CN112266414A

CN112266414A - 长效单链胰岛素类似物

Info

Publication number: CN112266414A
Application number: CN202010947063.3A
Authority: CN
Inventors: M.维斯
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2021-01-26
Also published as: WO2014071405A3; MX2015005662A; US9975940B2; WO2014071405A2; CN105008395B; US20150274803A1; CA2890719A1; PH12015500989A1; CN105008395A; IL238651A0; JP6584953B2; IL238651B; AU2013337250B2; EP2914620B1; JP2016506366A; CA2890719C; US20170137488A1; BR112015010194B1; KR102163936B1; ES2694418T3

Abstract

本发明涉及长效单链胰岛素类似物。提供一种单链胰岛素类似物，其含有在位置A8处的碱性侧链（精氨酸、组氨酸、赖氨酸或鸟氨酸）、在位置B29处的碱性侧链（精氨酸、组氨酸、赖氨酸或鸟氨酸）和长度为6‑11个残基的缩短的C结构域。C结构域的残基C1和C2具有‑1或‑2的净负电荷；C3选自Gly、Ala、Pro或Ser；剩余C结构域区段依次衍生自IGF‑II的C结构域（RRSR、SRRSR、VSRRSR、RVSRRSR或SRVSRRSR；SEQ ID NO:13）。治疗患有糖尿病或肥胖的患者的方法包括向该患者施用生理有效量的该胰岛素类似物或其生理学可接受的盐。

Description

长效单链胰岛素类似物

本申请为分案申请，原申请的申请日为2013年11月5日，申请号为201380069346.0(PCT/US2013/068585)，发明名称为“长效单链胰岛素类似物”。

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年11月5日提交的未决美国临时申请号61/722,350的权益。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是由National Institutes of Health在经费项目编号DK040949和DK074176下在合作协议下政府支持完成。美国政府对本发明可能享有某些权利。

发明背景

本发明涉及多肽激素类似物，其表现出增强的药理学性质，如提高的热力学稳定性、增强的对高于室温的热纤维化的抗性、降低的丝裂原活性和/或改变的药代动力学和药效动力学性质，即相对于相应野生型人激素的可溶性制剂提供更长的作用持续时间或更快速的作用持续时间。更特别地，本发明涉及由单一多肽链组成的胰岛素类似物，所述单一多肽链在A和B结构域之间含有新的一类缩短的连接（C）结构域。这种类别的C结构域具有6-11个残基的长度，由N-末端酸性元素和衍生自人IGF-II的连接结构域的C-末端片段组成。本发明的单链胰岛素类似物在A或B结构域中的其它位点处可以任选含有标准或非标准的氨基酸置换。

非标准蛋白质（包括治疗剂和疫苗）的工程改造可以具有广泛的医疗和社会益处。天然存在的蛋白质——如通常在人类、其它哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中编码的那样——常常赋予多种生物活性。衍生蛋白质的益处在于获得选择性活性，如降低的与不期望和不利的副作用（如促进癌细胞生长）相关的同源细胞受体的结合。社会益处的另一实例是对室温下或高于室温的降解的抗性提高，有利于运输、分布和使用。胰岛素提供了治疗性蛋白质的一个实例。不管通过RNA剪接的替代方式或通过翻译后糖基化的替代模式生成的受体同种型，结合到胰岛素受体的野生型人胰岛素和在其它哺乳动物基因组中编码的胰岛素分子是多器官和多种类型的细胞。野生型胰岛素还以低亲和力与同源1型胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）结合。

进一步的医药益处的实例是优化蛋白质对伸展或降解的稳定性。此类社会益处将通过针对室温或高于室温下的降解比标准蛋白质更难熔的蛋白质工程改造来增强，以用于电力与制冷不能始终可用的发展中世界的地区。由单一多肽链组成并任选含有非标准氨基酸置换的胰岛素类似物可以表现出在抗热降解或降低的丝裂原活性方面优异的性质。糖尿病在非洲和亚洲的未决流行加深了其物理降解造成的挑战。因为纤维化造成了高于室温的降解的主要途径，设计抗纤维化的制剂可以在此类受挑战区域提高胰岛素替代疗法的安全性和效率。

施用胰岛素早已被确定为糖尿病的治疗方法。在患有糖尿病的患者中常规胰岛素替代疗法的主要目的是严格控制血葡萄糖浓度以防止其偏离高于或低于健康人的正常范围特征。偏离低于正常范围与即时肾上腺素或神经低血糖症状相关，这在严重发作时会导致痉挛、昏迷和死亡。偏离高于正常范围与微血管病变（包括视网膜病、失明和肾衰竭相关）的长期风险增加相关。

胰岛素是在脊椎动物的代谢中起到重要作用的小球状蛋白质。胰岛素含有两条链，含有21个残基的A链和含有30个残基的B链。该激素以Zn²⁺-稳定化六聚物形式存储在胰岛β细胞中，但是以无Zn²⁺单体形式在血流中起作用。胰岛素是单链前体——胰岛素原的产物，其中连接区（35个残基）将B链的C-末端残基（残基B30）连接到A链的N-末端残基（图1A）。各种迹象表明，其由胰岛素样核心和无序的连接肽组成（图1B）。三种特定的二硫键（A6-A11、A7-B7和A20-B19；图1A和1B）形成被认为偶联到粗面内质网（ER）中胰岛素原的氧化折叠。胰岛素原在由ER输出至高尔基体后不久组装形成可溶性Zn²⁺-配位六聚物。内切蛋白酶解消化并转化为胰岛素在未成熟的分泌颗粒中发生，随后发生形态凝聚。已经通过电子显微镜法（EM）观察到成熟贮藏颗粒中锌胰岛素六聚物的结晶阵列。胰岛素序列以图示形式显示在图1C中。个别的残基通过氨基酸同一性（通常使用标准三字母代码）、链和序列位置（通常为上标形式）表示。与本发明相关的是长度6-11个残基的新型缩短的C结构域替代人胰岛素原的36-残基野生型C结构域特性的发明。

纤维化，作为在用于治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的制造、储存与使用中的严重问题，随着更高温度、更低pH、搅拌，或脲、胍、乙醇助溶剂的存在，或疏水性表面而增强。目前的美国药物法规要求，如果以1%或更高的水平发生纤维化，胰岛素要被丢弃。因为在更高温度下纤维化增强，患有糖尿病的患者最好在使用前必须将胰岛素保持冷藏。胰岛素或胰岛素类似物的纤维化对使用其中将少量胰岛素或胰岛素类似物定期注入患者体内的外部胰岛素泵的此类患者可能是特别关注的。在此类使用中，胰岛素或胰岛素类似物在泵设备中不保持冷藏，胰岛素的纤维化会导致用于将胰岛素或胰岛素类似物注入体内的导管堵塞，可能导致血糖水平不可预测地波动或甚至导致危险的高血糖症。在高于25℃的温度下，每提高10℃，胰岛素表现出10倍或更高的降解速率的提高；因此，指南要求储存在<30℃的温度下并优选冷藏储存。配制为pH小于5的可溶性溶液（如Lantus^® (Sanofi-Aventis)，其含有在pH 4.0下的甘精胰岛素和锌离子的未缓冲溶液）的基础胰岛素类似物也会由于在室温下或高于室温下的物理降解而限制其自身的寿命；此类制剂中使用的酸性条件削弱了胰岛素自组装，并减弱了锌离子的结合，降低了通过在锌-蛋白质组装物中的螯合作用能保护胰岛素类似物的程度。

胰岛素易于化学降解，涉及随分子中原子重排的损失的化学键断裂或不同胰岛素分子之间的化学键形成。化学键方面的此类变化通常在蛋白质的未折叠状态下介导，由此，提高其热力学稳定性的胰岛素的修饰也可能会延迟或防止化学降解。胰岛素还易于物理降解。蛋白质纤维化的目前的理论认为，纤维化机理经由部分折叠的中间状态进行，其进而聚集形成淀粉样蛋白的核。在该理论中，有可能的是稳定天然状态的氨基酸置换可能或可能不稳定该部分折叠的中间状态，并可能或可能不提高（或降低）天然状态与中间状态之间的自由能壁垒。因此，目前的理论表明，在双链胰岛素分子中给定的氨基酸置换提高或降低纤维化风险的趋势是高度不可预知的。胰岛素分子结构模型设想三-α螺旋的近乎完全展开（如在天然状态中看到的那样）以及B链的连续堆叠与A链的连续堆叠形成的β折叠的平行排列；在链之间和在A链中的天然二硫化物配对得以保留。此类平行交叉β折叠要求在A链的N末端与B链的C末端之间的显著分离（>30 Å），这两个末端在胰岛素单体天然状态中通常非常接近（< 10 Å）。具有缩短的C结构域的单链胰岛素类似物对纤维化的显著抗性在本领域是已知的，并被认为反映了胰岛素原丝中平行交叉β折叠的展开结构与具有天然二硫化物配对的单链胰岛素类似物的结构（其中缩短的C结构域将A链的N末端与B链的C末端之间的距离限制为在原丝中不利）之间的拓扑不相容性。

单链胰岛素类似物可能因此似乎提供了设计抗纤维化胰岛素类似物的有利途径。但是，过去，此类类似物表现出低活性，其相对于野生型人胰岛素可为1%或更低。（虽然Lee,H.C.等人(2000)声称具有长度为57个残基或58个残基的野生型A-和B-结构域的单链胰岛素类似物表现出相对于人胰岛素为30-40%范围的受体结合亲和力，该出版物因科学上的不当行为在2009年被撤回；在我们手中，由Lee, H.C.等人公开的类似物表现出小于1%的相对亲和力。）可以通过引入Asp^B10（一种本领域已知的用于提高胰岛素对胰岛素受体的亲和力的置换）以部分恢复亲和力。我们此前已经描述过具有C结构域接头GGGPRR的含有Asp^B10的57个残基的单链胰岛素。但是，在A结构域和/或B结构域中使用缩短的C结构域和此类置换可以令结合比例向着相对于IR-B对IR-A的结合提高的比例倾斜，如题为“Isoform-Specific Insulin Analogues”的美国专利申请号12/989,399（经此引用并入本文）中所公开的那样。描述了具有高受体结合亲和力的单链胰岛素类似物，其中缩短的C结构域是胰岛素样生长因子I（IGF-I；序列GYGSSSRRAPQT；SEQ ID NO: 12）的12个残基的C结构域，产生嵌合蛋白。但是，此类嵌合分子表现出对IGF-1R提高的相对和绝对亲和力。此类改变，如同与Asp^B10和在B10位置处的其它置换相关的那些，由于可能与摄取此类类似物的动物或人类患者中提高的癌症风险相关联而引起了广泛的关注。针对基础胰岛素类似物，即设计为随从皮下积存的12-24小时胰岛素吸收状况和12-24小时胰岛素作用状况每日一次给药的那些，此类关注尤为显著。

本发明出于医疗和社会需求，工程改造一种每日一次型基础单链胰岛素类似物，其结合了（i）对降解的抗性，与（ii）实质上体内降糖效力，以及（iii）降低的对IGF-1R的交叉结合，和（iv）类似于野生型人胰岛素的对该胰岛素受体的A-和B-同种型的亲和力比。后一目标反映了胰岛素在人体内的多效功能和靶组织。胰岛素作用的经典范例集中于作为该激素的靶组织的脂肪细胞（其中胰岛素调节甘油三酯液滴形式的燃料储存）、肝脏（其中胰岛素调节经由葡萄糖新生的葡萄糖生产，并调节糖原形式的燃料储存）和肌肉（其中胰岛素调节葡萄糖由血流经由运输注入GLUT4的质膜）的器官特异性功能。但是，最近的研究已经揭示，胰岛素在其它器官和组织中具有生理作用，如在大脑的下丘脑中，其中胰岛素响应性神经回路影响肝代谢、食欲、饱腹感，并有可能影响理想体重的设定点。尽管人类基因组含有编码该胰岛素受体的单个基因，含有胞质酪氨酸激酶结构域的跨膜蛋白，其前信使RNA经历选择性剪接以产生不同的A和B同种型，其分布分数在各器官中可能不同，并且其信号传导功能在相同细胞中可能不同。

该A和B同种型（指定为IR-A和IR-B）在对胰岛素的亲和力方面不同（对IR-A的亲和力比对IR-B的亲和力高两倍），并且仅IR-A（在由外显子11编码的α亚基中缺少肽结构域）以高亲和力结合IGF-II。尽管本领域中已知胰岛素类似物在对IR-A和IR-B各自的亲和力之比不同于野生型胰岛素，有可能胰岛素替代疗法的安全性和有效性最佳地需要施用其对IR-A和IR-B的亲和力之比类似于野生型胰岛素的胰岛素类似物。例如，胰岛素类似物对IR-A的结合相对于IR-A降低可能导致在大脑和在白细胞中胰岛素信号传导程度的相对或绝对降低，所述大脑和白细胞优势表达IR-A受体。类似地，胰岛素类似物对IR-B的结合相对于IR-B降低例如可能导致在经典靶器官中胰岛素信号传导程度的相对或绝对降低，所述经典靶器官展示IR-B受体的优势。此类倾斜的结合亲和力还可能扰乱靶细胞（胰岛β细胞）的细胞功能，其中IR-A介导的胰岛素信号传导和IR-B介导的胰岛素信号传导被认为介导不同细胞功能，其各自有助于适当的β细胞存活率和分泌功能。由于癌症细胞能表现IR-A的过度表达，用表现出提高的IR-A信号传导效力（相对于野生型人胰岛素）的类似物治疗患者可能会造成提高肿瘤生长的风险。在癌细胞中通过胰岛素类似物的有丝分裂信号传导可能通过表现出对有丝分裂IGF-IR受体的交叉结合（相对于野生型人胰岛素）提高的类似物，或通过表现出对IR-A的结合（相对于野生型人胰岛素）提高的类似物，或通过表现出在IGF-IR、IR-A或IR-B上延长的停留时间（相对于野生型人胰岛素）的类似物来介导。B链或B结构域的C末端（B28-B30）附近、在C末端突出端（B31或B32）中，或在单链胰岛素类似物的等效位置（C1和C2）处的碱性残基可以提高胰岛素类似物对IGF-IR的交叉结合并由此提高丝裂原活性。

因此合意的是发明单链胰岛素类似物，其仍然保留野生型胰岛素的至少一部分降葡萄糖作用，并具有可忽略的丝裂原活性和对IGF-IR的交叉结合。更通常地，需要一种胰岛素类似物，其在高于室温的温度下显示出提高的热力学稳定性和对纤维化提高的抗性，并同时表现出胰岛素受体的A和B同种型的亲和力比，由此实现野生型胰岛素多种器官特异性生物活性的至少一个子集。

发明概述

因此，本发明的一个方面是提供单链胰岛素类似物，该单链胰岛素类似物在皮下注射后在啮齿动物中对IGF-IR的交叉结合降低和作用持续时间延长，同时保留野生型胰岛素的至少一部分降葡萄糖活性。本发明的类似物在位置B10处含有组氨酸并由此避免对与该位置处的酸性置换（天冬氨酸或谷氨酸）相关的癌变的担忧。本发明的另一方面在于，该单链胰岛素类似物对IR-A和IR-B的绝对体外亲和力为相对于野生型人胰岛素的5-100%，因此不太可能表现出在激素-受体复合物中停留时间延长。本发明描述了表现出类似于野生型人胰岛素的对IR-A和IR-B的结合亲和力之比的单链胰岛素类似物的应用。

上述特征组合通过新型C结构域设计来提供，其中缩短的连接多肽（长度6-11个残基）含有N-末端酸性元素（残基C1和C2）、柔性接头或铰链（C3），和衍生自IGF-II的C结构域（C4-Cn，其中n = 6、7、8、9、10或11）的C-末端片段。根据含有32个残基B链的双链胰岛素类似物的研究来设计该N-末端酸性元素，在所述双联胰岛素类似物中甘精胰岛素的碱性Arg^B31-Arg^B32元素的电荷被反转（美国专利US 8,399,407，题为“Non-Standard InsulinAnalogues”，经此引用并入本文）。尽管不希望被理论束缚，可以设想，双残基酸性残基引入了对该类似物与IGF-IR的结合不利的静电排斥，但是可以被胰岛素受体同种型充分耐受。同样不希望被理论束缚，可以进一步设想，本发明的C结构域的IGF-II-衍生C-末端片段引入了有利的与胰岛素受体同种型的相互作用，并因此充当辅助受体结合元素，而不是单纯的连接元素（tether）或空间元素。

通常，本发明提供包含本发明的C结构域和在A8位置处含有置换的修饰的A链的单链胰岛素类似物。本发明由此涉及新的一类单链胰岛素类似物，其中该连接结构域（C结构域）具有6-11个残基的长度，并由两个元素组成。该N-末端元素由首两个残基组成（称为C1、C2和C3，对应于延长的胰岛素B链的残基B31-B33），其中（i）C1和C2含有至少一个酸性侧链和在pH 7.4下的-1或-2的净形式静电电荷，和（ii）C3提供如通过甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸所提供的柔性接头或结点。实例是但不限于以下二肽区段：EEG、AEG、EAG、EDG、DEG、DDG、ADG、ADG、EEA、AEA、EAA、EDA、DEA、DDA、ADA、ADA、EEP、AEP、EAP、EDP、DEP、DDP、ADP、ADP、EES、AES、EAS、EDS、DES、DDS、ADS或ADS。该C-末端元素含有衍生自人胰岛素样生长因子II（IGF-II）的肽区段，其C结构域具有序列SRVSRRSR（SEQ ID NO：13）。残基C4-Cn（其中n=6-11）衍生自IGF-II的C结构域或具有序列RVSRRSR、VSRRSR、SRRSR、RRSR或RSR的C-末端片段。这些混合C结构域的长度因此为最小6（在N-末端元素中的三个残基和在C-末端元素中的三个残基）至最大11（在N-末端元素中的三个残基和在C-末端元素中的八个残基）。该A链含有在A8处的碱性置换（赖氨酸、精氨酸或组氨酸）和在A21处的置换（Gly、Ala或Ser）以避免酸催化的脱酰胺或其它方式的Asn相关化学降解。在一个实施例中，该B链还含有Lys^B29→Arg的置换以避免在酵母中的生物合成过程中的Lys-特异性溶蛋白性裂解。

在另一实例中，本发明提供一系列具有EEGX_n形式的接头的单链胰岛素（SCI）分子，其中（i）在位置C1和C2处的EE元素（与Lantus^®的活性组分甘精胰岛素的RR元素的电荷相反）削弱了IGF-IR交叉结合，（ii）G提供柔性铰链，和（iii）X_n衍生自IGF-II的C结构域（序列SRVSRRSR；SEQ ID NO: 13）。使用IGF-II衍生的连接部分提供了多个Arg残基的存在（补偿了电负性EE元素以提供等电点的净位移），并在提高IR受体结合方面起推测作用。称为Thermalin-basal的SCI含有8残基连接肽（序列EEGSRRSR；SEQ ID NO: 14）。该长度的C结构域据信与对受体结合的诱导契合机理相容。

附图概述

图1A是包括A链和B链以及显示具有侧翼二元切割位点（实心圆）和C-肽（空心圆）的连接区的人胰岛素原序列的示意图。

图1B是胰岛素原的结构模型，所述胰岛素原由胰岛素样部分和无序的连接肽（虚线）组成。

图1C是显示B链中残基B27和B30位置的人胰岛素序列的示意图。

图2是显示野生型人胰岛素和本发明的单链胰岛素类似物（SCI-59B）的受体-结合研究的结果的图。顶部的图，使用胰岛素受体的同种型A（IR-A）的竞争性置换测定。中部的图，使用胰岛素受体的同种型B（IR-B）的竞争性置换测定。底部的图，使用1型IGF受体（IGF-1R）的竞争性置换测定。符号：人胰岛素（■）和SCI-59（▲）。这些数据的分析能够如表1中所提供的那样评估激素-受体解离常数。

图3提供了本发明的单链胰岛素类似物（SCI-59B）的2D-NMR谱图。在pH 3.5（如在基础制剂中）和37℃下获得的谱图；混合时间为200毫秒，场强度为700 MHz。

图4是显示中等剂量胰岛素类似物在通过链脲佐菌素患有糖尿病的大鼠（每只大鼠20微克）中的生物检测的结果。在血液[葡萄糖]中随时间（分钟）降低：Humalog^®（赖脯胰岛素）（■），（SCI-59B；▲），Lantus^®（甘精胰岛素）（♦）和稀释剂（●）。各制剂的一个单位（作为U-100）在5只STZ大鼠（N=5）中皮下注射；误差条显示标准误差。

图5A是显示通过链脲佐菌素患有糖尿病并施用新鲜的Thermalin-basal（T-b；▲）、加热的Thermalin-basal（●）、新鲜的Lantus^®（甘精胰岛素）（♦）、加热的Lantus^®（甘精胰岛素）（■）或稀释剂对照物（X）的Sprague-Dawley大鼠中经时血葡萄糖水平的图。加热样品在37℃下柔和搅拌。Thermalin-basal加热56天，Lantus^®加热12天。

图5B是显示通过链脲佐菌素患有糖尿病并施用新鲜的Thermalin-basal（T-b；▲）、加热的Thermalin-basal（●）、新鲜的Lantus^®（甘精胰岛素）（♦）、加热的Lantus^®（甘精胰岛素）（■）、稀释剂对照物（X）的Sprague-Dawley大鼠中经时血葡萄糖水平的图。加热样品在45℃下柔和搅拌。Thermalin-basal加热39天，Lantus^®加热6天。

发明详述

本发明涉及一种单链胰岛素类似物，所述单链胰岛素类似物提供持久的作用持续时间、类似于野生型胰岛素的IR-A/IR-B受体-结合亲和力比以及5-100%范围内的绝对亲和力（选择下限以对应于胰岛素原）、提高的针对IGF-IR的辨识力、推定提高的对A21位置处的化学降解的抗性（由于Asn被Gly、Ala或Ser置换）、推定提高的对高于室温的温度下纤维化的抗性（因单链拓扑结构）和推定提高的热力学活性（至少部分由于Thr^A8被碱性侧链置换：Arg、Lys、His、Orn）。

本发明的至少部分实例的一个方面在于单链类似物的等电点在6.8至7.8之间，使得在酸性条件下（pH3.0-4.5）的可溶性制剂预期在皮下积存（subcutaneous depot）中因pH值转变为接近中性而经历等电沉淀。本发明的至少部分实例的又一方面在于该单链胰岛素类似物保持经受类似于本领域已知的经典锌胰岛素六聚物如T₆胰岛素六聚物、T₃R^f ₃胰岛素六聚物或R₆胰岛素六聚物的蛋白质六聚物的锌离子依赖性形成的能力。

还可以预想，单链类似物还可以由衍生自动物胰岛素（如作为非限制性实例的猪、牛、马和犬胰岛素）的A-和B结构域序列制成。此外或替代地，本发明的胰岛素类似物可以含有残基B1-B3的缺失或可以与缺乏赖氨酸的变体B链结合（例如野生型人胰岛素中的LysB29）以避免在毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisciae）或其它酵母表达物种或菌株中的酵母生物合成中前体多肽的Lys定向蛋白酶解。本发明的单链胰岛素的B结构域可以任选含有意在提高热力学稳定性和受体-结合活性的其它置换。还可以设想，在C结构域中的Thr^B27、Thr^B30或一个或多个丝氨酸残基可以单独或组合地被单糖加合物修饰；实例由O-连接的N-乙酰基-β-D-半乳糖苷（称为GalNAc-Oβ-Ser或GalNAc-Oβ-Thr）、O-连接的α-D-吡喃甘露糖苷（甘露糖-Oβ-Ser或甘露糖-Oβ-Thr）和/或α-D-吡喃葡萄糖苷（葡萄糖-Oβ-Ser或葡萄糖-Oβ-Thr）提供。

此外，考虑到人胰岛素与动物胰岛素之间的相似性，以及过去在患有糖尿病的患者中使用动物胰岛素，还可以设想在胰岛素的序列中引入其它小的修饰，尤其是被认为“保守”的那些置换。例如，可以在具有类似侧链的氨基酸组中进行氨基酸的额外置换而不偏离本发明。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸（Ala或A）、缬氨酸（Val或V）、亮氨酸（Leu或L）、异亮氨酸（Iie或I）、脯氨酸（Pro或P）、色氨酸（Trp或W）、苯丙氨酸（Phe或F）和蛋氨酸（Met或M）。同样，中性极性氨基酸可以在它们的甘氨酸（Gly或G）、丝氨酸（Ser或S）、苏氨酸（Thr或T）、酪氨酸（Tyr或Y）、半胱氨酸（Cys或C）、谷氨酰胺（Glu或Q）和天冬酰胺（Asn或N）的组中互相置换。碱性氨基酸被认为包括赖氨酸（Lys或K）、精氨酸（Arg或R）和组氨酸（His或H）。酸性氨基酸是天冬氨酸（Asp或D）和谷氨酸（Glu或E）。除非另行指出或由上下文显而易见，本文中提到的氨基酸应认为是L-氨基酸。标准氨基酸也可以被属于同一化学种类的非标准氨基酸置换。作为非限制性实例，碱性侧链Lys可以被侧链长度较短的碱性氨基酸（鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸）取代。Lys还可以被中性脂族等排正亮氨酸（Nle）取代，其进而被含有更短的脂族侧链的类似物（氨基丁酸或氨基丙酸）置换。

出于比较目的提供人胰岛素原的氨基酸序列作为SEQ ID NO：1。

SEQ ID NO：1（人胰岛素原）

提供人胰岛素的A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：2（人A链）

提供人胰岛素的B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO：3。

SEQ ID NO：3（人B链）

以SEQ ID NOS：4-10给出了本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列，对应于长度为57、57、58、59、60、61和62的多肽。

SEQ ID NO：4

其中Xaa₁表示His、Arg、Lys或Orn；且其中Xaa₂是Lys、Arg或Orn；Xaa₃是Ala、Gly或Ser；且其中Xaa₄是Gly、Ala或Ser。

SEQ ID NO：5

其中Xaa₁表示His、Arg、Lys或Orn；并且其中Xaa₂是Lys、Arg或Orn；Xaa₃是Ala、Gly或Ser；并且其中Xaa₄是Gly、Ala或Ser。

SEQ ID NO：6

其中Xaa₁表示His、Arg、Lys或Orn；并且其中Xaa₂是Lys、Arg或Orn；并且其中Xaa₃是Gly、Ala或Ser。

SEQ ID NO：7

SEQ ID NO：8

SEQ ID NO：9

SEQ ID NO：10

下列DNA序列编码具有对于在毕赤氏巴斯德酵母中的使用状况优化的密码子的单链胰岛素类似物SCI-59B（见下文）。

SEQ. ID. NO 11

类似的合成基因已经在编码SCI-59A（参见下文）和含有额外置换Glu^B13→Gln的SCI-59A和SCI-59B的衍生物的毕赤氏巴斯德酵母中制备和克隆。

本发明的两种单链胰岛素类似物（称为SCI-59A和SCI-59B）通过在毕赤氏巴斯德酵母中生物合成前体多肽来制备；该系统分泌含有天然二硫键和裂解N-末端延长肽的折叠蛋白质。该裂解的单链胰岛素产品具有59的长度——30个残基的B结构域、8个残基的C结构域和21个残基的A结构域之和。该C结构域序列在各种情况下为EEG SRRSR（SEQ ID NO: 14），其中引入酸性元素（位置C1和C2；粗体）以削弱对IGF-1R的结合，引入Gly（位置C3；斜体）作为柔性接头，以及IGF-II C-结构域衍生元素（在本类似物中的位置C4-C8；下划线）。SCI-59A含有额外置换Thr^A8→His、Asn^A21→Gly和Lys^B29→Arg，而SCI-59B含有额外置换Thr^A8→Arg、Asn^A21→Gly和Lys^B29→Arg（SEQ ID NO: 7）。SCI-59A的形式等电点（pI）被预测通过C结构域序列（三个额外精氨酸残基被两个额外谷氨酸残基部分抵消）和位置A8处的额外的可滴定组氨酸的组合效果而朝向中性移动；B29处的Lys的Arg置换预期对等电点的效果可忽略不计。SCI-59B的形式pI被预测通过C结构域序列（如在SCI-59A中那样，三个额外精氨酸残基被两个额外谷氨酸残基部分抵消）和位置A8处的额外Arg的组合效果而进一步朝向中性移动。

表1. 体外受体-结合亲和力

	胰岛素	SCI-59A	SCI-59B
				人IR-A	0.026±0.005	0.249±0.036	0.055±0.008
人IR-B	0.058±0.007	1.20±0.165	0.154±0.021
				人OGF-1R	3.45±0.54	102.3±32.0	35.3±7.4

缩写：IR-B，胰岛素受体的剪接同种型B；IGF-1R，1型IGF受体。

表1包含SCI-59A和SCI-59B相对于野生型人胰岛素的受体-结合亲和力。图2中提供了代表性数据。这两种单链类似物各自表现出相对于野生型胰岛素对IGF-1R极低的交叉结合。（相对活性定义为类似物对野生型人胰岛素的激素-受体解离常数的比，如通过使用¹²⁵I-人胰岛素的竞争性置换试验测定。）SCI-59B表现出具有类似于野生型胰岛素的比例的在5-100%的目标范围内的对IR-A和IR-B的相对亲和力。相反，SCI-59A（在位置A8处不同）的IR-A和IR-B的亲和力各自低于SCI-59B。而SCI-59A对IR-A的亲和力在目标范围内（约10%），其对IR-B的亲和力在目标范围底部（实验误差内5%），获得了相对于野生型胰岛素提高的IR-A/IR-B结合比。这些发现表明，在接头EEGSRRSR（SEQ ID NO: 14）的情况下在位置A8处Arg优于His。SCI-59B的预测pI也比SCI-59A更接近于甘精胰岛素（其同样含有额外的两个精氨酸残基）的pI。

受体-结合活性的测定步骤如下。微量滴定条带板（Nunc Maxisorb）在4℃下用AU5IgG（100微升/孔，40毫克/毫升在磷酸盐缓冲的盐水中）孵育整夜。通过双位点顺序模型分析结合数据。对非特异性结合校正数据（在1 μΜ人胰岛素存在下相关的膜残留放射性的量）。在所有测定中，在不存在竞争性配体情况下结合的示踪剂的百分比小于15%以避免配体消耗的假象。如Whittaker和Whittaker所述那样通过拟合至数学模型来确定解离常数（K_d）（2005. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936）；该模型采用假设异源竞争的非线性回归（Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114）。

考虑到其更高的受体结合亲和力和更有利的预测的等电点，结构与生物研究集中于SCI-59B。2D-NMR NOESY谱提供了折叠结构的证据（图3）；NOEs的图案和化学位移符合57个残基的单链胰岛素类似物的现有分析（Hua, Q. X.等人(2008)）。

为了评估该类似物在动物模型中的生物活性和效力，通过用链脲霉素（STZ）处理令雄性Sprague-Dawley大鼠（平均体重~300克）患上糖尿病。蛋白质溶液含有KP-胰岛素（赖脯胰岛素，Humalog^®的活性成分；Eli Lilly and Co.）、甘精胰岛素（Lantus^®；Sanofi-Aventis）和/或本发明的单链胰岛素。通过注射由16毫克甘油、1.6毫克间甲酚、0.65毫克苯酚和3.8毫克磷酸钠pH 7.4组成的不含蛋白质的Lilly稀释剂（获自Eli Lilly and Co.）来提供对照物。如图4中所示，相对于Humulog^®（取自未到期的商品小瓶的U-100强度）和Lantus^®（取自未到期的商品小瓶的U-100强度）评价SCI-59B的活性。根据Lantus^®中甘精胰岛素的配方配制SCI-57B，除了pH调节为3.5（而不是pH 4.0）。这些制剂各自的一个单位皮下注射，通过使用临床血糖仪（Hypoguard Advance Micro-Draw计）的连续测量监控血糖浓度方面的所得变化。以五个成员为一组（N=5）在时间t=0时对大鼠进行皮下注射。在时间0和每10分钟直至360分钟从尾巴的剃毛末端获得血液。在类似于Lantus^®的配制条件下，发现本发明的SCI-59B保留了相当一部分甘精胰岛素的生物活性，并具有类似于或大于Lantus^®的作用持续时间。

合成59聚体 SCI，具有置换Arg^A8、Gly^A21、Arg^B29并具有接头EEGRSSSR（SEQ ID NO:7）。这种SCI称为Thermalin-basal或在图5中缩写为T-b。在25℃和pH 4.0下通过CD-监控的胍变性来评价热力学稳定性。通过应用二态模型获得3.5(±0.1)千卡/摩尔的伸展自由能（ΔG_u），这高于这些条件下甘精胰岛素的稳定性（2.7(±0.1)千卡/摩尔）。自由能的这种提高（ΔΔG_u 0.7(±0.2)千卡/摩尔）明显预测了提高的化学稳定性。

相对于甘精胰岛素通过在37℃与45℃下和pH 4.0下的U-100制剂中柔和搅拌来探测对纤维化的抗性。然而在37℃下在10天后和在45℃下在5天后Lantus沉淀，Thermalin-basal的溶液保持澄清，并且硫磺素T（淀粉样蛋白的探针）的荧光并未增强。

在通过链脲霉素产生糖尿病的Sprague-Dawley大鼠（约300克）中测试效力（图5A和5B）。在皮下注射U-100（0.6 mM）Thermalin-basal或Lantus^®（每只大鼠1单位；在Thermalin-basal组(▲)中N=5，在Lantus^®组(♦)中N=10），所获得的血糖浓度（AUC）的降低与恢复表明Thermalin-basal的效力类似于或大于Lantus^®的效力。

Thermalin-basal的活性持续时间也超过了Lantus^®。在37℃和45℃下柔和搅拌时Thermalin-basal或Lantus^®的效力的保留或损失表明，Lantus^®快速损失其效力（■），Thermalin-basal（●）在这些挑战性条件下保留完全活性数周。

治疗患有糖尿病的患者的方法包括施用如本文中所述的单链胰岛素类似物。本发明的另一方面在于，所述单链胰岛素类似物可以在酵母（毕赤氏巴斯德酵母）中制备或通过天然片段连接施以总化学合成。在非标准修饰的情况下合成制备路线是优选的；但是，可行的是借助扩展的遗传密码技术或四碱基密码子技术制造含有非标准修饰的单链类似物的子集。本发明的再一方面是采用非标准氨基酸置换可以提高单链胰岛素类似物对化学降解或对物理降解的抗性。我们进一步设想，本发明的类似物提供了治疗糖尿病或代谢综合征的方法。输送该胰岛素类似物的途径是经由使用注射器或注射笔装置通过皮下注射进行。

一种药物组合物可以包含此类胰岛素类似物，并且其可以任选包含锌。可以以每个胰岛素类似物六聚物2.2个锌原子至每个胰岛素类似物六聚物10个锌原子的不同的锌离子:蛋白质比包含锌离子。该制剂的pH为pH 3.0 - 4.5。在此类制剂中，该胰岛素类似物的浓度通常为大约0.6-5.0 mM；在试剂瓶或注射笔中可以使用最高5 mM的浓度；更浓缩的制剂（U-200或更高）在具有显著胰岛素抗性的患者中具有特别的益处。赋形剂可以包括甘油、甘氨酸、精氨酸、三羟甲基氨基甲烷、其它缓冲液和盐、以及抗微生物防腐剂如苯酚和间甲酚；后一种防腐剂已知提高胰岛素六聚物的稳定性。此类药物组合物可用于通过向患有糖尿病或其它病症的患者施用生理有效量的该组合物来治疗该患者。

基于上述公开内容，现在应当清楚的是，提供的单链胰岛素类似物将实现上文列举的目标。即，这些胰岛素类似物表现出提高的对纤维化的抗性，同时保留所需的药代动力学和药效动力学特征（赋予长效作用）并保持至少一部分野生型胰岛素的生物活性。因此要理解的是，任何变化显然落在要求保护的本发明的范围内，并且由此可以在不离开本文中公开和描述的本发明的精神的情况下确定特定组分要素的选择。

引用下列文献以证明本领域普通技术人员将理解本文中描述的测试和分析方法。

Glendorf, T., Knudsen, L., Stidsen, C.E., Hansen, B.F., Hegelund,A.C., S0rensen, A.R., Nishimura, E., & Kjeldsen, T. 2012. B10置换的胰岛素类似物的代谢与促有丝分裂效力的系统评估（Systematic evaluation of the metabolic tomitogenic potency ratio for B10-substituted insulin analogues）. PLoS One 7(2), e29198.

Hohsaka, T., & Sisido, M. 2012. 非天然氨基酸加入到蛋白中（Incorporation ofnon-natural amino acids into proteins）. Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 809-15.

Hua, Q.X., Nakagawa, S.H., Jia, W., Huang, K., Phillips, N.B., Hu, S. &Weiss, M.A. (2008) 活性超稳定的单链胰岛素类似物的设计：合成、结构和治疗应用（Design of an active ultrastable singe-chain insulin analog: synthesis,structure, and therapeutic implications）. J. Biol. Chem. 283, 14703-14716.

Kristensen, C, Andersen, A.S., Hach, M., Wiberg, F.C., Schaffer, L., &Kjeldsen, T. 1995. 单链胰岛素样生长因子I/胰岛素杂合物以高亲和力与胰岛素受体结合（A single-chain insulin-like growth factor I/insulin hybrid binds with highaffinity to the insulin receptor）. Biochem. J. 305, 981-6.

Lee, H.C., Kim, S.J., Kim, K.S., Shin, H.C., & Yoon, J.W. 2000. 采用单链胰岛素类似物通过基因治疗的1型糖尿病模型中的缓解（Remission in models of type 1diabetes by gene therapy using a single-chain insulin analogue）. Nature 408,483-8. Retraction in: Lee HC, Kim KS, Shin HC. 2009. Nature 458, 600.

Phillips, N.B., Whittaker, J., Ismail-Beigi, F., & Weiss, M.A. (2012) 胰岛素纤维化和蛋白设计：单链类似物对热降解的拓扑抗性和在泵储库的应用（Insulinfibrillation and protein design: topological resistance of single-chainnalogues to thermal degradation with application to a pump reservoir）. J.Diabetes Sci. Technol. 6, 277-288.

Sciacca, L., Cassarino, M.F., Genua, M., Pandini, G., Le Moli, R.,Squatrito, S., & Vigneri, R. 2010. 激活不同胰岛素受体同种型的胰岛素类似物和受体后信号传导（Insulin analogues differently activate insulin receptor isoformsand post-receptor signalling）. Diabetologia 53, 1743-53.

Wang, Z.X. 1995. 描述蛋白分子的两种配体竞争性结合的精确的数学表达（Anexact mathematical expression for describing competitive biding of twodifferent ligands to a protein molecule） FEBS Lett. 360: 111-114.

Whittaker, J.和Whittaker, L. 2005. 全长胰岛素受体的功能性胰岛素结合表位的表征（Characterization of the functional insulin binding epitopes of the full-length insulin receptor）. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936。

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<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 86

<212> PRT

<213> 人类

<400> 1

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

20 25 30

Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys

50 55 60

Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

85

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人类

<400> 2

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人类

<400> 3

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 4

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> X 是 A, G, 或 S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (44)..(44)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (57)..(57)

<223> X 是 G, A 或 S

<400> 4

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Glu

20 25 30

Gly Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser

35 40 45

Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55

<210> 5

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (32)..(32)

<223> X 是 A, G, 或 S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (44)..(44)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (57)..(57)

<223> X 是 G, A 或 S

<400> 5

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Xaa

20 25 30

Gly Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser

35 40 45

Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55

<210> 6

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (45)..(45)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (58)..(58)

<223> X 是 G, A 或 S

<400> 6

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu

20 25 30

Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys

35 40 45

Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55

<210> 7

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R, 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (46)..(46)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (59)..(59)

<223> X 是 G, A 或 S

<400> 7

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu

20 25 30

Gly Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile

35 40 45

Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55

<210> 8

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R, 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (47)..(47)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (60)..(60)

<223> X 是 G, A 或 S

<400> 8

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu

20 25 30

Gly Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser

35 40 45

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55 60

<210> 9

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(48)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (61)..(61)

<223> X 是 G, A 或 S

<400> 9

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu

20 25 30

Gly Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa

35 40 45

Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55 60

<210> 10

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(29)

<223> X 是 K, R, 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (49)..(49)

<223> X 是 H, R, K 或鸟氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (62)..(62)

<223> X 是G, A 或 S

<400> 10

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu

20 25 30

Gly Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys

35 40 45

Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

50 55 60

<210> 11

<211> 180

<212> DNA

<213> 人类

<400> 11

ttcgtcaatc aacacttgtg tggttcccac ttggttgagg cattgtactt ggtctgtggt 60

gagagaggat tcttctacac ccctagaact gaggagggtt ctagaagatc tagaggaatc 120

gtcgagcaat gttgtagatc catttgttcc ttgtaccaat tggagaacta ctgcggataa 180

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人类

<400> 12

Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类

<400> 13

Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 14

Glu Glu Gly Ser Arg Arg Ser Arg

1 5

Claims

1.单链胰岛素类似物，其包含SEQ ID NO: 4- 10的任一个的序列。

2.权利要求1的单链胰岛素类似物，其包含SEQ ID NO: 7的序列。

3.权利要求2的单链胰岛素类似物，其中位置29处的Xaa是Arg。

4.权利要求3的单链胰岛素类似物，其中位置59处的Xaa是Gly。

5.权利要求4的单链胰岛素类似物，其中位置46处的Xaa是Arg。

6.权利要求4的单链胰岛素类似物，其中位置46处的Xaa是His。

7.核酸序列，其编码SEQ ID NO: 4-10的任一个的单链胰岛素类似物。

8.权利要求7的核酸序列，其中该序列包含SEQ ID NO: 11。

9.单链胰岛素类似物或其生理学可接受的盐在制备降低患者血糖的药物中的用途，其中所述单链胰岛素类似物包含SEQ ID NO: 4-10的任一个的序列。

10.权利要求9的用途，其中该单链胰岛素类似物具有SEQ ID NO: 7的序列。

11.权利要求10的用途，其中SEQ ID NO: 7的位置29处的Xaa是Arg。

12.权利要求11的用途，其中SEQ ID NO: 7的位置59处的Xaa是Gly。

13.权利要求12的用途，其中SEQ ID NO: 7的位置46处的Xaa是Arg。

14.权利要求12的用途，其中SEQ ID NO: 7的位置46处的Xaa是His。