較例では、皮下投与されたインスリン−デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＷ約７０Ｋ）のインビボ薬力学的プロフィールを評価する。以下に示すように、米国特許公開公報第２００４０２０２７１９号に従って合成されるインスリン−デキストランコンジュゲートは、皮下注射後、該コンジュゲートポリマーのＭＷが大きいことによって体循環への吸収速度が大きく妨げられるため、比較的ゆっくり作用する。インスリン−デキストランを、変形臭化シアン（ＣＮＢｒ）カップリング反応を用いて合成した。簡単には、５００ｍｇのデキストラン（ＭＷ＝７０Ｋ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍｌの脱イオン水に溶解させた。得られた溶液に５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを１０．７±０．２に維持した。１５分間撹拌後、さらに５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、撹拌しながら４５分間、ｐＨを１０．７±０．２に維持した。次いで、この溶液に３００ｍｇの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を添加し、固体の重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを９．１５に調整した。この溶液を一晩撹拌し、１０Ｋ ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてＤＩ水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させた。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５充填カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって精製した。次いで、インスリン−デキストラン画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な粉末として得た。インスリンのコンジュゲーション度合は１０％（ｗ／ｗ）であった（（アミノ酸解析（ＵＣＬＡ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）で測定）。
インスリン−デキストランの皮下注射を、０．２５ｍｌの滅菌１×ＰＢＳ溶液（２０当量Ｕのインスリン／ｍｌ）を用いて、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２００〜２５０ｇ、ｎ＝４）の首の後ろ側に投与した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から−１５分および０分、ならびに１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００および３６０分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。図５に示されるように、グルコース底濃度に達するまでの時間（Ｔ底）は注射の約３時間後であり、血清グルコースレベルは、注射後少なくとも５時間低下したままであることがわかった。
ｂ．インスリン−グリコゲンの生理活性
この実施例では、皮下投与されたインスリン−グリコゲンのインビボ薬力学的プロフィールを評価する。 インスリン−グリコゲンコンジュゲートは実施例３２に従って合成した。インスリン−グリコゲンコンジュゲートの生理活性は、２．５当量Ｕのインスリン／ｋｇ用量を、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２００〜２５０ｇ、ｎ＝４）の首の後ろ側に注射することにより評価した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から−１５分および０分、ならびに１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００および３６０分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。上記のインスリン−デキストランコンジュゲートと比較すると、高ＭＷインスリン−グリコゲンコンジュゲートは、グルコースレベルを、ずっと急速に大きな程度で低下させる（図６参照）。この急速な作用および排出プロフィールは、皮下注射後の高ＭＷグリコゲンポリマー鎖の急速な酵素的消化によるものである。
ｃ．コンジュゲートとＲＨＩの生理活性の比較
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートおよび組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）のインビボ薬力学的プロフィールを評価および比較する。例示的コンジュゲートは、骨格としてＴＳＡＴ−Ｃ６、インジケータ類似体としてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。各場合において、コンジュゲートまたはＲＨＩは、３．５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。図７に示されるように、ＲＨＩと例示的コンジュゲートのグルコース抑制プロフィールは、例示的コンジュゲートがインビボで酵素的に消化され得ないにもかかわらず、ほぼ同一である。コンジュゲートの急速な作用および排出プロフィールは、おそらく、コンジュゲートがＲＨＩよりも１４％しか大きくなく、ＭＷの増大の効果（あれば）は、薬力学的特性の点において、ほぼ無視できることによるものが大きい。
実施例３８−ＲＨＩとのＰＫ比較
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートおよび組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）で得られた血清インスリンプロフィールを記載および比較する。例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。各場合において、コンジュゲートまたはＲＨＩは、３．５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。図８からわかるように、コンジュゲートの薬物動態プロフィールはＲＨＩのものと統計学的に識別不能であり、これは、皮下注射後、このコンジュゲートの血清中への吸収および血清からの排出が急速になされることを示す。
実施例３９−ＡＥＭ−２−ＴＳＡＴ−Ｃ６−インスリンコンジュゲートのＢ２９置換型のＰＫおよび生理活性
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートで得られた血清インスリンおよび血中グルコース抑制プロフィールを記載する。例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、ならびに薬物として組換えヒトインスリン（実施例３７および３８の場合のようにＢ１置換コンジュゲートではなく、Ｂ２９置換コンジュゲートを作製するため）用いて合成した。この場合、コンジュゲートは、５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。さらに、各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。図９からわかるように、Ｂ２９置換コンジュゲートの薬物動態プロフィールは、ＲＨＩのもの、ならびに実施例３８のＢ１置換コンジュゲートのものと統計学的に識別不能であり、これは皮下注射後、このコンジュゲートの血清中への吸収および血清からの排出も、急速になされることを示す。
実施例４０−リスプロとのＰＫおよび生理活性の比較
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートおよびインスリンリスプロで得られた血清インスリンおよび血中グルコースのプロフィールを比較する。インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は速効性インスリン類似体であり、Ｂ鎖のＣ末端の最後から２番目のリジンとプロリン残基が逆転している。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。また、比較のため、可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）のデータも示す（実施例３８および図８参照）。
例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。各場合において、コンジュゲートまたはインスリンリスプロは、３．５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。また、各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。図１２からわかるように、コンジュゲートの薬物動態プロフィールは、インスリンリスプロのものと統計学的に識別不能である。
実施例４１−生理活性に対する親和性リガンドの効果
この実施例では、皮下投与された一連の例示的コンジュゲートで得られた血中グルコースのプロフィールを比較する。例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。一連の親和性：ＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、ＡＥＴＭ−１ ＡＥＢＭ−１およびＡＥＴＭ−２（最も低い親和性から最も高い親和性まで）が包含されるように、親和性リガンドの組成をコンジュゲート間で変化させた。各場合において、コンジュゲートは、５Ｕ／ｋｇ（ＡＥＭ−２では３．５Ｕ／ｋｇ）で、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。
血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。また、各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。
図１３からわかるように、血糖降下性応答は、リガンドの親和性が増大するにつれて減少した。このデータにより、親和性リガンドの性質がコンジュゲートの生理活性に影響を及ぼし得ることが初めて示された。図１４〜１６は、試験した各４つのコンジュゲートの血中グルコースレベルを、血清インスリンレベルとともに示す。この結果は、親和性が高いリガンドを有するコンジュゲートのグルコース応答が低いことは、該コンジュゲートのＰＫプロフィールの低下に起因することをかなり明白に示す（ＡＥＭ−２の場合の図１４と、ＡＥＴＭ−２の場合の図１６を比較）。２００９年１月２８日に出願された米国特許出願第６１／１４７，８７８号、２００９年３月１２日に出願された米国特許出願第６１／１５９，６４３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許出願第６１／１６２，１０７号、２００９年３月２５日に出願された米国特許出願第６１／１６３，０８４号、２００９年６月２４日に出願された米国特許出願第６１／２１９，８９７号、２００９年７月７日に出願された米国特許出願第６１／２２３，５７２号、２００９年１０月１９日に出願された米国特許出願第６１／２５２，８５７号および２０１０年１月２７日に出願された対応ＰＣＴ出願に記載されているように、本発明者らは、このＰＫプロフィール（それに関連する生理活性）の低下は、生理学的グルコース濃度の増大によって逆転され得る（すなわち、血液循環中のコンジュゲートレベルは、グルコース濃度の増大とともに上昇する）ことを示した。一部の特定の実施形態では、このグルコース依存性は、コンジュゲートのインビボ特性をさらに微調整するために使用され得ることは認識されよう。
ＩＶ．結合部位修飾レクチン
この第４の組の実施例では、さまざまな結合部位修飾レクチンの調製および試験を記載する。
実施例４２−アジドフェニル−糖類修飾Ｃｏｎ Ａの合成
特に記載のない限り、工程はすべて、室温で行なった。まず、５．０ｇの天然Ｃｏｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ塩化マンガンおよび０．１％ｗ／ｖ アジ化ナトリウム（Ｓ２８緩衝液）を含む２００ｍｌの１０ｍＭ（ｐＨ５．０）の酢酸緩衝液溶液に溶解させ、不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって分離した。本発明者らは、種々の天然Ｃｏｎ Ａ市販調製物は、認識可能な濃度の阻害性糖類を含むことを見い出し、該糖類は、一部の特定の実施形態では光親和性修飾の前に除去される。この目的のため、この溶液を、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｓ２８移動相を使用）に２回通して精製した。最後に、得られた溶液をＳ２８で最終容量１Ｌまで希釈した。穏やかな撹拌条件下で、０．４ｇのヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した後、アジドフェニルグルコース（ＡＰＧ，ＰｏｌｙＯｒｇ Ｉｎｃ．，Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ）またはアジドフェニルマンノース（ＡＰＭ、ＰｏｌｙＯｒｇ Ｉｎｃ．、Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ）のいずれかを１６５ｍｇ添加した。この溶液を、暗所にて４Ｃで１時間、可能な限り低い撹拌速度で撹拌した。１時間の撹拌後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。２００ｍｌのこの溶液を、９インチ×１３インチのアルミニウムパンに注入し、ＣＬ−１０００ ＵＶ架橋炉（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）内部で、４Ｃにて１５分間、３６０ｎｍで反応させた（また、ＵＶ反応は、３０２ｎｍの光を用いて行なってもよい）。反応後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。次いで、清澄化した溶液をＢｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｋ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に１回通して精製した（Ｓ２８移動相を使用）。次いで、ＵＶ架橋反応およびＰ６精製プロセスを、溶液が全部反応するまで繰り返した。最後に、合わせたＰ６精製溶液を、Ｏｍｅｇａ ３０Ｋ膜を備えたＰａｌｌタンジェンシャルフロー濾過カートリッジ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて約１８０ｍｌまで濃縮した。得られた溶液を遠心分離および／または濾過によって清澄化し、０．２２ｕｍフィルターに通した後、アフィニティカラム精製を行なった。
実施例４３−ジアジリン光反応性リガンドの一般的な合成
０．９ｍｍｏｌのアミノエチル（ＡＥ）官能化糖類リガンド（例えば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を４ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、１．６ｍｌの無水トリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加すると、乳濁液が形成された。別個の容器において、２００ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）のＮＨＳ−ジアジリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）粉末を、暗条件下で、４ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた。溶解したら、ＮＨＳ−ジアジリン溶液をＡＥ−糖類溶液に滴下し、次いで、室温で一晩暗所にて反応させた。一夜溶液のＴＬＣ解析（５０％エタノール：５０％酢酸エチル）により、ジアジリン部分のＵＶシグナル（２５４ｎｍ）と、糖類シグナル（硫酸−エタノール染色）の共溶出と同時に、ＴＬＣの基部からのＡＥ官能化糖類リガンドの消失（硫酸−エタノール染色）が示されたため、反応の終了を確認した。次いで、この溶液を、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む８０ｍｌの（ｐＨ５．０）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液中で希釈し、必要であればｐＨをｐＨ５に調整し、次いで、Ｃｏｎ Ａとの光親和性反応の必要時まで凍結させた。
実施例４４−糖類官能化ジアジリンＣｏｎ Ａの合成および特性評価
特に記載のない限り、工程はすべて、室温で行なった。まず、５．０ｇの天然Ｃｏｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ塩化マンガンおよび０．１％ｗ／ｖ アジ化ナトリウム（Ｓ２８緩衝液）を含む２００ｍｌの１０ｍＭ（ｐＨ５．０）の酢酸緩衝液溶液に溶解させ、不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって分離した。本発明者らは、種々の天然Ｃｏｎ Ａ市販調製物は、認識可能な濃度の阻害性糖類を含むことを見い出し、該糖類は、一部の特定の実施形態では光親和性修飾の前に除去される。この目的のため、この溶液を、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｓ２８移動相を使用）に２回通して精製した。最後に、得られた溶液をＳ２８で最終容量１Ｌまで希釈した。次に、この溶液の容量を１×Ｓ２８を用いて１Ｌ〜リガンド容量の１／３にし、撹拌バーを入れた１Ｌ容量メディアボトル内に注入した。穏やかな撹拌条件下、暗所にて、０．４ｇのヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を溶解させた。次に、実施例４３で得られたジアジリン−糖類コンジュゲート３３ｍｌを、７回に分けて、穏やかな撹拌条件下、暗所にて添加した。溶解したら、溶液を全部、穏やかな撹拌下、暗所にて４Ｃでさらに１０分間インキュベートした。１０分間の撹拌後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。２５０ｍｌのこの溶液を、９インチ×１３インチのアルミニウムパンに注入し、ＣＬ−１０００ ＵＶ架橋炉（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）内部で、４Ｃにて１５分間、３６０ｎｍで反応させた。反応後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。次いで、清澄化した溶液をＢｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｋ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に１回通して精製した（Ｓ２８移動相を使用）。次いで、ＵＶ架橋反応およびＰ６精製プロセスを、溶液が全部反応するまで繰り返した。最後に、合わせたＰ６精製溶液を、Ｏｍｅｇａ ３０Ｋ膜を備えたＰａｌｌタンジェンシャルフロー濾過カートリッジ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて約１８０ｍｌまで濃縮した。得られた溶液を遠心分離および／または濾過によって清澄化し、０．２２ｕｍフィルターに通した後、アフィニティカラム精製を行なった。
実施例４５−修飾Ｃｏｎ Ａ試料のアフィニティカラム精製
実施例４２および４４に従って合成した光親和性修飾レクチンをアフィニティカラムクロマトグラフィーによって精製し、充分に反応した物質を、未反応および／または一部反応物質から分離した。１００〜２００ｍｌの溶液を、グルコース含有Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を充填し、Ｓ２８緩衝液で平衡化したＸＫ５０／１００カラム（５０ｍｍ直径×１００ｃｍ長さ）に注入した。次いで、カラムを、Ｓ２８を用いて５ｍｌ／分で４時間溶出させた。充分に反応した所望の画分が、まず、カラムから溶出され、続いて、まだグルコース含有固定相に対して一部親和性を有する一部反応物質が溶出された。典型的には、７０〜１２０分の間に溶出された物質を収集し、残りは廃棄した。次いで、カラムを、８０ｍＭのα−メチル−マンノース溶液を含むＳ２８緩衝液を用いて５ｍｌ／分で６時間洗浄して未反応レクチン（あれば）を除去した後、Ｓ２８中、５ｍｌ／分でさらに６時間再生させた。収集した画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ１００ｍｌまで濃縮し、０．２２ｕｍフィルターに通した後、さらなるアフィニティカラム精製工程（実施する場合）を行なった。カラム精製プロセスは２回目、３回目および４回目を繰り返し、後続の試験のために充分純粋な物質を得た。４回目の精製工程後、該物質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ１８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（この溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）によって測定）。この溶液を０．２２ｕｍフィルターに通し、後の試験で必要とされるまで４Ｃで保存した。
実施例４６−修飾Ｃｏｎ Ａ試料の化学的特性評価
ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、該物質に対して行ない、ＵＶ光への曝露の結果、有害なタンパク質分解性切断が起こらなかったことを確実にした。簡単には、１０〜１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ既製ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＰＡＧＥ実験を行なった。また、広い範囲の分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および天然コンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖｌｉｎ）レクチン（Ｃｏｎ Ａ、ＶＩ型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の２ｍｇ／ｍｌ試料も、対照として泳動させた。２５ｕＬの各修飾レクチンまたは対照試料を５ｕＬの−メルカプトエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む５０ｕＬの１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に溶解させ、試料を沸騰水浴中でほぼ５分間加熱した。試料を室温まで冷却させた後、２０ｕＬの各試料を既製ＰＡＧＥゲルのウェル内に負荷した。次いで、試料を２００ボルトで６０分間泳動させた。電気泳動後、ゲルを、脱イオン水：メタノール：氷酢酸（容量比６０：３０：１０）の溶液中に３０分間固定した後、脱イオン水中で２回洗浄した。最後に、ゲルを１×Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で６０分間染色した。最終のゲルをライトテーブルおよびデジタルカメラを用いて画像形成し、染色されたゲルを記録した。染色されたタンパク質バンドを、その分子量について、分子量および天然Ｃｏｎ Ａ対照試料と比較することによりアッセイした。ＵＶ光への曝露中での修飾レクチン試料のタンパク質分解性切断により、天然Ｃｏｎ Ａ対照に存在するものよりもＭＷが小さく、明白に異なると思われる分子量バンドがもたらされ得る。
ｂ．マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析
当業者には、ＭＡＬＤＩが、タンパク質の分子量を特性評価するための周知の手法であることは認識されよう。ＭＡＬＤＩは、親和性リガンドへのコンジュゲーション、および後続のアフィニティカラム精製後の修飾レクチンサブユニットのＭＷを特性評価するために使用され、修飾レクチンが親和性リガンドに共有結合された程度が計算され得る。
２ｍｇ／ｍｌの修飾レクチン試料を、脱イオン水で事前に平衡化したＢｉｏＳｐｉｎ ３０カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に添加した。ＢｉｏＳｐｉｎカラムを１０００×ｇで４分間遠心分離した。得られた溶出液には、実質的に脱塩された修飾レクチン試料が含まれていた。試料をドライアイス上で凍結させ、シナピン酸マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ解析のために発送した。
ｃ．解析用超遠心分離（ＡＵＣ）
ＡＵＣは、溶液中に存在するときのタンパク質試料の天然の分子量を調べるために使用される手法である。一部のレクチンは第４級構造を有するため（例えば、Ｃｏｎ Ａ）、非変性条件（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ）下での修飾レクチンの分子量を明らかにすることが推奨される。
修飾レクチン試料および対照天然Ｃｏｎ Ａ（ＶＩ型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）試料を、１．０、０．５および０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１２．５ｍＭのα−Ｄ−マンノースを含むＳ２８緩衝液に溶解させ、これらを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ｉ解析用超遠心分離機（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のＡＵＣセル内に入れ、１０ｋ、２０ｋ、３０ｋまたは４０ｋ ｒｐｍの速度で連続的にスピンさせ、各速度において、何時間か平衡化させた。各細胞を２８０ｎｍの波長でスキャンし、Ｗｉｎｍａｔｃｈソフトウェア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、ＡＵＣセルの平衡時間を求めた。各試料で得られたＡＵＣデータを、非線形最小二乗解析（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ｖｌ．０６（ＵＣｏｎｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＣＴ）を使用）を用いてフィットさせ、試料の分子量を得た。
ｄ．等温熱量測定
滴定熱量測定を、２５Ｃで、Ｍｉｃｒｏ−Ｃａｌ ＶＰ−ＩＴＣマイクロ熱量計（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）（１．４ｍｌ（公称）滴定セルを使用）にて行なった。典型的な修飾レクチンの濃度は、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ２）中、４〜６ｍｇ／ｍｌの範囲とした。試料を同じ緩衝液中１０ｍＭのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドで、最初の１回はシリンジを洗浄するために２μｌ増分を使用した後、４μｌの９回の注射を行ない、１１回目から３０回目の添加では８μｌに増加させ、２４０秒間隔で滴定した。通常、後の添加ほど、示されたバックグラウンド希釈熱はわずかであった（すなわち、全飽和）。データ（最初のデータ点、および任意の他の明らかに良くないデータは除外する）を、機器に付属のＯｒｉｇｉｎｓソフトウェアを用いて単一部位モデルにフィットさせた。
ｅ．ＭＡＣアッセイ
種々の光親和性標識レクチン（実施例４２および４４で合成し、実施例４５に従って精製したものなど）を、未修飾レクチンが結合し得る親和性リガンドを有する細胞を凝集させる能力に基づいて比較した。各組成物の最小凝集濃度（ＭＡＣ）を、Ｖ字型ウェルマイクロタイタープレート内で、ホルムアルデヒド安定化ウサギ赤血球の２％ｖ／ｖ懸濁液を使用し、Ｃｒｏｗｌｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３：３６８−３７３，１９８２の手順に従って測定した。ホルムアルデヒド処理ウサギ赤血球（公開された手順（Ｎｏｗａｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９３：１１５−１２３、１９７５）によって、ミシガン大学の実験動物医療部門（Ｕｎｉｔ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から取得したウサギ血液から調製）は、先の試験から利用可能であった。ＭＡＣは、可視凝集を示す最も高い希釈度におけるレクチンタンパク質の濃度（結合された化学物質化合物を除く）と定義した。
簡単には、レクチン組成物の水溶液を９６ウェルプレートのウェルに、レクチン濃度が約０．１〜１０００ｕｇ／ｍｌの範囲となるような希釈度を用いて添加した。次いで、ホルムアルデヒド処理ウサギ赤血球のアリコートを、各ウェルにピペットで移した。低レクチン濃度では、架橋細胞の網目が形成されるためには、存在するレクチンが不充分であり、細胞はＶ字型ウェルの底面に沈み、上から見ると、暗色のピンポイントの円のように見えるものがプレートの底面に形成された。しかしながら、レクチン濃度が最小凝集濃度（ＭＡＣ）に達すると、レクチン分子は、赤血球表面上で糖質受容体を架橋させ始め、それにより網目がもたらされるが、これは、Ｖ字型ウェルの底面に沈降され得ず、上から見ると、大きな不透明の広がった円のように見えるものが形成される。この大きな広がった円がもたらされる最も低い濃度を、具体的な製剤のＭＡＣ値とする。
以下の表に、上記の実施例に従って合成されたＣｏｎ Ａ系製剤のＭＡＣ値をまとめる（図１７も参照のこと）。
Figure 2012516338
実施例４７−マイトジェン活性アッセイ
この実施例では、種々の修飾レクチン組成物のＴ細胞マイトジェン活性を特性評価し、それにより比較するために使用され得るアッセイを記載する。この典型的なアッセイの変形例および択一例は当業者に自明であろう。レクチンによるＴ細胞の活性化は、一般的に、集合的にアクセサリー細胞と称される非Ｔ細胞集団（例えば、単球、樹枝状細胞）の存在を必要とするため、このアッセイでは、高度に精製されたＴ細胞ではなく、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が使用される。典型的なアッセイでは、ＰＢＭＣを３例の健常ヒトドナーの全血から単離し、９６ウェルプレート内に、約１００，０００細胞／ウェルで隔離して広げる。次いで、異なるレクチン組成物（例えば、天然および被処理）の３連の連続希釈物を、開始濃度１０００（または１００）ｕｇ／ｍｌでウェルに添加する。プレートを３７Ｃで３日間インキュベートし、この時点で０．８ｕＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加し、さらに１８時間インキュベートする。次いで、マイトジェン活性の度合を、増殖ＰＢＭＣによる３Ｈ−チミジン取込みによって調べる。一部の場合において、新規レクチン組成物（例えば、被処理組成物）のマイトジェン活性を天然マイトジェン活性に対する最大％で表示する。天然マイトジェン活性に対する最大％は、測定した全濃度での修飾レクチン組成物の最大ＣＰＭ（カウント毎分）値を、測定した全組成での組成物での天然レクチン組成物の最大ＣＰＭ値で除算することにより得られる。
以前の研究において、本発明者らは、ＭＡＣ値とＣｏｎ Ａマイトジェン活性に対する最大％との間に強い相関性、すなわち、ＭＡＣ値の有意な増大によりマイトジェン効果の有意な減少がもたらされることを見い出した。したがって、本開示では、ＭＡＣ値を、所与の化学修飾でのマイトジェン活性の低下の可能性を調べるためのサロゲートとして使用する。
Ｖ．コンジュゲートを制御可能に放出させるための架橋物質体
この第５の組の実施例では、コンジュゲートを制御可能に放出させるための例示的な架橋物質体の調製を記載する。また、この組の実施例では、該物質体のインビトロおよびインビボ特性の一例を記載する。
実施例４８−修飾Ｃｏｎ Ａから調製される架橋物質体
０．５０ｍｌの１８ｍｇ／ｍｌ ＤＥＭ−Ｃｏｎ Ａ溶液（Ｓ２８中）を遠心チューブに添加し、続いて、０．１１１ｍｌの１．１８ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛二水和物の脱イオン水溶液と混合した。次いで、ｐＨ８．２の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ１４緩衝液）中Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンの０．５０ｍｌの２．３ｍｇ／ｍｌ溶液を添加した後、急速に混合すると不溶性粒子の分散体が形成された。この分散体を室温で２０分間放置し、次いで、上清みから遠心分離によって分離した。得られたケークを、１．０ｍｌのｐＨ７．４の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ２４緩衝液）で２回洗浄した。このプロセス中、最初の上清みならびに２回の洗浄液を１つの大きな遠心チューブ内に収集した。合わせた上清みと洗浄液に、０．３３３ｍｌの１．１８ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛二水和物の脱イオン水溶液を添加した。この溶液を２０分間放置した後、さらなる沈殿粒子（あれば）を遠心分離によって単離し、最初の２回の洗浄工程で残留した粒子と合わせた。この合わせた不溶性画分を、さらに３回、０．３３３ｍｌのＳ２４緩衝液で洗浄した。残留した不溶物を０．３３３ｍｌのＳ２４緩衝液中に分散させ、穏やかな撹拌下、３７Ｃで一晩インキュベートした。翌日、残留粒子を再度、遠心分離によって単離し、０．３３３ｍｌのＳ２４中でさらに１回洗浄した。得られた不溶物を、総容量０．３０ｍｌ（Ｓ２４を使用）中に分散させ、後の試験のために確保した。このプロセスは、任意の量の所望の生成物を生成させるために直接的に規模拡大してもよい。Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンは、上記の合成において、異なる刺激に応答性の能力特性を有する製剤を得るために、Ｃ６−アミン−ＡＥＴＭ−２−インスリン（または任意の他のコンジュゲート）と置き換えてもよい。
実施例４９−非糖尿病ラットにおけるＩＰＧＴＴ実験
０．３００ｍｌの所与の架橋物質体を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｌｏｃａｔｉｏｎ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射する。製剤の注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得る。試験期間中は、飼料をラットケージから除く。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得る。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得る。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、純粋なインスリンコンジュゲート溶液で作成した標準曲線を用いて測定する。
図１８および１９は、ＤＥＭ−Ｃｏｎ ＡとＣ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンまたはＣ６−アミン−ＡＥＴＭ−２−インスリンから（それぞれ、実施例４８に記載の手順に従って）構築した架橋物質体で得られた結果を示す。ＤＥＭ−Ｃｏｎ Ａ／Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２製剤では、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）後、ベースラインからの血清インスリン濃度の約２倍の増大が示され、インビボでのグルコース応答性送達を示す。他方、ＤＥＭ−Ｃｏｎ Ａ／Ｃ６−アミン−ＡＥＴＭ−２製剤では、ＩＰＧＴＴ後、グルコースに応答してベースラインからの血清インスリン濃度の約３〜４倍の増大が示され、通常の生理学的グルコース濃度において、系から漏出される物質体は有意に少ない。さらに、ＤＥＭ−Ｃｏｎ Ａ製剤を受けたすべての動物の注射部位では、レクチンの存在による炎症または壊死の徴候は全く示されず、該光親和性修飾物質体の安全性プロフィールの改善がさらに確認される。
実施例５０−インスリン−グリコゲン架橋物質体のグルコース応答性溶解に対する種々の動物血清の効果およびアミラーゼ活性との相関性
この実施例では、インスリン−グリコゲン系コンジュゲートを用いて合成したグルコース応答性製剤の、グルコース濃度の関数としての種々の動物血清中のインビトロ溶解を記載する。インスリン−グリコゲンコンジュゲートは、以下の手順に従って合成した。まず、６２．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン溶液（ＲＨＩ）（ｐＨ８．２の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＡ）中）をｐＨ９．０に調整し、氷上で冷却させ、ＲＨＩストック溶液を得た。別途、０．３１２ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＡ）を３ｍｌのＤＩ水に溶解させ、ＴＥＡストック溶液を得た。別途、０．３００ｇのシアノジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１．２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、ＣＤＡＰストック溶液を得た。別途、１００ｍｇのマンノサミン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１．５ｍｌの１００ｍＭ（ｐＨ９）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に溶解させ、ｐＨ９．０に調整し、マンノサミンストック溶液を得た。別途、２．０ｇの牡蠣ＩＸ型グリコゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を４０ｍｌの１００ｍＭ（ｐＨ９）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に溶解させた後、この溶液を濾過によって清澄化し、氷浴で冷却した。次に、１ｍｌのＣＤＡＰストック溶液をグリコゲン溶液に添加し、１分間混合した後、１ｍｌのＴＥＡ溶液を添加し、得られた溶液のｐＨを９．０に調整した。さらに１分間の撹拌後、６２ｍｌのＲＨＩ溶液を添加し、得られた溶液を５分間撹拌した後、１．０６５ｍｌのマンノサミン溶液を添加した。この溶液を室温で一晩撹拌し、５０ｋＤａ ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させた。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０ ＨｉＬｏａｄ １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）充填カラムでのゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって３回精製した。次いで、インスリングリコゲン画分１を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得た。
２４種類のグルコース応答性製剤を、多価架橋剤としてアセチル化Ｃｏｎ Ａ（ＡＣＡ）を使用し、以下のようにして調製した。２００ｕｌの２５ｍｇ／ｍｌインスリン−グリコゲンコンジュゲート溶液（ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）を、２００ｕｌの２５ｍｇ／ｍｌ化学修飾アセチル化Ｃｏｎ Ａ（ＡＣＡ）溶液（ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）と混合し、２０分間放置した。次に、各製剤を遠心分離し、４００ｕｌのｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で、室温にて５回洗浄した。最後の洗浄および遠心分離後、上清みを廃棄し、残留不溶物を５０ｕｌの１×ＰＢＳ中に分散させた。
２４×５０ｕｌの分散体を９６ウェルプレートに、指定量のグルコースを含有する特定動物種由来の血清５０ｕｌとともに、以下の形式に従って添加した。
Figure 2012516338
実験開始時、各ウェルの外観は白色で不透明であった（光透過率の減少または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の増大によって測定）。次いで、９６ウェルプレートを３７Ｃで６時間インキュベートした後、各ウェルのＡ４５０値を再度測定した。残留製剤％を、Ａ４５０（最終）をＡ４５０（初期）で除算し、１００を乗算することにより計算した。物質体がすべて溶解した場合、Ａ４５０値はゼロに近く、ほぼ０％残留を示す。あるいはまた、物質体が溶解しなかった場合は、Ａ４５０は初期値に近く、ほぼ１００％残留を示す。
図２０の結果は、インスリン−グリコゲンコンジュゲートから構築された架橋物質体は、緩衝生理食塩水中インキュベートすると、６時間の試験中、理想的なグルコース応答性様式で溶解することを示す。しかしながら、該物質体は、ブタ血清中でインキュベートした場合、グルコース濃度に関係なく完全に溶解する。ラット血清では、一部グルコース応答性が維持されるが、グルコースの非存在下であっても、６時間の間で相当溶解する。ヒト血清中でインキュベートした物質体は、２０％超が、グルコースの非存在下でなお、溶解する。
このような違いを、まず、グリコゲンなどの線形α−１，４グリコシド結合を介して連結されたオリゴ糖からの比色分析シグナルの生成を利用したマイクロプレートアッセイを開発することにより、種それぞれの固有のアミラーゼおよびグルコシダーゼ消化活性と相関させた。アミラーゼ活性を調べるためには、４−ニトロフェニルα−Ｄ−ペンタ−（ｌ→４）−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用し、グルコシダーゼ活性を調べるためには、４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用した。各アッセイでは、特定の種由来の血清を、量を漸増させて１×ＰＢＳによって希釈し、既知濃度の比色分析のレポーターをこの溶液中でスパイクさせた後、４０５ｎｍにおける吸光度シグナル（Ａ４０５）を時間の関数として測定した。図２１ａおよび２１ｂに、それぞれ、アミラーゼおよびグルコシダーゼ活性について試験した種々の種の各血清における酵素活性によるＡ４０５の生成を示す。ここで、本発明者らは、ＰＢＳ中の血清の希釈度が１：８のとき、ブタ血清がラット血清のほぼ１７倍の消化活性を示すことを認めた。さらに、この条件下で試験したヒト血清中では、活性はほぼ全くないようである。したがって、それぞれの種の血清中での物質体の溶解プロフィールの違いは、種の血清が対象のグリコゲンコンジュゲートを消化する能力と直接相関している。総合すると、この結果により、グリコゲン消化の制限は回避されるが、グルコース応答性物質体はなお形成される、皮下用生理活性コンジュゲート（この開示において記載のものなど）を設計するための起動力がもたらされた。
実施例５１−ＡＣＡおよびＡＥＭ−２コンジュゲートを用いたグルコース応答性物質体
この実施例では、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成されたコンジュゲートを用いた、グルコース応答性の不溶性物質体の形成を記載する。５０ｕｌの２ｍｇ／ｍｌコンジュゲート溶液（ｐＨ８．２のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）を、５０ｕｌの２５ｍｇ／ｍｌ化学修飾アセチル化Ｃｏｎ Ａ（ＡＣＡ）溶液（ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）と、９６ウェルマイクロプレートの各ウェル内で混合した。各ウェルには、終濃度が０、５０、１００、２００、４００、８００および１６００ｍｇ／ｄｌとなるような漸増濃度の５．５ｕｌのグルコース濃縮液を入れた。最後のウェルには、効力の高いα−メチルマンノース糖類阻害薬５．５ｕｌを、終濃度が１００ｍＭとなるように入れた。次いで、漸増濃度のグルコースの存在下でＡＣＡ／コンジュゲート混合物が沈降する能力を評価した。この組合せが不溶性網目を形成した場合、ウェルの外観は、図２２に示されるように、白色で不透明となる（光透過率の減少または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の増大によって測定）。グルコース濃度が充分に高い場合、ウェル全体の内容物が可溶性で透明になる（光透過率の増大または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の減少によって測定）。この結果は、この具体的な製剤が、１００〜４００ｍｇ／ｄｌの濃度に対して最も応答性であり、インビボ試験の理想的な候補であることを明白に示す。さらに、後述するように、この具体的なコンジュゲートは、その生物学的効果を奏するために酵素的消化を必要とすることなく、非コンジュゲート型インスリンとほぼ同じ皮下生理活性を示す。
実施例５２−全動物血清における同様の能力
この実施例では、実施例５１のグルコース応答性製剤の、グルコース濃度の関数としての種々の動物血清中のインビトロ溶解を記載する。
２４×５０ｕｌの分散体を９６ウェルプレートに、指定量のグルコースを含有する特定動物種由来の血清５０ｕｌとともに、以下の形式に従って添加した。
Figure 2012516338
実験開始時、各ウェルの外観は白色で不透明であった（光透過率の減少または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の増大によって測定）。次いで、９６ウェルプレートを３７Ｃで６時間インキュベートした後、各ウェルのＡ４５０値を再度測定した。残留製剤％を、Ａ４５０（最終）をＡ４５０（初期）で除算し、１００を乗算することにより計算した。物質体がすべて溶解した場合、Ａ４５０値はゼロに近く、ほぼ０％残留を示す。あるいはまた、物質体が溶解しなかった場合は、Ａ４５０は初期値に近く、ほぼ１００％残留を示す。結果を図２２に示す。
同じ条件下で試験したインスリン−グリコゲン製剤と比較した場合（図２０参照）、この新しい製剤は、低グルコース濃度でグルコース応答性であり、かつ溶解に対して抵抗性であっただけでなく、そのグルコース応答特性は、試験したすべての種においてほぼ同一であった（図２３参照）。
実施例５３−ＡＣＡおよびＡＥＭ−２コンジュゲートを用いたグルコース応答性物質体
この実施例では、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成されたコンジュゲートを用いた、グルコース応答性の不溶性物質体を形成するための代替法を記載する。０．５０ｍｌの２．３ｍｇ／ｍｌコンジュゲート溶液（ｐＨ８．２の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ１４緩衝液）中）を遠心チューブに添加し、続いて、０．５００ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ ＡＣＡ溶液（ｐＨ７．４の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ２４緩衝液）中）と速やかに混合すると、不溶性粒子の分散体が形成された。この分散体を室温で２０分間放置し、次いで、上清みから遠心分離によって分離した。得られたケークを、１．０ｍｌのｐＨ７．４の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ２４緩衝液）で５回洗浄した。最後の洗浄後、残留不溶物を３７Ｃで一晩インキュベートした。翌日、残留粒子を再度、遠心分離によって単離し、１．０ｍｌのＳ２４中でさらに１回洗浄した。得られた不溶物を、総容量０．３０ｍｌ（Ｓ２４を使用）中に分散させ、後の試験のために確保した。このプロセスは、任意の量の所望の生成物を生成させるために直接的に規模拡大してもよい。
実施例５４−非糖尿病ラットにおけるＩＰＧＴＴ実験
０．３００ｍｌの実施例５３で調製した物質体を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。製剤の注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得た。試験期間中は、飼料をラットケージから除いた。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得た。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得た。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、純粋なインスリンコンジュゲート溶液で作成した標準曲線を用いて測定した。このアッセイでは、内因性ラットインスリンは交差反応しない。したがって、得られた結果はいずれも、単に、外因的に投与されたインスリンコンジュゲートによるものであり、動物の内因性インスリンによるものではなかった（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡキットの使用説明書を参照のこと（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ））。
別個の実験において、０．３００ｍｌの生理食塩水を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。生理食塩水の注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得た。試験期間中は、飼料をラットケージから除いた。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得た。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得た。続いて、血清インスリン濃度を、ラットインスリンに特異的な市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒａｔ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。この実験の結果により、正常な非糖尿病ラットの膵臓によって生成されるグルコース応答性の内因性インスリン分泌が確立された。
別個の実験において、５Ｕ／ｋｇの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。ＲＨＩの注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得た。試験期間中は、飼料をラットケージから除いた。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得た。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得た。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、純粋なインスリンコンジュゲート溶液で作成した標準曲線を用いて測定した。このアッセイでは、内因性ラットインスリンは交差反応しない。したがって、得られた結果はいずれも、単に、外因的に投与されたインスリンコンジュゲートによるものであり、動物の内因性インスリンによるものではなかった（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡキットの使用説明書を参照のこと（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ））。
図２４ａは、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）後のベースラインからの血清インスリン濃度の約２倍の増大を示し、インビボでのグルコース応答性送達を示す。さらに、好都合には、ピーク−ベースライン放出プロフィールは、正常な非糖尿病ラットにおけるグルコース応答性の内因性インスリン生成と同等である（図２４ｂ参照）。最後に、図２５は、厳密に同じ条件下で注射および解析されたＲＨＩは、ＩＰＧＴＴ投与後、急速に吸収および排出され、最初の１２０分間に重度の低血糖が引き起こされ、測定可能なグルコース応答性プロフィールが示されないことを示す。
実施例５５−非糖尿病ラットにおける正常血糖／高血糖クランプ実験
この実施例では、ラットのグルコースレベルを一定の値に維持し、グルコース濃度の関数として定常的な血清インスリン濃度状態を得るためのグルコースクランプの使用を記載する。０．３００ｍｌ（約０．６ｍｌ／ｋｇの体重）の実施例５３で調製した物質体を、４匹の正常な、頚静脈に二重カテーテル挿入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重３００〜４００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。各ラットの一方のカテーテルを、グルコース濃縮液を入れた可変速シリンジポンプに連結した。血中グルコース値を、尾静脈からの採血により５分毎に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、注射後、最初の２時間は、ラットが１００ｍｇ／ｄｌに維持されるように、シリンジポンプの静脈内注入速度を定期的に調整した。最初の２時間後、グルコース注入速度を４００ｍｇ／ｄｌに上げ、この速度でさらに２時間維持した。インスリン濃度（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）および血中グルコース値のための血清を定期的に収集した。図２６に示されるように、この物質は、１００〜４００ｍｇ／ｄｌの４倍のグルコース濃度の定常的増大状態（ｐ＜０．０５）、およびほぼ１：１で適合するグルコースレベルとインスリンレベル（ｐ＜０．０００１）を示す。
実施例５６−非糖尿病のブタにおける正常血糖／高血糖クランプ実験およびラットで得られた結果との一致
実施例５３の具体的な物質体は、ラット血清とブタ血清間で溶解速度に有意差を示さなかったため、以下の実験を行ない、同様のグルコース応答性プロフィールがブタにおいて得られ得るかどうかを調べた。０．３００ｍｌ（約０．０１２ｍｌ／ｋｇの体重）の実施例５３で調製した物質体を、４匹の正常な、頚静脈にカテーテル挿入した、雄Ｙｕｃａｔａｎ Ｍｉｎｉａｔｕｒｅブタ（Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）（体重２０〜２５ｋｇ）のそれぞれに皮下注射した。各ブタのカテーテルを、グルコース濃縮液を入れた可変速シリンジポンプに連結した。血中グルコース値を、静脈内カテーテル採血により５分毎に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、注射後、最初の２時間は、ブタが６５ｍｇ／ｄｌに維持されるように、シリンジポンプの静脈内注入速度を定期的に調整した。最初の２時間後、グルコース注入速度を４００ｍｇ／ｄｌに上げ、この速度でさらに２時間維持した。インスリン濃度および血中グルコース値のための血清を定期的に収集した。インスリンコンジュゲートは内因性ブタインスリンと交差反応しないため、ブタにおいてインスリンを検出するための新しいアッセイ方法論を開発し、実施した。まず、ブタ由来および例示的なインスリンコンジュゲートの両方を、ほぼ同じ信号雑音比で検出するためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を開発した。このキットでの内因性ブタインスリンによるシグナルを、特定のブランクブタ血清試料をｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ ＲＩＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）およびインスリンＲＩＡキットに流すことにより測定した。
得られた相関性を調べたら、血清試料のＲＩＡインスリンシグナル（あれば）は、内因性インスリンおよびコンジュゲート型インスリンの寄与に変換され得る。
この方法を使用し、正味のコンジュゲート血清インスリンレベル（内因性ブタインスリンは既に差し引いてある）を示すために図２７を作成した。これは、この製剤が、６５〜４００ｍｇ／ｄｌの６倍のグルコース濃度の定常的増大状態（ｐ＜０．０５）、およびほぼ１：１で適合するグルコースレベルとインスリンレベル（ｐ＜０．０００１）を示すことを示す。したがって、この製剤は、ラットとブタの両方において、ほぼ同じグルコース応答性様式で機能を発揮する。
実施例５７−式（ＩＶ）のコンジュゲート
この実施例では、式（ＩＶ）：
Figure 2012516338
のいくつかの例示的なコンジュゲートを記載する。
このコンジュゲートのまた他の実施形態ならびにこのコンジュゲートの中間体および作製方法は、米国特許仮出願第６１／１６２，１０５号（２００９年３月２０日出願）および対応ＰＣＴ出願（２０１０年１月２７日出願）を見るとよい。これらの関連出願の全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ）のコンジュゲートは、下記の例示的な基の１つ以上を含むものであり得る。
Ｒｘ
一部の特定の実施形態では、Ｒ ｘ は水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは、任意選択で置換されているＣ１−６アルキルである。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは、任意選択で置換されているＣ１−３アルキルである。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは、任意選択で置換されているメチルである。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは−ＣＨ３である。
Ｚ１
一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４またはＣ１−２の炭化水素鎖である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、または−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−または−（ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。
一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１−１０の炭化水素鎖であって、Ｚ１の１、２または３個のメチレン単位が、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１−１０炭化水素鎖であって、Ｚ１の１、２または３個のメチレン単位が、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−から選択される１つ以上の基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−、−ＣＨ（Ｒｆ）２、−ＣＨ２ＣＨ（Ｒｆ）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（（Ｒｆ）２−ＲＶ、−ＣＨ２Ｓ−、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、式中、Ｒｆは、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリールである（例えば、一部の特定の実施形態では、Ｒｆは、任意選択で置換されているアリールであり；一部の特定の実施形態では、Ｒｆはフェニルである）。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−である。
Ｙ１
一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、フリーラジカル開始剤の断片である。かかる断片は、ハロゲン、−ＯＲｅ、−ＳＲｅ、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、および任意選択で置換されているヘテロアリール部分を含むものであり得るため、Ｙ１の定義に包含される。
一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、水素、ハロゲン、または開始剤の断片である。一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、水素またはハロゲンである。一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、水素または臭素である。
Ｘ１
一部の特定の実施形態では、Ｘ１は−ＯＲＣである。一部の特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＯＲＣと−Ｎ（Ｒｄ）２の混合物である。一部の特定の実施形態では、Ｘ１は、−Ｎ（Ｒｄ）２である。
Ｗ１および
Figure 2012516338
一部の特定の実施形態では、
Figure 2012516338
は共有結合性の単結合である。
一部の特定の実施形態では、Ｗ１はポリマーに、アミノ基によって共有結合されている。一部の特定の実施形態では、Ｗ１はポリマーに、第１級アミノ基によって共有結合されている。
例えば、一部の特定の実施形態では、基
Figure 2012516338
は、基
Figure 2012516338
に相当し、式中、
［薬物−ＮＨ−］基または［薬物−Ｎ＝］基は、第１級アミノ基によって共有結合により直接コンジュゲートされた薬物である。他の実施形態では、薬物は、懸垂アミノ基を末端とするスペーサー基（例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、エステル結合、アミド結合など）を含むものであり得る。後者の実施形態により、薬物の活性部分とポリマーとの間隔を大きくすることが可能になる。
ｒ
一部の特定の実施形態では、ｒは１０〜２５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは１５〜２５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは２０〜２５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは５〜２０（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは１０〜２０（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは１５〜２０（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５である。一部の特定の実施形態では、ｒは５である。一部の特定の実施形態では、ｒは１０である。一部の特定の実施形態では、ｒは１５である。一部の特定の実施形態では、ｒは２０である。一部の特定の実施形態では、ｒは２５である。
一部の特定の実施形態では、基：
Figure 2012516338
は、基：
Figure 2012516338
（式中、（ｇ＋ｔ）の和はｒに等しい）の混合物に相当する。一部の特定の実施形態では、各場合のｇとｔは、独立して、１〜２４（両端を含む）の整数であるが、（ｇ＋ｔ）の和は５以上２５以下であるものとする。一部の特定の実施形態では、ｇとｔは、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、または１：１（ｇ：ｔ）の比率で存在する。一部の特定の実施形態では、ｔとｇは、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、または１：２（ｔ：ｔ）の比率で存在する。
例示的なコンジュゲート
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ−ａ１）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートが使用され得る。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ−ａ２）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートが使用され得る。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ−ｂ１）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートが使用され得る。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ−ｂ２）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートが使用され得る。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ−ｃｌ）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートが使用され得る。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶ−ｃ２）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートが使用され得る。
これらの任意の例示的なコンジュゲートにおいて、基：
Figure 2012516338
は、基：
Figure 2012516338
（式中、それぞれ、（ｇ＋ｔ）の和はｒに等しい）の混合物に相当する。一部の特定の実施形態では、ｒは１０である。一部の特定の実施形態では、ｒは２０である。
コンジュゲートの特性評価
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴（例えば、１Ｈ ＮＭＲ）；分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）；および鎖１本あたりの酸基の数の測定はフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）または酸滴定によって特性評価することができる。
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造（すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない）は、１０，０００Ｄａ未満、例えば約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約１，０００〜２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約２００〜１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの混合物を作製する。該コンジュゲートは、この混合物において、同じ分子量を有するものであっても異なる分子量を有するものであってもよい。一実施形態において、混合物の多分散性は１．５未満である。一実施形態において、混合物の多分散性は１．２５未満である。
実施例５８−式（Ｖ）のコンジュゲート
この実施例では、式（Ｖ）：
Figure 2012516338
のいくつかの例示的なコンジュゲートを記載する。
このコンジュゲートのまた他の実施形態ならびにこのコンジュゲートの中間体および作製方法は、米国特許仮出願第６１／１４７，８７８号（２００９年１月２８日出願）、米国特許仮出願第６１／１５９，６４３号（２００９年３月１２日出願）、米国特許仮出願第６１／１６２，１０７号（２００９年３月２０日出願）、米国特許仮出願第６１／１６３，０８４号（２００９年３月２５日出願）、米国特許仮出願第６１／２１９，８９７号（２００９年６月２４日出願）、米国特許仮出願第６１／２２３，５７２号（２００９年７月７日出願）、米国特許仮出願第６１／２５２，８５７号（２００９年１０月１９日出願）、および対応ＰＣＴ出願（２００９年１月２７日出願）を見るとよい。これらの関連出願の全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＸ−ａ）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートを提供する。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
のコンジュゲートを提供する。
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＸ−ａ）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートを提供する。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
Figure 2012516338
のコンジュゲートを提供する。
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＸ−ａ）：
Figure 2012516338
のコンジュゲートを提供する。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
Figure 2012516338
のコンジュゲートを提供する。
コンジュゲートの特性評価
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴（例えば、１Ｈ ＮＭＲ）；分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）；フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）などよって特性評価することができる。
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造（すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない）は、１０，０００Ｄａ未満、例えば約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約１，０００〜２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約２００〜１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
実施例５９−蛍光標識多糖の調製
この実施例では、蛍光多糖、特に、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）由来マンナン（これは、ＦＲＥＴ系グルコースセンサーに使用されることがある）の作製方法を記載する。このＴＲＩＴＣ−マンナン化合物は、実施例６０での適用に使用したものである。
簡単には、シュレンクチューブ内で、窒素下、１ｇのマンナン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を２０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に、９５Ｃで、溶液が透明になるまで溶解させる。次に、２滴のピリジン（無水、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を混合物に添加する。この加熱溶液に、２０ｍｇのＴＲＩＴＣ粉末を直接添加し、次いで、１０ｕｌのジラウリン酸ジブチルスズ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、混合物を２時間反応させた後、フラスコを温度浴から取り出し、放冷する。ＴＲＩＴＣ−マンナンを、５０：５０エタノール：ジエチルエーテル混合物を用いた数回の沈殿サイクルによって精製する。このとき、各沈殿工程間に、沈殿物を２０００×ｇで１０分間遠心分離し（Ａｌｌｅｇｒａ ２１Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）、最少量の脱イオン水に再溶解させ、遠心分離された粒子ケークを再溶解させる。これは、上記の条件下で溶液を遠心分離した後、上清み中に赤色または橙色の着色が見られなくなるまで繰り返す。最後に沈殿物を脱イオン水中に再溶解させたら凍結乾燥させ、精製ＴＲＩＴＣ−マンナン生成物を得る。
実施例６０−ＦＲＥＴ適用における修飾レクチン組成物の使用
この方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づいたグルコースセンサーとしての本発明の修飾Ｃｏｎ Ａ組成物の適用を示す。ＦＲＥＴは、２種類の異なるフルオロフォアが互いに近づくと、これにより、この２種類のフルオロフォア間でのエネルギー転移が可能になり、一方または両方のフルオロフォアの蛍光の減少（蛍光の消光と称される）がもたらされることに基づいている（Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ３４５：２０３−２１２、１９９７）。
糖質インヒビターの非存在下では、蛍光修飾Ｃｏｎ Ａと蛍光多糖の混合物は小さなゲルを形成し、近隣のフルオロフォアはＦＲＥＴを受ける。グルコースなどの糖質インヒビターの存在下では、蛍光修飾Ｃｏｎ Ａと蛍光多糖間の平均距離が増大し、ＦＲＥＴレベルの減少が引き起こされ、それにより、個々の蛍光シグナルの増大がもたらされる。
改善された安全性プロフィールのため、本発明の修飾Ｃｏｎ Ａ組成物は、非修飾Ｃｏｎ Ａが使用されたものよりも安全なインビボグルコースセンサーを提供し得る。
本開示の修飾Ｃｏｎ Ａを使用し、以下のインビトロ試験を行なう。ＦＩＴＣ標識修飾Ｃｏｎ Ａは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて作製され得る。次いで、精製ＦＩＴＣ−修飾Ｃｏｎ Ａを、実施例５９に従って合成されたＴＲＩＴＣ−マンナンと混合する。
３種類のストック溶液を以下のとおりに作製する。
（ｉ）ＦＩＴＣ−修飾Ｃｏｎ Ａ−６０ｍｇのＦＩＴＣ−修飾Ｃｏｎ Ａを、２ｍｌの１００ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解させる。
（ｉｉ）ＴＲＩＴＣ−マンナンストック−６０ｍｇのＴＲＩＴＣ−マンナンを、２ｍｌの１００ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解させる。
（ｉｉｉ）グルコースストック−１２００ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液を、１２００ｍｇのグルコースを１００ｍｌの１００ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解させることにより作製する。
次いで、ＦＩＴＣ修飾Ｃｏｎ ＡおよびＴＲＩＴＣ−マンナンのストック溶液の１：２の連続希釈を、１００ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２中で、それぞれ、ＦＩＴＣ−修飾Ｃｏｎ ＡおよびＴＲＩＴＣ−マンナンの終濃度が３０、３、０．３、０．０３、０．００３、０．０００３、０．００００３、および０．０００００３ｍｇ／ｍｌとなるように行なう。これらのストック溶液を、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ、ＮＪ）上で一緒に混合する。プレートは、全溶液を一緒に混合した後に全成分の終濃度が３倍減少するように設計する。
溶液を一緒に混合した後、プレートの蛍光を、蛍光プレートリーダー（ｆｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により、ＦＩＴＣでは４８５／５２５ｎｍフィルターペア、およびＴＲＩＴＣ蛍光の測定では５４４／５９０ｎｍフィルターペアを用いてアッセイする。
両方の組のフィルターペアでの測定後（１２００ｍｇ／ｄｌのグルコースバッファーを使用、室温）、プレートリーダーのインキュベータ機能を用いてプレートを３７Ｃまで加熱する。３０分間の平衡後、ＦＩＴＣとＴＲＩＴＣの両方の蛍光について、２回目のプレートの読み取りを行なう。その後、プレートを再度室温まで放冷する。
２、４、６および８列目にはすべて、さらに５０ｕｌの９６００ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液を加え、一方、１、３、５および７列にはすべて、さらに５０ｕｌのバッファーを加える。室温で３回目のプレートの読み取りを行ない、このプロセスを、最後に０．１Ｍ メチル−α−マンノピラノシドを用いて繰り返す。
このグルコースセンサーのさらなる最適化は、ポリマーの親和性を調整し、修飾Ｃｏｎ ＡとＴＲＩＴＣ−マンナンの蛍光負荷を最適化し、再度、実験を蛍光分光測光器で行ない、プレートリーダー／フィルターペアセットと比較して最大ＦＲＥＴまたはＦＲＥＴ消光が可能となるようにすることにより行なわれ得る。
実施例６１−粘度測定グルコースセンサー
この実施例では、修飾Ｃｏｎ Ａ組成物が、グルコース応答性溶液の粘度の変化に基づいてグルコースを検出することができる系において、どのようにして使用され得るかを示す。修飾Ｃｏｎ Ａ組成物を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む２０ｍＭのＢＥＳバッファー（ｐＨ７）に、１００ｍｇ Ｃｏｎ Ａ当量／ｍｌの濃度で溶解させる。別途、酵母マンナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、それぞれ０、１００、８００、１６００および３２００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含む２００ｍＭ ＢＥＳバッファー（ｐＨ７）の５種類の溶液に、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させる。０．７００ｍｌの修飾Ｃｏｎ Ａストック溶液を異なる濃度のグルコースを含む５種類の各マンナンストック溶液と、該５種類の溶液が０、５０、４００、８００および１６００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むことになるように混合する。
各溶液の粘度を、円錐平板型構造のマイクロビスコメータ機構を使用し、剪断速度として測定する。この円錐機構の寸法は直径が４ｃｍであり、２度の角度を有し、０．５８ｍｌの試料容量を必要とする。溶媒トラップを用いて、試料をエバポレーションして減量させる。各試料について、一連の剪断速度で、２２Ｃと３７Ｃの両方において定常状態の流動粘度が測定される。
この液体を体液と接触させると、測定される粘度は、その体液中のグルコース濃度と直接相関する。
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。

Claims (97)

  1. グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンと、
    コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートと
    を含む架橋物質体であって、
    該レクチンは、共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含み、該リガンドは、グルコースと、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関して競合し得、
    該２つ以上の親和性リガンドは、前記結合部位での該レクチンとの結合に関してグルコースと競合し、異なるコンジュゲート上の該レクチンと親和性リガンド間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、
    架橋物質体。
  2. 該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された薬物を含む、請求項１に記載の物質体。
  3. 該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された検出可能な標識を含む、請求項１に記載の物質体。
  4. 該レクチンが、レクチン１つあたり共有結合された親和性リガンドを１つだけ含む、請求項１に記載の物質体。
  5. 該レクチンが、グルコース結合部位１つあたり共有結合された親和性リガンドを１つ含む、請求項１に記載の物質体。
  6. 該レクチンが、カルネキシン、カルレチクリン、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、セレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、コレクチン（マンノース結合レクチン）、マンノース受容体、アグリカン、バーシカン、エンドウ凝集素（ＰＳＡ）、ソラマメレクチン、レンズマメレクチン、ダイズレクチン、ピーナッツレクチン、ヒゲレンリソウレクチン、イガマメレクチン、エンジュレクチン、ｂｏｗｒｉｎｇｉａ ｍｉｌｂｒａｅｄｉｉ由来レクチン、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、およびヤマゴボウマイトジェンからなる群より選択される、請求項１に記載の物質体。
  7. 該レクチンがＣｏｎ Ａレクチンである、請求項６に記載の物質体。
  8. 該レクチンが、ヒトマンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、ＣＬ−４３、およびコングルチニンからなる群より選択される、請求項１に記載の物質体。
  9. 該レクチンに共有結合された親和性リガンドが糖質を含む、請求項１に記載の物質体。
  10. 糖質がグルコースである、請求項９に記載の物質体。
  11. 糖質がマンノースである、請求項９に記載の物質体。
  12. 該レクチンに共有結合された親和性リガンドが糖質とリンカーを含み、該糖質が該リンカーに、芳香族炭素によって共有結合されている、請求項９に記載の物質体。
  13. アノマー炭素がαアノマーである、請求項１２に記載の物質体。
  14. 該親和性リガンドが該レクチンに、光励起性リンカーを用いて共有結合されたものである、請求項１２に記載の物質体。
  15. 光励起性リンカーが、アリール、プリン、ピリミジン、アルキルアジド、ジアゾ、ジアジリン、ベンゾフェノン、またはニトロベンゼン基を含むものである、請求項１４に記載の物質体。
  16. 光励起性リンカーがジアジリン基を含むものである、請求項１４に記載の物質体。
  17. 光励起性リンカーがアリールアジド基を含むものである、請求項１４に記載の物質体。
  18. 該親和性リガンドが該レクチンに、式：
    Figure 2012516338
     （式中：
    Ｒ３は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＮＯ２、およびハロゲンからなる群より選択され；
    ＸＬは共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の場合により置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位は、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ０２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられており；存在するＲ’は各々、独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分である）
    の光励起性リンカーを用いて共有結合されたものである、請求項１４に記載の物質体。
  19. −Ｎ３基がメタ位である、請求項１８に記載の物質体。
  20. −Ｎ３基がオルト位である、請求項１８に記載の物質体。
  21. −Ｎ３基パラ位である、請求項１８に記載の物質体。
  22. ＸＬの１〜５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている、請求項１８に記載の物質体。
  23. ＸＬがＣ１−１０炭化水素鎖で構築されている、請求項１８に記載の物質体。
  24. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている、請求項１８に記載の物質体。
  25. ＸＬの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている、請求項１８に記載の物質体。
  26. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）で置き換えられている、請求項１８に記載の物質体。
  27. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−で置き換えられている、請求項１８に記載の物質体。
  28. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている、請求項１８に記載の物質体。
  29. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項１８に記載の物質体。
  30. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項１８に記載の物質体。
  31. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項１８に記載の物質体。
  32. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項１８に記載の物質体。
  33. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項１８に記載の物質体。
  34. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項１８に記載の物質体。
  35. 該親和性リガンドが該レクチンに、式
    Figure 2012516338
     （式中：
    Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−ＣＦ３である）のものであり；
    ＸＬは共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ鋳）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ鋳）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられており；’
    存在するＲ’は各々、独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分である）
    の光励起性リンカーを用いて共有結合されたものである、請求項１４に記載の物質体。
  36. Ｒ４がＨである、請求項３５に記載の物質体。
  37. Ｒ４がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項３５に記載の物質体。
  38. Ｒ４がＣＦ３である、請求項３５に記載の物質体。
  39. ＸＬの１〜５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている、請求項３５に記載の物質体。
  40. ＸＬがＣ１−１０炭化水素鎖で構築されている、請求項３５に記載の物質体。
  41. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている、請求項３５に記載の物質体。
  42. ＸＬの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている、請求項３５に記載の物質体。
  43. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている、請求項３５に記載の物質体。
  44. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−で置き換えられている、請求項３５に記載の物質体。
  45. ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている、請求項３５に記載の物質体。
  46. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項３５に記載の物質体。
  47. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項３５に記載の物質体。
  48. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項３５に記載の物質体。
  49. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項３５に記載の物質体。
  50. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項３５に記載の物質体。
  51. ＸＬが
    Figure 2012516338
     である、請求項３５に記載の物質体。
  52. 該親和性リガンドが該レクチンに、光励起性でないリンカーを用いて共有結合されている、請求項１２に記載の物質体。
  53. 該親和性リガンドが該レクチンに、ｐＨまたは温度の変化によって活性化されるリンカーを用いて共有結合されている、請求項１２に記載の物質体。
  54. 該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質を含む、請求項１に記載の物質体。
  55. 該コンジュゲートの親和性リガンドが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースから選択される糖質を含む、請求項５４に記載の物質体。
  56. 該コンジュゲートの親和性リガンドがビマンノースまたはトリマンノースを含む、請求項５４に記載の物質体。
  57. 該コンジュゲートの親和性リガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項５４に記載の物質体。
  58. 該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質とリンカーを含み、該糖質が該リンカーに、芳香族炭素によって共有結合されている、請求項５４に記載の物質体。
  59. アノマー炭素がαアノマーである、請求項５８に記載の物質体。
  60. 薬物が抗糖尿病薬である、請求項２に記載の物質体。
  61. 薬物がインスリン分子である、請求項２に記載の物質体。
  62. 薬物がインスリン感受性改善薬である、請求項２に記載の物質体。
  63. 薬物がインスリン分泌促進薬（ｓｅｃｒｅｔａｔｏｇｕｅ）である、請求項２に記載の物質体。
  64. コンジュゲートの枠組構造がポリマー系である、請求項１に記載の物質体。
  65. コンジュゲートの枠組構造がポリマー系でない、請求項１に記載の物質体。
  66. コンジュゲートの枠組構造が分岐型または超分岐型である、請求項１に記載の物質体。
  67. コンジュゲートの枠組構造が多糖を含む、請求項１に記載の物質体。
  68. 該コンジュゲートが、一般式
    Figure 2012516338
     （式中、
    Ｒｘは、水素または任意選択で置換されているＣ１−６アルキルであり；
    Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２、３、４または５個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられており、式中、Ｒａは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
    存在するＸ１は各々、独立して、−ＯＲＣまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、式中、Ｒｃは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するＸ１の少なくとも２つは親和性リガンドを含むものとし；
    Ｙ１は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、式中、Ｒｅは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
    ｒは、５〜２５（両端を含む）の整数であり；
    Ｗ１は、薬物または検出可能な標識であり；
    Figure 2012516338
     は、共有結合性の単結合または二重結合に相当する）
    を有する、請求項１に記載の物質体。
  69. 該コンジュゲートが、一般式：
    （式中：
    ［（Ａ−Ｔ）］は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
    （Ａ−Ｔ）は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
    Ａ−Ｔは各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり；
    存在するＴは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
    存在するＲは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
    −Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
    存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
    存在するＬＢは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
    −Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
    存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
    存在するＬＤは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
    ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
    ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
    ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
    存在するｐは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
    存在するｎは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
    存在するｍは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
    存在するｖは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、存在する少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）
    を有する、請求項１に記載の物質体。
  70. ＸおよびＷがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が１０，０００Ｄａ未満である、請求項６８または６９に記載の物質体。
  71. ＸおよびＷがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が約３００〜約５，０００Ｄａの範囲である、請求項７０に記載の物質体。
  72. ＸおよびＷがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が約３００〜約８００Ｄａの範囲である、請求項７０に記載の物質体。
  73. 存在するＸの少なくとも２つが、糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項７０に記載の物質体。
  74. 存在するＸの少なくとも２つが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースからなる群より選択される糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項７０に記載の物質体。
  75. 存在するＸの少なくとも２つが、ビマンノースまたはトリマンノースを含む親和性リガンドを含む、請求項７０に記載の物質体。
  76. 存在するＸの少なくとも２つが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）およびアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）から選択される親和性リガンドを含む、請求項７０に記載の物質体。
  77. 存在するＸの少なくとも２つが、糖質とリンカーを含む親和性リガンドを含み、該糖質が該リンカーに、芳香族炭素によって共有結合されている、請求項７０に記載の物質体。
  78. アノマー炭素がαアノマーである、請求項７７に記載の物質体。
  79. １５０ｍＭのＮａＣｌを含み、グルコースを含まない３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に入れたとき不溶性である、請求項１に記載の物質体。
  80. 該コンジュゲートが該物質体から、グルコースの濃度に依存性の速度で、または標的分子の濃度に依存性の程度まで放出される、請求項７９に記載の物質体。
  81. ５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、実質的に不溶性のままである、請求項８０に記載の物質体。
  82. ５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、１０％未満の物質体が溶解する、請求項８０に記載の物質体。
  83. ５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、少なくとも５０％の物質体が溶解する、請求項８０に記載の物質体。
  84. ５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、１００％の物質体が溶解する、請求項８０に記載の物質体。
  85. 請求項１〜８４のいずれか１項に記載の物質体を患者に投与することを含む方法。
  86. 該物質体が皮下注射によって投与される、請求項８５に記載の方法。
  87. 該コンジュゲートが、該枠組構造に結合されたインスリン分子を含む、請求項８５に記載の方法。
  88. 患者が糖尿病である、請求項８７に記載の方法。
  89. 該物質体が、インスリン分子の平均日用量が１０〜２００Ｕの範囲となるように投与される、請求項８７に記載の方法。
  90. 該物質体が毎日投与される、請求項８９に記載の方法。
  91. 該物質体が毎月投与される、請求項８９に記載の方法。
  92. 該物質体が毎月投与される、請求項８９に記載の方法。
  93. 患者がインスリン感受性改善薬も受けている、請求項８９に記載の方法。
  94. 患者がインスリン分泌促進薬も受けている、請求項８９に記載の方法。
  95. （Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンであって、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関してグルコースと競合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含み、また、第１の標識を含む多価レクチンと、
    （ｂ）親和性リガンドおよび第２の標識を含むコンジュゲートと、
    を混合する工程
    ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす；
    （ＩＩ）試料を、該多価レクチンと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、
    （ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該レクチンと、該多価レクチンに対する親和性結合によって架橋物質体を形成して、測定可能な応答をもたらし、
    （ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該多価レクチン上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される；ならびに
    （ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
    を含む方法。
  96. （Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンであって、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関してグルコースと競合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含む多価レクチンと、
    （ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群と、
    （ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群と、
    を混合する工程、
    ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、
    （ＩＩ）試料を、該多価レクチンと第１の分子群および第２の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、
    （ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、第１の分子群および第２の分子群の構成員は、該多価レクチンに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、
    （ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第１および第２の分子と、該多価レクチン上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される；ならびに
    （ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
    を含む方法。
  97. （Ｉ）（ａ）複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、
    （ｂ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価レクチンであって、前記結合部位の少なくとも１つとの結合に関してグルコースと競合し得る共有結合された親和性リガンドを少なくとも１つ含む多価レクチン
    を準備する工程；
    （ＩＩ）該コンジュゲートと該レクチンを混合する工程、
    ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該レクチン間の結合によるものである；
    （ＩＩＩ）該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、
    これにより、該コンジュゲートが該レクチンから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる；ならびに
    （ＩＶ）生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程
    を含む方法。
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