BR112015010194B1 - Análogo de insulina de cadeia única, sequência de ácido nucleico e uso do mesmo - Google Patents
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Abstract
SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, ANÁLOGO DE INSULINA DE CADEIA ÚNICA E USO DO MESMO NA FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA REDUZIR A TAXA DE AÇÚCAR NO SANGUE. Um análogo de insulina de cadeia única contendo uma cadeia lateral básica na posição A8 (Arginina, Histidina, Lisina, ou Ornitina), uma cadeia lateral básica na posição B29 (Arginina, Histidina, Lisina, ou Ornitina), e um domínio C encurtado de comprimento de 6-11 resíduos é provido. Resíduos C1 e C2 do domínio C possuem uma carga negativa de rede de -1 ou -2; C3 é escolhido a partir de um grupo consistindo em Gly, Ala, Pro, ou Ser; e o segmento de domínio C restante é sucessivamente derivado do o domínio C de IGF-II (RRSR, SRRSR, VSRRSR, RVSRRSR, ou SRVSRRSR; SEQ ID NO: 13).Um método de tratamento de um paciente com diabetes mellitus ou obesidade compreende administrar uma quantidade efetiva fisiologicamente do análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo a um paciente.
Description
[001] Este pedido reivindica benefício do Pedido Provisório U.S. N. ° 61/722.350 depositado em 5 de novembro de 2012.
[002] Esta invenção foi feita com suporte do governo sob acordos cooperativos concedidos pelo National Institutes of Health - Institutos Nacionais de Saúde, sob números de concessão DK040949 e DK074176. O governo dos Estados Unidos pode possuir certos direitos sobre a invenção.
[003] Esta invenção refere-se a análogos de hormônio polipeptídeo que apresentam propriedades farmacêuticas reforçadas, tais como aumento da estabilidade termodinâmica, resistência aumentada à fibrilação térmica acima da temperatura ambiente, diminuição da mitogenicidade e/ou propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas alterado, ou seja, conferindo duração de ação mais prolongada ou duração mais rápida de ação em relação à formulações solúveis do hormônio humano de tipo selvagem correspondente. Mais particularmente, esta invenção se relaciona com análogos de insulina consistindo em uma cadeia de polipeptídeo única que contém uma classe nova de domínios (C) de conexão encurtados entre domínios A e B. De resíduos de 6-11 de comprimento, os domínios C desta classe consistem em um elemento ácido N-terminal e um segmento C- terminal, derivado do domínio de conexão de IGF-II humano. Os análogos de insulina de cadeia única da presente invenção opcionalmente podem conter as substituições de aminoácidos não padrão ou padrão em outros locais nos domínios A ou B.
[004] A engenharia de proteínas não-padrão, incluindo agentes terapêuticos e vacinas, pode ter benefícios médicos e sociais amplos. Proteínas de ocorrência natural — como codificado nos genomas dos seres humanos, outros mamíferos, os organismos vertebrados, organismos invertebrados ou células eucarióticas em geral — muitas vezes conferem várias atividades biológicas. Um benefício das proteínas derivadas seria conseguir atividade seletiva, tais como diminuição da ligação a receptores celulares homólogos, associado a um efeito colateral não intencional e desfavorável, tais como a promoção do crescimento das células cancerosas. Ainda um outro exemplo dos benefícios sociais seria resistência à degradação aumentada na ou acima da temperatura ambiente, facilitando o transporte, distribuição e uso. Um exemplo de uma proteína terapêutica é fornecido pela insulina. Insulina humana do tipo selvagem e moléculas de insulina codificadas nos genomas de outros mamíferos se ligam à receptores de insulina em múltiplos órgãos e diversos tipos de células, independentemente da isoforma do receptor gerado por modos alternativos de splicing de RNA ou por padrões alternativos de glicosilação pós-translacional. Insulina do tipo selvagem também se vincula com menor afinidade ao receptor de fator de crescimento de insulina do Tipo 1 (IGF-R1).
[005] Um exemplo de um benefício médico adicional seria otimização da estabilidade de uma proteína para desdobramento ou degradação. Tal benefício social seria reforçada pela engenharia de proteínas mais refratárias do que proteínas padrão com relação a degradação em ou acima da temperatura ambiente para usam nas regiões do mundo em desenvolvimento, onde a eletricidade e refrigeração não são consistentemente disponíveis. Análogos de insulina consistindo em uma cadeia única de polipeptídeos e opcionalmente substituições de aminoácidos não padrão podem apresentar propriedades superiores em relação a resistência à degradação térmica ou diminuição da mitogenicidade. O desafio colocado pela sua degradação física é aprofundado pela pendente epidemia de diabetes mellitus na África e na Ásia. Devido a fibrilação constituir a principal via de degradação acima da temperatura ambiente, o design de formulações resistentes à fibrilação pode melhorar a segurança e eficácia da terapia de reposição de insulina em tais regiões desafiadas.
[006] Administração de insulina há muito foi estabelecida como um tratamento para diabetes mellitus. Um objetivo principal da terapia de reposição de insulina convencional em pacientes com diabetes mellitus é o controle apertado da concentração de glicose do sangue para evitar sua excursão acima ou abaixo da característica de intervalo normal de seres humanos saudáveis. Excursões abaixo da escala normal estão associadas com sintomas adrenérgicos ou neuroglicopênicos imediatos, que, em episódios graves, levar a convulsões, coma e morte. Excursões acima da faixa normal estão associadas com risco aumentado em longo prazo da doença microvascular, incluindo retinopatia, cegueira e insuficiência renal.
[007] Insulina é uma pequena proteína globular que desempenha um papel central no metabolismo em vertebrados. Insulina contém duas cadeias, uma cadeia de A, contendo resíduos de 21 e uma cadeia B contendo 30 resíduos. O hormônio é armazenado na acélula-p do pâncreas como um hexâmero estabilizado por Zn2+, mas funciona como um monômero livre de Zn2+ na corrente sanguínea. Insulina é o produto de um precursor de cadeia única, proinsulina, em que uma região de conexão (35 resíduos) liga o resíduo C-terminal da cadeia B (resíduo B30) ao resíduo N- terminal da cadeia A (Fig 1A). Uma variedade de evidências indica que consiste em um núcleo semelhante à insulina e peptídeo de ligação desordenada (Fig. 1B). Formação de três pontes dissulfeto específicas (A6- A11 A7 - B7 e A20 - B19; Figs. 1A e 1B) é pensada para ser acoplada ao dobramento oxidativo de proinsulina no retículo endoplasmático (ER). Proinsulina é montada para formar hexâmeros coordenados de Zn2 + solúveis logo após exportação de ER para o complexo de Golgi. Digestão endoproteolítica e conversão em insulina ocorrem em grânulos secretores imaturos seguidos pela condensação morfológica. Matrizes cristalinas de hexâmeros de insulina de zinco dentro de grânulos de armazenamento maduro foram visualizadas por microscopia eletrônica (EM). A sequência de insulina é mostrada de forma esquemática na Figura 1C. Resíduos individuais são indicados pela identidade do aminoácido (normalmente usando um código de três letras padrão), a posição corrente e sequência (tipicamente como um sobrescrito). Se faz pertinente para a presente que a invenção dos domínios C encurtados de resíduos de comprimento de 6-11 no lugar de domínio C de tipo selvagem de 36 resíduos característicos de pró-insulina humana.
[008] Fibrilação, que é uma preocupação séria na fabricação, armazenamento e uso de insulina e análogos de insulina para o tratamento da diabetes mellitus, é reforçada com temperatura mais elevada, baixo pH, agitação ou a presença de ureia, guanidina, cossolvente etanol ou superfícies hidrofóbicas. Regulamentos de medicamentos nos EUA atuais exigem que a insulina seja descartada se fibrilação ocorrer em um nível igual ou superior a um por cento. Devido a fibrilação é reforçada em temperaturas mais altas, os pacientes com diabetes mellitus otimamente deve manter refrigerada antes do uso de insulina. Fibrilação de insulina ou um análogo de insulina pode ser uma preocupação especial para tais pacientes utilizando uma bomba de insulina externa, na qual pequenas quantidades de insulina ou análogo de insulina são injetadas no corpo do paciente em intervalos regulares. Em tal uso, insulina ou análogo de insulina não é mantido refrigerado dentro do aparato de bomba, e fibrilação de insulina pode resultar na obstrução do cateter usado para injetar insulina ou análogo de insulina no corpo, potencialmente resultando em flutuações imprevisíveis nos níveis de glicose no sangue ou até mesmo a perigosa hiperglicemia. Insulina exibe um aumento na taxa de degradação de 10 vezes ou mais para cada incremento de 10°C na temperatura acima de 25°C; consequentemente, as diretrizes orientam para armazenamento a temperaturas < 30°C e preferencialmente com refrigeração. Fibrilação de análogos de insulina basal formulados como soluções solúveis em pH menor que 5 (tais comode Lantus ® (Sanofi-Aventis), que contém uma solução sem tampão de insulina glargina e zinco ions em pH 4.0) também pode limitar suas vidas auto devido à degradação física na ou acima da temperatura ambiente; as condições ácidas empregadas em tais formulações prejudica auto-montagem de insulina e enfraquece a ligação de ions zinco, redução da extensão a que os análogos de insulina podem ser protegidos por sequestro de conjuntos zinco-proteína.
[009] Insulina é suscetível à degradação química, envolvendo a quebra de ligações químicas com perda de rearranjo de átomos dentro da molécula ou a formação de ligações químicas entre moléculas de insulina diferentes. Tais mudanças nas ligações químicas normalmente são mediadas no estado não dobrado da proteína, e então modificações de insulina que aumentem sua estabilidade termodinâmica também são susceptíveis de retardar ou impedir a degradação química. Insulina também é suscetível a degradação física. A presente teoria da fibrilação proteína postula que o mecanismo da fibrilação procede através de um estado intermediário parcialmente dobrado, que por sua vez agregados para formar um núcleo de amiloidogênicos. Nesta teoria, é possível que substituições de aminoácidos que estabilizam o estado nativo podem ou não podem estabilizar o estado intermediário parcialmente dobrado e podem ou podem não aumentar (ou diminuir) a barreira de energia livre entre o estado nativo e o estado intermediário. Portanto, a teoria atual indica que a tendência de uma determinado substituição de aminoácidos na molécula de insulina de duas cadeias para aumentar ou diminuir o risco de fibrilação é altamente imprevisível. Modelos da estrutura da molécula de insulina preveem desdobramento quase completo das hélices alfa triplas (como visto no estado nativo) com arranjos paralelos de folhas beta formou empilhamento sucessivo de cadeias B e empilhamento sucessivo de cadeias A; dissulfeto nativo de emparelhamento entre cadeias e dentro da cadeia A é mantido. Tais folhas paralelas de cruz-beta requerem separação substancial entre o N-terminal da cadeia A e C-terminal da cadeia B (> 30 A), ordinariamente terminal em estreita proximidade no estado nativo de monômero da insulina (< 10 A). Resistência marcada para fibrilação de análogos de insulina de cadeia única com domínios C encurtados é conhecida na técnica e pensada para refletir uma incompatibilidade topológica entre a estrutura inclinada de folhas beta em cruz paralelas em um protofilamento de insulina e a estrutura de um análogo de insulina de cadeia única com bissulfeto nativo emparelhamento em que o domínio C restringe a distância entre o N-terminal da cadeia-A e C-terminal da cadeia B sendo desfavorável em um protofilamento.
[0010] Análogos de insulina de cadeia única podem parecer assim fornecer uma abordagem favorável para a concepção de análogos de insulina resistente a fibrilação. No entanto, no passado, tais análogos apresentaram atividades baixas, que podem ser 1% ou inferiores em relação a insulina humana do tipo selvagem. (Embora Lee, H.C., et al. (2000) tenham afirmado que análogos de insulina de cadeia única com domínios A e B de tipo selvagem de resíduos de comprimento de 57 ou 58 resíduos apresentam afinidades de ligação ao receptor no intervalo 30-40% em relação à insulina humana, esta publicação foi cancelada em 2009 devido à má conduta científica; ao nosso ver análogos divulgados por Lee, H.C. et al apresentam afinidades relativas de menos de 1 %.) Afinidade em parte pode ser restaurada por introdução de AspB1°, uma substituição conhecida na técnica para aumentar a afinidade da insulina para o receptor de insulina de substituição. Anteriormente descrevemos uma insulina de cadeia única de 57 resíduos contendo AspB1° com GGGPRR vinculador de domínio C. No entanto, o uso de domínios C encurtados em conjunto com tais substituições no domínio A e/ou B podem distorcer a relação de vinculação em direção a uma relação melhorada de vinculação para IR-A em relação ao IR-B, conforme divulgado no Pedido de Patente US N. 0 12/989.399, intitulado "Análogos da insulina isoforma específica" (incorporados por referência neste documento). Um análogo de insulina de cadeia única com alta afinidade de ligação ao receptor foi descrito no qual o domínio C encurtado foi o domínio C de 12 resíduos de crescimento semelhante à insulina fator de crescimento de tipo insulina I (IGF-I; sequência de GYGSSSRRAPQT; SEQ ID NO: 12), produzindo uma proteína quimérica. No entanto, tais moléculas quiméricas exibem reforçadas afinidades relativas e absolutas para IGF-1R. Tais alterações, como aqueles associadas com AspB1° e outras substituições na posição B10, já suscitou ampla preocupação devido à possível associação com risco aumentado de câncer em animais ou humanos doentes a tomar tais análogos. Esta preocupação é especialmente marcada com relação a análogos de insulina basal, isto é, aqueles projetados para administração de uma vez por dia, com perfil de 12-24 horas de absorção de insulina de um perfil subcutâneo de depósito e 12-24 horas de ação da insulina.
[0011] A presente invenção foi motivada pelas necessidades médicas e sociais para projetar um análogo de insulina de cadeia única de uma vez por dia basal que combine (i) resistência à degradação (ii) potência hipoglicemica in vivo substancial (iii) redução de ligação em cruz a IGF-1R e (iv) uma relação de afinidades para isoformas A e B do receptor de insulina que é semelhante a insulina humana do tipo selvagem. O último objetivo reflete as funções de pleitrópicas e tecidos-alvo da insulina no corpo humano. O paradigma clássico de ação de insulina centrou-se em funções específicas do órgão dos adipócitos (onde insulina regula o armazenamento de combustíveis sob a forma de gotículas de triglicerídeo), o fígado (onde insulina regula a produção de glicose através da gluconeogênese e regula o armazenamento de combustível sob a forma de glicogênio) e muscular (onde a insulina regula o influxo de glicose da corrente sangüínea através do tráfico para a membrana plasmática de GLUT4) como os tecidos alvo do hormônio. Recente pesquisas revelaram, no entanto, que a insulina tem funções fisiológicas em outros órgãos e tecidos, tais como no hipotálamo do cérebro, no qual circuitos neurais insulino-responsivos influenciam o metabolismo hepático, apetite, saciedade e possivelmente o ponto de ajuste para o peso corporal ideal. Embora o genoma humano contenha um único gene que codifica o receptor de insulina, uma proteína transmembrana que contém um domínio de tirosina-quinase citoplasmática, seu pre-mensageiro RNA sofre splicing alterative para produzir isoformas A e B distintas, cuja distribuição fracionária pode ser diferente de órgão para órgão e cujas funções de sinalização podem variar dentro das mesmas células.
[0012] As isoformas A e B (designadas IR-A e IR-B) diferem em afinidade de insulina (afinidade para IR-A é duas vezes superior a afinidade para IR-B), e apenas IR-A (falta de um domínio de peptídeo a subunidade alfa codificado por exon 11) vincula-se a IGF-II com afinidade elevada. Apesar de análogos de insulina serem conhecidos na arte que diferem da insulina do tipo selvagem na proporção das respectivas afinidades para IR-A e IR-B, é possível que a segurança e a eficácia da terapia de reposição de insulina otimamente exigiria administração de um análogo de insulina cuja razão de afinidades para IR-A e IR-B é similar a insulina do tipo selvagem . Vinculação reduzida de um análogo de insulina para IR-A em relação a IR-A, por exemplo, pode levar a uma diminuição relativa ou absoluta na medida de sinalização de insulina no cérebro e em glóbulos brancos, que expressam uma predominância de receptores IR-A. Da mesma forma, vinculação reduzida de um análogo de insulina para IR-B em relação ao IR-B, por exemplo, talvez leva a uma diminuição relativa ou absoluta na sinalização da insulina sinalização em órgãos alvo clássico que apresentam predominância de receptores IR-B. Tais afinidades de vinculação enviesada também pode perturbar a função celular de células alvo (tais como células beta do pâncreas) em que sinalização de insulina de mediação de IR-A e sinalização de insulina mediada por IR-B são pensados para mediar funções celulares diferentes que cada um contribui para viabilidade beta-celular adequada e função secretora. Devido a células cancerosas poderem exibir sobre-expressão de IR-A, o tratamento de um paciente com um análogo que apresenta maior potência de sinalização de IR-A (em relação a insulina humana do tipo selvagem) pode representar um risco de aumentar o crescimento do tumor. Sinalização mitogênica por análogos de insulina em células cancerosas podem ser mediadas por análogos que exibem vinculação cruzada potencializada ao receptor IGF- 1R mitogênico (relativo à insulina humana de tipo selvagem) ou análogos que apresentam vinculação reforçada para IR-A (relativa ao insulina humana de tipo selvagem) ou por análogos que tempos de residência de exposição prolongada em IGF-1R, IR-A, ou IR-B (em relação a insulina humana do tipo selvagem), resíduos básicos perto do C-terminal da cadeia B ou domínio B (B28-B30), dentro de uma extensão C-terminal (B31 ou B32), ou nas posições equivalentes de um análogo de insulina de cadeia única (C1 e C2) pode realçar ligação em cruz de um análogo de insulina de IGF-1R e desse modo melhorar mitogenicidade.
[0013] Seria desejável, portanto, a inventar uma única cadeia análogo da insulina com a mitogenicidade negligenciável e transversal de ligação ao IGF-1R, no entanto, que retém pelo menos uma parte do efeito de diminuição da glucose de tipo selvagem de insulina. De modo mais geral, existe uma necessidade de um análogo de insulina que exibe maior estabilidade termodinâmica e aumento da resistência à fibrilação acima da temperatura ambiente, enquanto que exibem uma proporção de afinidades para as isoformas A e B do receptor de insulina, e assim por inferência, pelo menos, um subconjunto das múltiplas atividades biológicas específicas de órgãos de tipo selvagem de insulina.
[0014] Portanto, é um aspecto da presente invenção fornecer análogos de insulina de cadeia única que proporcionam diminuição da ligação em cruz a IGF-1R e duração de ação prolongada, mantendo pelo menos uma porção da atividade reduzindo a glicose da insulina humana do tipo selvagem em roedores após injeção subcutânea. Os análogos da presente invenção contêm histidina na posição B10 e assim contornam preocupações em relação a carcinogênese associado com uma substituição de ácidos (ácido aspártico ou ácido glutâmico) nessa posição. É um aspecto adicional da presente invenção que afinidades em vitro absolutas do análogo de insulina de cadeia única para IR-A e IR-B estando no intervalo 5-100% em relação ao tipo selvagem insulina humana e improvável para apresentar tempos de residência prolongada no complexo receptor de hormônio. A presente invenção aborda a utilidade dos análogos de insulina de cadeia única que exibem uma taxa de afinidades de vinculação a IR-A e IR-B que é semelhante a de insulina humana do tipo selvagem.
[0015] A combinação acima dos recursos é conferida por um projeto novo de domínio C em que um polipeptídeo é uma descrição de conexão (resíduos de comprimento 6-11) contém um elemento ácido N-terminal (resíduos C1 e C2), uma articulação flexível ou dobradiça (C3) e segmento C-terminal derivado do C-domínio do IGF-II (C4-Cn, onde n = 6, 7, 8, 9, 10 ou 11). O elemento ácido N-terminal foi projetado de acordo com estudos de análogos de insulina de duas cadeias contendo cadeias B de 32 resíduos em que as cargas de elemento ArgB31-ArgB32 básico de glargina de insulina foram invertidas (Pedido de patente US N° 8.399.407, intitulado "Análogos de Insulina Não Padronizados," incorporados por referência neste documento). Embora não se deseje ser constrangido pela teoria, prevê-se que o resíduo de ácido de 2-resíduos introduz a repulsão eletrostática desfavorável na ligação do análogo ao IGF-1R, mas é bem tolerado por isoformas do receptor de insulina. Também sem querer ser constrangido pela teoria, ainda prevê que o segmento C-terminal derivado de IGF-II do domínio C da presente invenção apresenta interações favoráveis com isoformas do receptor de insulina e então funciona como um elemento de ligação ao receptor auxiliar ao invés de um mero tether ou elemento de espaçamento.
[0016] Em geral, a presente invenção fornece um análogo de insulina de cadeia única, compreendendo um domínio C da presente invenção e um modificado substituições de contendo A cadeia na posição A8. A presente invenção refere-se assim a uma classe nova de análogos de insulina de cadeia única em que o domínio de conexão (C) é de 6-11 de comprimento e consiste em dois elementos. O elemento N-terminal consiste dos dois primeiros resíduos (designados C1, C2 e C3, correspondente a resíduos B31-B33 de uma insulina estendida da cadeia B) em que (i) C1 e C2 contêm pelo menos uma cadeia lateral ácida e uma carga eletrostática formal em pH 7,4 de -1 ou -2 e C3 (ii) fornece uma articulação flexível ou torção conforme fornecido pela glicina , alanina, prolina ou serina. são exemplos, mas não estão limitados aos seguintes segmentos de dipeptídeo: EEG, AEG, EAG, EDG, DEG, DDG, ADG, ADG, EEA, AEA, EAA, EDA, DEA, DDA, ADA, ADA, EEP.AEP, EAP, EDP, DEP, DDP, ADP, ADP, EES, AES, EAS, EDS, DES, DDS, ADS, ou ADS. . O elemento C- terminal contém um segmento de peptídeo derivado do fator de crescimento insulina do tipo humano II (IGF-II), cujo domínio C tem sequência SRVSRRSR (SEQ ID NO: 13). Resíduos c4-cn (onde n = 6-11) derivam do domínio C de IGFR-II ou fragmentos C-terminal com seqüências RVSRRSR, VSRRSR, SRRSR, RRSR ou RSR. Estes domínios híbrido C assim variam em comprimento desde um mínimo de 6 (três resíduos no elemento N-terminal) e três resíduos no elemento C-terminal até um máximo de 11 (três resíduos no elemento N-terminal e oito resíduos no elemento C-terminal). A cadeia contém uma substituição básica no A8 (histidina, arginina ou lisina) e uma substituição no A21 (Gly, Ala, ou Ser) para evitar deamidation catalisada por ácido ou outros modos de degradação química Asn-relacionados. No exemplo de uma cadeia B também contém substituições LysB29 >Arg para evitar divagem proteolítica de Lys-específicos durante a biossíntese na levedura.
[0017] Em outro exemplo, a presente invenção fornece uma série de moléculas de insulina (SCI) cadeia única com ligantes de EEG Xn onde o elemento (i) da EE em posições C1 e C2 (oposto no comando para o elemento de RR de de insulina glargina, o componente ativo de Lantus ®) enfraquece a ligação cruzada de IGF-1R, G (ii) fornece uma dobradiça flexível , e (iii) Xn deriva do C-domínio do IGF-II (seqüência SRVSRRSR; SEQ ID N °: 13). O uso de um tether IGF-ll-derivado fornece a presença de vários resíduos de Arg (compensando o elemento negativo de EE para fornecer uma mudança líquida no ponto isoeléctrico) e a hipótese de papel no reforço da ligação ao receptor IR. O SCI referido como Thermalin-basal contém um peptídeo de conexão 8-resíduo (seqüência EEGSRRSR; SEQ ID NO: 14). Acredita-se que domínios C deste comprimento são compatíveis com o mecanismo de ajuste induzido na ligação ao receptor.
[0016] FIG. 1a é uma representação esquemática da sequência de proinsulina humana, incluindo a cadeias A e B e a região de conexão mostrada com locais de clivagem dibásica flanqueada (círculos preenchidos) e peptídeo-C (círculos abertos).
[0017] FIG. 1B é um modelo estrutural de proinsulina, consistindo de uma fração semelhante à insulina e um peptídeo de conexão desordenado (linha tracejada).
[0018] FIG. 1C é uma representação esquemática da sequência de insulina humana indicando a posição dos resíduos B27 e B30 na cadeia B.
[0019] FIG. 2 é um gráfico mostrando os resultados dos estudos de ligação ao receptor de insulina humana do tipo selvagem e um análogo de insulina de cadeia única da presente invenção (SCI-59B). O painel superior, ensaio de deslocamento competitivo empregando isoforma A do receptor de insulina (IR-A). Painel médio, ensaio de deslocamento competitivo, empregando a isoforma B do receptor de insulina (IR-B). Parte inferior do painel, ensaio de deslocamento competitivo, empregando o receptor do tipo 1 IGF (IGF-1R). Símbolos: SCI-59 (A) e insulina humana (■). análise destes dados permite estimativas das constantes de dissociação do receptor de hormônio conforme previsto na tabela 1.
[0020] FIG. 3 fornece o espectro de 2D-NMR de um análogo de insulina de cadeia única da presente invenção (SCI-59B). O espectro do adquirido no pH 3.5 (como em uma formulação basal) e 37 °C; o tempo de mistura foi 200 ms e campo força 700 MHz.
[0021] FIG. 4 é um gráfico mostrando os resultados dos testes biológicos de análogos da insulina de dose média em ratos (20 g de μpor rato) processado diabético por steptozotocina. Diminuição no sangue [glicose] com o tempo (min): ©Humalog (insulina lispro) (■), (SCI-59B; A),©Lantus (insulina glargina) (♦) e diluente (Φ)- Uma unidade de cada formulação (como U-100) foi injetada por via subcutânea em 5 ratos STZ (N = 5); barras de erro indicam erros-padrão.
[0022] Fig. 5A é um gráfico mostrando níveis de glicose sanguínea ao longo do tempo em de ratos Sprague-Dawley processado diabético por steptozotocina e Thermalin-basal administrado fresco (T-b; A), Thermalin- basal (•) aquecida ,Lantus © fresco (insulina glargina) (♦), aquecida de Lantus® ( insulina glargina) (■), ou controle de diluente (X). Amostras aquecidas foram agitadas suavemente a 37 °C. Thermalin-basal foi aquecida por 56 dias Lantus © por 12 dias.
[0023] Fig. 5B é um gráfico mostrando níveis de glicose sanguínea ao longo do tempo em de ratos Sprague-Dawley processado diabético por steptozotocina e Thermalin-basal administrado fresco (T-b; A), Thermalin- basal (•) aquecida ,Lantus © fresco (insulina glargina) (♦), aquecida de Lantus® ( insulina glargina) (■), ou controle de diluente (X). Amostras aquecidas foram agitadas suavemente a 45 °C. Thermalin-basal foi aquecida por 39 dias, Lantus por 6 dias.
[0024] A presente invenção é direcionada para um análogo de insulina de cadeia única que fornece a prolongada duração de ação, uma relação de afinidades de ligação ao receptor IR-A/IR-B semelhantes do selvagem- tipo insulina com afinidades absolutas na gama 5-100% (limite inferior escolhido para corresponder a pró-insulina), aumentou a discriminação do IGF-1R, presume-se aumentada resistência à degradação química na posição A21 (devido à substituição da Asn por Gly Ala ou Ser), presume-se resistência aumentada à fibrilação acima da temperatura ambiente (devido à topologia de cadeia única) e presume-se aumento da atividade termodinâmico (devido em parte à substituição de A8 Thr por uma cadeia lateral básica; Arg, Lys, His, Orn).
[0025] É um aspecto de pelo menos alguns exemplos da presente invenção que o ponto isoelétrico do análogo de cadeia única está entre 6,8 e 7,8 tal que seria de esperar uma formulação solúvel em condições ácidas (pH 3,0-4,5) submeter-se a precipitação isoelétrica no depósito subcutâneo devido a uma mudança de pH próximo a neutralidade, também é um aspecto pelo menos alguns exemplos da presente invenção que o análogo de insulina de cadeia única reter uma competência a submeter-se a formação de íon zinco-dependente de análogos de hexâmeros de proteína para o hexâmero de insulina - zinco clássico conhecido na técnica como hexâmero de insulina T 6 insulina, T3Rf3 ou hexâmero de insulina R 6.
[0026] Também prevê-se que os análogos de cadeia única também podem ser feitos com sequências de A - e B-domínio derivadas de insulinas animais, como suínos, bovinos, equinos e caninas insulinas, a título de exemplos não limitante. Em adição ou em alternativa, o análogo de insulina da presente invenção pode conter um de eliminação de resíduos B1-B3 ou pode estar em combinação com uma corrente de variante B falta lisina (por exemplo, LysB29 na insulina humana do tipo selvagem) para evitar a proteólise Lys-dirigida de um precursor de polipeptídeo na biossíntese de levedura em Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisciae, ou outras cepas ou espécies de expressão de levedura. O domínio B da insulina de cadeia única da presente invenção pode opcionalmente conter outras substituições, destinadas ao aumento de estabilidade termodinâmica e atividade de vinculação ao receptor. Também é previsto ThrB27, ThrB3°, ou um ou mais resíduos de Serina no domínio C podem ser modificados, unicamente ou em combinação, por um aduto de monossacarídeo; exemplos são fornecidos pot O-ligado a N-acetil-a-D-galactopiranosídeo (designando GaINAc-Oa-Ser ou GaINAc-Oa-Thr), O-ligado a oc-D- manopiranosida (manose-Occ-Ser ou manose-Oa-Thr), e/ou a-D- glucopiranosida (glicose-Oa-Ser ou glicose-Oa-Thr). a. Além disso, tendo em conta a semelhança entre insulina humana e insulina de animais e utilização no passado de insulinas animais em pacientes humanos com diabetes mellitus, também se prevê que outras pequenas modificações na sequência de insulina podem ser introduzidas, especialmente aquelas substituições considerado "conservador". Por exemplo, adicionais substituições de aminoácidos podem ser feitas dentro de grupos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes, sem partir da presente invenção. Estes incluem os aminoácidos hidrofóbicos neutros: Alanina (Ala ou A), valina (Vai ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (lie ou eu), prolina (Pro ou P), triptofano (Trp ou W), fenilalanina (Phe ou F) e metionina (Met ou M). Da mesma forma, os aminoácidos polares neutros pode ser substituídos por outro dentro do grupo da glicina (Gly ou G), serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), tirosina (Tyr ou Y), cisteína (Cys ou C), glutamina (Glu ou Q) e asparagina (Asn ou N). Aminoácidos básicos são considerados incluem lisina (Lys ou K), arginina (Arg ou R) e histidina (His ou H). Amino ácidos acídicos são o ácido aspártico (Asp ou D) e o ácido glutâmico (Glu ou E). Salvo indicado de outro modo, ou onde quer que seja óbvio a partir do contexto, os aminoácidos observados neste documento devem ser considerados para ser aminoácidos L. Aminoácidos-padrão também podem ser substituídos pelos fora do padrão de aminoácidos que pertencem à mesma classe química. A título de exemplo não limitante, a cadeia lateral básica Lys pode ser substituída por aminoácidos básicos de menor comprimento de cadeia lateral (ornitina, ácido diaminobutírico ou diaminopropiônico). Lys também pode ser substituído por Norleucina isostere alifática neutra (Nle), que, por sua vez, pode ser substituída por análogos contendo cadeias de alifáticas laterais mais curtas (ácido aminobutírico ou ácido aminopropiônico). b. A sequência de aminoácidos de proinsulina humana é provida, para fins de comparação, como SEQ ID NO: 1. c. SEQ IP NO: 1 (proinsulina humana) d. Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg- Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly- Ala-Gly-Ser-Leu-GIn-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys-Arg-Gly-lle- Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu-Glu-Asn-Tyr- Cys-Asn e. A sequência de aminoácidos da cadeia A de insulina humana é provida como SEQ ID NO: 2. f.SEQ IP NO: 2 (cadeia A humana) g. Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn- Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn h. A sequência de aminoácidos da cadeia B de insulina humana é provida como SEQ ID NO: 3. i. SEQ IP NO: 3 (cadeia B humana) j. Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr- Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr k. A sequência de aminoácidos de análogos de insulina de cadeia única da presente invenção se dá em SEQ ID NOS: 4-10, correspondendo a polipeptídeos de comprimento de 57, 57, 58, 59, 60, 61 e 62. I.SEQ IP NO: 4 m. Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Xaa3- Glu-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-XaaT-Ser-lle-Cys-Ser- Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa4 l. Em que Xaa! indica His, Arg, Lys ou Orn; e onde Xaa2 é Lys, Arg ou Orn; Xaa3 é Ala, Gly ou Ser; e onde Xaa4 é Gly, Ala ou Ser. o. SEQ IP NO: 5 p. Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu- Xaas-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-XaarSer-lle-Cys-Ser- Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa4 q. EM que Xaa! indica His, Arg, Lys ou Orn; e onde Xaa2 é Lys, Arg ou Orn; Xaa3 é Ala, Gly ou Ser; e onde Xaa4 é Gly, Ala ou ser. r.SEQ IP NO: 6 s. Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu- Glu-Gly-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-XaarSer-lle-Cys- Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 r. Onde Xaa! indica His, Arg, Lys ou Orn; e onde Xaa2 é Lys, Arg, ou Orn; e onde Xaa3 é Gly, Ala ou Ser. u. SEQ IP NO: 7 v. Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu- Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-XaarSer-lle- Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 w. Where Xaa! indictes His, Arg, Lys ou Orn; and where Xaa2 is Lys, Arg, ou Orn; and where Xaa3 is Gly, Ala ou Ser. x. SEQ ID NO: 8 y. Phe-Val-Asn-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu- Glu-Gly-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Xaa-i-Ser-lle- Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 z. Onde Xaa! indica His, Arg, Lys ou Orn; e onde Xaa2 é Lys, Arg, ou Orn; e onde Xaa3 é Gly, Ala ou Ser. aa. SEQ ID NO: 9 bb. Phe-Val-Asn-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu- Glu-Gly-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Xaar Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa3 cc. Onde Xaa! indica His, Arg, Lys ou Orn; e onde Xaa2 é Lys, Arg, ou Orn; e onde Xaa3 é Gly, Ala ou Ser. dd. SEQ ID NO: 10 ee. Phe-Val-Asn-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-Glu- Glu-Gly-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys- XaarSer-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaas ff. Onde Xaa! indica His, Arg, Lys ou Orn; e onde Xaa2 é Lys, Arg, ou Orn; e onde Xaa3 é Gly, Ala ou Ser. gg. A seguinte seqüência de DNA codifica análogo de insulina de cadeia única SCI-59B (veja abaixo) com códons otimizados para padrões de uso em Pichia pastoris. hh. SEQ. IP. NO 11 TTCGTCAATCAACACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCATTGT ACTTGGTCTGTGGTG AGAGAGGATTCTTCTACACCCCTAGAACTGAGGAGGGTTCTAGAA GATCTAGAGGAATCG TCGAGCAATGTTGTAGATCCATTTGTTCCTTGTACCAATTGGAGAA CTACTGCGGATAA
[0027] Genes sintéticos de análogo foram preparados e clonados em Pichia pastoris codificando SCI-59A (veja abaixo) e derivados de SCI-59A e SCI-59B contendo a substituição adicional GluB13-*Gln.
[0028] Dois análogos de insulina de cadeia única da presente invenção (designado SCI-59A e SCI-59B) foram elaborados pela biossíntese de um polipeptídeo precursor em Pichia pastoris', este sistema segrega uma proteína dobrada que contém pontes dissulfeto nativo com peptídeo de extensão de N-terminal de divagem. Os produtos de insulina de cadeia única tiveram comprimento de 59, a soma de um domínio C de 30 resíduos , domínio C de 8 resíduos e domínio A de 21 resíduos. A sequência de domínio C foi em cada caso EEGSRRSR (SEQ ID NO: 14) no qual o elemento ácido (posições C1 e C2; negrito) foi introduzido para prejudicar a ligação ao IGF-1R, Gly (posição C3; itálico) foi introduzido como uma junta flexível e um elemento de IGF-II derivado de domínio C (C4-C8 posiciona o analógico presente; sublinhado). SCI-59A contido substituições adicionais ThrA8 >His,de^A21 Asn Gly e l_ysB29 7\rg considerando que SCI-59B continha substituições adicionais Thr^^Arg, AsnA21>Gly e LysB29 >Arg (SEQ ID NO: 7). O ponto isoelétrico formal (pl) de SCI-59A foi previsto para ser deslocado na direção de neutralidade pelos efeitos combinados da seqüência de domínio C (três resíduos Arginina adicionais parcialmente deslocados por dois resíduos adicionais de ácido glutâmico) e uma histidina titulável adicional na posição A8; a substituição de Arg para Lys na B29 era esperada para ter um efeito negligenciável sobre o ponto isoelétrico. O pl formal de SCI-59B foi previsto para ser ainda mais deslocado na direção de neutralidade pelos efeitos combinados da seqüência de domínio C (três resíduos de arginina adicionais parcialmente compensados por dois resíduos adicionais ácido glutâmico como SCI-59A) e um Arg adicional na posição A8. Tabela 1. In V/froAfin idades de Ligação ao Receptor
Abreviaturas: IR-B, isoforma B em splicing do receptor de insulina; IGF-1R, receptor IGF Tipo 1 a. A tabela 1 contém afinidades de ligação ao receptor de SCI- 59A e SCI-59B em relação a insulina humana do tipo selvagem. Dados representativos são fornecidos na Figura 2. Análogos de cadeia única os dois cada exibem baixíssima ligação em cruz a IGF-1R em relação à insulina de tipo selvagem. (Atividade relativa é definida como a razão entre as constantes de dissociação de receptor de hormônio do análogo a insulina humana do tipo selvagem, como medido por um ensaio de deslocamento do competidor usando 125- insulina humana.) SCI-59B apresenta afinidades relativas ao IR-A e IR-B no destino variando de 5100% com relação semelhante a insulina do tipo selvagem. Por outro lado, as afinidades IR-A e IR-B de SCI-59A (diferentes na posição A8) são cada inferiores a SCI-59B. Considerando a afinidade de SCI-59A para IR-A está dentro do intervalo de destino (ca. 10%), sua afinidade para IR-B está na parte inferior do intervalo alvo (5% dentro de erro experimental), resultando em uma relação de vinculação de IR-A/IR-B que pode ser elevada em relação ao tipo selvagem insulina... Estas verificações sugerem que Arg é preferencial sobre a His na posição A8 no contexto de vinculador EEGSRRSR (SEQ ID NO : 14). O pl previsto de SCI-59B também está mais próxima da insulina glargina (que também contém um excesso de dois resíduos de Arginina) do que a de SCI-59A. b. O protocolo para ensaio de ligação ao receptor atividades foi a seguinte, placas de strip da microplaca (Nunc Maxisorb) foram incubadas durante a noite a 4o C com AU5 IgG (100 μ l/poço de 40 mg/ml de tampão fosfato salino), ligação de dados foram analisadas por um modelo seqüencial de dois locais, dados foram corrigidos para ligação inespecífica (quantidade de radioactividade restantes membrana associada na presença de μM 1 insulina humana... em todos os ensaios, a porcentagem do tracer vinculada na ausência do ligante concorrente foi menos de 15% para evitar o da constantes de dissociação artefatos. Esgotamento por ligante (IÇ) foram determinados por meio de montagem de um modelo matemático, como descrito por Whittaker e Whittaker (2005. J. Biol. Chem. 280: 2093220936); The model employed non-linear regression with the assumption of heterologous competition (Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114). c. Estudos estruturais e biológicas focados em SCI-59B, à luz de sua maior afinidade de ligação ao receptor e mais favorável previsto ponto isoelétrico. o espectro NOESY 2D-NMR forneceu evidências para uma estrutura dobrada (Figura 3); o padrão de nãos e mudanças químicas estão de acordo com a análise prévia de um análogo de insulina de cadeia única de 57-resíduo (Hua, p. X. et al. (2008)). d. Para avaliar a atividade biológica e a potência de análogos em um modelo animal, ratos Sprague Dawley machos (massa corporal média ~ 300 gramas) eram tendenciosos diabético pelo tratamento com estreptozotocina (STZ). Soluções de proteínas contendo insulina KP (insulina Lispro, o componente ativo do Humalog®; Eli Lilly e Co.), insulina glargina (Lantus®; Sanofi-Aventis), e/ou uma insulina de cadeia única da presente invenção. Um controle foi fornecido pela injeção de diluente Lilly livre de proteína (Obtida de Eli Lilly e Co.) composto de 16 mg de glicerina, 1,6 mg mefa-cresol, fenol 0,65 mg e 3,8 mg de sódio fosfato pH 7,4. A atividade de SCI-59B foi avaliada em relação a de Humulog® (U-100 força tirada de um frasco comercial ainda em vigor) e Lantus® (U-100 força tirada de um frasco comercial ainda em vigor) como mostrado na Figura 4. SCI-57B foi formulado de acordo com a formulação de insulina glargina em® de Lantus, exceto que o pH foi ajustado em 3.5 (ao invés de pH 4.0). Uma unidade de cada uma destas formulações foram injetados por via subcutânea, e resultante de alterações na concentração de glicose no sangue foram monitoradas por medições serial utilizando um glicosímetro clínico (medidor Hypoguard Advance Micro-Draw). Ratos foram injetados por via subcutânea no tempo t = 0 em grupos de cinco (N = 5). Sangue foi obtido da ponta cortada da cauda no tempo 0 e a cada 10 minutos até 360 min. SCI-59B da presente invenção foram encontrados, em condições de formulação similar de Lantus®, para manter uma proporção substancial da atividade biológica da insulina glargina e com duração de ação semelhante ou maior que a de® Lantus. e. Um SCI 59mer foi sintetizado tendo o substituições Arg^.Gly^1, Arg B29 e tendo o vinculador EEGRSSSR (SEQ ID NO: 7). Este SCI é conhecido como Thermalin-basal ou abreviado como T-b na Fig. 5. Estabilidade termodinâmica foi avaliada em 25 °C e pH 4.0 por desnaturação de guanidina monitorada por CD. Uma energia livre de desdobramento (ΔGU) de 3,5(±0.1) kcal/mol foi obtida pela aplicação de um modelo de dois estados, que é maior do que a estabilidade da insulina glargina sob essas condições (2.7(±0.1) kcal/mol). Este aumento na energia livre (ΔΔGU 0,7(±0,2) kcal/mol) prevê estabilidade química significativamente maior. f. Resistência à fibrilação foi sondada por agitação suave em uma formulação de U-100 em 37 e 45 °C em pH 4.0 em relação a insulina glargina. Considerando que Lantus precipitou após 10 dias a 37 °C e depois de 5 dias a 45 °C, soluções de Thermalin-basal permaneceram claras e sem aumento na fluorescência de Thioflavin T (uma sonda de amilóide). g. A potência foi testada em ratos Sprague-Dawley (ca. 300 g) tendenciosos a diabéticos por estreptozotocina (Fig. 5A e 5B). Após injeção subcutânea de U-100 (0,6 mM) Thermalin-basal ouLantus ® (1 unidade por rato; N = 5, no grupo Thermalin-basal (A) e no grupo ® de Lantus (♦) de N = 10), a redução resultante e a recuperação da concentração de glicose no sangue (AUC) indicaram que a potência Thermalin-basal é semelhante ou maior do que a ®de Lantus. A duração da atividade de Thermalin-basal também ultrapassa a de Lantus®. Retenção ou perda de potência de® Thermalin-basal ou Lantus em agitação suave em 37 e 45 °C mostra que enquantoLantus ® rapidamente perde sua potência (■), Thermalin-basal (•) manteve plena atividade durante várias semanas sob estas condições desafiadoras. h. Um método para o tratamento de um paciente com diabetes mellitus compreende a administração de um análogo de insulina de cadeia única, conforme descrito neste documento. O outro aspecto da presente invenção é que os análogos de insulina de cadeia única podem ser preparados em levedura (Pichia pastoris) ou sujeitos a síntese química total pela ligação fragmenta nativo. A rota sintética de preparação é preferencial no caso de modificações não-padrão; no entanto, seria viável para a fabricação de um subconjunto dos análogos de cadeia única contendo modificações padronizadas por meio de tecnologia estendida do código genético ou tecnologia cordão de quatro bases. Ainda é um outro aspecto da presente invenção que o uso de substituições de aminoácidos não padrão pode aumentar a resistência do análogo de insulina de cadeia única, a degradação química ou a degradação física. Vislumbramos ainda que os análogos da presente invenção fornecem um método para o tratamento de diabetes mellitus ou síndrome metabólica. A rota de entrega do análogo de insulina é por via subcutânea, através da utilização de um dispositivo de seringa ou caneta.
[0029] Uma composição farmacêutica pode incluir tais análogos de insulina e que pode opcionalmente incluir o zinco. íons de zinco podem ser incluídos na variação íon de zinco: porções de proteína, variando de 2,2 átomos de zinco por hexâmero análogo de insulina a 10 átomos de zinco por hexâmero de análogo de insulina. O pH da formulação é no intervalo de pH 3,0 - 4,5. Em tal formulação, a concentração do análogo de insulina normalmente seria entre sobre 0,6-5,0 mM; concentrações de até 5 mM podem ser usadas no frasco ou caneta; quanto mais concentradas as formulações (U-200 ou superior) pode ser particularmente benéfico em pacientes com resistência à insulina marcada. Excipientes podem incluir glicerol, glicina, arginina, Tris, outros tampões e sais e conservantes antimicrobianos tais como fenol e me/ameta-cresol; os últimos conservantes são conhecidos para melhorar a estabilidade do hexâmero à insulina. Tal composição farmacêutica pode ser usado para tratar um paciente com diabetes mellitus ou outra condição médica através da administração de uma quantidade fisiologicamente eficaz da composição para o paciente. a. Com base na divulgação anterior, agora deve ser evidente que os análogos de insulina de cadeia única providos atenderão os objetivos estabelecidos acima. Ou seja, estes análogos de insulina apresentam resistência melhorada à fibrilação, mantendo características farmacocinéticas e farmacodinâmicas desejáveis (conferindo ação prolongada) e manter pelo menos uma fração da atividade biológica de insulina do tipo selvagem. Portanto, deve ser entendido que qualquer variação evidente queda no âmbito da invenção reivindicada, e assim, a seleção de elementos de componente específico pode ser determinada sem se afastar do espírito da invenção aqui divulgada e descrita. b. A seguinte literatura é citada para demonstrar que os métodos de teste e ensaio descritos aqui seriam entendidos por alguém ordinariamente versado na técnica.
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Claims (14)
1. Análogo de insulina de cadeia única caracterizado pelo fato de compreender as sequências de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 4-10.
2. Análogo de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7.
3. Análogo de insulina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 29 é Arg.
4. Análogo de insulina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 59 é Gly.
5. Análogo de insulina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 46 é Arg.
6. Análogo de insulina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 46 é His.
7. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o análogo de insulina de cadeia única conforme definido na reivindicação 1.
8. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a sequência compreende SEQ ID NO: 11.
9. Uso de uma quantidade fisiologicamente eficaz de um análogo de insulina de cadeia única ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina de cadeia única possui a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 4-10 para a fabricação de um medicamento para reduzir a taxa de açúcar no sangue de um paciente.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina de cadeia única possui a sequência de SEQ ID NO: 7.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 29 de SEQ ID NO: 7 é Arg.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 59 de SEQ ID NO: 7 é Gly.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 46 de SEQ ID NO: 7 é Arg.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que Xaa na posição 46 de SEQ ID NO: 7 é His.
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