KR102163936B1 - 장기-활성 싱글-체인 인슐린 유사체 - Google Patents

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Abstract

포지션 A8(아르기닌, 히스티딘, 리신 또는 오르니틴)에서의 기본적 측쇄, 포지션 B29(아르기닌, 히스티딘, 리신 또는 오르니틴)에서의 기본적 측쇄 및 길이 6-11 잔기의 단축된 C-도메인을 포함하는 싱글-체인 인슐린 유사체가 제공된다. C-도메인의 잔기들은 -1 또는 -2의 순음 전하를 갖고, C3은 Gly, Ala, Pro, 또는 Ser을 포함하는 그룹에서 선정되며, 남은 C-도메인 구간은 IGF-II(RRSR, SRRSR, VSRRSR, RVSRRSR, 또는 SRVSRRSR; SEQ ID NO: 13)의 C-도메인으로부터 성공적으로 유래된다. 진성 당뇨병 또는 비만을 가진 환자의 치료 방법은 환자에게 생리학적으로 효과적인 양의 인슐린 유사체 또는 생리학적으로 수용가능한 소금을 투약하는 것을 포함한다.

Description

장기-활성 싱글-체인 인슐린 유사체{LONG-ACTING SINGLE-CHAIN INSULIN ANALOGUES}
상호참조
본 출원은 미국 임시출원 번호 61/722,350(2012년 1월 5일 출원)에 기초하는 우선권을 주장한다.
연방으로부터 후원을 받은 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국국립보건원으로부터 받은 부여번호 DK040949 및 DK074176의 협력 계약서상의 정부 지원에 의해 만들어졌다. 미국 정부가 본 발명에 대해 특정 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 향상된 열역학적 안정성, 상온보다 높은 온도에서의 열적 피브릴화에 대한 증가된 저항성, 저감된 미토겐 활성, 및/또는 변형된 약동학적 및 약역학적 특성, 예를 들면, 대응되는 야생형 인간 호르몬의 액상 제형화에 대해 더 지속되는 기간의 활동 또는 더 급격한 기간의 활동을 부여하는 것과 같이, 향상된 약제상 특성을 보여 주는 폴리펩티드 호르몬 유사체에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 A와 B 도메인들 사이에서 단축된 연결 (C) 도메인들의 신규 클래스를 포함하는 단일 폴리펩티드 체인을 포함하는 인슐린 유사체들에 관한 것이다. 길이 6-11의 잔기에서, 이 클래스의 C 도메인들은 인간 IGF-II의 연결 도메인에서 유래된 N-터미널 산성원소 및 C-터미널 구간을 포함한다. 본 발명의 싱글-체인 인슐린 유사체들은 선택적으로 A 또는 B 도메인들에 있는 다른 사이트들에서의 표준 또는 비표준의 아미노산 대체물들을 포함할 수 있다.
치료제들 및 백신들을 포함하는 비표준 단백질들의 조작은 광범위한 약학적 및 사회적 이득을 제공할 수 있다. 일반적으로 인간들, 다른 포유류들, 척추동물 유기체들, 무척추동물 유기체들 또는 진핵 세포들의 게놈들에 코딩된 바와 같이 자연적으로 생성되는 단백질들은 자주 다수의 생물학적 활동들을 부여한다. 단백질 유도체들의 혜택으로는 암세포들의 성장을 촉진시키는 것과 같은 상동 세포 수용기들과 연관된 의도되지 않고 부정적인 부작용과의 저감된 결합과 같은 선택적인 활동을 구현하는 것이다. 사회적 혜택의 또 다른 예로는 상온 또는 그 이상에서의 열화에 대해 증가된 저항성과 수송, 분포 및 사용을 쉽게 하는 것이다. 치료용 단백질의 예로 인슐린이 제공된다. 야생형 인간 인슐린 및 다른 포유류들의 게놈들로 부호화된 인슐린 분자들은 다수의 기관들 및 다양한 세포들의 인슐린 수용체에 결합되는데, 이는 RNA 스플라이싱의 대안 모드들에 의해 생성된 수용체 아이이소포름이나 번역후 글리콜실화의 대안 패턴과는 상관없이 결합된다. 야생형 인슐린은 또한 상동 제1종 인슐린 유사 성장인자수용체 (IGF-1R)와 더 낮은 친화력으로 결합한다.
또 다른 의학적 혜택의 예로는 중첩풀림 또는 열화에 대한 단백질의 안정성의 최적화이다. 이와 같은 사회적 혜택은 전기 및 냉장이 지속적으로 제공되지 않는 개발도상국의 지역에서 사용될 수 있도록 상온 이상에서의 열화에 대해 표준 단백질들 보다 더 내화성을 갖는 단백질들의 설계에 의해 더 향상될 수 있다. 단일 폴리펩티드 체인으로 구성되고 선택적으로 비표준 아미노산 대체물들을 포함하는 인슐린 유사체들은 열적 열화 또는 저감된 미토겐 활성에 대한 저항성에 대해 우수한 특성을 보여줄 수 있다. 이의 물리적 열화로 인한 어려움은 아프리카와 아시아에서 계속되는 진성 당뇨병의 발병에 의해 더 어려워지고 있다. 피브릴화가 상온보다 높은 온도에서의 열화에 대한 주요 경로이기 때문에, 피브릴화 저항 제형들의 설계는 이와 같은 어려운 지역들에서 인슐린 대체 치료의 안정성과 약효를 향상시킬 수 있다.
인슐린의 처방은 오랫동안 진성 당뇨병의 치료로 자리 잡고 있다. 진성 당뇨병을 갖는 환자들에서의 기존 인슐린 대체 치료의 주요 목표는 혈당 농도를 엄격하게 조절하여 건강한 인체의 정상 범위 특성 위로 또는 아래로 이탈되는 것을 방지하는 것이다. 정상 범위 아래로의 이탈은 심할 경우에 경련, 혼수 상태 및 사망에 이르게 하는 즉각적인 아드레날린 작용 또는 신경 포도당 결핍에 의한 증상과 연관된다. 정상 범위 위로의 이탈은 망막증, 맹목, 및 신장 부전증을 포함하는 미세혈관 질환에 대해 증가하는 장기 리스크와 연관된다.
인슐린은 척추동물에서 신진대사에 중추적인 역할을 하는 작은 구상 단백질이다. 인슐린은 21개의 잔기들을 포함하는 A 체인 그리고 30개의 잔기들을 포함하는 2개의 체인들을 포함한다. 호르몬은 Zn2+ 안정된 헥사머로 췌장의 베타세포로 저장되지만 혈관에서는 Zn2+ 자유 모노머로 기능한다. 인슐린은 연결 영역(35개의 잔기들)이 B 체인의 C 터미널 잔기(B30 잔기)를 A 체인의 N 터미널 잔기로 링크 시키는 싱글-체인 전구체인 프로인슐린의 결과물이다(도 1a). 다양한 증거들이 이것이 인슐린 유사 코어 및 무질서 연결 펩티드를 포함하는 것을 나타내고 있다(도 1b). 세개의 특정 이황화 브리지들(A6-A11, A7-B7, 및 A20-B19; Figs. 1A 및 1B)의 형성은 조면소포체 (ER)에서의 프로인슐린의 산화적 접힘과 연관된다고 생각되어 지고 있다. 프로인슐린은 ER에서 골지 장치로 이출되고 얼마 안되어 액상 Zn2+ 배위 핵사머를 형성하기 위해 어셈블된다. 인슐린으로의 단백질 분해 소화 및 전환은 미숙 분비과립들과 뒤따르는 형태학적 응축에서 일어난다. 성숙 저장과립들 안의 아연 인슐린 헥사머들의 결정질 어레이들은 전자현미기술(EM)에 의해 시각화 되어졌다. 인슐린의 시퀀스를 도 1C에서 개략적으로 보여주고 있다. 개별 잔기들은 아미노산의 식별(보통 표준의 3개의 문자 코드를 사용), 체인 및 시퀀스 위치(보통 위첨자로)로 지정된다. 본 발명에 관련된 발명으로는, 인간 프로인슐린의 36-잔기 야생형 C 도메인 특성을 대체하는 신규 길이 6-11의 단축된 C 도메인들에 대한 발명이 있다.
진성 당뇨병의 치료를 위한 인슐린 및 인슐린 유사체의 제조, 저장 및 사용에서의 심각한 문제인 피브릴화는 더 높은 온도, 더 낮은 pH, 애지테이션, 또는 우레아, 구아니딘, 에탄올 조용매 또는 소수성 표면들의 존재에 의해 더 증가한다. 현재의 미국 제약 규정은 피브릴화가 1 퍼센트 이상의 레벨에서 일어나면 인슐린을 폐기하도록 요구하고 있다. 피브릴화가 더 높은 온도에서 증가하기 때문에 진성 당뇨병을 가진 환자들은 인슐린을 사용하기 전에 냉장하여야 한다. 인슐린 또는 인슐린 유사체의 피브릴화는 작은 양의 인슐린 또는 인슐린 유사체가 환자의 몸에 일반적인 간격으로 주입되는 외부 인슐린 펌프를 활용하는 환자들에게 특히 문제가 될 수 있다. 이와 같은 사용에서는, 인슐린과 인슐린 유사체는 펌프 장치에서 냉장되지 않고 보관되며, 인슐린의 피브릴화는 결과적으로 몸에 인슐린 또는 인슐린 유사체를 주입하는데 사용되는 카테터를 차단하여 예측할 수 없는 혈당 레벨 변동 또는 위험한 과혈당증도 유발할 수 있다. 인슐린은 25℃ 보다 높은 온도에서 10℃ 증가할 때 열화율은 10배 또는 그 이상 증가하기 때문에, 지침들에서는 30℃ 미만의 온도에서 저장하거나 바람직하게는 냉장하도록 하고 있다. 5 미만의 pH에서 액상 용액으로 제형된 기저 인슐린 유사사체들의 피브릴화는(pH 4.0에서 인슐린 글라진 및 아연 이온들의 버퍼링되지 않은 용액을 포함하는 랜터스(Sanofi-Aventis)와 같은) 상온 이상에서의 물리적 열화로 자신들의 생명을 제한시킬 수 있고, 이와 같은 제형들에 적용된 산성 조건들은 인슐린 자가-어셈블리를 손상시키고 아연 이온들의 결합을 약화시켜 인슐린 유사체들이 아연-단백질 어셈블리들 내에서 격리에 의해 보호될 수 있는 정도를 저감시킨다.
인슐린은 화학적 열화에 약하고, 이는 분자내에서 원자들의 재배열 또는 다른 인슐린 분자들 사이에서 화학적 결합들의 형성의 손실에 의한 화학적 결합의 파손을 수반한다. 화학적 결합들에서의 이러한 변화들은 보통 단백질의 접히지 않은 상태에서 조절되고 이의 열역학적 안정성을 증가시키는 인슐린의 변경은 또한 화학적 열화를 지연시키거나 방지시킬 가능성이 높다. 인슐린은 또한 물리적 열화에 약하다. 단백질 피브릴화의 현재 이론에서는 피브릴화의 메커니즘은 부분적으로 접힌 중간 상태를 통해 진행되고, 이후에 아밀로이드 핵을 형성하도록 합쳐진다고 받아들여지고 있다. 이 이론에서는, 고유의 상태를 안정화시키는 아미노산 대체물들이 부분적으로 접힌 중간 상태를 안정화하거나 안정화하지 않고 고유 상태 및 중간 상태 사이의 자유에너지 장벽을 증가(또는 감소)시키거나 증가(또는 감소)시키지 않을 가능성이 있다. 따라서, 현재 이론은 2-체인 인슐린 분자에서의 주어진 아미노산 대체물의 피브릴화의 위험을 증가 또는 감소시키는 성향은 예측하기 어렵다고 지적하고 있다. 인슐린 분자 구조의 모델들에서 B-체인들을 연속적으로 쌓고 A-체인들을 연속적으로 쌓아 형성된 베타-시트들의 평행 구성을 갖는 3-알파 헬리케들(고유 상태에서 보여진 바와 같이)의 거의 완전한 중첩풀림이 예상되고, 체인들간 및 A-체인 내에서 고유의 이황화 페어링이 유지된다. 이러한 평행 크로스-베타 시트들은 A-체인의 N 말단과 B-체인의 C-말단 사이에 실질적인 분리를 필요로 하고(>30 Å), 말단들은 보통 인슐린 모노머의 고유 상태에 인접해 있다(< 10 Å). 단축된 C-도메인을 갖는 싱글-체인 인슐린 유사체들의 피브릴화에 대한 현저한 저항성은 당해 기술에 잘 알려져 있고 이는 인슐린 프로토필라멘트에서의 평행 크로스-베타 시트들의 스플레이 구조와 고유의 이황화 페어링을 갖는 싱글-체인 인슐린 유사체의 구조 사이의 위상적 비호환성을 반영한다고 생각되어 지고 있으며, 단축된 C-도메인이 프로토필라멘트에서 불리하도록 A-체인의 N-말단 및 B-체인의 C-말단 사이의 거리를 제약한다.
따라서, 싱글-체인 인슐린 유사체들이 피브릴화 내성 인슐린 유사체의 설계에 대해 긍정적인 접근을 제공한다고 보여질 수 있다. 하지만, 과거에는 이러한 유사체들이 낮은 활동력을 보여주었고 이는 야생형 인간 인슐린에 비해 1% 이하일 수 있다. (비록 Lee, H.C. 외 (2000)가 길이 57인 잔기들 또는 58인 잔기들의 야생형 A- 및 B-도멘인들을 갖는 싱글-체인 인슐린 유사체들이 인간 인슐린에 비해 30 - 40%의 범위의 수용체 결합 친화력을 보여준다고 주장했지만, 이 발표는 과학적 부도덕 행위로 인해 2009년에 철회되었고 우리가 실험 했을 때는 Lee, H.C. 외가 개시한 유사체들은 1% 미만의 상대적인 친화력을 보여주었다.) 당해 기술 분야에서 알려진 인슐린 수요체를 위한 인슐린의 친화력을 향상시키는 대체물인 AspB10을 도입하여 친화력을 부분적으로 복구시킬 수 있다. 우리는 C-도메인 링커 GGGPRR을 갖는 AspB10을 포함하는 57-잔기 싱글-체인 인슐린을 이전에 설명하였다. 하지만, 단축된 C-도메인들을 이와 같은 A-도메인 및/또는 B-도메인에서의 대체물들과 함께 사용하면 미국 특허출원 번호 12/989,399, "아이소포름 특정 인슐린 유사체들" (문헌의 원용)에서 개시된 바와 같이 결합의 비율을 IR-B에 대해 IR-A로 결합의 비율이 증가되도록 왜곡시킬 수 있다. 높은 수용체-결합 친화력을 갖는 싱글-체인 인슐린 유사체가 설명되었고 여기서 단축된 C-도메인은 인슐린 유사 성장인자 I의 12 잔기 C-도메인(IGF-I; 시퀀스 GYGSSSRRAPQT; SEQ ID NO: 12)이었고, 키메라 단백질을 만들어냈다. 하지만, 이러한 키메라 분자들은 IGF-1R을 위한 향상된 상대적 및 절대적 친화력들을 보여준다. AspB10과 연관된 것들과 B10 위치에서의 다른 대체물들과 같은 이러한 변형들은, 이러한 유사사체들을 사용하는 동물들 또는 인간 환자들에서 증가된 암발병의 위험과 연관되었을 가능성으로 인해 광범위한 우려를 자아냈다. 이러한 우려는 기저 인슐린 유사체들, 예를 들면, 피하 저장으로부터의 12-24 시간 인슐린 흡수 프로필 및 12-24 시간 인슐린 활동 프로필을 갖는 하루에 한번 투약을 위해 설계된 것들에 대해 특히 두드러진다.
본 발명은 (i) 열화에 대한 저항성과 (ii) 실질적인 생체내 저혈당 효능과 (iii) 저감된 IFG-1R과의 크로스 결합과 (iv) 야생형 인간 인슐린과 비슷한 인슐린 수용체의 A 및 B 아이소포름을 위한 친화력들의 비율을 결합하는 기저 하루에 한번 싱글-체인 인슐린 유사체의 설계에 대한 의학적 및 사회적 필요성이 이유가 되었다. 후자의 목표는 인체에서의 인슐린의 다면발현 기능들과 표적 조직들을 반영하고 있다. 인슐린 활동의 고전적인 패러다임은 지방세포들(인슐린이 중성지방 입자들의 형태의 연료의 저장을 조절하는), 간(인슐린이 포도당신생과정을 통해 포도당의 생성을 조절하고 글리코젠의 형태의 연료의 저장을 조절하는), 및 근육(인슐린이 GLUT4의 원형질막으로의 수송을 통해 혈류로부터 포도당의 유입을 조절하는)의 기관특정 기능들을 호르몬의 표적조직들로 집중하였다. 하지만, 최근 연구는 인슐린은 다른 기관들과 인슐린 반응 신경회로가 간장대사, 식욕, 포만감, 및 아마도 이상적인 몸무게의 설정값에 영향을 끼치는 뇌의 시상하부와 같은 조직에 생리학적 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 비록 인간 게놈이 인슐린 수용체를 부호화하는 단일 유전자를 포함하지만, 세포질 타이로신-키나제 도메인을 포함하는 막관통 단백질과 이의 RNA 전구체는 고유의 A 및 B 아이소포름들을 얻기 위한 또 다른 스플라이싱을 겪고, 이것의 단편적 분포는 기관마다 다를 수 있고 이것의 신호 기능들이 같은 세포안에서 다를 수 있다.
A 및 B 아이소포름들(IR-A 및 IR-B로 지정)은 인슐린을 위한 친화력이 다르고(IR-A를 위한 친화력이 IR-B를 위한 친화력보다 두배 크다), IR-A(엑손 11에 의해 부호황된 알파 소단위에서 펩티드 도메인이 부족한)만이 IFG-II를 높은 친화력으로 결합한다. 비록 대응되는 IR-A 및 IR-B의 친화력의 비율에서 야생형 인슐린과 다른 인슐린 유사체들이 당해 기술 분야에서 알려져 있지만, 인슐린 대체 치료의 안정성과 약효는 야생형 인슐린과 비슷한 IR-A 및 IR-B의 친화력의 비율을 갖는 인슐린 유사체의 투약이 최적으로 요구될 수 있다. 예컨대, IR-A에 비해 IR-A과의 저감된 인슐린 유사체의 결합은 IR-A 수용체들이 우세함을 보여주는 백혈구에서의 인슐린 신호의 정도를 상대적으로 또는 절대적으로 감소시킬 수 있다. 비슷하게, 예컨데, IR-B에 비해 IR-B과의 저감된 인슐린 유사체의 결합은 IR-B 수용체들 우세함을 보여주는 기존의 표적 기관들에서의 인슐린 신호의 정도를 상대적으로 또는 절대적으로 감소시킬 수 있다. 이러한 왜곡된 결합 친화력들은 IR-A-중재 인슐린 신호 및 IR-B-중재 인슐린 신호가 적정한 베타 세포 생존능력 및 분비기능에 기여하는 다른 세포 기능들을 중재한다고 생각되는 표적 세포들(췌장 베타신호와 같은)의 세포 기능을 또한 교란할 수 있다. 암세포들이 IR-A의 과잉발현을 나타낼 수 있기 때문에, IR-A 신호(야생형 인간 인슐린에 비해)의 증가된 효능을 보여주는 유사체로 환자를 치료하면 종양의 성장을 증가시키는 위험을 초래할 수 있다. 암세포들에서의 인슐린 유사체들에 의한 미토겐 활성 신호는 미토겐 활성 IGF-1R 수용체에 대해 증가된 크로스 결합(야생형 인간 인슐린에 비해)을 보여주는 유사체들 또는 IR-A에 대해 증가된 결합(야생형 인간 인슐린에 비해)을 보여주는 유사체들 또는 IGF-1R, IR-A, 또는 IR-B에서의 장기 체류 시간(야생형 인간 인슐린에 비해)을 보여주는 유사체들에 의해 중재될 수 있다. C-터미널 신장(B31 또는 B32) 내에서의 B-체인 또는 B-도메인의 C-말단 근처 (B28-B30) 또는 싱글-체인 인슐린 유사체(C1 또는 C2)의 상등 포지션들에서의 기본적인 잔기들은 IGF-1R과의 인슐린 유사체의 크로스 결합을 증가시킬 수 있고 미코겐 활성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 무시할 정도의 미코겐 활성 및 IGF-1R과의 크로스 결합을 가지면서 적어도 야생형 인슐린의 포도당 저감 효과를 부분적으로 보유하는 싱글-체인 인슐린 유사체의 발명이 요구된다. 더욱 일반적으로, 상온보다 높은 온도에서 향상된 열역학적 안정성 및 피브릴화에 대해 향상된 저항성을 보여주면서 인슐린 수용체의 A 및 B 아이소포름의 친화력들의 비율을 보여주는 인슐린 유사체에 대한 요구가 있고, 적어도 야생형 인슐린의 다수의 기관 특정 생물학적 활동들의 부분 집합에 대한 요구가 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 IGF-1R과의 저감된 크로스 결합과 활동의 연장된 기간을 제공하면서 피하 주사 이후에 설치류에서의 야생형 인슐린의 포도당 저감 활동 중 적어도 일부분을 보유하는 싱글-체인 인슐린 유사체를 제공하는 것이다. 본 발명의 유사체들은 B10 포지션에서 히스티딘을 포함하여 이 포지션에서의 산성 대체물(아스파르트산 또는 글루타민 산)과 연관된 발암에 대한 우려를 피할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 IR-A 및 IR-B에 대한 싱글-체인 인슐린 유사체의 절대 체외 친화력들이 야생형 인간 인슐린에 대해 5 - 100%의 범위를 갖고 호르몬 수용체 복합체에서의 장기 체류 시간들을 보여주지 않을 가능성이 높다. 본 발명은 야생형 인간 인슐린과 유사한 IR-A 및 IR-B에 대한 결합 친화력 비율을 나타내는 싱글-체인 인슐린 유사체들을 활용하기 위한 것이다.
상기 특징들은, 단축된 연결 폴리펩티드(길이 6-11 잔기들)가 N-터미털 산성 요소(C1 및 C2 잔기들), 유연한 조인트 또는 힌지(C3), 및 IGF-II의 C-도메인으로부터 유래된 C-터미널 구간(C4-Cn, 여기서 n=6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)을 포함하는 신규 C-도메인을 설계함으로써 달성된다. N-터미널 산성 요소는 인슐린 글라진의 기본 ArgB31-ArgB32 요소의 전하들을 역전시킨 32-잔기 B-체인들을 포함하는 2-체인 인슐린 유사체들을 연구하여 설계되었다(미국 특허 번호 8,399,407 "비표준 인슐린 유사체들", 문헌의 원용). 이론에 제한되는 것은 바람직하지 않으나, 2-잔기 산성 잔기는 IGF-1R과 유사체의 결합에 바람직하지 않은 정전기 반발을 제공하지만, 인슐린 수용체 아이소포름들에 의해 양호하게 견딜 수 있을 것으로 예측된다. 또한, 이론에 제한되는 것은 바람직하지 않으나, 본 발명의 C-도메인의 IGF-II 유래 C-터미널 구간은 인슐린 수용체 아이소포름과 바람직한 상호작용을 제공하여 단순히 테더 또는 공간 요소가 아닌 보조적인 수용체 결합 요소로 작용하는 것이 예측된다.
일반적으로, 본 발명은 본 발명의 C-도메인과 포지션 A8에 대체물들을 포함하는 변형된 A-체인을 포함하는 싱글-체인 인슐린 유사체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 열결 도메인(C 도메인)이 6-11의 길이를 갖고 두개의 요소들을 포함하는 신규 클래스의 싱글-체인 인슐린 유사체들에 속한다. N-터미널 요소는 첫 두개의 잔기들(C1, C2 및 C3로 지정되고, 연장된 인슐린 B-체인의 B31-B33 잔기들에 대응)을 포함하고 (i) C1 및 C2는 적어도 하나의 산성측 체인 및 -1 또는 12의 pH 7.4에서의 순 형식 정전 전하를 포함하고, (ii) C3은 글리신, 알라닌, 프롤린 또는 세린으로 제공되는 유연한 조인트 또는 킹크를 제공한다. 예를 들면, 하지만 다음의 디펩티드 구간들에 제한되지 않는다,: EEG, AEG, EAG, EDG, DEG, DDG, ADG, ADG, EEA, AEA, EAA, EDA, DEA, DDA, ADA, ADA, EEP, AEP, EAP, EDP, DEP, DDP, ADP, ADP, EES, AES, EAS, EDS, DES, DDS, ADS, 또는 ADS. C-터미널 요소는 C 도메인이 SRVSRRSR(SEQ ID NO: 13)의 시퀀스를 갖는 인간 인슐린 유사 성장 인자 II(IGF-II)에서 유래된 펩티드 구간을 포함한다. C4-Cn(n=6-11)의 잔기들은 IFG-II의 C-도메인 또는 RVSRRSR, VSRRSR, SRRSR, RRSR, 또는 RSR 시퀀스들을 갖는 C-터미널 단편들로부터 유래된다. 이들 하이브리드 C 도메인들은 최소 6(N-터미널 요소에 3개의 잔기들 및 C-터미널 요소에 3개의 잔기들)에서 최대 11(N-터미널 요소에 3개의 잔기들 및 C-터미널 요소에 8개의 잔기들)까지의 길이에 대한 범위를 갖는다. A-체인은 산촉매 디아미드화 또는 Asn 관련된 화학적 열화의 다른 모드들을 피하기 위하여 A8(리신, 아르기닌 또는 히스티딘)에서의 기본적 대체물 및 A21(Gly, Ala, 또는 Ser)에서의 기본적 대체물을 포함한다. 일례에서, B-체인은 이스트에서의 생합성의 과정에서 Lys 특정 단백질 가수 분해 분할을 피하기 위하여 LysB29→Arg의 대체물들도 포함한다.
또 다른 일례에서, 본 발명은 EEGXn 형태의 링커들을 갖는 싱글-체인 인슐린(SCI)의 시리즈들을 제공하고 (i) C1 및 C2 포지션들에서의 EE 요소는(란투수의 활성 요소인 인슐린 글라진의 RR 요소와 반대의 전하를 갖는) IFG-1R의 크로스 결합을 방해하고, (ii) G는 유연한 힌지를 제공하고, (iii) Xn은 IGF-II(SRVSRRSR 시퀀스; SEQ ID NO 13)의 C-도메인으로부터 유래된다. IGF-II 유래 테더의 사용은 다수의 Arg 잔기들의 존재(등전점의 순이동을 제공하기 위해 음의 EE 요소를 보상하는) 및 IR 수용체 결합을 증가시키는 가정된 역할을 제공한다. 써말린-바잘(Thermalin-basal)로 명명된 SCI는 8 잔기 연결 펩티드(EEGSRRSR 시퀀스; SEQ ID NO: 14)를 포함하고 이 길이의 C 도메인들은 수용체 결합에서의 유도된 맞춤의 메커니즘과 호환된다.
도 1a는 A 및 B 체인을 포함하는 인간 프로인슐린의 시퀀스를 개략적으로 나타내는 도면으로 플랭킹 이염기 분할 사이트들(채워진 원들) 및 C-펩티드(빈 원들)로 연결 영역을 나타낸다.
도 1b는 프로인슐린의 구조적 모델로 인슐린 유사 반족 및 무질서 연결 펩티드 (파선)을 포함한다.
도 1C는 B-체인에서의 B27 및 B30 잔기들의 포지션을 나타내는 인간 인슐린의 시퀀스를 개략적으로 나타낸다.
도 2는 야생형 인간 인슐린 및 본 발명의 싱글-체인 인슐린 유사체(SCI-59B)의 수용체-결합 연구들의 연구들을 나타내는 그래프이다. 상부 패널, 인슐린 수용체의 아이소포름 A를 적용한 경쟁적 변위 분석 (IR-A). 중부 패널, 인슐린 수용체의 아이소포름 B를 적용한 경쟁적 변위 분석 (IR-B). 하부 패널, 제1종 IGF 수용체를 적용한 경쟁적 변위 분석 (IGF-1R). 심볼: 인간 인슐린(■) 및 SCI-59(▲). 이들 데이터의 분석은 표 1에서 제공된 바와 같이 호르몬-수용체 해리상수들의 추산을 가능하게 한다.
도3은 본 발명의 싱글-체인 인슐린 유사체의 2D-NMR 스펙트럼을 제공한다(SCI-59B). 스펙트럼은 pH 3.5(기저 제형에서와 같이) 및 37 °C에서 얻었고; 혼합 시간은 200 ms이었고 전계강도는 700MHz이었다.
도4는 steptozotocin에 의해 당뇨병이 발병된 쥐들(쥐당 20 μg)에서의 중간-투여량 인슐린 유사체의 생물학적 시험의 결과를 나타낸다. 시간에 따른 혈 [당]의 저감: 휴마로그(리스프로 인슐린)(
Figure 112015052983861-pct00001
), (SCI-59B;
Figure 112015052983861-pct00002
), 랜터스(인슐린 글라진)(
Figure 112015052983861-pct00003
), 및 희석액(
Figure 112015052983861-pct00004
). 각 제형의 한개의 유닛(U-100)이 5개의 STZ 쥐들(N=5)에 피하 저장되게 주입되었고 에러바들은 표준오차를 나타낸다.
도 5a는 steptozotocin에 의해 당뇨병이 발병되고 신선한 써말린-바잘 (T-b;
Figure 112015052983861-pct00005
), 가열된 써말린-바잘 (
Figure 112015052983861-pct00006
), 신선한 랜터스(인슐린 글라진) (
Figure 112015052983861-pct00007
), 가열된 랜터스(인슐린 글라진) (
Figure 112015052983861-pct00008
),또는 희석액 제어 (
Figure 112015052983861-pct00009
)를 투약한 스프래그 다우리 쥐들에서 시간에 따른 혈당 레벨들을 나타내는 그래프이다. 가열된 샘플들은 37 °C에서 완만하게 교반되었다. 써말린-바잘는 56일 동안 가열되었고 랜터스는 12일 동안 가열되었다.
도 5b는 steptozotocin에 의해 당뇨병이 발병되고 신선한 써말린-바잘 (T-b;
Figure 112015052983861-pct00010
), 가열된 써말린-바잘 (
Figure 112015052983861-pct00011
), 신선한 랜터스(인슐린 글라진) (
Figure 112015052983861-pct00012
), 가열된 랜터스(인슐린 글라진) (
Figure 112015052983861-pct00013
),또는 희석액 제어 (
Figure 112015052983861-pct00014
)를 투약한 스프래그 다우리 쥐들에서 시간에 따른 혈당 레벨들을 나타내는 그래프이다. 가열된 샘플들은 45 °C에서 완만하게 교반되었다. 써말린-바잘는 39일 동안 가열되었고 랜터스는 6일 동안 가열되었다.
본 발명은 장기간의 활동, 5-100%(하한은 프로인슐린에 대응되도록 선정)의 범위의 절대적 친화력들을 갖는 야생형 인슐린과 비슷한 IR-A/IR-B 수용체-결합 친화력들의 비율, IGF-1R에 대해 증가된 식별력, 포지션 A21에서의 화학적 열화에 대해 추정되는 증가된 저항성(Gly, Ala 또는 Ser에 의한 Asn의 대체에 의해), 상온보다 높은 온도에서의 피브릴화에 대한 추정되는 증가된 저항성(싱글-체인 토폴로지에 의해), 및 추정되는 증가된 열역학적 활동(어느 정도 Arg, Lys, His, Orn의 기본적 측쇄에 의한 ThrA8의 대체에 의해)을 제공하는 싱글-체인 인슐린 유사체에 관한 것이다.
본 발명의 적어도 일부 실시예에 의하면, 싱글-체인 유사사체의 등진점은 6.8에서 7.8 사이에 있어 산성 조건(pH 3.0-4.5)하에서의 액상 제형화는 pH가 중성 근처로 이동함에 따라 피하 지방 저장에서 등전 침전이 이루어진다는 것이 예상된다. 또한, 본 발명의 적어도 일부 실시예에 의하면, 싱글-체인 인슐린 유사체는 당해 기술에서 T6 인슐린 헥사머, T3Rf 3 인슐린 헥사머, 및 R6 인슐린 헥사머로 알려진 기존의 아연 인슐린 헥사머와 유사한 단백질 헥사머들의 아연-이온-의존성 제형이 일어나도록 하는 능력을 보유한다.
싱글-체인 유사체들이 돼지, 소, 말 및 개의 인슐린들과 같은 동물 인슐린들부터 유래된 A 및 B 도메인 시퀀스로 만들어 질 수도 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한 또는 이와 다르게, 본 발명의 인슐린 유사체는 피치아 파스토리스, 사카로미세스 세라비시에 또는 다른 이스트 발현 종 또는 스트래인들에서의 이스트 생합성에서 전구체 폴리펩티드의 Lys-유도된 단백질 분해를 피하기 위해 B1-B3 잔기들의 삭제 또는 리신(예컨대, 야생형 인간 인슐린에서의 LysB29)이 부족한 변형 B 체인과의 합성을 포함할 수 있다. 본 발명의 싱글-체인의 B-도메인은 선택적으로 열역학적 안정성 및 수용체-결함 활동을 증가시키기 위한 다른 대체물들을 포함할 수 있다. ThrB27, ThrB30 또는 C-도메인에서 하나 이상의 세린 잔기들이 개별적으로 또는 조합으로 단당류 부가물에 의해 변형될 수 있다. 이의 예로 O 결합형 N-아세틸-β-D-galactopyranoside(GalNAc-Oβ-Ser 또는 GalNAc-Oβ-Thr로 지정된), O 결합형 α-D-mannopyranoside (mannose-Oβ-Ser 또는 mannose-Oβ-Thr)및/또는 O 결합형 α-D-glucopyranoside(glucose-Oβ-Ser 또는 glucose-Oβ-Thr)가 있다.
더욱이, 인간과 동물 인슐린들이 비슷하다는 것과 과거에 진성 당뇨병을 가진 인간 환자들에서의 동물 인슐린들의 사용을 고려하여, 인슐린의 시퀀스에서의 다른 작은 변형들, 특히, "보수적"이라고 여겨진 대체물들이 도입될 수 있다. 예컨대, 추가적인 아미노산의 대체물들이 발명에서 벗어나지 않고 비슷한 측쇄를 갖는 아미노노산 그룹들 내에서 만들어질 수 있다. 이들은 중성 소수성 아미노산들을 포함한다: 알라닌(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 루신(Leu 또는 L), 이소루신(Ile 또는 I), 프롤린(Pro 또는 P), 트립토판 (Trp 또는 W), 페닐알라닌(Phe 또는 F) 및 메티오닌(Met or M). 이와 같이, 중성 극성 아미노산들이 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 타이로신(Tyr 또는 Y), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Glu 또는 Q), 및 아스파라긴 (Asn 또는 N)의 그룹들 내에서 서로를 대체할 수 있다. 기본 아미노산들은 리신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R) 및 히스티딘 (His 또는 H)을 포함한다고 볼 수 있다. 산성 아미노산들은 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루탐산(Glu 또는 E)이다. 다른 언급이 없거나 문맥상에서 분명하면, 이후에 언급된 아미노산들은 L-아미노산이라고 간주되어야 한다. 표준 아미노산들은 같은 화학적 클래스에 속하는 비표준 아미노산들에 의해서도 대체될 수 있다. 제한되지 않는 예에 의해, 기본적인 측쇄 Lys는 더 짧은 측쇄 길이의 기본적 아미노산들(오르니틴, 다이아미노뷰틸릭산 또는 다이아미노프로피오닉산)에 의해 교체될 수 있다. Lys는 더 짧은 지방성 측쇄들(아미노뷰틸릭산 또는 아미노프로피오닉산)을 포함하는 유사체에 의해 대체되는 중성 지방성 등배전자체 노르로이신(Nle)에 의해서도 교체될 수 있다.
인간 프로인슐린의 아미노산 시퀀스가, 비교를 위해, SEQ ID NO: 1로 제공된다.
SEQ ID NO: 1(인간 프로인슐린)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 A 체인의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO: 2로 제공된다.
SEQ ID NO: 2(인간 A 체인)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 B 체인의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO: 3로 제공된다.
SEQ ID NO: 3(인간 B 체인)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
본 발명의 싱글-체인 인슐린 유사체들의 아미노산 시퀀스는 57, 57, 58, 59, 60, 61 및 62의 길이의 폴리펩티드들에 대응되는 SEQ ID NO: 4-10로 주어진다.
SEQ ID NO: 4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Xaa3-Glu-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa4
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이고; 및 Xaa4 는 Gly, Ala 또는 Ser이다.
SEQ ID NO: 5
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Xaa3-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa4
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이고; 및 Xaa4 는 Gly, Ala 또는 Ser이다.
SEQ ID NO: 6
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; 및 Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이다.
SEQ ID NO: 7
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; 및 Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이다.
SEQ ID NO: 8
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; 및 Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이다
SEQ ID NO: 9
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; 및 Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이다.
SEQ ID NO: 10
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa1-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3
여기서 Xaa1는 His, Arg, Lys or Orn을 나타내고; and Xaa2는 Lys, Arg, 또는 Orn이고; 및 Xaa3는 Ala, Gly, 또는 Ser이다.
다음의 DNA 시퀀스는 피치아 파스토리스에서 사용 패턴들을 위해 최적화된 코돈들을 갖는 싱글-체인 인슐린 유사체 SCI-59B(아래 참조)을 부호화한다.
SEQ ID NO: 11
TTCGTCAATCAACACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCATTGTACTTGGTCTGTGGTG
AGAGAGGATTCTTCTACACCCCTAGAACTGAGGAGGGTTCTAGAAGATCTAGAGGAATCG
TCGAGCAATGTTGTAGATCCATTTGTTCCTTGTACCAATTGGAGAACTACTGCGGATAA
유사 합성 유전자들은 SCI-59A(아래 참조) 및 SCI-59A 및 추가적인 대체물인 GluB13 →Gln을 포함하는 SCI-59B의 유도체를 부호화하는 피치아 파스토리스에서 준비되고 복제되었다.
본 발명의 두개의 싱글-체인 인슐린 유사체들(SCI-59A 및 SCI-59B로 지정)은 피치아 파스토리스에서의 전구체 폴리펩티드의 생합성에 의해 준비되었고 이 시스템은 분열 N-터미널 연장 펩티드를 갖는 고유의 이황화다리들을 포함하는 접힌 단백질을 분비한다. 분열된 싱글-체인 인슐린 결과물들은 30-잔기 B-도메인, 8-잔기 C-도메인 및 21-잔기 A-도메인의 합인 59의 길이를 갖는다. C-도메인 시퀀스는 각 사례에서 EE G SRRSR (SEQ ID NO: 14)이었고 산성 요소(포지션 C1 및 C2; 굵은)는 IGF-1R에 결합되는 것을 약화시키기 위해 도입되었고, Gly(포지션 C3; 이태릭)는 유연한 조인트로 도입되었고, IGF-II C-도메인-유래 요소(현재의 아날로그에서의 포지션 C4-C8; 밑줄)가 도입되었다. SCI-59A는 추가적인 대체물들인 ThrA8→His, AsnA21→Gly, 및 LysB29→Arg들을 포함하였고, 이에 반해 SCI-59B는 추가적인 대체물들인 ThrA8→Arg, AsnA21→Gly, 및 LysB29→Arg들을 포함하였다(SEQ ID NO: 7) SCI-59A의 정식 등전점(pi)은 C-도메인 시퀀스(두개의 추가적인 글루탐산 잔기들에 의해 부분적으로 오프셋된 세개의 추가적인 아르르기닌 잔기들) 및 포지션 A8에서의 추가적인 적정 히스티딘의 결합된 효과에 의해 중성으로 이동될 것으로 예측되었고 B29에서 Arg의 Lys로의 대체는 등전점에서 무시할 수 있는 효과가 있을 것으로 예상되었다. SCI-59B의 정식 pi는 C-도메인 시퀀스(SCI-59A에서와 같이 두개의 추가적인 글루탐산 잔기들에 의해 부분적으로 오프셋된 세개의 추가적인 아르르기닌 잔기들) 및 포지션 A8에서의 추가적인 Arg의 결합된 효과에 의해 중성으로 더 이동될 것으로 예측되었다.
체외 수용체-결합 친화력
인슐린 SCI-59A SCI-59B
인간 IR-A 0.026 ± 0.005 0.249 ± 0.036 0.055 ± 0.008
인간 IR-B 0.058 ± 0.007 1.20 ± 0.165 0.154 ±.021
인간 IGF-1R 0.45 ± 0.54 102.3 ± 32.0 35.3 ±7.4
약자: IR-B, 인슐린 수용체의 스플라이싱 아이소포름 B; IGF-1R, 제1종 IGF 수용체.
표 1은 야생형 인간 인슐린과 관련된 SCI-59A 및 SCI-59B의 수용체-결합 친화력들을 포함한다. 기준 데이터는 도 2에 제공한다. 두개의 싱글-체인 유사체들 각각은 야생형 인슐린에 비해 IGF-1R과 매우 낮은 크로스-겨합을 보여준다. (상대적 활동은 유사체 대 야생형 인간 인슐린의 호르몬-수용체 해리상수의 비율로 정의되고, 이는 125I-인간 인슐린을 사용한 경쟁적 변위 분석에 의해 측정된다.) SCI-59B는 IR-A 및 IR-B의 상대적 친화력이 표적 범위인 5-100% 내에 있고 야생형 인슐린의 것과 비슷한 비율을 갖는 것을 보여준다. 이와 반대로 SCI-59 A의 IR-A 및 IR-B의 진화력들(포지션 A8에서 다른)은 SCI-59B의 것들에 비해 각각 낮다. 반면, IR-A를 위한 SCI-59A의 친화력은 표적 범위(약 10%) 안에 있고, IR-B를 위한 이의 친화력은 표적 범위의 낮은 값을(실험 오류 내 5%) 가져 야생형 인슐린에 비해 IR-A/IR-B 결합 비율이 상승된다. 이러한 발견은 연결기 EEGSRRSR (SEQ ID NO: 14)의 맥락에서 포지션 A8에서 Arg가 His보다 더 바람직하다는 것을 보여준다. 예측된 SCI-59B의 pi도 SCI-59A의 것보다 인슐린 글라진(이는 마찬가지로 두개의 아르기닌 잔기들을 초과하여 포함한다)을 것에 더 가깝다.
수용체-결합 활동들의 분석을 위한 프로토콜은 다음과 같다. 미량정량 스트립판들(Nunc Maxisorb)은 4℃에서 AU5 IgG (인산완충식염수에서 40 mg/ml의 100 μl/well)로 하룻밤동안 배양되었다. 결합 데이터는 2측 순차적인 모델에 의해 분석되었다. 데이터는 비특이성 결합(1μM의 인간 인슐린의 존재에서 연관된 막에 남아 있는 방사능의 양)에 대해 보상되었다. 모든 분석에서 경쟁하는 리간드의 부재내에 속박된 추적자의 비율은 리간드-소모 아티팩트를 피하기 위해 15% 미만이었다. 해리상수(Kd)는 Whittaker과 Whittaker(2005. J. Biol Chem. 280:20932-20936)에 의해 설명된 수학 모델에 맞추어 결정되었다. 이 모델은 이종 조직 경쟁의 가정을 통한 비선형 회귀분석을 적용하였다(Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114).
구조적 및 생물학적 연구들은 SCI-59B의 더 높은 수용체-결합 친화력가 더 바람직한 예측된 등전점 때문에 SCI-59B에 집중하였다. 2D-NMR NOESY 스펙트럼은 접힌 구조에 대한 증거를 제공하였고(도3), NOE들의 패턴과 화학적 이동은 57-잔기 싱글-체인 유사체(Hua, Q. X. et al. (2008))의 기존 분석과 일치한다.
동물 모델에서의 유사체들의 생물학적 활동과 효능을 평가하기 위해, 남성 스프래그 다우리 쥐들(평균 체질량이 ~300그램)을 steptozotocin(STZ)에 의해 당뇨병을 발병하였다. KP-인슐린(인슐린 리스프로, 휴말록의 활성 요소; Eli Lilly and Co.), 인슐린 글라진(랜터스; Sanofi-Aventis), 및/또는 본 발명의 싱글-체인 인슐린을 포함하는 단백질 용액들. 제어는 16mg의 글리세세린, 1.6mg의 메타 크레졸, 0.65mg의 페놀 및 3.8mg의 pH 7.4인 인산나트륨으로 구성된 단백질 결핍 릴리 희석제(Eli Lilly and Co.에서 얻은)의 주입에 의해 제공되었다. SCI-59B의 활동은 도 4에 나타난 바와 같이 휴뮬로그(U-100 강도는 유효한 사업적 유리병에서 측정) 및 랜터스(U-100 강도는 유효한 사업적 유리병에서 측정)의 것과 비교하여 평가하였다. SCI-57B는 pH가 3.5로 조절(pH 4.0이 아닌)한 것 외에는 랜터스에서의 인슐린 글라진의 제형에 따라 제형되었다. 이들 제형들의 각 유닛은 피하에 주입하였고 이로 인한 혈당 농도에서의 변화를 임상 혈당측정기(Hypoguard Advance Micro-Draw meter)를 사용한 연속 측정에 의해 모니터링하였다. 쥐들은 5개(N=5) 단위의 그룹으로 시간 t=0에서 피하에 주입하였다. 피는 꼬리의 자른 끝 부분에서 시간 0에서 360분이 될 때까지 매 10분마다 얻었다. 본 발명의 SCI-59B는, 랜터스의 것과 비스한 제형의 조건하에서, 랜터스의 것보다 비슷하거나 더 긴 활동의 기간을 가지면서 인슐린 글라진의 생물학적 활동의 상당한 부분을 보유하는 것을 발견했다.
59mer SCI는 대체물 ArgA8, GlyA21, ArgB29 및 연결기 기EEGRSSSR (SEQ ID NO: 7)를 갖고 합성되었다. 이 SCI는 써멀린-기저 또는 도 5와 같이 줄여서 T-b로 나타낸다. 열역학적 안정성은 CD-모니터링 구아니딘 변성에 의해 25℃ 및 pH 4.0에서 평가되었다. 2 상태 모델의 활용으로 3.5(±0.1) kcal/mole의 중첩풀림(△GU)의 자유 에너지를 얻었고 이는 이들 조건들(2.7(±0.1) kcal/mole)하에서의 인슐린 글라진의 안정성보다 높다. 이와 같은 자유 에너지(△△GU 0.7(±0.2))의 증가는 화학적 안정성의 상당한 증가를 예측한다.
피브릴화에 대한 저항성은 인슐린 글라진과 관련하여 pH 4.0에서 37 및 45℃ 에서 U-100 제형에서의 완만한 애지애이션에 의해 조사하였다. 반면, 랜터스는 37℃에서 10일 후에, 45℃에서 5일 후에 침전하였고, 써말린-바잘의 용액들은 티오플라빈 T(아밀로이드의 프로브)의 형광에서의 증가 없이 깨끗하게 남았다.
효능은 streptozotocin에 의해 당뇨병을 발병시킨 스프래그 다우리 쥐들(약 300g)에서 시험하였다(도 5a 및 5b). U-100 (0.6 mM) 써말린-바잘 또는 랜터스(쥐당 1 유닛; 써말린-바잘 그룹 (▲)에서 N=5, 랜터스 그룹(◆)에서 N=10)의 피하 주입 이후, 이로 인한 혈당 농도(AUC)의 저감 및 회복은 써말린-바잘의 효능이 랜터스의 효능과 비슷하거나 더 좋다는 것을 나타낸다. 써말린-바잘의 활동의 기간도 랜터스의 것을 초과하였다. 37℃ 및 45℃에서 완만한 애지테이션에서의 써말린-바잘 또는 랜터스의 효능의 보유 또는 손실은 랜터스는 자신의 효능(■)을 급격하게 잃어버린 반면, 써말린-바잘(●)는 이러한 어려운 조건하에서 몇 주간 완전한 활동을 보유하였다.
진성 당뇨병을 가진 환자를 치료하는 방법은 이후에 설명하는 싱글-체인 인슈린 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서는, 싱글-체인 인슐린 유사사체들이 이스트(피치아 파스토리스) 또는 고유 단편 결찰에 의한 전체적인 화학적 합성이 될 수 있다. 준비의 합성 루트가 비표준 변형의 경우에 바람직하지만,
연장된 유전자-코드 기술 또는 세개-베이스 코돈 기술에 의한 비표준 변형을 포함하는 싱글-체인 유사사체들의 부분 집합을 제조하는 것이 가능할 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서는, 비표준 아미노산 대체물들을 사용하면 화학적 열화 또는 물리적 열화에 대한 싱글-체인 인슐린 유사사체의 저항성을 증가시킬 수 있다. 우리는 본 발명의 유사사체들이 진성 당뇨병 또는 신진대사 장애의 치료 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 인슐린 유사사체의 전달 경로는 시린지 또는 펜 장차를 통해 피하 주입에 의한다.
의약 조성물은 이러한 인슐린 유사체들을 포함할 수 있고 선택적으로 아연을 포함할 수 있다. 인슐린 유사체 헥사머당 2.2 아연 원자들에서 인슐린 유사체 헥사머당 10 아연 원자들의 범위를 갖는 변화하는 아연 이온:단백질 비율에서 포함될 수 있다. 제형의 pH 는 pH 3.0 - 4.5의 범위를 갖는다. 이와 같은 제형에서, 인슐린 유사체의 농도는 보통 0.6-5.0 mM 사이이고; 5mM까지의 농도는 유리병 또는 펜을 사용할 수 있고; 더 농축된 제형들(U-200 이상)은 현저한 인슐린 저항성을 갖는 환자들에게 특히 유리하다. 첨가제는 글리세세롤, 글리신, 아르르가닌, 트리스, 다른 버퍼들과 소금, 및 페놀 및 메타 크레졸과 같은 항균성 보존제를 포함하고 후자의 보존제는 인슐린 헥사사머의 안정성을 향상시킨다고 알려져 있다. 이와 같은 의약 조성물은 환자에게 생리학적으로 효과적인 양의 조성물을 투약하여 진성 당뇨병 또는 다른 질병을 갖는 환자를 치료하는 사용될 수 있다.
상기 개시된 내용에 따르면, 제공되는 싱글-체인 인슐린 유사체가 상기 언급된 목표를 수행할 수 있다는 것은 명백하다. 즉, 이들 인슐린 유사사체들은 피브릴화에 대해 향상된 저항성을 보여주면서, 바람직한 약동학적 및 약역학적 특성들(지속되는 활동을 부여)을 보유하고, 야생형 인슐린의 생물학적 활동 중 적어도 일부분을 유지한다. 따라서, 다양한 변형들도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이고, 여기에 개시되고 설명된 본 발명의 범주 내에서 특성 구성요소의 선택이 가능하다.
하기 문헌들은 여기서 설명한 시험 및 분석 방법들이 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 이해할 수 있다는 것을 보여주기 위해 인용되었다.
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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> X is A, G, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> X is G, A or S <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Glu 20 25 30 Gly Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 <210> 5 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> X is A, G, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> X is G, A or S <400> 5 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Xaa 20 25 30 Gly Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> X is G, A or S <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys 35 40 45 Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 <210> 7 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R, or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> X is G, A or S <400> 7 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile 35 40 45 Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 <210> 8 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R, or ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> X is G, A or S <400> 8 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser 35 40 45 Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 60 <210> 9 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> X is G, A or S <400> 9 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa 35 40 45 Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 60 <210> 10 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K, R, or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is H, R, K or Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> X is G, A or S <400> 10 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 60 <210> 11 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ttcgtcaatc aacacttgtg tggttcccac ttggttgagg cattgtactt ggtctgtggt 60 gagagaggat tcttctacac ccctagaact gaggagggtt ctagaagatc tagaggaatc 120 gtcgagcaat gttgtagatc catttgttcc ttgtaccaat tggagaacta ctgcggataa 180 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 14 Glu Glu Gly Ser Arg Arg Ser Arg 1 5

Claims (14)

  1. SEQ ID NOS: 4-10 중 어느 하나의 시퀀스를 포함하는 싱글-체인 인슐린 유사체.
  2. 제1 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 시퀀스를 포함하는 싱글-체인 인슐린 유사체.
  3. 제2 항에 있어서, 포지션 29에 있는 Xaa는 Arg인 싱글-체인 인슐린 유사체.
  4. 제3 항에 있어서, 포지션 59에 있는 Xaa는 Gly.인 싱글-체인 인슐린 유사체.
  5. 제4 항에 있어서, 포지션 46에 있는 Xaa는 Arg.인 싱글-체인 인슐린 유사체.
  6. 제4 항에 있어서, 포지션 46에 있는 Xaa는 His.인 싱글-체인 인슐린 유사체.
  7. SEQ IDS: NO 4-10의 어느 하나의 싱글-체인 인슐린 유사체를 인코딩하는 핵산 시퀀스.
  8. 제7 항에 있어서, 상기 시퀀스는 SEQ ID NO: 11을 포함하는 핵산 시퀀스.
  9. 제1 항의 싱글-체인 인슐린 유사체를 포함하는, 진성 당뇨병의 치료를 위한 약학조성물.
  10. 제9 항에 있어서, 상기 싱글-체인 인슐린 유사체는 SEQ ID NO: 7의 시퀀스를 갖는, 진성 당뇨병의 치료를 위한 약학조성물.
  11. 제10 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 포지션 29에서의 Xaa가 Arg인, 진성 당뇨병의 치료를 위한 약학조성물.
  12. 제11 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 포지션 59에서의 Xaa가 Gly인, 진성 당뇨병의 치료를 위한 약학조성물.
  13. 제12 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 포지션 46에서의 Xaa가 Arg인, 진성 당뇨병의 치료를 위한 약학조성물.
  14. 제12 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 포지션 46에서의 Xaa가 His인, 진성 당뇨병의 치료를 위한 약학조성물.
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