KR102059736B1 - 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 펩티드 링커의 사용을 통하여 인간 IgG Fc 영역에 융합된 인슐린 수용체 효능제를 포함하는 융합 단백질 및 당뇨병의 치료에서의 이러한 융합 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 연장된 시간 작용 프로파일을 갖고 연장된 기간 동안 기저 글루코스 조절을 제공하는 데 유용하다.
Description
본 발명은 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 펩티드 링커를 사용하여 인간 IgG Fc 영역에 융합된 인슐린 수용체 효능제를 포함하는 융합 단백질, 및 당뇨병의 치료에서의 이러한 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 연장된 시간 작용 프로파일을 갖고 연장된 기저 글루코스 조절 및 간 글루코스 생산의 억제를 제공하는 데 유용하다.
당뇨병은 인슐린 분비, 인슐린 작용, 또는 둘 다에서의 결함으로부터 발생된 고혈당증을 특징으로 하는 만성 장애이다. 제1형 당뇨병은 인슐린 분비 능력이 거의 또는 전혀 없는 것을 특징으로 하고, 제1형 당뇨병을 갖는 환자는 생존을 위해 인슐린을 필요로 한다. 제2형 당뇨병은 손상된 인슐린 분비, 인슐린 저항성, 과도한 간 글루코스 생산, 및/또는 상기 모든 것으로부터의 원인으로부터 발생된 상승된 혈액 글루코스 수준을 특징으로 한다. 제2형 당뇨병을 갖는 환자의 적어도 3분의 1에서, 질환은 인슐린 요법이 절대적으로 요구될 때까지 진행된다.
정상 혈당을 달성하기 위해, 인슐린 대체 요법은 정상 개체에서의 내인성 인슐린 분비의 패턴에 가능한 가깝게 유사하게 하는 것을 목적으로 한다. 인슐린에 대한 생리학적 1일 요구량은 변동적이고, 2개의 상: (a) 식사-관련 혈액 글루코스 급등을 처리하기 위해 소정 펄스 (볼루스)의 인슐린을 필요로 하는 식사시간 상, 및 (b) 최적 공복 혈액 글루코스를 유지하기 위한 간 글루코스 생산을 조절하기 위해 소정의 지속된 (기저) 양의 인슐린을 필요로 하는 식사간 상으로 분리될 수 있다.
제1형 당뇨병 환자가 인슐린을 거의 또는 전혀 생산하지 않기 때문에, 제1형 당뇨병을 위한 효과적인 인슐린 요법은 일반적으로 2가지 유형의 외인성으로 투여되는 인슐린의 사용을 수반한다: 볼루스 주사에 의해 제공되는 신속-작용, 식사시간 인슐린, 및 1일 1회 또는 2회 투여되어 식사 사이의 혈액 글루코스 수준을 조절하는, 장기-작용, 기저 인슐린. 제2형 당뇨병을 갖는 환자의 치료는 전형적으로 처방된 체중 감소, 운동, 및 당뇨병성 식이로 시작하지만, 이들 대책이 상승된 혈당을 조절하는 데 실패하는 경우, 이어서 경구 의약 및 인크레틴-기반 요법, 예컨대 증가된 인크레틴 수준을 가능하게 하는 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 수용체 효능제 및/또는 디펩티딜 펩티다제 4 (DPP-4) 억제제의 투여를 필요로 할 수 있다. 이들 의약이 여전히 불충분한 경우, 인슐린으로의 치료가 고려된다. 질환이 인슐린 요법을 필요로 하는 지점까지 진행된 제2형 당뇨병 환자는 일반적으로 장기-작용, 기저 인슐린의 단일 매일 주사로 시작하지만, 필요에 따라, 일부 경우에 신속-작용 인슐린의 식사시간 주사가 포함될 수 있다.
여러 유형의 기저 인슐린이 현재 입수가능하다. 상표명 란투스(LANTUS)® 하에 판매되는 인슐린 글라진은, 인슐린 A-쇄의 위치 21에서 아스파라긴이 글리신으로 대체되고, 2개의 아르기닌이 B-쇄의 C-말단에 부가된 변형된 인슐린 구조를 포함한다. 상표명 레베미르(LEVEMIR)® 하에 판매되는 인슐린 데테미르는, B-쇄의 위치 30에서 트레오닌이 결실되고 B-쇄의 위치 29에서 리신이 14-탄소, 미리스토일 지방산의 B29에서의 리신의 ε-아민 기로의 공유 연결을 통해 유도체화된 변형된 인슐린 구조를 포함한다. 상표명 트레시바(TRESIBA)® 하에 유럽 및 일본에서 입수가능한 인슐린 데글루덱은, B-쇄의 위치 30에서 트레오닌이 결실되고, B-쇄의 위치 29에서의 리신의 ε-아미노 기가 γ-L-글루탐산 링커를 통해 헥사데칸디오산과 공유적으로 유도체화된 변형된 인슐린 구조를 포함한다. 모든 이들 인슐린은 1일-1회 투여되도록 지시된다.
기존 인슐린 요법의 매일 주사를 수반하는 치료 요법은 투여가 복잡하고 고통스러울 수 있고 원하지 않는 부작용, 예컨대 저혈당증 및 체중 증가를 일으킬 수 있다. 따라서, 많은 당뇨병 환자는 혈액 글루코스 수준의 긴밀한 조절을 유지하기 위해 필요한 인슐린 요법을 따르기를 원치 않거나 또는 따를 수 없거나, 또는 따르는 것이 불가능하다. 불량한 혈당 조절은 심장 질환, 졸중, 신경 손상, 하지 절단, 시각 상실, 및 신장 질환을 포함하는, 심각한 당뇨병-관련 합병증이 발생할 환자의 위험을 증가시킨다. 더 긴 작용 지속기간을 갖고; 따라서 수용도 및 순응도를 개선시키기 위해 현재 입수가능한 인슐린 제품보다 더 적은 주사를 필요로 하는 인슐린 제품을 확인하기 위한 연구가 수행되고 있다.
CN103509118은 인간 인슐린 B-쇄 및 인간 인슐린 A-쇄가 4 내지 50개 아미노산 C-펩티드 연결 서열에 의해 접합되고, 인슐린 A-쇄는, 추가의 링커 없이, 이뮤노글로불린 Fc 단편에 직접적으로 부착된 것인 단백질을 기재하며, 마우스에서의 시험이 이러한 단백질이 약 3일만큼 긴 생체내 반감기를 갖는다는 것을 보여준다고 언급하고 있다. KR101324828은 비-펩티딜 링커의 사용을 통해 이뮤노글로불린 Fc 영역에 연결된 프로인슐린 유사체를 기재하며, 이러한 단백질이 기존 요법에 비해 증가된 혈청 반감기를 제공한다고 언급하고 있다. 공보는 펩티드 링커가 체내에서 효소에 의해 용이하게 절단되기 때문에 펩티드 링커를 사용하는 융합 단백질이 혈액에서 활성 의약의 반감기를 증가시킬 수 없다는 것을 주장하며, 비-펩티딜 링커가 펩티드 링커에 비해 개선을 나타낸다고 언급하고 있다.
상기, 및/또는 임의의 다른 공보에서의 개시내용에도 불구하고, 본 발명자들은 여러 장애를 극복하여, 1주-1회만큼 드물게 투여하는 것을 포함하는 현재 입수가능한 인슐린 제품보다 덜 빈번한 투여에 충분한 증가된 작용 지속기간을 갖는 글루코스-강하 제품에 대한 계속적인 필요를 충족시키는, 인슐린 수용체 효능제, 펩티드 링커 및 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 발견하였다. 예를 들어, 목적하는 연장된 시간 작용 프로파일을 달성하기 위해, 인슐린 클리어런스의 주요 경로인 신속한 수용체 매개 클리어런스를 피하도록 약화된 효력을 갖지만, 여전히 충분한 글루코스 강하를 제공하기에는 충분한 효력을 갖는 융합 단백질을 설계하는 것이 요구되었다. 또한, 인슐린 클리어런스의 다른 주요 경로인 신장 클리어런스를 최소화하고, 유체역학적 크기-제한된 세포주위 확산을 통한 말초 노출을 조절하기 위해, 충분히 크며, 투여된 후에 인슐린 수용체 효능제가 인간 IgG Fc 영역으로부터 단백질분해적으로 절단되지 않는 (이러한 절단이 심지어 인간 IgG Fc 영역이 여전히 순환 중임에도 인슐린 수용체 효능제의 목적하는 신장 클리어런스보다 빠른 클리어런스를 발생시키기 때문임) 융합 단백질이 설계되어야 했다. 게다가, IgG Fc 도메인은 자가-회합하도록 진화하여 안정한 이량체를 형성하고, 이러한 이량체는, IgG Fc 영역과 융합된 인슐린 모이어티를 각각 포함하는 2개의 융합 단백질로부터 형성되는 경우, 2개의 인슐린 모이어티가 서로 인접하여 인슐린 모이어티의 자가-회합 또는 이량체화를 가능하게 하며, 이는 인슐린 B-쇄 자가-회합 영역을 통해 매개된다. 이러한 인슐린 이량체는 불활성이어서, 인슐린 수용체 효능제 모이어티의 감소된 자가-회합을 갖는 융합 단백질이 설계되어야 했다. 여러 추가의 과제를 극복하여 치료제로서 상업적 제조 및 제제화에 적합한 융합 단백질이 생성되었다. 본 발명은 기존 인슐린 치료와 비교하여 연장된 작용 지속기간을 가짐으로써, 최대 1주 1회를 포함하는 기존 인슐린 제품보다 덜 빈번한 주사를 허용하고, 그에 따라 더 빈번한 주사를 수반하는 기존 치료 요법의 복잡성 및 그와 연관된 통증을 감소시키는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 편평한 약동학적 프로파일 및 제한된 말초 노출을 가지며, 이는 추가의 당뇨병 의약, 예컨대 인크레틴-기반 요법과 조합하여 제공되는 경우를 포함하여, 낮은 일상 가변성, 및 저혈당증의 최소 발생률을 생성한다. 본 발명의 융합 단백질은 또한 체중 증가를 초래하지 않고 연장된 작용 지속기간을 제공할 수 있다.
본 발명은 하기를 포함하는 융합 단백질을 제공한다:
a) 화학식 Z1-Z2-Z3을 갖는 인슐린 수용체 효능제, 여기서
i) Z1이 아미노산 서열:
을 포함하는 인슐린 B-쇄 유사체이며, 여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q, 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하며, 단 인슐린 B-쇄 유사체는 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1);
ii) Z2가 5 내지 10개의 아미노산을 포함하는 제1 펩티드 링커이며, 여기서 상기 아미노산 중 적어도 5개는 G 잔기이고;
iii) Z3이 아미노산 서열:
을 포함하는 인슐린 A-쇄 유사체이며, X1은 T 또는 I이고; X2는 D, Y, Q 또는 E이고; X3은 G, N, S 또는 A이고; X4는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하며, 단 X3이 N인 경우, X4는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 한다 (서열식별번호: 2);
b) 제2 펩티드 링커; 및
c) 인간 IgG Fc 영역;
여기서 인슐린 수용체 효능제의 C-말단 잔기는 제2 펩티드 링커의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합되고, 제2 펩티드 링커의 C-말단 잔기는 IgG Fc 영역의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합된다.
본 발명은 또한 하기로 이루어지는 융합 단백질을 제공한다:
a) 화학식 Z1-Z2-Z3을 갖는 인슐린 수용체 효능제, 여기서
i) Z1이 아미노산 서열:
을 갖는 인슐린 B-쇄 유사체이며, 여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q, 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하며, 단 인슐린 B-쇄 유사체는 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고 (서열식별번호: 1);
ii) Z2가 5 내지 10개의 아미노산을 포함하는 제1 펩티드 링커이며, 여기서 상기 아미노산 중 적어도 5개는 G 잔기이고;
iii) Z3이 아미노산 서열:
을 갖는 인슐린 A-쇄 유사체이며, X1은 T 또는 I이고; X2는 D, Y, Q 또는 E이고; X3은 G, N, S 또는 A이고; X4는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하며, 단 X3이 N인 경우, X4는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 한다 (서열식별번호: 2);
b) 제2 펩티드 링커; 및
c) 인간 IgG Fc 영역;
여기서 인슐린 수용체 효능제의 C-말단 잔기는 제2 펩티드 링커의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합되고 제2 펩티드 링커의 C-말단 잔기는 IgG Fc 영역의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명 또한 당뇨병, 비만, 이상지혈증 또는 대사 증후군을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이는 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 심장 질환, 졸중, 신병증, 망막병증, 및 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당뇨병-관련 상태를 치료하거나 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이는 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 의약의 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
1. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 숙주 세포를 상기 융합 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
2. 상기 숙주 세포로부터 융합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 의해 생산된 융합 단백질을 제공한다.
도 1. 도 1은 스트렙토조토신 (STZ)-처리된 래트 당뇨병 모델에서의 본 발명의 예시적인 융합 단백질에 대한 약역학적 데이터를 제공한다.
도 2. 도 2는 본원에 기재된 단백질의 배위의 개략적 다이어그램을 제공한다. 도 2의 다이어그램에 사용된 특정한 모양 (예를 들어, 타원, 반원 등)은 본 발명의 융합 단백질의 개별 성분의 의미 또는 구조를 기재하거나 또는 특징화하는 것으로 의도되지 않고, 해석하기 위해 사용되어서는 안 된다는 것에 주목해야 한다.
도 2. 도 2는 본원에 기재된 단백질의 배위의 개략적 다이어그램을 제공한다. 도 2의 다이어그램에 사용된 특정한 모양 (예를 들어, 타원, 반원 등)은 본 발명의 융합 단백질의 개별 성분의 의미 또는 구조를 기재하거나 또는 특징화하는 것으로 의도되지 않고, 해석하기 위해 사용되어서는 안 된다는 것에 주목해야 한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 또는 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형, 및 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 2개의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 X6-X9는 각각 G이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 및 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 가지며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 각각의 위치 X4, X5, X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; X6-X9는 각각 G이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X3은 N이고; X4는 G, N, S, V, L 또는 P 이외의 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 또는 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형 및 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 2개의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 X6-X9는 각각 G이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 및 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 각각의 위치 X4, X5, X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 가지며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; X6-X9는 각각 G이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 또는 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형 및 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 2개의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 X6-X9는 각각 G이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 및 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 각각의 위치 X4, X5, X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 가지며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; X6-X9는 각각 G이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 X1 및 X2 둘 다에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 또는 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형 및 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 2개의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 X6-X9는 각각 G이고, X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 X4 및 X5에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 각각의 위치 X4, X5, X6, X7, X8, 및 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 변형을 포함하고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 서열을 가지며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고; X6-X9는 각각 G이고; 인슐린 A-쇄 유사체는 서열식별번호: 2의 서열을 가지며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재한다.
특정 실시양태에서, 제1 펩티드 링커 (Z2)는 아미노산 서열: 
을 포함하며, 여기서 X1은 G이거나 또는 부재하고; X2는 G, S이거나 또는 부재한다 (서열식별번호: 3).
특정 실시양태에서, 상기 기재된 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제, 즉, Z1-Z2-Z3은 아미노산 서열:
을 포함하며 여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q, 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하고; X10은 G이거나 또는 부재하고; X11은 G, S이거나 또는 부재하고; X12는 T 또는 I이고; X13은 D, Y, Q 또는 E이고; X14는 G, N, S 또는 A이고; X15는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하고, X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9 중 적어도 하나는 각각 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 위치 B16, B25, B27, B28, B29 또는 B30에서 발견된 것과 상이한 아미노산이어야 하고, 추가로 단 X14가 N인 경우, X15는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 한다 (서열식별번호: 4).
특정의 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제, 즉 Z1-Z2-Z3은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
(서열식별번호: 5).
특정 실시양태에서, 제2 펩티드 링커는 10 내지 25개의 아미노산을 갖는 펩티드이며, 여기서 상기 아미노산 중 적어도 50%는 G 잔기이다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드 링커는 아미노산 서열 [GGGGX]n을 포함하는 펩티드이며, 여기서 X는 Q, E 또는 S이고; 여기서 n은 2-5이다. 특정 실시양태에서, 제2 펩티드 링커는 아미노산 서열:
을 포함하며 여기서 X1은 Q 또는 E이고; X2는 Q 또는 E이고; X3은 Q 또는 E이고; X4는 G, E, Q이거나 또는 부재하고; X5는 G이거나 또는 부재하고; X6은 G이거나 또는 부재한다 (서열식별번호: 6).
특정의 바람직한 실시양태에서, 제2 펩티드 링커는 아미노산 서열:
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 IgG 항체의 1개의 중쇄로부터의 단편을 포함한다. 이러한 IgG 영역을 포함하는 융합 단백질의 개략적 다이어그램은 도 2의 다이어그램 (A)에 제공된다. 다른 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 IgG 항체의 2개의 중쇄로부터의 단편을 포함한다. 이러한 IgG 영역을 포함하는 융합 단백질의 개략적 다이어그램은 도 2의 다이어그램 (B)에 제공된다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체로부터의 Fc 영역이다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 하기 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 항체로부터의 Fc 영역이며:
여기서 X1은 F, Q 또는 E이고; X2는 F, Q 또는 E이고; X3은 V 또는 T이고; X4는 V 또는 T이고; X5는 N, D 또는 Q이고; X6은 K이거나 또는 부재한다 (서열식별번호: 8).
특정 실시양태에서, IgG Fc 영역은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 8의 위치 1에서 C 잔기의 N-말단 측면에 야생형 IgG1 Fc 서열에서 발견될 아미노산의 일부 또는 모두를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 인간 IgG Fc 영역은 IgG2 또는 IgG4 항체로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 하기 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 항체로부터의 Fc 영역이며:
여기서 X1은 F, Q 또는 E이고; X2는 F, Q 또는 E이고; X3은 V 또는 T이고; X4는 V 또는 T이고; X5는 N, D 또는 Q이고; X6은 R 또는 K이고; X7은 K이거나 또는 부재한다 (서열식별번호: 9).
특정 실시양태에서, IgG Fc 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 9의 위치 1에서 C 잔기의 N-말단 측면에 야생형 IgG4 Fc 서열에서 발견될 아미노산의 일부 또는 모두를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 F이고; X3은 V이고; X4는 V이고; X5는 N이고; X6은 R이고; X7은 부재한다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 하기 아미노산 서열을 갖는 IgG2 항체로부터의 Fc 영역이며:
여기서 X1은 F, Q 또는 E이고; X2는 F, Q 또는 E이고; X3은 V 또는 T이고; X4는 V 또는 T이고; X5는 N, D 또는 Q이고; X6은 K이거나 또는 부재한다 (서열식별번호: 10).
특정 실시양태에서, IgG Fc 영역은 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 10의 위치 1에서 E 잔기의 N-말단 측면에 야생형 IgG2 Fc 서열에서 발견될 아미노산의 일부 또는 모두를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 F이고; X3은 V이고; X4는 V이고; X5는 N이고; X6은 부재한다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은 아미노산 서열:
을 포함하며 여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하고, 단 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9 중 적어도 하나는 각각 인간 인슐린 B-쇄의 위치 B16, B25, B27, B28, B29 또는 B30에 존재하는 것 이외의 아미노산이고; X10은 G이거나 또는 부재하고; X11은 G, S이거나 또는 부재하고; X12는 T 또는 I이고; X13은 D, Y, Q 또는 E이고; X14는 G, N, S 또는 A이고; X15는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하고; 단 X14가 N인 경우, X15는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 하고; X16은 Q 또는 E이고; X17은 Q 또는 E이고; X18은 Q 또는 E이고; X19는 G, E, Q이거나 또는 부재하고; X20은 G이거나 또는 부재하고; X21은 G이거나 또는 부재하고; X22는 E 또는 P이고; X23은 E 또는 P이고; X24는 A 또는 V이고; X25는 G이거나 또는 부재하고; X26은 Q 또는 H이고; X27은 Y 또는 F이고; X28은 L 또는 V이고; X29는 S 또는 A이고; X30은 S 또는 P이고; X31은 A 또는 T이고; X32는 Q 또는 R이고; X33은 V 또는 M이고; X34는 R 또는 K이고; X35는 E 또는 Q이고; X36은 L 또는 P이다 (서열식별번호: 11).
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 및 서열식별번호: 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 아미노산 서열:
특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 이량체의 형태로 존재한다. 이러한 이량체의 개략적 다이어그램은 도 2의 다이어그램 (C)에 제공된다. 특정 실시양태에서, 이량체는 동종이량체이며, 여기서 이량체를 구성하는 2개의 융합 단백질의 아미노산 서열은 동일하다. 특정 실시양태에서, 이량체는 이종이량체이며, 여기서 이량체를 구성하는 2개의 융합 단백질의 아미노산 서열은 상이하다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 융합 단백질, 완충 작용제, 계면활성제, 및 등장성 작용제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제는 시트르산 및/또는 시트레이트이고, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이고, 등장성 작용제는 만니톨이다. 특정 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 8.0 범위이다. 특정 실시양태에서, pH는 약 6.0 내지 약 7.4의 범위이다. 특정 실시양태에서, pH는 약 6.0 내지 6.75의 범위이다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 추가의 활성 성분을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 활성 성분은 인크레틴-기반 요법이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 인크레틴-기반 요법은 GLP-1R 효능제이다. 바람직하게는, GLP-1R 효능제는 둘라글루티드이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료 유효량의 융합 단백질의 1일 1회 투여를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량의 융합 단백질은 1주 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질의 치료 유효량은 1개월마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 저혈당증 및/또는 체중 증가의 위험을 감소시키면서 당뇨병을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 당뇨병, 비만, 이상지혈증, 및/또는 대사 증후군을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이는 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 추가의 활성 성분과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 이러한 실시양태에서의 융합 단백질 및 추가의 활성 성분은 동시에, 순차적으로 또는 단일 조합된 제제로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 활성 성분은 인크레틴-기반 요법이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 인크레틴-기반 요법은 GLP-1R 효능제이다. 바람직하게는, GLP-1R 효능제는 둘라글루티드이다. 특정 실시양태에서, 조합물은 1일 1회 투여된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 조합물은 1주 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 조합물은 1개월마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 당뇨병, 비만, 이상지혈증 또는 대사 증후군의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 졸중, 신병증, 망막병증, 및 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당뇨병-관련 상태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 저혈당증 및/또는 체중 증가의 위험을 감소시키면서 당뇨병을 갖는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공하며, 이는 환자에게 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 또 다른 활성 성분과 동시, 개별 또는 순차적 조합으로 사용하기 위해 제공된다. 특정 실시양태에서, 추가의 활성 성분은 인크레틴-기반 요법이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 인크레틴-기반 요법은 GLP-1R 효능제이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 당뇨병, 비만, 이상지혈증 또는 대사 증후군의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환, 졸중, 신병증, 망막병증, 및 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당뇨병-관련 상태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 저혈당증 및/또는 체중 증가의 위험을 감소시키면서 당뇨병을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공하며, 이는 본 발명의 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 당뇨병, 비만, 이상지혈증 또는 대사 증후군의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 또 다른 활성 성분과 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합하여 투여하기 위한 것이다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "인슐린 수용체 효능제"는 인슐린 수용체에 결합하고 활성화시켜, 공지된 기술, 예컨대 하기 기재된 연구에 제시되는 것들을 사용하여 시험 및 측정될 수 있는 특징인 혈액 글루코스 수준의 강하 및/또는 간 글루코스 생산의 억제를 일으키는 단백질을 지칭한다.
본 발명의 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제 부분은 인슐린 B-쇄의 유사체 및 인슐린 A-쇄의 유사체를 포함한다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "인슐린 A-쇄" 및 "인슐린 B-쇄"는 천연 야생형 서열이 널리 공지된 인간 인슐린 분자 (CAS 번호 11061-68-0)의 A 및 B 쇄를 지칭한다. 인간 인슐린 A-쇄는, 하기 서열을 가지며 관련 기술분야에서 A1-A21로서 지칭되는 21개의 아미노산으로 이루어진다:
인간 인슐린 B-쇄는, 하기 서열을 가지며 관련 기술분야에서 B1-B30으로서 지칭되는 30개의 아미노산으로 이루어진다:
인간 인슐린의 분자에서, A- 및 B-쇄는 2개의 디술피드 결합, CysA7-CysB7 및 CysA20-CysB19에 의해 접합된다. A-쇄는 CysA6-CysA11에 쇄내 디술피드 결합을 갖는다.
목적하는 연장된 시간 작용 프로파일을 달성하기 위해, 본 발명의 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제는 여전히 순환 중이고, 연장된 기간에 걸쳐 인슐린 수용체와 상호작용할 수 있어야 한다. 본 발명의 융합 단백질이 순환 중에 목적하는 기간 동안 남아있도록 하기 위해, 융합 단백질의 제거는 약화되어야 한다. 인슐린 제거의 2개의 주요 경로는 신장 클리어런스 및 인슐린 수용체-매개 클리어런스이다. 문헌 [Iglesias P, et al. Diabetes Obes. Metab. 2008;10:811-823]을 참조한다. 신장 클리어런스를 최소화하기 위해, 적어도 약 인간 혈청 알부민의 크기의 유체역학적 크기를 갖는 분자가 요구되고, 이러한 유체역학적 크기는 인간 IgG Fc 영역에 의해 본 발명의 융합 단백질에 제공된다. 수용체-매개 클리어런스에 대하여, 융합 단백질은 그것이 목적하는 것보다 더 신속한 수용체-매개 클리어런스를 일으키기 때문에 인슐린 수용체에서 그렇게 효력이 있을 수는 없지만, 융합 단백질은 상업적으로 실현가능한 용량에서 충분한 글루코스 조절을 제공할 만큼은 충분히 효력이 있어야 한다. 따라서, 융합 단백질의 효력은 조심스럽게 균형을 이뤄야 하고, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 그것이 이러한 균형을 달성하도록 한다.
인슐린 분자는 이량체 및 육량체로 자가-회합하는 경향이 있다. 인슐린의 진화적으로-보존된, 자가-회합 경향에 대한 수많은 역할이 제안되었으며, 이는 (1) 세포내 공포 저장 동안의 분자의 화학적 및 열적 안정화; (2) 생체내 피브릴화로부터의 단량체성 인슐린의 보호; (3) 샤페론-보조 안정화 및 세포내 발현 동안의 폴딩을 위한 치환; 및/또는 (4) 분비 트래픽킹에 필수적이라는 것을 포함한다. 그러나, 인슐린의 활성 형태는 단량체이다.
자가-회합하고자 하는 인슐린 분자의 경향 및 이러한 자가-회합된 분자의 비활성은, 본 발명과 관련되며, 이는 인간 IgG Fc 영역이 또한 자가-회합하여, 전형적으로 힌지 영역에서의 디술피드 결합을 통해 공유 회합된 이량체를 형성하는 경향이 있고, 이러한 이량체는 본 발명의 융합 단백질에서의 인간 IgG Fc 영역으로부터 형성되기 때문이다. 인간 IgG Fc 영역의 이량체화의 결과로서, 2개의 인슐린 수용체 효능제 "아암"은 서로에게 인접하고, 그로 인해 비교적 높은 국부 농도로 존재한다. 인간 인슐린의 경우에, 이러한 인접은 인슐린 모이어티의 자가-회합, 또는 이량체화를 선호하는 경향이 있을 것이며, 이는 분자의 활성에 영향을 준다. 자가-회합되거나 또는 이량체화된 인슐린 모이어티 아암을 갖는 Fc 융합 단백질 이량체의 개략적 다이어그램은, 도 2의 다이어그램 (D)에 제공된다. 인슐린 분자의 자가-회합하는 경향은 또한 1개 초과의 Fc 융합 단백질 이량체로부터 인슐린 모이어티의 자가-회합, 또는 이량체화를 유도할 수 있고; 자가-회합되거나 또는 이량체화된 인슐린 모이어티를 갖는 2개의 Fc 융합 단백질 이량체의 이량체의 개략적 다이어그램은 도 2의 다이어그램 (E)에 제공된다. 또한, 2개 초과의 Fc 융합 단백질 이량체에서의 인슐린 모이어티는 또한 이러한 방식으로 자가-회합하여, 예를 들어, 3개의 이량체로 구성된 삼량체, 또는 심지어 3개 초과의 이량체로 구성된 더 높은 차수의 응집체를 형성할 수 있다.
그러나, 본 발명의 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제 부분은 자가-회합하거나 또는 이량체화하는 경향이 축소되었고, 따라서 본 발명의 융합 단백질로 구성된 융합 단백질 이량체는 도 2의 다이어그램 (D) 및 (E)에 도시된 구조와는 반대로, 도 2의 다이어그램 (C)에 도시된 구조를 선호하는 경향이 있다. 따라서, 본 발명은 2개의 융합 단백질의 이량체를 제공하지만, 이량체에서의 각 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제 "아암"은, 예를 들어 도 1의 다이어그램 (C)에 도시된 바와 같이 우세하게 단량체성 상태를 유지하고, 따라서 인슐린 수용체와 상호작용하는 것이 보다 더 가능하다.
본 발명의 융합 단백질에서, 인슐린 수용체 효능제에서의 인슐린 B-쇄의 유사체는 인간 인슐린 B-쇄의 아미노산 서열에 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, 인슐린 수용체 효능제 부분의 자가-회합하거나 또는 이량체화하는 성향을 감소시키기 위해, 인슐린 B-쇄 유사체는, 서열식별번호: 1에 각각 위치 X4, X5 및 X6-9로서 나타내어진 위치 B16, B25 또는 B27-30에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄로부터 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, X4 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B16에 상응함)는 E, Q 또는 H로 변형되고; X5 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B25에 상응함)는 H로 변형되고; X6 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B27에 상응함)은 결실되거나 또는 G, S, H 또는 V로 변형되고; X7 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B28에 상응함)은 결실되거나 또는 G, E, K, D, S 또는 H로 변형되고; X8 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B29에 상응함)은 결실되거나 또는 G, E, P, Q, D 또는 H로 변형되고; X9 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B30에 상응함)는 결실되거나 또는 G, S, E 또는 K로 변형될 수 있다. 인슐린 수용체 효능제 부분의 자가-회합하는 성향을 감소시키는 것 이외에도, 인슐린 B-쇄 유사체의 위치 B16 및 B25 - 각각, 서열식별번호: 1의 X4 및 X5 -에 대한 변형이 또한 이루어져 효력을 조정하고/거나, 발현을 개선시키고/거나, 화학적 및/또는 물리적 안정성을 개선시키고/거나, 융합 단백질이 다른 통상적으로 사용되는 부형제와 함께 제제화될 수 있는 용이성을 개선시키고/거나 탈아미드화를 제거할 수 있다. 인슐린 B-쇄 유사체는 또한 이러한 이유로 인해 추가의 변형을 포함할 수 있다. 서열식별번호: 1의 변수를 참조하면, 이러한 추가의 변형은 하기를 포함한다: X1 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B1에 상응함)의 Q 또는 A로의 변형; X2 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B2에 상응함)의 G로의 변형; 및/또는 X3 (인간 인슐린 분자의 B-쇄에서 B3에 상응함)의 K, D 또는 G로의 변형.
특정의 바람직한 실시양태에서, 인슐린 B-쇄 유사체는 서열식별번호: 1의 위치 X4, X5 및 X6-9에서 인간 인슐린 B-쇄의 아미노산 서열에 대한 하나 초과의 변형을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, X4는 E이고 X5는 H이다. 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 1의 X6-X9의 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: GGES, GGGS, GGDS, GGEG, GGGG, SSES, SSGS, GGEE, GGGE, GGEK, GGGK, TPGS, TGGS, HGES, GHES, GGHS, GGEH, HGGS, GHGS, GGGH, GGDD, VGES, TEET, TKPT, GGGG, TGGG, TPGG, EPKT, TDKT, TPGS, EGGS, EGES, EEES, EPES, EPEP 및 GGDD. 바람직한 실시양태에서, 이들 4개의 아미노산의 서열은 GGGS, GGGG 또는 TEET이다. 특히 바람직한 실시양태에서, X4는 E이고, X5는 H이고 X6-9는 GGGG이다.
서열식별번호: 1의 X6-X9는 인슐린 B-쇄 유사체의 C-말단 (Z1)을 포함하는 것으로서 상기 기재되는 반면에, 이들 아미노산이 인슐린 수용체에서 융합 단백질의 활성에 중요하지 않고, 따라서 대안적으로 제1 펩티드 링커의 연장 (Z2)으로 여겨질 수 있다는 것에 주목하여야 한다. 예를 들어, 서열식별번호: 4와 관련하여, X6-X9는 인슐린 B-쇄 유사체의 일부 또는 그 인슐린 수용체 효능제에서의 제1 펩티드 링커로 여겨질 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에서, 인슐린 수용체 효능제 부분에서의 인슐린 A-쇄의 유사체는 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형을 포함하여 화학적 및 물리적 안정성을 개선시키고/거나, 효력을 조정하고/거나, 발현을 증진시키도록 의도될 수 있다. 서열식별번호: 2의 변수를 참조하면, 이들 변형은 하기를 포함한다: X1 (인간 인슐린 분자의 A-쇄에서 A10과 상응함)의 T로의 변형; X2 (인간 인슐린 분자의 A-쇄에서 A14와 상응함)의 D, Q 또는 E로의 변형; 및/또는 X3 (인간 인슐린 분자의 A-쇄에서 A21과 상응함)의 G, S 또는 A로의 변형. 바람직한 실시양태에서, X1은 T이고, X2는 D이고, X3은 G이다.
또한, 탈아미드화 뿐만 아니라 화학적 및/또는 단백질분해적 절단을 피하기 위해, 인슐린 수용체 효능제에서의 인슐린 A-쇄의 유사체에서의 위치 21에서의 아미노산, 즉 서열식별번호: 2에서의 X3이 N - 인간 인슐린의 분자에서의 상응하는 위치에 존재하는 아미노산 -인 경우에, C-말단에 특정 아미노산, 예컨대 G 또는 N, 또는 특정 실시양태에서, P, S, V 또는 L이 바로 후속되어서는 안 된다. 예를 들어, 문헌 [Vlasak J, Ionescu R., MAbs. 2011 May-Jun;3(3):253-63. Fragmentation of Monoclonal Antibodies]을 참조한다. 이 요건이 인슐린 A-쇄의 유사체에 관한, 서열식별번호: 2에서의 위치 X4 및 X5에 대한 옵션과 관련하여 상기 기재된 제1 융합 단백질에서 열거되는 반면에, 인슐린 A-쇄의 유사체에서의 위치 21에서의 아스파라긴 잔기에 후속하는 비-글리신 잔기는, 제2 펩티드 링커와는 반대로, 인슐린 수용체 효능제의 일부로 여겨지는 것이 중요하지 않다는 것에 주목하여야 한다. 예를 들어, 서열식별번호: 11과 관련하여, A-쇄 유사체 부분에서의 위치 21에 상응하는 잔기는 X14에 의해 나타내어지고, 후속 아미노산인 X15는 인슐린 수용체 효능제 또는 제2 펩티드 링커의 일부로 여겨질 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질에서, 인슐린 B-쇄 유사체의 C-말단 잔기는 제1 펩티드 링커의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합되고 제1 펩티드 링커의 C-말단 잔기는 인슐린 B-쇄 유사체의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합된다. 제1 펩티드 링커는 인슐린 A-쇄 및 B-쇄의 유사체에 충분한 가요성을 제공하여 인슐린 수용체에 결합하는 데 필요한 구조를 달성하여야 하지만, 그것이 그 결합을 과도하게 방해할 만큼 길어서는 안된다. 제1 펩티드 링커의 길이 및 조성은 융합 단백질의 효력 및/또는 발현을 조정하기 위해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 링커는 5 내지 10개의 아미노산 길이이고, 그 중 적어도 5개는 G 잔기이다. 특정 실시양태에서, 제1 펩티드 링커의 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: GGGGGG, GGGGG, EGGGGG, GEGGGG, GGEGGG, GGGEGG, GGGGEG, GGGGGE, KGGGGG, GKGGGG, GGKGGG, GGGKGG, GGGGKG, GGGGGK, HGGGGG, GHGGGG, GGHGGG, GGGHGG, GGGGHG, GGGGGH, GGGGGA, GGGGGR, SGGGGG, GSGGGG, GGSGGG, GGSGGGK, GGSGGGG 및 GGSGGG. 특정의 바람직한 실시양태에서, 제1 펩티드 링커의 서열은 서열식별번호: 3을 포함한다. 가장 바람직하게는, 제1 펩티드 링커의 서열은 GGSGGGG (서열식별번호: 15)이다. 본 발명의 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제 부분은 또한 상기 기재된 바와 같이 인간 인슐린의 분자에서 발견된 디술피드 결합, 즉, CysA7-CysB7 및 CysA20-CysB19에서 인슐린 A-쇄 및 B-쇄의 유사체를 접합시키는 2개의 디술피드 결합, 및 CysA6-CysA11에서 인슐린 A-쇄의 유사체에서의 쇄내 디술피드 결합을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질의 인슐린 수용체 효능제 부분의 C-말단 잔기는 제2 펩티드 링커의 N-말단 잔기에 융합되고 제2 펩티드 링커의 C-말단 잔기는 Fc 부분의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합된다. 제2 펩티드 링커가, 충분한 입체형태적 가요성을 제공하기 위해 글리신 풍부인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 제2 펩티드 링커는 30개 미만의 아미노산 길이이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 제2 펩티드 링커는 10 내지 25개의 아미노산 길이이며, 아미노산의 적어도 50%는 글리신 잔기이다. 바람직한 제2 펩티드 링커는 서열 (GGGGX15)n을 포함하며 여기서 X15는 Q, E 또는 S이고 n = 2-5이다. 보다 바람직한 제2 펩티드 링커는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직한 제2 펩티드 링커는 아미노산 서열 
(서열식별번호: 7)을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "인간 IgG Fc 영역"은 면역학의 분야에서 용어에 통상적으로 주어지는 의미를 갖는다. 구체적으로는, 이 용어는 2개의 항원 결합 영역 (Fab 단편)을 항체로부터 제거함으로써 획득된 인간 IgG 항체 단편을 지칭한다. 특히, Fc 영역은 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역 도메인을 포함하고, 또한 힌지 영역의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질의 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 IgG 항체의 1개의 중쇄로부터의 불변 영역의 단편을 포함하며, 그의 개략적 도시는 도 2의 다이어그램 (A)에 제공되고, 다른 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 IgG 항체의 2개의 중쇄로부터의 불변 영역의 단편을 포함하며, 그의 개략적 도시는 도 2의 다이어그램 (B)에 제공된다. 이러한 실시양태에서, 2개의 중쇄의 불변 영역은 비-공유 상호작용 및 디술피드 결합을 통해 서로 회합된다.
각각 상이한 구조 및 이펙터 기능으로서 공지된 생물학적 기능을 갖는 4개의 IgG 하위부류 (G1, G2, G3, 및 G4)가 있다. 일반적으로 이들 이펙터 기능은 Fc 수용체 (FcγR)와의 상호작용을 통해 또는 보체 인자 C1q에 결합함으로써 매개된다. FcγR에 결합하는 것은 항체-의존성 세포-매개 세포용해로 이어질 수 있지만, 반면에 보체 인자에 결합하는 것은 보체-매개 세포 용해로 이어질 수 있다. IgG 하위부류의 Fc 영역의 구조 및 특성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. G2 및 G4가 G1 및 G3 항체보다 더 낮은 수용체 결합 및 이펙터 기능 활성을 가지고 있지만, 본 발명의 융합 단백질은 IgG 하위부류 중 임의의 것으로부터의 Fc 영역을 함유할 수 있고, 따라서 바람직하다.
본원에 사용되는 경우, 용어 인간 IgG Fc 영역은 또한 이러한 항체 단편의 버전을 포함하며 이는 변형되고/거나, 연장되고/거나 말단절단되어, 예를 들어, 특성 또는 특징 예컨대 보체 및/또는 Fc 수용체 결합 기능, 이펙터 기능, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 제조성, 및/또는 안정성이 변경된 것이다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질의 인간 IgG Fc 영역은 변형되어 N-연결된 글리코실화 부위를 감소시키거나 제거할 수 있으며, 이는 C1q 결합 친화도 및 세포독성을 감소시킬 것이고, 이는 면역원성을 보조하고/거나, 입체형태적 안정성 및 생체내 클리어런스율에 영향을 주고/거나, 이펙터 기능을 변형시킬 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 인간 IgG Fc 영역은 또한 디술피드 매개 Fc 이량체화를 단순화하기 위해 힌지 영역의 일부 또는 모두를 제거되도록 할 수 있다. 변경의 다른 예는 인산화, 황산화, 아실화, 글리코실화, 메틸화, 아세틸화, 아미드화 및/또는 이종이량체 분자의 생산을 가능하게 하는 변형을 포함한다. IgG 하위부류의 인간 IgG Fc 영역의 구조 및 특성을 변형시키는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
융합 단백질의 최종 구조에 상관없이, 인간 IgG Fc 영역은 인슐린 수용체 효능제의 생체내 혈장 반감기를 연장하도록 작용하여야 한다. Fc 부분이 반감기를 확장하는 그의 능력으로 인해 이용되고 있는 이종 Fc 융합 단백질을 제조함에 있어서, 임의의 이펙터 기능을 최소화하는 것이 중요하다. 게다가, 융합된 인슐린 수용체 효능제는 인슐린 수용체에 결합하고 활성화시켜, 공지된 기술, 예컨대 하기 기재된 연구에 제시된 것들을 사용하여 시험 및 측정될 수 있는 특징인 혈액 글루코스 수준의 강하 및/또는 간 글루코스 생산의 억제를 일으키는 것이 가능하도록 유지되어야 한다. 본 발명의 융합 단백질의 긴 반감기는, 예를 들어, 하기 기재된 방법을 사용하여 입증될 수 있다.
하나의 바람직한 인간 IgG Fc 영역은, 이펙터 기능을 추가로 감소시키고 동종이량체 형성을 촉진하기 위해 변형되고, 서열식별번호: 9 (여기서 X1이 F이고; X2는 F이고; X3은 V이고; X4는 V이고; X5는 N이고; X6은 R이고; X7은 부재한다)에서와 같이 힌지의 부분이 결실된 IgG4 Fc 영역이다.
또 다른 바람직한 인간 IgG Fc 영역은 서열식별번호: 10 (여기서 X1은 F이고; X2는 F이고; X3은 V이고; X4는 V이고; X5는 N이고; X6은 부재한다)에서와 같이 힌지의 부분이 결실된 IgG2 Fc 영역이다.
상기 열거된 바람직한 인간 IgG Fc 영역의 아미노산 서열은 힌지 영역의 부분이 결실되어 디술피드 매개 이량체화를 단순화하였지만, 그 힌지 영역이 특정 실시양태에서는 존재할 수 있다는 것에 주목하여야 한다. 예를 들어, 야생형 IgG2 Fc 영역은 그의 N-말단 끝에 6개의 아미노산 서열 ERKCCV를 포함하고, 이들 아미노산이 서열식별번호: 10에 제시된 IgG2 Fc 영역 서열에 열거되지는 않지만, 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 영역이 그의 N-말단 끝에 6개의 아미노산 서열 ERKCCV의 일부 또는 모두를 추가로 포함할 수 있는 것으로 여겨진다. 유사하게, 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 영역은 IgG4 Fc 영역의 N-말단 끝에서 발견되는 6개의 아미노산, 즉 ESKYGP의 일부 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다. 마찬가지로, 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 영역은 IgG1 Fc 영역의 N-말단 끝에서 발견되는 10개의 아미노산, 즉: EPKSCDKTHT의 일부 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 어떤 아미노산이 제2 펩티드 링커의 C-말단 끝을 구성하고 어떤 아미노산이 인간 IgG Fc 영역의 N-말단 끝을 구성하는지에 대한 정확한 서술은 본 발명의 융합 단백질의 구조 또는 기능에 중요하지 않다. 예를 들어, 서열식별번호: 11과 관련하여, 위치 X19-X22와 상응하는 잔기는 제2 펩티드 링커의 C-말단 끝 또는 인간 IgG Fc 영역의 N-말단 연장으로서 기재될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기-기재된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있으며, 이는 cDNA 및 합성 DNA를 포함하고, 이는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축중성의 결과로 달라질 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다: 오직 단백질에 대한 코딩 서열만, 단백질에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 전구-단백질 서열; 단백질에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 단백질에 대한 코딩 서열의 인트론 또는 비-코딩 서열 5' 및/또는 3'. 따라서 용어 "단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 단백질에 대한 코딩 서열 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 후 숙주 세포에서 발현될 것이다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 내재된 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 그 세포의 검출을 가능하게 하는 선택 마커를 함유할 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK293, BHK, 또는 COS 세포에서; 박테리아 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 플로오레센스(Pseudomonas fluorescence)에서; 곤충 세포에서, 또는 진균 또는 효모 세포에서 용이하게 생산될 수 있고, 이는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 배양된다. 그러나, 곤충, 및 효모 또는 다른 진균 세포는 비-인간 N-글리칸을 생산하며, 따라서 이러한 세포에서 생산된 N-연결된 글리코실화를 갖는 단백질은 환자에게 투여되는 경우에 면역원성 반응을 유발할 수 있다. 따라서 이러한 세포에서의 생산은 N-연결된 글리코실화 부위의 제거 및/또는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 인간 N-글리칸을 생산하기 위한 세포의 유전자 조작을 필요로 한다. 예를 들어, 문헌 [Hamilton SR, et al., Production of complex human glycoproteins in yeast, 301 Science (5637): 1244-6 (August 2003)]을 참조한다. 포유동물 세포에서의 생산이 바람직하고, 바람직한 포유동물 숙주 세포는 글루타민 신테타제 (GS) 발현 시스템을 함유하는 CHOK1SV 세포주이다 (미국 특허 번호 5,122,464 참조).
관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 융합 단백질 및 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질전환은 통상적으로 원핵 세포에 대해 이용되며, 반면에 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다.
단백질 정제의 다양한 방법이 사용될 수 있고 이러한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) 및 Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, N.Y. (1994)]에 기재된다.
상기 기재된 바와 같이, 특정 실시양태에서의 본 발명의 융합 단백질은 이량체로서 생산된다. 이러한 이량체에서, 융합 단백질의 인간 IgG Fc 영역은 비-공유 상호작용 및 디술피드 결합을 통해 서로 회합된다. 이러한 이량체의 개략적 도시는 도 2의 다이어그램 (C)에 제공된다. 이러한 이량체를 구성하는 2개의 융합 단백질 - 예를 들어, 도 2의 다이어그램 (C)에 도시된 이량체의 융합 단백질 A 및 융합 단백질 B -의 아미노산 서열이 동일한 경우에, 이량체는 본원에서 "동종이량체"로서 지칭된다. 상기 나타내어진 바와 같이, 포유동물 세포에서의 본 발명의 융합 단백질의 발현이 바람직하고, 이러한 세포에서의 발현은 동종이량체를 생성한다. 이러한 동종이량체에서의 융합 단백질은 Fc 부분에서 비-공유 상호작용 및 분자간 디술피드 결합을 통해 회합된다. 예를 들어, 서열식별번호: 12의 융합 단백질을 코딩하는 유전자에 의해 생산된 단백질은 쇄내 디술피드 결합을 통해 공유 결합된 (즉 C80-C80 및 C83-C83) 동종이량체일 것이다.
이량체를 구성하는 2개의 융합 단백질 - 예를 들어, 도 2의 다이어그램 (C)에서의 융합 단백질 A 및 융합 단백질 B -의 아미노산 서열이 상이한 경우, 이량체는 본원에서 "이종이량체"로서 지칭된다. 이러한 이종이량체는 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lewis SM, et al. Nat. Biotechnol. 32(2):191-8 (2014); Carter, J. Immunol. Methods, 248(1-2):7-15 (2001); Ridgway, J. B. et al. Protein Eng. 9(7):617-2 (1996)]을 참조한다.
본원에서 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물에 대한 언급은 그 융합 단백질의 동종이량체를 함유하고/거나, 이종이량체의 하나의 구성원이 그 융합 단백질인 이종이량체를 함유하는 제약 조성물을 포함한다. 유사하게, 본원에서 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 방법에 대한 언급은, 그 융합 단백질의 동종이량체를 투여하는 것 및/또는 이종이량체의 하나의 구성원이 그 융합 단백질인 이종이량체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 마찬가지로, 요법에 사용하기 위한 융합 단백질 및/또는 의약의 제조에 사용하기 위한 융합 단백질에 대한 언급은, 요법에 및/또는 의약의 제조에 사용하기 위한, 그 융합 단백질의 동종이량체, 및/또는 이종이량체의 하나의 구성원이 그 융합 단백질인 이종이량체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 당뇨병 또는 고혈당증, 또는 인슐린 투여가 상태의 증상 및 합병증을 퇴치하거나 완화하고자 하는 목적으로 지시되는 다른 상태를 갖는 환자의 관리 및 치유를 지칭한다. 치료하는 것은 본 발명의 융합 단백질을 투여하여 증상 또는 합병증의 개시를 예방하거나 또는 지연시키는 것, 증상 또는 합병증을 완화하는 것, 또는 질환, 상태, 또는 장애를 제거하는 것을 포함한다. 치료될 환자는 포유동물, 및 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "예방하다" 또는 "예방하는"은 하나 이상의 상태, 증상, 합병증 또는 장애의 위험 또는 발생률을 감소시키는 것, 또는 진행을 제거하거나 또는 늦추는 것을 지칭한다.
본 발명의 융합 단백질은 매우 다양한 질환 및 상태를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 고혈당증, 인슐린-의존성 당뇨병을 갖는 대상체 뿐만 아니라 비-인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 대상체가 포함되며, 이는 치료 경험이 없는 대상체 뿐만 아니라 경구 의약, 예컨대 술포닐우레아, 메트포르민, 티아졸리딘디온 예컨대 피오글리타존, α-글루코시다제 억제제 예컨대 아카르보스, 및/또는 인크레틴-기반 요법, 예컨대 DPP-4 억제제 및 GLP-1R 효능제를 포함하는 비인슐린 주사제로 치료되고 있는 대상체를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 이러한 환자에서 혈액 글루코스를 조절하는 데 사용될 수 있고, 불충분한 혈액 글루코스 조절로 인한 상태 또는 합병증 예컨대 망막병증, 신경병증 또는 신장 질환을 치료할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 매일, 격일, 1주 2회, 1주 3회, 1주 1회, 1개월마다 2회 또는 1개월마다 1회 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 작용 지속기간은 1주 1회 투여를 허용할 만큼 충분히 연장된다. 그러나, 심지어 이러한 장기 작용 분자에 대해서도, 효과적인 글루코스 조절이 또한 보다 빈번한 치료 요법, 예컨대 1일-1회를 사용하여 긴 약동학적 프로파일을 갖는 약물을 서서히 투여 축적시킴으로써 제공될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 인지될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Heise T and Meneghini LF, 20 Endocr. Pract. p75-83 (2014)]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 추가의 활성 성분, 예컨대 인슐린 또는 인슐린 유사체, 인크레틴-기반 요법, 또는 경구 당뇨병 의약, 예컨대 술포닐우레아, 메트포르민, 티아졸리딘디온 예컨대 피오글리타존 또는 α-글루코시다제 억제제 예컨대 아카르보스와 조합하여 투여된다.
용어 "인크레틴-기반 요법"은 GLP-1 및 위 억제 펩티드 (GIP)를 포함하는 인크레틴으로 공지된 대사 호르몬의 군의 투여를 포함하거나, 또는 그의 효과를 촉진하고/거나, 가능하게 하고/거나, 증진시키고/거나 자극하는 임의의 치료를 포함한다. 현재 입수가능한 인크레틴-기반 요법은 DPP-4 억제제 및 GLP-1R 효능제를 포함한다.
"DPP-4 억제제"는 인크레틴의 분해를 담당하는 DPP-4 효소를 차단하는 화합물이다. 현재 입수가능한 DPP-4 억제제는 시타글립틴 (자누비아(Januvia)®), 및 리나글립틴 (트라드젠타(Tradjenta)®)을 포함한다.
"GLP-1R 효능제"는 천연 인간 GLP-1 (서열식별번호: 25), GLP-1 유사체, GLP-1 유도체 또는 GLP-1 융합 단백질의 아미노산 서열을 포함하며, GLP-1 수용체에서 활성을 유지하는 화합물로 정의된다. GLP-1R 활성은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있으며, 이는 GLP-1 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화를 측정하는 생체내 실험 및 시험관내 검정, 예를 들어, 각각 EP 619,322 및 미국 특허 번호 5,120,712에 기재된 바와 같은, 췌장섬 세포 또는 인슐린종 세포를 사용하는 검정을 사용하는 것을 포함한다. GLP-1 유사체는 천연 인간 GLP-1의 아미노산 서열 (서열식별번호: 25)과 비교하는 경우 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 반전, 또는 부가를 포함하는 변형을 갖는 분자이다. GLP-1 유도체는 천연 인간 GLP-1의 아미노산 서열 (서열식별번호: 25) 또는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 그의 아미노산 측기, α-탄소 원자, 말단 아미노 기, 또는 말단 카르복실산 기 중 하나 이상에 적어도 하나의 화학적 변형을 추가적으로 갖는 분자이다. GLP-1 융합 단백질은 GLP-1, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유도체 부분 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 단백질이다. 현재 입수가능한 GLP-1R 효능제는 엑세나티드 (바이에타(Byetta)® 및 바이듀레온(Bydureon)®), 리라글루티드 (빅토자(Victoza)®), 알비글루티드 (탄제움(Tanzeum)®) 및 둘라글루티드 (트루리시티(Trulicity)®)를 포함하며, 그의 구조는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US 5,424,286 (엑세나티드); US 6,268,343 (리라글루티드); US 2014044717 (알비글루티드); 및 US 7,452,966 (둘라글루티드)을 참조한다.
본 발명의 융합 단백질이 추가의 활성 성분과 조합하여 제공되는 실시양태에서, 융합 단백질 및 추가의 활성 성분은 동시에, 순차적으로 또는 단일의, 조합된 제제로 투여될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 그를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 이러한 질환 및 상태를 치료하는 데 효과적이다. 본원에 사용된 어구 "치료 유효량"은 허용되지 않는 부작용을 유발하지 않으면서 환자에서 혈액 글루코스를 조절하기에 충분한 본 발명의 융합 단백질의 양을 지칭한다. 대상체에게 투여된 융합 단백질의 치료 유효량은 질환의 유형 및 중증도에 및 대상체의 특징, 예컨대 전반적 건강, 연령, 성별, 체중, 및 약물에 대한 내성에 따라 달라질 것이다. 통상의 기술자는 이들 및 다른 인자에 따라 달라지는 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량은 1주 1회 투여되는 경우에 약 0.01 nmol/kg 내지 약 100 nmol/kg의 범위이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량은 1주 1회 투여되는 경우에 약 1 nmol/kg 내지 약 50 nmol/kg의 범위이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량은 1주 1회 투여되는 경우에 약 16 nmol/kg 내지 약 25 nmol/kg의 범위이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량은 1주 1회 투여되는 경우에 약 1 mg 내지 약 200 mg의 범위이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량은 1주 1회 투여되는 경우에 약 25 mg 내지 약 175 mg의 범위이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량은 1주 1회 투여되는 경우에 약 100 mg 내지 약 160 mg의 범위이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 융합 단백질이 또 다른 활성 성분, 예컨대 GLP-1R 효능제와 조합하여 투여되는 경우에, 조합된 2종의 치료제의 활성이 환자에서 혈액 글루코스를 조절하기에 충분하도록 용량이 조정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 이러한 조합으로 혈액 글루코스 수준을 조절하기 위해 투여되어야 하는 융합 단백질의 양은 융합 단백질이 단독요법으로서 투여되는 경우에 필요로 하였을 것보다 더 적을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질이 GLP-1R 효능제와 조합하여 제공되는 경우에, 1주 1회 용량으로 제공될 융합 단백질의 양은 단독요법으로서 사용하기 위한 동일한 융합 단백질의 양, 예컨대 상기 단락에서 기재된 용량과 비교하여 최대 50%만큼 감소될 수 있다.
바람직하게는, 일부 실시양태에서의 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량의 투여는 효과적인 글루코스 조절을 제공하는 한편 기존 치료에 비해 저혈당증 및/또는 체중 증가의 위험을 감소시킬 것이다. 인슐린 수용체를 효능화하는 당뇨병 요법에 의해 유발된 저혈당증의 발생률은 투여 후의 치료제의 농도의 신속한 급증을 피함으로써 최소화될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 투여 후의 농도의 신속한 급증 없이 연장된 시간 작용 프로파일을 갖는다.
더욱이, 본 발명의 융합 단백질이 또 다른 활성 성분, 특히 GLP-1R 효능제와 조합하여 제공되는 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 간선호 활성은 또한 글루코스 수준을 조절하면서 저혈당증의 위험을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 유창 동모양혈관 내피를 통해 간에 용이하게 접근할 수 있으므로 분자가 주변부에서 간 글루코스 생산 활성을, 존재하는 경우 약간, 조절할 수 있는 한편, GLP-1R 효능제는 주변부로의 관류가 용이하게 가능한 췌장으로부터의 내인성 인슐린의 글루코스-의존성 분비를 촉진하여 근육 및 지방에서의 글루코스 흡수를 조절한다.
본 발명의 융합 단백질은 비강 투여 또는 폐 흡입에 의해 비경구로 투여된다. 비경구 투여가 바람직하고, 예를 들어, 전신 투여, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하, 또는 복강내 주사에 의한 것을 포함할 수 있다.
융합 단백질은 본 발명의 융합 단백질 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 전형적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 본질적으로 비경구이고 관련 기술분야에 널리 공지된, 비경구 제품에 대한 통상적인 부형제를 사용하는 임의의 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: the Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]을 참조한다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질은 포유동물 세포에서 발현되는 경우에 동종이량체이다. 따라서, 본원에 사용되는 경우, 용어 "융합 단백질을 포함하는 조성물"은 융합 단백질의 동종이량체를 함유하는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 적어도 1 mg/mL, 적어도 2 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 20 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 30 mg/mL, 적어도 35 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 55 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 65 mg/mL, 적어도 75 mg/mL, 적어도 100 mg/ml 또는 그 초과의 농도로 존재하는 본 발명의 융합 단백질을 갖는 조성물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 10-100 mg/mL의 농도로 존재한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 15-75 mg/mL의 농도로 존재하고, 가장 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 20-65 mg/mL의 농도로 존재한다.
용어 "부형제"는 융합 단백질 또는 임의의 다른 추가의 활성 성분(들) 이외에 조성물에 첨가되는 임의의 물질을 의미한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 이러한 부형제의 예는 완충 작용제, 계면활성제, 등장성 작용제 및 보존제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 완충 작용제를 포함하여 조성물의 pH를 조절한다. "완충 작용제"는 그의 짝산-짝염기 성분의 작용에 의해 pH의 변화를 저항하는 물질이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 약 5.5 내지 약 8.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 6.75의 pH를 갖는다. 본 발명의 조성물의 pH를 목적하는 범위로 조절하는 데 적합한 완충 작용제는 작용제 예컨대 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 또는 그의 산, 아르기닌, 트리스(TRIS) 및 히스티딘 완충제, 뿐만 아니라 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "트리스"는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3,-프로판디올, 및 그의 임의의 약리학상 허용되는 염을 의미한다. 유리 염기 및 히드로클로라이드 형태 (즉, 트리스-HCl)는 트리스의 2가지 통상적인 형태이다. 트리스는 또한 관련 기술분야에 트리메틸올 아미노메탄, 트로메타민, 및 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄으로서 공지되어 있다. 본 발명의 조성물에 바람직한 완충 작용제는 시트레이트, 또는 시트르산, 및 포스페이트이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 등장성 작용제를 포함하여 세포 팽윤 또는 세포 파열로 인한 주사 시의 통증을 최소화한다. "등장성 작용제"는 생리학상 허용되며, 제제에 적합한 긴장성을 부여하여 투여된 제약 조성물과 접촉하는 세포 막을 가로지르는 물의 순 흐름을 방지하는 화합물이다. 공지된 등장성 작용제는 글리세롤, 염 예컨대 염화나트륨, 및 만니톨, 덱스트로스 및 락토스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 모노사카라이드를 포함한다. 바람직한 등장성 작용제(들)는 만니톨 및 염화나트륨이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 계면활성제를 포함한다. "계면활성제"는 액체의 표면 장력을 낮추는 물질이다. 제약 조성물에 사용되고 본 발명의 특정 조성물에 사용될 수 있는 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 400, PEG 3000, 트리톤(TRITON) X-100), 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르 (예를 들어, 브리즈(BRIJ)), 폴리프로필렌 글리콜, 블록 공중합체 (예를 들어, 폴록사머, 플루로닉(PLURONIC) F68; 폴록사머 407, 플루로닉 F127; 테트로닉스(TETRONICS)), 소르비탄 알킬 에스테르 (예를 들어, 스팬(SPAN)), 폴리에톡실화 피마자 오일 (예를 들어, 콜리포르(KOLLIPHOR), 크레모포르(CREMOPHOR)) 및 트레할로스를 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 보존제를 함유할 수 있다. 용어 "보존제"는 제약 제제에 첨가되어 다중-사용 및/또는 적정가능한 조성물에서 항미생물제로서 작용하는 화합물을 지칭한다. 비경구 제제에서 효과적이고 허용가능한 것으로서 관련 기술분야에 공지되어 있는 보존제 중에는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알콜, 메틸- 또는 프로필-파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 질산페닐제2수은, 티메로살, 벤조산, 및 그의 다양한 혼합물이 있다. 페놀계 보존제는 화합물 페놀, m-크레졸, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 메틸파라벤, 및 그의 혼합물을 포함한다. 보존제가 필요한 경우에, 본 발명의 조성물에 사용되는 보존제는 바람직하게는 페놀계 보존제, 바람직하게는 m-크레졸 또는 페놀이다.
특정 페놀계 보존제, 예컨대 페놀 및 m-크레졸은 인슐린 및 인슐린 육량체에 결합함으로써, 입체형태적 변화를 안정화시켜 물리적 또는 화학적 안정성, 또는 둘 다를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 다른 단백질을 포함하는 조성물에서, 이러한 보존제는 단백질 응집체 또는 고분자량 중합체 (HMWP)의 형성을 초래할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Maa YF and Hsu CC, Int J Pharm 140: 155-168 (1996); Fransson J, et al., Pharm. Res., 14: 606-612 (1997); Lam XM, et al., Pharm. Res., 14: 725-729 (1997); Remmele RL Jr, et al., Pharm Res 15: 200-208. (1998); Thirumangalathu R, et al., J Pharm Sci 95: 1480-1497 (2006)]을 참조한다. 치료 제제에서의 이러한 단백질 응집체는 면역 반응을 유도하는 그의 경향으로 인해서 바람직하지 않다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열은 최적화되어 페놀계 보존제를 또한 함유하는 조성물에서 융합 단백질의 물리적 안정성을 증진시킨다. 예를 들어, 본 발명자들은 놀랍게도 인슐린 A-쇄의 유사체에서의 위치 10 (서열식별번호: 2에 열거된 인슐린 A-쇄의 유사체에서의 변수 X1)에서의 아미노산 돌연변이의 존재가, 하기 안정성 연구에 제시되는 바와 같이 페놀계 보존제의 존재 하에 융합 단백질의 응집체의 축적을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
융합 단백질의 발현 및 정제
본 발명의 융합 단백질을 CHO 글루타민 신테타제 (GS) 녹아웃 (GSKO) 세포주를 사용하는 포유동물 세포 발현 시스템에서 생산한다. GS 유전자 녹아웃은 선택 조건 하에 저- 또는 비-생산적 세포의 생존을 가능하게 할 수 있는 내인성 GS 배경 활성을 제거함으로써 강화된 선택 엄격도를 가능하게 한다. 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 글루타민 신테타제 (GS) 함유 발현 플라스미드 내로 서브-클로닝한다. 융합 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 세포 배양 배지 내로의 융합 단백질의 분비를 증진시키는 신호 펩티드의 코딩 서열과 프레임에 맞게 융합시킨다. 발현을 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 유도한다. CHO GSKO 세포를 전기천공 및 적절한 양의 재조합 발현 플라스미드를 사용하여 안정하게 형질감염시킨다.
형질감염된 세포는 글루타민-무함유 배지에서 벌크 선택을 거친다. 형질감염된 풀을 저밀도로 플레이팅하여 안정한 발현 세포의 클론에 가까운 증식이 일어나도록 한다. 마스터웰을 융합 단백질 발현에 대해 스크리닝하고 생산에 사용되도록 하기 위해 혈청-무함유 현탁 배양물 중에서 규모를 확장한다.
배지 내로 분비된 융합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 표준 크로마토그래피 기술에 따라 정제할 수 있다. 간략하게, 정화된 배지로부터의 융합 단백질을 포스페이트 완충 염수 pH 7.4로 평형화된 Mab 선택 단백질 A (GE)에 의해 포획한다. 포스페이트 완충 염수 pH 7.4로의 세척 단계 후에, 결합된 융합 단백질을 10 mM 시트르산 pH 3.0으로 용리한다. 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 1/10 부피의 1M 트리스 pH 8.0을 첨가함으로써 중화시킨다. 가용성 응집체 및 다량체를, 크기 배제, 소수성 상호작용 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같은, 단량체성 융합 단백질 (공유 연결된 동종이량체)을 함유하는 분획을 풀링하고, 멸균 여과하고, 보관한다.
본 발명의 예시적인 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기에 제시된다:
시험관내 활성
실시예 1-3, 5 및 9의 시험-로트를 포스페이트 완충 염수 (PBS, pH 7.4) 또는 10 mM 시트레이트 완충제 (pH 6.5) 중에서 제조하고, 4℃에서 보관한다. 생합성 인간 인슐린 (일라이 릴리 앤 컴파니(Eli Lilly and Company))을 0.01 N HCl 중에서 제조하고 동결된 분취물로서 보관하거나, 또는 m-크레졸, 아연, 염화나트륨, 및 트리스 완충제 (pH 7.3)를 함유하는 제제화된 혼합물 중에서 100 유닛/mL로 제조하고 4℃에서 보관한다.
융합 단백질의 친화도를 C-말단에 C9 에피토프 태그를 함유하는 인간 인슐린 수용체 이소형 A (hIR-A) 또는 인간 인슐린 수용체 이소형 B (hIR-B)를 과다-발현하는 안정하게-형질감염된 293EBNA 세포 (EBNA-1을 발현하는 293HEK 인간 배아 신장 세포)로부터 제조된 P1 막에서 수행되는 수용체 결합 검정에서 결정한다. 결합 친화도를 인간 재조합 (3-[125I]-아이오도티로실-A14)-인슐린을 사용하여 정상-상태에서 수행되는 경쟁적 방사성-리간드 결합 검정으로부터 결정한다. 시험 샘플에 대한 값을 비표지된 인간 인슐린의 활성에 대한 퍼센트로서 계산한다. IC50 값을 4-파라미터 로지스틱 비-선형 회귀 분석 (XL피트(XLFit) 버전 4.0, IDBS)으로부터 결정한다. 필요한 경우, 곡선 상부 또는 하부 파라미터를 각각 100 또는 0으로 설정한다.
친화도 상수 (Ki)를 식 Ki = IC50 / (1 + D /Kd)에 기초한 IC50 값으로부터 계산하고, 여기서 D는 실험에 사용된 방사성-리간드의 농도이고 Kd는 포화 결합 분석으로부터 결정된 방사성-리간드의 그의 동족 수용체에 대한 평형 결합 친화도 상수 (hIR-A = 0.205 nM; hIR-B = 0.251 nM)이다. Ki에 대한 보고된 값은 기하 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 제시되며, 반복 결정의 횟수는 "n"에 의해 나타내어진다 (표 1).
예시된 융합 단백질은 hIR-A 및 hIR-B 둘 다에 친화도를 갖는다. 인간 인슐린에 비해, 예시된 융합 단백질은 hIR-A 및 hIR-B에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다 (표 1).
표 1:
Ki 값은 기하 평균이다. SEM은 평균의 표준 오차이다. n은 관찰 횟수이다.
생체내 연구
스트렙토조토신 (STZ)-처리된 래트 당뇨병 모델에서의 연구
융합 단백질의 효과를 STZ-처리된 래트 당뇨병 모델에서 조사한다. 400-425 그램 체중인 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 이소플루란으로 마취시키고 자노사르(Zanosar)® (STZ 항목 # 89256, 테바 패런테랄 메디신스(Teva Parenteral Medicines), 40 mg/kg IV)의 단일 주사를 제공한다. 래트를 자노사르®의 주사 3일 후에 연구에 사용하고; 오직 400-550 mg/dL 사이의 비-공복 혈액 글루코스를 갖는 동물만을 이들 연구에 사용한다.
래트를 혈액 글루코스 및 체중의 비교가능한 분산을 제공하기 위해 군에 분배하고 이어서 무작위화한다. 혈액 글루코스를 아큐체크 아비바(Accucheck Aviva) 혈당측정기 (로슈(Roche))를 사용하여 측정한다. STZ-처리된 래트에 30 nmol/kg 용량의 단일 피하 (SC) 주사를 제공한다.
글루코스 측정을 위한 혈액 샘플을 꼬리 채혈에 의해 수집한다. 동물은 실험 전체에 걸쳐 음식물 및 물에 자유롭게 접근한다. 혈액 글루코스 데이터는 도 1에 제공된다. 도 1에 제시된 데이터는 평균 ± SEM (실시예 1 및 8에 대해 n=6; 남아있는 실시예에 대해 n=3)이다. 초기 급식 기간 동안의 시점 (0 내지 24시간)에 대한 혈액 글루코스 데이터를 수집하지만, 시각적 표현의 용이성을 위해 도 1에 포함시키지는 않는다. 도 1에 제시된 바와 같이, 실시예 1-10은 각각 장기간 동안 글루코스 강하를 제공한다.
실시예 1, 3-6 및 9-10의 약동학적 특성을 또한 상기 기재된 바와 같이 STZ-처리된 래트에서 피하 (SC) 투여 후에 특징화한다. 데이터를 인슐린 수용체에 결합할 수 있는 인슐린의 존재를 필요로 하는 인슐린 수용체 ELISA 검정을 사용하여 생성한다. 인슐린 수용체 ELISA는 인간 인슐린 수용체 (R&D 시스템즈(R&D Systems)#1544-IR/CF aa28-944)를 포획물로서 이용한다. 인간 인슐린 수용체를 마우스 항-6x 히스태그 항체 (노바젠(Novagen) 70796)에 의해 이뮨론(Immunlon) 4 HBX 플레이트에 부착시킨다. 융합 단백질 표준 곡선 및 샘플을 100% 래트 K3 EDTA 혈장에 희석하고 마우스 항-인간 IgG Fc 양고추냉이 퍼옥시다제 (서던바이오테크(SouthernBiotech) 9040-05)에 의해 검출한다. 실시예 3-6 및 9-10의 336시간 시점에서의 농도는 모두 22.1 ± 9.8 mg/mL 내지 1498 ± 690 mg/mL이다. 표 3은 시간 경과에 따른 실시예 1의 농도를 나타내고, 표 4는 실시예 1에 대한 데이터의 비-구획 분석에 따른 약동학적 파라미터를 나타낸다. 데이터는 본 발명의 융합 단백질에 대한 생체이용률의 연장된 지속기간을 지지한다.
표 3
데이터는 n=3의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
표 4
데이터는 n=3의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 약어: AUC0 -∞ - 0부터 무한대까지의 곡선하 면적, Cmax - 최대 농도, Tmax - 최대 농도에서의 시간, CL - 클리어런스, F - 생체이용률, t1/2 - 반감기.
정상 래트에서의 정상혈당성 클램프 연구
수컷 스프라그-돌리 래트에서의 정상혈당성 클램프 연구를 수행하여 글루코스 이용에 대한 실시예 1의 전반적 생체내 활성을 이해하고 간 대 말초 조직에서의 실시예 1의 활성을 결정한다. 3-3H-글루코스의 볼루스/연속 주입을 만성적으로 카테터삽입된, 밤새-금식시킨 래트에서 개시하여 기저 조건 하에 내인성 글루코스 생산 (EGP)을 결정한다. 시험 물품 -7nmol/kg [볼루스] 및 1nmol/kg/시간 [연속 속도] - 또는 인슐린 리스프로 비교자 - [볼루스 없음] 및 0.75 mU/kg/분 [연속 속도] -의 볼루스/연속 정맥내 주입을 이어서 투여하고 20% 글루코스의 가변적 정맥내 주입을 개시하고 주기적으로 조정하여 혈액 글루코스 농도를 100-110 mg/dL로 유지한다. 볼루스/주입 속도를 선택하여 각 군에서 정상혈당성 클램프 조건 하에, 대등한 글루코스 주입 속도 (GIR) 및 EGP의 대등한 억제를 달성한다. 소마토스타틴을 투여하여 내인성 인슐린 분비를 억제한다. 동맥 혈액 샘플을 실험 동안 획득하여, 적혈구용적률, 혈장 인슐린, 및 유리 지방산, C-펩티드, 및 기저 및 클램프 EGP를 모니터링한다. 실험 종료 시에, 2-[1-14C]-데옥시글루코스를 투여하여 정상 상태 글루코스 농도 하에서의 조직 글루코스 흡수를 측정한다. 이들 매치된 조건 하에, 시험 물품 및 비교자의 말초 활성을 가자미근에서의 글루코스 흡수 및 혈장 유리 지방산 (FFA)의 억제로서 분석한다. 모든 데이터를 인슐린 리스프로 군을 대조군 비교자로서 사용하는 던넷(Dunnett)의 사후 검정에 의한 일원 분산 분석을 사용하여 분석한다.
실시예 1의 볼루스 및 주입 용량은 클램프 실험의 과정에 걸쳐 274 ± 57 nM의 정상 혈장 농도를 일으킨다. 표 5에 제시된 바와 같이, 동물의 군 둘 다는 실험의 클램프 상 동안 대등한 GIR을 달성한다. 실시예 1 군에서의 평균 혈액 글루코스는 인슐린 리스프로 군보다 약간 더 높다. 군은 둘 다 유사한 기저 및 클램프 EGP 속도를 갖는다 (표 5). 게다가, 실시예 1 군에서의 기저 EGP로부터의 퍼센트 변화는 인슐린 리스프로 대조군과 대등하다 (표 5). 동등하게 클램프된 조건 하에서 말초 활성을 평가하기 위해, 혈장 FFA의 억제 및 근육 글루코스 흡수를 측정한다. 인슐린 리스프로가 클램프 실험의 과정에 걸쳐 혈장 FFA 수준의 감소를 일으킨 반면에, 실시예 1은 그렇지 않았다 (표 5). 게다가, 실시예 1의 주입은 인슐린 리스프로에 비해 가자미근에서의 글루코스 흡수의 33% 감소를 일으킨다 (표 5). 총괄적으로, 이들 데이터는 실시예 1이 인슐린 리스프로에 비해 감소된 말초 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다.
표 5:
값은 인슐린 리스프로에 대한 13마리의 동물 및 실시예 1에 대한 17마리의 동물의 평균 ± SEM으로 나타낸다. Rg = 글루코스 대사 지수. 통계적 분석을 일원 ANOVA에 이어 던넷의 사후 검정에 의해 완료하였다. * = 인슐린 리스프로와 유의하게 상이함 (p<0.05).
시노몰구스 원숭이에서의 생체내 효능
실시예 1의 약동학적 (PK) 파라미터를 시노몰구스 원숭이에서의 1.5 nmol/kg의 단일 정맥내 투여 및 3 nmol/kg의 단일 피하 투여 후에 평가한다. PK 분석을 위한 혈장 샘플을 군/경로당 3마리 동물로부터, 3주의 과정에 걸쳐 수집한다. 2개의 검정을 PK 분석을 위해 이용한다: 인슐린 수용체 ELISA 및 전체 IgG Fc ELISA. 인슐린 수용체 ELISA는 인간 인슐린 수용체 (R&D 시스템즈1544-IR/CF)를 포획물로서 이용한다. 인간 인슐린 수용체를 마우스 항-히스태그 항체 (노바젠 70796)에 의해 이뮨론 4 HBX 플레이트에 부착시킨다. 실시예 1 표준 곡선 및 샘플을 100% 시노몰구스 원숭이 혈장 (항응고제는 K3 EDTA였음) 중에서 희석하고 마우스 항-인간 IgG Fc 양고추냉이 퍼옥시다제 (서던바이오테크 9040-05)에 의해 검출한다. 전체 IgG ELISA는 항-인간 IgG2 (압캠 ab1933)를 포획 시약으로서 이용한다. 실시예 1을 100% 시노몰구스 원숭이 혈장 중에서 희석하고 검출 항체는 인슐린 수용체 ELISA에서와 동일하다. 검정 둘 다로부터의 결과를 표 6에 제시하고, 연관된 PK 파라미터를 표 7에 제시한다. 실시예 1은 원숭이에서 완전한 생체이용률을 제시하고, 활성 인슐린 검정 및 전체 Fc 검정은 유사한 결과를 제공한다.
표 6. 정상 시노몰구스 원숭이에서의 실시예 1의 PK.
데이터는 n=3으로부터의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 약어: IV = 정맥내; SD = 표준 편차; NC = 계산되지 않음
표 7. 표 6에서의 데이터의 비-구획 분석으로부터 유래된 PK 파라미터.
데이터는 n=3으로부터의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 약어: AUC0 - inf - 0부터 무한대까지의 곡선하 면적, Cmax - 최대 농도 (IV 투여에 대해 Cmax는 시간 0에서의 외삽된 농도임), Tmax - 최대 농도에서의 시간, CL - 클리어런스, F - 생체이용률, t1/2 - 반감기, Vss - 분포의 정상-상태 부피, NA - 적용가능하지 않음.
안정성
실시예 1의 비-보존된 65 mg/mL 제제
실시예 1을 10 mM 시트레이트, 46.4 mg/mL 만니톨, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 6.5 중에서 65 mg/mL로 제제화하고, 30℃에서 보관한다. 샘플을 1 μL의 65 mg/mL 샘플로 주사하여, 제0, 2, 및 4주에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 퍼센트 고분자량에 대하여 분석한다. 분석용 SEC를 TSKgel SuperSW3000 (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)) 칼럼 및 0.4 mL/분으로 15분 동안 유동하는 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.0 이동상이 장착된 애질런트(Agilent) 1100 시스템에서 수행한다. 피크를 280 nm의 흡광도로 검출하고 크로마토그램을 켐스테이션(ChemStation) 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 제0 시점에서의 퍼센트 고분자량은 1.13%이고, 제2주 시점에서는 1.68%이고, 제4주 시점에서는 1.74%이다. 이들 결과는 30℃에서의 4주 후의 수용성 응집체의 최소 성장에 의해 65 mg/mL 농도에서의 실시예 1의 안정성을 지지한다.
실시예 1 및 3의 보존된 및 비-보존된 1 mg/mL 제제
실시예 1 및 3을 30 mM m-크레졸의 존재 또는 부재 하에 10 mM 시트레이트, pH 6.5 중에서 1 mg/mL로 제제화하고, 30℃에서 보관한다. 샘플을 10 μL의 1 mg/mL 샘플로 주사하여 제0 시점 및 제2주 시점에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 퍼센트 고분자량에 대하여 분석한다. 분석용 SEC를 TSKgel G3000SWxl (도소 바이오사이언스) 칼럼 및 각각 m-크레졸의 부재 또는 존재 하의 샘플에 대해 35분 또는 45분 동안 0.5 mL/분으로 유동하는 PBS + 350 mM NaCl, pH 7.4 이동상이 장착된 애질런트 1100 시스템에서 수행한다. 피크를 214 nm의 흡광도로 검출하고 크로마토그램을 켐스테이션 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 실시예 3에 대해, m-크레졸의 부재 및 존재 하에 제0 시점에서의 퍼센트 고분자량은 각각 0.2% 및 3.06%이다. m-크레졸의 부재 및 존재 하에 제2주에서의 퍼센트 고분자량은 각각 0.2% 및 1.73%였다. 이들 결과는 제0 시점에서의 실시예 3에 대해 m-크레졸의 첨가 후 가용성 응집체의 즉각적인 증가를 보여준다. 실시예 1에 대해, m-크레졸의 부재 및 존재 하에 제0 시점에서의 퍼센트 고분자량은 각각 0.16% 및 0.15%였다. m-크레졸의 부재 및 존재 하에 제2주에서의 퍼센트 고분자량은 각각 0.18% 및 0.31%였다. 이들 결과는 보존제의 존재 하의 인슐린 A-쇄 유사체에서의 위치 10 (서열식별번호: 2에서의 변수 X1, 상기 기재된 제1 융합 단백질에서의 Z3)에서 T 잔기로의 아미노산 변형을 포함하는 실시예 1의, 그 위치에 천연 I 잔기를 포함하지만 그 외에는 실시예 1과 동일한 인슐린 수용체 효능제 아미노산 서열을 포함하는 실시예 3에 비한 안정성을 입증한다.
서열
서열식별번호: 1 - 인슐린 B-쇄의 유사체
여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하며, 단 인슐린 B-쇄 유사체는 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함한다
서열식별번호: 2 - 인슐린 A-쇄의 유사체
X1은 T 또는 I이고; X2는 D, Y, Q 또는 E이고; X3은 G, N, S 또는 A이고; X4는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하며, 단 X3이 N인 경우, X4는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 한다
서열식별번호: 3 - 제1 펩티드 링커
서열식별번호: 4 - 인슐린 수용체 효능제
여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하고; X10은 G이거나 또는 부재하고; X11은 G, S이거나 또는 부재하고; X12는 T 또는 I이고; X13은 D, Y, Q 또는 E이고; X14는 G, N, S 또는 A이고; X15는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하며, 단 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9 중 적어도 하나는 각각 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 위치 B16, B25, B27, B28, B29 또는 B30에서 발견된 것과 상이한 아미노산이어야 하고, 추가로 단 X14가 N인 경우, X15는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 한다
서열식별번호: 5 - 인슐린 수용체 효능제
서열식별번호: 6 - 제2 펩티드 링커
여기서 X1은 Q 또는 E이고; X2는 Q 또는 E이고; X3은 Q 또는 E이고; X4는 G, E, Q이거나 또는 부재하고; X5는 G이거나 또는 부재하고; X6은 G이거나 또는 부재한다
서열식별번호: 7 - 제2 펩티드 링커
서열식별번호: 8 - 인간 IgG Fc 영역
여기서 X1은 F, Q 또는 E이고; X2는 F, Q 또는 E이고; X3은 V 또는 T이고; X4는 V 또는 T이고; X5는 N, D 또는 Q이고; X6은 K이거나 또는 부재한다
서열식별번호: 9 - 인간 IgG Fc 영역
여기서 X1은 F, Q 또는 E이고; X2는 F, Q 또는 E이고; X3은 V 또는 T이고; X4는 V 또는 T이고; X5는 N, D 또는 Q이고; X6은 R, 또는 K이고; X7은 K이거나 또는 부재한다
서열식별번호: 10 - 인간 IgG Fc 영역
여기서 X1은 F, Q 또는 E이고; X2는 F, Q 또는 E이고; X3은 V 또는 T이고; X4는 V 또는 T이고; X5는 N, D 또는 Q이고; X6은 K이거나 또는 부재한다
서열식별번호: 11 - 융합 단백질
여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하며, 단 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9 중 적어도 하나는 각각 인간 인슐린 B-쇄의 위치 B16, B25, B27, B28, B29 또는 B30에 존재하는 것 이외의 아미노산이고; X10은 G이거나 또는 부재하고; X11은 G, S이거나 또는 부재하고; X12는 T 또는 I이고; X13은 D, Y, Q 또는 E이고; X14는 G, N, S 또는 A이고; X15는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하며, 단 X14가 N인 경우, X15는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 하고; X16은 Q 또는 E이고; X17은 Q 또는 E이고; X18은 Q 또는 E이고; X19는 G, E, Q이거나 또는 부재하고; X20은 G이거나 또는 부재하고; X21은 G이거나 또는 부재하고; X22는 E 또는 P이고; X23은 E 또는 P이고; X24는 A 또는 V이고; X25는 G이거나 또는 부재하고; X26은 Q 또는 H이고; X27은 Y 또는 F이고; X28은 L 또는 V이고; X29는 S 또는 A이고; X30은 S 또는 P이고; X31은 A 또는 T이고; X32는 Q 또는 R이고; X33은 V 또는 M이고; X34는 R 또는 K이고; X35는 E 또는 Q이고; X36은 L 또는 P이다
서열식별번호: 12 - 융합 단백질
서열식별번호: 13 - 인간 인슐린 A-쇄
서열식별번호: 14 - 인간 인슐린 B-쇄
서열식별번호: 15 - 제1 펩티드 링커
서열식별번호: 16 - 융합 단백질
서열식별번호: 17 - 융합 단백질
서열식별번호: 18 - 융합 단백질
서열식별번호: 19 - 융합 단백질
서열식별번호: 20 - 융합 단백질
서열식별번호: 21 - 융합 단백질
서열식별번호: 22 - 융합 단백질
서열식별번호: 23 - 융합 단백질
서열식별번호: 24 - 융합 단백질
서열식별번호: 25 - GLP-1
SEQUENCE LISTING
<110> Eli Lilly and Company
<120> FUSION PROTEINS
<130> X20356
<150> 62/158079
<151> 2015-05-07
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa at position 1 is Phe, Gln or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Val or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Glu, Tyr, Gln or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa at position 25 is His or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa at position 27 is Gly, Thr, Ser, His, Val, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa at position 28 is Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa at position 29 is Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa at position 30 is Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala, or is absent
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is Thr or Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa at position 14 is Asp, Tyr, Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa at position 21 is Gly, Asn, Ser, or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa at position 22 is any naturally occurring amino acid, or is
absent
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Xaa Cys Ser Leu Xaa Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Xaa Xaa
20
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa at position 1 is Gly or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Gly, Ser, or is absent
<400> 3
Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa at position 1 is Phe, Gln, or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Val or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Glu, Tyr, Gln, or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa at position 25 is His or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa at position 27 is Gly, Thr, Ser, His, Val, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa at position 28 is Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa at position 29 is Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa at position 30 is Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa at position 31 is Gly or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa at position 33 is Gly, Ser, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa at position 47 is Thr or Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa at position 51 is Asp, Tyr, Gln, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa at position 58 is Gly, Asn, Ser, or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa at position 59 is any naturally occurring amino acid, or is
absent
<400> 4
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
20 25 30
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Xaa Cys
35 40 45
Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa Xaa
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa at position 5 is Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa at position 15 is Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Gly, Glu, Gln, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa at position 21 is Gly or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa at position 21 is Gly or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa at position 22 is Gly or is absent
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Phe, Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Xaa at position 18 is Phe, Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa at position 37 is Val or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa at position 39 is Val or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(72)
<223> Xaa at position 72 is Asn, Asp or Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (222)..(222)
<223> Xaa at position 222 is Lys or is absent
<400> 8
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Xaa Val Xaa Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215 220
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa at position 17 is Phe, Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa at position 19 is Phe, Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa at position 38 is Val or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa at position 40 is Val or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa at position 73 is Asn, Asp or Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (185)..(185)
<223> Xaa at position 185 is Arg or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (223)..(223)
<223> Xaa at position 223 is Lys or is absent
<400> 9
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Xaa Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Xaa Val Xaa Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215 220
<210> 10
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Phe, Gln, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Xaa at position 18 is Phe, Gln, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa at position 37 is Val or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa at position 39 is Val or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(72)
<223> Xaa at position 72 is Asn, Asp, or Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (222)..(222)
<223> Xaa at position 222 is Lys or is absent
<400> 10
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Xaa Val Xaa Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215 220
<210> 11
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa at position 1 is Phe, Gln, or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Val or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Glu, Tyr, Gln, or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa at position 25 is His or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa at position 27 is Gly, Thr, Ser, His, Val, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa at position 28 is Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa at position 29 is Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa at position 30 is Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa at position 31 is Gly, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa at position 33 is Gly, Ser, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa at position 47 is Thr or Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa at position 51 is Asp, Tyr, Gln, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa at position 58 is Gly, Asn, Ser or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa at position 59 is any naturally occurring amino acid, or is
absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> Xaa at position 64 is Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(69)
<223> Xaa at position 69 is Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(74)
<223> Xaa at position 74 is Gln or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> Xaa at position 79 is Gly, Glu, Gln, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa at position 80 is Gly or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa at position 81 is Gly or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa at position 82 is Glu or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(90)
<223> Xaa at position 90 is Glu or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa at position 91 is Ala and Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(94)
<223> Xaa at position 94 is Gly or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (125)..(125)
<223> Xaa at position 125 is Gln or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (157)..(157)
<223> Xaa at position 157 is Tyr or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (166)..(166)
<223> Xaa at position 166 is Leu or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (187)..(187)
<223> Xaa at position 187 is Ser or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (188)..(188)
<223> Xaa at position 188 is Ser or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (196)..(196)
<223> Xaa at position 196 is Ala or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (212)..(212)
<223> Xaa at position 212 is Gln or Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (254)..(254)
<223> Xaa at position 254 is Val or Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (266)..(266)
<223> Xaa at position 266 is Arg or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (276)..(276)
<223> Xaa at position 276 is Glu or Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (302)..(302)
<223> Xaa at position 302 is Leu or Pro
<400> 11
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
20 25 30
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Xaa Cys
35 40 45
Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa Xaa Ala Gly Xaa Pro Ser
85 90 95
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
100 105 110
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Xaa Glu Asp Pro
115 120 125
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
130 135 140
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Xaa Arg Val Val
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Val Xaa His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
165 170 175
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Xaa Xaa Ile Glu Lys Thr
180 185 190
Ile Ser Lys Xaa Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
195 200 205
Pro Pro Ser Xaa Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
210 215 220
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
225 230 235 240
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Xaa Leu Asp
245 250 255
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Xaa Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Xaa Gly
290 295 300
<210> 12
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
115 120 125
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
145 150 155 160
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
165 170 175
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
180 185 190
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
210 215 220
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 16
<211> 300
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 16
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Glu Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
165 170 175
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
245 250 255
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
260 265 270
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
275 280 285
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 17
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 17
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
85 90 95
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
100 105 110
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
115 120 125
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
145 150 155 160
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170 175
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
180 185 190
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
210 215 220
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 18
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 18
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Cys Pro Pro
65 70 75 80
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
85 90 95
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
100 105 110
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
115 120 125
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
130 135 140
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
145 150 155 160
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
165 170 175
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
180 185 190
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
195 200 205
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
210 215 220
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
225 230 235 240
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
245 250 255
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
260 265 270
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
275 280 285
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 19
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 19
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
85 90 95
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
100 105 110
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
115 120 125
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
145 150 155 160
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170 175
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
180 185 190
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
210 215 220
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 20
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 20
Phe Val Gly Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
85 90 95
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
100 105 110
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
115 120 125
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
145 150 155 160
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170 175
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
180 185 190
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
210 215 220
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 21
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 21
Ala Gly Gly Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Glu Cys Pro Pro
65 70 75 80
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
85 90 95
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
100 105 110
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
115 120 125
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
130 135 140
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
145 150 155 160
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
165 170 175
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
180 185 190
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
195 200 205
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
210 215 220
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
225 230 235 240
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
245 250 255
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
260 265 270
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
275 280 285
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 22
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 22
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys Thr Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
115 120 125
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
145 150 155 160
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
165 170 175
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
180 185 190
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
210 215 220
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 23
<211> 298
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 23
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Glu Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Pro
65 70 75 80
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
85 90 95
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
100 105 110
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
115 120 125
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
130 135 140
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
145 150 155 160
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
165 170 175
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
180 185 190
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
195 200 205
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
210 215 220
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
225 230 235 240
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
245 250 255
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
260 265 270
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
275 280 285
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 24
Phe Val Gly Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
115 120 125
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
145 150 155 160
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
165 170 175
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
180 185 190
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
210 215 220
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
Claims (37)
- a) 화학식 Z1-Z2-Z3을 갖는 인슐린 수용체 효능제이며, 여기서
i) Z1이 아미노산 서열:
을 포함하는 인슐린 B-쇄 유사체이며, 여기서 X1은 F, Q 또는 A이고; X2는 V 또는 G이고; X3은 N, K, D, G, Q, A 또는 E이고; X4는 E, Y, Q, 또는 H이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 G, T, S, H, V이거나 또는 부재하고; X7은 G, E, P, K, D, S, H이거나 또는 부재하고; X8은 G, E, K, P, Q, D, H이거나 또는 부재하고; X9는 G, T, S, E, K, A이거나 또는 부재하며, 단 인슐린 B-쇄 유사체는 X4, X5, X6, X7, X8, 또는 X9에서 인간 인슐린의 분자의 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고 (서열식별번호: 1);
ii) Z2가 5 내지 10개의 아미노산을 포함하는 제1 펩티드 링커이며, 여기서 상기 아미노산 중 적어도 5개는 G 잔기이고;
iii) Z3이 아미노산 서열:
을 포함하는 인슐린 A-쇄 유사체이며, 여기서 X1은 T 또는 I이고; X2는 D, Y, Q 또는 E이고; X3은 G, N, S 또는 A이고; X4는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재하며, 단 X3이 N인 경우, X4는 G 또는 N 이외의 아미노산이어야 하는 것 (서열식별번호: 2)인 인슐린 수용체 효능제;
b) 10 내지 25개의 아미노산을 갖는 링커이며, 여기서 상기 아미노산 중 적어도 50%는 G 잔기인 제2 펩티드 링커; 및
c) 인간 IgG Fc 영역
을 포함하며, 여기서 인슐린 수용체 효능제의 C-말단 잔기는 제2 펩티드 링커의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합되고, 제2 펩티드 링커의 C-말단 잔기는 인간 IgG Fc 영역의 N-말단 잔기에 직접적으로 융합되는 것인 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
인슐린 B-쇄 유사체가 서열식별번호: 1의 X4 또는 X5에서 인간 인슐린 B-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하고;
인슐린 A-쇄 유사체가 서열식별번호: 2의 X1 또는 X2에서 인간 인슐린 A-쇄의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 변형을 포함하는 것인 융합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
인슐린 B-쇄 유사체가 서열식별번호: 1의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 F이고; X2는 V이고; X3은 N 또는 D이고; X4는 E이고; X5는 H이고;
인슐린 A-쇄 유사체가 서열식별번호: 2의 서열을 포함하며, 여기서 X1은 I 또는 T이고; X2는 D이고; X3은 G이고; X4는 부재하는 것인 융합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 인슐린 B-쇄 유사체가 서열식별번호: 1의 서열을 포함하며, 여기서 X6-X9는 각각 G인 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 펩티드 링커가 하기 아미노산 서열:
X1GX2GGGG
을 포함하며, 여기서 X1은 G이거나 또는 부재하고; X2는 G, S이거나 또는 부재하는 것 (서열식별번호: 3)인 융합 단백질. - 제5항에 있어서, 서열식별번호: 3의 X1 및 X2가 각각 G 및 S인 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인슐린 수용체 효능제가 하기 아미노산 서열:
(서열식별번호: 5)을 갖는 것인 융합 단백질.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 펩티드 링커가 서열 [GGGGX]n을 갖는 펩티드를 포함하며, 여기서 X는 Q, E 또는 S이고; n은 2-5인 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 펩티드 링커가 하기 아미노산 서열:
을 포함하며,
X1은 Q 또는 E이고;
X2는 Q 또는 E이고;
X3은 Q 또는 E이고;
X4는 G, E, Q이거나 또는 부재하고;
X5는 G이거나 또는 부재하고;
X6은 G이거나 또는 부재하는 것 (서열식별번호: 6)인 융합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 펩티드 링커가 하기 아미노산 서열:
(서열식별번호: 7)을 갖는 것인 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IgG Fc 영역이 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 Fc 영역인 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IgG Fc 영역이 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
- 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 2개의 융합 단백질의 동종이량체.
- 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 2개의 융합 단백질의 동종이량체, 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는, 당뇨병의 치료를 위한 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, 1종 이상의 완충 작용제, 1종 이상의 계면활성제, 및 1종 이상의 등장성 작용제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, 시트레이트, 시트르산, 폴리소르베이트 80, 및 만니톨을 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, pH 범위가 5.5 내지 8.0인 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, pH 범위가 6.0 내지 6.75인 제약 조성물.
- 제16항에 있어서, 추가의 활성 성분을 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제21항에 있어서, 추가의 활성 성분이 인크레틴-기반 요법인 제약 조성물.
- 제22항에 있어서, 인크레틴-기반 요법이 GLP-1R 효능제인 제약 조성물.
- 제23항에 있어서, GLP-1R 효능제가 둘라글루티드인 제약 조성물.
- 제15항의 동종이량체 및 둘라글루티드를 포함하는 제약 조성물.
- 삭제
- 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, 당뇨병의 치료를 위한 제약 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, 추가의 활성 성분과 동시, 개별 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한, 당뇨병의 치료를 위한 제약 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, 둘라글루티드와 동시, 개별 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한, 당뇨병의 치료를 위한 제약 조성물.
- 제15항의 동종이량체를 포함하는, 둘라글루티드와 동시, 개별 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한, 당뇨병의 치료를 위한 제약 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
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