CZ308383B6 - Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce - Google Patents

Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce Download PDF

Info

Publication number
CZ308383B6
CZ308383B6 CZ2014-450A CZ2014450A CZ308383B6 CZ 308383 B6 CZ308383 B6 CZ 308383B6 CZ 2014450 A CZ2014450 A CZ 2014450A CZ 308383 B6 CZ308383 B6 CZ 308383B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
insulin
derivative
receptor
octapeptide
igf
Prior art date
Application number
CZ2014-450A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2014450A3 (cs
Inventor
Jiří Jiráček
Lenka Žáková
Václav Vaněk
Václav Veverka
Andrzej Marek BRZOZOWSKI
Original Assignee
Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I.
The University Of York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I., The University Of York filed Critical Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I.
Priority to CZ2014-450A priority Critical patent/CZ308383B6/cs
Priority to PCT/CZ2015/000065 priority patent/WO2016000667A1/en
Priority to EP15745135.2A priority patent/EP3160993B1/en
Publication of CZ2014450A3 publication Critical patent/CZ2014450A3/cs
Publication of CZ308383B6 publication Critical patent/CZ308383B6/cs

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/41921,2,3-Triazoles
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/28Insulins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/62Insulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Derivát inzulinu vzorce I, tvořený des(B23-B30)oktapeptid-inzulinem (DOI) a modifikovaným oktapeptidem, které vytvářejí amidovou vazbu mezi karboxylovou skupinou C-terminálního ArgB22 v molekule DOI a aminoskupinou N-terminálního GlyB23 v molekule oktapeptidu II, přičemž des(B23-B30)oktapeptid-inzulin je lidský inzulin bez C-terminálního oktapeptidu B23-B30 a modifikovaný oktapeptid vzorce II napodobuje sekvenci B23-B30 lidského inzulinu. Derivát inzulinu vzorce I je použitelný jako antidiabetické činidlo s rychlým nástupem účinku a nízkým rizikem vzniku rakovinného bujení.

Description

Derivát inzulínu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce
Oblast techniky
Vynález se týká přípravy a případného použití in vivo nového derivátu inzulínu s vysokou vazebnou afinitou vůči oběma izoformám receptoru inzulínu, přičemž afinita vůči izoformě B je výrazně vyšší než vůči izoformě A; derivát zároveň vykazuje velmi nízkou afinitou vůči receptoru pro IGF-1.
Dosavadní stav techniky
Metabolické onemocnění diabetes mellitus neboli cukrovka, postihuje ve světě miliony lidí. Statistické odhady hovoří jasně: počet lidí postižených diabetem bude neustále růst, přičemž v roce 2030 bude na světě asi 550 milionů diabetiků. Z tohoto důvodu je velmi důležitý výzkum interakce inzulínu s receptorem inzulínu, který by mohl vést k vývoji nových derivátů inzulínu s vlastnostmi zvyšujícími komfort diabetických pacientů.
Inzulín je peptidový hormon, jehož hlavní funkcí je regulace koncentrace glukózy v krvi a umožnění jejího vstupu do buňky. Mimo to má inzulín zásadní vliv na metabolismus bílkovin a tuků. Primární struktura inzulínu je tvořena peptidovými řetězci A (21 aminokyselin) a B (30 aminokyselin), které jsou navzájem spojeny dvěma intermolekulámími disulfidickými můstky (A7-B7 a A20-B19). Dále je jeden intramolekulámí můstek přítomný v řetězci A (A6-A11). Sekundární a terciární struktura inzulínu je schematicky znázorněna na Obrázku 1.
Řetězec A formuje dvě šroubovice. Řetězec B vytváří v tzv. T-stavu šroubovici jen ve své střední části. V tzv. R-stavu (který se vytváří pouze za přítomnosti malých cyklických alkoholů jako je např. fenol) tato šroubovice v B-řetězci pokračuje až k N-terminální aminokyselině Bl. (Whittingham J. L., Edwards D. J. a spoluautoři, Biochemistry 1998, 37, 11516). Fyziologický význam T-a R- konformací není doposud znám.
Jako monomer inzulín existuje jen při nízkých koncentracích. Při vyšších koncentracích vytváří dimery a za přítomnosti zinečnatých iontů hexamery (Antolíková E., Žákova L. a spoluautoři, J. Biol Chem. 2011, 286,36968).
Biologický účinek inzulínu je primárně zprostředkován vazbou monomeru inzulínu na receptor inzulínu (IR). Receptor inzulínu je tetramemí membránový glykoprotein skládající se ze dvou extracelulámích podjednotek a a dvou transmembránových a intracelulámích podjednotek b. Podjednotky jsou navzájem spojeny několika disulfidickými můstky (McKern N. M., Lawrence M. C. a spoluautoři, Nature 2006, 443, 218). Vazba inzulínu na receptor aktivuje enzym tyrosinkinázu, který je součástí intracelulámí části B-podjednotky, a poté dochází ke spuštění signalizační kaskády a biologických účinků inzulínu.
Receptor inzulínu se díky alternativnímu sestřihu exonu 11 (aminokyseliny 717-729) genu receptoru vyskytuje ve dvou izoformách; IR-A (- exon 11) a IR-B (+ exon 11). Rozdílová sekvence 12 aminokyselin je umístěna na C-konci a-podjednotky receptoru a je nazývána aCTpeptidem. aCT-peptid je velmi důležitý z hlediska vazebných vlastností a tkáňové distribuce receptoru. IR-B je klasickou formou receptoru, která ve fyziologických koncentracích váže pouze inzulín. IR-B je primárně exprimován v játrech, svalové tkáni a tukové tkáni. Relativní zastoupení IR-B vzhledem k IR-A je -100% v dospělých játrech, 80% v tukové tkáni, a 50 až 70% ve svalech (Moller D. E., Yokota A. a spoluautoři, Mol. Endocrinol. 1989, 3, 1263). IR-B spouští hlavně metabolickou signalizační dráhu končící vstupem glukózy do buňky. IR-A je exprimován převážně v prenatálním věku a v dospělosti hlavně v mozku, slezině a také v rakovinných buňkách (De Meyts P., Endocrinology 2012, 153, 2054).
- 1 CZ 308383 B6
Obě izoformy IR-A i IR-B vážou inzulín s podobnou afinitou (0,2 až 0,3 nmol.I-1). Na rozdíl od IR-B, IR-A váže mimo inzulínu v nanomolámích koncentracích i hormon IGF-2 a poněkud slaběji i IGF-1 (inzulínu podobný růstový faktor 1 a 2) (Frasca F., Pandini G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1999, 19, 3278; Morcavallo A., Genua M. a spoluautoři, J. Biol. Chem. 2012, 287, 11422). Aktivace IR-A receptoru hormony IGF vede hlavně k mitogenním efektům (Frasca F., Pandini G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1999, 19, 3278). Komplexnost systému dále navíc podtrhuje fakt, že obě izoformy IR mohou vytvářet heterodimery jak navzájem, tak s podjednotkami receptoru IGF-1 (IGF-IR). Hybrid IGF-IR:IR-A je například receptorem pouze pro hormony IGF a inzulín neváže (Malaguamera R., Belfiore A., Front. Endocrinol. 2012, 2, 1).
Inzulín se váže na extracelulámí podjednotky a, nicméně struktura komplexu inzulínu vázaného na receptor stále není přesně známá. Předpokládá se, že molekula inzulínu musí při vazbě na receptor podléhat jistým konformačním změnám (De Meyts P., Bioessays 2004, 26, 1351).
Jednou z předpokládaných konformačních změn oproti strukturám znázorněným na Obrázku 1 je odklon C-konce B-řetězce od centrální části molekuly inzulínu (Obrázek 2). Tento odklon má za důsledek odkrytí předtím skrytých aminokyselin Al až A3, které jsou podle všech dosavadních poznatků nezbytné pro vazbu inzulínu na receptor a jsou součástí tzv. vazebného místa 1 v molekule inzulínu (které tvoří aminokyseliny GlyAl, IleA2, ValA3, GlnA5, ThrA8, TyrA19, AsnA21, ValB12, TyrB16, GlyB23, PheB24, PheB25) (Mayer J. P., Zhang F. a spoluautoři, Biopolymers 2007, 88, 687). Pro vazbu inzulínu na receptor dále jsou nezbytné i aminokyseliny SerA12, LeuA13, GluA17, HisBlO, GluB13 and LeuB17, které tvoří tzv. vazebné místo 2 (Schaffer L., Eur. J. Biochem. 1994, 221, 1127; Conlon J. M., Peptides 2001, 22, 1183; Ward C. W., Lawrence M. C, Bioessays 2009, 31,422).
Významným milníkem ve studiu interakce inzulínu s receptorem inzulínu bylo nedávné vyřešení krystalové struktury komplexu inzulínu s konstrukty receptoru inzulínu (Menting J. G., Whittaker J. a spoluautoři, Nature 2013, 493, 241). Obrázek 3 ukazuje interakci inzulinu s LI doménou receptoru a aCT peptidem (z izoformy A). V této struktuře chybí informace o druhém vazebném místě inzulinu a receptoru (FnlII domény) a zároveň obě flexibilní části inzulinu, tzn. N- a C-konec B-řetězce, nejsou viditelné. Viditelné interakce centrální části řetězce B s aCT peptidem a LI doménou a řetězce A s aCT peptidem nicméně potvrdily výše zmíněné předpoklady o interakci inzulinu s receptorem. Dalším zajímavým a důležitým zjištěním bylo, že pokud by byl C-konec B-řetězce ve stejné konformaci jako je v zásobních formách inzulinu (Obr. 1), docházelo by k jeho střetu s aCT peptidem ležícím na LI doméně. Ze struktury na obrázku 3 je zřejmé, že skutečně musí docházet k odklonu minimálně části řetězce B inzulinu od centrální šroubovice inzulinu podobně, jak je tomu naznačeno na Obrázku 2. Z Obrázku 2 také plyne, že i ohnutý C-konec B-řetězce inzulinu může velmi pravděpodobně interagovat s aCT, a to pravděpodobně rozdílně s aCT peptidy z izoforem A B.
Deriváty či analogy inzulinu jsou látky, které vycházejí svojí strukturou ze struktury molekuly lidského inzulinu, avšak cílenými modifikacemi v aminokyselinové sekvenci A či B řetězce je u nich dosaženo pozměněných biologických účinků a rozdílné vazebné afinity vůči receptoru.
Deriváty inzulinu jsou vyvíjeny především pro zlepšení kvality léčby diabetů a ke zvýšení komfortu pacientů. Dalším důležitým důvodem přípravy derivátů inzulinu je snaha o vyjasnění interakce inzulinu s receptorem inzulinu, neboť jak již bylo výše zmíněno, doposud není interakce těchto dvou proteinů dopodrobna prozkoumána a krystalový komplex obou molekul nebyl doposud připraven.
V současné době je na trhu celkem 6 farmaceutických přípravků s obsahem těchto derivátů, využívaných v lékařské praxi (Mooradian A. D., Bembaum M. a spoluautoři, Ann. Intern. Med. 2006, 145, 125). Tři z nich jsou tzv. rychle působící inzulinové deriváty (Lispro, Aspart a Glulisine). Vyznačují se rychlejším nástupem a rychlejším odezněním účinku vzhledem k
-2CZ 308383 B6 lidskému inzulínu. Zbylé tři deriváty (Glargine, Detemir a Degludec) patří mezi tzv. dlouhodobě působící deriváty a vyznačují se několikanásobně prodlouženou dobou účinku. Principem zmíněného působení těchto klinicky používaných derivátů je změna jejich rozpustnosti vzhledem k přirozenému inzulínu. Té je docíleno především ovlivněním schopnosti dimerizace a tvorby hexamerů, změnou isoelektrického bodu (pí) molekul derivátů či zvýšením schopnosti vázat se na sérové proteiny.
Všechny tři klinicky používané deriváty s rychlým nástupem účinku (Lispro, Aspart a Glulisine) byly připraveny modifikacemi aminokyselin v primární struktuře molekuly lidského inzulínu za účelem snížení schopnosti dimerizace molekuly a tím zvýšení rozpustnosti dané látky, vedoucí ke zrychlenému vstřebávání. Hlavní výhodou při aplikaci těchto látek je tak rychlejší snížení koncentrace glukózy v krvi při hyperglykemických stavech než při podání klasického lidského inzulínu. Zároveň umožňují pacientům dřívější příjem potravy po aplikaci derivátu než po podání lidského inzulínu. Inzulín Lispro, první vyvinutý derivát s rychlým nástupem účinku (Howey D. C., Bowsher R. R. a spoluautoři, Diabetes 1994, 43, 396), byl připraven záměnou aminokyselin lysinu a prolinu v pozicích 28 a 29 B-řetězce. Na trhu je dostupný od roku 1996 pod názvem Humalog (firma Eli Lilly). Inzulín Aspart byl připravený záměnou aminokyseliny prohnu v pozici 28 B-řetězce za kyselinu asparagovou (Setter S. M., Corbett C. F. a spoluautoři, Ann. Pharmacother. 2000, 34, 1423). Pro klinické použití byl schválen v roce 2000 pod názvem Novalog (firma Novo Nordisk). V molekule derivátu Glulisine je v řetězci B substituovaná asparagová kyselina na pozici B3 lysinem a molekula lysinu na pozici B29 kyselinou glutamovou (Rave K., Klein O. a spoluautoři, Diabetes Care 2006, 29, 1812). Inzulín Glulisine je klinicky dostupný od roku 2004 pod názvem Apidra (firma Sanofi Aventis).
Dlouhodobě působící derivát Glargine je derivát inzulínu s náhradou asparaginu glyčinem v pozici 21 A-řetězce a přidanými dvěma molekulami argininu v pozici 30 B-řetězce (Rosenstock J., Schwartz S. L. a spoluautoři, Diabetes Care 2001, 24, 631). Je komerčně dostupný od roku 2003 pod názvem Lantus (firma Sanofi Aventis). V případě Glarginu se projevuje zvýšení pí molekuly derivátu. Po jeho subkutánní aplikaci dochází k tvorbě precipitátů a pomalejšímu uvolňování do krve. Druhý dlouhodobě působící derivát inzulínu, Detemir, vykazuje díky přítomnosti hydrofobního postranního řetězce vyšší schopnost tvorby hexamerů. To spolu s vyšší afinitou k plazmatickému albuminu přispívá k výslednému prodlouženému efektu této látky. Detemir byl připraven připojením kyseliny myristové na lysin na pozici 29 B-řetězce (Plank J., Bodenlenz M. R. a spoluautoři, Diabetes Care 2005, 28, 1107). Je komerčně dostupným od roku 2006 pod názvem Levemir (firma Novo Nordisk). Posledním dlouhodobě působícím derivátem inzulínu, který byl v roce 2012 uveden na evropský trh, je inzulín Degludec vyvinutý firmou Novo Nordisk a distribuovaný pod obchodním jménem Tresiba. Jeho působení trvá po s.c. podání až 40 hodin. Inzulín Degludec je derivát inzulínu s hexadekanovou kyselinou, připojenou k postrannímu řetězci LysB29 inzulínu pomocí gamma-L-glutamové kyseliny (Wang F., Surh J. a spoluautoři, Diabetes Metab. Syndr. Oběs. Target Ther. 2012, 5, 191).
Některé z klinicky užívaných analogů inzulínu vykazují podobnost sekvence s IGF-1 a 2, mají vyšší afinitu vůči receptoru IGF-1R než lidský inzulín a vykazují také i vyšší mitogenní aktivitu než lidský inzulín. V současnosti je intenzivně studován vztah mezi použitím těchto analogů a vznikem rakoviny. Možná rizika se týkají hlavně dlouhodobě působících analogů, jako je Glargine (Kurtzhals P., Schaffer L. a spoluautoři, Diabetes 2000, 49, 999).
Inzulínová resistence a hyperinzulinemie mohou zvýšit riziko rakoviny také díky aktivaci a deregulaci exprese IR, konkrétně izoformy IR-A (Belfiore A., Frasca F. a spoluautoři, Endocr. Rev. 2009, 30, 586). Schopnost IGF-2 vázat se na IR-A hraje důležitou roli v tomto mechanismu. V nedávné době byl zaveden termín IGF-2-oma pro tumory sekretující IGF-2 (Dynkevich Y., Rother K. I. a spoluautoři, Endocr. Rev. 2013, 34, 798). Vazba IGF-2 na IR-A, IGF-IR a hybridní receptor IR-A/IGF-1R následně zapříčiňuje zvýšenou expresi a aktivaci těchto receptoru a IGF-2, což má za následek tvorbu růst podporující smyčky IR-A/IGF
-3 CZ 308383 B6
1R/IGF-2. Analogy inzulínu se zvýšenou selektivitou vazby ve prospěch IR-B a se sníženou afinitou vůči IGF-IR by tedy byly vysoce žádoucí.
V nedávné době bylo připraveno několik vysoce aktivních derivátů inzulínu s N-methylovanou aminokyselinou v poloze B26 (Záková L., Kazdová L. a spoluautoři, Biochemistry 2008, 47, 5858) a následně byly určeny i jejich krystalové struktury (Jiráček J., Záková L. a spoluautoři, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107, 1966). Překvapivě bylo zjištěno, že tyto deriváty se vyznačují novým typem b-ohybu typu II v polohách B25-B26. Vytvoření tohoto ohybu vede k odkrytí předtím zakrytých aminokyselin A1-A3. Předpokládá se, že podobný b-ohyb se může vyskytovat v tzv. aktivované formě inzulínu při vazbě hormonu na receptor. Tento předpoklad podporuje i nedávno vyřešená krystalová struktura fragmentu receptoru inzulínu a inzulínu samotného (Obr. 3). Přítomnost tohoto ohybu v C-konci B-řetězce inzulínu, který je částí molekuly důležitou pro dimerizaci inzulínu, má rovněž za následek, že tyto deriváty mají výrazně sníženou schopnost dimerizace (Jiráček J., Záková L. a spoluautoři, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107, 1966) a v organismu tudíž vykazují rychlejší nástup fýziologického účinku než přirozený inzulín. V další nedávné studii (Záková L., Kletviková E. a spoluautoři, J. Biol. Chem. 2013, 288, 10230) jsme dále podpořili teorii b-ohybu v polohách B25-B26. Z výsledků studie je totiž zřejmé, že Phe v poloze B24 musí zůstat ve stejné poloze jako v zásobní formě inzulínu, a tudíž při interakci inzulínu s receptorem velmi pravděpodobně nedochází k celkovému odklonu C-konce B-řetězce inzulínu již od polohy B21, ale pouze k částečnému ohybu od polohy B25 dále.
V předchozím užitném vzoru č. 24985 (Deriváty inzulínu s cyklickou strukturou v C-konci Břetězce) jsme nárokovali přípravu a vlastnosti nových derivátu inzulínu s triazolovým můstkem umístěným v různých pozicích C-konce B-řetězce inzulínu (B24-B30). Žádný z příkladů derivátů uváděných v užitném vzoru ovšem nevykazoval takové unikátní vlastnosti jako derivát I, nárokovaný v této patentové přihlášce.
Předkládaná přihláška vynálezu popisuje nový derivát inzulínu, vykazující velmi vysokou (více než 500 % vzhledem k lidskému inzulínu) vazebnou afinitu vůči metabolické izoformě (IR-B) receptoru inzulínu a zároveň 5x nižší vazebnou afinitu vůči receptoru pro IGF-1, než má lidský inzulín. Tyto vlastnosti derivátu I jsou zcela nové a předurčují derivát I k léčbě diabetiků za sníženého rizika vývinu rakovinného bujení. Díky vysoké afinitě k IR-B by mohl být derivát I používán i při nižších množstvích, což by zlevnilo léčbu.
Podstata vynálezu
Tento vynález popisuje nový derivát lidského inzulínu vzorce I, mající cyklickou strukturu v Ckonci B-řetězce. Derivát I vykazuje vyšší afinitu vůči oběma izoformám receptoru inzulínu, než má lidský inzulín a zároveň výrazně vyšší afinitu vůči majoritně metabolické izoformě B než vůči majoritně růstové izoformě A tohoto receptoru. Další výhodou je výrazně nižší afinita derivátu vůči IGF-IR, než je afinita inzulínu lidského. Tyto vlastnosti nový derivát inzulínu vzorce I předurčují k použití jako efektivně působící inzulín, snižující hladinu glukózy in vivo s potenciálně menšími vedlejšími účinky, zejména co se týká možnosti vzniku rakoviny, než má inzulín lidský.
Předmětem této přihlášky vynálezu je derivát inzulínu vzorce I,
-4CZ 308383 B6
(I), kde DOI je des(B23-B30)oktapeptid-inzulin, což je lidský inzulín bez C-terminálního oktapeptidu B23-B30, připojený k modifikovanému oktapeptidu II, napodobujícímu sekvenci B23-B30 lidského inzulínu, pomocí peptidové vazby mezi C-koncovou karboxylovou skupinou DOI v poloze B22 a aminoskupinou glycinu na N-konci modifikovaného oktapeptidu
(Π), a jeho farmaceuticky přijatelné soli a solváty.
Předmětem vynálezu je i derivát inzulínu vzorce I podle vynálezu, popřípadě jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, pro použití jako léčivo.
Předmětem vynálezu je i derivát inzulínu vzorce I podle vynálezu, popřípadě jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, pro použití při léčení nebo prevenci stavu, charakterizovaného zvýšenou hladinou cukru v krvi či pro léčení diabetů.
Dalším předmětem předkládané přihlášky vynálezu je také použití derivátu inzulínu vzorce I či jeho farmaceuticky přijatelných solí či solvátů, anebo směsí takových sloučenin, pro přípravu léčiva pro léčení nebo prevenci stavu, charakterizovaného zvýšenou hladinou cukru v krvi či pro léčení diabetů.
Předmětem této přihlášky vynálezu je i farmaceutický prostředek, obsahující derivát inzulínu vzorce I či jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, nebo směsi takových sloučenin.
Kromě toho je předmětem této přihlášky vynálezu i farmaceutický prostředek, obsahující kromě derivátu inzulínu vzorce I či jeho farmaceuticky přijatelných solí či solvátů, anebo směsi takových sloučenin, také farmaceuticky přijatelné nosiče, excipienty a diluenty.
Předmětem přihlášky vynálezu je také farmaceutický prostředek, obsahující derivát inzulínu vzorce I či jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, nebo směsi takových sloučenin, pro léčení nebo prevenci stavu, charakterizovaného zvýšenou hladinou cukru v krvi či pro léčení diabetů.
Farmaceuticky přijatelnými solemi se rozumí soli kationtů nebo aniontů spadajících do vzorce I s příslušnými protionty, které jsou akceptovatelné pro použití ve farmacii. Příklady farmaceuticky přijatelných solí jsou soli alkalických kovů a alkalických zemin, amoniové soli, soli kovů, soli aniontů anorganických či organických kyselin, jako jsou například halogenidy, sírany, uhličitany, acetáty, sukcináty a mnohé další.
Solváty obsahují spolu s molekulou sloučeniny vzorce I i molekuly vody či jiných látek, například rozpouštědel, které jsou přijatelné pro použití ve farmaceutických prostředcích.
Derivát inzulínu I podle předkládané přihlášky vynálezu vykazuje ve srovnání s lidským inzulínem dvojnásobnou vazebnou afinitu vůči izoformě A receptoru inzulínu (IR-A) v membránách lidských IM-9 lymfocytů, a dokonce pětinásobnou vůči metabolické izoformě B receptoru inzulínu (IR-B) v membránách myších fíbroblastů, transfekovaných touto izoformou (IR-B). Tato látka je tedy 2 až 5x aktivnější vůči receptoru inzulínu ve srovnání s inzulínem lidským, navíc s výraznou preferencí pro metabolickou izoformu B. Kromě toho vykazuje téměř 5x nižší vazebnou afinitu než lidský inzulín vůči IGF-1 receptoru (IGF-IR) v membránách myších fíbroblastů transfekovaných lidským IGF-IR.
Zde předkládaný derivát inzulínu tedy ve svých vlastnostech spojuje nejen preferenční afinitu vůči IR-B, tedy metabolické formě receptoru, ale i velmi vysokou vazebnou afinitu obecně (533% vzhledem k inzulínu lidskému) a řadí se tak mezi analogy inzulínu s nej silnější vazbou vůbec. Unikátní je zvláště jeho velmi nízká afinita vůči receptoru pro IGF-1 (IGF-IR). Podobné účinky nebyly ještě u žádného derivátu inzulínu popsány a předurčují tento derivát I k praktickému použití pro efektivní snižování hladiny krevní glukózy u diabetiků s nižším rizikem vzniku rakovinného bujení (díky nízké vazbě na IGF-IR). Až 5x vyšší afinita vůči metabolické izoformě IR-B vzhledem k lidskému inzulínu také může umožnit použití nižších dávek tohoto derivátu vzhledem k inzulínu lidskému, což by mohlo zlevnit léčbu.
Objasnění výkresů
Obr. 1 znázorňuje schematicky struktury monomeru inzulínu v T-stavu (vlevo) a v R-stavu (vpravo).
Obr. 2 znázorňuje předpokládaný odklon C-konce B-řetězce inzulínu (tmavě šedá šipka) od centrální části molekuly.
Obr. 3 znázorňuje strukturu komplexu inzulínu s receptorem inzulínu reprezentovaným U1 doménou, CR doménou a aCT peptidem. U molekuly inzulínu jsou vyznačeny N- (Al a B7) a C-koncové (A21 a B21) aminokyseliny obou řetězců viditelné ve struktuře.
Obr. 4 znázorňuje vazebné křivky lidského inzulínu (·), derivátu inzulínu I () vůči receptoru inzulínu (izoforma IR-A) v membránách lidských IM-9 lymfocytů. Na ose x je vynesen log
-6CZ 308383 B6 molámí koncentrace testovaného inzulínu a derivátu, na ose y je vynesena míra vazby radioaktivně značeného 125I-inzulinu (v %), který je vytěsňován z vazby na receptor neznačeným inzulínem či jeho derivátem.
Obr. 5 znázorňuje vazebné křivky lidského inzulínu (·), derivátu inzulínu I () vůči receptoru inzulínu (izoforma IR-B) v membránách myších fíbroblastů. Na ose x je vynesen log molámí koncentrace testovaného inzulínu a derivátu, na ose y je vynesena míra vazby radioaktivně značeného 125I-inzulinu (v %), který je vytěsňován z vazby na receptor neznačeným inzulínem či jeho derivátem.
Obr. 6 znázorňuje vazebné křivky lidského inzulínu (·), derivátu inzulínu I () a lidského IGF-1 (T)vůči receptem IGF-1R v membránách myších fíbroblastů. Na ose x je vynesen log molámí koncentrace testovaného inzulínu a derivátu, na ose y je vynesena míra vazby radioaktivně značeného 125I-IGF-1 (v %), který je vytěsňován z vazby na receptor neznačeným inzulínem, IGF-1 či derivátem I.
Obr. 7 znázorňuje porovnání reprezentativních NMR stmktur derivátu inzulínu I (A) a lidského inzulínu (PDB kód 2HIU) (B) měřených v prostředí 20% kyseliny octové. Řetězce A jsou vyznačeny světle šedě a řetězce B tmavě šedě. Pro názornost jsou zobrazeny i postranní řetězce PheB24, PheB25, TyrB26 v lidském inzulínu a PheB24, PheB25 a triazolový můstek v derivátu I.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam uvedených zkratek:
Bz benzyl
DIPEA N,N-diisopropylethylamin
DCM dichlormethan
DIC N,N-dicyklohexylkarbodiimid
DOI des(B23-B30)oktapeptid-inzulin
DMF N,N-dimethylformamid
Fmoc 9-fluorenylmethyloxykarbonyl
HBTU 2-(IH-benzotriazol-1 —yl)— 1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát
HOBT N-hydroxybenzotriazol
IR receptor inzulínu
IGF inzulínu podobný růstový faktor
IGF-IR receptor inzulínu podobného růstového faktem
NMP N-methyl-2-pyrrolidon
TFE 2,2,2-trifluorethanol
RP-HPLC vysoce účinná kapalinová chromatografíe na reverzní fázi
HR-ESI hmotnostní spektoskopie o vysokém rozlišení, využívající elektronspray ionizaci
TPCK p-tosyl-L-fenylalaninchlormetylketon
HEPES 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l -yl]ethansulfonová kyselina
EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová
BSA hovězí sérový albumin
MeOH methanol
t-BuOH t-butanol
A) Příprava nové sloučeniny
Příprava lineárního prekursom III pro cyklický oktapeptid II
-7CZ 308383 B6
(ΠΙ)
Lineární oktapeptid III byl připraven metodou syntézy na pevné fázi. Jako polymemí nosič byla použita vysoce acidolabilní 2-Cl-tritylová pryskyřice firmy Merck-Novabiochem (obvykle v množství odpovídajícím 400 x 10“6 molu aktivních skupin). Manuální syntéza probíhala v plastové injekční stříkačce s fritou. Pro syntézu oktapeptidu byly použity aminokyseliny s primárními a-aminoskupinami chráněnými pomocí skupiny Fmoc a s chráněnými hydroxylovými skupinami postranních řetězců pomocí terciárního butylu (tBu). Do lineárního oktapeptidu v poloze B26 umístěna (S)-5-azido-2-(Fmoc-amino)pentanová kyselina (SigmaAldrich kat. číslo 714291) a do polohy B29 (S)-2-(Fmoc-amino)-4-pentynová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 00397). Navázání první aminokyseliny na pryskyřici bylo docíleno přídavkem aminokyseliny (1 ekvivalent) a DIPEA (3 ekvivalenty) k pryskyřici (1 ekvivalent) v DCM v celkovém objemu 1 ml. Reakce probíhala asi 2 hodiny za teploty místnosti. Poté byla pryskyřice s navázanou aminokyselinou ponechána cca 2x10 minut v 2 x 2 ml směsi DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1). Tím došlo k deaktivování a zablokování zbývajících nezreagovaných chloridových skupin pryskyřice. Chránící skupina (Fmoc) primární aaminoskupiny byla odstraněna opakovaným (5 a 20 min) působením 1 ml 30% (obj./obj.) roztoku piperidinu v DMF. Úspěšnost reakce byla hodnocena spektrofotometricky měřením absorbance vzniklého dibenzofulven-piperidinového komplexu při vlnové délce 301 nm (ε = 7040 M-1cm-1). Navázání další aminokyseliny bylo katalyzováno použitím kondenzačního činidel HBTU a DIPEA v 2 ml NMP. Reakce probíhala vždy nejméně 1 hodinu. Poměr látkových množství jednotlivých složek reakce (aminokyselina : HBTU : DIPEA) byl roven 3:3:6 vzhledem k aminoskupině přítomné na pryskyřici (1 ekvivalent). V alternativním případě, kdy byla směs ponechána reagovat přes noc, byla použita činidla HOBT a DIC v prostředí směsi rozpouštědel DCM a NMP v poměru 1:1(1 ml). V tomto případě bylo látkové množství všech složek reakce ekvimolámí. Kontrola úspěšného provedení reakce byla provedena Kaiserovým testem (Kaiser E., Colescott R. L. a spoluautoři, Anal. Biochem. 1970, 34, 595) na přítomnost primárních aminoskupin. Podle výsledku testu se buď zopakovala reakce se stejnou aminokyselinou, nebo se přistoupilo k odstranění chránící skupiny Fmoc poslední navázané aminokyseliny. Oktapeptid byl z polymemího nosiče pryskyřice odštěpen působením 5 ml směsi 20% (obj./obj.) TFE a 20% (obj./obj.) kyseliny octové v DCM po dobu 2 hodin. Následně byl produkt štěpení odpařen do sucha a zbylé chránící skupiny (tBu) byly odstraněny působením 5 ml směsi 50%) kyseliny trifluoroctové (TFA), 2% triisopropylsilanu a 2% H2O v DCM po dobu 1 hodiny, všechny procentní údaje jsou objemová procenta. Produkt byl poté opět odpařen do sucha, 3x promyt diethyletherem a rozpuštěn v 10% kyselině octové. Oktapeptid byl dále přečištěn pomocí RPHPLC, lyofilizován a identifikován pomocí hmotnostní spektrometrie. Čistota dle RP-HPLC byla větší než 95 %. Výtěžek po RP-HPLC purifikaci byl 55% (143 mg, 84 pmol) a je kalkulován vzhledem k substituci pryskyřice dosažené po první kondenzaci první aminokyseliny (285 pmol, tj. 100%). HR-ESI C43H57N11O11 [M+H]+vypočteno 904,432, nalezeno 904,432.
Příprava cyklického oktapeptidu II
Lineární oktapeptid III (46 mg, 51 pmol, 1 molámí ekvivalent) byl rozpuštěn v 650 ml odvzdušněné (vakuum, Ar) směsi voda : tBuOH (2:1). K roztoku byla přidána kyselina askorbová (15 ekvivalentů), C11SO4.5H2O (10 ekvivalentů) a tris[(I-benzyl-lH-l,2,3-triazol-4yl)methyl]amin (TBTA, 5 ekvivalentů) v 100 ml téže směsi voda : tBuOH (2:1). Reakční směs byla po krátkém zamíchání ponechána stát při laboratorní teplotě bez přístupu světla. Průběh reakce byl monitorován pomocí RP-HPLC před a po přidání reakčních činidel. Vznik cyklického produktu se projevil vymizením výchozího lineárního peptidu a vznikem nového produktu s kratším retenčním časem. Reakční směs byla odpařena na rotační vakuové odparce do objemu asi 10 ml a peptid by odsolen na kolonce nosiče reverzní fáze (Chromabond® C-18, objem asi 12 ml). Odsolený oktapeptid byl dále přečištěn pomocí RP-HPLC, lyofilizován a identifikován pomocí hmotnostní spektrometrie. Čistota dle RP-HPLC byla větší než 95 %. Výtěžek po RPHPLC purifikaci byl 58% (27 mg, 30 pmol). HR-ESI C43H57N11O11 [M+H]+vypočteno 904,432, nalezeno 904,432.
Příprava derivátu inzulínu I
Nový deriváty inzulínu vzorce I byl připraven metodou enzymatické semisyntézy podle Žákové a kol. (Žáková L., Zýka D. a spoluautoři, J. Pept. Sci. 2007, 13, 334). Cyklický oktapeptid (18,8 mg, 21 pmol) a DOI (29,2 mg, 5,4 pmol) byly rozpuštěny v směsi (celkový objem 200 pl) obsahující 55% (obj./obj.) DMF ve vodě, 20 x 10“3 mol.l“1 octan vápenatý a 1,9mg TPCK trypsinu (Sigma-Aldrich, T-1426 či T-8802). pH roztoku bylo upraveno přidáním 5 mikrolitrů JV-methylmorpholinu na hodnotu 6,9 až 7,0. Reakční směs byla ponechána reagovat za míchání při laboratorní teplotě po dobu 24 hodin. Vznik produktů byl monitorován pomocí RP-HPLC. Reakce byla zastavena přidáním vychlazeného acetonu. Precipitát byl rozpuštěn v 10% (obj./obj.) kyselině octové ve vodě a produkt purifikován pomocí RP-HPLC. Identita produktu byla potvrzena pomocí hmotnostní spektrometrie na přístroji LTQ Orbitrap XL od firmy Thermo Fisher Scientific. Čistota dle RP-HPLC byla větší než 95 %. Výtěžek (vztažený k DOI jako k limitní složce rekce) po RP-HPLC purifikaci byl 17% (5,3 mg, 0,92 pmol). HR-ESI [M] vypočteno 5747,58, nalezeno 5747,59.
B) Vazebná afinita derivátu inzulínu I vůči izofomě IR-A lidského receptoru inzulínu v membránách lymfocytů IM-9
Principem testování vazebné afinity inzulínových derivátů je kompetice derivátu s lidským inzulínem, radioaktivně značeným na tyrosinu v pozici A14 pomocí isotopu 125I (Perkin-Elmer, USA, 2200 Ci/mmol, τ=60 dní) o vazebné místo na inzulínovém receptoru. K testování vazebných afinit inzulínového derivátu vůči izoformě A receptoru inzulínu (IR-A) in vitro byla použita buněčná linie lidských lymfocytů IM-9 s vysokou mírou exprese isoformy A inzulínového receptoru. Při testování byla použita metodika postupu podle De Meytse (De Meyts P. 1976, Methods in Receptor Research, M. Dekker, New York, 301) a Morcavalla a koi. (Morcavallo A., Genua M. a spoluautoři, J. Biol. Chem. 2012, 287, 11422).
Buňky IM-9 byly pěstovány podle doporučeného postupu dodavatele (ATCC, Manassas, USA; LGC Standards, Polsko). Buňky rostly v podmínkách zvlhčené atmosféry s 5% obsahem CO2, při teplotě 37 °C, v komerčně dostupném médiu RPMI-1640 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (hmotn./obj.), 2 x 10“3 mol.l“1 glutamin a 100 U/ml penicilinu/streptomycinu (všechny chemikálie od firmy Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Pro zajištění optimálních podmínek růstu byly buňky pasážovány 3x týdně. Buňky byly nejdříve spočítány a poté naředěny na koncentraci 2 miliony/ml.
Zásobní roztoky inzulínu a derivátu byly připraveny v 0,1% kyselině octové. Koncentrace byly určeny měřením absorbance při 280 nm a extinkčních koeficientů (ε) 5840 MAcm“1 pro lidský inzulín, respektive 4560 MAcm“1 pro derivát I s pouze třemi tyrosiny. Ředěním vazebným
-9CZ 308383 B6 pufrem (viz níže) byly následně připraveny roztoky o klesající koncentraci testovaného derivátu inzulínu. V reakční směsi byly buňky inkubovány vždy s roztokem inzulínového derivátu o příslušné naředěné koncentraci a o konstantním množstvím radioaktivně značeného inzulínu (20 000 impulzů za minutu). Reakce probíhala po dobu 2,5 h, při teplotě 15 °C ve vazebném pufru o následujícím složení: 100 x 10-3 mol.l-1 HEPES/NaOH pH 7,6; 100 x 10-3 mol.l-1 NaCl, 5 x 10-3 mol.l-1 KC1, 1,3 x 10-3 mol.l-1 MgSCfi, 1 x 10-3 mol.l-1 EDTA, 10 x 10-3 mol.l-1 glukóza, 15 x 10-3 mol.l-1 octan sodný a 1% BSA (hmotn./obj.). Celkový reakční objem byl 500 pl. Směs byla míchána každých 30 minut. Z každé zkumavky byly vytvořeny duplikáty o objemu 200 μΐ a reakce byla zastavena přídavkem 200 μΐ vazebného pufru o teplotě 4 °C. Směs byla dále odstřeďována při 15 000 g po dobu 10 min, při 4 °C. Po odsátí supematantu byla změřena radioaktivita pelety na γ-počítači. Získaná data byla vyhodnocena za použití modelu vazby do jednoho vazebného místa pomocí programu vytvořeného v aplikaci Excel a vyvinutého v laboratoři Pierre De Meytse v Dánsku (Groth A. V., Shymko R. M., Hagedorn Research Institute, Dánsko, 2008, dar P. de Meytse), či za pomoci GraphPad Prism 5.0 za použití stejného modelu vazby do jednoho místa metodou nelineární regrese beroucí v úvahu potenciální depleci ligandu a byla určena hodnota disociační konstanty (Ka) derivátu či lidského inzulínu vůči receptoru. Použitá koncentrace 125I-radioaktivně značeného inzulínu byla 0,01 x 10-9 mol.l-1. Jako K(i 125Iznačeného inzulínu vůči receptoru byla použita hodnota 0,3 x 10-9 mol.l-1.
Výsledky vazebné studie s derivátem inzulínu I a lidským inzulínem jsou uvedeny v Tabulce 1 a na Obrázku 4.
C) Vazebná afinita derivátu inzulínu I vůči isofomě IR-B lidského receptoru inzulínu v membránách myších embryonálních fíbroblastů
Princip testování vazebné afinity inzulínových derivátů je stejný jako v případě isoformy IR-A. K testování vazebných afinit inzulínového derivátu vůči izoformě B (IR-B) receptoru inzulínu in vitro byla ovšem použita buněčná linie myších embryonálních fíbroblastů odvozená z myších embryonálních buněk s deletovaným (knock-out) genem pro myší IGF-1 R (Seli C., Dumenil G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1994, 14, 3604) a s vysokou mírou exprese isoformy B lidského inzulínového receptoru díky transfekci buněk tímto receptorem. Při testování byla použita metodika postupu podle Frasca a kol. (Frasca F., Pandini G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1999, 19, 3278).
Buněčná linie myších embryonálních fíbroblastů transfekovaných lidským genem pro expresi IR-B (R-B) byla pěstována v inkubátoru při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5% obsahem CO2 v médiu s vysokým obsahem glukózy (87,6% DMEM medium s obsahem glukózy 4,5 g/1, 10% FBS, 2 mmol.l-1 L-Gln, 100 U/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycin, 3 pg/ml puromycin) a třikrát týdně „pasážovány. Dva dny před testováním byly buňky nasazeny do 24-jamkových destiček v koncentraci 3000 buněk na jamku.
Testování vazebné afinity probíhá stejně jako v prvním případě kompeticí mezi testovaným derivátem a 125I radioaktivně značeným lidským inzulínem metodou dle Frasca a kol. (Frasca F., Pandini G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1999, 19, 3278). Namnožené buňky v počtu asi 38 000 na jamku byly dvakrát omyty vazebným pufrem (100 mmol-1 HEPES, 100 mmol.l-1 NaCl, 5 mmol.l-1 KC1, 1,3 mmol.l-1 MgSCfi, 1 mmol.l-1 EDTA, 10 mmol.l-1 glukóza 15 mmol.l-1 octan sodný a 1% BSA, pH 7,6) a do každé jamky byla pipetována reakční směs v tomto pořadí: vazebný pufr, odpovídající koncentrace testovaného analogu a 125I-inzulin o aktivitě 43 000 impulzů za minutu v celkovém reakčním objemu 0,25 ml. Koncentrace 125I-inzulinu byla 0,043 x 10-9 mol.l-1. Reakce byla inkubována po dobu 16 hod při 5 °C za stálého míchání. Po ukončení inkubační doby byla reakční směs odsáta, buňky s navázanými analogy promyty vazebným pufrem a solubilizovány roztokem 0,1 mol.l-1 NaOH. Roztok s odlepenými buňkami byl přenesen do zkumavek a byla změřena jeho radioaktivita pomocí γ-počítače (Wizard 1470 Automatic Gamma Counter, Perkin Elmer, Wellesley, USA). Každý vzorek byl měřen po dobu 60 s. Získaná data byla vyhodnocena pomocí programu GraphPad Prism 5.0 za použití modelu vazby
- 10 CZ 308383 B6 do jednoho vazebného místa metodou nelineární regrese beroucí v úvahu potenciální depleci ligandu a byla určena hodnota disociační konstanty (Ka) derivátu či lidského inzulinu vůči receptoru. Jako K(i 125I-značeného inzulinu vůči receptoru byla použita hodnota 0,3 x IO-9 mol. I1.
Výsledky vazebné studie s derivátem inzulinu I a lidským inzulínem jsou uvedeny v Tabulce 1 a na Obrázku 5.
D) Vazebná afinita derivátu inzulinu I vůči lidskému receptoru pro IGF-1 (IGF-IR) v membránách myších embryonálních fíbroblastů
Principem testování vazebné afinity inzulínových derivátů je stejný jako v případě isoformy IRES. K testování vazebných afinit inzulínového derivátu vůči IGF-IR in vitro byla ovšem použita buněčná linie myších embryonálních fíbroblastů odvozená z myších embryonálních buněk s deletovaným (knock-out) genem pro myší IGF-IR (Sell C., Dumenil G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1994, 14, 3604) a s vysokou mírou exprese lidského receptoru pro IGF-1 (IGF-IR) díky transfekci buněk tímto receptorem. Při testování byla použita metodika postupu podle Frasca a kol. (Frasca F., Pandini G. a spoluautoři, Mol. Cell. Biol. 1999, 19, 3278).
Buněčná linie myších embryonálních fíbroblastů transfekovaných lidským genem pro IGF-IR byla pěstována stejně jako buněčná linie s transfekovanou isoformou IR-B.
Testování vazebné afinity probíhá za použití kompetice mezi testovaným derivátem a radioaktivně (125I) značeným lidským IGF-1 (Perkin-Elmer, 2497 Ci/mmol). Postup byl stejný jako v případě buněk s IR-B s výjimkou několika detailů. Koncentrace neznačeného lidského IGF-1 byla určena měřením absorbance při 280 nm a extinkčního koeficientu (ε) 4560 M-1.cm-1. Namnožené buňky byly použity v počtu asi 21 000 na jamku a 125I-IGF-1 byl použit v aktivitě 44 000 impulzů za minutu na jamku, což při celkovém reakčním objemu 0,25 ml odpovídá koncetraci 125I-IGF-1 asi 0,039 x 10-9 mol.l-1. Jako K& 125I-značeného IGF-1 vůči receptoru byla použita hodnota 0,2 x 10 mol.l-1.
Výsledky vazebné studie s derivátem inzulinu I a lidským inzulínem jsou uvedeny v Tabulce 1 a na Obrázku 6.
Tabulka 1
Hodnoty disociačních konstant (Kfl lidského inzulinu či lidského IGF-1 a derivátu inzulinu I vůči lidskému receptoru inzulinu v membránách lidských IM-9 lymfocytů (izoforma IR-A), receptoru inzulinu v membránách myších fíbroblastů transfekovaných buď izofomou B (IR-B) lidského receptoru inzulinu či lidským receptorem pro IGF-1 (IGF-IR). Relativní vazebná afinita derivátu je vyjádřena v % vůči lidskému inzulinu (100%) a definována jako (Kd lidského inzulinu/Kd derivátu inzulinu) x 100. (n) je počet měření.
Látka IR-A D. !s !Ů Qm< ř IR-B J 'J (n í Relativní v IGF-IR | IR-A azebnú <11 mi ta IR-B ±sp. [%]! IGF-IR
Lidský insulin 0,43 ± 0,04 (5) 0,80 ±0,19 (4) 351 ±68 | íoo±9 (3) | 100 ±24 100 ±19
Derivát I 0,19 ±0,03 O) 0,15 ± 0,04 (3) 1606 ±973 | 226 ±36 '3)..... I ...................... 533 ±142 22 ±13
Lidský' IGF-1 - - 0,29 ±0,12 | (5) | 1210 ±500
- 11 CZ 308383 B6
Derivát inzulínu I vykazuje dvojnásobnou afinitu vůči isoformě IR-A, a dokonce pětinásobnou vůči IR-B, než má lidský inzulín. Poměr relativních afinit derivátu vůči oběma isoformám je tedy asi 2,3 (533%/226%) a je tedy výrazně více ve prospěch metabolické formy receptoru (IR-B) než je tomu u inzulínu lidského. Srovnatelných výsledků dosáhla jen Glendorfová a kol (Glendorf T., Stidsen C. E. a spoluautoři, Plos One 2011, 6), kdy byl tento poměr u analogu [HisA8,HisB25,GluB27,des-ThrB30]-inzulinu 2, ale afinity analogu vůči oběma izoformám byly výrazně nižší (67% pro IR-A a 140% pro IR-B) než u derivátu I. Vyššího poměru afinit (IR-B%/IR-A%) v hodnotě 4 dosáhli Glendorfová a kol. u analogů [HisA8,AsnB25,GluB27,des-ThrB30]-inzulinu a [HisA8,AsnB25,Asp B27,des-ThrB30]inzulinu, ale pouze za cenu nižších afinit vůči receptorům (10 až 57%). Derivát inzulínu I tedy ve svých vlastnostech spojuje nejen preferenční afinitu vůči IR-B, ale i velmi vysokou vazebnou afinitu obecně (533% vzhledem k inzulínu lidskému) a řadí se tak mezi analogy inzulínu s nejsilnější vazbou vůbec. Derivát inzulínu I navíc poskytuje další potenciální výhodu oproti inzulínu lidskému a tou je jeho velmi nízká afinita vůči receptoru pro IGF-1 (IGF-IR), která je skoro 5x nižší než afinita inzulínu lidského.
E) Určení NMR struktury derivátu inzulínu I
Spektra NMR byla naměřena při 25 °C za použití spektrometru Bruker Avance 600 MHz vybaveném troj rezonanční (^Ν/^Ο/Ή) kryosondou. Vzorek derivátu inzulínu I byl připraven v koncentraci 1,5 mmol.l-1 v objemu 0,35 mU 20% d4-deuterované octové kyseliny (pH 1,9) či 25 mmol.l-1 deuterovaném Tris pufru (pH 8,0) obsahujícím 5% D2O a 95% H2O. Byly změřeny série homonukleámích spekter (2D TOCSY, DQF-COSY a 2D NOESY) za účelem získat sekvenčně specifická přiřazení rezonancí pro derivát I. 2D TOCSY spektra byla měřena se směšovacím časem 60 ms, zatímco 2D NOESY spektra byla měřena se směšovacím časem 200 ms. Aminokyseliny zapojené do vytváření stabilních vodíkových vazeb peptidového řetězce byly identifikovány monitorováním rychlosti výměny amidů peptidového řetězce v 2D TOCSY spektrech derivátu I rozpuštěného ve 20% d4-značené kyselině octové a 80% D2O. Soubor konvergujících struktur derivátu I byl nejprve vypočten pomocí programu Cyana 2.1 (Herrmann T., Guntert P. a spoluautoři, J Mol. Biol. 2002, 319, 209), kde byly také automaticky přiřazeny NOE signály identifikované v 2D NOESY spektru. Následovně bylo použito pět cyklů simulovaného žíhání spolu s omezeními redundantních dihedrálních úhlů (software Redac) (Guntert P., Wuthrich K., J. Biomol. NMR 1991, 1, 447) za účelem vytvoření skupiny konvergujících struktur bez významných odchylek oproti strukturním omezením (vzdálenosti a van der Waalsovské chyby < 0,5 Á). Struktury potom prošly výpočtem v explicitním rozpouštědle za použití softwaru YASARA a silového pole YASARA (Haijes E., Haijes S. a spoluautoři, Structure 2006, 14, 881). Nakonec byla vybrána skupina 29 struktur s nejnižší celkovou energií, která reprezentuje exprimentální strukturní omezení. Pro analýzu této skupiny struktur byly použity programy Molmol (Koradi R., Billeter M. a spoluautoři, J Mol. Graph. 1996, 14, 51), PSVS (Bhattacharya A., Tejero R. a spoluautoři, Proteins 2007, 66, 778) a PyMol (www.pymol.org).
Derivát inzulínu I poskytnul velmi podobná spektra jak v kyselém (20% d4-značená kyselina octová, pH 1,9) tak v bazickém (25 mmol.l-1 deuterovaný Tris pufir, pH 8,0) prostředí což indikuje, že derivát zaujímá v obou prostředích podobnou konformaci. V prostředí 20% kyseliny octové bylo za použití homonukleámích NMR experimentů dosaženo v podstatě kompletního sekvenčně specifického přiřazení Ή NMR rezonancí. Celkově bylo dosaženo přiřazení 98,8 % všech rezonancí protonů s výjimkou špatně rozlišených Ηζ signálů postranních řetězců fenylalaninů v polohách B24 a B25 a dále jednoho z Hb protonů CysAl 1. Přiřazení Ή rezonancí bylo použito pro automatické přiřazení NOE signálů v 2D NOESY spektru za použití programu Cyana (Herrmann T., Guntert P. a spoluautoři, J. Mol. Biol. 2002, 319, 209), což mělo za výsledek unikátní přiřazení 96,8 % (886/915) pozorovaných NOE píků a 764 neredundantních omezení Ή-Ή vzdáleností. Všech 29 úspěšně konvergujících struktur derivátu I dosažených ze 100 počátečních konformaci za použití 794 strukturních NMR omezení včetně 30 omezení pro vodíkové vazby (tj. > 16 omezení na jednu aminokyselinu derivátu a včetně dalších 18 omezení
- 12 CZ 308383 B6 pro 3 disulfidové můstky bylo dále doladěno v prostředí vody jako rozpouštědla pomocí programu YASARA (Haijes E., Haijes S. a spoluautoři, Structure 2006, 14, 881). Omezení vzdáleností a strukturní statistika pro finálních 29 struktur derivátu I jsou uvedeny v Tabulce 2.
Detailní analýza NMR struktury ukázala (Obrázek 7), že řetězec A derivátu I adoptoval typickou konformaci typu šroubovice-ohyb-šroubovice, jaká je přítomná i v molekule lidského inzulínu. Stejně tak je velmi konzervovaná i konformace řetězce B od PheBl až po GlyB23. Naproti tomu konformace lidského inzulínu a derivátu I se v C-konci řetězce B (aminokyseliny B24-B30) zásadně liší. Kovalentní triazolové raménko mezi pozicemi B26 a B29 derivátu I směřuje peptidový řetězec derivátu (pozice B25-B30) do ohnuté konformace, přičemž triazolový linker je směřován přibližně do místa, které v lidském inzulínu zaujímá postranní řetězec TyrB26. Nicméně celý peptidový řetězec derivátu I je v pozicích B25-B30 více vzdálen od centrální části molekuly. Inkorporace triazolového raménka do mezipozice B26 a B29 tedy zapříčinila větší rozvolněnost a flexibilitu derivátu I v této části molekuly, což je i příčinou jeho vyšší afinity vůči oběma izoformám receptoru inzulínu, neboť tento derivát inzulínu tak může snadněji než lidský inzulín přecházet do tzv. aktivní konformace při vazbě na receptor, která, jak se domníváme, je charakterizována B26-ohybem v této části řetězce B či ohybem podobným (Jiráček J., Záková L. a spoluautoři, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107, 1966; Záková L., Kletviková E. a spoluautoři, J. Biol. Chem. 2013, 288, 10230). Rozvolněnost struktury derivátu v C-konci Břetězce má i za následek rozrušení jeho dimerizační oblasti, což ho předurčuje k nižší schopnosti vytvářet dimery, a tím i rychlejšímu nástupu účinku při případné aplikaci in vivo.
Neredundantm omezeni vzdálimosti794
Signály NOE v rámci, jednotlivých aminokyselin [i “ j]219
Sekvenční signály NOE [| i - j | - 1 ]215
Signály NOE středního dosahu [1 < | i - j | < 5]162
Signály NOE dlouhého dosahu [] i - j | > 5]165
Experimentální omezení vodíkových vazeb30
Omezení vztažená na j e dnu am in okysel inu16,2
Celkový počet kalkulovaných struktur100
Počet výsledných struktur29
Priiměrný počeřporušení omezení vzdáleností
0,1 x10'tKmaž0,2x 10**i0m5,14
0,2 x 104£!m až 0,5 λ x 10wm2,45 > 0.5 x J.O’!'rn0 rjn.s. porušení vzdálenosti / omezení (x0.03
Maximální porušení vzdálenosti (x 10‘w m)0,49
Souhrn Ramachandranova vynesení pomoci programu Procheck
Aminokyseliny v povolené oblastí 90,4%
Aminokyseliny v dodatečně povolené oblastí 9,4%
Aminokyse! in y ve výj imeč nč po volené oblasti OJ %
Aminokyseliny v zakázané oblasti 0,1%
- 13 CZ 308383 B6
r.m.s.d. průměrné struktury (řetězec Aι. a řetězec Bi.23) Těžké atomy peptidového řetězce (x 10’10m) Všechny těžké atomy (x 10'lom)
1,1 ±0,3
2,0 ±0,4
Průmyslová využitelnost
Derivát inzulínu I podle tohoto vynálezu může být účinnou složkou farmaceutických prostředků pro léčení, popřípadě prevenci diabetů a stavů, charakterizovaných zvýšenou hladinou krevního cukru, tzn. pro snižování koncentrace krevní glukózy. Vzhledem k vysoké afinitě vůči receptoru inzulinuA to zejména vůči metabolické isoformě B a zároveň velmi nízké afinitě vůči receptoru pro IGF-1 i snížené schopnosti dimerizovat má tento derivát dobré předpoklady pro použití jako preparát s rychlým nástupem účinku a se sníženým rizikem vývinu rakovinného bujení.

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Derivát inzulínu o vzorci I,
    (I) mající cyklickou strukturu v C-konci B-řetězce, přičemž DOI je des(B23-B30)oktapeptid-inzulin, tedy lidský inzulín bez C-terminálního oktapeptidu B23-B30, připojený k oktapeptidu o vzorci II
    - 14 CZ 308383 B6
    (Π) napodobujícímu sekvenci B23-B30 lidského inzulínu, pomocí peptidové vazby mezi Ckoncovou karboxylovou skupinou DOI v poloze B22 a aminoskupinou glycinu na N-konci modifikovaného oktapeptidu II, a jeho farmaceuticky přijatelné soli a solváty.
  2. 2. Derivát inzulínu o vzorci I podle nároku 1, popřípadě jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, pro použití jako léčivo.
  3. 3. Derivát inzulínu o vzorci I podle nároku 1, popřípadě jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, pro použití při léčbě nebo prevenci stavu, charakterizovaného zvýšenou hladinou cukru v krvi, či pro léčbu diabetů.
  4. 4. Použití derivátu inzulínu vzorce I podle nároku 1, či jeho farmaceuticky přijatelných solí či solvátů, anebo směsí takových sloučenin, pro přípravu léčiva pro léčbu nebo prevenci stavu, charakterizovaného zvýšenou hladinou cukru v krvi, či pro léčbu diabetů.
  5. 5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje derivát inzulínu vzorce I podle nároku 1 či jeho farmaceuticky přijatelné soli či solváty, nebo směsi takových sloučenin.
  6. 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kromě derivátu inzulínu vzorce I podle nároku 1 či jeho farmaceuticky přijatelných solí či solvátů, anebo směsi takových sloučenin, také farmaceuticky přijatelné nosiče, excipienty a diluenty.
  7. 7. Farmaceutický prostředek podle nároku 5 nebo 6, pro použití k léčbě nebo prevenci stavu, charakterizovaného zvýšenou hladinou cukru v krvi, či pro léčbu diabetů.
CZ2014-450A 2014-06-30 2014-06-30 Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce CZ308383B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-450A CZ308383B6 (cs) 2014-06-30 2014-06-30 Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce
PCT/CZ2015/000065 WO2016000667A1 (en) 2014-06-30 2015-06-22 Insulin derivative with cyclic structure in the c-terminus of the b-chain
EP15745135.2A EP3160993B1 (en) 2014-06-30 2015-06-22 Insulin derivative with cyclic structure in the c-terminus of the b-chain

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-450A CZ308383B6 (cs) 2014-06-30 2014-06-30 Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2014450A3 CZ2014450A3 (cs) 2016-01-13
CZ308383B6 true CZ308383B6 (cs) 2020-07-15

Family

ID=53773123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2014-450A CZ308383B6 (cs) 2014-06-30 2014-06-30 Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3160993B1 (cs)
CZ (1) CZ308383B6 (cs)
WO (1) WO2016000667A1 (cs)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014071405A2 (en) * 2012-11-05 2014-05-08 Case Western Reserve University Long-acting single-chain insulin analogues

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jiracek J; et al: Novel insulin analogues with cyclic structures mimicking the active conformation of the hormone at the C-terminus of the B-chain 2012 Journal of Peptide Science 18, S41 *
Kaplan V.: Nové analogy lidského insulinu s kovalentně stabilizovanými cyklickými strukturami v C-konci B-řetězce, Diplomová práce (Mgr.) Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, datum obhajoby: 13-09-2011 *
PUV 2012-26680 & CZ 24985, Jiracek J. et al., 4.3.2013 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3160993B1 (en) 2018-06-27
EP3160993A1 (en) 2017-05-03
WO2016000667A1 (en) 2016-01-07
CZ2014450A3 (cs) 2016-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102256992B (zh) 胰岛素类似物
EP3221343B1 (en) Insulin receptor partial agonists
US10597436B2 (en) Acylated insulin compound
AU2013337250B2 (en) Long-acting single-chain insulin analogues
US10745458B2 (en) Non-standard insulin analogues
CN102307584A (zh) 表现出对胰岛素受体的高活性的基于yl的胰岛素-样生长因子
KR20120129875A (ko) 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체
JP7456007B2 (ja) 長時間作用アシル化インスリン化合物
JP2017534675A (ja) 脂質化アミド系インスリンプロドラッグ
WO2016172269A2 (en) Insulin analogs having shortened b chain peptides and associated methods
CZ308383B6 (cs) Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce
JP2024500284A (ja) 芳香族ホウ素含有化合物及びインスリン類似体
CZ24985U1 (cs) Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce
Sicinski et al. A Robust Platform for the Molecular Design of Potent, Protease-Stable, Long-Acting GIP Analogues
WO2024059674A1 (en) Gip and glp-1 dual agonist compounds
CN116917297A (zh) 芳香族含硼化合物和胰岛素类似物
TW201315477A (zh) 多胜肽

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210630