CN1281466A - 人胰岛素衍生物的聚集体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有持久作用曲线的人胰岛素衍生物的水溶性聚集体。可溶性胰岛素衍生物作用的延长与一种新机理有关。该机理是基于部分或完全形成可溶性聚集体形式的衍生物,该聚集体形式的特征是在所定义的凝胶过滤系统中,其尺寸大于醛缩酶(Mw=158KDa)。

Description

人胰岛素衍生物的聚集体
发明领域
本发明涉及作用持久的、人胰岛素衍生物的水溶性聚集体，能形成这种聚集体的人胰岛素衍生物，含有它们的药物组合物，以及这种聚集体在治疗糖尿病中的用途。
发明背景
多尿症是对糖尿病和尿崩症患者中尿排泄过度病症的总称。糖尿病是一种代谢疾病，其中利用葡萄糖的能力或多或少地完全丧失了。总人口中约有2％患有多尿症。
自二十年代采用胰岛素以来，在改善糖尿病的治疗方面不断取得进步。为了帮助避免血糖水平过高，糖尿病患者经常要进行多次注射治疗，由此在每餐中给药胰岛素。许多糖尿病患者采用每天多次注射胰岛素的方案进行治疗，该方案包括每天注射一次或两次持久作用胰岛素，以补偿基本需要，同时补充以弹丸注射迅速作用的胰岛素，以补偿与进餐相关的需要。
持久作用型胰岛素组合物是本领域中公知的。因此，一种主要类型的持久作用型胰岛素组合物包含胰岛素结晶或无定形胰岛素的可注射含水悬液。在这些组合物中，所使用的胰岛素化合物一般是精蛋白胰岛素、锌胰岛素或精蛋白锌胰岛素。
当使人或动物胰岛素形成更高结合形式时，例如存在Zn2+离子时，将发生沉淀，得到结晶或无定形形式的产物(Brange，胰岛素的盖仑制剂，20-27页，Springer Verlag 1987)。因此，在pH7并使用猪胰岛素的6Zn2+/六聚物时，结果是几乎完全从溶液中沉淀出来(Grant，生物化学杂志126，433-440，1972)。推测最大的可溶性聚集体由4个六聚物单位组成，相当于分子量为约144kDa。Blundell等(糖尿病21(增刊2)，492-505，1972)描述了在pH7和Zn2+的存在下，猪胰岛素的可溶性单位是六聚体。早先在pH2下的超速离心研究显示，胰岛素二聚物，Mw12kDa，是占优势的物质(Jeffrey，自然197，1104-1105，1963；Jeffrey，生物化学5，489-498，1966；Jeffrey，生物化学5，3820-3824，1966)。Fredericq在pH8下使用相对胰岛素为0.4-0.8％(w/w)的Zn2+进行操作，他报道了相当于十二聚体结构的分子量72kDa，并且使用1％的Zn，得到约200-300kDa的分子量(生物化学与生物物理学文献65，218-228，1956)。Blundell等(蛋白质化学进展26，297-330，1972)全面回顾了动物胰岛素的结合状态。
使用胰岛素悬液有某些缺点。因此，为了获得精确的定量，在从小瓶中抽出或从药筒中压出确定体积的悬液之前，必须通过轻微振摇使胰岛素颗粒均匀悬浮。而且，为了避免结块或凝结，胰岛素悬液在储存时，温度必须保持在比胰岛素溶液更窄的范围内。
尽管早先人们认为精蛋白无免疫原性，但现今的研究结果表明，精蛋白在人体中可能是有免疫原性的，它们用于医疗目的时，可能会导致抗体形成(Samuel等，利用微补体固定试验进行的有关精蛋白在人体和实验动物体内的免疫原性研究。临床与实验免疫学33，252-260页(1978))。
另外，还有证据表明，精蛋白-胰岛素复合物自身是免疫原性的(Kurtz等，用精蛋白-胰岛素治疗的患者体内针对精蛋白的循环IgG抗体。糖尿病学25，322-324页(1983))。因此，对于某些患者来说，必须避免使用含有精蛋白的持久作用型胰岛素组合物。
另一种类型的持久作用型胰岛素组合物是pH值低于生理pH值的溶液，由于溶液注射时pH值升高，胰岛素将从中沉淀出来。其缺点是，胰岛素固体颗粒充当了局部刺激物，从而在注射部位引起组织炎症。
WO91/12817(Novo NordiskA/S)公开了包含钴(Ⅲ)胰岛素络合物的可溶性持久作用型胰岛素组合物。这些络合物的持久作用仅是中等水平，且生物可利用率降低了。
在例如WO95/07931(Novo NordiskA/S)、WO96/00107(NovoNordiskA/S)和WO97/31022(Novo NordiskA/S)中公开了含有与B26-B30任何位置上的赖氨酸残基中的ε-氨基连接的亲脂取代基的可溶性胰岛素衍生物。与可溶性人胰岛素相比，这些衍生物经皮下注射后具有持久作用，并且这种持久作用已由与皮下组织、血液和外周组织中白蛋白的可逆结合得到解释(Markussen，糖尿病学39，281-288，1996；Kurzhals，生物化学杂志312，725-731，1995；Kurzhals，药物科学杂志85，304-308，1996；和Whittingham，生物化学36，2826-2831，1997)。
然而，现在我们已发现了使某些可溶性胰岛素衍生物作用延长的一种新机理。该新机理是基于部分或完全形成可溶性聚集体形式的衍生物，所述聚集体形式的特征是在确定的凝胶过滤系统中，其尺寸大于醛缩酶(Mw=158KDa)。
附图的简要描述
图1．在使用SephacrylS-300HR柱的凝胶过滤系统中，KAV值相对于分子量的校正曲线，其中用包含125mM氯化钠和pH7.4的20mM磷酸钠的中性含水洗脱剂洗脱。很显然，KAV与分子量的对数之间存在近似线性关系。标准显示在表1中。
图2．分别具有0、2和3 Zn2+/六聚物的LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰岛素的凝胶过滤，其中使用SephacrylS-300HR柱，用包含125mM氯化钠和pH7.4的20mM磷酸钠的中性含水洗脱剂洗脱，结果证明了Zn2+对衍生物聚集体形成的重要性。28×1cm柱以15ml/h的速率洗脱。胰岛素衍生物作为包含600μM衍生物，0、2或3Zn2+/6个胰岛素分子、20mM NaCl、16mM苯酚、16mM间甲苯酚、pH7.5的7mM磷酸钠的标准制剂注射(200l)。
图3．具有3 Zn2+/六聚物的LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰岛素的凝胶过滤，其中使用SephacrylS-300HR柱，用包含pH7.5的5mM磷酸钠缓冲液、10mM氯化钠、16mM苯酚、16mM间甲苯酚和1.6％(w/w)甘油的中性含水洗脱剂洗脱。与图2的对比说明了氯化钠的浓度对衍生物聚集体形成的重要性。
图4．缀合配体的合成方案。
对本发明的描述
本文中使用的词语“胰岛素衍生物”(以及相关词语)是指其中至少有一个有机取代基连接到一个或多个氨基酸上的人胰岛素或其类似物。
本文中使用的“人胰岛素类似物”(以及相关词语)的意思是指其中一个或多个氨基酸已被删除和/或被其他氨基酸(包括非可编码(non-codeable)氨基酸)替换的人胰岛素，或包含附加氨基酸，即51个氨基酸以上的人胰岛素。
本发明是基于一种新的聚集和可溶形式的胰岛素衍生物的发现。该新的、可溶性聚集形式的胰岛素衍生物经皮下注射后缓慢离解，这使得它们适合用于长时间作用的胰岛素制剂，优点是该制剂不含沉淀。作为可溶制剂而不是悬浮制剂的优点在于：可以更精确地给药；可避免振摇小瓶或笔状管；允许使用更细的针头，也就意味着注射过程中疼痛更小；更容易灌注小瓶或药筒；以及可避免在药筒中装入小球以便在没有空气时悬浮沉淀。
更具体地说，本发明涉及一种胰岛素衍生物的水溶性聚集体，其特征在于它具有比醛缩酶更大的尺寸，优选大于铁蛋白，该尺寸是用本文中规定的凝胶过滤系统测定的。
本发明的聚集体优选具有利用SephacrylS-300HR凝胶通过凝胶过滤法测得相当于KAV值小于0.32、优选小于0.20的表观容积，或者具有利用Superose6HR凝胶通过凝胶过滤法测得相当于KAV值小于0.50、优选小于0.40的表观容积。
该聚集体优选在pH6.8-8.5范围内是可溶的。
在已知大多数胰岛素存在六聚物单位的条件下，可以观察到胰岛素衍生物的新的聚集体形式。因此，在一个优选的实施方案中，该聚集体形式由六聚物亚单位组成，优选有至少4个、更优选5-50个、更优选5-200个六聚物亚单位。本发明聚集体形式的任何六聚物亚单位可以具有任何已知的R6、R3T3或T6结构(Kaarsholm，生物化学28，4427-4435，1989)。
我们还发现，象Zn2+和酚类化合物这样的已知能使六聚物单位稳定的物质也可使一些胰岛素衍生物的新的聚集体形式稳定。形成聚集体的构件可以是从胰岛素的X射线结晶测定结构得知的六聚物单位(Blundell，糖尿病2l(增刊2)，492-505，1972)。象Zn2+这样的已知能以2或4 Zn2+/六聚物络合物(Blundell，糖尿病21(增刊2)，492-505，1972)的形式稳定六聚物单位的离子是有些衍生物聚集体形成所必需的，比如LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰岛素。图2显示了LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰岛素的分别含有0、2和3 Zn2+/六聚物的制剂在本文所述的系统中的凝胶过滤。不存在Zn2+时，没有形成聚集体，洗脱位置指示存在单体和二聚物。因此，本发明的聚集体中优选每6个胰岛素衍生物分子包含至少2个锌离子，更优选包含2-5个锌离子，更优选包含2-3个锌离子。另外，该聚集体中每6个胰岛素衍生物分子包含至少3个酚类化合物分子比较有利。在2 Zn2+/六聚物结构的中心腔中，6个GluB13残基提供了与多达3个Ca2+离子结合的结合部位(Sudmeier等，科学212，560-562，1981)。因此，加入Ca2+离子稳定了该六聚物并可加入到药物制剂中，条件是胰岛素衍生物保持在溶液中。
本发明的聚集体皮下注射到人体中后的消失半衰期(disappearhalf-time)优选与人胰岛素NPH制剂的一样长或比它更长。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，聚集体由具有结合白蛋白的胰岛素衍生物组成，其结合白蛋白数比LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30)人胰岛素的低。
本发明中将采用的优选的胰岛素衍生物一级结构是：
a)胰岛素衍生物B链上的残基B24-B30为序列Phe-X-X-X-X-X-X，其中每个X独立地代表任何可编码的氨基酸或缺失；
b)胰岛素衍生物B链上的残基B25-B30为序列Phe-X-X-X-X-X，其中每个X独立地代表任何可编码的氨基酸或缺失；
c)胰岛素衍生物B链上的残基B26-B30为序列Tyr-X-X-X-X，其中每个X独立地代表任何可编码的氨基酸或缺失；
d)胰岛素衍生物B链上的残基B27-B30为序列Thr-X-X-X，其中每个X独立地代表任何可编码的氨基酸或缺失；
e)胰岛素衍生物B链上的残基B28-B30为序列Pro-X-X，其中每个X独立地代表任何可编码的氨基酸或缺失；或者
f)胰岛素衍生物B链上的残基B29-B30为序列Lys-X，其中X代表任何可编码的氨基酸或缺失；
条件是通过例如游离脂肪细胞测定或通过对胰岛素受体的亲和评定，该胰岛素衍生物显示出至少5％的效能。
本发明聚集体的胰岛素衍生物的赖氨酸残基上的取代基优选为含有6-40个碳原子的亲脂基。更优选是具有6-40个碳原子、优选具有12-36个碳原子的酰基取代基。
最优选的酰基形式的亲脂取代基如下：CH3-(CH2)n-CO-，(COOH)-(CH2)n-CO-，(NH2-CO)-(CH2)n-CO-，HO-(CH2)n-CO-，其中4≤n≤38。
在另一个优选的实施方案中，亲脂取代基是5-α石胆酸或5-β石胆酸。
在另一个优选的实施方案中，亲脂取代基是胆酸、猪胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、猪脱氧胆酸或胆烷酸的5-α或5-B异构体。
在另一个优选的实施方案中，亲脂取代基是梭链孢酸、梭链孢酸衍生物或甘草亭酸。
在又一个优选的实施方案中，亲脂取代基利用氨基酸接头与赖氨酸残基相连。根据该实施方案，亲脂取代基有利地经γ-或α-谷氨酰基接头、或经β-或α-天冬氨酰基接头、或经α-酰氨基-γ-谷氨酰基接头、或经α-酰氨基-β-天冬氨酰基接头与赖氨酸残基相连。
本发明还提供了能形成聚集体的新型胰岛素衍生物。这些胰岛素衍生物可以以聚集体的形式加入药物制剂中，另一方面，它们也可以以非聚集体形式加入药物制剂中，在这种情形中，经皮下注射所述制剂后形成聚集体。
因此，本发明还涉及包含胰岛素衍生物聚集体或经皮下注射后形成聚集体的非聚集型胰岛素衍生物的药物制剂。
优选地，本发明的药物制剂包含聚集体，其主要部分(优选75％以上)具有比醛缩酶更大的尺寸，该尺寸是利用该制剂的介质作为洗脱剂通过凝胶过滤确定的。
在另一个实施方案中，提供了包含能聚集和能迅速作用的胰岛素类似物的药物制剂，所述迅速作用的胰岛素类似物优选是人胰岛素或下列胰岛素类似物之一：AspB28人胰岛素，LysB28ProB29人胰岛素或des(B30)人胰岛素。这样的制剂将提供迅速开始的作用以及长时间的作用。
在该实施方案中，药物制剂优选包含摩尔比为90∶10-10∶90的聚集型胰岛素和迅速作用型胰岛素。
通过加入能提高药物制剂粘度的生理学上可接受的试剂，可以进一步减慢聚集型胰岛素在体内的缓慢离解。因此，本发明的药物制剂还可包含能提高粘度的试剂，优选聚乙二醇、聚丙二醇、其共聚物、葡聚糖和/或聚交酯。
药物制剂优选进一步包含缓冲物质，诸如TRIS、磷酸盐、甘氨酸或双甘氨肽(或其它两性离子物质)缓冲液；等渗剂，诸如NaCl、甘油、甘露糖醇和/或乳糖；和作为防腐剂的苯酚和/或间甲苯酚。在药物制剂的辅助物质中，用作等渗剂的氯化钠和用于防腐的苯酚是特别重要的，因为它们能促进制剂的聚集，并由此有效地延长从注射部位消失的时间。本发明的药物制剂优选包含浓度为10-150mM的Na+离子。
最优选的药物制剂是含有0.1-2mM的本发明胰岛素衍生物、0.3-0.9％Zn(w/w相对于胰岛素衍生物)、总浓度为5-50mM的酚化合物如苯酚或间甲苯酚或其混合物、以及浓度为10-150mM Na+离子的制剂。
本发明还涉及治疗糖尿病的方法，该方法包含给予需要这种治疗的患者有效量的本发明胰岛素衍生物的水溶性聚集体，或有效量的能在皮下注射后形成水溶性聚集体的本发明胰岛素衍生物。
本发明的胰岛素衍生物可以用WO95/07931(Novo Nordisk A/S)，WO96/00107(Novo Nordisk A/S)，WO97/31022(Novo Nordisk A/S)，PCT申请No.DK97/00296(Novo Nordisk A/S)，EP 511 600(Kurakay有限公司)和EP712 862(Eli lilly)中公开的通用方法制备。表2中所列的衍生物已用下述方法制得：将des(B30)人胰岛素的LysB29的ε-氨基用活化为相应N-羟基琥珀酰亚胺酯形式的配体选择性酰化。该缀合配体可以利用常规肽化学法制备(图4)。
在上述专利申请以及Markussen，糖尿病学39，281-288，1996；Kurzhals，生物化学杂志312，725-731，1995；Kurzhals，药物科学杂志85，304-308，1996；和Whittingham，生物化学36，2826-2831，1997中列出的一些因白蛋白结合机理而具有持久作用的衍生物，确实也具有按照本发明形成高分子量可溶性聚集体的能力。WO95/07931的LysB29(Nε石胆酰-γ-Glu-)des(B30)人胰岛素，和WO97/31022的LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基-)des(B30)人胰岛素，是能在中性pH下形成高分子量可溶性聚集体的胰岛素衍生物的例子。关于它们诱导聚集体形成的能力，在亲脂取代基之间有选择性。因此，两个异构体-LysB29(Nε石胆酰-γ-Glu-)des(B30)人胰岛素和LysB29(Nε石胆酰-α-Glu-)des(B30)人胰岛素中，只有第一种在所用制剂中形成聚集体，参见表1。
聚集体形成的测定
使用对球状蛋白具有1500kDa排阻极限、对线性葡聚糖具有400kDa排阻极限的凝胶，通过凝胶过滤法证明聚集形式。在该凝胶过滤中使用pH中性含水缓冲液系统，将聚集态的胰岛素衍生物以药物制剂的形式、600nmol胰岛素/ml的浓度加到柱上。胰岛素衍生物的聚集态在分子量为158kDa的醛缩酶之前洗脱。
用此部分中描述的条件进行的凝胶过滤实验是直接的物理化学方法，用来显示胰岛素衍生物的潜在聚集体形成性能。除了各种生物学因素外，在猪体内皮下注射后的消失还反映了白蛋白结合和胰岛素衍生物的聚合体形成性能的联合作用。
使用SephacrylS-300HR柱，通过凝胶过滤，证明高分子量可溶性聚集体的形成，其中用包含125mM氯化钠和pH7.4的20mM磷酸钠的中性含水洗脱剂洗脱。选择该缓冲液系统来模仿组织的离子强度和pH，为的是能够在与皮下注射后类似的条件下检测聚集的衍生物。显然，在具有更低浓度的氯化钠或者更低或更高pH值的其它缓冲液系统中，衍生物可能不以聚集态出现。但是，当欲评定药物制剂中的实际聚集状态时，用该制剂的介质(除了与胰岛素结合的Zn2+)作为凝胶过滤的洗脱剂。
28×1cm柱以15ml/h的速率洗脱。胰岛素衍生物作为包含600μM衍生物、200或300μM Zn2+、20mM NaCl(或不同的)、16mM苯酚、16mM间甲苯酚、pH7.5的7mM磷酸钠的标准制剂注射(200μl)。
SephacrylS-300HR的排阻极限由制造商Pharmacia作了说明，对球状蛋白，为1500kDa分子量，对线性葡聚糖，为400kDa。在实践中，不同大小溶质的洗脱的特点在于有效容积，表达为KAV值：KAV=(VE-VO)/(VT-VO)其中VE是洗脱容积，VO是空隙容积，例如蓝葡聚糖的洗脱容积，VT是总容积。因此，KAV值与柱尺寸无关。在该系统中，醛缩酶(Mw158kDa)在KAV约0.32处洗脱，白蛋白(Mw67kDa)在KAV约0.38处洗脱，胰岛素单体形式(Mw6kDa)的KAV值为约0.71。使用一系列分子量标准物对柱进行校正，结果显示KAV与分子量的对数之间有近似线性关系，参见图1。表1．
大于醛缩酶(Mw158kDa)的结合性胰岛素衍生物，小于醛缩酶的非结合性胰岛素衍生物和用作分子大小标记的标准物的KAV值、白蛋白结合常数和消失半衰期。在猪体内的白蛋白结合常数和消失半衰期已利用LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30)人胰岛素作为参照化合物进行了标准化。NPH胰岛素在猪体内的消失T50％已测量为10.5小时(Markussen等，1996年)。化合物                                 KAV      白蛋白结合         消失
                                              Kass，(mol/l)-1   T50％，小时形成大于醛缩酶的聚集体的人胰岛素结合衍生物**LysB29(Nε-石胆酰基-y-Glu)des(B30)    0.04*       0.3×105            22.8LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)  0.05        25×105             18.7LysB29(Nεω-羧基十九烷酰基)des(B30)  0.04        36×105             21.9LysB29(Nε胆甾烯基氧基羰基)           0.00形成小于醛缩酶的聚集体的人胰岛素非结合性衍生物**人胰岛素***                            0.61           0                 (2)人胰岛素(无锌)                         0.72LysB29(Nε石胆酰基)(无锌)             0.74LysB29(Nε癸酰基)***                  0.67        0.06×105          5.1LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30)         0.51        1.0×105           14.3LysB29(Nε石胆酰基-α-Glu-)des(B30)   0.53        0.3×105           11.8标准物****B9Asp，B27Glu人胰岛素(单体，Mw 6kDa)   0.71           0                 (1)核糖核酸酶(Mw13.7kDa)                  0.63白蛋白(Mw67kDa)                        0.38醛缩酶(Mw158kDa)                       0.32过氧化氢酶(Mw232kDa)                   0.30铁蛋白(Mw440kDa)                       0.19甲状腺球蛋白(Mw669kDa)                 0.08*75％衍生物洗脱在主峰中，25％洗脱在单体或二聚物位置处。**作为包含600μM衍生物、200μM Zn2+、0-20mM氯化钠、7mM磷酸钠、16mM苯酚、16mM间甲苯酚、1.6％甘油和pH7.5的药物制剂以200μl样品上样。***与**相同，但Zn2+为300μM。****标准物溶解于水中使用。
能形成可溶性高分子量聚集体并主要基于该性能而具有持久作用的胰岛素衍生物的实例是LysB29(Nε石胆酰基-γ-Glu)des(B30)人胰岛素，参见表1。值得一提的是，这类化合物的消失半衰期与白蛋白结合常数之间的比值高。不能形成可溶性高分子量聚集体但基于白蛋白结合性能而具有持久作用的胰岛素衍生物的实例是LysB29(Nε石胆酰基-α-Glu-)des(B30)人胰岛素和LysB29(Nε十四烷酰基)des(B30)人胰岛素，参见表1。值得一提的是，这类化合物的消失半衰期/白蛋白结合常数比值低。
 在WO97/31022中，已将LysB29(Nεω-羧基十七烷酰基)des(B30)人胰岛素配制成包含600nmol/ml衍生物、pH7.5的5mM磷酸钠缓冲液、10mM氯化钠、16mM苯酚、16mM间甲苯酚、2-3 Zn2+/六聚物和1.6％(w/v)甘油的药物制剂。为了确定该制剂中的聚集程度，利用与上文中所述相同的柱进行凝胶过滤，但是使用该制剂的介质作为洗脱剂。Zn2+大部分是胰岛素结合型，因此不被认为是介质的组分。由于洗脱剂含有酚类物质，因此用HPLC监测各级分中衍生物的浓度，参见图3。KAV值约为0.45，指示六聚物或十二聚物单位是该制剂中的主要种类，即，在该公开的制剂中不存在胰岛素衍生物的高分子量聚集体。
现已开发了另一种能测量胰岛素衍生物形成可溶性高分子量聚集体能力的、适于HPLC设备的方法。柱的大小、注入容积和流速与第一种方法相当，然而温度升高至37℃，且磷酸盐缓冲液变为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和另外的氯化钠。象在第一种方法中一样，聚集态胰岛素定义为在凝胶过滤标准物醛缩酶之前洗脱。
表2中显示了两种锌浓度的KAV值。与参照物LysB29(Nε十四烷酰基-)des(B30)胰岛素相比，从皮下注射部位消失的时间长与该胰岛素衍生物易形成大聚集体的趋势有关。
表2．用凝胶过滤法2测量的胰岛素衍生物的聚集体形成。
    化合物 KAV(Superose 6HR)2) 白蛋白结合 在猪体内消失1)
2Zn2+/6ins  3Zn2+/6ins     Kass,(105M-1)     T50％,(h)
LysB29(Nε-石胆酰基-γ-Glu-)des(B30)HI     0.00     -0.01     0.33     22.8
LysB29(Nε-脱氧胆酰基-γ-Glu-)des(B30)HI     0.20     0.07     0.03     13.9
LysB29(Nε-石胆酰基-α-酰氨基-γ-Glu-)des(B30)HI     -0.02     0.00     0.23     ＞34
LysB29(Nε-石胆酰基-β-Asp-)des(B30)HI     0.18     0.11     n.d.     n.d.
LysB29(Nε-石胆酰基-β-Ala-)des(B30)HI     0.00     0.13     n.d.     n.d.
LysB29(Nε-石胆酰基-γ-氨基丁酰基-)des(B30)HI     0.06     0.00     n.d.     n.d.
LysB29(Nε-石胆酰基-)des(B30)HI     -0.01     0.23     0.38     ＞34
LysB29(Nε-脱氢石胆酰基-)des(B30)HI     0.05     0.03     0.26     ＞34
LysB29(Nε-胆烷酰基-)des(B30)HI     0.40     0.17     0.48     20.1
LysB29(Nε-十六烷酰基-α-酰氨基-γ-Glu-)des(B30)HI     0.38     0.41     0.56     15.3
AspA21LysB29(Nε-十四烷酰基-)des(B30)HI     0.55     0.46     0.97     16.4
LysB29(Nε-十四烷酰基-)des(B30)HI     0.58     0.56     1.00     14.3
人胰岛素，(HI)     0.64     0.64     -     2
标准物：
AspB9GluB27HI(单体，Mw6kDa)     0.73
核糖核酸酶(Nw13.7kDa)     0.72
卵白蛋白(Mw43kDa)     0.58
醛缩酶(Mw158kDa)     0.50
铁蛋白(Mw440kDa)     0.40
甲状腺球蛋白(Mw669kDa)     0.28
1)对LysB29(Nε十四烷酰基-)des(B30)人胰岛素标准化(T50％=14.3h)2)Superose 6HR10/30(Pharmacia Biotech)在37℃下用氯化钠140mM、三羟甲基氨基甲烷10mM、叠氮化钠0.02％(用盐酸调至pH7.4)洗脱。跑90分钟(0.25ml/min.)后，洗涤150分钟(0.5ml/min.)。注入容积为200μl。

Claims (44)

1、一种胰岛素衍生物的水溶性聚集体，其特征在于：用上述指定的凝胶过滤系统测定，它具有比醛缩酶更大的尺寸。
2、权利要求1所述的聚集体，其特征在于：用上述指定的凝胶过滤系统测定，它具有比铁蛋白更大的尺寸。
3、如权利要求1所述的聚集体，其特征在于：用SephacrylS-300HR凝胶经凝胶过滤测定，它具有相当于KAV值小于0.32、优选小于0.20的表观容积。
4、如权利要求1所述的聚集体，其特征在于：用Superose6HR凝胶经凝胶过滤测定，它具有相当于KAV值小于0.50、优选小于0.40的表观容积。
5、如权利要求1-4任一项所述的聚集体，其特征在于它在pH6.8-8.5范围内是可溶的。
6、如权利要求1-5任一项所述的聚集体，它基本上由胰岛素衍生物的六聚亚单位组成。
7、如权利要求6所述的聚集体，它由至少4个、优选5-50个、更优选5-200个聚集的六聚亚单位组成。
8、如权利要求1-7任一项所述的聚集体，其中每6个胰岛素衍生物分子包含至少2个锌离子，优选包含2-5个锌离子，更优选包含2-3个锌离子。
9、如权利要求1-8任一项所述的聚集体，其中每6个胰岛素衍生物分子包含至少3个酚类化合物分子。
10、如权利要求1-9任一项所述的聚集体，它在皮下注射到人体中后的消失半衰期与人胰岛素NPH制剂的一样长或更长。
11、如权利要求1-10任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物具有比LysB29(Nε-十四烷酰基)des(B30)人胰岛素更低的白蛋白结合性。
12、如权利要求1-11任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物B链上的残基B24-B30为序列Phe-X-X-X-X-X-X，其中每个X独立地代表任何氨基酸或缺失，至少一个X是Nε-取代的赖氨酸残基。
13、如权利要求1-12任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物B链上的残基B25-B30为序列Phe-X-X-X-X-X，其中每个X独立地代表任何氨基酸或缺失，至少一个X是Nε-取代的赖氨酸残基。
14、如权利要求1-13任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物B链上的残基B26-B30为序列Tyr-X-X-X-X，其中每个X独立地代表任何氨基酸或缺失，至少一个X是Nε-取代的赖氨酸残基。
15、如权利要求1-14任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物B链上的残基B27-B30为序列Thr-X-X-X，其中每个X独立地代表任何氨基酸或缺失，至少一个X是Nε-取代的赖氨酸残基。
16、如权利要求1-15任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物B链上的残基B28-B30为序列Pro-X-X，其中每个X独立地代表任何氨基酸或缺失，至少一个X是Nε-取代的赖氨酸残基。
17、如权利要求1-16任一项所述的聚集体，其中胰岛素衍生物B链上的残基B29-B30为序列Lys-X，其中X代表任何氨基酸或缺失。
18、如权利要求12-17任一项所述的聚集体，其中赖氨酸残基上的取代基是含有6-40个碳原子的亲脂基。
19、如权利要求18所述的聚集体，其中取代基是具有6-40个碳原子、优选具有12-36个碳原子的酰基。
20、如权利要求19所述的聚集体，其中酰基是CH3-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
21、如权利要求19所述的聚集体，其中酰基是(COOH)-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
22、如权利要求19所述的聚集体，其中酰基是(NH2-CO)-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
23、如权利要求19所述的聚集体，其中酰基是HO-(CH2)n-CO-，且4≤n≤38。
24、如权利要求19所述的聚集体，其中亲脂取代基是5-α石胆酸或5-β石胆酸。
25、如权利要求19所述的聚集体，其中亲脂取代基是胆酸、猪胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、猪脱氧胆酸或胆烷酸的5-α或5-β异构体。
26、如权利要求19所述的聚集体，其中亲脂取代基是脱氢石胆酸的5-α或5-β异构体。
27、如权利要求19所述的聚集体，其中亲脂取代基是梭链孢酸、梭链孢酸衍生物或甘草亭酸。
28、如权利要求19-27所述的聚集体，其中酰基利用氨基酸接头与赖氨酸残基相连。
29、如权利要求28所述的聚集体，其中氨基酸接头是α-谷氨酰基或γ-谷氨酰基结合的或者β-或α-天冬氨酰基结合的。
30、如权利要求28所述的聚集体，其中氨基酸接头是γ-氨基丁酰基、β-丙氨酰基、α-酰氨基-γ-谷氨酰基、或α-酰氨基-β-天冬氨酰基结合的。
31、一种新的能形成上述权利要求任一项所述聚集体的胰岛素衍生物。
32、一种药物制剂，它包含如权利要求1-30任一项所述的胰岛素衍生物的聚集体。
33、如权利要求32所述的药物制剂，它包含权利要求1-30任一项所述的聚集体，其主要部分，优选75％以上，具有比醛缩酶更大的尺寸，该尺寸是利用该制剂的介质作为洗脱剂通过凝胶过滤确定的。
34、一种包含聚集型胰岛素衍生物和迅速作用型胰岛素类似物的药物制剂，其中后者优选是人胰岛素或AspB28人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素或des(B30)人胰岛素。
35、如权利要求34所述的药物制剂，其中聚集型胰岛素与迅速作用型胰岛素的摩尔比为90∶10-10∶90。
36、如权利要求32-35任一项所述的药物制剂，它包含能提高粘度的试剂，优选聚乙二醇、聚丙二醇、其共聚物、葡聚糖和/或聚交酯。
37、如权利要求32-36任一项所述的药物制剂，它包含一种缓冲物质，优选TRIS、磷酸盐或甘氨酸缓冲液。
38、如权利要求32-37任一项所述的药物制剂，它包含一种两性离子缓冲物质，优选双甘氨肽。
39、如权利要求32-38任一项所述的药物制剂，它包含等渗剂，优选NaCl、甘油、甘露糖醇和/或乳糖。
40、如权利要求32-39任一项所述的药物制剂，它包含浓度为10-150mM的Na+离子。
41、如权利要求32-40任一项所述的药物制剂，它包含作为防腐剂的苯酚和/或间甲苯酚。
42、一种药物制剂，它含有0.1-2mM权利要求31所述的胰岛素衍生物、0.3-0.9％Zn(w/w，相对于胰岛素衍生物)、总浓度为5-50mM的酚类化合物如苯酚或间甲苯酚或其混合物、以及浓度为10-150mM的Na+离子。
43、一种治疗糖尿病的方法，包括给予需要这种治疗的人有效量的如权利要求1-30任一项所述的胰岛素衍生物的水溶性聚集体。
44、一种治疗糖尿病的方法，包括给予需要这种治疗的人有效量的、能在皮下注射后形成水溶性聚集体的权利要求31所述胰岛素衍生物。
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