CN102245624A - 基于酰胺的胰岛素前药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供胰岛素和胰岛素类似物的前药制剂，其中胰岛素肽已通过酰胺键连接二肽前药元件来修饰。本文公开的前药具有至少10小时、更通常大于2小时、20小时和小于70小时的延长半寿期，并且在生理条件下通过由化学不稳定性驱动的非酶促反应转化成活性形式。

Description

基于酰胺的胰岛素前药
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2008年12月19日提交的美国临时专利申请号61/139,218的优先权权益，该申请的公开内容通过引用以其整体明确结合到本文中。
背景发明
胰岛素是一种肽激素，由二链异二聚体组成，所述异二聚体以生物合成方式由低效能单链胰岛素原前体通过酶加工获得。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“A链”(SEQ ID NO：1)和“B链”(SEQ ID NO：2))组成，共有51个氨基酸。B链的C端区和A链的2个末端区以三维结构缔合装配成以高亲和力结合胰岛素受体的部位。
对于几乎所有形式的糖尿病，胰岛素都具有无以伦比的降低葡萄糖的能力。遗憾的是，其药理学并不是葡萄糖敏感性的，因此它能够产生可导致危及生命的低血糖症的过度作用。不稳定的药理学作用是胰岛素疗法的标志，使得要使血糖正常化而又不发生低血糖症极为困难。此外，天然胰岛素的作用持续时间短，而且天然胰岛素需要修饰使之适用于基础葡萄糖的控制。已确立的延迟胰岛素起效的方法包括降低溶解度和白蛋白结合。
例如，已制备了两种市售的胰岛素衍生物以提供较长的作用特征。更具体地讲，制备了胰岛素衍生物[GlyA21，ArgB31，ArgB32]胰岛素，以使胰岛素的pI由5.4变为6.7，导致该肽在生理pH下沉淀，由此迟缓吸收和作用时间(参见Bolli等，Diabetologia 1999，42，1151-1167)。然而，这种胰岛素衍生物的IGF-1亲和力升高，导致增殖作用增强和肿瘤发生的可能性增加。另一种市售的胰岛素衍生物是[LysB29-十四烷酰基，des(B30)]胰岛素，其中LysB29用C14脂肪酸酰化(Mayer等，Peptide Science，88，5，687-713)。脂肪酸链的存在促进肽与血清白蛋白的结合，导致血浆半寿期延长。然而，这种衍生物具有体内效能降低的缺点。另外，两种胰岛素衍生物的生物作用在一名患者与另一患者间具有差异。
前药化学法为在从给药部位清除并在血浆中以高度限定的浓度平衡后精确控制胰岛素作用的开始和持续时间提供了机会。与现有的长效胰岛素类似物和制剂相比，该方法的主要优点是胰岛素贮库不是其中进行注射的皮下脂肪组织，而是血液区室。这就排除了现有技术延迟胰岛素衍生物起效所遇到的吸收变化性。这还使通过皮下注射以外的途径给予该肽激素成为可能。
胰岛素与其受体结合将引起生物刺激，但也将通过胰岛素肽的酶促降解而启动胰岛素诱导的药理性质的后续钝化。使用胰岛素前药衍生物的额外优势是这类方法还根据抑制前药被相应受体识别的策略，来延长胰岛素的生物半寿期。尽管这些优势与前药衍生物相关，但是制备这类前药的复杂特性至今一直妨碍有效胰岛素前药衍生物的制备。为了开发成功的前药激素，需要活性部位结构地址(structuraladdress)，其可构成用于前药结构元件可逆附着的基础。该结构地址需提供两个关键特征；(1)选择性化学修饰的潜力，和(2)在脱去前药结构元件时以天然形式提供高度活性的能力。将本文公开的胰岛素前药以化学法转化为可被受体识别的结构，其中该化学转变的速度将决定体内生物作用的开始和持续时间。本申请公开的前药化学法有赖于分子内的化学反应，该反应不依赖其它化学添加剂或者酶或酶抑制剂。
理想的前药在生理条件(例如pH 7.2和37℃)下应可溶于水，并且以粉末形式长期保存时应保持稳定。与母体药物相比，前药还应是免疫沉默的，并具有低活性。前药的活性通常不超过母体药物活性的10％，在一个实施方案中，与母体药物相比，前药的活性小于10％、小于5％、约1％或小于1％。此外，前药当注射到体内时，应在规定时段内定量转化为活性药物。申请人首次公开了符合这些目标中的每一项的胰岛素前药类似物。
发明概述
基于肽的药物是十分有效的药物，其作用持续时间相对较短，治疗指数可变。本公开内容涉及胰岛素前药，其中将前药衍生物设计成起效延迟，而且药物半寿期延长。起效延迟是有利的，因为允许前药在其活化前系统分布。因此，给予前药排除了在给药时由峰值活性引起的并发症，并提高母体药物的治疗指数。
根据一个实施方案，将二肽通过酰胺键与胰岛素肽的活性部位共价连接来制备胰岛素的前药衍生物。在一个实施方案中，二肽在干扰胰岛素与胰岛素受体和IGF-1受体相互作用的能力的位置上与胰岛素肽共价结合。随后在生理条件下且缺乏酶活性时，通过导致二酮哌嗪或二酮吗啉形成的分子内反应除去二肽，恢复多肽的完整活性。
在一个实施方案中，提供具有U-O-胰岛素的通用结构的胰岛素前药，其中U为氨基酸或羟酸，O为通过在U-O和胰岛素肽的胺之间形成酰胺键而与胰岛素肽连接的N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，U-O二肽在A链或B链各自的N端或与A链或B链各自的A19、B16或B25位对应的氨基酸侧链上通过酰胺键结合。在一个实施方案中，选择U-O的结构，其中在生理条件下，在PBS中，在约1小时-约720小时内U-O自胰岛素肽的化学裂解完成至少约90％。在一个实施方案中，在生理条件下，在PBS中，U-O自胰岛素肽的化学裂解半寿期(t1/2)为至少约1小时-约1周。
在一个实施方案中，选择U和O以抑制存在于哺乳动物血清中的酶从胰岛素肽上酶促切割U-O二肽。在一个实施方案中，选择U和/或O，使得在生理条件下，在PBS中，从胰岛素肽对U-O的裂解半寿期不大于在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中从胰岛素肽对U-O的裂解半寿期的两倍(即与不存在DPP-IV蛋白酶的相同条件相比，在该酶存在和生理条件下从胰岛素前药中裂解U-O不会以超过2倍的速率发生)。在一个实施方案中，U、O或U-O与之连接的胰岛素肽的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，U和/或O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，O为N-烷基化氨基酸，但不是脯氨酸。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有以下式I通用结构的化合物：
Figure BPA00001390113300041
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基(heterocyclic))、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有以下式I通用结构的化合物：
Figure BPA00001390113300051
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在一个实施方案中，二肽延伸物包含以下通用结构的化合物：
Figure BPA00001390113300052
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，R3为C1-C8烷基，R4选自H、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环。
根据一个实施方案，提供包含A链和B链的胰岛素前药类似物，其中A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)，B链包含序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ IDNO：14)。A链和B链式中的指称Z和J独立地为H(形成N端胺)或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300061
其中
X14为将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ IDNO：14)序列的N端连接的键，或者X14表示将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)序列的N端连接的选自以下的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQ ID NO：11)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300071
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300072
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300073
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300081
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300082
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300083
其中R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是X、X12、X13、J和Z中的一个并且只有一个包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300091
在一个实施方案中，如果J或Z包含式I的二肽，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为氢。
根据一个实施方案，存在于Z、J、R10、R11或R12上的二肽包含具有下式I通用结构的化合物：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
根据一个实施方案，存在于Z、J、R10、R11或R12上的二肽包含具有下式I通用结构的化合物：
Figure BPA00001390113300101
其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
根据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中胰岛素肽的A链包含序列Z-GIVEQCCTSICSLYQLENX2CN(SEQ ID NO：6)，B链包含选自以下的序列：HLCGSHLVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO：7)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：8)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO：9)，其中Z为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300102
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300111
其中R10为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300112
前提条件是Z和R10不同时为H，且不同时为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300113
根据一个实施方案，提供单链胰岛素前药类似物。在这个实施方案中，人胰岛素B链或其功能类似物的羧基端与人胰岛素A链或其功能类似物的N端共价连接，其中具有以下通用结构的二肽前药部分在肽的N端或者在与A链或B链各自的A19、B16或B25位对应的氨基酸侧链上通过酰胺键共价结合：
Figure BPA00001390113300114
在一个实施方案中，B链通过4-12个或4-8个氨基酸的肽接头与A链连接。
在另一个实施方案中，将胰岛素前药类似物的溶解度通过将亲水部分与肽共价连接来提高。在一个实施方案中，亲水部分与B链的N端氨基酸或与SEQ ID NO：9的28位氨基酸或SEQ ID NO：8的29位氨基酸连接。在一个实施方案中，亲水部分为分子量范围为约500-约40,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)链。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量范围选自约500-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。
酰化或烷基化可增加胰岛素肽在循环中的半寿期。在前药激活时，酰化或烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的起效和/或延长对胰岛素受体的作用持续时间。胰岛素类似物可以在与亲水部分所连接氨基酸位置相同的氨基酸位置上酰化或烷基化，或者在不同的氨基酸位置上酰化或烷基化。
根据一个实施方案，提供包含本文公开的任何新的胰岛素前药类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述胰岛素前药类似物的纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。这类组合物可含有本文公开的A19胰岛素类似物，其浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌并任选装入各种包装容器中保存的含水溶液剂。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干散剂。药物组合物可进一步作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将组合物给予患者的一次性装置。容器或试剂盒可贴上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。
根据一个实施方案，提供调节胰岛素依赖性患者的血糖水平的改进方法。该方法包括按对控制糖尿病治疗有效的量给予本公开内容的胰岛素前药类似物的步骤。在一个实施方案中，将胰岛素前药类似物用分子量范围为约5,000-约40,000道尔顿的PEG链聚乙二醇化。
附图简述
图1是制备人胰岛素的两步合成策略的示意图。该方法的详情见实施例1。
图2是比较合成人胰岛素相对于经纯化的天然胰岛素的胰岛素受体特异性结合的曲线图。图中所提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图3是比较天然胰岛素和A19胰岛素类似物(胰岛素(p-NH2-F)19)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图4是比较天然胰岛素和IGF1(YL)B16B17类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图5是制备IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19类似物(不会被激活)所用的合成流程示意图。
图6是比较IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19和IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19的二肽延伸形式的相对胰岛素受体结合的曲线图，其中二肽AiBAla在A19位上结合(即IGF1(YB16LB17)A19-AiBAla)。
图7A-7C给出按照本公开内容制备的二聚体的活性。图7A显示IGF-1单链二聚体的结构，该二聚体包含通过B链氨基端的侧链间的二硫键连接在一起的2条单链IGFB16B17衍生肽(IGF-1B链[C0H5Y16L17O22]-A链[O9，14，15N18，21]；SEQ ID NO：68)。图7B为显示胰岛素、IGF-1、单链IGFB16B17衍生肽二聚体和二链IGFB16B17衍生肽二聚体的相对胰岛素受体结合的曲线图。图7C为显示胰岛素、IGF-1和二链IGFB16B17衍生肽二聚体诱导胰岛素受体磷酸化的相对活性的曲线图。
图8A-8C显示前药形式的IGFB16B17衍生肽(IGF1A(Ala)6，7，11，20酰胺的(pNH2-F)19上的Aib-Pro)的降解。将二肽在PBS(pH 7.4)中于37℃保温预定长度的时间。在开始保温后20分钟(图8A)、81分钟(图8B)和120分钟(图8C)取出等分量，用0.1％TFA淬灭，然后用分析型HPLC测定。用LC-MS鉴定a峰(IGF1A(Ala)6，7，11，20(pNH2-F)1酰胺)和b峰(IGF1A(Ala)6，7，11，20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺)，并通过峰面积积分来定量。数据表明IGF1A(Ala)6，7，11，20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺随时间自发非酶促地转化成IGF1A(Ala)6，7，11，20(pNH2-F)1酰胺。
图9A和图9B为表示前药Aib，dPro-IGF1YL(通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图9A是比较在PBS中保温的天然胰岛素(于4℃下在1小时时测定)和A19 IGF前药类似物(Aib，dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、2.5小时和10.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图9B是比较在20％血浆/PBS中保温的天然胰岛素(于4℃下在1.5小时时测定)和A19 IGF前药类似物(Aib，dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、1.5小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图10A和图10B为描述前药dK，(N-异丁基G)-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图10A是比较在PBS中保温的天然胰岛素(在4℃下于1小时时测定)和A19 IGF前药类似物(IGF1YL:dK，(N-异丁基G)随时间变化(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图10B是比较在20％血浆/PBS中保温的天然胰岛素(于4℃下在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK，(N-异丁基G)随时间变化(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图11A和图11B为描述前药dK(e-乙酰基)，Sar)-IGF1YL(通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图11A是比较在PBS中保温的天然胰岛素(于4℃下在1小时时测定)和A19 IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基)，Sar)随时间变化(0小时、7.2小时和91.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图11B是比较在20％血浆/PBS中保温的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19 IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基)，Sar)随时间变化(0小时、9小时和95小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19 IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
发明详述
定义
在描述和要求保护本发明时，根据下文给出的定义使用下列术语。
将本文使用的术语“前药”定义为在显示其药理作用之前经历化学修饰的任何化合物。
“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内施加生物作用的多肽。
本文使用的术语“氨基酸”包括既含氨基官能团又含羧基官能团的任何分子，其中氨基和羧酸基连接至同一碳(α碳)上。α碳任选可具有一个或两个其它的有机取代基。未说明其立体化学的情况下对氨基酸的命名意在包括L型或D型氨基酸或外消旋混合物。然而，在氨基酸通过其三字母码命名并包括上标数字的情况下，通过在三字母码和上标数字之前加上小写字母d来指定D型氨基酸(例如dLys-1)，其中缺乏小写字母d的命名(例如Lys-1)意在说明天然L型氨基酸。在该命名法中，加上上标数字表明氨基酸在IGF肽序列中的位置，其中位于IGF序列内的氨基酸用从N端起连续编号的正的上标数字标示。在N端或通过侧链与IGF肽连接的其它氨基酸从0开始编号，并随着其更远离IGF序列，以负整数值递增。例如，与IGF的N端连接的二肽前药内的氨基酸位置标为aa-1-aa0-IGF，其中aa0表示二肽的羧基端氨基酸，aa-1表示二肽的氨基端氨基酸。
本文使用的术语“羟酸”是指已经修饰以用羟基置换α碳氨基的氨基酸。
本文使用的术语“非编码氨基酸”包括不是任何下列20个氨基酸的L-异构体的任何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“二肽”是α氨基酸或α羟酸通过肽键与另一个氨基酸连接形成的化合物。
本文使用的不存在任何其它指称的术语“化学裂解”包括导致共价化学键断裂的非酶促反应。
“生物活性多肽”是指能够体外和/或体内施加生物作用的多肽。
本文所用对肽的一般提及意在包括具有修饰的氨基端和羧基端的肽。例如，标明标准氨基酸的氨基酸序列意在包括N端和C端上的标准氨基酸以及N端上相应的羟酸和/或经修饰包含替换末端羧酸的酰胺基的相应的C端氨基酸。
本文使用的“酰化的”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的酰基的氨基酸，与其制备方法无关。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的，该方法包括在包含入肽前使氨基酸酰化或在肽合成之后接着对肽进行化学酰化。在一个实施方案中，酰基导致肽具有一种或多种以下性质：(i)循环中的半寿期延长、(ii)起效延迟、(iii)作用持续时间延长、(iv)对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进、和(v)对胰岛素肽受体的效能增加。
本文使用的“烷基化的”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的烷基的氨基酸，与其制备方法无关。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的，该方法包括在包含入肽中之前使氨基酸烷基化或肽合成之后接着对肽进行化学烷基化。在不固守任何特定理论的情况下，据认为肽的烷基化将获得与肽的酰化相似(如果不是相同的话)的作用，例如循环中的半寿期延长、起效延迟、作用持续时间延长、对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进和对胰岛素肽受体效能增加。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药用载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水或水/油乳剂)和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府管理机构批准或美国药典录入的用于动物(包括人)的任何物质。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的生物活性的化合物的盐，并且其在生物学或其它方面不是不合乎需要的。本文公开的许多化合物能够通过氨基和/或羧基或其类似基团的存在而形成酸式盐和/或碱式盐。
可由无机和有机碱制备药学上可接受的碱加成盐。仅作为实例，由无机碱得到的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。由有机碱得到的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。
可由无机和有机酸制备药学上可接受的酸加成盐。由无机酸得到的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。由有机酸得到的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。
本文使用的术语“治疗”包括预防特定的病症或病况，或减轻特定病症或病况的相关症状和/或防止或消除所述症状。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”总的来说是指保持葡萄糖血液水平接近正常水平，并可根据既定情况，包括提高或降低血糖水平。
本文使用的“有效的”量或“治疗有效量”的前药是指无毒但足量的前药以提供所需作用。例如一种所需要的作用会是预防或治疗高血糖症。“有效”量在受试者之间不同，这取决于个体的年龄和一般状况、给药方式等。因此，并非总是能指定确切的“有效量”。然而，在任何个体情况下，本领域普通技术人员采用常规实验可确定合适的“有效”量。
术语“胃肠外”意指不通过消化道但通过某些其它途径，例如鼻内、吸入、皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
本文使用的术语“天然胰岛素肽”意在表示包含A链SEQ ID NO：1和B链SEQ ID NO：2的51个氨基酸异二聚体以及包含SEQ ID NO：1和2的单链胰岛素类似物。本文使用的缺乏更多描述性语言的术语“胰岛素肽”意在包括包含A链SEQ ID NO：1和B链SEQ ID NO：2的51个氨基酸异二聚体及其单链胰岛素类似物(包括例如已公布的国际申请WO96/34882和美国专利号6,630,348中公开的单链胰岛素类似物，其公开内容通过引用结合到本文中)，以及包括包含天然A链和/或B链的修饰衍生物的异二聚体和单链类似物，所述修饰衍生物包括A19、B16或B25位上的氨基酸被修饰成4-氨基苯丙氨酸，或者一个或多个选自以下位置的氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B 10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位置中的任何或全部的缺失。本文使用的“胰岛素前药类似物”是指在干扰胰岛素的活性或基于IGF1的胰岛素类似物的活性(例如与胰岛素和IGF-1受体相互作用的能力)的位置上，通过经由酰胺键共价连接二肽来修饰的胰岛素肽(或实施例9中公开的基于IGF1的胰岛素类似物)。
本文使用的术语“单链胰岛素类似物”包括一组结构上相关的蛋白质，其中胰岛素A和B链共价连接。
本文使用的氨基酸“修饰”是指氨基酸的取代、添加或缺失，或者通过在/从氨基酸上添加和/或除去化学基团而对氨基酸的衍生，包括用任何通常存在于人蛋白质中的20个氨基酸以及非典型的或非天然存在的氨基酸取代或添加任何所述氨基酸。非典型氨基酸的商用来源包括Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)，ChemPep Inc.(Miami，FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)。非典型氨基酸可购自商业供应商、从头合成、或者由天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生化。
本文使用的氨基酸“取代”是指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。在本申请全文中，所有通过字母和数字提及的具体氨基酸位置(例如A5位)是指在各自天然人胰岛素A链(SEQ ID NO：1)或B链(SEQ ID NO：2)中A链(例如A5位)或B链(例如B5位)的该位置上的氨基酸，或其任何类似物中相应的氨基酸位置。例如，本文缺乏任何更多详尽描述提及的“B28位”意指其中缺失了SEQ ID NO：2的第一个氨基酸的胰岛素类似物B链相应的B27位。
将本文使用的术语“保守氨基酸取代”在此定义为在下列5组之一内的互换：
I.小的脂族非极性或略有极性的残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性带负电荷的残基及其酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln；
III.极性带正电荷的残基：
His、Arg、Lys、鸟氨酸(Orn)；
IV.大的脂族非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸；
V.大的芳族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。
本文使用的通用术语“聚乙二醇链”或“PEG链”是指呈支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，用通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为9。缺乏任何更多描述的该术语意在包括平均总分子量为500-80,000道尔顿的乙二醇聚合物。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数字后缀联用以表示其大致平均分子量。例如，PEG-5,000是指总分子量平均为约5,000道尔顿的聚乙二醇链。
本文使用的术语“聚乙二醇化的”等术语是指已通过将聚乙二醇链与化合物连接对其天然状态进行修饰的化合物。“聚乙二醇化多肽”是具有与多肽共价结合的PEG链的多肽。
本文使用的“接头”是使两个独立的实体彼此结合的键、分子或分子的基团。接头可为两个实体提供最佳间隔，或者还可提供使两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
本文使用的“胰岛素二聚体”是包含2个胰岛素肽通过接头彼此共价结合的复合体。在缺乏任何限定性语言下使用时，术语胰岛素二聚体既包括胰岛素同二聚体又包括胰岛素异二聚体。胰岛素同二聚体包含2个相同的亚基(各自包含A链和B链)，而胰岛素异二聚体包含2个不同的亚基，然而2个亚基彼此大致相似。
本文使用的术语“C1-Cn烷基”(其中n可为1-6)表示具有一个至指定数目的碳原子的支链或直链烷基。通常C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本文使用的术语“C2-Cn烯基”(其中n可为2-6)表示具有2个至指定数目的碳原子和至少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基(-CH2-CH＝CH2)、1，3-丁二烯基、(-CH＝CHCH＝CH2)、1-丁烯基(-CH＝CHCH2CH3)、己烯基、戊烯基等。
术语“C2-Cn炔基”(其中n可为2-6)是指具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。
本文使用的术语“芳基”是指具有一个或两个芳环的单环或二环碳环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。通过指明碳存在的数目来表示芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语“(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)”是指通过1-3元烷基链与母体部分连接的5-10元芳基。
本文使用的术语“杂芳基”是指含有一个或两个芳环并在芳环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或二环环系。通过指明碳存在的数目来表示杂芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语“(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)”是指通过1-“n”元烷基链与母体部分连接的5或6元杂芳基。
术语“C3-Cn环烷基”是指包含碳和氢原子的非芳族单环或多环，其下标数字表示碳原子存在的数目。例如术语C3-C8环烷基表示环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基化合物。
术语“C3-Cn杂环基”是指含有1-“n-1”个杂原子的环烷基环系，其中杂原子选自氧、硫和氮。例如措词“5元杂环”或“C5杂环”包括但不限于具有一个杂原子的5元杂环(例如噻吩、吡咯、呋喃)；在1，2或1，3位具有两个杂原子的5元杂环(例如唑、吡唑、咪唑、噻唑、嘌呤)；具有3个杂原子的5元杂环(例如三唑、噻二唑)。
本文使用的术语“C3-Cn元环”是指包含共3-“n”个数目的元素彼此连接形成环的饱和或不饱和烃环结构，其中环元素选自C、O、S和N。该术语意在包括环烷基、杂环、芳基和杂芳基。
本文使用的术语“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的一个或多个成员。
本文使用的无更多规定的术语“患者”意在包括任何驯养的温血脊椎动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。
实施方案
本公开内容提供配制成延迟起效和延长胰岛素肽的半寿期，从而改进基础胰岛素肽的治疗指数的胰岛素前药衍生物。本文公开的胰岛素前药化学法允许通过非酶促降解机制激活前药。所公开的前药化学法可与活性部位胺化学缀合形成酰胺，酰胺在二酮哌嗪形成时恢复成为母体胺并释放前药元件。这种新的生物友好型前药化学法在生理条件(例如pH约7，37℃，水性环境)下自发降解，而且不依赖于酶促降解。前药衍生物的持续时间取决于二肽前药序列的选择，因此为前药制剂提供了灵活性。
在一个实施方案中，提供在生理条件下非酶促激活半寿期(t1/2)介于1-100小时之间的前药。本文公开的生理条件意在包括温度为约35-40℃，pH为约7.0-约7.4，更通常包括水性环境中pH为7.2-7.4，温度为36-38℃。在一个实施方案中，在生理条件下能够形成二酮哌嗪的二肽通过酰胺键与胰岛素肽共价连接。
有利的是，裂解速率(由此激活前药)取决于二肽前部分(pro-moiety)的结构和立体化学，还取决于亲核体的强度。本文公开的前药最终将以化学法转化成可被该药物的天然受体识别的结构，其中该化学转化的速度将决定体内生物作用的开始时间和持续时间。本申请公开的前药化学法有赖于不依赖额外化学添加剂或酶的分子内化学反应。转化速度受二肽取代基的化学性质和在生理条件下二肽取代基的裂解所控制。由于生理pH和温度紧紧地调节在严格限定的范围内，因此前药至药物的转化速度表现出高的患者内和患者间再现性。
如本文所公开，提供前药，其中生物活性多肽具有至少1小时、更通常大于20小时但小于100小时的延长半寿期，并且在生理条件下，通过由固有的化学不稳定性驱动的非酶促反应而转变为活性形式。在一个实施方案中，前药的非酶促活化t1/2时间介于1-100小时之间，更通常介于12小时和72小时之间，而在一个实施方案中，通过将前药在磷酸盐缓冲溶液(例如PBS)中于37℃和pH 7.2下保温测定的t1/2介于24-48小时之间。运用公式t1/2＝.693/k，其中‘k’为前药降解的一级速率常数，来计算各种前药的半寿期。在一个实施方案中，前药的活化在酰胺键连接的二肽裂解，并形成二酮哌嗪或二酮吗啉和活性胰岛素肽之后发生。
已经证实由天然或合成氨基酸组成的特定二肽在生理条件下促进分子内分解以释放活性胰岛素肽。二肽可与存在于天然胰岛素的氨基或者与通过天然胰岛素肽修饰而引入胰岛素肽的氨基连接(通过酰胺键)。在一个实施方案中，选择抗存在于哺乳动物血清的肽酶(包括例如二肽基肽酶IV(DPP-IV))切割的二肽结构。因此，在一个实施方案中，与蛋白酶不存在时进行的反应相比，在血清蛋白酶存在下利用生理条件进行反应时，二肽前药元件从生物活性肽上的裂解速率不显著提高(例如大于2X)。因此二肽前药元件自胰岛素肽的裂解半寿期(在生理条件下，在PBS中)不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中二肽前药元件自胰岛素肽的裂解半寿期的2、3、4或5倍。在一个实施方案中，包含DPP-IV蛋白酶的溶液为血清，更具体地讲为哺乳动物血清，包括人血清。
根据一个实施方案，二肽前药元件包含结构U-O，其中U为氨基酸或羟酸，O为N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，U、O或U-O与之连接的胰岛素肽的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，U和/或O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，O为N-烷基化氨基酸但不是脯氨酸。在一个实施方案中，氨基酸O的N-烷基化基团为C1-C18烷基，在一个实施方案中，N-烷基化基团为C1-C6烷基。在一个实施方案中，U-O为包含本文定义的式I结构的二肽。
在一个实施方案中，二肽在选自A链或B链的N端氨基的氨基上或者在存在于胰岛素肽活性部位的氨基酸的侧链氨基上与胰岛素肽连接。根据一个实施方案，二肽延伸物通过存在于或接近活性部位的赖氨酸残基的侧链胺与胰岛素肽共价连接。在一个实施方案中，二肽延伸物通过合成氨基酸或修饰氨基酸连接，其中合成氨基酸或修饰氨基酸具有适于二肽延伸物共价连接的官能团(例如氨基-苯丙氨酸的芳族胺)。根据一个实施方案，二肽在选自A链或B链的N端氨基的氨基上或者在存在于A19、B16或B25位的芳族胺(例如4-氨基-苯丙氨酸残基)的侧链氨基上与胰岛素肽连接。在一个实施方案中，U-O二肽在A19位通过存在于A19位的4-氨基苯丙氨酸结合。
将二肽前药元件设计成在生理条件下和在缺乏酶活性时自发裂解其酰胺键成为胰岛素类似物。在一个实施方案中，二肽延伸物的N端氨基酸包含C-烷基化氨基酸(例如氨基异丁酸)。在一个实施方案中，二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸(例如脯氨酸或N-甲基甘氨酸)。在一个实施方案中，二肽包含N端C-烷基化氨基酸和随后的N-烷基化氨基酸的序列。
申请人发现，在A链19位上的天然酪氨酸上可以容纳选择性插入的4-氨基苯基氨基酸部分而又不损失胰岛素肽的效能(参见图3)。该活性部位氨基随后与本文公开的二肽前药部分进行的化学酰胺化显著降低胰岛素受体结合活性，从而提供胰岛素的合适前药(参见图6，给出IGF1Y16L17(p-NH2-F)A19类似物的数据，已证实该类似物具有与胰岛素(p-NH2-F)A19相当的活性，参见图4)。因此，在一个实施方案中，二肽前药元件通过酰胺键与A194-氨基苯丙氨酸的芳环连接，其中二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，而二肽的N端氨基酸为任何氨基酸。
二肽前药部分还可与胰岛素肽的其它部位连接以制备胰岛素的前药或长效类似物(depot analog)。根据一个实施方案，提供胰岛素前药/长效类似物，其包含A链、B链和通过酰胺键与选自以下的一个或多个位点连接的二肽：A链或B链的N端氨基或者内部氨基酸的侧链氨基，包括例如与存在于A19、B16或B25位上的4-氨基-苯丙氨酸残基的芳族胺连接的二肽。在一个实施方案中，胰岛素肽包含两个二肽元件，其中二所述肽元件任选聚乙二醇化、烷基化、酰化或与长效聚合物连接。在一个实施方案中，二肽包含后接N-烷基化氨基酸的N端C-烷基化氨基酸。
包含胰岛素前药类似物的A链和B链可包含各自肽的天然序列(即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，或者可包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的衍生物，其中所述衍生物包括将A19、B16或B25位上的氨基酸修饰成4-氨基苯丙氨酸和/或一个或多个选自以下位置的氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A19和A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B 17、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30；或者在B1-4和B26-30位置中的任何或全部上的缺失。在一个实施方案中，二肽前药元件与A链或B链的N端氨基连接，其中二肽前药元件的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，而二肽前药元件的N端氨基酸为任何氨基酸，前提条件是如果二肽的C端氨基酸为脯氨酸，则二肽的N端氨基酸包含C-烷基化氨基酸。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含下式I的通用结构：
Figure BPA00001390113300241
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。
在另一个实施方案中，二肽前药元件包含以下通用结构：
Figure BPA00001390113300251
其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是如果式I的二肽通过某一肽的N端胺连接，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸为呈D立体异构体构型的氨基酸。
在一个实施方案中，提供式I的前药元件，其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH，R8为H。在一个实施方案中，R3为C1-C8烷基，R4选自H、C1-C6烷基、CH2OH、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环。在另一个的实施方案中，R5为NHR6，R8为H。
在另一个实施方案中，提供式I的前药元件，其中
R1选自H、C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；R8为H，前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸为非编码氨基酸，在一个实施方案中为呈D立体异构体构型的氨基酸。
在其它实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，R8为H。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8中的至少一个为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；
R8为氢；和
R5为NH2，前提条件是R1和R2两者都不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为NH2，前提条件是R1和R2两者都不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH；和
R8为氢，前提条件是R1和R2两者都不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R2为氢；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是，如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
根据一个实施方案，提供包含胰岛素肽和酰胺连接的二肽的胰岛素前药类似物。更具体地讲，胰岛素前药类似物包含A链序列和B链序列，其中A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQ ID NO：3)或者其类似物，该类似物包含因1-9、1-5或1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18(相对于天然胰岛素A链)，B链序列包含序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)或者其类似物，该类似物包含因1-10、1-5或1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：14序列的序列：B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30(相对于天然胰岛素B链；即SEQ ID NO：14的氨基酸X4相当于天然胰岛素的B5位)。Z和J独立地为H或包含下式I的通用结构的二肽；
Figure BPA00001390113300301
X14或为将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQID NO：14)序列连接的键，或者X14表示选自以下的将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)序列连接的1-4个氨基酸的序列：X9VNQ(SEQ ID NO：21)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中m为选自0-3的整数，X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为H或包含下式I的通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300311
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300312
其中m为选自0-3的整数，X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11为H或包含下式I的通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300313
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300314
其中m为选自0-3的整数，X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12为H或包含下式I的通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300321
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，R13为COOH，B链的羧基端氨基酸具有替代天然α碳羧基的酰胺(CONH2)。在一个实施方案中，X、X12、X13、J和Z中的一个或多个为包含下式I通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300322
而在一个实施方案中，X、X12、X13、J和Z中的两个包含下式I通用结构的二肽：
根据一个实施方案，X、X12、X13、J和Z中的至少一个为包含下式I通用结构的二肽：
而在一个实施方案中，X、X12、X13、J和Z中的一个并且只有一个包含下式I通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300333
(即只有一个二肽前药元件与胰岛素肽连接)。此外，如果二肽前药元件与A链或B链的N端连接(即J或Z中的任一个包含二肽)，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2中的至少一个不为H，而在一个实施方案中，R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，J和Z两者都为H，X12为OH，X13为H或OH，X为NHR10，其中R10为包含式I通用结构的二肽。在另一个实施方案中，A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQ ID NO：3)，B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)，m为1，X12为OH，X13为H或OH，X为NHR10，其中R10为包含式I通用结构的二肽，R13为COOH，B链的羧基端氨基酸具有替代天然α碳羧基的酰胺(CONH2)，其余标记如紧接的上文中所定义。
在一个实施方案中，存在于X、X12、X13、J和Z上的二肽为包含下式I通用结构的二肽：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，如果J或Z包含式I的二肽，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为氢。
在一个实施方案中，R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH，R8为H。根据另一个实施方案，m为1，R8为H，R3为C1-C6烷基，R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在一个实施方案中，m为1，R8为H，R3为C1-C6烷基，R4选自H、C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，X9为苯丙氨酸，且单个二肽延伸物通过A链或B链N端的酰胺键与胰岛素肽连接。在一个备选实施方案中，胰岛素肽包含在A链19位上的4氨基苯丙氨酸取代，且单个二肽延伸物通过在4氨基苯丙氨酸的芳族胺上形成的酰胺键与胰岛素肽连接。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物包含C端酰胺或酯，替换A链和/或B链的C端羧酸酯。
根据一个实施方案，将式I的二肽进一步修饰以包含大的聚合物，其干扰胰岛素类似物与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力。二肽随后裂解从二肽复合体中释放出胰岛素类似物，其中释放的胰岛素类似物具有完整活性。根据一个实施方案，J包含式I的二肽，其中将式I的二肽进一步修饰以包含大的聚合物，其干扰结合的胰岛素类似物与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力。根据一个实施方案，X、X12、X13、J和Z之一包含下式I通用结构的二肽：
其中将式I的二肽聚乙二醇化、烷基化或酰化。在一个实施方案中，J、Z或X中的任一个包含式I的酰化或聚乙二醇化二肽，而在一个实施方案中，J包含式I的酰化或聚乙二醇化二肽。
在一个实施方案中，二肽前药元件在A链或B链的N端通过酰胺键与胰岛素肽共价结合，或者与携带内部氨基酸侧链的胺连接，其中二肽还包含与二肽连接的长效聚合物。在一个实施方案中，胰岛素肽的天然氨基酸被适于与式I的二肽形成酰胺键的氨基酸取代。在一个实施方案中，携带二肽的长效物在选自以下的位置上连接：A14、A19、B16、B28和B29。在一个实施方案中，两个或更多个长效聚合物与单个二肽元件连接。将长效聚合物经选择以具有生物相容性和足够大小，使得通过共价连接二肽修饰的胰岛素肽在给予患者时在注射部位保持螯合和/或不能够与其相应受体相互作用。二肽随后裂解释放出胰岛素肽以与预期靶标相互作用。
根据一个实施方案，长效聚合物选自本领域技术人员已知的生物相容性聚合物。长效聚合物的大小通常约为20,000-120,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物的大小为约40,000-100,000或约40,000-80,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物的大小为约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿。合适的长效聚合物包括但不限于葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、己内酯型聚合物、聚己内酯、聚酐、聚胺、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚二氧杂环己酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚苹果酸、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸及其共聚物、三元共聚物和混合物，以及生物可降解聚合物及其共聚物，包括己内酯型聚合物、聚己内酯和共聚物(其包括聚对苯二甲酸丁二酯)。在一个实施方案中，长效聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和乳酸与乙醇酸的共聚物，而在一个具体实施方案中，长效聚合物为聚乙二醇。在一个实施方案中，长效聚合物为聚乙二醇，且与二肽元件连接的长效聚合物总的分子量约为40,000-80,000道尔顿。
根据一个实施方案，式I的二肽还包含聚环氧乙烷、烷基或酰基。在一个实施方案中，一条或多条聚环氧乙烷链与式I的二肽连接，其中聚环氧乙烷链总的分子量为约20,000-约80,000道尔顿，或40,000-80,000道尔顿或40,000-60,000道尔顿。在一个实施方案中，聚环氧乙烷为聚乙二醇。在一个实施方案中，至少一条分子量约40,000道尔顿的聚乙二醇链与式I的二肽连接。在另一个实施方案中，将式I的二肽用具有足够大小的酰基酰化以结合血清白蛋白，从而在给药时使胰岛素类似物失活。酰基可以是直链或支链的，而在一个实施方案中是C16-C30脂肪酸。例如，酰基可以是C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸中的任一种。在一个实施方案中，酰基是C16-C20脂肪酸，例如C18脂肪酸或C20脂肪酸。
根据一个实施方案，提供提供包含A链序列和B链序列的胰岛素前药类似物，其中A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQ ID NO：3)，B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)，其中
X14选自将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8-R14(SEQ ID NO：14)序列连接的N端胺、X9VNQ(SEQ ID NO：21)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中U为氨基酸或羟酸，O为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300381
其中m为选自0-3的整数，X12选自OH、NH2和OCH3；
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300382
其中m为选自0-3的整数，X13选自H、OH、NH2和OCH3；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；R13和R14独立地为COOH或CONH2。在一个实施方案中，X7和X8两者都为酪氨酸，R13为COOH，B链的羧基端氨基酸具有替代天然α碳羧基的酰胺(CONH2)。
根据一个实施方案，提供包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)或其类似物的化合物，该类似物包含因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18(相对于天然胰岛素A链序列)。在这个实施方案中，X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300391
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，
而且其中R10和Z独立地为H或结构U-O的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，O为N-烷基化氨基酸，其中O通过形成酰胺键与SEQ IDNO：3的肽连接，前提条件是R10和Z不同，且U、O或U-O与之连接的SEQ ID NO：3的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，在生理条件下，在PBS中，二肽从SEQ ID NO：3中的化学裂解在约1小时-约720小时内完成至少约90％。在另一个实施方案中，在生理条件下，在PBS中，U-O自SEQ ID NO：3的化学裂解半寿期(t1/2)为至少约1小时-约1周。在一个实施方案中，化合物还包含通过分子间二硫键或作为重组单链多肽与SEQ ID NO：3的A链连接的胰岛素B链。
二肽元件上的取代基的选择和二肽前药元件的连接位点可影响二肽前药元件从胰岛素肽上进行化学裂解的速率。在一个实施方案中，提供包含A链序列和B链序列的胰岛素前药，其中A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)，B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO：4)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300401
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；和
X14选自键、X9VNQ(SEQ ID NO：21)、VNQ、NQ和Q，X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸，而且其中包含以下结构的二肽前药元件与肽SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的N端氨基酸的α氨基连接：
Figure BPA00001390113300402
前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为氢。在这个实施方案中，提供在生理条件下，在PBS中t1/2为约1小时的化合物，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺。
在其它实施方案中，具有在N端连接的前药元件且t1/2为例如约1小时的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
Figure BPA00001390113300411
其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或者R1和R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
或者，提供包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的A链序列和X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)的B链序列的胰岛素前药，其中二肽前药元件与肽SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：14的N端氨基酸的α氨基连接，且在生理条件下和PBS中显示介于约6-约24小时之间的t1/2。在一个实施方案中，这类化合物包含式I前药元件，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基和芳基，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；和
R5为胺，前提条件是R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8之一为氢。
在另一个实施方案中，提供包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的A链序列和X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)的B链序列的胰岛素前药，其中二肽前药元件与肽SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：14的N端氨基酸的α氨基连接，且在生理条件下和PBS中显示约72-约168小时的t1/2。在一个实施方案中，这类化合物包含式I前药元件，其中
R1选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R2为H；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺或N-取代的胺或羟基；
前提条件是，如果R1为烷基或芳基，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
在一个实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间或者在一个实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；前提条件是R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8中的至少一个为氢。
在一个实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间，或者在一个实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
Figure BPA00001390113300431
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；和
R5为NH2，前提条件是R1和R2两者都不为氢。
在其它实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间，或者在一个实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
Figure BPA00001390113300432
其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4为氢；和
R5为NH2，前提条件是R1和R2两者都不为氢。
在一个实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12-约72小时之间，或者在一个实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中
R1和R2独立选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH，前提条件是R1和R2两者都不为氢。
另外，提供具有与胰岛素A链或B链肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72-约168小时的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：
其中R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是，如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
在一个实施方案中，二肽前药元件与胰岛素肽内部氨基酸的侧链胺连接。在这个实施方案中，t1/2为例如约1小时的前药具有以下结构：
Figure BPA00001390113300442
其中
R1和R2独立地为C1-C8烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
此外，t1/2为例如介于约6-约24小时之间且具有与内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
Figure BPA00001390113300451
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8中的至少一个为氢。
另外，提供t1/2为例如约72-约168小时且具有与胰岛素肽的内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中所述二肽前药元件具有以下结构：
Figure BPA00001390113300461
其中R1选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；前提条件是，如果R1和R2两个均独立地为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1或R2中的任一个通过(CH2)p与R5连接，其中p为2-9。
在一个实施方案中，二肽前药元件与胰岛素肽内部氨基酸的侧链胺连接，其中内部氨基酸包含下式IV的结构：
Figure BPA00001390113300462
其中
n为选自1-4的整数。在一个实施方案中，n为3或4，而在一个实施方案中，内部氨基酸为赖氨酸。在一个实施方案中，二肽前药元件与位于胰岛素肽B链28或29位的氨基酸侧链上的伯胺连接。
在一个实施方案中，提供包含A链序列和B链序列的胰岛素前药，其中A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)，B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQID NO：14)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300471
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为H或包含以下通用结构的二肽：
其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300482
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300483
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300484
X14选自氢(形成N端胺)、X9VNQ(SEQ ID NO：21)、VNQ、NQ和Q，
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸，前提条件是R10、R11和R12中的一个并且只有一个为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300491
根据其中二肽前药元件与芳族氨基酸芳基的氨基取代基连接的一个实施方案，可提供具有所需激活时间的前药制剂。例如，提供包含下式III结构且在生理条件下和PBS中t1/2约为1小时的胰岛素前药：
Figure BPA00001390113300492
其中m为0-3的整数。在其中胰岛素前药包含式III结构并具有这类半寿期的一个实施方案中，
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。在一个实施方案中，m为1。
在一个实施方案中，二肽前药元件通过胰岛素肽芳族氨基酸芳基上存在的胺与胰岛素肽连接，其中t1/2为例如约1小时的前药具有以下结构的二肽：
Figure BPA00001390113300493
其中R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2或OH；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含式III结构且在生理条件下和PBS中t1/2为约6-约24小时的胰岛素前药，其中m为0-3的整数。在其中胰岛素前药包含式III结构并具有这类半寿期的一个实施方案中，
R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基和芳基，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代的胺。在一个实施方案中，m为1。
在一个实施方案中，提供具有通过存在于芳族氨基酸芳基上的胺连接的二肽前药元件且t1/2为例如约6-约24小时的前药，其中所述二肽包含以下结构：
Figure BPA00001390113300501
其中
R1选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含式III结构且在生理条件下和PBS中t1/2为约72-约168小时的胰岛素前药，其中m为0-3的整数。在其中胰岛素前药包含式III结构并具有这类半寿期的一个实施方案中，
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代的胺和羟基。在一个实施方案中，m为1。
在一个实施方案中，提供具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72-约168小时的前药，其中所述二肽包含以下结构：
Figure BPA00001390113300511
其中R1选自氢、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)COOH和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4为氢或与R3形成4-6元杂环；
R8为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在一个实施方案中，胰岛素前药类似物包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQ ID NO：3)的A链序列和X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)的B链序列，其中
X1选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300521
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为酪氨酸；
X8为酪氨酸或苯丙氨酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；而且其中B链包含1-4个氨基酸的羧基端延伸物，其中所述羧基端延伸物包含具有以下结构的氨基酸：
其中m为0-3的整数；
n为1-4的整数；
R12为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300532
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；和
R13为COOH或CONH2。
在一个实施方案中，胰岛素前药类似物包含A链序列和B链序列，所述A链序列包括序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQ ID NO：3)，所述B  链序列包括序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTX10X11-R14(SEQ IDNO：5)，其中J为H(形成N端胺)或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300541
其中X14或是将“J”元件与SEQ ID NO：14连接的键，或者X14表示选自以下的将“J”元件与SEQ ID NO：14连接的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQ ID NO：11)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300542
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300543
其中X12选自OH、OCH3、NH2和NHR11，其中R11为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300551
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300552
其中X13选自H、OH、OCH3、NH2和NHR12，其中R12为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300553
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH；和
R13和R14独立地为COOH或CONH2，前提条件是X12、X13或J中的一个并且只有一个为包含以下通用结构的二肽：
(即只有一个二肽前药元件与胰岛素肽连接)。在一个实施方案中，J为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300562
X和X12各自为OH，X13为H，进一步的前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个备选实施方案中，X12为NHR11，J和X13各自为H，X为OH。在另一个备选实施方案中，X13为NHR12，X和X12各自为OH，J为H。在一个实施方案中，B链包含序列J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQ ID NO：15)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQ IDNO：16)，其中J、X4、X5、X6、X7、X8和X9如紧接的上文中所定义。在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，R4选自H、C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，X4为组氨酸，X5为丝氨酸，X6为组氨酸。
在另一个实施方案中，提供包含Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的A链序列和包含序列X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO：4)的B链序列的胰岛素前药类似物，其中
Z为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300571
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300572
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为包含以下通用结构的二肽：
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
其中R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是X和Z不同时为二肽且X为OH时Z不为H。在一个实施方案中，如果Z为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300581
且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5元杂环，则R1和R2中的至少一个不为H。在一个实施方案中，A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENYCX3(SEQ ID NO：17)，B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQID NO：12)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQID NO：13)。
在一个备选实施方案中，提供包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的A链序列和含有序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：12)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO：13)的B链序列的胰岛素前药类似物，其中X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300582
其中U为氨基酸或羟酸，O为N-烷基化氨基酸；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。在一个实施方案中，U-O表示以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300591
其中R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在另一个实施方案中，X7为酪氨酸，X8为苯丙氨酸，X9为苯丙氨酸，而在又一个实施方案中，X4为组氨酸，X5为丝氨酸，X6为组氨酸。在另一个实施方案中，U-O表示以下通用结构的二肽：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含Z-GIVEQCCTSICSLYQLENX2CX3-R13(SEQ ID NO：18)的A链序列和含有序列X4LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R14(SEQ ID NO：19)的B链序列的胰岛素前药类似物，其中
Z为H或包含以下通用结构的连接酰胺的二肽：
Figure BPA00001390113300601
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300611
其中X选自OH和NHR10；
其中R10为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300612
X3为丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH；和
R13和R14独立地为COOH或CONH2；前提条件是如果Z为H，则X不为OH，且如果X为OH，则Z不为H。在一个实施方案中，R13为COOH，R14为CONH2。在另一个实施方案中，X2为下式III通用结构的氨基酸：
Figure BPA00001390113300621
Z为H，X3为丝氨酸，X4为组氨酸，R13为COOH，R14为CONH2。在又一个实施方案中，
R1选自H和C1-C4烷基；
R2选自H、C1-C6烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，R3为CH3，R4为H，R5为NH2，或者，R5为NH2，R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。根据一个实施方案，胰岛素前药类似物的B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT-R14(SEQ ID NO：8)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT-R14(SEQ ID NO：9)或FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR-R14(SEQ ID NO：10)，其中R14为COOH或CONH2，而在一个实施方案中，R14为CONH2。
在一个实施方案中，提供包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的多肽的胰岛素前药类似物，其中
Z为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300631
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300632
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，X1为苏氨酸，X3为天冬酰胺或甘氨酸，而在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环，前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两个都不为H。
在一个实施方案中，提供包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的多肽的胰岛素前药类似物，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300641
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，如紧接的上文中所定义的A链GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)通过二硫键或作为单链多肽与包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)的B链连接，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为酪氨酸；和
X8为苯丙氨酸。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1、R2和R4独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在一个实施方案中，X1为苏氨酸，X3为天冬酰胺或甘氨酸。
在一个实施方案中，R1选自H和C1-C6烷基，R2选自H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)C(O)NH2、CH2OH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6环烷基)和CH2(C6芳基)R7，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。
根据一个实施方案，提供单链胰岛素前药类似物，其中人胰岛素B链或其功能类似物的羧基端与人胰岛素A链或其功能类似物的N端共价连接，且其中具有以下通用结构的二肽前药部分在肽的N端或在氨基酸侧链(包括例如在对应于各自天然胰岛素A链或B链的A19、B16或B25位的位置)通过酰胺键共价结合：
Figure BPA00001390113300661
根据一个实施方案，单链胰岛素类似物包含式：B-P-A的化合物，其中：B表示人胰岛素的B链或者本文公开的B链的功能类似物或前药类似物之一，A表示人胰岛素的A链或者本文公开的A链的功能类似物或前药类似物之一，P表示包括肽接头在内的接头，其使A链与B链共价连接。在一个实施方案中，接头为约5-约18个、或约10-约14个、或约4-约8个或约6个氨基酸的肽接头。在一个实施方案中，B链通过4-12或4-8个氨基酸的肽接头与A链连接。
在一个实施方案中，式B-P-A的单链胰岛素前药类似物包含具有序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的A链和含有序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)的B链序列，其中J为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300671
其中X14为键或选自以下的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQ IDNO：11)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NHR10和OCH3；其中R10为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300673
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300681
其中X12选自OH、OCH3和NHR11，其中R11为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300682
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300683
其中X13选自H、OH、OCH3和NHR12，其中R12为H或包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300684
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是Z、J、R10、R11或R12中的一个并且只有一个为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300691
(即只有一个二肽前药元件与胰岛素肽连接)。
在一个实施方案中，J为包含以下通用结构的二肽：
Figure BPA00001390113300692
X和X12各自为OH，X13为H，前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个备选实施方案中，X12包含式I的二肽，J和X13各自为H，X为OH。在另一个备选实施方案中，X13包含式I的二肽，X和X12各自为OH，J为H。在另一个实施方案中，X包含式I的二肽，J和X13各自为H，X12为OH。在一个实施方案中，B链包含序列J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQ ID NO：15)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQ IDNO：16)，其中J、X4、X5、X6、X7、X8和X9如紧接的上文中所定义。在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，R4选自H、C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在又一个实施方案中，X4为组氨酸，X5为丝氨酸，X6为组氨酸。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含式：B-P-A的化合物，其中：
B表示包含序列X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO：4)的B链序列或其功能类似物，
A表示包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的A链序列或其功能类似物，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300701
X3为天冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸。
P表示包括肽接头在内的接头，其将A链的氨基端与B链的羧基端共价连接。在一个备选实施方案中，单链胰岛素类似物包含式：A-P-B的化合物，其中：A表示人胰岛素A链或其功能类似物，B表示人胰岛素B链或其功能类似物，P表示包括肽接头在内的接头，其将B链的氨基端与A链的羧基端共价连接。在一个实施方案中，肽接头包含4-8个氨基酸。
根据一个实施方案，肽接头长度为5-18个氨基酸，且包含选自以下的序列：Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO：22)、Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO：23)、Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：32)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO：24)、Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：25)、Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO：26)、Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO：27)、Gly-Gly-Tyr-Pro-GIy-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO：28)、Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO：29)、Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO：30)和Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO：31)。在一个实施方案中，肽接头的长度为7-12个氨基酸且包含序列Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO：22)或Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO：23)。
在另一个实施方案中，肽接头包含选自以下的序列：AGRGSGK(SEQ ID NO：35)、AGLGSGK(SEQ ID NO：36)、AGMGSGK(SEQ IDNO：37)、ASWGSGK(SEQ ID NO：38)、TGLGSGQ(SEQ ID NO：39)、TGLGRGK(SEQ ID NO：40)、TGLGSGK(SEQ ID NO：41)、HGLYSGK(SEQ ID NO：42)、KGLGSGQ(SEQ ID NO：43)、VGLMSGK(SEQ ID NO：44)、VGLSSGQ(SEQ ID NO：45)、VGLYSGK(SEQ ID NO：46)、VGLSSGK(SEQ ID NO：47)、VGMSSGK(SEQ ID NO：48)、VWSSSGK(SEQ ID NO：49)、VGSSSGK(SEQ ID NO：50)、VGMSSGK(SEQ ID NO：51)、TGLGSGR(SEQ ID NO：52)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：53)、KGLSSGQ(SEQ ID NO：54)、VKLSSGQ(SEQ ID NO：55)、VGLKSGQ(SEQ ID NO：56)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：57)、SRVSRRSR(SEQ IDNO：65)、GYGSSSRRAPQT(SEQ ID NO：66)和VGLSKGQ(SEQ IDNO：58)。在一个实施方案中，接头包含GSSSRRAP(SEQ ID NO：67)或SRVSRRSR(SEQ ID NO：65)。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物具有以下氨基酸序列：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa-Cys-Asn(SEQ ID NO：33)或Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa-Cys-Asn(SEQ IDNO：34)，其中Xaa为以下通用结构的氨基酸
Figure BPA00001390113300721
本文公开的胰岛素肽可以为包含通过接头结合的至少2、3或更多个肽的二聚体、三聚体或更高级次的多聚体的部分，其中至少一个或两个肽包含与胰岛素肽连接的二肽前药元件。二聚体可以是同二聚体或异二聚体，包含选自天然胰岛素、天然IGF-1、天然IGF-II和本文公开的胰岛素类似物肽的肽。在一个实施方案中，接头选自双官能巯基交联剂和双官能胺交联剂。在某些实施方案中，接头为PEG，例如5kDa PEG、20kDa PEG。在一些实施方案中，接头为二硫键。
例如，二聚体的每个单体可包含Cys残基(例如位于末端的Cys或位于内部的Cys)，且每个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。二聚体的每个单体代表A链和B链的异二聚体。A链和B链通过二硫键连接，或制备成单链肽。在本发明的一些方面，单体通过末端氨基酸(例如N端或C端)、通过内部氨基酸或通过至少一个单体的末端氨基酸和至少一个其它单体的内部氨基酸连接起来。在具体的方面，单体不通过N端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾对尾(tail-to-tail)”方向连接在一起，其中每个单体的C端氨基酸连接在一起。缀合物部分可与本文所述的任何胰岛素肽(包括二聚体、三聚体或更高级次多聚体)共价连接。
还可修饰本文公开的前药以改进肽在生理pH下肽在水性溶液中的溶解度，同时通过防止肽的肾清除而提高肽的有效持续时间。因为与血浆蛋白质相比，肽的分子大小相对较小，因此肽容易被清除掉。将肽的分子量增加到40kDa以上超过了肾阈，从而显著延长了在血浆中的持续时间。因此，在一个实施方案中，对肽前药作进一步修饰以包含共价连接的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分为血浆蛋白聚环氧乙烷链或免疫球蛋白Fc部分。因此，在一个实施方案中，对本发明公开的前药作进一步修饰以包含一个或多个与氨基酸的侧链共价连接的亲水基团。
根据一个实施方案，通过将亲水部分与B链的N端氨基酸或位于B链羧基端的赖氨酸氨基酸(包括例如SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：13的28位或SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：12的29位)的侧链连接，来进一步修饰本文公开的胰岛素前药。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药类似物，其中通过将亲水部分与肽接头的侧链连接来修饰肽接头的一个氨基酸。在一个实施方案中，修饰氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，肽接头选自TGLGSGQ(SEQ ID NO：39)、VGLSSGQ(SEQ ID NO：45)、VGLSSGK(SEQ IDNO：47)、TGLGSGR(SEQ ID NO：52)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：53)、KGLSSGQ(SEQ ID NO：54)、VKLSSGQ(SEQ ID NO：55)、VGLKSGQ(SEQ ID NO：56)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：57)和VGLSKGQ(SEQ IDNO：58)，且亲水部分(例如聚乙二醇)与肽接头的赖氨酸侧链连接。
在另一个实施方案中，通过将修饰氨基酸加至胰岛素前药B链的羧基端，来进一步修饰本文公开的胰岛素前药类似物，其中对C端加入的氨基酸进行修饰以包含与该氨基酸连接的亲水部分。在一个实施方案中，加到C端的氨基酸为修饰的半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，亲水部分选自血浆蛋白、聚环氧乙烷链和免疫球蛋白的Fc部分。
在一个实施方案中，亲水基团为聚环氧乙烷链，而在一个实施方案中，两个或更多个聚环氧乙烷链与胰岛素前药类似物的两个或更多个氨基酸侧链共价连接。根据一个实施方案，亲水部分在选自以下的位置与本文公开的胰岛素前药类似物的氨基酸侧链共价连接：A9、A14、A15、B22、B28、B29和B链的C端或N端。对于具有多个聚环氧乙烷链的胰岛素前药类似物，聚环氧乙烷链可以在B链的N端氨基酸上连接，或者与位于B链羧基端的赖氨酸氨基酸的侧链连接，或者通过在肽的C端添加单个氨基酸而连接，其中所添加的氨基酸具有与其侧链连接的聚环氧乙烷链。根据一个实施方案，聚环氧乙烷链或其它亲水部分与包含二肽前药元件的两个氨基酸之一的侧链连接。在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有与其侧链胺连接的聚环氧乙烷链的赖氨酸(D或L构型)。
亲水部分的连接
在另一个实施方案中，通过将亲水部分与肽共价连接来提高本文公开的胰岛素类似物的溶解度。可在任何用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的合适条件下，将亲水部分与胰岛素类似物连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原烷基化、迈克尔加成(Michael addition)、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应基(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与目标化合物上的反应基(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)进行的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于将水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、硫氢基、巯基、三氟甲磺酸基、三氟乙磺酸基、氮丙烯(azidirine)、环氧乙烷和5-吡啶基。如果通过还原烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单一活性醛，使得聚合程度受到控制。参见例如Kinstler等，Adv.Drug.Delivery Rev.54：477-485(2002)；Roberts等，Adv.DrugDelivery Rev.54：459-476(2002)；以及Zalipsky等，Adv.Drug.DeliveryRev.16：157-182(1995)。
合适的亲水部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如POG)、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、聚乙二醇单甲醚、一-(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧杂环戊烷、聚-1，3，6-三
Figure BPA00001390113300751
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(PPG)和其它聚环氧烷、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、肠菌酸(colonic acid)或其它多糖聚合物、菲可(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。
根据一个实施方案，亲水部分(例如聚乙二醇链)的分子量选自约500-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量选自约500-约5,000道尔顿、或约1,000-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。在其它示例性的实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约20,000-约40,000道尔顿。
在一个实施方案中，将葡聚糖用作亲水部分。葡聚糖是主要通过α1-6连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。可得到许多分子量范围的葡聚糖，例如约1kD-约100kD，或约5、10、15或20kD至约20、30、40、50、60、70、80或90kD。
考虑了直链或支链聚合物。缀合物的所得制备物可以是基本单分散性的或多分散性的，且可具有每个肽约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
根据一个实施方案，本文公开的胰岛素前药类似物被氨基酸取代进一步修饰，其中取代氨基酸包含适于与亲水部分(包括例如聚乙二醇)交联的侧链。在一个实施方案中，在待亲水部分连接的胰岛素前药类似物位置上的氨基酸被天然或合成氨基酸取代(或加在C端上)，以引入亲水部分或使亲水部分容易连接。例如，在一个实施方案中，在选自A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B21、B22、B26、B27、B28、B29和B30的位置上的天然氨基酸被赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基取代(或将赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基加在C端上)，以供聚乙二醇链共价连接。
在一个实施方案中，胰岛素前药类似物具有单个加在B链的羧基端上的半胱氨酸残基，或者胰岛素前药类似物被至少一个半胱氨酸残基取代，其中将所述半胱氨酸残基的侧链用巯基反应性试剂进一步修饰，所述巯基反应性试剂包括例如马来酰亚胺基、乙烯砜、2-吡啶基巯基、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可含有羧基、酮基、羟基和醚基团以及其它亲水部分，例如聚乙二醇单元。在一个备选实施方案中，胰岛素前药类似物具有单个加到B链的羧基端上的赖氨酸残基，或者胰岛素前药类似物被赖氨酸取代，以及使用胺反应性试剂例如羧酸的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)或亲水部分(例如聚乙二醇)的醛对取代赖氨酸残基的侧链进行进一步修饰。
在其中胰岛素前药类似物包含聚乙二醇链的实施方案中，聚乙二醇链可呈直链的形式，或者其可以是支链的。根据一个实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约20,000-约60,000道尔顿。多条聚乙二醇链可与胰岛素前药类似物连接以提供具有最佳溶解度和血液清除特征的胰岛素前药类似物。在一个实施方案中，胰岛素前药类似物与平均分子量为约20,000-约60,000道尔顿的单一聚乙二醇链连接。在另一个实施方案中，胰岛素前药类似物与两条聚乙二醇链连接，其中两条链总的平均分子量为约40,000-约80,000道尔顿。在一个实施方案中，平均分子量为20,000或60,000道尔顿的单一聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接。在另一个实施方案中，单一聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，且平均分子量为约40,000-约50,000道尔顿。在一个实施方案中，两条聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，其中第一条和第二条聚乙二醇链各自的平均分子量为20,000道尔顿。在另一个实施方案中，两条聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，其中第一条和第二条聚乙二醇链各自的平均分子量为40,000道尔顿。
在另一个实施方案中，提供包含与肽共价结合的两条或更多条聚乙二醇链的胰岛素前药类似物，其中聚乙二醇链的总分子量为约40,000-约60,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化胰岛素前药类似物包含与选自B链N端的一个或多个氨基酸和/或SEQ ID NO：9的28位或SEQ ID NO：8的29位连接的聚乙二醇链，其中PEG链总的分子量为约40,000-约80,000道尔顿。
根据一个实施方案，胰岛素肽或其前药/长效衍生物与辅助肽融合，所述辅助肽能够形成类似于化学性PEG(例如重组PEG(rPEG)分子)的延伸构象，例如国际专利申请公开号WO2009/023270和美国专利申请公开号US2008/0286808中披露的辅助肽。rPEG分子不是聚乙二醇。在一些方面，rPEG分子是包含一个或多个甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸的多肽。在一些方面，rPEG是均聚物，例如聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其它实施方案中，rPEG包含重复的两种氨基酸，例如聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-A1a)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些方面，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如聚(Gly-Ser-Glu)。在具体的方面，rPEG延长胰岛素肽的半寿期。在一些方面，rPEG包含净的正电荷或净的负电荷。在一些方面，rPEG缺乏二级结构。在一个实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸，而在一个实施方案中，长度为约40-约50个氨基酸。在一些方面，辅助肽通过肽键或蛋白酶切割位点与本发明肽的N端或C端融合，或者插入本发明肽的环中。在一些方面，rPEG包含亲和标签或与大于5kDa的PEG连接。在一个实施方案中，rPEG赋予本发明肽增加的流体动力学半径、血清半寿期、蛋白酶抗性或溶解度，而在一些方面赋予肽降低的免疫原性。
根据一个实施方案，提供胰岛素前药类似物，其中血浆蛋白与该肽的氨基酸侧链共价连接以改进胰岛素前药类似物的溶解度、稳定性和/或药代动力学。例如，血清白蛋白可与本文提供的胰岛素前药类似物共价结合。在一个实施方案中，血浆蛋白与B链的N端和/或与SEQ ID NO：9的28位或SEQ ID NO：8的29位对应的氨基酸共价结合。
根据一个实施方案，提供胰岛素前药类似物，其中代表免疫球蛋白分子的Fc部分的线性氨基酸序列与本文公开的胰岛素前药类似物的氨基酸侧链共价连接，以改进胰岛素前药类似物的溶解度、稳定性和/或药代动力学。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可与B链的N端、或者A链或B链的C端、或者已末端延伸的A链或B链的C端共价结合。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可与B链的C端共价结合，包括例如与相当于SEQ ID NO：9的28位或SEQ ID NO：8的29位的氨基酸连接。Fc部分通常自IgG中分离，但是来自任何免疫球蛋白的Fc肽片段应起等同作用。
在本发明的一个具体方面，通过对胰岛素前药类似物的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基进行直接烷基化或酰化，来对胰岛素前药类似物进行修饰以包含烷基或酰基。在一个实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基对胰岛素前药类似物进行直接酰化。在一个实施方案中，在选自以下的一个或多个位置上进行酰化：A9、A14、A15、B22、B28或B29。在这点上，酰化胰岛素前药类似物可包含SEQ ID NO：3的A链氨基酸序列和SEQ ID NO：5的B链，或者SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5的修饰氨基酸序列，其中A9、A14、A15、B22、B28或B29位上的至少一个氨基酸被修饰成为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，通过B28或B29位氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰岛素前药类似物的直接酰化。在又一个的实施方案中，胰岛素前药类似物包含与存在于B28或B29位上的Lys的ε-氨基结合并具有1-24个碳原子的羧酸的酰基。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药类似物，其中通过对肽接头的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基进行直接酰化，来修饰肽接头的氨基酸之一以包含酰基。根据一个实施方案，单链胰岛素类似物的肽接头选自AGRGSGK(SEQ ID NO：35)、AGLGSGK(SEQ ID NO：36)、AGMGSGK(SEQ ID NO：37)、ASWGSGK(SEQ ID NO：38)、TGLGSGQ(SEQ ID NO：39)、TGLGRGK(SEQ ID NO：40)、TGLGSGK(SEQ ID NO：41)、HGLYSGK(SEQ ID NO：42)、KGLGSGQ(SEQ ID NO：43)、VGLMSGK(SEQ ID NO：44)、VGLSSGQ(SEQ ID NO：45)、VGLYSGK(SEQ ID NO：46)、VGLSSGK(SEQ ID NO：47)、VGMSSGK(SEQ ID NO：48)、VWSSSGK(SEQ IDNO：49)、VGSSSGK(SEQ ID NO：50)、VGMSSGK(SEQ ID NO：51)、TGLGSGR(SEQ ID NO：52)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：53)、KGLSSGQ(SEQ ID NO：54)、VKLSSGQ(SEQ ID NO：55)、VGLKSGQ(SEQ ID NO：56)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：57)和VGLSKGQ(SEQ IDNO：58)，其中A链中、B链中或连接肽中的至少一个赖氨酸残基通过酰化被化学修饰。在一个实施方案中，酰化基团包含1-5个、10-12个或12-24个碳的链。
根据一个实施方案，进一步修饰本文公开的胰岛素前药类似物以将其它化合物与该类似物的前药二肽部分连接。在一个实施方案中，将包含二肽前药元件的氨基酸侧链聚乙二醇化、酰化或烷基化。在一个实施方案中，二肽用包含1-5个、10-12个或12-24个碳的链的基团酰化。在一个实施方案中，二肽用40-80KDa聚乙二醇链进行聚乙二醇化。在一个实施方案中，二肽前药元件是聚乙二醇化的，且与二肽连接的胰岛素肽是酰化的，包括例如B链C端赖氨酸的酰化。根据一个实施方案，亲水部分或螯合大分子与包含以下通用结构的二肽的R2侧链共价连接：
Figure BPA00001390113300791
其中R2选自(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C1-C4烷基)NH2。在一个实施方案中，R2为(C3-C4烷基)NH2。螯合大分子为本领域技术人员所知，包括葡聚糖和大分子量聚乙二醇(即大于或等于80KDa)。通过将螯合大分子与二肽部分连接，前药将保持螯合，同时活性胰岛素肽根据二肽酰胺键裂解的动力学慢慢释放。
本公开内容还包括其它缀合物，其中本发明的胰岛素前药类似物任选通过共价结合和任选通过接头与缀合物连接。可通过共价化学键；诸如静电、氢、离子、范德瓦尔斯或者疏水或亲水相互作用等物理力实现连接。可采用各种非共价偶联系统，包括生物素-链霉亲和素、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞黏着分子配偶体；或彼此具有亲和力的其任何结合配偶体或片段。
示例性缀合物包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向肽、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记物(例如放射性同位素、荧光团或酶标记物)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其它治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，提供包含本公开内容的胰岛素前药类似物和血浆蛋白的缀合物，其中所述血浆蛋白选自白蛋白、运铁蛋白和血纤蛋白原。在一个实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分是白蛋白或运铁蛋白。在一个实施方案中，接头包含长为1-约60个原子、或1-30个原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子或10-20个原子的链。在一个实施方案中，链原子全部为碳原子。在一个实施方案中，接头骨架中的链原子选自C、O、N和S。可以根据其预计的溶解度(亲水性)来选择链原子和接头，使得提供更易溶解的缀合物。在一个实施方案中，接头提供受到存在于靶组织或器官或细胞的酶或其它催化剂或水解条件裂解的官能团。在一个实施方案中，接头的长度足够长以减小位阻的可能性。如果接头为共价键或肽基键，且缀合物为多肽，则整个缀合物可为融合蛋白。这类肽基接头可以为任何长度。示例性接头的长度为约1-50个氨基酸、5-50、3-5、5-10、5-15或10-30个氨基酸。或者这类融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法产生。
缀合物和融合物
本公开内容还包括其它缀合物，其中本文公开的胰岛素类似物任选通过共价结合和任选通过接头与缀合物部分连接。可以通过共价化学键；诸如静电、氢、离子、范德瓦尔斯或疏水或亲水相互作用等物理力实现连接。可以采用各种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞黏着分子配偶体；或彼此具有亲和力的其任何结合配偶体或片段。
可以通过使肽的靶定氨基酸残基与有机衍生剂反应将肽与缀合物部分经由直接共价键连接，所述有机衍生剂能够与选定侧链或这些靶定氨基酸的N端或C端残基反应。肽或缀合物上的反应基包括例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其它衍生剂。或者，缀合物部分可以通过中间载体(例如多糖或多肽载体)与肽间接连接。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物以及这些氨基酸和其它氨基酸(例如丝氨酸)的混合聚合物，以给所得到的负载载体提供所需要的溶解度性质。
半胱氨酰基残基最常与诸如氯乙酸或氯乙酰胺等α-卤代乙酸酯(和相应的胺)反应，得到羧基甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸(chloroacetylphosphate)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化合物、甲基2-吡啶基二硫化合物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-
Figure BPA00001390113300811
-1，3-二唑反应，来使半胱氨酰基残基衍生化。
通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应使组氨酰残基衍生化，因为该衍生剂对组氨酰基侧链相对具有特异性。对溴代苯甲酰甲基溴也是可用的；该反应优选在0.1M二甲胂酸钠中于pH 6.0进行。
使赖氨酰残基和氨基端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。与这些衍生剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于使含有α-氨基的残基衍生化的其它合适试剂包括亚氨酸酯例如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
通过与一种或若干种常用试剂(其中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮)反应来修饰精氨酰残基。因胍官能团的高pKa所致，精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可对酪氨酰残基进行特异修饰，其中特别关注的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基。最常见的是分别使用N-乙酰基咪唑(acetylimidizole)和四硝基甲烷形成O-乙酰基酪氨酰基类和3-硝基衍生物。
通过与诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮
Figure BPA00001390113300821
-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺等碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)(其中R和R′为不同的烷基)反应，选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)。此外，通过与铵离子反应，将天冬氨酰残基和谷氨酰残基转化成天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页(1983))、天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺化；N端胺的乙酰化和/或C端羧酸基的酰胺化或酯化。
另一种类型的共价修饰包括将糖苷与肽进行化学偶联或酶促偶联。可将糖连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基(例如半胱氨酸的巯基)，(d)游离羟基(例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基)，(e)芳族残基(例如酪氨酸或色氨酸的芳族残基)，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法披露于1987年9月11日公布的WO87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)。
可与本文所述的任何胰岛素类似物连接的示例性缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记(例如放射性同位素、荧光团或酶标记)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其它治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，提供包含本文公开的胰岛素类似物和血浆蛋白的缀合物，其中血浆蛋白选自白蛋白、运铁蛋白、血纤蛋白原和球蛋白。
在一个实施方案中，接头包含长为1-约60个原子、或1-30原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子或10-20个原子的链。在一个实施方案中，链原子全部为碳原子。在一个实施方案中，接头骨架中的链原子选自C、O、N和S。可根据其预期的溶解度(亲水性)来选择链原子和接头，以提供更易溶解的缀合物。在一个实施方案中，接头提供受到存在于靶组织或器官或细胞中的酶或其它催化剂或水解条件裂解的官能团。在一个实施方案中，接头的长度足够长以减小位阻的可能性。如果接头为共价键或肽基键，且缀合物为多肽，则整个缀合物可为融合蛋白。这类肽基接头可以为任何长度。示例性接头的长度为约1-50个氨基酸、5-50、3-5、5-10、5-15或10-30个氨基酸。或者，这类融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法产生。
如上所述，在一个实施方案中，胰岛素类似物是缀合的，例如与免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)融合。已知的免疫球蛋白(Ig)类型包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C端区，其负责与具有诸如再循环(其导致半寿期延长)、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)等活性的Fc受体结合。
例如，根据某些定义，人IgG重链Fc区自Cys226延伸到重链的C端。“铰链区”一般自人IgG1的Glu216延伸到Pro230(可通过比对参与半胱氨酸结合的半胱氨酸，来将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包括2个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常自氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常自氨基酸342延伸至氨基酸447。所提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或者区段的氨基酸编号都基于Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Public Health，Bethesda，Md。在一个相关的实施方案中，Fc区可包含免疫球蛋白重链的一个或多个天然或修饰的恒定区(除CH1以外)，例如IgG和IgA的CH2和CH3区，或者IgE的CH3和CH4区。
合适的缀合物部分包括包含FcRn结合部位的免疫球蛋白序列的部分。FcRn，一种补救受体，负责使免疫球蛋白再循环，并将其送回血液循环中。根据X-射线晶体学，已描述了结合FcRn受体的IgG Fc部分的区域(Burmeister等，1994，Nature 372：379)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2和CH3结构域的连接点。Fc-FcRn接触处全都在单一Ig重链内。主要接触部位包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
一些缀合物部分可包括或者可不包括FcγR结合部位。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR进行直接接触的Fc区内的位置的实例为氨基酸234-239(下铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C′/E环)和氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann等，Nature 406：267-273，2000)。IgE的下铰链区还涉及FcRI结合(Henry等，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基参见Lewis等(J Immunol.175：6694-701，2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基参见Sayers等(J Biol Chem.279(34)：35320-5，2004)。
可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变体Fc区在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中包含至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)中包含至少一个氨基酸修饰。被认为赋予对FcRn提高的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等，2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其它突变可减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而又不显著降低对FcRn的亲和力。例如，Fc区297位的Asn用Ala或另一个氨基酸取代去除高度保守的N-糖基化位点，并可导致Fc区的免疫原性降低同时半寿期延长，以及与FcγR的结合减少(Routledge等，1995，Transplantation 60：847；Friend等，1999，Transplantation 68：1632；Shields等，1995，J.Biol.Chem.276：6591)。已进行了减少与FcγR结合的IgG1 233-236位上的氨基酸修饰(Ward和Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2：77和Armour等1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。一些示例性的氨基酸取代参见美国专利7,355,008和7,381,408，通过引用以其整体各自结合到本文中。
酰化和烷基化
根据一个实施方案，对本文公开的胰岛素类似物进行修饰以包含酰基或烷基。酰化或烷基化可以延长胰岛素类似物在循环中的半寿期。酰化或烷基化可有利地延迟起效和/或延长在胰岛素受体和/或IGF-1受体上的作用持续时间和/或提高对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性和/或提高溶解度。可以在连接亲水部分的同一氨基酸位置上，或在不同的氨基酸位置上对胰岛素类似物进行酰化或烷基化。
在一个实施方案中，本发明提供胰岛素类似物，其经修饰以包含与在相当于天然胰岛素A10、B28、B29的位置上，或者在A链或B链的C端或N端上的氨基酸共价连接的酰基或烷基。胰岛素类似物在胰岛素类似物氨基酸与酰基或烷基之间还可包含间隔物。在一个实施方案中，酰基为脂肪酸或胆汁酸或其盐，例如C4-C30脂肪酸、C8-C24脂肪酸、胆酸、C4-C30烷基、C8-C24烷基，或包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。间隔物是具有用于连接酰基或烷基的合适反应基的任何部分。在示例性的实施方案中，间隔物包含氨基酸、二肽或三肽，或亲水双官能间隔物。在一个实施方案中，间隔物选自：Trp、Glu、Asp、Cys和包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH的间隔物，其中m为1-6的任何整数，n为2-12的任何整数。这类酰化或烷基化胰岛素肽还可另包含亲水部分，任选聚乙二醇。前述胰岛素类似物中的任一种可包含两个酰基或两个烷基，或其组合。
可以在胰岛素类似物内的任何位置上进行酰化，前提是保持胰岛素类似物胰岛素激动剂活性。酰基可直接与胰岛素类似物的氨基酸共价连接，或通过间隔物间接与胰岛素类似物的氨基酸共价连接，其中所述间隔物位于胰岛素肽的氨基酸与酰基之间。在本发明的一个具体方面，通过对胰岛素肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接酰化，将胰岛素类似物修饰成包含酰基。在一个实施方案中，胰岛素类似物通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接酰化。在一个实施方案中，酰化位于相当于天然胰岛素的A10、B28、B29或者A链或B链的C端或N端。在这点上，酰化胰岛素类似物可包含SEQ ID NO：9和SEQID NO：10的氨基酸序列，或其修饰氨基酸序列，该序列包含一个或多个本文所述氨基酸修饰，其中在相当于天然胰岛素的A10、B28、B29的位置上或者A链或B链的C端或N端中的至少一个氨基酸被修饰成包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，通过在相当于天然胰岛素的A10、B28、B29位上的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰岛素肽的直接酰化。根据一个实施方案，二肽元件的氨基酸侧链之一被酰化。
在一个实施方案中，待酰化的氨基酸为下式IV的氨基酸：
Figure BPA00001390113300861
其中n＝1-4
[式IV]
在一些示例性的实施方案中，式IV的氨基酸是其中n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。
在其它实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为下式V的氨基酸：
Figure BPA00001390113300862
其中n＝1-4
[式V]
在一些示例性的实施方案中，式V氨基酸是其中n为1的氨基酸(Ser)。
在其它实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸为下式VI的氨基酸：
其中n＝1-4
[式VI]
在一些示例性的实施方案中，式VI氨基酸为其中n为1的氨基酸(Cys)。
在一些示例性的实施方案中，通过对间隔物的胺、羟基或巯基的酰化来修饰胰岛素类似物以包含酰基，所述间隔物与在A10、B28或B29位(按照野生型胰岛素的氨基酸编号)上的氨基酸的侧链连接。间隔物与之连接的氨基酸可以是包含允许与间隔物连接的部分的任何氨基酸。例如包含侧链NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适宜的。在一个实施方案中，间隔物是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或者是包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
当通过间隔物的胺基团进行酰化时，酰化可通过氨基酸的α胺或侧链胺进行。在其中α胺被酰化的情况下，间隔物氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔物氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。或者，间隔物氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。在其中间隔物氨基酸的侧链胺被酰化的情况下，间隔物氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式I氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔物氨基酸的α胺和侧链胺两个都可能被酰化，使得胰岛素肽是二酰化的。本公开内容还考虑二酰化胰岛素类似物。
当酰化通过间隔物的羟基进行时，所述氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以为式II氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，该氨基酸为Ser。
当酰化通过间隔物的巯基进行时，所述氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可为式III氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，该氨基酸为Cys。
在一个实施方案中，间隔物包含亲水双官能间隔物。在一个具体的实施方案中，间隔物包含氨基聚(烷氧基)羧酸。在这点上，间隔物可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，可购自PeptidesInternational，Inc.(Louisville，KY)。
通过胺、羟基和巯基进行肽酰化的合适方法是本领域已知的。参见例如Miller，Biochem Biophys Res Commun 218：377-382(1996)；Shimohigashi和Stammer，Int J Pept Protein Res 19：54-62(1982)；Previero等，Biochim Biophys Acta 263：7-13(1972)(用于通过羟基进行酰化的方法)；San和Silvius，J Pept Res 66：169-180(2005)(用于通过巯基进行酰化的方法)；Bioconjugate Chem.“Chemical Modifications ofProteins：History and Applications”第1，2-12页(1990)；Hashimoto等，Pharmacuetical Res.“Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin andtheir Biological Activity”第6卷，第2期第171-176页(1989)。
酰化胰岛素肽的酰基可为任何大小，例如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的一些具体实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酸。例如，酰基可为以下脂肪酸中的任一种：C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在一个实施方案中，酰基为C8-C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在一个备选实施方案中，酰基为胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸(cholesterol acid)。
在一个具体的实施方案中，胰岛素类似物包含胆固醇酸，其通过烷基化脱氨基Cys间隔物(即烷基化3-巯基丙酸间隔物)与胰岛素类似物的Lys残基连接。烷基化脱氨基Cys间隔物可以为例如包含十二乙二醇部分的脱氨基-Cys间隔物。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含以下结构：
本文所述的酰化胰岛素类似物可进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体的实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法完成，例如本文所述的任何方法。
或者，酰化胰岛素肽可包含间隔物，其中对间隔物进行酰化并且修饰以包含亲水部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含选自Cys、Lys、Orn、高Cys和Ac-Phe中的一个或多个氨基酸的间隔物。
根据一个实施方案，对胰岛素类似物进行修饰以包含通过酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺键与胰岛素类似物连接的烷基，用于延长循环中的半寿期和/或延迟起效和/或延长作用持续时间和/或提高对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性。
烷基化胰岛素肽的烷基可以是任何大小，例如任何长度的碳链，且可以是直链或支链的。在本发明的一个实施方案中，烷基为C1-C30烷基。例如，烷基可以是以下烷基中的任一种：C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基。在一个实施方案中，烷基为C8-C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些具体的实施方案中，烷基包含胆汁酸的类固醇部分，所述胆汁酸例如为胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
根据一个实施方案，提供包含本文公开的任何新的胰岛素前药类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述胰岛素前药类似物的纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。这类组合物可含有本文公开的A19胰岛素类似物，浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌的水溶液剂，任选装入各种包装容器中保存。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干散剂。药物组合物还可作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将所述组合物给予患者的一次性装置。容器或试剂盒可标上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。
在一个实施方案中，提供包含第一和第二胰岛素前药类似物的混合物的组合物，其中第一和第二胰岛素前药类似物根据前药元件结构而彼此不同。更具体地讲，第一胰岛素前药类似物可包含半寿期与第二胰岛素前药类似物的二肽前药元件的半寿期基本不同的二肽前药元件。因此，选择二肽元件上取代基的不同组合可供制备以下组合物，其包含在所需时限和特定的时间间隔内以受控方式激活的胰岛素前药类似物的混合物。例如，可将组合物制成餐时释放活性胰岛素，接着在夜间根据活化时间释放出适当剂量的活化胰岛素。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文公开的胰岛素前药类似物和天然胰岛素或胰岛素的已知生物活性衍生物的混合物。
所公开的胰岛素前药类似物被认为适于之前已对胰岛素肽所述的任何用途。因此，本文所述的胰岛素前药类似物可用于治疗高血糖症，或治疗由高血糖水平所致的其它代谢病。因此，本发明包括包含本公开内容的胰岛素前药类似物和药学上可接受的载体的药物组合物，用于治疗患有高血糖水平的患者。根据一个实施方案，待使用本文公开的胰岛素前药类似物治疗的患者为驯养动物，而在另一个实施方案中，待治疗的患者为人。
按照本公开内容治疗高血糖症的一种方法包括采用任何标准给药途径将本发明公开的胰岛素前药类似物给予患者的步骤，所述给药途径包括胃肠外，例如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、经皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一个实施方案中，皮下或肌内给予组合物。在一个实施方案中，胃肠外给予组合物，且将胰岛素前药类似物组合物预先包装在注射器中。
本发明的胰岛素前药类似物可单独或与其它抗糖尿病药组合给予。本领域已知的或正在研究中的抗糖尿病药包括天然胰岛素；天然胰高血糖素及其功能衍生物；磺脲类，例如甲苯磺丁脲(甲糖宁(Orinase))、醋酸己脲(戴美乐(Dymelor))、妥拉磺脲(妥拉磺脲片剂(Tolinase))、氯磺丙脲(特泌胰(Diabinese))、格列吡嗪((利糖妥片(Glucotrol))、格列本脲(达安宁(Diabeta)、优降糖(Micronase)、达安辽(Glynase))、格列美脲(亚莫利(Amaryl))或格列齐特(达美康(Diamicron))；氯茴苯酸类，例如瑞格列奈(repaglinide)(Prandin)或那格列奈(nateglinide)(Starlix)；双胍类，例如二甲双胍(格华止(Glucophage))或苯乙双胍；噻唑烷二酮类，例如罗格列酮(文迪雅(Avandia))、吡格列酮(pioglitazone)(Actos)或曲格列酮(瑞如林(Rezulin))或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(德赛天(Glyset))、阿卡波糖(阿卡糖(Precose)/拜糖平(Glucobay))；艾塞那肽(百泌达(Byetta))或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，例如维格列汀或西格列汀；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或FBP酶(果糖1，6-二磷酸酶)抑制剂。
可采用标准的药学上可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，配制包含本文公开的胰岛素前药类似物的药物组合物并给予患者。因此，本公开内容还包括包含一种或多种本文公开的胰岛素前药类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含在磷酸盐缓冲系统中的pH为约4.0-约7.0、浓度为1mg/ml的胰岛素前药类似物。药物组合物可包含作为唯一的药学活性组分的胰岛素前药类似物，或者胰岛素前药类似物可与一种或多种其它活性剂组合。根据一个实施方案，提供包含本文公开的胰岛素前药类似物之一和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述胰岛素前药类似物优选为无菌的，且优选纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。这类组合物可含有胰岛素前药类似物，其中所得活性肽存在的浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌的水溶液剂，任选保存在各种容器内。根据一个实施方案，可使用本发明的化合物制备易于注射的预制溶液剂。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干散剂。药物组合物还可作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将组合物给予患者的一次性装置。容器或试剂盒可标上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。
本文描述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒和其它类似实施方案均考虑胰岛素前药类似物包括其所有的药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供具有将胰岛素前药类似物组合物给予患者的装置的试剂盒。试剂盒还可包括各种容器，例如小瓶、管、瓶等。优选试剂盒还包括使用说明书。根据一个实施方案，试剂盒的装置为气雾剂分配装置，其中组合物预包装在气雾剂装置内。在另一个实施方案中，试剂盒包含注射器和针，而在一个实施方案中，胰岛素类似物组合物预包装在注射器中。
可通过标准合成方法、重组DNA技术或制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备本发明的化合物。虽然通过标准重组DNA技术无法表达某些非天然氨基酸，但其制备法是本领域已知的。除标准肽化学反应以外，适用时可通过标准有机化学反应合成包含非肽部分的本发明化合物。
实施例1
胰岛素A链和B链的合成
采用Boc化学法，在4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂或4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂上合成胰岛素A链和B链。使用95∶5HF/对甲酚于0℃达1小时，使肽从树脂上裂解。在除去HF且醚沉淀后，将肽溶于50％乙酸水溶液，然后冻干。或者，用Fmoc化学法合成肽。使用三氟乙酸(TFA)/三异丙基甲硅烷(TIS)/H2O(95∶2.5∶2.5)于室温达2小时，使肽从树脂上裂解。通过加入过量的乙醚使肽沉淀，并将沉淀溶于酸性缓冲水溶液。用RP-HPLC监测肽的质量，并通过质谱法(ESI或MALDI)证实。
合成在氨基酸7上具有一个游离半胱氨酸且所有其它半胱氨酸作为乙酰氨基甲基A-(SH)7(Acm)6，11，20保护起来的胰岛素A链。合成在7位上具有一个游离半胱氨酸且其它半胱氨酸作为乙酰氨基甲基B-(SH)7(Acm)19保护起来的胰岛素B链。粗制肽通过常规RP-HPLC纯化。
按照图1所示通用程序，将合成的A链和B链通过其天然二硫键连接彼此连接起来。在室温下，通过溶于DMF或DMSO，并按1∶1摩尔比率与2，2’-联硫基双(5-硝基吡啶)(Npys)反应，使相应的B链活化成Cys7-Npys衍生物。活化用RP-HPLC监测，产物用ESI-MS证实。
通过以1∶1摩尔比率，总的肽浓度为10mg/ml，使相应的A-(SH)7(Acm)6，11，20和B-(Npys)7(Acm)19溶解，来形成第一个B7-A7二硫键。当链结合反应完成时，将混合物稀释至50％乙酸水溶液的浓度。通过加入碘，同时形成最后的两个二硫键。将40倍摩尔过量的碘加入溶液中，将混合物在室温下再搅拌1小时。加入抗坏血酸水溶液终止反应。混合物用RP-HPLC纯化，最终的化合物用MALDI-MS证实。如图2和表1数据所示，对于胰岛素受体结合，按照该方法制备的合成胰岛素与纯化的胰岛素不相上下。
还可以采用允许将非编码氨基酸掺入蛋白质中的系统，体内合成包含修饰氨基酸(例如A19位上的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽，所述系统包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970教导的系统。
表1：合成胰岛素相对于天然胰岛素的活性
实施例2
通过还原性烷基化进行的胺基(N端和赖氨酸)的聚乙二醇化
a.合成
以1∶2∶30摩尔比率，将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-醛(Aldyhyde)和NaBH3CN溶于乙酸缓冲液(pH 4.1-4.4)。反应溶液由0.1N NaCl、0.2N乙酸和0.1N Na2CO3组成。胰岛素肽浓度约为0.5mg/ml。反应在室温下在6小时内进行。反应程度用RP-HPLC监测，反应物的收率约为50％。
b.纯化
反应混合物用0.1％TFA稀释2-5倍后，上样至制备型RP-HPLC柱中。HPLC条件：C4柱；流速10ml/分钟；A缓冲液：含10％ACN和0.1％TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1％TFA的ACN溶液；线性梯度：B％0-40％(0-80分钟)；将PEG-胰岛素或类似物在约35％缓冲液B中洗脱。所需化合物用MALDI-TOF证实，接着通过亚硫酸盐解(sulftolysis)或胰蛋白酶降解进行化学修饰。
通过N-羟基琥珀酰亚胺酰化进行的胺基(N端和赖氨酸)的聚乙二醇化
a.合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)与mPEG20k-NHS以1∶1的摩尔比率一起溶于0.1N N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)。胰岛素肽浓度约为0.5mg/ml。反应进程用HPLC监测。在室温下2小时后，反应物的收率约为90％。
b.纯化
将反应混合物稀释2-5倍后，加样至RP-HPLC。HPLC条件：C4柱；流速10ml/分钟；A缓冲液：含10％ACN和0.1％TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1％TFA的ACN溶液；线性梯度：B％0-40％(0-80分钟)；在约35％B时收集PEG-胰岛素或类似物。所需化合物通过MAIDI-TOF证实，接着通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰。
苯丙氨酸芳环上乙酰基的还原性胺化聚乙二醇化
a.合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-酰肼和NaBH3CN按1∶2∶20的摩尔比率溶于乙酸缓冲液(pH 4.1-4.4)。反应溶液由0.1NNaCl、0.2N乙酸和0.1N Na2CO3组成。在室温下经过24小时，胰岛素或胰岛素类似物的浓度约为0.5mg/ml。反应进程用HPLC监测。反应物的转化约为50％。(通过HPLC计算)
b.纯化
反应混合物稀释2-5倍后，加样至RP-HPLC。HPLC条件：C4柱；流速10ml/分钟；A缓冲液：含10％ACN和0.1％TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1％TFA的ACN溶液；线性梯度：B％0-40％(0-80分钟)；在约35％B时收集PEG-胰岛素或PEG-胰岛素类似物。所需化合物通过MAIDI-TOF证实，接着通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰。
实施例3
胰岛素受体结合测定：
在竞争结合测定中，采用闪烁亲近技术，测定了每种肽对胰岛素或IGF-1受体的亲和力。在Tris-Cl缓冲液(0.05M Tris-HCl(pH 7.5)、0.15M NaCl、0.1％w/v牛血清白蛋白)中对肽进行系列的3倍稀释，然后在96孔板(Corning Inc.，Acton，MA)中与0.05nM(3-[125I]-碘酪氨酰基)A TyrA14胰岛素或(3-[125I]-碘酪氨酰基)IGF-1(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)混合。将从过量表达人胰岛素或IGF-1受体的细胞中制备的等分量的1-6微克质膜片段加入各孔中，加入0.25mg/孔聚乙烯亚胺处理的麦胚凝集素A型闪烁亲近测定珠粒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。以800rpm振摇5分钟后，将板于室温保温12小时，用MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)测量放射性。在各孔中，用浓度比试验样品最高浓度高4倍的过量“非放射性”天然配体测量非特异性结合(NSB)的放射性。在无竞争剂的各孔中检测总的结合放射性。如下计算百分比特异性结合：％特异性结合＝(结合的NSB/总的结合的NSB)x100。应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)求出IC50值。
实施例4
胰岛素受体磷酸化测定：
为了测量胰岛素或胰岛素类似物的受体磷酸化，将受体转染的HEK293细胞接种到96孔组织培养板(Costar #3596，Cambridge，MA)中，并在补充了100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10mM HEPES和0.25％牛生长血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(HyClone SH30541，Logan，UT)中在37℃、5％CO2和90％湿度下培养16-20小时。在补充了0.5％牛血清白蛋白的DMEM(Roche AppliedScience #100350，Indianapolis，IN)中制备系列稀释的胰岛素或胰岛素类似物，并与贴壁细胞一起加入各孔中。在潮湿环境与5％CO2下于37℃温育15分钟后，细胞用5％低聚甲醛于室温固定20分钟，用磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)洗涤两次，用2％牛血清白蛋白/PBS封闭1小时。然后，将板洗涤三次，加入按照生产商的建议在PBS与2％牛血清白蛋白复溶的针对磷酸酪氨酸的辣根过氧化物酶缀合的抗体(Upstate biotechnology #16-105，Temecula，CA)。在室温下保温温3小时后，将板洗涤4次，将0.1ml TMB单一溶液底物(Invitrogen，#00-2023，Carlbad，CA)加入各孔中。5分钟后通过加入0.05ml 1N HCl停止显色。在Titertek Multiscan MCC340(ThermoFisher，Pittsburgh，PA)中测量450nm下的吸光度。绘制吸光度相对于肽浓度的剂量反应曲线，应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)求出EC50值。
实施例5
确定模型二肽裂解(PBS中)的速率
将一种特殊的六肽(HSRGTF-NH2；SEQ ID NO：59)用作模型肽，在该模型肽上可研究二肽N端延伸物的裂解速率。制备二肽延伸的模型肽，将Boc保护的肌氨酸和赖氨酸相继加入模型肽结合的树脂上以产生肽A(Lys-Sar-HSRGTF-NH2；SEQ ID NO：60)。通过HF使肽A裂解后，用制备型HPLC纯化。
测定相应前肽的裂解速率。通过其相应的峰面积求出前肽和模型母体肽的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，来求出前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。用式t1/2＝.693/k，计算各种前药裂解的半寿期。测出该模型肽HSRGTF-NH2(SEQ ID NO：59)的Lys-Sar延伸物的半寿期为14.0小时。
实施例6
用全d-同工型模型肽测定的血浆中二肽裂解半寿期的速率
使用另外的模型六肽(dHdTdRGdTdF-NH2SEQIDNO：63)测定血浆中二肽裂解的速率。使用各氨基酸的d-异构体以防止除前药延伸物以外的模型肽的酶促切割。这种模型d-异构体六肽以类似于l-异构体的方式合成。如先前对肽A所报道，将肌氨酸和赖氨酸相继加至N端以制备肽B(dLys-dSar-dHdTdRGdTdF-NH2SEQ ID NO：64)。
测定各个前肽的裂解速率。通过其各自的峰面积求出前肽和模型母体肽的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，来求出前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。测出这个模型肽dHdTdRGdTdF-NH2(SEQ ID NO：63)的Lys-Sar延伸物的半寿期为18.6小时。
实施例7
采用实施例5中所述方法，测定与模型六肽(HSRGTF-NH2；SEQID NO：59)连接的其它二肽的裂解速率。在这些实验中得到的结果见表2和表3。
表2：PBS中与N端对氨基-Phe侧链连接的二肽O-U自模型六肽(HSRGTF-NH2；SEQ ID NO：59)的的裂解
Figure BPA00001390113300981
Figure BPA00001390113300991
表3：PBS中与1位(X)上的组氨酸(或组氨酸衍生物)连接的二肽U-O自模型六肽(XSRGTF-NH2；SEQ ID NO：59)的裂解
                    NH2-U-O-XSRGTF-NH2
  化合物   U(氨基酸)   O(氨基酸)   X(氨基酸)   t1/2
  1   F   P   H   不裂解
  2   羟基-F   P   H   不裂解
  3   G   P   H   不裂解
  4   羟基-G   P   H   不裂解
  5   A   P   H   不裂解
  6   C   P   H   不裂解
  7   S   P   H   不裂解
  8   P   P   H   不裂解
  9   K   P   H   不裂解
  10   E   P   H   不裂解
  11   脱氢V   P   H   不裂解
  12   P   d-P   H   不裂解
  13   d-P   P   H   不裂解
  14   Aib   P   H   32小时
  15   Aib   d-P   H   20小时
  16   Aib   P   d-H   16小时
  17   环己基-   P   H   5小时
  18   环丙基-   P   H   10小时
  19   N-Me-Aib   P   H   ＞500小时
  20   α，α-二乙基-Gly   P   H   46小时
  21   羟基-Aib   P   H   61
  22   Aib   P   A   58
  23   Aib   P   N-甲基-His   30小时
  24   Aib   N-甲基-Gly   H   49分钟
  25   Aib   N-己基-Gly   H   10分钟
  26   Aib   氮杂环丁烷-2-甲酸   H   ＞500小时
  27   G   N-甲基-Gly   H   104小时
  28   羟基-G   N-甲基-Gly   H   149小时
  29   G   N-己基-Gly   H   70小时
  30   dK   N-甲基-Gly   H   27小时
  31   dK   N-甲基-Ala   H   14小时
  32   dK   N-甲基-Phe   H   57小时
  33   K   N-甲基-Gly   H   14小时
  34   F   N-甲基-Gly   H   29小时
  35   S   N-甲基-Gly   H   17小时
  36   P   N-甲基-Gly   H   181小时
实施例8
鉴定结构适于前药构建的胰岛素类似物
已知A链的19位是胰岛素活性的重要部位。因此，在该部位进行修饰以允许前药元件的连接是理想的。已合成了胰岛素在A19上的特定类似物，并表征了其对胰岛素受体的活性。在A19上鉴定出两种高活性结构类似物，其中在第二活性部位芳族残基(B24)上的相当结构变化在鉴定类似完整活性的胰岛素类似物方面是不成功的。
表4和表5阐述对于针对胰岛素受体的完整活性，A19位具有高度结构保守性(用实施例3所述测定法测定受体结合)。表4表明只有两种在A19上具有修饰的胰岛素类似物具有类似于天然胰岛素的受体结合活性。对于4-氨基胰岛素类似物，提供了三个单独实验的数据。标示“活性(试验中)”的一栏比较了同时进行的两个单独实验的胰岛素类似物相对于天然胰岛素的结合百分比。标示“活性(0.60nM)”的一栏是胰岛素类似物相对于使用该测定法得到的胰岛素结合的历史平均值的相对结合百分比。在任一种分析中，两种A19胰岛素类似物(4-氨基苯丙氨酸和4-甲氧基苯丙氨酸)显示大致等于天然胰岛素的受体结合。图3表示显示天然胰岛素和A19胰岛素类似物对胰岛素受体的各自特异性结合的曲线图。表5提供的数据表明，具有与天然胰岛素相当的结合活性的两种A19胰岛素类似物(4-氨基和4-甲氧基)，还显示对胰岛素受体相当的活性(采用实施例4所述测定法测定受体活性)。
表4：A19胰岛素类似物的胰岛素受体结合活性
Figure BPA00001390113301021
表5：A19胰岛素类似物的胰岛素受体磷酸化活性
Figure BPA00001390113301022
实施例9
胰岛素样生长因子(IGF)类似物
用于分离胰岛素A链的典型纯化方案使用NH4HCO3缓冲液(pH＝7.8)。在这些条件下，二肽前药元件快速从A链上裂解。为了简化前药的纯化以研究其对胰岛素受体的活性，申请人使用IGF类似物进行了这类研究，所述IGF类似物显示与天然胰岛素的活性类似对胰岛素受体的活性。更具体地讲，IGF类似物(IGF1(YB16LB17)包含天然IGF A链和B链(分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62)，其中天然IGF B链的15和16位(分别相当于天然胰岛素B链的16和17位)上的天然谷氨酰胺和苯丙氨酸已分别用酪氨酸和亮氨酸残基置换。如图4和下表6所示，IGF1(YB16LB17)的结合活性表明，所述化合物是十分有效的胰岛素类似物。
表6
实施例10
IGF前药衍生物
根据A19胰岛素类似物的活性(参见实施例5)，对IGF1A:B(YB16LB17)类似物进行了类似修饰，并研究了其结合和刺激胰岛素受体活性的能力。图5提供以下通用合成流程，其用于制备IGF1A:B(YB16LB17)(其中天然酪氨酸用4-氨基苯丙氨酸置换[IGF1A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺])，以及用于制备其二肽延伸的衍生物[IGF1 A:B(YB16LB17)A19-AiBAla酰胺](其中包含AiB和Ala的二肽通过与A19 4-氨基苯丙氨酸的酰胺键与所述肽连接)。如图6和表7所示，IGF类似物IGF1(YB16LB17)A(p-NH2-F)19与胰岛素受体特异性结合，其中该类似物的二肽延伸衍生物不能与胰岛素受体特异性结合。注意到二肽延伸物缺乏可供自发裂解二肽的适当结构(在二肽的第二个位置上不存在N-烷基化氨基酸)，因此不存在胰岛素受体结合的恢复。
表7
Figure BPA00001390113301041
制备IGFB16B17衍生肽的又一种前药衍生物，其中二肽前药元件(丙氨酸-脯氨酸)通过酰胺键与A链氨基端连接(IGF1(YB16LB17)(AlaPro)A-1，0)。如表8所示，IGF1(YB16LB17)(AlaPro)A-1，0对胰岛素受体的亲和力显著下降。根据表3数据，注意到二肽前药元件缺乏可供自发裂解二肽前药元件的适当结构，因此检测到的胰岛素受体结合不是前药元件裂解的结果。
表8
Figure BPA00001390113301042
实施例11
其它的IGF胰岛素类似物。
IGF1(YB16LB17)(YL)B16B17肽序列的进一步修饰披露了对胰岛素和IGF-1受体的效能不同的其它IGF胰岛素类似物。这些类似物中每种的结合数据见表9(采用实施例3的测定法)，其中修饰的位置根据天然胰岛素肽(DPI＝des B26-30)的相应位置指定。例如，本文提及的缺乏任何更多详尽描述的“位置B28”可能意指其中SEQ ID NO：2的第一氨基酸已缺失的胰岛素类似物B链的相应B27位。因此，一般提及的“B(Y16)”是指天然IGF-1序列B链15位上的酪氨酸残基的取代。有关胰岛素和IGF类似物的相对受体结合的数据见表9，有关IGF类似物刺激的磷酸化(采用实施例4的测定法)的数据见表10。
Figure BPA00001390113301061
Figure BPA00001390113301071
Figure BPA00001390113301081
Figure BPA00001390113301091
Figure BPA00001390113301101
实施例12
形成自IGFB16B17衍生肽的前药形式的二肽裂解
测定了(pNH2-Phe)酰胺连接的二肽AibPro从不同IGF-1肽上的裂解以确定肽序列或异源双链体对二肽裂解的影响。受测试肽的结果见表12，数据表明，仅IGF1-A链就代表研究IGF1 B:A(YL)B16，17肽的前药半寿期的良好模型。
表12
Figure BPA00001390113301111
对于前药形式，IGF A链的前药衍生物与二硫化物结合的A链和B链构建体(IGF1 A:B(YB16LB17)的比较显示，两种化合物具有类似的半寿期。因此，经测定仅IGF1A链就是研究IGF1 B:A(YB16LB17)上的前药半寿期的良好模型。注意，AibAla衍生物不裂解，因此不是前药，但用来表明修饰可使胰岛素类似物IGF1 A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺钝化。为简单起见，使用不存在B链的仅IGF1 A链来测定前药半寿期。各前肽的半寿期按实施例5所述方法测定。数据见表13：
表13：IGF1二肽延伸的(p-NH2-F)A19酰胺上的二肽半寿期
Figure BPA00001390113301121
数据表明，通过改变二肽前药元件上的取代基，前药的半寿期可从2小时到＞100小时不等。
使用IGF1-A(pNH2-F)19型肽并改变通过A19位上4-氨基苯丙氨酸连接的二肽前药元件的氨基酸组成，来制备其它前药衍生肽。在PBS和在20％血浆/PBS(即存在血清酶时)中测定不同构建体的二肽半寿期。结果见表14。结果表明经测定的4种肽中有3种不受血清酶的影响。
表14：IGF1-A(pNH2-F)19上的二肽半寿期
Figure BPA00001390113301131
实施例13
IGFB16B17衍生肽随时间变化的受体结合
制备IGFB16B17衍生肽的前药制剂，并使用实施例3的胰岛素受体结合测定法测定其随时间变化的降解。如下制备用于该测定法的肽：
二肽-IGF1A类似物
如无具体说明，则Boc-化学法用于指定肽类似物的合成。将选定的二肽H2N-AA1-AA2-COOH加到IGF1A(Ala)6，7，11，20上的(pNH2-Phe)19。在MBHA树脂上合成IGF-1 A链C端三肽Boc(Fmoc-pNH-Phe)-Ala-Ala。用20％哌啶/DMF于室温处理30分钟脱去Fmoc后，使用3倍过量的氨基酸、PyBop、DIEA和催化量的吡啶，使Fmoc-AA2与在A19上的对氨基苄基侧链偶联。采用AppliedBiosystems 430A肽合成仪，完成其余IGF-1A链(Ala)6，7，11，20序列的Boc-合成，得到IGF-1 A链(Boc)0(Ala)6，7，11，20(Fmoc-AA2-pNH-Phe)19-MBHA。在从AA2的N端脱去Fmoc基团后，使用3倍过量的氨基酸、DEPBT和DIEA使Boc-AA1与胺偶联。通过TFA脱去余留在A链上的两个Boc基团，接着通过HF裂解，得到IGF-1A链(Ala)6，7，11，20(H2N-AA1-AA2-pNH-Phe)19酰胺。在AA1为d-赖氨酸的情况下，在ε-胺上进行乙酰化后脱去Boc。二肽-IGF-1 A链类似物用半制备型RP-HPLC纯化，并用通过分析型RP-HPLC和MALDI质谱法表征。
二肽-IGF-1(YL)类似物
如紧接的上文中所述但将PAM树脂用于合成IGF-1A链以在HF裂解时得到C端酸，将选定的二肽H2N-AA1-AA2-COOH加到IGF-1 A链(Acm)6，11，20上的(pNH2-Phe)19。在MBHA树脂上合成IGF-1 B链(YL)16，17(Acm)19，得到C端酰胺。在100％DMSO中通过与DTNP按1∶1摩尔比率反应，用Npys修饰CysB7上的游离巯基。采用流程1所示的“1+2”两步链组合策略，装配经纯化的二肽-IGF-1 A链和IGF-1 B链(YL)16，17衍生物。在半制备型RP-HPLC进行中间纯化和最终纯化，并用分析型RP-HPLC和MALDI质谱法表征。
将IGFB16B17衍生肽前药在PBS(pH 7.4)中于37℃保温，在预定的时间间隔内取出等分量，进一步的降解用0.1％TFA淬灭，对等分量进行分析型HPLC分析。用LC-MS鉴定代表IGFB16B17衍生肽的前药形式和活性形式的a峰和b峰，并通过HPLC峰面积的积分进行量化。图8A-8C显示IGFB16B17衍生肽前药：IGF1A(Ala)6，7，11，20(Aib-Pro-pNH-F)19降解的HPLC分析输出结果。在开始将前药于PBS中保温后20分钟(图8A)、81分钟(图8B)和120分钟(图8C)内取出等分量。数据表明IGF1A(Ala)6，7，11，20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺随时间自发性非酶促转化为IGF1A(Ala)6，7，11，20(pNH2-F)1酰胺。
用实施例3的体外测定法测量，根据化合物结合胰岛素受体的能力，还测定了IGFB16B17衍生肽的前药形式向其活性形式的降解。图9A和图9B曲线图表示前药Aib，dPro-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性。图9A曲线图比较了在PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(Aib，dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、2.5小时和10.6小时)的相对胰岛素受体结合。图9B曲线图比较了在20％血浆/PBS中保温的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(Aib，dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、1.5小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化为活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。针对胰岛素受体结合测定了IGFB16B17衍生肽的活性，由于潜在的IGFB16B17衍生肽的活性比天然胰岛素的活性高，因此相对于胰岛素大于100％的活性是可能的。
图10A和图10B曲线图表示前药dK，(N-异丁基G)-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性。图10A曲线图比较了在PBS中保温的天然胰岛素(于4℃在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK，(N-异丁基G)随时间变化(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合。图10B曲线图比较了在20％血浆/PBS中保温的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK，(N-异丁基G)随时间变化(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化为活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图11A和图11B曲线图表示前药dK(e-乙酰基)，Sar)-IGF1YL(通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性。图11A曲线图比较了在PBS中保温的天然胰岛素(于4℃在1小时时测定)和A19 IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基)，Sar)随时间变化(0小时、7.2小时和91.6小时)的相对胰岛素受体结合。图11B曲线图比较了在20％血浆/PBS中保温的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基)，Sar)随时间变化(0小时、9小时和95小时)的相对胰岛素受体结合。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化为活性IGF1YL肽时，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
Figure IPA00001390112800011
Figure IPA00001390112800021
Figure IPA00001390112800041
Figure IPA00001390112800051
Figure IPA00001390112800061
Figure IPA00001390112800071
Figure IPA00001390112800081
Figure IPA00001390112800101
Figure IPA00001390112800111
Figure IPA00001390112800121
Figure IPA00001390112800131
Figure IPA00001390112800141
Figure IPA00001390112800151
Figure IPA00001390112800161
Figure IPA00001390112800201
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Figure IPA00001390112800231
Figure IPA00001390112800241
Figure IPA00001390112800251
Figure IPA00001390112800261
Figure IPA00001390112800271
Figure IPA00001390112800281
Figure IPA00001390112800291
Figure IPA00001390112800301
Figure IPA00001390112800311
Figure IPA00001390112800321
Figure IPA00001390112800341
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Figure IPA00001390112800361
Figure IPA00001390112800371
Figure IPA00001390112800381
Figure IPA00001390112800391

Claims (61)

1.一种化合物，其包含结构Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)或其类似物，所述类似物包含因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18；其中
Z为H或结构U-O的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，O为N-烷基化氨基酸，且O通过形成酰胺键与SEQ ID NO：3连接，而且其中U、O或U-O与之连接的SEQ ID NO：3的氨基酸为非编码氨基酸，并且在生理条件下，在PBS中Z自SEQ ID NO：3的化学裂解半寿期(t1/2)为至少约1小时-约1周；
X1选自苏氨酸、组氨酸和赖氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200011
其中m为选自0-3的整数；
X选自OH、OCH3、NH2和NHR10，其中R10为包含通用结构：U-O的二肽元件；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸和丙氨酸；
前提条件是如果X为NHR10，则Z为H，且如果Z为U-O，则X为OH、NH2或OCH3。
2.权利要求1的化合物，其中
Z为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200021
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200022
其中X选自OH、OCH3、NH2和NHR10，其中R10为包含以下通用结构的二肽元件：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是如果X为NHR10，则Z为H，并且如果Z为
Figure FPA00001390113200031
则X为OH、NH2或OCH3，并且如果Z为
且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2之一不为H。
3.权利要求1的化合物，其中U-O为具有下式I通用结构的化合物：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
4.权利要求1或2的化合物，其中Z为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200041
其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺。
5.权利要求1或2的化合物，其中Z为包含以下通用结构的二肽元件：
其中R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基和芳基，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；和
R5为胺；
R8为H；
进一步的前提条件是R1和R2两个均不为氢。
6.权利要求1或2的化合物，其中X为NHR10；
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。
7.权利要求1或2的化合物，其中X为NHR10；
R1选自氢、C1-C18烷基和芳基，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代的胺。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，其中X1为苏氨酸。
9.权利要求1-8中任一项的化合物，其中X3为天冬酰胺或甘氨酸。
10.权利要求2或3的化合物，其中
Z为H；
X为NHR10；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
11.权利要求2的化合物，其中
Z为
X为OH；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
12.权利要求10或11的多肽，其中
R2选自H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)C(O)NH2、CH2OH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6环烷基)和CH2(C6芳基)R7，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
13.一种包含A链和B链的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)，所述B链序列包含序列X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO：4)，其中
Z为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200062
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200071
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200072
X3选自天冬酰胺和甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是如果X为NHR10，则Z为H，并且如果X为OH、NH2或OCH3，则Z为
并且如果Z为
Figure FPA00001390113200082
且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2各自不为H。
14.权利要求13的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：12)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO：13)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；和
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。
15.权利要求13的胰岛素类似物，其中
X4为组氨酸；
X5为丝氨酸；和
X6为组氨酸。
16.权利要求15的胰岛素类似物，其中
X1为苏氨酸。
17.权利要求14的胰岛素类似物，其中
Z为H；
X为NHR10；
R1选自H和C1-C4烷基；
R2选自H、C1-C6烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
18.权利要求17的胰岛素类似物，其中R3为CH3，R4为H。
19.权利要求17的胰岛素类似物，其中R5为NHR6。
20.权利要求17的胰岛素类似物，其中R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
21.权利要求13的胰岛素类似物，其中
X为OH；
R1选自H和C1-C4烷基；
R2选自H、C1-C6烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
22.权利要求15的胰岛素类似物，其中
Z为H；
X为NHR10；
R3为C1-C6烷基；和
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
23.权利要求15的胰岛素类似物，其中
X为OH；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
24.权利要求22的胰岛素类似物，其中所述B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTX10X11(SEQ ID NO：20)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
25.权利要求22的胰岛素类似物，其中所述B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTX10X11(SEQ ID NO：20)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
26.权利要求22的胰岛素类似物，其中
R3为甲基；
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
27.权利要求13的胰岛素类似物，其中亲水部分与所述胰岛素类似物连接。
28.权利要求24或25的胰岛素类似物，其中所述B链序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列，亲水部分在选自以下的位置上与所述胰岛素类似物连接：B链的N端氨基酸、SEQ ID NO：8的29位赖氨酸和SEQ ID NO：9的28位赖氨酸。
29.权利要求27的胰岛素类似物，其中所述亲水部分为聚乙二醇。
30.一种包含A链和B链的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)或因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18，所述B链序列包含序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)或因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：14的序列：B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，其中
Z和J独立地为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200111
X14选自键、X9VNQ(SEQ ID NO：21)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200121
其中X选自OH、NHR10和OCH3，其中R10为H或包含以下通用结构的二肽元件：
X3选自天冬酰胺、甘氨酸和丙氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸和丝氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200123
其中X12选自OH、OCH3和NHR11，其中R11为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200124
X8为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、OCH3和NHR12，其中R12为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200132
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是R10、R11、R12、J和Z中的一个并且只有一个包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200141
31.权利要求30中任一项的胰岛素类似物，其中Z包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200142
所述二肽元件是酰化的或聚乙二醇化的。
32.权利要求30中任一项的胰岛素类似物，其中J包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200143
所述二肽元件是酰化的或聚乙二醇化的。
33.权利要求31或32的胰岛素类似物，其中将所述二肽元件用一条或两条聚乙二醇链进行聚乙二醇化，其中所述聚乙二醇链的总的分子量范围为约20,000-约80,000道尔顿。
34.权利要求31或32的胰岛素类似物，其中将所述二肽元件用包含16-30个碳原子的酰基进行酰化。
35.权利要求34的胰岛素类似物，其中将所述二肽元件用C26脂肪酸或C28脂肪酸进行酰化。
36.权利要求30的胰岛素类似物，其中
Z、J和X13各自为H；
X为OH；
X12为NHR11，其中R11为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200151
37.权利要求30的胰岛素类似物，其中
Z和X13各自为H；
X和X12各自为OH；
J为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200152
前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。
38.权利要求30的胰岛素类似物，其中
Z和J两者都为H；
X和X12各自为OH；
X13为NHR12，其中R12为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200153
39.权利要求30的胰岛素类似物，其中
Z和J各自为H；
X为OH；和
所述B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQ ID NO：15)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQ ID NO：16)，其中
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸，和
X7为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200161
其中X12选自OH、NH2和NHR11，其中R11为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200162
X8为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H，NH2、OCH3和NHR12，其中R12为包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200164
前提条件是如果X13为H、NH2或OCH3，则X12为NHR11，并且如果X13为NHR12，则X12为OH、NH2或OCH3。
40.权利要求36-39中任一项的胰岛素类似物，其中
X1为苏氨酸；
X4为组氨酸；
X5为丝氨酸；和
X6为组氨酸。
41.权利要求40的胰岛素类似物，其中X3为天冬酰胺或甘氨酸。
42.权利要求35-40中任一项的胰岛素类似物，其中
R1选自H和C1-C4烷基；
R2选自H、C1-C6烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5或6元环；
R3为C1-C6烷基；和
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
43.权利要求30的胰岛素类似物，其中所述B链包含序列J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTX10X11(SEQ ID NO：5)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
44.权利要求43的胰岛素类似物，其中所述B链序列包含序列J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQ ID NO：15)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQ ID NO：16)，其中
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。
45.权利要求44的胰岛素类似物，其中亲水部分与在选自以下的位置上的氨基酸连接：B链的N端氨基酸、SEQ ID NO：15的29位赖氨酸或SEQ ID NO：16的28位赖氨酸。
46.权利要求45的胰岛素类似物，其中所述亲水部分为聚乙二醇。
47.权利要求30的胰岛素类似物，其中亲水部分或螯合大分子与包含以下通用结构的二肽元件的R2侧链共价连接：
Figure FPA00001390113200181
其中R2表示(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH或(C1-C4烷基)NH2。
48.权利要求47的胰岛素类似物，其中所述亲水部分为聚乙二醇。
49.权利要求48的胰岛素类似物，其中所述A链或B链是酰化的。
50.一种包含式：B-P-A的化合物的单链胰岛素类似物，其中：
B    表示以下序列，其包含J-B-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQ ID NO：14)的序列或因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：14的序列：B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30；
A表示以下序列，其包含Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO：3)的序列或因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO：3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18；和
P表示约4-约14个氨基酸的肽接头，其中
Z和J独立地为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200191
B选自键、X9VNQ(SEQ ID NO：21)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200192
其中X选自OH、NHR10和OCH3，其中R10为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200193
X3选自天冬酰胺、甘氨酸和丙氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸和丝氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、OCH3和NHR11，其中R11为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200202
X8为以下通用结构的氨基酸
Figure FPA00001390113200203
其中X13选自H、OH、OCH3和NHR12，其中R12为H或包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200204
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是R10、R11、R12、J和Z中的一个并且只有一个包含以下通用结构的二肽元件：
Figure FPA00001390113200211
51.权利要求50的单链胰岛素类似物，其中所述肽接头包含以下序列：Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO：22)、AGRGSGK(SEQ ID NO：35)、AGLGSGK(SEQ ID NO：36)、AGMGSGK(SEQ IDNO：37)、ASWGSGK(SEQ ID NO：38)、TGLGSGQ(SEQ ID NO：39)、TGLGRGK(SEQ ID NO：40)、TGLGSGK(SEQ ID NO：41)、HGLYSGK(SEQ ID NO：42)、KGLGSGQ(SEQ ID NO：43)、VGLMSGK(SEQ IDNO：44)、VGLSSGQ(SEQ ID NO：45)、VGLYSGK(SEQ ID NO：46)、VGLSSGK(SEQ ID NO：47)、VGMSSGK(SEQ ID NO：48)、VWSSSGK(SEQ ID NO：49)、VGSSSGK(SEQ ID NO：50)、VGMSSGK(SEQ IDNO：51)、TGLGSGR(SEQ ID NO：52)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：53)、KGLSSGQ(SEQ ID NO：54)、VKLSSGQ(SEQ ID NO：55)、VGLKSGQ(SEQ ID NO：56)、TGLGKGQ(SEQ ID NO：57)和VGLSKGQ(SEQ IDNO：58)。
52.权利要求50或51的单链胰岛素类似物，其中所述B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ IDNO：12)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ IDNO：13)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；和
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。
53.权利要求52的胰岛素类似物，其中
Z为H；
X为NHR10；
X4为组氨酸；
X5为丝氨酸；和
X6为组氨酸；
R1选自H和C1-C4烷基；
R2选自H、C1-C6烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。
54.权利要求13-30或50中任一项的胰岛素类似物，其中所述类似物在选自以下的一个或多个位置上被酰化：A9、A14、A15、B22、B28或B29。
55.一种二聚体或多聚体，其包含权利要求1-54中任一项的胰岛素类似物。
56.前述权利要求中任一项的胰岛素类似物，其中对应于U的二肽元件氨基酸为呈D-立体化学构型的氨基酸。
57.一种药物组合物，其包含权利要求12、30或50中任一项的胰岛素类似物和药学上可接受的载体。
58.一种治疗糖尿病的方法，所述方法包含给予有效量的权利要求57的药物组合物。
59.一种胰岛素前药类似物，其包含
A链，其包含SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：1的修饰衍生物，所述修饰衍生物包含在A19位的氨基酸被修饰成4-氨基苯丙氨酸和任选一个或多个在选自以下位置的氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A19和A21；
B链，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的修饰衍生物，所述修饰衍生物包含在B16或B25位的氨基酸被修饰成4-氨基苯丙氨酸和任选一个或多个选自以下位置的氨基酸取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30或者B1-4和B26-30位置中的任何或所有的缺失；和
二肽元件，其通过酰胺键与A链或B链的N端氨基或存在于A19、B16或B25位上的4-氨基-苯丙氨酸残基芳族胺的侧链氨基连接，其中所述二肽元件包含后接N-烷基化氨基酸的N端C-烷基化氨基酸。
60.权利要求1-59中任一项的化合物在制备用于治疗高血糖症的药物中的用途。
61.权利要求1-59中任一项的化合物在治疗糖尿病中的用途。
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