JPH06511471A - インスリンの燐酸化の方法およびそれによって製造された物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

薬剤の治療指数は致死量と効果的な投与量の比で規定される。インスリンに関し てはこの比が極めて低い（Ｂｒａｎｇｅ、Ｙ、　インスリンの本草医学、スブリ ンガーーベルラーグ、ニューヨーク、１９８７）。この理由によりインスリンは 危険な薬剤である。過剰な投与による臨床的結果は昏睡か死である。苛立たしい この過敏な臨床像はインスリンの皮下吸収の割合と持続時間の実質的な日々の変 化である（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌ、Ｊｏ等、臨床薬理学の教本、Ｈａｓｓ ｅｌｂｌａｔｔ　Ａ、（！ｉ）、ＸＸＸＩＩ／２，１９７５．スプリンガーーベ ルラーグ、ニューヨーク）。これは臨床現場において通常観察される血糖の大き な変化の主な原因である。日々のインスリン吸収に影響する多くの要素が研究さ れてきている（Ｂｉｎｄｅｒ、Ｃ，、Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉ ｃｏｌ　（Ｃｏｐｎｈ）（別冊２）２７：　１−８７．１９６９．；Ｂｉｎｄｅ ｒ。 Ｃ９等、５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９：１５６−６ ３．１９６７　；Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｏ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ　５ニア ７−９１．１９８２；５ｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌ、Ｊ、等、Ａｃｔａ　Ｐａｅ ｄｉａｔｒ　５ｃａｎ　（別冊）２７０：９７−１０２．１９７７）、低い治療 指数と避けかたり用々の投与量の変化の複合結果のため、インスリン治療は控え めに実施されなければならない。 控えめなインスリン治療では血糖を通常の範囲に管理することはほとんど不可能 に近い。その結果、インスリン依存糖尿患者の糖と他の代謝物質の管理は普通通 常値から遠いものとなる。科学的結果大部分が、この乏しい糖管理は全てでは無 いにしても大部分この病気の衰弱と潜在的に致命的であることの複合化に起因し ていることを示している。手始めに、インスリン依存患者の平均生存期待年数は 、インスリンが発見された７１年前のように、３５年に留まっている。吸収率の 日々の変動が血糖へのより少ない影響をもつインスリンの生産と使用は糖尿薬の 処置と管理に大きな利益となるだろう。 ある種の燐酸化インスリンの使用はより優れた血糖管理と、少なくとも部分的に 、燐酸化インスリンの皮下吸収における与えられた％変化のために、現在用いる ことができるインスリンより顕著に低い血糖変化をもたらす。 インスリンは以前には燐酸を用いる方法によって燐酸化されていた（Ｆ　ｅ　ｒ 　ｒｅｌＲ，Ｅ、等、Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅ ｍｉｅａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、７０．２１０７−７．１９４８）、あるいはカッ プリング剤を用いた非水系有機溶媒中で燐酸とＰＯＣｌ、を用いる方法によって 燐酸化されていた（Ｃｅｒａｍｉ　Ａ、等、米国特許番号４，５３４，８９４お よび４，７０５，８４５）あるいは燐酸アミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｃｌａ ｔｅ）を用いる方法によって燐酸化されていた（Ｒａｔｈｌｅｖ、ＶとＲｏｓｅ ｎｂｅｒｇ　Ｔ、、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ ｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、６５．３１９−３３９．１９５６）ｏＦｅｒｒｅｌ等 やＲａｔｈｌｅｖとＲｏｓｅｎｂｅｒｇによって作られた燐酸化インスリンは燐 酸化の過程をより深く理解するために、特に燐酸化がどのように生材学系と関係 しているかという知識を増加するために計画された研究の一部である。この燐酸 化インスリンの臨床的優位性は何ら述べられていない。 Ｃｅｒａｍｉ等に許可された特許は、インスリン搬送システム中に保存された場 合、重合しないという優位性を持つ硫酸化および燐酸化インスリンの生産を含む 。このようにこれらのインスリンはＣｅｒａｍｉ等によって述べられているよう にインスリンポンプを詰まらせないという優位性をもつ、そしてインスリンポン プを用いている患者が少ないため、これらインスリンは血糖のより良い管理をも たらすべきである。しかしながら、前記インスリンは議論すべき血糖のより良き 管理をもたらす生理特性について何も示していない。それ故この効果に合わせて 作られるべきフレイムは存在しない。 ここで説明される本方法との差異に関し、Ｃｅｒａｍｉ等の特許は、方法の改善 が非水系溶媒中で燐酸化を実施することにより達成されたことを強調している。 Ｃｅｒａｍｉ等は、米国特許４，７０５，８４５の第１欄、３９−５１行に、水 系の条件は過酷でインスリンの崩壊を導くと指摘している。すなわち、彼らは、 非水系極性有機溶媒中の硫酸あるいは燐酸と脱水剤の使用が非崩壊の状態でイン スリンを効果的に変性することを教える。以後に述べる本発明の方法は差異とし て　１）水系溶媒中で実施される、２）過酷でないＰＨの条件下で実施される、 そして、３）実質的に低下した等電点の燐酸化インスリンを含む方法あるいは精 製化によって生産され、Ｃｅｒａｍｉ等の生産物のように反応しないインスリン は実質上含んでいない（米国特許４，７０５．８４５の第４欄表１，２を参照） 。 物に関する差異としては、Ｃｅｒａｍｉ等の特許はインスリンの自由水酸基上の みでの燐酸化をフレイムしている（米国特許４，７０５，８４５の第２欄、２９ −３１行）。本願発明の物では主要な燐酸化はチロシン−〇Ｈ基、セリーンの水 酸基およびスレオニン残基と同様に自由アミノ基上で生ずる。 本願発明は、全ての知られた従来技術から異なっているばかりでな（生産された 燐酸化インスリンは、顕著な異なった薬理学による血糖のコントロールが優れて いる。皮下に注入された時に見られる血糖コントロールのこの優れた特性は、燐 酸化インスリンに関するどの従来技術にも見られない。血糖をコントロールする 改善された能力は少なくとも部分的に、不変性インスリンと比較しインスリン投 与における血糖％変化の減少した変化に起因していると信じられる。 発明の概要 広い見地から見るとインスリンのようなペプチドの燐酸化のための方法を提供す るもので、この方法は前記ペプチド水溶液を有効量の）すスフォラスオキシクロ ライド（オキシ塩化燐）と前記ペプチドの好ましい燐酸化の条件での反応を含む 。インスリンの水溶液は好ましくは２°Ｃから４°Ｃの範囲の温度で、２から１ ０の範囲より好ましくは６．９から９．５の範囲のｐＨでフオスフオラスオキシ クロライドと、１５分から４時間の範囲の時間反応し、インスリンの燐酸化が成 され、不変性のインスリンが実質的に無いインスリンが生産される。 この方法は付加的に燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液による透析 あるいはゲル濾過を含みえる。これらの透析あるいはゲル濾過は微量の反応物質 、不純物や塩を除去するためであり、さらに燐酸化インスリンを含む透析物ある いは濾過物を得るためである。好ましくは得られた透析物あるいは濾過物を凍結 乾燥し凍結乾燥物を得る。そして得られた凍結乾燥物を、高性能液体クロマトグ ラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび生産的等電点電気泳動捕集の少 なくとも一つにより、分離し精製する。そしてそこから得られたものをゲル濾過 、透析および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する。 糖尿病の治療に使用する燐酸化インスリンはこのように調製される。その燐酸化 インスリンはより低い等電点、好ましくは４より低い等電点を持つように調製さ れあるいは精製されるべきである。その燐酸化インスリンはそのインスリンのチ ロシン残基上に置換された少な（とも一つの燐酸基をもつ。そしてその燐酸化イ ンスリンはおそら（付加的にＡ１グリシン、Ｂ１フェニルアラニン、Ｂ２９リジ ン、Ｂ２２アルギニンそしてＡ１８、Ａ２１、およびＢ３アスパラギンから選ば れたそのインスリン中の自由アミノ基上に燐酸化されているだろう。その燐酸化 インスリンは付加的にスレオニン残基の少な（とも一つ、セリン残基の少な（と も一つに燐酸化されているだろう。 人間の糖尿病の治療法はその人間に対して効果的な治療上の投与量の燐酸化イン スリンを施薬することを含む。その燐酸化インスリンは実質的に不変性のインス リンを含むものではなく、大いに減少（低下）した等電点を持つ。そのインスリ ンは皮下注射、静脈注入あるいは注射により施薬さね、鼻腔あるいは直腸に施、 薬されるだろう。 図面の簡単な説明 本発明の方法は添付図面を参照して説明される。その図面中国１から図４は、糖 尿病に罹った犬の燐酸化インスリンを用いて達成された血糖の優れたコントロー ルを示すグラフである。 図５から７そして図１２は、糖尿病に罹った犬の特定量だけインスリン投与割合 を変化させたときの燐酸化されたインスリンが通常のインスリンに対して血糖変 化が小さいことを示すグラフである。 図８は、通常の犬に通常のおよび燐酸化インスリンのいずれかを投与量を変え図 ９と図１０は、個々に通常のおよび燐酸化インスリンの赤外スペクトラを示すグ ラフである。そして 図１１は、図１０の拡大図であるグラフである。 発明の詳細な説明 本発明の方法によれば、インスリンの燐酸化は水溶液中でオキシ塩化燐と接触さ せることで燐酸化できる。ベブチッドや蛋白質に含まれるアミノ基（ＮＨｔ’） または水酸基（ＯＨ）が上記の反応により燐酸化される。インスリンの反応は、 アルカリのｐＨでおこなう時や、次の例でのべるようにインスリンの遊離のアミ ノ基やインスリンのチロシン、セリン、スレオニンの水酸基が燐酸化される。イ ンスリン中のチロシン残基の燐酸化はｐＨを９．０以上にすることで反応が著し く進行しｐＨが９．　０−９．　５での反応が２７６ｎｍの吸収が消失すること で確認された。セリン、スレオニン残基の脱燐酸化は、中性またはアルカリのｐ Ｈで貯蔵されているときにおきるので、アルカリ性ではセリン、スレオニンの燐 酸化が抑制される。セリン、スレオニンの燐酸エステルはアルカリのｐＨでは不 安定であり、酸性のｐＨでは安定である。このためアルカリではアミノ酸の燐− アミノ誘導体に変化する。ｐＨ２，０〜３，０で４℃または２２℃の貯蔵では燐 酸化インスリンの脱燐酸化の速度は４〜５倍となり、アミノ基が水酸基から燐酸 化される。ここで述べられる燐酸化インスリンは、１）脂肪族水酸基（セリン、 スレオニン）、２）芳香族水酸基（チロシン）、３）遊離アミノ基の燐酸化であ ることを吸収バンドにより明かに示される。 豚のインスリンの遊離水酸基は八８とＢ２７のスレオニン、Ａ９、Ａ１２、Ｂ９ のセリン、芳香族水酸基はＡ１４、Ａ１９、Ｂ２６のチロシン、遊離のアミノ基 は囲まれたＡ１のグリシン、Ｂ１のフェニールアラニン、Ｂ２２のアルギニン、 Ｂ２９リジン、Ａ１８、Ａ２１．Ｂ３のアスパラギンである。表１に他の人およ び他のインスリンのアミノ酸組成を示す。人と豚のインスリンの燐酸化では８３ ０位に付加されているスレオニンを除いておなしとなる。

【表１】 豚　人間　牛　ネズミ１　ネズミ２ ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ Ｉ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＨＥＧＬＹ　ＰＨＥＧＬＹ　 ＰＨＥ２　ＩＬＥ　ＶＡＬ　’ＩＬＥ　ＶＡＬ　工ＬＥ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＶＡ Ｌ　ＩＬＥ　ＶＡＬ３　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮＶＡ Ｌ　ＬＹＳＶＡＬ　ＬＹＳ４　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬ ＮＡＳＰ　ＧＬＮＧＬＵ　ＧＬＮ５　ＧＬＮ　ＨＩＳ　ＧＬＮ　ＨＩＳ　ＧＬＮ 　Ｈ工５ＧＬＮＨ工ＳＧＬ？ＪＨ工Ｓ６　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　Ｃ ＹＳ　ＬＥＵＣＹＳ　ＬＥＵＣＹＳ　ＬＥＵ７　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＣＹ Ｓ　ＣＹＳ　ＣＹＳＣＹＳ　ＣＹＳＣＹＳ　ＣＹＳ８　ｍｍ　ＧＬＹ　ＴＨＲＧ ＬＹ　ＴＨＲＧＬＹＡＬＡ　ＧＬ、ＹＡＬＡ　ＧＬＹ９　ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＳ ＥＲＳＥＲ５ＥＲ５ＥＲＰＲＯＳＥＲ５ＥＲ１０ＩＬＥ　ＨＩＳ　ＸＬＥ　ＨＩ Ｓ　ＶＡＬ　ＨＸＦ；ＸＸ２．　Ｈ工５ＩＬＥ　ＨＸＳ１２　ＳＥＲＶＡＬ　Ｓ ＥＲＶＡＬ　ＳＥＲｖＡＬｓＥＲＶＡＩ、ＳＥＲＶＡＬｌ、３ＬＥＵ　ＧＬＵ　 ＬＥＵ　ＧＩ、Ｕ　ＬＥＵ　ＧＬＵＬＥＵ　ＧＬＵ都Ｕ　ＧＬｔ）１４　ＴＹＲ ＡＬＡ　ＴＹＲＡＬＡ　ＴＹＲＡＬＡＴＹＲ’　ＡＬＡＴＹＲＡＬＡ１５　Ｇゴ 　ＬＥＵ　Ｇゴ　征ＵＧ耐　都ＵＧ漆　部υＧ鮒　都Ｕ１６　ＬＥＵ　ＴＹＲ本 Ｕ　ＴＹＲ部Ｕ　ＴＹＲ画　ＴＹＲ部Ｕ　ＴＹＲ１７ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　 ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＥＵＧＬＵ　ＬＥＵＧＬＵ　ＩＪ：Ｕ１８　ＡＳＮ　ＶＡＬ 　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬＡＳＮ　ＶＡＬＡＳＮ　ＶＡＬｌ９　ＴＹＲ ＣＹＳ　ＴＹＲＣＹＳ　ＴＹＲＣＹＳＴＹＲＣＹＳＴＹＲＣＹＳ２０　ＣＹＳ　 ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＧＬＹＣＹＳ　ＧＬＹＣＹＳ　ＧＬＹ２１　 ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＧＬＵＡＳＮ　ＧＬＵＡＳＮ　ＧＬ Ｕ豚　人間　牛　ネズミ１　ネズミ２ ＡＢ　ＡＢＡＢＡＢＡＢ ２２　人ＲＧ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＡＲＧ２：ｌ　ＧＬＹ　ＧＬＹ　ＧＬ Ｙ　ＧＬＹ　ＧＬＹ２４　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ２５　ＰＨ Ｅ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ２６　ＴＹＲＴＹＲＴＹＲ，ＴＹＲＴＹＲ ２７Ｔ）ｔＲＴＨＲＴＨＲＴＨＲＴＨＲ２Ｂ　ＰＲＯＰＲＯＰＲＯＰＲＯＰＲＯ ２９ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＭＥＴ３０　ＡＬＡ　ＴＨＲＡＬＡ　Ｓ ＥＲＳＥＲ本発明の方法による燐酸化反応の程度が増加するに従い、生成物はそ のスペクトルにおいて、以下の変化を示す。　：１）紫外領域における吸収の減 少、特にチロシンの燐酸化を示す２７６　ｎｍにおける吸収の減少　、２）赤外 領域での吸収の増加、特に１０．７．１１．４５ｎｍでの吸収の増加（遊離アミ ノ基の燐酸化反応）、３）９９０−’の吸収の増加（セリン、スレオニンの水酸 基の燐酸化反応）。 従来の水溶液中の反応とは異なり、この方法では、温和なｐＨ条件と温度と時間 とを組み合わせて反応させることでインスリンを安定化している。 好ましい反応はオキシ塩化燐を徐々に添加し、インスリン溶液のｐＨを２〜１１ より好ましくは６．５〜９．５に保持して反応を進行させる。さらに好ましくは 緩衝液またはｐＨが制御できる適当な緩衝液が使用できる。クエン酸塩、酢酸塩 、グリシンなどが酸性のｐＨの反応に使用できる。燐酸塩、グリシン、ＴＲＩＣ ＩＮＥ（商標）　、ＨＥＰＥＳ　（商標）などがアルカリのｐＨの時の反応に使 用できる。ｐＨは反応中に塩基を添加して制御できる。しかしこのことは、その 方法を一層困難にする。 反応温度は０〜４°Ｃが好ましい。好ましい反応時間は１５分から４時間である 。 しかしそれには拘束されずオキシ塩化燐の添加速度の基づく。オキシ塩化燐の濃 度、ｐＨ１反応時間、温度が燐酸化の度合いを決める。 得られる燐酸化インスリンの大部分が実質的に未変性インスリンの等電点（原料 の種類によるが未変性インスリンの等電点は５．３〜５．５）より低い等電点を 有する燐酸化インスリンを製造するためには、反応は十分なオキシ塩化燐との反 応と／または十分な長さの時間（実施する温度での）を含む。さらに燐酸化イン スリンは精製、燐酸化の違いを分けて単離する工程を含み、これにより等電点は 低（なる。さらに、燐酸化インスリンの精製の工程を含み、これにより燐酸化さ れていないインスリンがすべて除かれる。未変性インスリンはここで述べた燐酸 化インスリンから得られる温和な薬理学的利点を打ち消してしまうため、この未 反応のインスリンの除去（Ｃｅｒａｍｉ等の特許では開示されていない）は必要 である。 動物からのインスリンまたは再結合方で製造されたインスリンでも上記の方法で 燐酸化できる。 皮下注射において、作用を持続させるためにプロタミンや亜鉛を添加することが できる。 さらにこの方法において塩化ナトリウム、燐酸ナトリウムなどの塩や防腐剤とし てメタクレゾール、メチルパラベン、フェノールを配合することができる。 この燐酸化インスリンは水の媒体中で保存すると脱燐酸化がおきる。ＥＤＴＡな どのキレート剤を安定剤として加えて脱燐酸化を防ぐことができる。塩化ナトリ ウム、燐酸ナトリウムなどの塩も脱燐酸化の抑制効果があるが、その濃度が２５ ｍＭ−０，５Ｍでは十分でなく部分的に有効である。 以下に本発明の具体的方法および生成物の効能を例示するがこれに限定されるも のではない。 〔実施例１〕 ４０ｍｇの単一組成の豚のインスリンを蒸留脱イオン水（１０ｍｌ）に溶解して ｐＨを２．５とした。この溶液を激しく攪拌しながら０．２６８ｇの燐酸ナトリ ウム（Ｎａ　２ＨＰ０４　・７Ｈ２０）またはＩＯＮの水酸化ナトリウムを加え てｐＨを７〜９まで上げた。この溶液をドライアイス／氷／エタノール浴中で０ 〜２℃に冷却し、０〜２°Ｃに予め冷却した１７５μｍのオキシ塩化燐を滴状か つ一定速度で８０分かけて添加した。反応混合物は常に攪拌しながら０〜２℃に 冷却したＩＯＮの水酸化ナトリウムを添加しその間のｐＨのふれを６．５と９． ５の間に保つようにした。オキシ塩化燐を添加している間、反応混合物は０℃〜 ４℃に保った。上記８０分間の反応中には、０．９２ｇのトリスヒドロキシアミ ノメタン（商標トリス）緩衝液を反応混合物に加えた。オキシ塩化燐の添加後４ ０分したところで０〜２℃に冷却したＩＯＮの水酸化ナトリウムを反応混合物中 に滴下してｐＨを７〜８に制御し、室温になるまで放置した。生成物は４°Ｃで ２．３ｇ／ｌの食塩水と脱イオン水とに代え平衡になるまで透析を繰り返した。 なお蒸留水には予め透析物に対して０．２５容量％のメタクレーゾルが添加され ている。 〔実施例２．３．４．５．６〕 各実施例の合成例は、オキシ塩化燐の量を次のように代えた他は、実施例１と同 じ条件で実施された。（ａ）実施例２のオキシ塩化燐の量は３５０μｍ、（ｂ） 実施例３のオキシ塩化燐の量は２４０μｍ、（ｃ）実施例４のオキシ塩化燐の量 は１００μｍ、（ｄ）実施例５のオキシ塩化燐の量は５０μｍ、（ｅ）実施例６ のオキシ塩化燐の量は６００μｍである。 〔実施例７〕 実施例１の条件において燐酸ナトリウムの緩衝液を使用しない他は、実施例１と 同じ条件で実施された。 〔実施例８〕 実施例１の反応工程においてトリス緩衝液を加えなかった。上記のｐＨの調整は ＩＯＮの水酸化ナトリウムのみでおこなった。 〔実施例９〕 実施例２の条件においてオキシ塩化燐添加後の反応混合物を０〜４℃に４時間保 持し、ｐＨはその時点のまま保持して反応を完結させた他は、実施例２と同じ条 件で実施された。 ［実施例１０］ 実施例２の条件において豚のインスリンの代わりに人のインスリンを使用した以 外は実施例２と同じ条件で実施された。 〔実施例１１〕 実施例１の条件において牛のインスリンを使用した以外は実施例１と同じ条件で 実施された。 〔実施例１２〕 実施例２の条件で亜鉛を含まないナトリウム−インスリンを使用した以外は、実 施例２と同じ条件で実施された。 〔実施例１３） 実施例３に記載した方法でインスリンを製造し、０．２５％のメタクレゾールを 含む２５ｍＭ燐酸緩衝液でｐＨ７，２〜７．４で再構成し、腐敗防止と食塩によ る等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）溶液とした。 〔実施例１４〕 実施例２に記載した方法でインスリンを製造し、０．２５％のメタクレゾールを 含む１５０ｍＭ燐酸緩衝液でｐＨ７，２で液状に戻し、食塩による等張溶液とし た。 〔実施例１５〕 実施例１３０条件においてインスリンとプロタミンのモル比を６：１の割合でプ ロタミンを燐酸化インスリンに加えた以外は実施例１３に記載した方法でインス リンを製造した。 〔実施例１６〕 実施例１２の条件においてインスリンとプロタミンのモル比を１：１の割合でプ ロタミンを加えた以外は実施例１２に記載した方法でインスリンを製造した。 〔実施例１７〕 Ｚｎ−の全濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように酢酸亜鉛を添加上以外は、実施 例１６に記載した方法で製造した。 〔実施例１８〕 プロタミンを省いた以外は実施例１７に記載した方法で製造した。濃度０．１ｍ ｇ／ｍｌのＺｎ”＋の存在は、効果を延ばすことができる。 〔実施例１９〕 実施例１の方法においてオキシ塩化燐の添加を５分間隔で等量添加した以外は、 実施例１の条件で製造をおこなった。 〔実施例２０〕 上記の実施例１〜１９の方法で得た生成物を、ＢＩＯＲＡＤ（商標）ｍｉｎｔ− ＩＥＦセルを用いて４％のポリアクリルアミドゲルを含み３．５および／または ５／７の両性電解質でｐＨの傾斜（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を確立させ等電点電気泳 動法（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｓｉｎｎｇ）で分析した。生成 物の等電点は２．　１〜５．２の範囲であった。燐酸化の度合いが増加した１０ 個の燐酸化インスリンが確認できた。生成物の燐酸化の度合いと異質生成物とは 、反応物濃度や反応時間および温度を変化させることで制御できる。 燐酸化の異なる生成物はイオン交換クロマトグラフィーで分離できる。特にＡ２ ５セフアセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）を用いｐＨ５，０〜７．５の範囲で塩化ナト リウムの濃度を０から０．４Ｍにするリニアー傾斜（１１ｎｅａｒ　ｇｒａｄｉ ｅｎｔ）で分離できる。 〔実施例２１〕 インスリン分子に導入された燐酸基の数は、表２、表３に示した様に反応液中に 添加するオキシ塩化燐の量を変えることで制御できる。表２に示すように、１０ ０μｍのオキシ塩化燐を添加した実施例４の場合には、主成分が等電点（ｐｌ） 　４．　７でインスリンモノマーに対して１．８の燐酸基が導入されていた。オ キシ塩化燐の量を増した実施例２の方法では、生成物の５５％がｐＩが３．５の 燐酸化インスリンであった（５燐酸基／インスリンモノマー）。表３に示すよう にこの方法では燐酸化インスリンの燐酸基は１．　１〜１１．３の範囲で導入さ れた。

【表２】

【表３】 等電点　インスリンモノマーに （ＰＩ）　対する燐酸基の平均個数 〔実施例２２〕 オキシ塩化燐の量を増加させていくと、増加したオキシ塩化燐がチロシン残基を 燐酸化させる。このことが、２７６ｎｍ　（ＵＶ）の吸収が減少することで確か められる。実施例３．２．６での２７６　ｎｍの吸収は、燐酸化されていないイ ンスリンの吸収のそれぞれ８２％、５３％、３５％であった。このことは、２４ ０μｍのオキシ塩化燐を使用して燐酸化すると、チロシン残基が平均１個燐酸化 される（実施例３参照）、実施例６の様にオキシ塩化燐の量を増すと平均３個の チロシン残基が燐酸化されることとなる。 〔実施例２３〕 実施例２．３．６で得た生成物についてフーリエ変換赤外線スペクトル（ＦＴＩ Ｒ）を調べた。９９０ｃｍ−’　（ＣＨ２０Ｐ→０　結合、すなわち、インスリ ン中のセリン、スレオニン）と１０６０ｃｍ−１（芳香族燐酸、チロシン）の透 過の減少（吸収の増加）が認められた。実施例４の燐酸化生成物のＦＴＲＩスペ クトルを図１０．１１に、未処理のインスリンのＦＴＲＩを図９に示す。９９０ 　ｃｍ−！の吸収はＣＨ２ｏｐｏ　結合の伸縮振動に起因するのだろう。この９ ９０　ｃｍ−１の吸収ピークは９００〜ｌ　Ｏ５０ｃｍ−’の間に表れる。 〔実施例２４〕 実施例２．３．６で得た生成物のＦＴＩＲの９２５〜９４０　ａｍ−’の吸収は Ｎ−Ｐ結合の生成を示すもので、インスリンのアミノ基が燐酸化されたことにな る。 この吸収の増加はオキシ塩化燐が１００μｍでの反応の生成物には認められない 。 燐酸化インスリンは燐酸化の進行とともにニンヒドリンとの反応が低下し、燐酸 化の度合いが進んでいることを示す。このことはインスリンの遊離のアミノ基が オキシ塩化燐の量の増加により燐酸化されていることを示している。 〔実施例２５〕 等電点電気泳動（ＩＦ）（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）で 測定した結果、上記の全ての燐酸化物を４℃または２２℃で（ａ）ｐＨ３，０か （ｂ）ｐ）（！１１．０の水中で貯蔵することにより、全ての燐酸化物は脱燐酸 化した。燐酸エステルは、一般に酸性のｐＨ下では安定であり、Ｎ−フォスフェ ート化合物はアルカリのｐＨ下で安定である。したがって前記の知見でアミン基 および燐酸エステル（セリン、スレオニン）の脱燐酸化が調べられる。 〔実施例２６〕 上記の脱燐酸化の進行は塩類の添加により抑制される。塩化ナトリウムや燐酸ナ トリウムは２５ｍＭ−０，５Ｍの濃度範囲でこの効果を示す。しかしながらこの 抑制効果は完全ではなり２２°Ｃで８日放置後に、上記の溶液の脱燐酸比誘めら れた。 〔実施例２７〕 キレート剤は遊離の金属イオンと効率的に結合する。遊離の金属イオンは良く知 られているようにフォスフェートと結合し、脱燐酸化の触媒となる。 ５０ｍＭのキレート剤のエチレンヂアミンーテトラー酢酸（ＥＤＴＡ）を含む燐 酸化インスリンの溶液は、ｐＨ７〜９での貯蔵において脱燐酸化に対して著しく 安定であった。５０ｍＭのＥＤＴＡと２５ｍＭ〜１５０ｍＭの食塩または燐酸ナ トリウムを含む燐酸化インスリン溶液は、２２℃で６０日貯蔵した後でも脱燐酸 化が認められなかった。 〔実施例２８〕 実施例２．３．４．６で得た燐酸化インスリンは、精製とそれぞれの成分への分 離をイオン交換クロマトグラフィーでおこなった。ＤＥＡＥセファデックス（ｓ ｅｐｈａｄｅｘ）　、セファセル（ｓｅｐｈａｃｅｌ）　、類似のゲルなどが使 用できるが、最も良い分離はＱ　５ｅｐａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ（商標 ）であった。 分離はｐＨ６，５〜８．５で４〜２２℃でおこなった。好ましい分離条件は、１ ５ｍＭのビストリス（ＢＩＳＴＲＩＳ商標）でｐＨ６，５１５ｍ１／ｈｒ４°Ｃ Ｏ，１〜０．３５ＭのＮａＣ１の傾斜（ｇｒ　ａｄ　ｉ　ｅｎ　ｔ）。 生成物は生産的等電点電気泳動捕集（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｓ ｉｎｇ）法により精製できる。例えば商標ＲＯＴＯＦＯＲＩＥＦのセルを用い３ １５．５／７の両性電解質でｐＨの傾斜を確立しておこなった。分離は８００〜 ２００ボルトで２〜６時間でおこなった。 〔実施例２９〕 部分精製はアセトニトリルを含むＨＰＬＣ傾斜を用いることでおこなうことがで きる。 〔実施例３０〕 前記の方法で得た生成物を精製または等電点を４以下に処理した実質的主成分の 物質を長時間効能と短時間効能の燐酸化インスリンとして用いて２か月にわたっ て糖尿病の犬に皮下注射処理をした。 犬は、長時間、短時間効能の未変性の市販インスリンを使用する時以外は、自己 の制御に代え同一の管理体制にきりかえた。血糖は２４時間／日でモニターした 。３６の実験を２４時間持続して各人におこなった。犬には全ての試験用こ１田 こ３度の食事を同じカロリー（３４０ｋｃａｌ）内容で午前８時、１２時、午後 ４時に与えた。犬には、短時間効能のインスリンを午前８時３０分、午後１２時 ３０分、午後４時３０分に長時間効能のインスリンを午前８時３０分、午後１０ 時３０分に注射した。測定された無糖値の範囲は燐酸化インスリンを受けた犬は 未変性の市販のインスリンを受けた犬に比べて図１および図２に示すように顕著 に少ない。 図３、図４に示すように血糖は、動物の燐酸化処理したインスリンと正常範囲に 近い値である。コントロールの向上は１日中の２４点の中から２１が統計的に重 要である（ｐ＜０．０５）。血漿（プラズマ）グルコースの平均値（太線）と標 準偏差（ＳＤ　線で囲まれた面積部）をこの図は示す。 〔実施例３１） この実施例は実施例３の方法で製造した燐酸化インスリン（実質的に低い平均等 電点をもつように製造、精製されたもの）を４匹の糖尿病（膵臓の切除された） の犬に１日２４時間連続注入した。実験の最初の段階では、通常または燐酸化イ ンスリンのどちらかを用いて、断食状態で、プラズマグルコースを午前７時３０ 分時の正常値から２−４時間後６０ｍｇ％の定準化するに必要な注射インスリン 量を決めた。図５に示すように、これにより燐酸化および通常インスリン共に実 験の２時間後にはｅＯｍｇ％の平準化（ｐｌａｔｅａｕ）を延ばすことができた 。各インスリンで達成されたグルコースの平準化に意味ある違いはなかった。 この血糖の６０ｍｇ％への低減過程の割合をＭａｘ　Ｒａｔｅと名付は九　その 後の日こ、１）図６に示す６２％のＭＡＸ　ＲＡＴＥか、２）図７に示す３６％ のＭＡＸ　ＲＡＴＥのどちらかに匹敵するインスリン注射の低減割合の処理を受 けた以外の、４匹の糖尿病の大全ては、同じ条件の実験を受けた。図６に示す様 に６２％の通常インスリンの注射率での低減は、犬のグルコースを上昇させ平均 １５０ｍｇ％の平準化となる。同じように燐酸化インスリンの低減結果の平準化 は８０〜８５ｍｇ％である（図６）。 図７に示したように、ＭＡＸ　ＲＡＴＥを３６％にさらに割合を下げても類似し た結果が得られた。この試験では、通常のインスリンが注射された犬のグルコー スのしきい値は１８０ｍｇ％（腎臓のしきい値は腎臓がグルコースを尿中に流し だしはじめる値）であった。燐酸化インスリンを注射した犬のグルコースのレベ ルの平均は低く１２０〜１３０ｍｇ％に達した。 この例は、通常のインスリンと比較し、インスリンの投与量を変えることに起因 する血糖やプラズマグルコースの低い変化を示すためになされたものである。 すべての実験は全ての犬に対して３回実施された。 〔実施例３２〕 実施例２で製造した燐酸化インスリンと通常のインスリン（Ｉｌｅｔｉｎ　ＩＩ 　ｐｕｒｅ　Ｐａｒｋ　）を静脈注射で４匹の正常で断食したピーグル犬に投与 した。各インスリンは投与量を広く変えた投与であり、−田こ各人につき１回の 試験を行い２回以上の試験はしなかった。各人の血漿グルコースを注射後１５分 間２分間隔で測定した（ＹＳＩ）。通常値からのグルコースの減少速度を各イン スリンの投与量ついて測定した。結果を図８に示す。図８のデータを解析すると 、グルコースの低下速度を増加させるために必要とするインスリン投与量の増大 ％変化は通常のインスリンに比較し燐酸化インスリンは大きい。たとえば、表４ に示す様に、３．５ｍｇ％／ｍｉｎ、のグルコースの低下をもたらすため、通常 のインスリンの投与量を２８％増加した時、グルコースの低下速度の増加は３． ５〜４．０ｍｇ％／ｍｉｎ、　となる。同じ効果を得るために必要とする燐酸化 インスリンの投与量の増加は６６％であった。この事は以下のことを示す：１） 通常のインスリンの投与量の変化は、燐酸化インスリンの投与量の変化に比較し 、グルコース低下の低下速度において顕著に大きな変化をもたらす（例えば、等 しい投与量とした場合）。２）表４に示す様に、検討した全ての投与量の範囲に おいて上記のことが事実適合する。

【表４】 この表は、表の左側の欄に示すグルコースの低下速度の変化をもたらすのに必要 なインスリンの投与量の増量％を示す。 〔実施例３３〕 ２匹の糖尿病の犬に、１日１回、毎日午後２時に１１００ｋｃａｌの食事と食事 時に通常の（例えば、即効性の）インスリンを所定量与えた。 さらに犬には２４時間毎に通常のインスリンまたは実施例６により調製した燐酸 化インスリンを連続して注入した。 この実験を続けている間、最小のインスリン注入の必要割合は、平均午前８時に 断食プラズマグルコースが９５ｍｇ％となるように各インスリン量を調整した。 一度この割合を決定すると、インスリンの注入割合は各次の日の午前８時までに 断食時のプラズマグルコースが６５−７５ｍｇ％となるまで増加を続けた（最高 　３日連続）。 図１２に示すように、インスリンの注入割合は断食時のグルコースを９５から７ ５ｍｇ％に低下させるためには、燐酸化インスリンを７０％増加させることが必 要があるが、通常のインスリンでは２０％増加が必要であるのみである。終わり の３例に述べた好ましい投与結果の生理学上の効果として、全体または一部分か ら前記の燐酸化インスリンは優れたグルコース制御が得られるといえる。 プラズマグルコース（ＰＧ）の管理 −日の時間 図２ プラズマグルコース（ＰＧ）の管理 リン酸化対不変性インスリン Ｍ −日の時間 図３ プラズマグルコース（ＰＧ）の管理 リン酸化対不変性インスリン リン酸化対不変性インスリン Ａｒ／１ 一日の時間 （％、Ｎ）　Ｙ−ｒ：’＋（ＡｈＸ’−１４（％肥）　’ｒ−Ｃ’１（Ｉｔム、 Ｘ’−／（９６３［［１）　Ｍ−ｃ４ｔ（、、＝ｚｒ−１（仔／％加）面取土１ ）■’１−Ｃ（＋　Ｊ：／ＡＸ（：１：：−（％）＊薪値 図１２ グルコースを１００から７０■％に低下させるために通常インスリン　リン酸化 インスリン ポンプの翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＣＡ９２１０００８２ ２、発明の名称 インスリンの燐酸化の方法およびそれによって製造された物３、特許出願人 住所（居所）　カナダ、オンタリオ、トロント、エルムストリート８８、エム５ ジー１エツクス８ 代表者　フリーセン・ジェームズ・デー国籍　カナダ ４、代理人 〒４５０　愛知県名古屋市中村区名駅３丁目２番５号１９９３年２月９日 ６、添付書類の目録 補正書の翻訳文　１通 Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、　６５．３１９−３３９．１９５６）。Ｆｅｒｒｅｌ等 やＲａｔｈｌｅｖとＲｏｓｅｎｂｅｒｇによって作られた燐酸化インスリンは燐 酸化の過程をより深く理解するために、特に燐酸化がとのように生材学系と関係 しているかという知識を増加するために計画された研究の一部である。この燐酸 化インスリンの臨床的優位性は何ら述べられていない。 Ｃｃｒａｍｉ等に許可された特許は、インスリン搬送システム中に保存された場 合、重合しないという優位性を持つ硫酸化および燐酸化インスリンの生産を含む 。このようにこれらのインスリンはＣｅｒａｍｉ等によって述べられているよう にインスリンポンプを詰まらせないという優位性をもつ、そしてインスリンポン プを用いている患者が少ないため、これらインスリンは血糖のより良い管理をも たらすべきである。しかしながら、前記インスリンは議論すべき血糖のより良き 管理をもたらす生理特性について何も示していない。それ故この効果に合わせて 作られるべきフレイムは存在しない。 インスリンはまた過剰のビリデンとオキシ塩化燐とにより燐酸化されるというＺ 、Ｒｏｕｂａｌ　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　６８．１９６８（ Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、０ｈｉｏ、Ｕ、Ｓ、））の開示がある。この開示では燐酸化 は無水の媒体中でおこなわれ低血糖を変える効果を有しない。 ここで説明される本方法との差異に関し、Ｃｅｒａｍｉ等の特許は、方法の改善 が非水系溶媒中で燐酸化を実施することにより達成されたことを強調している。 Ｃｅｒａｍｉ等は、米国特許４，７０５，８４５の第１欄、３９−５１行に、水 系の条件は過酷でインスリンの崩壊を導くと指摘している。すなわち、彼らは６ 、微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物あ るいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液によ る透析あるいはゲル濾過工程、凍結乾燥物を得るため、前記透析物あるいは濾過 物を凍結乾燥する工程、前記凍結乾燥物を、高性能液体クロマトグラフィー、イ オン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少なくとも一つにより 、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾過、透析および凍 結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方法。 ７、微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物 あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液に よる透析あるいはゲル濾過工程、面記透析物あるいは濾過物を高性能液体クロマ トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少な くとも一つにより、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾 過および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方 法。 ８、　糖尿病の治療に使用するためクレーム２の方法にしたがって製造され〜実 質的に低下した等電点をもつように製造あるいは精製された燐酸化インスリン。 ９　等電点は４より小さい請求項８の燐酸化インスリン。 １０、請求項２の方法で作られた燐酸化インスリン。 １１、請求項３の方法で作られた燐酸化インスリン。 １２、請求項５の方法で作られた燐酸化インスリン。 １３、請求項６の方法で作られた燐酸化インスリン。 国際調査報告 ｍｍｌｌａｍｍ１ｌａ＃Ｉｈ（１ｗＭＩＩｓρＣＴ／ＣＡ９２１０００８２国際 調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。 ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ペプタイドの水溶液を有効量のオキシ塩化燐と前記ペプタイドの燐酸化に好 ましい条件で反応させることを含むペプタイドの燐酸化方法。
2. ２．前記ペプタイドはインスリンである請求項１の方法。
3. ３．前記インスリンの水溶液が前記オキシ塩化燐と２から４℃の温度範囲の湿度 で２から１０のｐＨ範囲のｐＨで反応させる請求項２の方法。
4. ４．前記ｐＨは６．９から９．５の範囲内にある請求項３の方法。
5. ５．不変性のインスリンが実質的に無いインスリンをつくるための燐酸化は、前 記インスリンの水溶液が前記オキシ塩化燐と１５分から４時間の時間範囲の時間 反応される請求項３の方法。
6. ６．微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物 あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液に よる透析あるいはゲル濾過工程、凍結乾燥物を得るため、前記透析物あるいは濾 過物を凍結乾燥する工程、前記凍結乾燥物を、高性能液体クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少なくとも一つによ り、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾過、透析および 凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方法。
7. ７．微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物 あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液に よる透析あるいはゲル濾過工程、前記透析物あるいは濾過物を高性能液体クロマ トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少な くとも一つにより、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾 過および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方 法。
8. ８．糖尿病の治療に使用するための実質的に低下した等電点をもつように製造あ るいは精製された燐酸化インスリン。
9. ９．等電点は４より小さい請求項８の燐酸化インスリン。
10. １０．請求項２の方法で作られた燐酸化インスリン。
11. １１．請求項３の方法で作られた燐酸化インスリン。
12. １２．請求項５の方法で作られた燐酸化インスリン。
13. １３．請求項６の方法で作られた燐酸化インスリン。
14. １４．糖尿病の治療に使用するためのインスリンのチロシン残基に置換された少 なくとも１つの燐酸基をもつ燐酸化インスリン。
15. １５．Ａ１グリシン、Ｂ１フェニルアラニン、Ｂ２９リジン、Ｂ２２アルギニン およびＡ１８、Ａ２１、とＢ３アスパラギンのグループから選ばれたインスリン の自由アミノ基の少なくとも１つが付加的に燐酸化された請求項１４の燐酸化イ ンスリン。
16. １６．少なくとも１つのスレオニン残基に付加的に燐酸化された請求項１５の燐 酸化インスリン。
17. １７．少なくとも１つのセリン残基に付加的に燐酸化された請求項１６の燐酸化 インスリン。
18. １８．実質的に不変性インスリンの無いかつ低い等電点をもつ燐酸化インスリン を人間に対して処方することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。
19. １９．請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６あるいは 請求項７の方法で作られた燐酸化インスリンを人間に対して所定量処方すること を含む人間の糖尿病の治療のための方法。
20. ２０．実質的に不変性インスリンの無いかつ低い等電点をもつ燐酸化インスリン を人間に対して皮下注射、静脈注入あるいは注射により施薬され、鼻腔あるいは 直腸に処方することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。
21. ２１．請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６あるいは 請求項７の方法で作られた燐酸化インスリンを人間に対して皮下注射により処方 することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。