KR100508616B1 - 염기성 아미노산 첨가를 통한 활성이 증가된 단일사슬 인슐린 아날로그 - Google Patents

염기성 아미노산 첨가를 통한 활성이 증가된 단일사슬 인슐린 아날로그 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염기성 아미노산 첨가를 통한 단일사슬 인슐린 유사체의 활성이 강화된 인슐린 아날로그 및 그의 제조방법과 당뇨병치료에 적용함에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B사슬(B-chain)과 A사슬(A-chain)의 사이에, 양 말단에 아르기닌(arginine) 또는 리신(lysine)을 포함하는 7 내지 15개의 아미노산으로 구성된 펩티드가 첨가된 단일사슬 인슐린 유사체(single-chain insulin analog), 이들 유사체의 제조 및 이들 유사체를 이용한 당뇨병치료에 관한 것이다.

Description

염기성 아미노산 첨가를 통한 활성이 증가된 단일사슬 인슐린 아날로그{Insulin analogs having enhanced bioactivity in the single-chain by basic amino acid residues}
본 발명은 염기성 아미노산 첨가를 통한 단일사슬 인슐린 유사체의 활성이 강화된 인슐린 아날로그 및 그의 제조방법과 당뇨병치료에 적용함에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B사슬(B-chain)과 A사슬(A-chain)의 사이에, 양 말단에 아르기닌(arginine) 또는 리신(lysine)을 포함하는 7 내지 15개의 아미노산으로 구성된 펩티드가 첨가된 단일사슬 인슐린 유사체(single-chain insulin analog), 이들 유사체의 제조 및 이들 유사체를 이용한 당뇨병치료에 관한 것이다.
당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM)은 자가면역반응에 의하여 인슐린을 생산하는 췌장의 베타세포가 파괴되어 발병하는데, 이의 치료방법으로 인슐린의 주입, 췌장의 베타세포의 재생 및 이식, 유전자 치료 등 여러가지 방법이 연구되었다( Giannoukakis, N. et al.(1999) Diabetes, 48:2107).
현재, 당뇨병환자들의 치료책으로 가장 널리 이용되고 있는 방법으로, 1일에 2-3회 가량의 인슐린 투여가 이루어지고 있다. 인슐린 저항성에 의해 나타나는 제 2형 당뇨병의 경우, 약 30%의 당뇨병 환자들에 있어 인슐린투여를 요하고 있다.
인슐린은 체장의 베타세포에서 분비되는 51개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 호르몬으로서 동물에서 혈당의 조절에 관여한다. 인슐린은 다이설파이드 결합으로 연결이 되어 있는 A사슬과 B사슬로 구성되어 있는데 생체 내에서는 프로인슐린에서 C-펩타이드가 단백질분해효소에 의해 가수분해되어 유리된 후 생성된다(In: Insulin : Molecular Biology and Pathology(ed. Ashcroft, F.M. & Ashcroft, S.J.H.) IRL Press, Oxford(1992)).
인슐린 활성은 세포 표면에 있는 인슐린 수용체에 단량체 인슐린이 결합함으로서 개시된다. 수용체 결합의 정확한 성질 및 수용체-결합 상태에서의 인슐린 구조는 현재 약학 및 생물물리학적으로 커다란 관심사이다. 다양한 돌연변이 및 화학적 변형이 수행되었고, 그 결과는 주로 인슐린의 기능적 표면이 B사슬의 C-말단 및 A사슬의 N-말단을 포함함을 나타낸다. 그중 특별한 관심은 유연성(flexibilty)이 수용체 결합에 중요하다고 여겨지는 B-사슬의 C-말단 영역이다.
지난 수십년간 많은 종류의 단일사슬 인슐린 유사체가 만들어 졌다. 이들 유사체들은 B사슬의 C-말단과 A-사슬의 N-말단을 다양한 길이의 펩타이드 또는 화합물로 구성된 링커(linker)로 연결시켰다. B사슬의 C-말단 영역에 위치하는 LysB29와 A사슬의 N-말단의 GlyA1을 직접 연결시킨 단일-사슬 인슐린 유사체의 경우 생물학적으로 불활성을 나타내었다(Derewenda, U., Derewenda, Z., Dodson, E.J., Dodson, G.G. & Bing, X(1991) J. Mol. Biol. 220: 425).
단일사슬 인슐린 유사체는 초기에는 화학적인 방법에 의해 합성되었다. 다양한 길이의 화합물 링커를 첨가한 단일사슬 인슐린 유사체의 활성을 조사한 결과 어느 경우에도 인슐린 대비 14% 이상의 활성을 얻지를 못하였다(Cutfield, J.,Cutfield, S., Dobson, E., Dobson, G., Hodgkin, D. & Reynolds, C.(1981) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362: 755). B사슬(1-29)과 A사슬(1-21) 사이를 알라닌-알라닌-리신으로 구성된 링커를 첨가한 단일사슬 인슐린 유사체의 경우 인슐린의 0.5%의 활성을 나타내었다 (Kobayashi, M., Sasaoka, T., Sugibayashi, M., Iwanishi, M. & Shigeta, Y.(1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 7: 25). B사슬과 A사슬 사이에 RR-31개의 아미노산-KR 서열을 지닌 프로인슐린은 인슐린에 비해 약 2%의 수용체 결합 활성을 지닌 것으로 알려져 있다. 최근까지 프로인슐린을 포함하여 단일사슬 인슐린 유사체는 인슐린의 활성에 훨씬 미치지 못하며, 유의적으로 감소된 수용체 결합력을 나타내었다. 높은 활성을 지닌 단일-사슬 인슐린 유사체의 개발은 그 자체로서 인슐린 대체제로의 이용뿐 만 아니라 새로운 인슐린 유사체 또는 비-펩티드성 인슐린 대체제(alternative)의 고안을 촉진할 수 있다.
본 발명에서는 B사슬의 C-말단과 A사슬의 N-말단 사이에 여러 개의 염기성 아미노산을 포함하는 링커를 첨가시켜, 단일사슬 인슐린 유사체의 활성을 획기적으로 강화되도록 고안하였다. 이렇게 만들어진 단일사슬 인슐린 유사체들은 쥐를 이용한 생체 내(in vivo) 실험에서 기존 인슐린과 유사한 혈당강하 능력을 나타내었다. 또한 본 발명에서 고안된 단일사슬 인슐린 유사체들은 모두 인슐린보다 장시간 활성(long-acting)을 나타내, 인슐린 대체제로의 적용이 가능함을 보여주고 있다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 염기성 아미노산 첨가를 통한 단일사슬 인슐린 유사체의 활성을 강화하는 방법을 제공하여 이를 당뇨병치료에 적용함에 그 목적이 있다. 즉, 본 발명은 단일사슬 인슐린 유사체들이 인슐린 활성을 나타내는데 있어 인슐린의 B사슬의 C-말단과 A사슬의 N-말단 사이에 첨가하는 연결 펩티드(linker peptide)의 길이와 연결 펩티드 양 말단에 첨가하는 염기성 아미노산의 개수가 단일사슬 인슐린 유사체의 활성에 대단히 중요하게 작용함을 발견하여 이를 토대로 새로운 인슐린 유사체를 개발하게 된 것이다.
본 발명은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지닌 B사슬 - L사슬(링커 아미노산 서열을 지닌 사슬) - 서열번호: 1의 아미노산 서열을 지닌 A사슬로 구성된 단일사슬 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.
상기식에서 L사슬은 7 내지 15 개의 아미노산 서열을 가지며 하기식(Ⅰ)로 나타낸다.
X1 - Y - X2 (I)
X1: 아르기닌 또는 리신에서 선택된 2 내지 3 개의 염기성 아미노산 서열
Y: 3 내지 11 개의 불특정 아미노산 서열
X2: 아르기닌 또는 리신에서 선택된 2 내지 3 개의 염기성 아미노산 서열
또한 이때 상기식(I)의 L사슬에 있어서 Y는 3 내지 5 개의 불특정 아미노산으로 구성된 것임을 특징으로 하고, X1은 아르기닌-아르기닌 또는 아르기닌-아르기닌-아르기닌이고 X2는 리신-아르기닌 또는 리신-아르기닌-아르기닌임을 특징으로 한다.
한편 본 발명은 상기 단일사슬 인슐린 유사체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 당뇨병 치료제를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 구체적으로 아래의 일반식의 펩타이드 서열을 갖는 단일사슬 인슐린 유사체들의 염기서열과 아미노산 서열, 제조 및 정제, 그리고 이들 유사체를 이용한 당뇨병 치료에 관한 것이다.
본 발명은 단일사슬 인슐린 유사체들이 인슐린 활성을 나타내는데 있어 인슐린의 B사슬의 C-말단과 A사슬의 N-말단 사이에 첨가하는 연결 펩티드(linker peptide)의 길이와 연결 펩티드 양 말단에 첨가하는 염기성 아미노산의 개수가 단일사슬 인슐린 유사체의 활성에 대단히 중요하게 작용함을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
(실시예 1) 단일사슬 인슐린 유사체들(single-chain insulin analogs)의 제조
단일사슬 인슐린 유사체들은 인간프로인슐린 유전자로부터 제조하였다. 프로인슐린 유전자는 염기서열의 끝부분이 서로 겹치는 65~68 염기 길이의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성한 후, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 약어로 PCR)을 수행하여 제조하였다. 인간 프로인슐린 유전자는 E. coli의 코돈 선호도를 고려하여 박테리아 숙주 내에서 발현율을 극대화시키도록 디자인하였다. 단일사슬 인슐린 유사체들의 유전자는 앞서 제조한 인간프로인슐린 유전자를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 제조하였다. 제조된 유전자들은 발현 플라스미드인 pET-3a(Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorff, J.W.(1990) Methods Enzymol. 185: 60)에 삽입하였고, E. coli BL21 (DE3)를 형질전환시켜 단일사슬인슐린 유사체를 생산하는 균주를 제조하였다.
제조된 생산균주들 중, 단일사슬 인슐린 유사체 M4의 유전자를 포함하는 발현벡터를 E. coli 숙주세포에 도입하여 형질전환시킨 E. coli BL21(DE3 + pT2M4PI) 균주를 2002년 8월 31일 기탁번호 KCCM-10421호로 서울특별시 서대문구 홍제1동 유림빌딩 361-221호에 소재하는 한국미생물보존센터에 부다페스트조약에 의거 국제기탁하였다.
단일사슬 인슐린 유사체들은 E. coli 세포 내에서 봉입체(inclusion bodies)를 형성하는 융합 단백질 형태로 생산되었으며, 발현율은 총세포 단백질의 약 20~25% 수준이었다. 융합 단백질 유전자의 발현은 pET-3a 플라스미드 내의 T7 프로모터에 의해 조절되며, IPTG 첨가에 의해 E. coli BL21(DE3) 세포에서 발현되었다. 융합 단백질을 6M GuHCl로 녹인 후, 이어 술폰화반응을 수행하였다. 술폰화된 융합단백질은 Ni-킬레이트 친화(affinity) 컬럼을 이용하여 정제하였고, CNBr 반응에 의해 단일사슬 유사체 부분을 절단하였다. 술폰화된 단일사슬 인슐린 유사체들은 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고, 순도(purity)는 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다.
(실시예 2) 리폴딩(refolding) 반응
술폰화된 단일사슬 인슐린 유사체의 리폴딩 반응은 50μM(0.37mg/ml)의 유사체 단백질 농도에서 50mM 글리신(glycine) 완충액(pH 11.0) 내에서 수행되었다. 리폴딩 반응은 2 당량의 β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)(0.6mM)을 첨가한 후, 4℃에서 20시간 동안 천천히 교반하며 수행하였으며, H3PO4를 첨가하여 pH를 2.5로 맞추어 반응을 중지시켰다. 16㎍의 유사체에 해당하는 단백질 용액을 Zorbax C8-역상 컬럼(4.6mm ×250mm)에 주입한 후, 황산암모늄(pH 2.5)의 용매 A 및 90% 아세토나이트릴(acetonitrile)의 용매 B를 이용하여 20~60%의 용매 B의 직선 농도 기울기로 1ml/분의 유속으로 용출하였고, 215nm에서 흡광도를 측정하였다. 반응 생성물의 리폴딩 수율은 HPLC 크로마토그램 내에서 정확하게 폴딩된 종류의 피크(peak) 크기를 표준과 비교함으로서 측정하였다.
(실시예 3) CD 구조분석
단일사슬 인슐린 유사체의 구조적 특성을 조사하기 위하여 JASCO J-710 스펙트로폴라리미터(sepctropolarimeter) 기기를 이용하여 CD(circular dichroism) 스펙트럼을 측정하였다. 시료들은 0.2mg/ml 농도로 준비하였으며, 정확한 농도는 흡광 계수 6.2 x 103M-1cm-1을 이용하여 276nm에서의 흡광도를 측정하여 계산하였다.
(실시예 4) 생체 외(in vitro) 활성측정
생체외 활성측정은 실시예 4-1과 4-2에 각각 기술한 수용체 결합 활성과 글루코스 흡수 측정방법에 의해 실시하였고, 그 결과는 표 1에 나타나 있다. 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 결과는 수용체 결합 활성과 글루코스 흡수 활성 사이에는 서로 상관관계가 있어서 모든 유사체가 동일한 수용체 결합 기작에 의해 작용됨을 보여준다. 본 발명은 또한 인슐린 B사슬의 C-말단과 A사슬의 N-말단사이에 첨가되는 연결 펩티드의 양 말단에 염기성 아미노산인 R(Arg)과 K(Lys)의 첨가 유무에 따라 유사체들 간에 커다란 활성 차이가 나타남을 보여주고 있다. 단일사슬 인슐린 유사체가 인슐린 활성을 나타내는데 있어 염기성 잔기의 중요성은 또한 RR 및 KR 잔기를 지니지 않은 C-펩티드만을 함유한 데스(des)-[RR-KR]-프로인슐린이 프로인슐린 보다 훨씬 적은 수용체 결합활성을 나타내는데에서 증명되고 있다. D 시리즈 유사체의 결과는 연결 펩티드의 아미노산 잔기가 7개에서 3개로 감소될 때 10배 이상 활성이 감소하는 식으로 활성이 연결 펩티드의 크기에 크게 의존적임을 나타내고 있다.
(실시예 4-1) 인슐린수용체 결합 측정
인슐린수용체 결합 측정은 전술된 바와 같이 IM-9 임파구세포를 이용하여 수행하였다(Pollet, R.J., Standaert, M.L. and Hasse, B.A.(1977) J. Biol. Chem. 252: 5828). 간단히 설명하면 다음과 같다. ml당 5 x 106개의 IM-9 세포를 10pM의 인간 125I-인슐린(A-14)과 함께 RRA 완충액(100mM HEPES, 120mM NaCl, 1.2mM MgSO4, 2.5mM KCl, 15mM 구연산나트륨, 10mM 글로코스, 1mM EDTA 및 1% BSA, pH 7.6으로 조정됨)내에서 배양하였고, 최종 부피가 0.4ml가 되도록 시료의 농도를 증가시켰다. 15℃에서 2시간 배양 후, 10,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 IM-9 세포를 수집하였고, 상층액은 흡출방법에 의해 제거하였다. 세포에 결합된 125I-인슐린의 양은 Packard Auto-Gamma Counter를 이용한 방사능 측정을 통해 계산하였다.
(실시예 4-2) 세포 내 글루코스 흡수(uptake) 측정
3T3-L1 섬유아세포가 지방세포(adipocyte)로의 분화 및 글루코스 흡수 측정은 전술된 방법(Frost, S.C. and Lane, M.D.(1985) J. Biol. Chem. 260: 2646)을 일부 변경하여 다음과 같이 실시하였다. 3T3-L1 섬유아세포는 5%의 CO2/공기의 조건에서 10% 송아지 혈청으로 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 내에서 직사각형의 8-웰 디쉬(26 x 33mm)에서 컨플루언스(confluence)되도록 생장시켰다. 컨플루언스 2일 후, 세포는 2일 동안의 0.5mM의 이소부틸메틸크산틴(isobutylmethylxanthine), 0.25μM의 덱사메타손(dexamethasone) 및 1㎍/ml의 인슐린으로 처리한 후, 2일 동안 인슐린 단독 처리에 의해 분화를 유도시켰다. 그 후 medium을 DEME와 10%의 태아 소 혈청으로 2일에 한번씩 교환하였다. 세포는 분화후 8일과 10일 사이에 이용되었다. 글루코스 흡수를 측정하기 전에, 분화된 세포를 1%의 BSA를 함유한 혈청없는 DEME 내에서 배양하였다. 그 후 세포를 0.5%의 소혈청 알부민(KRBH/BSA)으로 보충한 3 x 2ml의 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(133.4mM NaCl, 4.75mM KCl, 2.544mM CaCl2, 1.187mM MgCl, 4.3mM NaHCO3, 1,187mM KHPO4, 10mM HEPES, pH 7.4)으로 세척하였고, 동일한 완충액으로 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 인슐린 또는 단일사슬 유사체를 연속 희석하여 첨가하였고, 세포를 다시 15분 동안 배양하였다. 글루코스 흡수는 2-[3H]데옥시글루코스(1μCi/웰) 및 글루코스(0.1mM 최종 농도)의 첨가에 의해 개시하였고, 10분 후 10mM의 글루코스를 함유한 차가운 인산염-완충 식염수(PBS)로 3회 세척함으로서 종결하였다. 세포를 0.1M NaOH에 용해한 후, 세포에 결합된 인슐린 또는 단일사슬 유사체의 양은 신틸레이션(scintillation) 카운팅을 이용한 방사능 측정을 통해 측정하였다.
단일사슬 인슐린 유사체의 활성. 서열은 B사슬의 C-말단과 A사슬의 N-말단을 연결하는 펩타이드의 서열을 나타냄
단일사슬인슐린 유사체 연결펩티드 서열 ED50
수용체 결합 활성 글루코스 흡수 활성
인슐린 - 0.74 (100)a 0.332 (100)
B1 RRRR APGDV KRR 2.21 (33.5) 1.153 (28.8)
B2 RRR APGDV KRRR 2.32 (31.9) 1.137 (29.2)
H1 RRR APGDV KR 1.33 (55.6) 0.806 (41.2)
H2 RR APGDV KRR 1.21 (61.2) 0.768 (43.2)
H3 RRR APGDV KRR 1.20 (61.7) 0.765 (43.4)
M1 RR APGDV KR 1.47 (50.5) 0.932 (35.6)
M2 RR YPGDV KR 1.63 (45.5) 0.932 (35.6)
M3 RR HPGDV KR 1.57 (47.3) 0.949 (35.1)
M4 RR GPG KR 1.52 (48.8) 1.06 (31.3)
M5 RR GGGGG KR 1.71 (43.4) 1.10 (30.2)
T1 RR GPG GG 3.26 (22.8) 1.95 (17.0)
T2 GG GPG KR 2.68 (27.7) 1.56 (21.3)
T3 RG GPG GR 2.94 (25.2) 1.88 (17.7)
D1 APGDV 25.1 (2.96) 9.38 (3.54)
D2 YPGDV 16.5 (4.50) 4.05 (8.20)
D3 HPGDV 22.3 (3.32) 6.23 (5.33)
D4 GPG 60.1 (1.23) 15.3 (2.17)
D5 GGGPGG 10.2 (7.25)
D6 GG GPG GG 5.69 (13.0) -
프로인슐린 RR-C peptide-KR 33.7 (2.20) 26.5 (1.25)
des-프로인슐린 C peptide 258 (0.29) -
a괄호안의 값은 인슐린 대비 상대치를 %로 나타낸 값.
(실시예 4-3) 생체 내(in vivo) 활성측정
단일사슬 인슐린 유사체의 생체 내 활성은 사육장치(cage)에 가두어 둔 Spraque-Dawley 쥐(rat)를 이용하여 측정하였다. 190-210g 체중의 수컷 쥐를 16시간 동안 굶긴 후, 대조군 혈액을 쥐 꼬리의 끝을 절단하여 채취하였고, 이어서 체중 100g 당 0.1ml의 단일사슬 인슐린 유사체 용액을 피하주입을 통해 주사하였다. 주사후 1시간과 2시간후에 혈액을 채취하였고, 전체 혈액 내의 글루코스 농도는 Alpkem Autoanalyzer를 이용하여 글루코스 옥시다제(glucose oxidase) 방법(Trinder, P.(1969) J. Clin. Pathol. 22: 246)을 이용하여 측정하였다.
단일사슬 인슐린 유사체들은 실험실 내에서보다 생체 내에서 활성이 더욱 높은 현상을 보였으며, 프로인슐린과 비슷하게 인슐린보다 더 장시간 활성을 나타내었다.
인간 인슐린은 피하 투여 1시간 후 최대 혈당강하 반응을 나타내었고, 혈액 글루코스 수준은 3시간과 4시간 사이에 투여하기 전과 같은 원점(baseline)으로 돌아옴을 나타내었다. 인간 프로인슐린은 피하 투여 2시간 후 최대 혈당강하 반응을 나타내었고, 이어 3~4시간에 걸쳐 혈당강하 반응이 나타났다. 단일사슬 인슐린 유사체도 인간 프로인슐린처럼 투여 2시간 후 최대 혈당강하 반응이 나타났으며, 이어 3~4시간에 걸쳐 혈당강하 반응이 나타남을 보였다. 이러한 결과는 단일사슬 인슐린 유사체들이(프로인슐린도 단일사슬임) 인슐린보다 장시간에 걸쳐 혈당강하효과를 나타내는데 훨씬 유리함을 보여주고 있다.
단일사슬 인슐린 유사체의 생체 내 혈당 강하효과(nmol/kg)
인슐린 유사체 ED50a(nmol/kg) 인슐린 대비 효능비(%)
1시간후 2시간후 1시간후 2시간후
인슐린 1.5 1.8 100 100
B1 3.3 2.8 45.8 65.2
H2 2.1 2.0 71.2 92.1
M2 2.8 2.2 53.6 81.8
M4 2.4 2.4 62.5 75.0
T1 4.2 4.1 35.7 43.9
D1 7.2 7.1 20.8 25.4
프로인슐린 8.0 8.0 18.8 22.2
a ED50 값은 단백질(인슐린, 프로인슐린 또는 인슐린유사체)을 피하주사후 각각 1시간과 2시간후 최대혈당 강하효과의 50% 값을 나타내는 단백질의 양을 나타냄.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 단일사슬 인슐린 유사체들이 인슐린 활성을 나타내는데 있어 인슐린의 B사슬의 C-말단과 A사슬의 N-말단 사이에 첨가하는 연결 펩티드(linker peptide)의 길이와 연결 펩티드 양 말단에 첨가하는 염기성 아미노산의 개수가 단일사슬 인슐린 유사체의 활성에 대단히 중요하게 작용함을 보여준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 IM-9 림프구 세포를 이용한 인간 인슐린과 단일사슬 인슐린 유사체들의 수용체 결합 활성을 나타낸 것이다. 인간 인슐린(●), M1(…), M2(－ ·－), M4(■), G5(­­­), T1(▼), T2(▲), D1(△), D2(▽), D4(□), D6(○), 인간 프로인슐린(◆), des-프로인슐린(◇).
도 2는 지방세포를 이용한 인간 인슐린과 단일사슬 인슐린 유사체들의 글루코스 흡수 활성을 나타낸 것이다. 인간 인슐린(●), M1(…), M2(－ ·－), M4(■), T1(▼), T2(▲), D1(△), D2(▽), D4(□), 인간 프로인슐린(◆).
도 3은 여러 pH 조건에서의 D4(△), D7(○), M4(▲), M5(●) 등의 단일사슬 인슐린 유사체들의 리폴딩 수율을 나타낸 것이다.
도 4는 인간 인슐린(-)과 M4(…), D4(­­­), D7(－ ·－) 등의 단일사슬 인슐린 유사체들의 근자외선(near-UV) CD 스펙트럼을 나타낸 것이다.
<110> SHIN, Hang-Cheol SEONG, Baik-Lin <120> Insulin analogs having enhanced bioactivity in the single-chain by basic amino acid residues <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

Claims (4)

  1. 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지닌 B사슬 - L사슬(링커 아미노산 서열을 지닌 사슬) - 서열번호: 1의 아미노산 서열을 지닌 A사슬로 구성된 단일사슬 인슐린 유사체
    상기식에서 L사슬은 7 내지 12 개의 아미노산 서열을 가지며 하기식(Ⅰ)로 나타낸다.
    X1 - Y - X2 (I)
    X1: 아르기닌-아르기닌 또는 아르기닌-아르기닌-아르기닌이고,
    Y: 3 내지 8 개의 불특정 아미노산 서열이고,
    X2: 리신-아르기닌 또는 리신-아르기닌-아르기닌이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기식(I)의 L사슬에 있어서 Y는 3 내지 5 개의 불특정 아미노산으로 구성된 것임을 특징으로 하는 단일사슬 인슐린 유사체
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제 2항의 단일사슬 인슐린 유사체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 당뇨병 치료제
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