MX2015005662A - Analogos de insulina de una sola cadena de larga accion. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un análogo de insulina de una sola cadena que contiene una cadena lateral básica en la posición A8 (Arginina, Histidina, Lisina u Ornitina), una cadena lateral básica en la posición B29 (Arginina, Histidina, Lisina u Ornitina) y un C-dominio reducido de 6-11 residuos de longitud. Los residuos C1 y C2 del C-dominio tienen una carga negativa neta de -1 o -2; C3 se elige de un grupo que consiste de Gly, Ala, Pro o Ser; y el segmento de C-dominio restante se deriva sucesivamente del C-dominio de IGF-II (RRSR, SRRSR, VSRRSR, RVSRRSR o SRVSRRSR; SEQ ID NO: 13). Un método para tratar a un paciente con diabetes mellitus u obesidad comprende administrar una cantidad fisiológicamente efectiva del análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo a un paciente.

Description

ANÁLOGOS DE INSULINA DE UNA SOLA CADENA DE LARGA ACCIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a análogos de hormona de polipéptido que exhiben propiedades farmacéuticas mejoradas, tales como estabilidad termodinámica incrementada, resistencia aumentada a la fibrilación térmica arriba de la temperatura ambiente, mitogenicidad disminuida y/o propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas alteradas, es decir, que confieren duración de acción más prolongada o duración de acción más rápida con relación a las formulaciones solubles de la hormona humana de tipo silvestre correspondiente. Más particularmente, esta invención se relaciona a análogos de insulina que consisten de una sola cadena de polipéptido que contiene una clase novedosa de dominios de conexión (C) reducidos entre los dominios A y B. De los 6-11 residuos de longitud, los dominios C de esta clase consisten de un elemento acidico N-terminal y un segmento C-terminal derivado del dominio de conexión de IGF-II humana. Los análogos de insulina de una sola cadena de la presente invención opcionalmente pueden contener sustituciones de aminoácido estándares o no estándares en otros sitios en los dominios A o B.

La ingeniería de proteínas no estándares, que incluyen agentes terapéuticos y vacunas, pueden tener amplios beneficios médicos y sociales. Las proteínas que ocurren naturalmente - como codificado en los genomas de seres humanos, otros mamíferos , organismos vertebrados , organismos invertebrados o células eucarióticas en general frecuentemente confieren múltiples actividades biológicas. Un beneficio de las proteínas derivadas sería lograr actividad selectiva, tal como enlace disminuido a los receptores celulares homólogos asociados con un efecto secundario no propuesto y no favorable, tal como la promoción del crecimiento de células de cáncer. Todavía otro ejemplo de un beneficio social sería la resistencia aumentada a la degradación en o arriba de la temperatura ambiente, facilitando el transporte, distribución y uso. Un ejemplo de una proteína terapéutica se proporciona por la insulina. La insulina humana de tipo silvestre y las moléculas de insulina codificadas en los genomas de otros mamíferos se enlazan a receptores de insulina que son múltiples órganos y diversos tipos de células, sin considerar la isoforma de receptor generada por los modos alternativos del empalme de RNA o por los patrones alternativos de la glicosilación pos-traduccional. La insulina de tipo silvestre también se enlaza con menor afinidad al receptor de factor de crecimiento similar a insulina Tipo 1 homólogo (IGF-1R).

Un ejemplo de un beneficio médico adicional sería la optimización de la estabilidad de una proteína hacia el desplegamiento o degradación. Tal beneficio social sería aumentado por la ingeniería de las proteínas más refractarias que las proteínas estándares con respecto a la degradación en o arriba de la temperatura ambiente para el uso en regiones del mundo en desarrollo donde la electricidad y la refrigeración no son disponibles consistentemente. Los análogos de insulina que consiste de una sola cadena de polipéptido y que contienen opcionalmente sustituciones de aminoácidos no estándares pueden exhibir propiedades superiores con respecto a la resistencia a la degradación térmica o mitogenicidad disminuida. El reto presentado por su degradación física es profundizado por la epidemia pendiente de diabetes mellitus en África y Asia. Debido a que la fibrilación presenta la mayor ruta de degradación arriba de la temperatura ambiente, el diseño de formulaciones resistentes a la fibrilación puede aumentar la seguridad y eficacia de la terapia de reemplazo de insulina en tales regiones problemáticas.

La administración de insulina se ha establecido por largo tiempo como un tratamiento para la diabetes mellitus. Un objetivo mayor de la terapia de reemplazo de insulina convencional en pacientes con diabetes mellitus es el control estricto de la concentración de glucosa en la sangre para prevenir su excursión arriba o abajo del intervalo normal característico de sujetos humanos sanos. Las excursiones abajo del intervalo normal están asociadas con síntomas adrenérgicos o neuroglucopénicos inmediatos, que en episodios severos conducen a convulsiones, coma y muerte. Las excursiones arriba del intervalo normal están asociados con el riesgo a largo plazo incrementado de enfermedad microvascular, incluyendo retinopatia, ceguera y falla renal.

La insulina es una proteina globular pequeña que desempeña una función central en el metabolismo en vertebrados. La insulina contiene dos cadenas, una cadena A, que contiene 21 residuos, y una cadena B que contiene 30 residuos. La hormona se almacena en la b-célula pancreática como un hexámero estabilizado con Zn2+, pero funciona como un monómero libre de Zn2+en la corriente sanguínea. La insulina es el producto de un precursor de una sola cadena, proinsulina, en la cual una región de conexión (35 residuos) enlaza el residuo C-terminal de la cadena B (residuo B30) al residuo N-terminal de la cadena A (Fig.1A). Una variedad de evidencia indica que está consiste de un núcleo similar a insulina y el péptido de conexión desordenado (Fig. IB). La formación de tres puentes de disulfuro específicos (A6-A11, A7-B7 y A20-B19; Figs. 1A y IB) se cree que es acoplada al plegamiento oxidante de la proinsulina en el retículo endoplásmico rugoso (ER). La proinsulina se ensambla para formar hexámeros coordinados de Zn2+ solubles poco tiempo después de la exportación del ER al aparato Golgi. La digestión endoproteolítica y la conversión a insulina ocurre en gránulos secretorios inmaduros seguido por la condensación morfológica. Los arreglos cristalinos de hexámeros de insulina de zinc dentro de los gránulos de almacenamiento maduros se ha visualizado por la microscopía electrónica (EM). La secuencia de la insulina se muestra en forma esquemática en la Figura 1C. Los residuos individuales indican por la identidad del aminoácido (típicamente utilizando un código de tres letras estándar), la cadena y la posición de secuencia (típicamente como un superíndice). Pertinente a la presente invención esta la invención de dominios C reducidos novedosos de 6-11 residuos de longitud en lugar del dominio C de tipo silvestre de 36 residuos característico de la proinsulina humana.

La fibrilación, que es un problema serio en la fabricación, almacenamiento y uso de insulina y análogos de insulina para el tratamiento de diabetes mellitus, se aumenta con la temperatura más alta, menor pH, agitación, o la presencia de urea, guanidina, co-solvente de etanol o superficies hidrofóbicas. Las regulaciones de fármacos de los Estados Unidos actuales demandan que la insulina sea desechada si ocurre la fibrilación a un nivel de uno por ciento o más. Debido a que la fibrilación se aumenta en temperaturas más altas, los pacientes con diabetes mellitus óptimamente deben mantener la insulina refrigerada antes del uso. La fibrilación de la insulina o un análogo de insulina puede ser un problema particular para tales pacientes que utiliza una bomba de insulina externa, en la cual pequeñas cantidades de insulina o análogo de insulina se inyectan en el cuerpo del paciente en intervalos regulares. En tal utilización, la insulina o análogo de insulina no se mantiene refrigerada dentro del aparato de bomba, y la fibrilación de la insulina puede dar por resultado el bloqueo del catéter utilizado para inyectar la insulina o análogo de insulina en el cuerpo, dando por resultado potencialmente fluctuaciones no predecibles en los niveles de glucosa en la sangre o aún hiperglucemia peligrosa. La insulina exhibe un incremento en la velocidad de degradación de 10 veces o más por cada incremento de 10°C en temperatura arriba de 25°C; por consiguiente las guías requieren almacenamiento en temperaturas < 30°C y de preferencia con refrigeración. La fibrilación de análogos de insulina básales formulados como soluciones solubles en pH menor que 5 (tal como Lantus® (Sanofi-Aventis) que contiene una solución no amortiguada de insulina glargina e iones de zinc a pH 4.0) también pueden limitar sus vidas en anaquel debido a la degradación física en o arriba de la temperatura ambiente; las condiciones acídicas empleadas en tales formulaciones deterioran el autoensamblaje de la insulina y debilita el enlace de los iones de zinc, reduciendo el grado al cual los análogos de insulina se pueden proteger mediante la secuestración dentro de los ensamblajes de zinc-proteína.

La insulina es susceptible a degradación química, que involucra el rompimiento de los enlaces químicos con la pérdida de arreglo de átomos dentro de la molécula o la formación de enlaces químicos entre diferentes moléculas de insulina. Tales cambios en los enlaces químicos se medían ordinariamente en el estado desplegado de la proteína, y de esta manera las modificaciones de la insulina que aumentan su estabilidad termodinámica también son probables que retarden o prevengan la degradación química. La insulina también es susceptible a la degradación física. La presente teoría de la fibrilación de proteína presenta que el mecanismo de fibrilación procede por la vía de un estado intermediario parcialmente plegado, que a su vez se agrega para formar un núcleo amiloidogénico. En esta teoría, es posible que las sustituciones de aminoácido que estabilizan el estado nativo pueden o no pueden estabilizar el estado intermediario parcialmente plegado y pueden o no pueden incrementar (o disminuir) la barrera de energía libre entre el estado nativo y el estado intermediario. Por lo tanto, la teoría actual indica que la tendencia de una sustitución de aminoácido dada en la molécula de insulina de dos cadenas para incrementar o disminuir el riesgo de fibrilación es altamente impredecible. Los modelos de la estructura de la molécula de insulina contemplan el desplegamiento casi completo de las tres alfa hélices (como se observa en el estado nativo) con arreglos paralelos de beta-láminas formadas en apila ientos sucesivo de las cadenas B y el apilamíento sucesivo de las cadenas A; el emparejamiento de disulfuro nativo entre las cadenas y dentro de la cadena A es retenido. Tales betaláminas cruzadas paralelas requieren separación sustancial entre el N-terminal de la cadena A y el C-terminal de la cadena B (> 30 Á), términos ordinariamente en estrecha proximidad en el estado nativo del monómero de insulina (< 10 A). La resistencia marcada a la fibrilación de los análogos de insulina de una sola cadena con C-dominios reducidos es conocida en la téenica y se cree que refleja una incompatibilidad topológica entra la estructura exhibida de las betas-láminas cruzadas paralelas en un protofilamento de insulina y la estructura de un análogo de insulina de una sola cadena con emparejamiento de disulfuro nativo en el cual el C-dominio reducido restringe la distancia entre el N-terminal de la cadena A y el C-terminal de la cadena B que es no favorable en un protofilamento.

Los análogos de insulina de una sola cadena por lo tanto se podrían observar que proporcionan un procedimiento favorable hacia el diseño de análogos de insulina resistentes a la fibrilación. Sin embargo, en el pasado tales análogos han exhibido bajas actividades, que puede ser 1% o menor con relación a la insulina humana de tipo silvestre. (Aunque Lee, H.C., y colaboradores (2000) reclamó que los análogos de insulina de una sola cadena con los dominios A y B de tipo silvestre de 57 residuos o 58 residuos de longitud exhiben afinidades de enlace de receptor en el intervalo de 30-40% con relación a la insulina humana, esta publicación fue retraída en el 2009 debido al mal conducto científico; en nuestras manos los análogos descritos por Lee, H.C y colaboradores exhiben afinidades relativas de menor que 1%). La afinidad podría ser en parte restaurada por la introducción de AspB1°, una sustitución conocida en la téenica para aumentar la afinidad de insulina para el receptor de insulina. Los inventores han descrito previamente una insulina de una sola cadena de 57 residuos que contiene AspB1° con el enlazador de C-dominio GGGPRR. Sin embargo, el uso de C-dominios reducidos en conjunción con tales sustituciones en el dominio A y/o el dominio B pueden conducir a la relación de enlace hacia una relación aumentada de enlace a IR-A con relación a IR-B como es descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 12/989,399, titulada "Isoform-Epecific Insulin Analogues" (incorporada por referencia en la presente). Un análogo de insulina de una sola cadena con alta afinidad de enlace de receptor se describió en la cual el C-dominio reducido fue el C-dominio de 12 residuos del factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I; secuencia GYGSSSRRAPQT; SEQ ID NO: 12) que produce una proteína quimérica. Sin embargo, tales moléculas quiméricas exhiben afinidades relativas y absolutas amentadas para IGF-1R. Tales alteraciones, similares aquellas asociadas con AspB1° y otras sustituciones en la posición B10, han inducido a un amplio problema debido a la posible asociación con un riesgo incrementado de cáncer en animales o pacientes humanos que toman tales análogos. Este problema es especialmente marcado con respecto a los análogos de insulina básales, es decir, aquellos diseñados para la administración de una vez al día con el perfil de 12-24 horas de absorción de insulina desde un depósito subcutáneo y el perfil de 12-24 horas de acción de insulina.

La presente invención se motivó por las necesidades médicas y sociales para diseñar un análogo de insulina de una sola cadena de una vez al día basal que combina (i) la resistencia a la degradación con (ii) potencia hipoglucémica in vivo sustancial con (iii) enlace cruzado reducido a IGF-1R y (iv) una relación de afinidades para las isoformas A y B del receptor de insulina que es similar a aquel de la insulina humana de tipo silvestre. Este último objetivo reflejó las funciones pleiotrópicas y los tejidos objetivo de insulina en el cuerpo humano. El paradigma clásico de la acción de insulina se ha enfocado en las funciones específicas de órganos de los adipocitos (donde la insulina regula el almacenamiento de combustibles en la forma de gotitas de triglicéridos), el hígado (donde la insulina regula la producción de glucosa por la vía de la gluconeogénesis y regula el almacenamiento de combustible en la forma de glucógeno) y el músculo (donde la insulina regula la afluencia de glucosa desde la corriente sanguínea por la vía del tráfico a la membrana de plasma de GLUT4) como los tejidos objetivo de la hormona. La investigación reciente ha revelado, sin embargo, que la insulina tiene funciones fisiológicas en otros órganos y tejidos, tal como en el hipotálamo del cerebro, en donde el circuito neural responsivo insulina influye en el metabolismo hepático, apetito, saciedad y posiblemente el punto de ajuste para el peso corporal ideal. Aunque el genoma humano contiene un solo gen que codifica el receptor de insulina, una proteina de transmembrana que contiene un dominio de tirosina-quinasa citoplásmico, es el RNA pre-mensajero que se somete al empalme alterativo para producir distintas isoformas A y B, cuya distribución fraccionaria puede diferir de órgano a árgano y cuya funciones de señalización pueden diferir dentro de las mismas células.

Las isoformas A y B (designadas IR-A e IR-B) difieren la afinidad para la insulina (afinidad para IR-A es dos veces más alta que la afinidad para IR-B) y únicamente IR-A (que carece de un dominio de péptido en la subunidad alfa codificada por el exón 11) enlaza IGF-II con alta afinidad. Aunque los análogos de insulina son conocidos en la téenica que difieren de la insulina de tipo silvestre en la relación de afinidad respectivas para IR-A e IR-B, es posible que la seguridad y eficacia de la terapia de reemplazo de insulina óptimamente requerirla la administración de un análogo de insulina cuya ración de afinidades para IR-A e IR-B es similar a aquella de la insulina de tipo silvestre. El enlace reducido de un análogo de insulina a IR-A con relación a IR-A, por ejemplo, podría conducir a una disminución relativa o absoluta en el grado de la señalización de insulina en el cerebro y en los glóbulos blancos, que expresa una predominancia de los receptores IR-A. De manera similar, el enlace reducido de un análogo de insulina a IR-B con relación a IR-B, por ejemplo, podría conducir a una disminución relativa o absoluta en el grado de señalización de insulina en los órganos objetivo clásicos que exhiben predominancia de los receptores IR-B. Tales afinidades de enlace sesgadas también podrían perturbar la función celular de las células objetivo (tales como células beta pancreáticas) en las cuales la señalización de insulina que media IR-A y la señalización de insulina que media IR-B se cree que median las funciones celulares diferentes que cada una contribuye a la viabilidad de célula beta apropiada y la función secretoria. Debido a que las células de cáncer pueden exhibir sobreexpresión de IR-A, el tratamiento de un paciente con un análogo que exhibe potencia aumentada de señalización de IR-A (con relación a la insulina humana de tipo silvestre) puede presentar un riesgo de incrementar el crecimiento de tumor. La señalización mitogénica por los análogos de insulina en células de cáncer puede ser mediada por análogos que exhiben enlace cruzado aumentado al receptor IGF-IR mitogénico (con relación a la insulina humana de tipo silvestre) o por análogos que exhiben enlace aumentado a IR-A (con relación a la insulina humana de tipo silvestre) o por análogos que exhiben tiempos de residencia prolongados en IGF-IR, IR-A o IR-B (con relación a la insulina humana de tipo silvestre). Los residuos básicos cerca de la C-terminal de la cadena B o el dominio B (B28-B30) dentro de una extensión C-terminal (B31 o B32), o en las posiciones equivalentes de un análogo de insulina de una sola cadena (C1 y C2) pueden aumentar el enlace cruzado de un análogo de insulina a IGF-IR y de eta manera aumentar la mitogenicidad.

Por lo tanto, sería deseable inventar un análogo de insulina de una sola cadena con mitogenicidad insignificante y enlace cruzado al IGF-IR que no obstante retenga por lo menos una porción del efecto de disminución de glucosa de la insulina de tipo silvestre. Más generalmente, hay una necesidad por un análogo de insulina que exhiba estabilidad termodinámica incrementada y resistencia incrementada a la fibrilación arriba de la temperatura ambiente mientras que exhiba una relación de afinidades para las isoformas A y B del receptor de insulina, y de esta manera mediante la implicación de por lo menos un subconjunto de las actividades biológicas específicas de órgano múltiples de la insulina de tipo silvestre.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, es un aspecto de la presente invención proporcionar análogos de insulina de una sola cadena que proporcionen el enlace cruzado disminuido a IGF-IR y duración de acción prolongada mientras que retengan por lo menos una porción de la actividad de disminución de glucosa de la insulina de tipo silvestre en roedores después de la inyección subcutánea. Los análogos de la presente invención contienen histidina en la posición B10 y de esta manera evitan los problemas que consideran la carcinogénesis que está asociada con una sustitución acidica (ácido aspártico o ácido glutámico) en esta posición. Es un aspecto adicional de la presente invención que las afinidades in vitro absolutas del análogo de insulina de una sola cadena para IR-A e IR-B estén en el intervalo de 5-100% con relación a la insulina humana de tipo silvestre y de esta manera improbable de exhibir tiempos de residencia prologados en el complejo de receptor de hormona. La presente invención se dirige a la utilidad de los análogos de insulina de una sola cadena que exhiben una relación de afinidades de enlace para IR-A e IR-B que es similar a aquella de la insulina humana de tipo silvestre.

La combinación anterior de características es conferida por un diseño de C-dominio novedoso en donde un polipéptido de conexión reducido (6-11 residuos de longitud) contiene un elemento acídico N-terminal (residuos C1 y C2), una junta flexible o bisagra (C3) y el segmento C-terminal derivado del C-dominio de IGF-II (C4-Cn, donde n = 6, 7, 8, 9, 10 o 11). El elemento acidico N-terminal se diseñó de acuerdo con los estudios de análogos de insulina de dos cadenas que contienen cadenas B de 32 residuos en donde las cargas del elemento básico ArgB31-ArgB32 de la insulina glargina se revirtieron (patente de los Estados Unidos No. 8,399,407, titulada "Non-Standard Insulin Analogues" incorporada por referencia en la presente. Aunque no se desea que sea restringido por la teoría, se contempla que el residuo acídico de dos residuos introduce repulsión electrostática desfavorable en el enlace del análogo a IGF-1R pero es bien tolerado por las isoformas de receptor de insulina. También sin desear que sea restringido por la teoría, además se contempla que el segmento C-terminal derivado de IGF-II del C-dominio de la presente invención introduce interacciones favorables con las isoformas de receptor de insulina y de esta manera funciona como un elemento de enlace de receptor fijador antes que una mera atadura o elemento espaciador.

En general, la presente invención proporciona un análogo de insulina de una sola cadena que comprende un C-dominio de la presente invención y una cadena A modificada que contiene sustituciones en la posición A8. La presente invención de esta manera pertenece a una clase novedosa de análogos de insulina de una sola cadena en donde el dominio de conexión (dominio C) es de longitud 6-11 y consiste de dos elementos. El elemento N-terminal consiste de los dos primeros residuos (designados Cl, C2 y C3, correspondientes a los residuos B31-B33 de una cadena B de insulina extendida) en donde (i) Cl y C2 contiene por lo menos una cadena lateral acídica y una carga electrostática formal neta en pH 7.4 de -1 o -2 y (ii) C3 proporciona un punto flexible o enlace como es proporcionado por Glicina, Alanina, Prolina o Serina. Ejemplos son, pero no están limitados a los siguientes segmentos de dipéptido: EEG, AEG, EAG, EDG, DEG, DDG, ADG, ADG, EEA, AEA, EAA, EDA, DEA, DDA, ADA, ADA, EEP, EEP, EAP, EAP, EDP, DEP, DDP, ADP, ADP, EES, AES, EAS, EDS, DDS, ADS o ADS. El elemento C-terminal contiene un segmento de péptido derivado del factor de crecimiento similar a insulina humano II (IGF-II) cuyo dominio C tiene la secuencia SRVSRRSR (SEQ ID NO: 13). Los residuos C4-Cn (donde n = 6-11) se derivan del C-dominio de IGF-II o los fragmentos C-terminales con las secuencias RVSRRSR, VSRRSR, SRRSR, RRSR o RSR. Estos dominios C híbridos de esta manera varían en longitud de un mínimo de 6 (tres residuos en el elemento N-terminal y tres residuos en el elemento C-terminal) a un máximo de 11 (tres residuos en el elemento N-terminal y ocho residuos en el elemento C-terminal). La cadena A contiene una sustitución básica en A8 (Lisina, Arginina o Histidina) y una sustitución en A21 (Gly, Ala o Ser) para evitar la desamidación catalizada con ácido u otros modos de degradación química relacionada con Asn. En un ejemplo la cadena B también contiene sustituciones LysB29—>-Arg para evitar la segmentación proteolítica especifica de Lys en el curso de la biosíntesis en levadura.

En otro ejemplo, la presente invención proporciona una serie de moléculas de insulina de una sola cadena (SCI) con enlazadores de la forma EEGXn donde (i) el elemento EE en las posiciones C1 y C2 (opuesto en carga al elemento RR de insulina glargina , el componente activo de Lantus®) deteriora el enlace cruzado de IGF-1R, (ii) G proporciona una bisagra flexible y (iii) Xn se deriva del C-dominio de IGF-II (secuencia SRVSRRSR; SEQ ID NO: 13). El uso de una atadura derivada de IGF-II proporciona la presencia de múltiples residuos de Arg (compensando el elemento EE negativo para proporcionar un desplazamiento neto en el punto isoeléctrico) y la función planteada como hipótesis en aumentar el receptor de enlace IR. El SCI referido como Thermalina-basal contiene un péptido de conexión de 8 residuos (secuencia EEGSRRSR; SEQ ID NO: 14). Los dominios C de esta longitud se cree que son compatibles con el mecanismo de ajuste inducido en el enlace de receptor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS La FIG.1A es una representación esquemática de la secuencia de proinsulina humana que incluye la cadenas A y B y la región de conexión mostrada con sitios de segmentación dibásicos flanqueantes (circuios llenos) y C-péptido (circuios en blanco).

La FIG. IB es un modelo estructural de proinsulina, que consiste de una porción similar a la insulina y un péptido de conexión desordenado (línea de guiones).

La FIG.1C es una representación esquemática de la secuencia de insulina humana que indica la posición de los residuos B27 y B30 en la cadena B.

La FIG.2 es una gráfica que muestra los resultados de los estudios de enlace de receptor de la insulina humana de tipo silvestre y un análogo de insulina de una sola cadena de la presente invención (SCI-59B). Panel superior, ensayo de desplazamiento competitivo que emplea la isoforma A de receptor de insulina (IR-A). Panel de en medio, ensayo de desplazamiento competitivo que emplea la isoforma B del receptor de insulina (IR-B). Panel del fondo, ensayo de desplazamiento competitivo que emplea el receptor IGF de Tipo 1 (IGF-1R). Símbolos: insulina humana (¦) y SCT59 (A). El análisis de estos datos permite los estimados de las constantes de disociación del receptor de hormona como es proporcionado en la Tabla 1.

La FIG. 3 proporciona el espectro 2D-NMR de un análogo de insulina de una sola cadena de la presente invención (SCI-59B). El espectro es adquirido en pH 3.5 (como en la formulación basal) y 37°C; el tiempo de mezclado fue 200 ms y la resistencia de campo 700 MHz.

La FIG.4 es una gráfica que muestra los resultados de la prueba biológica de los análogos de insulina de mediana dosis en ratas (20 mg por rata) hechas diabéticas por esteptozotocina. La disminución en la sangre [glucosa] con el tiempo (min): Humalog® (lispro insulina) (P), (SCI-59B;, D), Lantus® (insulina glargina ) (O) y diluyente (o). Una unidad de cada formulación (como U-100) se inyectó subcutáneamente en 5 ratas STZ (N=5); las barras de error indican errores estándares.

La Fig.5A es una gráfica que muestra los niveles de glucosa en la sangre a través del tiempo en ratas Sprague- Dawlcy hechas diabéticas por steptozotocina y Termalina-basal fresca administrada (T-b; D), Termalina-basal calentada (O), Lantus® fresco (insulina glargina ) ( ), Lantus® calentada (insulina glargina) (?), o control de diluyente (X). Las muestras calentadas se agitaron levemente a 37°C. La Termalina-basal se calentó durante 56 dias y Lantus® durante 12 días.

La Fig.5B es una gráfica que muestra los niveles de glucosa en la sangre a través del tiempo en ratas Sprague- Dawley hechas diabéticas por esteptozotocina y Termalina-basal fresca administrada (T-b; D), Termalina-basal calentada (O), Lantus® fresca (insulina glargina) (O), Lantus® calentada (insulina glargina) ( ), control de diluyente (X). Las muestras calentadas se agitaron levemente a 45°C. La Termalina-basal se calentó durante 39 días y Lantus® durante 6 días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige hacia un análogo de insulina de una sola cadena que proporciona duración de acción prolongada, una relación de afinidades de enlace de receptor IR-A/IR-B similares a aquellas de la insulina de tipo silvestre con afinidades absolutas en el intervalo 5-100% (el límite inferior elegido para corresponder a proinsulina) , discriminación incrementada contra IGF-1R, restringe aumentada supuesta a la degradación química en la posición A21 (debido a la sustitución de Asn por Gly, Ala o Ser) , resistencia aumentada supuesta a la fibrilación arriba de la temperatura ambiente (debido a la topología de una sola cadena) y actividad termodinámica incrementada supuesta (debido en parte a la sustitución de ThrA8 por una cadena lateral básica; Arg, Lys, His, Orn).

Es un aspecto de por lo menos algunos ejemplos de la presente invención que el punto isoeléctrico del análogo de una sola cadena este entre 6.8 y 7.8 tal que una formulación soluble bajo condiciones acídicas (pH 3.0-4.5) seria esperada que se someta a la precipitación isoeléctrica en el depósito subcutáneo debido a un desplazamiento de pH a casi la neutralidad. También es un aspecto de por lo menos algunos ejemplos de la presente invención que el análogo de insulina de una sola cadena retenga una competencia a someterse a la formación dependientes de ión de los análogos de hexámeros de proteína al hexámero de insulina de zinc clásico conocido en la téenica como hexámero de insulina T6, hexámero de insulina T3Rf3 o hexámero de insulina R6.

También se contempla que los análogos de una sola cadena también se pueden hacer con secuencias de dominio A y B derivadas de insulinas animales, tales como insulinas porcinas, bovinas, equinas y caninas, a manera de ejemplos no limitantes. Además o en la alternativa, el análogo de insulina de la presente invención puede contener una supresión de residuo Bl-B3 o se puede combinar con una cadena B variante que carece de Lisina (por ejemplo, LysB29 en insulina humana de tipo silvestre) para evitar la proteólisis dirigida por Lys de un polipéptido precursor en la biosintesis de levadura en Pichia pastorís , Saccharomyces cerevisciae, u otras especies o cepas de expresión de levadura. El dominio B de la insulina de una sola cadena de la presente invención opcionalmente puede contener otras sustituciones, propuestas para aumentar la estabilidad termodinámica y la actividad de enlace de receptor. También se contempla que ThrB27, ThrB30, o uno o más residuos de Serina en el C-dominio se pueden modificar, individualmente o en combinación, por un aducto de monosacárido; ejemplos se proporcionan por N-acetil-p-D-galactopiranósido O- enlazado (designado GalNAc-Op-Ser o GalNAc-Op-Thr), a-D-manopiranósido O-enlazado (manosa-Op-Ser o manosa-O^-Thr) y/o a-D-glucopiranósido (glucosa-Op-Ser o glucosa-Op-Thr).

Además, en vista de la similitud entre las insulinas humana y de animal, y el uso en el pasado de insulinas de animal en pacientes humanos con diabetes mellitus, también se contempla que otras modificaciones menores en la secuencia de insulina se pueden introducir, especialmente aquellas sustituciones consideradas "conservativas". Por ejemplo, las sustituciones adicionales de aminoácidos se pueden hacer dentro de grupos de aminoácidos con cadenas laterales similares, sin apartarse de la presente invención. Estos incluyen los aminoácidos hidrofóbicos neutros: Alanina (Ala o A), Valina (Val o V), Leucina (Leu o L), Isoleucina (lie o I), Prolina (Pro o P), Triptófano (Trp o W), Fenilalanina (Phe o F) y Metionina (Met o M). Del mismo modo, los aminoácidos polares neutros pueden ser sustituidos entre si dentro de su grupo de Glicina (Gly o G), Serina (Ser o S), Treonina (Thr o T), Tirosina (Tyr o Y), Cisteina (Cys o C), Glutamina (Glu o Q) y Asparagina (Asn o N). Los aminoácidos básicos se consideran que incluyen Lisina (Lys o K), Arginina (Arg o R) e Histidina (His o H). Los aminoácidos acidicos son ácido Aspártico (Asp o D) y ácido Glutámico (Glu o E). A menos que se mencione de otra manera o cualquiera sea obvio del contexto, los aminoácidos mencionados en la presente deben ser considerados que son L-aminoácidos. Los aminoácidos estándares también se pueden sustituir por aminoácidos no estándares que pertenecen a la misma clase química. A manera de ejemplo no limitante, la cadena lateral básica Lys se puede reemplazar por aminoácidos básicos de longitud de cadena lateral más corta (Ornitina, ácido Diaminobutírico o ácidos Diaminopropiónico). Lys también se puede reemplazar por el isóstere alifático neutro Norleucina (Nle), que a su vez se puede sustituir por análogos que contienen cadenas laterales alifáticas más cortas (ácido A inobutírico o ácido Aminopropiónico).

La secuencia de aminoácidos de proinsulina humana se proporciona, para propósitos comparativos como SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1 (proinsulina humana) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu- Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro- Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn La secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana se proporciona como SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 (cadena A humana) Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu- Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn La secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana se proporciona como SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3 (cadena B humana) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu- Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr La secuencia de aminoácidos de análogos de insulina de una sola cadena de la presente invención se dan en SEQ ID NOS: 4-10, correspondientes a los polipéptidos de longitud 57, 57, 58, 59, 60, 61 y 62.

SEQ ID NO: 4 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Xaa3-Glu-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val- Glu-Gln-Cys-Cys-Xaai-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa4 Donde Xaai indica His, Arg, Lys o Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; Xaa3 es Ala Gly, o Ser; y donde Xaa4 es Gly, Ala o Ser.

SEQ ID NO: 5 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Xaa3-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaai-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa4 Donde Xaai indica His, Arg, Lys o Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; Xaa3 es Ala, Gly o Ser; y donde Xaa4 es Gly, Ala o Ser.

SEQ ID NO: 6 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaai-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 En donde Xaai indica His, Arg, Lys o Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; y donde Xaa3 es Gly, Ala o Ser.

SEQ ID NO: 7 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaai-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 Donde Xaai indica His, Arg, Lys o Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; y donde Xaa3 es Gly, Ala o Ser.

SEQ ID NO: 8 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaai-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 En donde Xaa3 indica His, Arg, Lys or Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; y donde Xaa3 es Gly, Ala o Ser.

SEQ ID NO: 9 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa -Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 En donde Xaai indica His, Arg, Lys o Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; y donde Xaa3 es Gly, Ala o Ser.

SEQ ID NO: 10 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu- Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro- Xaa2-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile- Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa -Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu- Asn-Tyr-Cys-Xaa3 En donde Xaai indica His, Arg, Lys o Orn; y donde Xaa2 es Lys, Arg o Orn; y donde Xaa3 es Gly, Ala o Ser.

La siguiente secuencia de DNA codifica el análogo de insulina de una sola cadena SCI-59B (ver enseguida) con codones optimizados para patrones de utilización en Pichia pastoris.

SEQ. ID. NO 11 TTCGTCAATCAACACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCATTGTACTTGGTCTGTGGTG AGAGAGGATTCTTCTACACCCCTAGAACTGAGGAGGGTTCTAGAAGATCTAGAGGAATCG TCGAGCAATGTTGTAGATCCATTTGTTCCTTGTACCAATTGGAGAACTACTGCGGATAA Los genes sintéticos análogos se han preparado y clonado en Pichia pastoris que codifica SCI-59A (ver enseguida) y los derivados de SCI-59A y SCI-59B que contienen la sustitución adicional GluB13-»Gln.

Dos análogos de insulina de una sola cadena de la presente invención (designados SCI-59A y SCI-59B) se prepararon mediante la biosintesis de un polipéptido precursor en Pichia pastoris; este sistema secreta una proteína plegada que contiene puentes de disulfuro nativos con el péptido de extensión N-terminal de segmentación. Los productos de insulina de una sola cadena segmentados tienen longitud 59, la suma de un residuo 30 B-dominio, 8-residuo C-dominio y 21-residuo A- dominio. La secuencia de C-dominio fue en cada caso EEGSRRSR (SEQ ID NO: 14) en donde el elemento acidico (posiciones C1 y C2; en negrita) se introdujo para deteriorar el enlace a IGF- 1R, Gly (posición C3; cursiva) se introdujo como un punto flexible y un elemento derivado del C-dominio de IGF-II (posiciones C4-C8 en el presente análogo; subrayado). SCI-59A contuvo sustituciones adicionales ThrA8-»His, AsnA21—»Gly y Lys829—»Arg mientras que SCI-59B contuvo sustituciones adicionales ThrA8—»Arg, AsnA21-»Gly y LysB29->Arg (SEQ ID NO: 7).El punto isoeléctrico formal (pl) SCI-59A se predijo que es desplazado hacia la neutralidad por los efectos combinados de la secuencia de C-dominio (tres residuos de Arginina adicionales parcialmente desviados por dos residuos de ácido Glutámico adicionales) y una Histidina tituladle adicional en la posición A8; la sustitución de Arg para Lys en B29 se esperó que tenga un efecto significativo en el punto isoeléctrico. El pl formal de SCI-59B se predijo que además es desplazada hacia la neutralidad por los efectos combinados de la secuencia de C- dominio (tres residuos de Arginina adicionales parcialmente desviados por dos residuos de ácido Glutámico adicionales como en SCI-59A) y una Arg adicional en la posición A8.

Tabla 1. Afinidades de Enlace de Receptor In Vitro Abreviaciones: IR-B, isoforma B de empalme de receptor de insulina; IGF-1R, receptor de IGF Tipo 1.

La Tabla 1 contiene afinidades de enlace de receptor de SCI-59A y SCI-59B en relación a la insulina humana de tipo silvestre. Los datos representativos se proporcionan en la Figura 2. Los dos análogos de una sola cadena pueden exhibir enlace cruzado muy bajo a IGF-1R con relación a la insulina de tipo silvestre. (La actividad relativa se define como la relación de las constantes de disociación de receptor de hormona del análogo a la insulina humana de tipo silvestre, como medido por un ensayo de desplazamiento competitivo utilizando 125I-insulina humana.) SCI-59B exhibe afinidades relativas para IR-A e IR-B en el intervalo objetivo de 5-100% con relación similar a aquella de la insulina de tipo silvestre. En contratare las afinidades IR-A e IR-B de SCI-59A (diferentes en la posición A8) son cada una menores de aquellas de SCI-59B. Mientras que la afinidad de SCI-59A para IR-A está dentro del intervalo objetivo (aproximadamente 10%), su afinidad para IR-B está en el fondo del intervalo objetivo (5% dentro del error experimental) que da por resultado una relación de enlace de IR-A/IR-B que puede ser elevada con relación a la insulina de tipo silvestre. Estos descubrimientos sugieren que Arg se prefiere sobre His en la posición A8 en el contexto del enlazador EEGSRRSR (SEQ ID NO: 14). La ml predicha de SCI-59B también es más cercana a aquella de la insulina glargina (que del mismo modo contiene un exceso de dos residuos de arginina) que aquella de SCI-59A.

El protocolo para el ensayo de las actividades de enlace de receptor fue como sigue. Placas de tira de microtítulo (Nunc Maxisorb) se incubaron durante la noche a 4°C con ACJ5 IgG (100 ml/cavidad de 40 mg/ml en solución salina amortiguada con fosfato). Los datos de enlace se analizaron mediante un modelo secuencial de dos sitios. Los datos se corrigieron para el enlace no especifico (cantidad de radiactividad que permanece en la membrana asociada en la presencia de 1 mM de insulina humana. En todos los ensayos el porcentaje del enlace trazador en la ausencia de ligando de competición fue menor que 15% para evitar los artefactos de agotamiento de ligando. Las constantes de disociación [K¿) se determinaron al ajustar a un modelo matemático como es descrito por Whittaker and Whittaker (2005, J. Bíol . Chem . 280: 20932-20936); el modelo empleó la regresión no lineal con la suposición de competición heteróloga (Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114).

Los estudios estructurales y biológicos enfocados en SCI-59B en vista de su afinidad de enlace de receptor más alta y el punto isoeléctrico predicho más favorable. El espectro 2D-NMR NOESY proporcionó evidencia para una estructura plegada (Figura 3); el patrón de NOEs y desplazamiento químico están de acuerdo con los análisis previos de un análogo de insulina de una sola cadena de 57 residuos (Hua, Q.X. y colaboradores (2008)).

Para evaluar la actividad biológica y potencia de los análogos en un modelo animal, ratas Sprague-Dawlcy machos (masa corporal media -300 gramos) se volvieron diabéticas mediante el tratamiento con estreptozotocina (STZ). Las soluciones de proteína que contienen KP-insulina (insulina Lispro, el componente activo de Humalog®; Eli Lilly y Co.), insulina Glargina (Lantus®; Sanofi-Aventis) y/o una insulina de una sola cadena de la presente invención. Se proporcionó un control mediante la inyección del diluyente Lilly libre de proteínas (obtenido de Eli Lilly y Co.) compuesta de 16 mg de glicerina, 1.6 mg de meta-cresol, 0.65 mg de fenol y 3.8 mg de fosfato de sodio pH 7.4. La actividad de SCI-59B se evaluó en relación a aquella de Humulog® (concentración U-100 tomada de un frasquito comercial no expirado) y Lantus® (concentración U-100 tomada de un frasquito comercial no expirado) como se muestra en la Figura 4. SCI-57B se formuló de acuerdo con la formulación de insulina Glargina en Lantus® excepto que el pH se ajustó en 3.5 (antes que pH 4.0). Una unidad de cada una de estas formulaciones se inyectó subcutáneamente, y los cambios resultantes en la concentración de glucosa en la sangre se monitorearon mediante mediciones en serie utilizando un glucómetro clínico (Hypoguard Advance Micro-Draw. meter). Las ratas se inyectaron subcutáneamente en el tiempo t = 0 en grupos de cinco (N = 5). La sangre se obtuvo de la punta engrapada de la cola en el tiempo 0 y cada 10 minutos hasta 360 min. SCI-59B de la presente invención se encontró, bajo condiciones de formulación similar a aquella del Lantus®, que retiene una proporción sustancial de la actividad biológica de la insulina glargina y con duración de acción similar a o mayor que aquella del Lantus®.

Un SCI de 59mer se sintetizó que tiene las sustituciones ArgA8, Gly21, ArgB29 y que tiene el enlazador EEGRSSSR (SEQ ID NO: 7). Este SCI es referido como Termalina-basal o abreviado como T-b en la Fig. 5. La estabilidad termodinámica se evaluó a 25°C y pH 4.0 mediante la desnaturalización de guanidina monitoreada con CD. Una energía libre de desplegamiento (AG0) de 3.5(±0.1) kcal/mol se obtuvo mediante la aplicación de un modelo de dos estados, que es más alto que la estabilidad de la insulina glargina bajo estas condiciones (2.7(±0.1) kcal/mol). Este incremento en la energía libre (AAGu 0.7(±0.2) kcal/mol) predice la estabilidad química significativamente aumentada.

La resistencia a la fibrilación se sondeó mediante la agitación leve en una formulación U-100 a 37 y 45°C en pH 4.0 en relación a la insulina glargina. Mientras que el Lantus precipitó después de 10 dias a 37°C y después de 5 dias a 45°C, las soluciones de Thermalina-basal permanecieron claras y sin incremento en la fluorescencia de Tioflavina T (una sonda de amiloide).

La potencia se probó en ratas Sprague-Dawlcy ( aproximadamente 300 g) hechas diabéticas por estreptozotocina (Fig. 5A y 5B). Después de la inyección subcutánea de U-100 (0.6 mM) de Termalina-basal o Lantus® (1 unidad por rata; N=5 en el grupo Termalina-basal (A) y N=10 en el grupo Lantus® (¨)), la reducción resultante y recuperación de la concentración de glucosa en la sangre (AUC) indicó que la potencia de Termalina-basal es similar a o mayor que aquella del Lantus®.

La duración de actividad de la Termalina-basal también excede aquella del Lantus®. La retención o pérdida de potencia de Termalina-basal o Lantus® en agitación leve a 37 y 45°C muestra que mientras Lantus® rápidamente pierde su potencia (¦), Termalina-basal (·) retuvo la actividad completa por varias semanas bajo estas condiciones problemáticas.

Un método para tratar a un paciente con diabetes mellitus comprende administrar un análogo de insulina de una sola cadena como es descrito en la presente. Es otro aspecto de la presente invención que los análogos de insulina de una sola cadena se pueden preparar ya sea en levadura ( Pichia pastoris) o someterse a la síntesis química total mediante la ligación de fragmento nativo. La ruta sintética de preparación es preferida en el caso de modificaciones no estándares; sin embargo, sería factible fabricar un subconjunto de los análogos de una sola cadena que contiene modificaciones no estándares por medio de la teenología de código genético extendido o la tecnología de codón de cuatro bases. Todavía es otro aspecto de la presente invención que el uso de las sustituciones de aminoácidos no estándares pueden aumentar la resistencia del análogo de insulina de una sola cadena a la degradación química o a la degradación física. Los inventores además contemplan que los análogos de la presente invención proporcionan un método para el tratamiento de diabetes ellitus o el síndrome metabólico. La ruta de suministro del análogo de insulina es mediante inyección subcutánea a través del uso de una jeringa o dispositivo de pluma.

Una composición farmacéutica puede comprender tales análogos de insulina y que pueden opcionalmente incluir zinc. Los iones de zinc se pueden incluir en relaciones de ión zinc: proteína variantes, que varían de 2.2 átomos de zinc por hexámero de análogo de insulina a 10 átomos de zinc por hexámero de análogo de insulina. El pH de la formulación está en el intervalo de pH 3.0 - 4.5. En tal formulación, la concentración del análogo de insulina típicamente estaría entre aproximadamente 0.6-5.0 mM; concentraciones de hasta 5 mM se pueden utilizar en un frasquito o pluma; las formulaciones más concentradas (U-200 o más alta) pueden ser de beneficio particular en pacientes con resistencia a la insulina notable. Los excipientes pueden incluir glicerol, glicina, arginina, Tris, otras soluciones amortiguadoras y sales, y conservadores antimicrobianos tales como fenol y meta-cresol; estos últimos conservadores son conocidos que aumentan la estabilidad del hexámero de insulina. Tal composición farmacéutica se puede utilizar para tratar a un paciente que tiene diabetes mellitus u otra condición médica al administrar una cantidad fisiológicamente efectiva de la composición al paciente.

En base a la descripción anterior, ahora debe ser evidente que los análogos de insulina de una sola cadena proporcionados llevarán a cabo los objetivos expuestos anteriormente en la presente. Específicamente, estos análogos de insulina exhiben resistencia aumentada a la fibrilación mientras que retienen las características farmacocinéticas y farmacodinámicas deseables (que confieren acción prolongada) y mantiene por lo menos una fracción de la actividad biológica de la insulina de tipo silvestre. Por lo tanto, se va entender que cualquiera de las variaciones evidentes se encuentra del alcance de la invención reclamada y de esta manera, la selección de elementos componentes específicos se puede determinar sin apartarse del espíritu de la invención aquí divulgada y descrita.

La siguiente literatura se cita para demostrar que los métodos de prueba y de ensayo descritos en la presente serian entendidos por uno de habilidad ordinaria en la téenica.

Glendorf, T., Knudsen, L., Stidsen, C.E., Hansen, B.F., Hegelund, A.C., S0rensen, A.R., Nishimura, E., & Kjeldsen, T. 2012. Systematic evaluation of the metabolic to mitogenic potency ratio for B10-substituted insulin analogues. PLoS One 7(2), e29198. Hohsaka, T., & Sisido, M. 2012. Incorporation of non-natural amino acids into proteins. Curr. Opin . Chem . Biol . 6, 809-15.

Hua, Q.X., Nakagawa, S.H., Jia, W. , Huang, K., Phillips, N.B., Hu, S. & Weiss, M.A. (2008) Design of an active ultrastable single-chain insulin analog: synthesis, structure, and therapeutic implications. J. Biol . Chem. 283, 14703-14716.

Kristensen, C, Andersen, A.S., Hach, M., Wiberg, F.C., Schaffer, L., & Kjeldsen, T. 1995. A single-chain insulin-like growth factor I/insulin hybrid binds with high affinity to the insulin receptor. Biochem. J. 305, 981-6.

Lee, H.C., Kim, S.J., Kim, K.S., Shin, H.C., & Yoon, J.W. 2000. Remission in models of type 1 diabetes by gene therapy using a single-chain insulin analogue. Nature 408, 483-8.

Retraction in: Lee HC, Kim KS, Shin HC.2009. Nature 458, 600.

Phillips, N.B., Whittaker, J., Ismail-Beigi, F., & Weiss, M.A. (2012) Insulin fibrillation and protein design: topological resistance of single-chain analogues to thermal degradation with application to a pump reservoir. J. Diabetes Sci . Technol . 6, 277-288.

Sciacca, L., Cassarino, M.F., Genua, M., Pandini, G., Le Molí, R., Squatrito, S., & Vigneri, R. 2010. Insulin analogues differently actívate insulin receptor isoforms and post-receptor signalling. Diabetologia 53, 1743-53.

Wang, Z.X.1995. An exact mathematical expression for describing competitive biding of two different ligands to a protein molecule FEBS Lett . 360: 111-114.

Whittaker, J., and Whittaker, L. .2005. Characterization of the functional insulin binding epitopes of the full-length insulin receptor. J. Biol . Chem. 280: 20932-

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un análogo de insulina de una sola cadena, caracterizado porque comprende las secuencias de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-10.

2. El análogo de insulina de una sola cadena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7.

3. El análogo de insulina de una sola cadena de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque Xaa en la posición 29 es Arg.

. El análogo de insulina de una sola cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque Xaa en la posición 59 es Gly.

5. El análogo de insulina de una sola cadena de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque Xaa en la posición 46 es Arg.

6. El análogo de insulina de una sola cadena de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque Xaa en la posición 46 es His.

7. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica un análogo de insulina de una sola cadena de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-10.

8. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia comprende SEQ ID NO: 11.

9. Un método para disminuir el azúcar en la sangre de un paciente, caracterizado porque comprende administrar una cantidad fisiológicamente efectiva de un análogo de insulina de una sola cadena o una sal fisiológicamente aceptable del mismo al paciente, en donde el análogo de insulina de una sola cadena tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-10.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el análogo de insulina de una sola cadena tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque Xaa en la posición 29 de SEQ ID NO: 7 es Arg.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Xaa en la posición 59 de SEQ ID NO: 7 es Gly.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque Xaa en la posición 46 de SEQ ID NO: 7 es Arg.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque Xaa en la posición 46 de SEQ ID NO: 7 es His.