DE19535701A1

DE19535701A1 - Phosphorylierte Insuline und deren Derivate, Verfahren zu deren Herstellung, ihre Verwendung und eine sie enthaltende Zubereitung

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Publication number: DE19535701A1
Application number: DE1995135701
Authority: DE
Inventors: Hartwig Prof Dr Hoecker; Dietrich Prof Dr Brandenburg; Volker Dr Lenz; Jens Kleinjung
Original assignee: Deutsches Wollforschungsinstitut
Current assignee: Deutsches Wollforschungsinstitut
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 1997-03-27

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, phosphorylierte Insuline und deren Derivate, die als vermindert-hypoglykämische und vermindert-aggregierende Insulinderivate mit veränderten Oberflächen- und Lösungseigenschaften verwendet werden können, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.

Die Verbindungen sind zur Behandlung von Diabetes mellitus geeignet und besitzen ein gegenüber nativem Insulin verändertes Wirkungsprofil. Trotz der stetigen Verbesserung pharmazeutischer Insulinzubereitungen besteht weiterhin Bedarf an neuen Insulinprodukten, insbesondere mit verringerter hypoglykämischer Wirkung, anderen Löslichkeits- und Transporteigenschaften sowie geringerer Aggregationstendenz und Immunogenität.

Beschreibung

Das pancreatische Hormon Insulin spielt eine wichtige Rolle in der physiologischen Kontrolle des Glucose-Metabolismus. Es reduziert die Glucosekonzentration im Blut u. a. durch Aktivierung des Glucosetransportes und die Umwandlung von Glucose zu Glycogen. Insulinmangel führt zu erhöhtem Glucosespiegel im Plasma und zu dem Krankheitsbild des Diabetes mellitus. Etwa 2-3% der Durchschnittsbevölkerung in Deutschland sind diabetisch. Insulin und Insulinderivate werden bekanntlich in pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt. Als überwiegende Therapieform wird die Substitutionstherapie durch subkutane Injektion des Hormons angewandt. Die häufigste Anwendungsform ist eine Injektion zweimal täglich. Die damit verbundene rasche Senkung des Blutzuckerspiegels kann bei der Routineapplikation über das physiologisch sinnvolle Maß hinausgehen und zur Hypoglykämie führen, die eine schwerwiegende Beeinträchtigung und Gefährdung des Patienten darstellt. Die Hypoglykämie ist unvorhersagbar; sie tritt bei Typ1- diabetischen Patienten durchschnittlich ein- bis zweimal pro Woche auf.

Eine Unterdrückung der hypoglykämischen Wirkung besitzen phosphorylierte Insuline (A.M. Albisser, U.S. Pat. 5,242,900 (1991); W.D. Lougheed, Int. Pat. 92/14754 (1992)). Unter Phosphorylierung wird die kovalente Verknüpfung eines Phosphorsäurederivates mit einer Aminosäurefunktion, meistens OH (O-Phosphorylierung) oder NH₂ (N-Phosphorylierung), verstanden. Die erste Phosphorylierung von Insulin mittels konzentrierter Phosphorsäure stammt von H.R.E. Fraenkel-Conrat et al., Journal of the American Chemical Society, Band 70, S. 2101-2107 (1948). Die Umsetzung von Insulin mit Phosphoramidat in wäßriger Lösung führte zu N-Phosphorylierung (V. Rathlev und T. Rosenberg, Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 65, S. 319-339 (1956)).

Von einer gegenüber Insulin verlängerten Wirksamkeit eines Gemisches phosphorylierter Insuline, das aus einer Reaktion mit Phosphorylchlorid in Pyridin stammt, berichten Z. Roubal et al., Vnitr. Lek., Band 13(4), S. 369-381 (1967). Weitere Darstellungen mit konzentrierter Phosphorsäure und katalytisch wirkenden Reagenzien in organischen Lösungsmitteln (A. Cerami et al., U.S. Pat. 4,534,894 und 4,705,845 (1987)) und mit Phosphorylchlorid in wäßriger Lösung (A.M. Albisser, U.S. Pat. 5,242,900 (1991); W.D. Lougheed, Int. Pat. 92/14754 (1992)) wurden beschrieben.

Die Phosphorylierung von Insulin mit den erwähnten Methoden führt zu einem Produktgemisch, da beispielsweise Humaninsulin 10 Hydroxylfunktionen und 3 Aminofunktionen besitzt. Die Primärstruktur von Humaninsulin ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die erzeugten N-Phosphorylierungsprodukte können in wäßrigen Lösungsmitteln schonend hydrolysiert werden, während die O-Phosphorylierungsprodukte stabiler sind.

Zur Charakterisierung der erhaltenen Produkte ist daher eine Trennung in Einzelsubstanzen und eine Analyse der Verbindungen erforderlich.

In keiner der genannten Veröffentlichungen wird jedoch der Nachweis einer vollständigen Trennung erbracht oder eine Einzelverbindung charakterisiert. Die dort beschriebenen bzw. verwendeten Stoffe sind Produktgemische, welche anhand von Einzeldaten wie dem isoelektrischen Punkt oder dem Gesamtphosphatgehalt charakterisiert wurden. Wie aus der Int. Pat. 92/14754 hervorgeht, wurden Gemische phosphorylierter Insuline mittels Ionenaustausch-Chromatographie und isoelektrischer Fokussierung getrennt und Infrarot- Spektren angefertigt. Es wird jedoch kein Nachweis über das Gelingen der Trennung geliefert, die Infrarot-Spektren sind nicht als Spektren von Insulinderivaten zu identifizieren und der Beweis für die behauptete Zusammensetzung dieser Stoffe wurde nicht erbracht. Das wäre insbesondere bei der Verwendung hochreaktiver Verbindungen wie Phosphorsäure und Phosphorylchlorid, die zu einer erheblichen Anzahl von Nebenprodukten führen können, notwendig. So sind Desamidierungen, Oxidationen und hydrolytische Schädigungen des Proteingerüstes unter den angegebenen Reaktionsbedingungen zu erwarten, und bei den isolierten Stoffen kann es sich neben phosphorylierten Insulinen um Abbauprodukte der Zielverbindungen handeln. Die nicht bezweifelten physiologischen Effekte phosphorylierter Insuline beziehen sich demnach auf Substanzgemische, deren genaue Zusammensetzung unklar ist.

In dem Bestreben, die bekannten Verfahren zur Synthese phosphorylierter Insuline zu verbessern und erstmalig die Darstellung von Einzelsubstanzen der genannten Art zu beschreiben und eindeutig zu belegen, wurden nun mehrere, verbesserte Verfahren erarbeitet. Mit diesen ist es möglich, entweder gezielt ein phosphoryliertes Insulinderivat darzustellen oder den Reaktionsumsatz so zu steuern, daß ein mit üblichen proteinchemischen Mitteln trennbares Produktgemisch entsteht, dessen Einzelsubstanzen nachfolgend getrennt und identifiziert werden können. Die neuen Insulinderivate besitzen O-Posphorylbindungen und lassen sich mit der allgemeinen Formel I beschreiben:

Ins-(OPO₃RR′)_x (I)

in welcher

a) R,R′ = H oder eine beliebige Schutzgruppe der Phosphorsäuregruppen, vorzugsweise Benzyl-, t-Butyl-, oder Methyl-
b) x = Phosphorylierungsgrad mit x = 1 bis zu der Anzahl reaktiver Hydroxyfunktionen
c) Ins = Insulinderivate im weitesten Sinne, z. B. natürliche oder unnatürliche Derivate mit Schutzgruppen an funktionellen Gruppen oder Aminosäureaustausch in verschiedenen Positionen, Insulinderivate mit verkürzten, verlängerten oder verknüpften Ketten, einzelne Ketten oder Teilsequenzen der oben genannten Insuline sind,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Die Synthese der Insulinderivate nach Formel I kann nach zwei Strategien erfolgen: der selektiven "Baustein-Methode" und der "globalen Phosphorylierung".

Nach der "Baustein-Methode" wird ein phosphoryliertes Aminosäurederivat durch enzymatische Semisynthese (Verfahrensvariante a) oder durch chemische Kupplungsmethoden (Verfahrensvariante b) in die Insulinsequenz eingefügt.

Nach der "globalen Phosphorylierung" (Verfahrensvariante c) wird ein Insulinderivat durch Phosphorylierungsreagenzien unter permanenter Reaktionskontrolle an reaktiven Hydroxyl funktionen phosphoryliert.

Der isoelektrische Punkt der Insulinderivate der Formel I liegt bei Monosubstitution zwischen 4 und 5 (gemessen in der isoelektrischen Fokussierung) gegenüber 5,4 bei nativem Insulin.

Durch die an der Oberfläche des Moleküls befindlichen, zusätzlichen Ladungen bei ungeschützten Phophorsäurerestern ist die Löslichkeit der modifizierten Insulinderivate der Formel I in wäßrigen Lösungsmitteln erhöht.

Variante a)

Die Herstellung der Insulinderivate der Formel I kann dadurch erfolgen, daß man ausgehend von Insulin oder einem Insulinderivat durch Austausch des B30-Restes mit einer phosphorylierten Aminosäure in Gegenwart von einem Enzym, vorzugsweise Lysylendoproteinase, eine Phosphorylierung durchführt.

Dieser Austausch wird im wesentlichen nach zwei Verfahrenskategorien durchgeführt: den "Eintopf-Verfahren" und den "Zweistufen-Verfahren".

Nach den "Eintopf-Verfahren" wird der B30-Ala-Rest in einem einzigen Verfahrensschritt gegen das phosphorylierte Aminosäurederivat ausgetauscht.

Nach den "Zweistufen-Verfahren" wird in einer ersten Verfahrensstufe der B30-Rest abgespalten (Proteolyse) und dann in einer separaten zweiten Verfahrensstufe ein phosphoryliertes Aminosäurederivat angeknüpft (Kupplungsreaktion).

Beide Verfahren sind aus der industriellen Gewinnung von Humaninsulin aus Schweineinsulin nach semisynthetischen Verfahren bekannt, wie z. B. beschrieben von E.W. Schmitt und H.G. Gattner, Hoppe Seyler′s Z. Physiol. Chem., Band 359, S. 799-802 (1978). Die Strukturformel eines mit diesem Verfahren dargestellten Phosphoinsulins ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Das Gelingen und der Fortschritt des enzymkatalysierten Verfahrens bei der Verwendung phosphorylierter Aminosäuren sind sehr überraschend, da Phosphoaminosäuren nicht dem natürlichen Substratspektrum von Lysylendoproteinase entsprechen. Insbesondere die zweifach negative Ladung der phosphorylierten Seitenkette ist bei keiner proteinogenen Aminosäure vorhanden. Zudem ist bekannt, daß phosphororganische Verbindungen die katalytische Wirkung von Serinproteasen, zu denen Lysylendoproteinase gehört, inhibieren (Q. Zhao et al., Biochemistry, Band 33, S. 8128-8138 (1994)).

Als Insulin-Ausgangsmaterialien kommen für das erfindungsgemäße Verfahren im Prinzip alle möglichen tierischen Insuline sowie auch Humaninsulin in Frage. Beispielhafte tierische Insuline sind Schweine-, Schaf- und Rinderinsulin. Die Insuline können auch in Form ihrer Derivate eingesetzt werden; als solche kommen in Frage die Salze, Komplexe, mit Schutzgruppen versehene Insuline, Insuline mit am N-Terminus der B-Kette oder auch der A-Kette abgespaltenen Aminosäuren (z. B. Des-Phe^B1-Humaninsulin, Des-Gly^Al- Humaninsulin) etc.

Auch natürliche und unnatürliche Insulinvorstufen, an denen sich an ein oder mehrere der Kettenenden noch Aminosäuren, Peptide oder sonstige Verlängerungen anschließen, können als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Beispielhafte natürliche und unnatürliche Insulinvorstufen sind Schweineproinsulin und gentechnologisch abgewandelte Varianten.

Voraussetzung für die Verwendung der genannten Insulinderivate in diesem Verfahren ist ein Lysinrest im C-terminalen Bereich der B-Kette.

Als phosphorylierte Aminosäurederivate lassen sich alle als Phosphorsäureester vorliegenden natürlichen oder unnatürlichen Aminosäurederivate einsetzen, bevorzugt Serin, Threonin und Tyrosin, mit geschützten oder ungeschützten COOH- und P(O)(OH)₂- Funktionen. Außerdem kann die Carboxylfunktion auch zu CH₂OH reduziert sein.

Variante b)

Die Herstellung der Insulinderivate der Formel I kann dadurch erfolgen, daß man ein Insulin oder Insulinderivat mit aktivierten oder unter Aktivierung von phosphorylierten Aminosäurederivaten umsetzt. Die Aktivierung erfolgt in an sich bekannter Weise durch Verwendung von Carbodiimiden oder ähnlichen Kupplungsreagenzien zu aminogeschützten Aktivestern. Beispielhaft seien Succinimid- und Benzotriazolester genannt.

Die Phosphorsäuregruppen können geschützt oder ungeschützt vorliegen. Acylierungen mit Phosphoaminosäuren sind aus der Peptidchemie bekannt (J.W. Perich in "Peptides and Protein Phosphorylation", (B.E. Kemp, Hrsg.), Kap. 12, S. 289-314, CRC Press, Boca Raton (1990)). Die Methode ist bisher ausschließlich auf kurze Peptide angewandt worden. Beispielhafte Strukturformeln von Phosphoinsulinen, die mit diesem Verfahren dargestellt werden können, sind in Fig. 3 und 4 wiedergegeben.

Der Fortschritt des Verfahrens betrifft die gezielte Phosphorylierung eines Proteins mit strukturell und chemisch anspruchsvoller Zusammensetzung durch Acylierung mit Phosphoaminosäuren. Die gezielte Einführung des phosphorylierten Aminosäurederivates erfordert den selektiven Schutz freier Aminogruppen der Insulinsequenz. Das native Insulinmolekül besitzt Aminogruppen in den Positionen A1, B1 und B29. Die Synthese phosphorylierter Polypeptide in Lösung ist wegen Löslichkeitsproblemen oft schon auf eine Sequenzlänge von 10-15 Aminosäuren beschränkt (L. Otvos et al., Int. J. Pep. Prot. Res., Band 34, S. 129-133 (1989)). Zusätzlich bereiten Dephosphorylierungen durch das Nucleophil Piperidin bei der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Probleme (E.A. Kitas et al., J. Chem. Soc. Commun., S. 338-339 (1991)). Das Gelingen der Phosphorylierung des Insulins ist überraschend, da bereits die Acylierung kurzer Peptidsequenzen mit Phosphoaminosäuren nicht trivial ist und sich in Lösung durch Acylierungs- und Löslichkeitsprobleme erhebliche Einschränkungen hinsichtlich des Produktspektrums ergeben. Bei Insulin müssen zudem noch die Zweikettenstruktur und die Anwesenheit einer Reihe potentieller Acylierungsstellen berücksichtigt werden.

Als Insulin-Ausgangsmaterialien kommen die unter a) genannten Insulinderivate in Frage.

Variante c)

Die Herstellung der Insulinderivate der Formel I kann dadurch erfolgen, daß man ein Insulin oder Insulinderivat mit Phosphorylierungsreagenzien wie Phosphorsäure, Phosphorsäure anhydride, Phosphorylhalogenide und Phosphoamidite oder deren Derivate, vorzugsweise 100%ige Phosphorsäure, Phosphorylchlorid, Diaryl- und Dialkylphosphoamidit zu entsprechenden phosphorylierten Insulinen und deren Derivaten umsetzt.

Wenn Phosphoamidite, Phosphine oder den Derivate eingesetzt werden, wird anschließend eine Oxidation von ^IIIP zu ^VP mit Oxidationsmitteln wie Iod oder Selendioxid durchgeführt.

Das Verfahren der globalen Phosphorylierung erfordert eine präparative Trennung des Produktgemisches in Einzelsubstanzen. Die Trennung kann durch Ionenaustausch- Chromatographie, RP-Kieselgel-Chromatographie, Metall-Chelat-Chromatographie, Elektrophorese oder isoelektrische Fokussierung in an sich bekannter Weise erfolgen.

Das Verfahren wurde gegenüber den beschriebenen Methoden dadurch erheblich verbessert, daß eine Umsatzkontrolle während der Reaktion durch Bestimmung des Wassergehaltes des Reaktionsmediums, vorzugsweise mittels Karl-Fischer-Titration, durchgeführt wurde. Auch eine Schädigung der Proteine durch säurekatalysierte Hydrolyse wird dadurch eingeschränkt.

Das Gelingen und der Fortschritt des Verfahrens bei der Kontrolle des Wassergehaltes sind unerwartet, da das Wasser selber in sehr geringer Konzentration vorliegt und kein unmittelbarer Reaktionspartner bei der Phosphorylierung ist. Durch die Umsatzkontrolle wird die Bildung eines komplexen Gemisches phosphorylierter Insuline und deren Derivate, bedingt durch die vielfältigen Reaktionsmöglichkeiten des Insulins, vermieden. Solche Gemische sind bis jetzt noch nicht nachweislich in Reinsubstanzen getrennt worden.

Aus den Ausgangsinsulinen entstehen nach den erfindungsgemäßen Verfahren a) bis c) in guten bis hohen Ausbeuten die entsprechenden phosphorylierten Insuline und deren Derivate.

Die Endprodukt-Isolierung erfolgt bevorzugt durch chromatographische Verfahren mittels Gelpermeations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und RP-Kieselgel- Chromatographie oder durch präparative isoelektrische Fokussierung.

Erfindungsbeispiele Beispiel 1 (Variante a) Synthese von [Tyr(p)^B30]-Insulin

5 g Phosphotyrosin werden in einer Mischung aus 5,625 ml Ethanol, 5,625 ml N,N-Dimethylformamid und 6,250 ml Wasser suspendiert und durch Zugabe von 1,2 ml Triethylamin gelöst. Der apparente pH-Wert beträgt 7,1 (Glaselektrode). Zu dieser Lösung werden langsam unter starkem Rühren 500 mg Humaninsulin und 10 mg Lysylendoproteinase gegeben. Die Umsetzung wird mittels RP-Kieselgel-Chromatographie in dem System 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril verfolgt. Nach 24 h bei 25°C wird die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 10%iger Essigsäure gestoppt.

Die Insulinderivate werden durch Gelpermeations-Chromatographie an Sephadex®G-50 (125 cm·2,5 cm) in 10%iger Essigsäure abgetrennt. 20 ml der Reaktionslösung werden bei einer Chromatographie aufgetragen. Die Insulinfraktion wird mittels Ionenaustausch- Chromatographie an Q-Sepharose®High Load 16/10 (10 cm·1,6 cm), äquilibriert in 20 mM TRIS/HCl-Puffer (pH 8,0) mit 40% 2-Propanol, getrennt. Die Elution geschieht mit einem 0-0,2 molaren NaCl-Gradienten. Die Fraktion des [Tyr(p)^B30]-Insulins wird in 20 ml 50 mM Ammonium-hydrogencarbonat·NH₃ (pH 9,5) mit 10% 2-Propanol gelöst. Die Entsalzung wird an Sephadex®G-25 (90 cm·2,5 cm) in 50 mM Ammonium-hydrogencarbonat (pH 7,8) durchgeführt. Die Ausbeute nach Gefriertrocknung beträgt 116 mg [Tyr(p)^B30]-Insulin (23%) bei einer chromatographischen Reinheit von 90%. Das Produkt wird durch RP-Kieselgel- Chromatographie in dem System 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril auf eine Reinheit von 98% gebracht (85% Ausbeute).

Beispiel 2 (Variante b) Synthese von [Tyr(p)^B1]-Insulin

183 mg Fmoc-Tyr(p)-OH, 57,9 mg 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat und 78,0 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid werden in 5 ml N,N-Dimethylformamid gelöst. Nach einstündiger Voraktivierung unter Rühren wird der Ansatz zentrifugiert. Der Überstand wird in eine Lösung von 250 mg N^α ^A1,N^ε ^B29-Bis(Msc)-des[Phe^B1]-Insulin in 20 ml N,N-Dimethylformamid, versetzt mit 0,2 ml N-Methylmorpholin, getropft. Das Ausgangsinsulin wurde in an sich bekannter Weise durch selektiven Msc-Schutz der Aminogruppen und Edman-Abbau dargestellt. Nach 3stündigem Schütteln wird der Ansatz unter Kühlung mit 10%iger Essigsäure auf das doppelte Volumen verdünnt; mittels Gelpermeations-Chromatographie an Sephadex®G-25 werden die Insulinderivate von niedermolekularen Verbindungen getrennt. Zur Reinigung wird eine RP-Kieselgel- Chromatographie an Eurosil®-Bioselect in dem System 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/2-Propanol durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 197 mg bei einer chromatographischen Reinheit von 88%. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt durch Lösen von 197 mg des erhaltenen N^α ^A1,N^ε ^B29-Bis(Msc)-[Tyr(p)^B1]-Insulin bei 0°C in 10 ml einer 10%igen wäßrigen Piperidin Losung. Der Ansatz wird langsam geschüttelt, nach 180 Minuten mit 30%iger Essigsäure angesäuert und mittels Gelpermeations- Chromatographie an Sephadex®G-25 getrennt. Zur Reinigung wird eine RP Kieselgel Chromatographie an Eurosil®-Bioselect in dem System 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/2-Propanol durch geführt. Die Ausbeute an [Tyr(p)^B1]-Insulin beträgt 37 mg bei einer chromatographischen Reinheit von 97%.

Beispiel 3 (Variante b) Synthese von [Tyr(p)^N ^α ^A1]-Insulin

166,7 mg Fmoc-Tyr(p)-OH, 52,8 mg 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat und 71,2 mg N,N′- Dicyclohexylcarbodiimid werden in 5 ml N,N-Dimethylformamid gelöst. Nach 1stündiger Voraktivierung wird der Ansatz zentrifugiert und der Überstand langsam in eine Lösung von 200 mg Insulin in 20 ml N,N-Dimethylformamid, versetzt mit 0,16 ml N-Methylmorpholin, getropft. Nach 3stündigem Schütteln wird der Ansatz mit 10%iger Essigsäure auf das doppelte Volumen verdünnt. Die Proteinfraktion wird mittels Gelpermeations- Chromatographie an Sephadex®G-25 abgetrennt und gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 52 mg bei einer chromatographischen Reinheit von 44%. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt durch Lösen von 52 mg des erhaltenen N^α ^A1-Tyr(p)-Insulins bei 0°C in 10%iger wäßriger Piperidin-Lösung. Nach 180 Minuten wird der Ansatz mit 30%iger Essigsäure angesäuert. Anschließend wird das Produkt mittels Gelpermeations-Chromatographie an Sephadex®G-25 und Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Fractogel®TSK, äquilibriert in 20 mM TRIS/HCl (pH 7,8) mit 20% 2-Propanol, getrennt. Die Elution geschieht mit einem 0-0,15 molaren NaCl-Gradienten. Die weitere Reinigung geschieht durch RP-Kieselgel-Chromatographie an Eurosil®-Bioselect in dem System 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/2-Propanol und anschließende Gefriertrocknung. Die Ausbeute beträgt 16,5 mg bei einer chromatographischen Reinheit von 99%.

Beispiel 4 (Variante c) Synthese global phosphorylierter Insuline und deren Derivate

300 mg Humaninsulin werden bei 0°C in 14,25 ml N,N-Dimethylformamid suspendiert. 0,75 ml 100%iger Phosphorsäure werden unter Rühren hinzugetropft, wobei das Insulin in Lösung geht. Dann werden 0,075 ml Phosphorylchlorid in 0,225 ml N,N-Dimethylformamid hinzugetropft. Nach einer Stunde Reaktionszeit wird die Wasserkonzentration mittels Karl- Fischer-Titration bestimmt und beträgt 447 mM. Anschließend werden in einstündigem Abstand zweimal jeweils 0,224 ml Phosphorylchlorid und einmal 0,174 ml Phosphorylchlorid, gelöst in 0,7 ml N,N-Dimethylformamid, langsam zum Reaktionsansatz getropft. 30 Minuten nach der Zugabe wird jeweils eine coulometrische Wasserbestimmung durchgeführt. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 24 h beträgt die Wasser Konzentration 40 mM. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 g Eis abgestoppt. Anschließend wird der pH-Wert des Ansatzes mit 10 M NaOH auf pH 7,4 eingestellt und das Gesamtvolumen mit Wasser auf 75 ml gebracht. Der Ansatz wird 5 h gegen 50 mM Ammonium-hydrogencarbonat- Lösung und 16 h gegen Wasser dialysiert. Die Proteiniösung wird im Vakuum eingeengt, durch Gelpermeations-Chromatographie an Sephadex®G-25 in 50 mM Ammonium hydrogencarbonat-Lösung (pH 7,8) gereinigt und gefriergetrocknet. Die Ausbeute an phosphorylierten Insulinen beträgt 311 mg. Die weitere Reinigung erfolgt durch Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Fractogel®TSK, äquilibriert in 20 mM TRIS/HCl-Puffer (pH 7,8) mit 20% 2-Propanol. Die Elution geschieht mit einem 0-0,2 molaren NaCl-Gradienten. Die Entsalzung erfolgt durch Gelpermeations- Chromatographie an Sephadex®G-25. Die Fraktionen werden mittels präparativer isoelektrischer Fokussierung an Sephadex®G-75 im entsprechenden pH-Bereich in einzelne Verbindungen aufgetrennt. Die Fokussierung erfolgt in 6M Harnstofflösung innerhalb von 20 h bei einer Spannung von 100-600 V. Die erhaltenen Fraktionen werden durch Gelpermeations-Chromatographie an Sephadex®G-25 entsalzt.

Claims

1. Phosphorylierte Insuline der Formel I Ins-OPO₃RR′)_x (I)in welcher

2. Verfahren zur Herstellung von Insulinderivaten der Formel I gemäß der Definition in Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin oder Insulinderivate, vorzugsweise die Sequenzen des Human-, Schweine- oder Rinderinsulins enthaltend, mit einem O-phosphorylierten Aminosäurederivat oder Peptid und Lysylendoproteinase in Kontakt bringt, wobei die Aminosäure in Position B30 gegen das phosphorylierte Aminosäurederivat oder Peptid ausgetauscht (Transpeptidierung) bzw. neu eingeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Reaktionsmischung zwischen 0 und 40°C, vorzugsweise zwischen 20 und 30°C, liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzyme für die enzymatische Abspaltung gegebenenfalls Carboxypeptidase A, Achromobacter-Protease und/oder Trypsin verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Verhältnis von Enzymmenge zu Insulin-Eduktmenge zwischen 0,0001 und 1 mg/mg, vorzugsweise zwischen 0,005 und 0,2 mg/mg, eingestellt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der apparente pH-Wert der Reaktionslösung zwischen 4 und 10, vorzugsweise zwischen 7 und 9, liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Insulin-Edukte zwischen 1 und 250 mg/ml, insbesondere zwischen 5 und 20 mg/ml, liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt des wäßrig organischen Lösungsmittelgemisches, in dem außer Wasser, Ethanol und N,N-Dimethylformamid auch Dimethylsulfoxid, Acetonitril, 1,4-Butandiol, Methanol oder andere polare Lösungsmittel verwendet werden können, zwischen 20 und 80%, insbesondere zwischen 40 und 60%, eingestellt wird.

9. Verfahren zur Herstellung von Insulinderivaten der Formel I gemäß der Definition in Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin oder Insulinderivate, vorzugsweise die Sequenzen des Human-, Schweine- oder Rinderinsulins enthaltend, einer gezielten Acylierung unterwirft, welche entweder mit aktivierten oder unter Aktivierung von phosphorylierten Aminosäurederivaten oder phosphorylierten Peptiden durchgeführt wird, wobei vorhandene freie COOH-, OH-, SH-, NH₂-, Guanido- und/oder Imidazol-Funktionen in an sich bekannter Weise geschützt vorliegen können.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Reaktionsmischung zwischen -10 und 50°C, bevorzugt zwischen 20 und 30°C, liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Acylierungsmittels zwischen 1 und 1000 mM, insbesondere zwischen 10 und 100 mM, liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der apparente pH- Wert der Lösung zwischen 4 und 10, bevorzugt zwischen 6 und 8, liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Insulin-Edukte zwischen 0,1 und 100 mM, bevorzugt zwischen 1 und 10 mM, liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Methanol, Ethanol, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, 1,4-Butandiol oder ein anderes polares Lösungsmittel verwendet wird.

15. Verfahren zur Herstellung von Insulinderivaten der Formel I gemäß der Definition in Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin oder Insulinderivate, vorzugsweise die Sequenzen des Human-, Schweine-, oder Rinderinsulins enthaltend, unter Kontrolle der Umsetzungsrate durch Messung des Wassergehaltes mit einem phosphorylierenden Reagenz umsetzt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Wassergehalt der Reaktionslösung mittels Karl-Fischer-Titration bestimmt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulinderivate mit phosphorylierenden Reagenzien wie Phosphorsäure, Phosphorsäureanhydride, Phosphorylhalogenide und Phosphoamidite zu entsprechenden phosphorylierten Insulinen und deren Derivaten umsetzt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphory lierungsreagenz 100%ige Phosphorsäure, Phosphorylchlorid, Diaryl- und Dialkyl phosphoamidit eingesetzt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Reaktionsmischung zwischen -10 und 50°C, vorzugsweise zwischen 20 und 30°C, liegt.

20. Verfahren nach Anspruch 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Phosphorylierungsreagenzes zwischen 1 und 1000 mM, insbesondere zwischen 10 und 100 mM,liegt.

21. Verfahren nach Anspruch 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserkonzentration der Reaktionslösung zwischen 0 und 500 mM, vorzugsweise zwischen 10 und 100 mM, liegt.

22. Verfahren nach Anspruch 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Insulin-Edukte zwischen 0,1 und 100 mM, bevorzugt zwischen 1 und 10 mM, liegt.

23. Verfahren nach Anspruch 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphorylierung in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Ethanol, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, 1,4-Butandiol oder einem anderen polaren Lösungsmittel durchgeführt wird.

24. Verwendung der Insulinderivate und deren physiologisch verträglicher Salze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 23 als Wirkstoffe für pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung von Diabetes mellitus.

25. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Insulinderivat der Formel I und/oder mindestens eines von deren physiologisch verträglichen Salzen gemäß der Definition in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 23 in gelöster, amorpher und/oder kristalliner - vorzugsweise in amorpher und/oder kristalliner - Form.

26. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 25, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer der folgenden - unter die Formel I fallenden - Insulinderivate: [Tyr(p)^B30]-Humaninsulin
[Tyr(p)^B1]-Humaninsulin
[Tyr(p)^N ^α ^A1]-Humaninsulinsowie deren physiologisch verträglichen Salzen.

27. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 25 oder 26 als Injektionslösung bzw. -suspension mit einem pH-Wert zwischen 3,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen 5,0 und 8,5.

28. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Insulinderivat der Formel I und/oder mindestens eines von deren physiologisch verträglichen Salzen, gegebenenfalls mit anderen modifizierten und/oder unmodifizierten Insulin(derivat)en, mit einem physiologisch annehmbaren Träger sowie gegebenenfalls geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.