BR112021005419A2 - conjugado que compreende um ou mais polímeros hidrofílicos, uso do mesmo e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

CONJUGADO QUE COMPREENDE UM OU MAIS POLÍMEROS HIDROFÍLICOS, USO DO MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção se refere a uma inédita proteína de fusão GLP-1 e um conjugado da mesma, uma composição farmacêutica contém os mesmos, e um uso dos mesmos na redução do açúcar no sangue ou do peso corporal, especialmente para tratar diabetes, em particular diabetes tipo II.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CONJUGADO QUE COMPREENDE UM OU MAIS POLÍMEROS HIDROFÍLICOS, USO DO MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Chinês
201811125762.9, depositado em 26 de setembro de 2018, e intitulado como “PROTEÍNA DE FUSÃO GLP1-Fc E CONJUGADO DA MESMA”, e cujas revelações são, pelo presente, incorporadas pela referência em sua íntegra.
CAMPO DA TÉCNICA
[002] A presente invenção se refere a proteínas de fusão de polipeptídeo biologicamente ativas e seus conjugados de polímero que têm longa meia-vida in vivo, especialmente agonistas de receptor de GLP-1 que têm longa meia-vida in vivo, composições farmacêuticas que contêm os mesmos, e o uso dos mesmos na redução da glicose sanguínea (especialmente, no tratamento de diabetes, em particular diabetes tipo II) e no controle do peso corporal.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[003] Com o desenvolvimento da economia, a extensão da expectativa de vida média da população e a mudança do estilo de vida, a diabetes se tornou um principal problema de cuidados com a saúde em todo o mundo. Seja em países desenvolvidos ou em desenvolvimento, a incidência de diabetes está aumentando bruscamente. Em 2007, houve aproximadamente 246 milhões de pacientes diabéticos globalmente, e um paciente diabético morreu a cada 10 segundos. Estima-se que, em 2025, o número de pacientes diabéticos globais irá alcançar 333 milhões. A China se tornou o "epicentro" da diabetes com 40 milhões de pacientes diabéticos atualmente e cerca de 5 % de incidência de diabetes, e é o segundo maior país do mundo para a diabetes (o primeiro é a Índia). Há dois tipos de diabetes, diabetes dependente de insulina (diabetes tipo I) e diabetes não dependente de insulina (diabetes tipo II), em que a diabetes tipo II responde por mais do que 90 % de pacientes diabéticos. A diabetes tipo II se apresenta como desregulação da secreção ou efeito da insulina e disfunção da célula β, o que leva à disfunção metabólica de gordura, carboidrato e proteína, resultando em hiperglicemia crônica e, em última análise, causando várias complicações microvasculares, macrovasculares e de vários órgãos. Hoje em dia, há dois tipos de fármacos para controlar a diabetes: 1) fármacos de estímulo à secreção da insulina, tais como sulfonilureias, meglitinidas, inibidores de dipeptidil peptidase, e análogos de GLP-1; e 2) fármacos sem estímulo à secreção da insulina, tais como insulina, inibidores de α-glucosidase, biguanidas, tiazolidinedionas, análogos de insulina, etc. Atualmente, muitos fármacos de tratamento de diabetes tradicionais usados clinicamente são impotentes para os pacientes com diabetes tipo II. Estes fármacos falham ao suprimir a progressiva deterioração das células β da ilhota, para reduzir o nível de hemoglobina glicosilada (HbA1c) no sangue, ou para impedir as complicações de diabetes, tais como doença cardíaca e falha renal, e estes fármacos são acompanhados por variados graus de efeitos colaterais. Portanto, é necessário desenvolver um fármaco inédito para o tratamento da diabetes tipo II.
[004] O hormônio intestinal peptídeo tipo glucagon-1 (GLP-1) foi identificado em 1985, que é expressado pelo gene proglucagon depois de comer e principalmente secretado pelas células L da mucosa intestinal. O GLP-1 pode estimular as células β da ilhota a secretar a insulina (J Med Chem, 47, 4128-4134, 2004) e desempenha um importante papel na estabilização dos níveis da glicose sanguínea. A administração exógena de GLP-1 pode normalizar o nível da glicose sanguínea em pacientes com diabetes tipo II (Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16, 390-410, 1996; e Diabetologia, 28, 565-573, 1985). O GLP-1 tem as seguintes funções: agir nas células β da ilhota de uma maneira dependente de glicose, promover a transcrição do gene da insulina, aumentar a biossíntese e a secreção de insulina, estimular a proliferação e a diferenciação das células β, inibir a apoptose da célula β e, desse modo, aumentar o número de células β da ilhota, inibir a secreção de glucagon, aumentar a sensibilidade dos receptores de insulina das células periféricas, reduzir HbA1c, suprimir o apetite e a alimentação, e atrasar o esvaziamento gástrico (Diabetic Med, 18, 144-149, 2001; Diabetes, 51, 1443-1452,
2002; Diabetologia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1553, 1996; Am. J. Physicl Endocrinol. Metab, 281, E242-247, 2001; Patentes US 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; e Diabetes, 44, 1295, 1995). Entretanto, o GLP-1 é facilmente degradado por dipeptidil peptidase (DPPIV) in vivo com uma meia-vida de menos do que 2 minutos, e assim, dificilmente pode se tornar um efetivo fármaco antidiabético.
[005] Devido à curta meia-vida e fracas estabilidade física e química, os fármacos de peptídeo são facilmente degradados por várias proteases in vivo, de forma que os mesmos usualmente exijam múltiplas injeções em um dia, o que traz ônus físico, mental e financeiro aos pacientes, e limita sua conformidade ao fármaco. Portanto, há uma urgente necessidade na tecnologia para fármacos com estruturas inéditas para estender seus ciclos plasmáticos e aumentar sua exposição sistêmica ao fármaco.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Depois de anos de pesquisa e experimentos de longo prazo, os inventores descobriram que, depois da fusão de um polipeptídeo com um parceiro de fusão (por exemplo, fragmento Fc, albumina, XTEN ou transferrina) que é capaz de estender a meia-vida do polipeptídeo para gerar uma proteína de fusão, e adicional conjugação com um polímero hidrofílico (tal como polialquileno glicol, especificamente PEG), isto pode aumentar efetivamente a estabilidade in vivo dos polipeptídeos biologicamente ativos e melhorar a eficácia dos fármacos. A presente invenção foi concluída com base na descoberta exposto.
[007] No primeiro aspecto, a presente invenção provê uma proteína de fusão de um agonista de receptor de GLP-1, compreendendo um agonista de receptor de GLP- 1 e um parceiro de fusão (FP) capaz de estender a meia-vida da proteína de fusão in vivo, em que o agonista de receptor de GLP-1 e o parceiro de fusão são ligados diretamente ou através um primeiro adaptador L1.
[008] Preferivelmente, o primeiro adaptador L1 é um peptídeo que contém 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácidos; mais preferivelmente, o primeiro adaptador L1 é um peptídeo flexível que contém A, T, G e/ou S, tal como (GS)n, em que n é um número inteiro de 1 a 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10.
[009] O mais preferivelmente, o primeiro adaptador L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 13), PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14), SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15), SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16), SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 17) e GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).
[010] Em uma modalidade, o agonista de receptor de GLP-1 é um comprimento completo, truncado ou variante de GLP-1 ou análogo de GLP-1, por exemplo, Exendina-4, GLP-1(1-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, ou semaglutida.
[011] Em uma outra modalidade, o parceiro de fusão (FP) é um comprimento completo, truncado ou variante do fragmento Fc da imunoglobulina, albumina, XTEN ou transferrina; preferivelmente, o fragmento Fc é derivado a partir de um fragmento Fc da imunoglobulina humana; preferivelmente, o fragmento Fc é composto por um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em domínio CH1, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CH4; preferivelmente, o fragmento Fc é derivado a partir do fragmento Fc de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM, mais preferivelmente, do fragmento Fc de IgG; mais preferivelmente, o fragmento Fc é derivado a partir do fragmento Fc de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, e mais preferivelmente, o fragmento Fc de IgG tem reduzidos efeito ADCC e/ou efeito CDC e/ou afinidade de ligação intensificada a FcRn.
[012] Em ainda uma outra modalidade, o parceiro de fusão (FP) também é ligado diretamente ou por meio de um segundo adaptador L2 a uma sequência de ST que contém um sítio de reconhecimento de sortase, e em que a sortase é, por exemplo, sortase A ou sortase B; preferivelmente, o ST contém o sítio de reconhecimento central LPXTG de sortase A, em que X é qualquer aminoácido, e o ST é tais como LPETG, LPETGG ou LPETGGG; mais preferivelmente, o ST contém adicionalmente uma etiqueta de afinidade ligada no sítio de reconhecimento de sortase, e o ST é, por exemplo, LPETGGHHHHHH ou LPETGGWSHPQFEK.
[013] Em que o segundo adaptador L2 é um peptídeo que contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácidos.
[014] Mais preferivelmente, o segundo adaptador L2 é um peptídeo flexível que contém A, T, G e/ou S, tal como (GS)n, em que n é um número inteiro de 1 a 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10; e o mais preferivelmente, o segundo adaptador L2 é selecionado a partir do grupo que consiste em: GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18), GGGGS (SEQ ID NO: 19), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20), e GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21).
[015] Em uma outra modalidade, a proteína de fusão tem uma estrutura de GLP- 1-L1-FP-L2-ST, em que GLP-1 representa o agonista de receptor de GLP-1, e o agonista de receptor de GLP-1, L1, L2, FP e ST tem a mesma definição, como exposto, e em que qualquer um ou ambos de L1 e L2 podem não estar presentes.
[016] Em uma modalidade específica, a sequência de aminoácido da proteína de fusão é apresentada em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, ou 22; ou a proteína de fusão é codificada pela sequência de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, ou 23.
[017] No segundo aspecto da presente invenção, um conjugado é provido, em que um, dois ou mais polímeros hidrofílicos são anexados na extremidade da proteína de fusão do primeiro aspecto, preferivelmente, o polímero hidrofílico é anexado no sítio de reconhecimento de sortase por meio de uma reação de transpeptidação, em particular, a proteína de fusão pode ser em uma forma de monômero ou dímero.
[018] Em uma modalidade, os um, dois ou mais polímeros hidrofílicos são, cada qual, independentemente selecionados a partir de polissacarídeo e polialquileno glicol, tais como polipropileno glicol e polietileno glicol; o polialquileno glicol pode ser capeado na extremidade, por exemplo, capeado com grupo alcóxi, tal como grupo metóxi, e/ou o polialquileno glicol é linear ou ramificado, e, por exemplo, o grupo de polialquileno é ramificado, tal como polietileno glicol ramificado, especialmente, polietileno glicol ramificado capeado com grupo metóxi; o peso molecular do polialquileno glicol pode ser ≥ 1, ≥ 10, ≥ 20, ≥ 30, ≥ 40, ≥ 50, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, ≥ 90, ≥ 100, ≥ 110, ≥ 120, ≥ 130, ≥ 140, ≥ 150, ou ≥ 160 kDa, por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 kDa, ou um valor entre quaisquer dois dos valores; e, preferivelmente, o peso molecular do polímero hidrofílico é 20 kDa ou 40 kDa.
[019] O terceiro aspecto da presente invenção é prover um método para produzir o conjugado descrito no segundo aspecto, que compreende contatar a proteína de fusão descrita no primeiro aspecto com sortase (tais como sortase A ou sortase B) e o polímero hidrofílico, em que uma extremidade do polímero hidrofílico tem um grupo amina que pode ser amidado pela sortase.
[020] Em uma modalidade, uma extremidade do polímero hidrofílico contém poli- Gly, tal como GGGAA.
[021] O quarto aspecto da presente invenção é para prover uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade efetiva da proteína de fusão descrita no primeiro aspecto e/ou do conjugado descrito no segundo aspecto, e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável.
[022] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é para uso na redução da glicose sanguínea ou do peso corporal, por exemplo, no tratamento de diabetes, mais especificamente, no tratamento de diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II, especialmente no tratamento de diabetes tipo II.
[023] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica é em uma forma de preparação líquida ou preparação liofilizada.
[024] O quinto aspecto da presente invenção é para prover o uso da proteína de fusão descrita no primeiro aspecto ou do conjugado descrito no segundo aspecto para a fabricação de um medicamento para reduzir a glicose sanguínea ou o peso corporal, por exemplo, o medicamento é para uso no tratamento de diabetes, incluindo diabetes tipo I e diabetes tipo II, especialmente diabetes tipo II.
[025] O sexto aspecto da presente invenção é para prover um método para reduzir a glicose sanguínea ou o peso corporal, compreendendo administrar a proteína de fusão descrita no primeiro aspecto ou o conjugado descrito no segundo aspecto em um sujeito com necessidade dos mesmos, por exemplo, para tratar diabetes, incluindo diabetes tipo I e diabetes tipo II, especialmente diabetes tipo II.
[026] O sétimo aspecto da presente invenção é para prover um kit que compreende a proteína de fusão descrita no primeiro aspecto, o conjugado descrito no segundo aspecto e/ou a composição farmacêutica descrita no quarto aspecto, e as instruções para uso opcionais.
[027] Os inventores descobriram que o conjugado GLP-1-Fc da presente invenção pode prover um efeito hipoglicêmico surpreendentemente de longo prazo. Além do mais, se comparado com os fármacos similares existentes, o conjugado GLP- 1-Fc da presente invenção pode reduzir significativamente a rápida perda de peso corporal causada por tomar fármacos hipoglicêmicos, de forma que a segurança clínica dos fármacos seja enormemente melhorada, e, portanto, tenha grande valor de aplicação clínica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[028] A figura 1A mostra a estrutura do vetor da expressão eucariótica da proteína de fusão GLP-1 e a figura 1B mostra os resultados do teste da curva de crescimento e viabilidade da célula da linha celular estável GLP1-L1-Fc2-L2-ST (número de clone: P1-3G3C2) durante a fermentação.
[029] A figura 2 mostra os resultados do exame microscópico da linha celular estável GLP1-L1-Fc2-L2-ST (número de clone: P1-3G3C2) em diferentes pontos no tempo durante a fermentação. A figura 2A é a imagem das células no dia 5 do cultivo, e a figura 2B mostra as células quando coletadas (dia 13).
[030] A figura 3 mostra o metabolismo da glicose no supernatante da cultura da linha celular estável GLP1-L1-Fc2-L2-ST (número de clone: P1-3G3C2) durante a fermentação.
[031] A figura 4 mostra os metabolismos de NH4+ e lactose (Lac) no supernatante da cultura da linha celular estável GLP1-L1-Fc2-L2-ST (número de clone: P1-3G3C2) durante a fermentação.
[032] A figura 5 mostra os resultados da eletroforese da proteína GLP1-L1-Fc2- L2-ST em gel não reduzido (esquerda: M/1/2/3) e gel reduzido (direita: 4/5/6/M). 1 e 6: supernatante do caldo de fermentação terminal; 3 e 4: amostras depois da purificação; 2 e 5: amostras do caldo de fermentação no dia 10.
[033] A figura 6 mostra os resultados do teste de eletroforese SDS (A) e análise SEC (B) da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST purificada.
[034] A figura 7 mostra os resultados do teste de eletroforese SDS e análise RPC da taxa de reticulação das duas proteínas. A figura 7A e a figura 7C são o gel SDS da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST reticulado com 20 kDa e 40 kDa de PEG, respectivamente; a figura 7B e a figura 7D são os resultados de RPC da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST reticulada com 20 kDa e 40 kDa de PEG, respectivamente; e a figura 7E é o resultado de RPC da proteína GLP1-L1-Fc2-ST reticulada com 40 kDa de PEG.
[035] A figura 8 mostra os resultados do cromatograma por troca de ânion (A) e teste RPC (B) de GLP1-L1-Fc2-L2-ST depois da reticulação.
[036] A figura 9 mostra os resultados do teste de atividade de GLP1-L1-Fc2-L2-
ST reticulado com 20 kDa de PEG e 40 kDa de PEG, respectivamente. Comparado com dulaglutida, a atividade relativa do substrato não reticulado (GLP1-Fc) é 98,10 %. As atividades de ambos os produtos reticulados com PEG diminuíram, em que a atividade relativa do produto reticulado com 20 kDa de PEG (PEG (20 kDa)-GLP1-Fc) é 40,38 % e a atividade relativa do produto reticulado com 40 kDa de PEG (PEG (40 kDa)-GLP1-Fc) é 32,85 %.
[037] A figura 10A mostra a curva de resposta do teste de tolerância à glicose em camundongos C57BL/6 depois de 24 h de administração; a figura 10B mostra o efeito de 24 h depois da administração na tolerância à glicose dos camundongos C57BL/6 (AUC); a figura 10C mostra a curva de resposta do teste de tolerância à glicose em camundongos C57BL/6 depois de 144 h de administração; a figura 10D mostra o efeito de 144 h depois da administração na tolerância à glicose de camundongos C57BL/6 (AUC); a figura 10E mostra a curva de resposta do teste de tolerância à glicose em camundongos C57BL/6 depois de 168 h de administração; a figura 10F mostra o efeito de 168 h depois da administração na tolerância à glicose de camundongos C57BL/6 (AUC); a figura 10G mostra a curva de resposta do teste de tolerância à glicose em camundongos C57BL/6 depois de 192 h de administração; a figura 10H mostra o efeito de 192 h depois da administração na tolerância à glicose de camundongos C57BL/6 (AUC); a figura 10I mostra a curva de resposta do teste de tolerância à glicose em camundongos C57BL/6 depois de 216 h de administração; a figura 10J mostra o efeito de 216 h depois da administração na tolerância à glicose de camundongos C57BL/6 (AUC); a figura 10K mostra a curva de resposta do teste de tolerância à glicose em camundongos C57BL/6 depois de 240 h de administração; a figura 10L mostra o efeito de 24 0h depois da administração na tolerância à glicose de camundongos C57BL/6 (AUC); e a figura 10M mostra as mudanças de peso corporal dos camundongos C57BL/6 depois da administração.
[038] A figura 11 mostra a curva de crescimento e a viabilidade da célula da linha celular estável GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (número de clone: P1-P132C7) durante a fermentação em batelada alimentada.
[039] A figura 12 mostra as imagens microscópicas de células estáveis GLP1-L1- Fc4-L2-STG3 (número de clone: P1-P132C7) em diferentes pontos no tempo durante a fermentação em batelada alimentada. A figura 12A mostra as células no dia 5 do cultivo, e a figura 12B mostra as células quando coletadas (dia 13).
[040] A figura 13 mostra o metabolismo da glicose no supernatante da cultura da linha celular estável GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (número de clone: P1-P132C7) durante a fermentação em batelada alimentada.
[041] A figura 14 mostra a tendência do pH da linha celular estável GLP1-L1-Fc4- L2-STG3 (número de clone: P1-P132C7) em um biorreator de 15 L durante a fermentação em batelada alimentada.
[042] A figura 15 mostra os resultados da eletroforese SDS-PAGE da proteína alvo GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 no supernatante do caldo de fermentação em batelada alimentada 15L. A pista 1 é a amostra purificada, a pista 2 é o marcador de proteína, e as pistas 3, 4 e 5 são o supernatante do caldo de fermentação nos 12º, 13º e 14º dias.
[043] A figura 16 mostra os resultados de eletroforese SDS-PAGE (A) e análise SEC (B) da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 purificada.
[044] A figura 17 mostra os resultados da eletroforese SDS-PAGE e da análise RPC da taxa de reticulação das duas proteínas. A figura 17A é o teste SDS da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 reticulada com 40 kDa de PEG, e a figura 17B é o teste RPC da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 reticulada com 40 kDa de PEG.
[045] A figura 18 mostra os resultados do cromatograma por troca de ânion (A) e do teste SEC (B, C) de GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 depois da reticulação.
[046] A figura 19 mostra os resultados do teste de atividade de GLP1-L1-Fc4-L2- STG3 reticulado com 40 kDa de PEG. A atividade relativa do substrato não reticulado (GLP1-Fc) em relação à dulaglutida é 112,24 %. A atividade do produto reticulado com PEG diminuiu, em que a atividade relativa de GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 reticulado com 40 kDa de PEG (PEG (40 kDa)-GLP1-Fc) é 21,51 %.
[047] A figura 20A mostra a tolerância à glicose dos camundongos C57BL/6
(AUC) 1-8 dias depois da administração, e a figura 20B mostra as mudanças de peso corporal dos camundongos C57BL/6 depois da administração.
[048] A figura 21A mostra o efeito na glicose sanguínea dos camundongos diabéticos tipo II induzidos por STZ 1-12 dias depois da administração, e a figura 21B mostra as mudanças de peso corporal dos camundongos diabéticos tipo II depois da administração.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[049] O termo usado neste pedido tem o mesmo significado da tecnologia anterior. A fim de definir o significado dos termos usados, o significado específico de alguns termos neste pedido é dado a seguir. Quando a definição aqui exposta conflitar com o significado convencional do termo, a definição aqui exposta deve prevalecer.
[050] O termo "aminoácido" da forma aqui usada se refere a aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, e análogos de aminoácido e todos os seus estereoisômeros D e L. O aminoácido não natural inclui, mas sem limitações, ácido azetidina carboxílico, 2-aminoadipato, 3-aminoadipato, β-alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6- aminocaproico, ácido 2-amino-heptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3- aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, terc-butilglicina, ácido 2,4- diaminoisobutírico, ácido 2,2’-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etil glicina, N-etil asparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N- metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. Os análogos de aminoácido incluem os aminoácidos naturais e os aminoácidos não naturais cujo grupo carboxila C-terminal, grupo amina N-terminal ou grupo de cadeia lateral é quimicamente capeado na extremidade reversivelmente ou irreversivelmente, ou quimicamente modificado em um outro grupo funcional, tais como sulfóxido de metionina, sulfona de metionina, S-(carboximetil)-cisteína, sulfóxido de S-(carboximetil)-cisteína e sulfona de S-(carboximetil)-cisteína.
[051] Os termos "polipeptídeo" ou "proteína" aqui usados intercambiavelmente se referem a um composto de pelo menos dois resíduos de aminoácido conectados um no outro por ligações covalentes (tais como ligações de peptídeo), que podem ser polipeptídeos recombinantes, polipeptídeos naturais ou polipeptídeos sintéticos. Além do mais, o "polipeptídeo" ou a "proteína" da presente invenção também se referem às variantes ou análogos dos mesmos, isto é, polipeptídeos que variam na sequência de aminoácido em uma ou mais substituições, deleções, inserções, fusões, truncamentos, ou qualquer combinação dos mesmos. Uma variante de polipeptídeo pode ser completamente funcional ou pode carecer de uma ou mais atividades. As variantes completamente funcionais podem conter, por exemplo, apenas substituições ou mudanças conservadoras em resíduos não críticos ou em regiões não críticas. As variantes funcionais também podem conter substituições de aminoácidos similares, que resultam em função inalterada ou mudanças insignificantes na função. Os aminoácidos essenciais para a função podem ser identificados por métodos conhecidos na tecnologia, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de glicina (Cunningham, B. and Wells, J., Science, 244: 1081-1085, 1989). Os sítios chaves para a atividade de polipeptídeo podem ser determinados, por exemplo, por análise estrutural, tais como cristalização, ressonância magnética nuclear ou rótulo de fotoafinidade (Smith, L., et al., J. Mol. Biol., 224:899-904, 1992; and de Vos, A. et al., Science, 255: 306-312, 1992).
[052] O termo "conjugado" aqui usado se refere a um produto formado por um polipeptídeo ou uma variante de polipeptídeo covalentemente ou não covalentemente ligada no grupo de modificação aqui descrito.
[053] No geral, o termo "polímero" aqui usado tem o significado comumente entendido por aqueles versados na técnica, e se refere tanto ao próprio polímero quanto a seus derivados modificados no terminal, a menos que explicitamente declarado de outra forma.
[054] Além do mais, para o polímero, tal como polietileno glicol, há muitas maneiras de determinar seu peso molecular. Já que os polímeros são compostos por moléculas com diferentes graus de polimerização em uma certa faixa de distribuição, os pesos moleculares dos polímeros são, no geral, representados por seu peso molecular médio, especificamente, peso molecular médio numérico ou peso molecular médio em peso. Embora o peso molecular médio numérico e o peso molecular médio em peso possam ter alguns desvios quando o grau de polimerização dos polímeros diferir enormemente, para os polímeros com uma faixa de distribuição estreita, os dois tendem a ser iguais. A menos que de outra forma especificada, para os polímeros, tal como o polietileno glicol aqui mencionado, quando se refere ao seu peso molecular, o mesmo pode ser tanto o peso molecular médio em peso quanto o peso molecular médio numérico. AGONISTA DO RECEPTOR DE GLP-1
[055] Os peptídeos tipo glucagon incluem o peptídeo tipo glucagon-1 (GLP-1) e o peptídeo tipo glucagon-2 (GLP-2), ambos os quais são derivados a partir de proglucagon, que consiste em 158 aminoácidos e pode ser clivado em diferentes cadeias de peptídeo. Já que o GLP-1 tem os efeitos farmacológicos de promoção da secreção da insulina, proteção das células β da ilhota, inibição da secreção de glucagon e esvaziamento gástrico, e redução do apetite, o mesmo pode ser clinicamente usado no tratamento da diabetes tipo II e da obesidade. O GLP-2 é um fator nutricional que promove o crescimento do intestino delgado, inibe a apoptose celular, promove o esvaziamento gástrico, e aumenta o apetite, portanto, o mesmo pode ser clinicamente usado no tratamento da síndrome do intestino curto. O GLP-1 biologicamente ativo no corpo humano é, principalmente, GLP-1(7-36) amida e GLP- 1(7-37). O GLP-1 natural (com meia-vida de menos do que 5 min) é facilmente hidrolisado e inativado por dipeptidil peptidase IV (DPP-IV), portanto, é difícil que seja usado em clínica.
[056] O termo " agonista do receptor de GLP-1" se refere a uma molécula capaz de ativar o receptor de GLP-1, tal como o GLP-1 de ocorrência natural derivado a partir de diferentes fontes, tais como seres humanos ou animais, e as variantes, fragmentos e análogos funcionais formados por um ou mais (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) substituições, deleções e/ou adições de aminoácido das sequências tipo selvagem de agonistas de receptor de GLP-1 naturais (tais como GLP-1 e Exendina-4), por exemplo, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, semaglutida, etc. PROTEÍNA DE FUSÃO DE GLP-1
[057] O agonista do receptor de GLP-1 (tais como GLP-1 e as variantes e os fragmentos funcionais do mesmo) é ligado em um parceiro de fusão capaz de aumentar a meia-vida, tal como o fragmento Fc da imunoglobulina humana, para formar uma proteína de fusão. As proteínas de fusão na presente invenção são referidas como "proteína de fusão com atividade do agonista de receptor de GLP-1" ou "proteína de fusão do GLP-1".
[058] A imunoglobulina humana IgG é composta por quatro polipeptídeos (duas cópias idênticas de cadeia leve e cadeia pesada) covalentemente ligados por ligações de dissulfeto. A proteólise das moléculas IgG por papaína produz dois fragmentos Fab e um fragmento Fc. O fragmento Fc é composto por dois polipeptídeos ligados em conjunto por ligações de dissulfeto. Cada polipeptídeo, do N-terminal ao C-terminal, consiste em região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3. A estrutura do fragmento Fc é quase a mesma em todos os subtipos de imunoglobulina humana. IgG é uma das proteínas das mais abundantes no sangue humano, que constitui 70 % a 75 % da imunoglobulina total no soro humano.
[059] A meia-vida em circulação de IgG, que é a mais longa entre todos os cinco tipos de imunoglobulinas, pode alcançar 21 dias. Foi relatado combinar a região Fc de IgG com outras proteínas (tais como várias citocinas e receptores solúveis) para formar as proteínas de fusão (Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14: 52-60, 1996; e Patentes US 5.116.964 e 5.541.087). Uma típica proteína de fusão é uma proteína dimérica ligada pelos resíduos de cisteína na região de dobradiça Fc de IgG para formar uma molécula similar a IgG, mas carecendo do domínio CH1 e da cadeia leve. Devido à homologia estrutural, as propriedades farmacocinéticas in vitro da proteína de fusão Fc são bastante similares àquelas do isótipo de IgG humana. Portanto, construir as proteínas de fusão hGH ligadas na região Fc de IgG humana irá ajudar a estender a meia-vida em circulação de hGH e/ou aumentar sua atividade biológica.
[060] A região Fc da imunoglobulina é segura de ser usada como um carreador farmacêutico em virtude de a mesma ser um polipeptídeo biodegradável que pode ser metabolizado no corpo. Além do mais, se comparado com a íntegra da molécula da imunoglobulina, a região Fc da imunoglobulina tem um peso molecular relativamente baixo, o que é benéfico para a preparação, a purificação e a produção do conjugado. Já que a região Fc da imunoglobulina não contém o fragmento Fab (sua sequência de aminoácido varia de acordo com a subclasse do anticorpo e é, portanto, altamente heterogênea), espera-se que a região Fc da imunoglobulina possa aumentar enormemente a homogeneidade da substância e tenha baixa antigenicidade.
[061] O termo "região Fc da imunoglobulina" ou “fragmento Fc”, da forma usada na presente invenção, se refere a uma proteína que contém região constante em cadeia pesada 2 (CH2) e região constante em cadeia pesada 3 (CH3), mas não região variável em cadeia pesada e cadeia leve, região constante em cadeia pesada 1 (CH1) e região constante em cadeia leve 1 (CL1). A mesma também pode conter a região de dobradiça na região constante em cadeia pesada. Além do mais, o fragmento Fc usado na presente invenção pode conter parte da ou a íntegra da região Fc que contém a região constante em cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante em cadeia leve 1 (CL1) sem regiões variáveis em cadeia pesada e em cadeia leve, desde que o mesmo tenha uma função fisiológica que é basicamente similar à ou melhor do que aquela da proteína natural. Além do mais, o mesmo pode ser um fragmento Fc com uma deleção relativamente longa das sequências de aminoácido de CH2 e/ou CH3. Portanto, a região Fc da imunoglobulina usada na presente invenção pode compreender 1) domínio CH1, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CH4; 2) domínio CH1 e domínio CH2; 3) domínio CH1 e domínio CH3; 4) domínio CH2 e domínio CH3; 5) a combinação de um ou mais domínios com (parte da ou a íntegra da) região de dobradiça da imunoglobulina; ou 6) o dímero de quaisquer domínios da região constante em cadeia pesada e da região constante em cadeia leve.
[062] Além disto, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção compreende sequência de aminoácido natural e derivados (mutantes) da mesma. Devido a uma ou mais deleções, inserções, substituições não conservadoras ou conservadoras, ou uma combinação das mesmas, dos resíduos de aminoácido, a sequência de aminoácido derivada pode ter uma sequência diferente da sequência de aminoácido natural. Por exemplo, para Fc IgG, os resíduos de aminoácido nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, ou 327 a 331, que são conhecidos como críticos à ligação, podem ser usados como alvos adequados para a modificação. A região Fc da imunoglobulina da presente invenção também pode compreender uma variedade de outros derivados, incluindo aqueles sem a região capaz de formar as ligações de dissulfeto, aqueles que têm diversas deleções dos resíduos de aminoácido no N-terminal do Fc natural, ou aqueles que têm resíduos de metionina adicionais no N-terminal do Fc natural. Além do mais, para se livrar de funções do efetor, a deleção pode ser desenhada em sítio de ligação de complemento, tais como o sítio de ligação C1q e o sítio ADCC. As técnicas para preparar tais derivados da região Fc da imunoglobulina são reveladas em WO 97/34631 e WO 96/32478.
[063] Para as proteínas e os peptídeos, as substituições de aminoácido que, no geral, não mudam a atividade molecular são conhecidas na tecnologia (H.Neurath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As substituições mais comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em qualquer direção.
[064] Se necessário, permite-se que a região Fc seja modificada, tais como fosforilação, sulfatação, acrilato, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, e amidação.
[065] Os derivados de Fc têm a mesma atividade biológica da região Fc na presente invenção ou têm melhor estabilidade estrutural (tal como a estabilidade estrutural em relação ao calor, ao pH, etc.) do que a correspondente região Fc dos mesmos.
[066] Além do mais, estas regiões Fc podem ser derivadas a partir de formas naturais isoladas a partir de seres humanos e outros animais, incluindo gado, cabra, porco, camundongo, coelho, hamster, rato e porquinho da Índia, ou derivadas a partir de recombinante ou derivado de células ou micro-organismos animais transformados. Aqui, a região Fc pode ser obtida a partir de imunoglobulina natural pela separação da imunoglobulina intacta proveniente de organismos humanos ou animais e pelo tratamento da mesma com enzimas proteolíticas. A papaína digere a imunoglobulina natural em regiões Fab e Fc, ao mesmo tempo em que o tratamento com pepsina resulta na produção de fragmentos pFc’ e F(ab’)2. Os fragmentos Fc ou pFc’ podem ser isolados, por exemplo, por cromatografia por exclusão de tamanho.
[067] Além do mais, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção pode ser uma forma que tem cadeias de açúcar natural, ou cadeias de açúcar aumentadas ou reduzidas, se comparada com a forma natural, ou pode ser uma forma desglicosilado. O aumento, a diminuição ou a remoção das cadeias de açúcar Fc da imunoglobulina podem ser alcançados pelos métodos comumente usados na tecnologia, tais como métodos químicos, métodos enzimáticos, e métodos de engenharia genética usando micro-organismos. A remoção das cadeias de açúcar do fragmento Fc resulta em uma significativa redução na afinidade de ligação ao complemento (C1q) e redução ou perda de citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por célula ou citotoxicidade dependente de complemento, e, desse modo, respostas imune in vivo desnecessárias não serão induzidas. Em vista disto, a região Fc da imunoglobulina na forma desglicosilada ou não glicosilada pode ser mais adequada com o propósito da presente invenção para uso como um medicamento.
[068] O termo "desglicosilação", da forma usada na presente invenção, significa a remoção enzimática de frações de açúcar da região Fc, e o termo "não glicosilado" significa que a região Fc é produzida em uma forma aglicosilada (por exemplo, em células eucarióticas, tais como células de mamífero, ou em procariotas, tal como E. coli).
[069] Além do mais, a região Fc da imunoglobulina pode ser uma região Fc derivada a partir de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, ou preparada por uma combinação ou um híbrido da mesma. Preferivelmente, a mesma é derivada a partir de IgG ou IgM (duas das proteínas mais abundantes no sangue humano), o mais preferivelmente IgG (que é conhecido por estender a meia-vida de ligante-proteína de ligação).
[070] O termo "combinação", da forma usada na presente invenção, significa um dímero ou um multímero formados por dois ou mais polipeptídeos de cadeia única que são ligados em conjunto, em que os polipeptídeos de cadeia única podem ser derivados a partir da mesma ou diferente região Fc da imunoglobulina. Isto é, o dímero ou o multímero podem ser formados por dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo que consiste em fragmento Fc de IgG, fragmento Fc de IgA, fragmento Fc de IgM, fragmento Fc de IgD, e fragmento Fc IgE.
[071] Em uma outra modalidade, a proteína de fusão GLP-1 da presente invenção é um homodímero.
[072] Em uma outra modalidade, a proteína de fusão GLP-1 é adicionalmente ligada em um fragmento que contém um sítio de reconhecimento de sortase, isto é, o fragmento "ST" descrito na presente invenção.
[073] O termo "sortase", incluindo sortase A e sortase B, foi descoberto pela primeira vez por ter a função de ancorar as proteínas da superfície bacteriana na parede celular. O "sinal de classificação" das proteínas da superfície foi identificado por consistir em três partes chaves: a sequência LPXTG, a sequência hidrofóbica e uma cauda de resíduos positivamente carregados na maior parte dos casos. A sequência LPXTG é muito conservadora e pode ser reconhecida pela sortase, então, a cisteína (Cys) da transpeptidase age como um grupo nucleofílico para atacar a ligação de peptídeo entre a treonina e a glicina do motivo LPXTG C-terminal do substrato (tal como a proteína da superfície), fazendo com que a ligação de peptídeo clive (acilação), o que, por sua vez, produz uma acilase intermediária, e, finalmente, o peptídeo é covalentemente ligado na parede celular ou na subunidade fímbria para funcionar (desacilação).
[074] Em uma modalidade da presente invenção, a sortase A é utilizada para o acoplamento sítio-dirigido de PEG. Em uma modalidade específica, os sítios de reconhecimento central da sortase A LPETG, LPETGG, e LPETGGG são usados. Em uma outra modalidade específica, diferentes etiquetas de afinidade podem ser adicionadas no sítio de reconhecimento, tais como LPETGGHHHHHH, LPETGGWSHPQFEK, etc.
[075] Em uma outra modalidade, a proteína de fusão GLP-1 da presente invenção é produzida por métodos recombinantes, compreendendo, por exemplo, expressar a proteína em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica adequada, e isolar a proteína de fusão GLP-1 da presente invenção por técnicas convencionais. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo que codifica o peptídeo pode ser sintetizada pelo método de síntese química, primeiro, e, então, a sequência pode ser clonada em um vetor de expressão adequado para a expressão sob o controle de um promotor adequado. Alternativamente, os métodos de mutagênese, tal como a mutagênese PCR, podem ser empregados para obter a sequência de nucleotídeo que codifica GLP-1 a partir de GLP-1 tipo selvagem, e, então, a sequência, e a sequência de outros elementos para construir a proteína de fusão pode ser clonada para um vetor de expressão adequado para a expressão sob o controle de um promotor adequado. Estas tecnologias estão completamente dentro das capacidades daqueles versados na técnica, e há inúmeros preceitos na tecnologia anterior.
[076] As células hospedeiras eucarióticas adequadas compreendem células de mamífero, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2. As células estão, preferivelmente, crescendo em condições adequadas para expressar a proteína de fusão GLP-1 da presente invenção. Quanto aos reagentes e às condições usados para produzir ou isolar a proteína de fusão GLP-1 da presente invenção, não há restrições especiais, e qualquer sistema conhecido na tecnologia ou comercialmente disponível pode ser aplicado. Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão GLP- 1 é obtida pelos métodos descritos na tecnologia.
[077] Há uma variedade de vetores de expressão que podem ser usados para preparar a proteína de fusão GLP-1, que pode ser selecionada a partir de vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Os vetores de expressão procarióticos podem incluir, por exemplo, plasmídeos, tais como pRSET, pET, e pBAD, em que os promotores que podem ser usados incluem, por exemplo, lac, trc, trp, recA, ou araBAD. Os vetores da expressão eucariótica incluem: (i) vetores usados para a expressão em levedura, tais como pAO, pPIC, pYES, e pMET, em que os promotores, tais como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc., podem ser usados; (ii) vetores usados para a expressão em células de inseto, tais como pMT, pAc[delta], plB, pMIB, pBAC, etc., em que os promotores, tais como PH, p10, MT, Ac5, OplE2, gp64, polh, etc., podem ser usados; e (iii) vetores usados para a expressão em células de mamífero, tais como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e os vetores derivados a partir de sistemas virais, tais como vírus vaccinia, vírus adeno-associado, herpes-vírus, retrovírus e congêneres, em que os promotores, tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β-actina, podem ser usados. Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão GLP-1 é expressada em um sistema de célula procariótica ou eucariótica, e sequências de codificação otimizadas para códão são usadas. Em uma modalidade preferida, a sequência para expressar a proteína de fusão GLP-1 contém um peptídeo líder e/ou um peptídeo sinal para facilitar a secreção da proteína de fusão GLP-1 da célula para o exterior da célula para a separação e a purificação. Em uma outra modalidade preferida, a sequência que expressa a proteína de fusão GLP-1 não contém um peptídeo líder e/ou um peptídeo sinal, e, em vez de ser secretada para o exterior da célula, a proteína de fusão GLP-1 é obtida pela lise da célula para a separação e a purificação.
[078] Em uma outra modalidade, na proteína de fusão da presente invenção, a proteína GLP-1 e o fragmento Fc são diretamente ligados. Em uma outra modalidade, a proteína GLP-1 e o fragmento Fc são ligados através de um primeiro adaptador L1. Em uma outra modalidade, o fragmento Fc e o fragmento que contém a sequência de reconhecimento de sortase são diretamente ligados. Em uma outra modalidade, o fragmento Fc e o fragmento que contém a sequência de reconhecimento de sortase são ligados através de um segundo adaptador L2.
[079] Em uma modalidade preferida, o primeiro adaptador L1 e/ou o segundo adaptador L2 compreendem um peptídeo que contém 1, 2, 3 ou mais aminoácidos. Mais preferivelmente, o primeiro adaptador L1 e/ou o segundo adaptador L2 compreendem um peptídeo flexível que contém A, T, G e/ou S, tal como (GS) n, em que n é um número inteiro de 1 a 50, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10.
[080] Por exemplo, o primeiro adaptador L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 13), PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14), SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15), SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16), SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 17) e GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).
[081] Por exemplo, o segundo adaptador L2 é selecionado a partir do grupo que consiste em: GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18), GGGGS (SEQ ID NO: 19), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20) e GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21). CONJUGADOS DA PROTEÍNA DE FUSÃO DO GLP-1
[082] A proteína de fusão GLP-1 da presente invenção pode ser conjugada com um ou mais grupos de polímeros para formar um conjugado da proteína de fusão GLP-
1, em que o polímero é conjugado com a extremidade da proteína de fusão, tais como o N-terminal ou o C-terminal. O "polímero" aqui usado é, preferivelmente, fisiologicamente aceitável, que inclui aqueles solúveis em uma solução ou suspensão aquosas e sem efeitos negativos, tais como efeitos colaterais em mamíferos depois da administração do conjugado da proteína de fusão GLP-1 em uma quantidade farmaceuticamente efetiva. Os polímeros que podem ser usados na presente invenção não são particularmente limitados. Os polímeros, no geral, preferivelmente, têm 2 a cerca de 3.000 unidades em repetição. O grupo de polímeros pode ser selecionado a partir de polímeros naturais ou sintéticos, cujos exemplos incluem, mas sem limitações, por exemplo, polissacarídeos, polialquileno glicóis, tais como polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG), óxido de polietileno (PEO), copolímero de etileno glicol e propileno glicol, álcool polivinílico e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção é conjugado com um ou mais grupos de PEG para modificação.
[083] Na presente invenção, o polímero não é limitado a uma estrutura em particular, o mesmo pode ser linear (tais como alcóxi PEG ou PEG bifuncional), ramificado ou com múltiplos braços (tais como PEG bifurcado ou PEG ligado em núcleo de poliol), dendrítico ou pode ter ligações degradáveis. Além do mais, a estrutura interna do polímero pode ser organizada em qualquer número de diferentes padrões, que podem ser selecionados a partir de homopolímeros, copolímeros alternantes, copolímeros aleatórios, copolímeros em bloco, terpolímeros alternantes, terpolímeros aleatórios, terpolímeros em bloco e congêneres. O polímero também pode incluir poli(óxido de alquileno) polímeros, ácido polimaleico, poli(D,L-alanina) e congêneres.
[084] Em algumas modalidades, o polímero é polietileno glicol (PEG) ou derivados do mesmo, tal como metóxi polietileno glicol (mPEG). Aqui, a menos que especificamente indicado, os polietileno glicóis (PEG) incluem aqueles tanto com grupos hidroxila como o grupo terminal quanto com outros grupos como o grupo terminal. Os outros grupos incluem, mas sem limitações, alcóxi, cicloalcóxi, cicloalquilóxi, alquenila, arilóxi ou aralquilóxi. Estes tipos moleculares de PEG são conhecidos na tecnologia anterior e são rotineiramente usados na modificação do polipeptídeo. A cadeia lateral do PEG pode ser linear, ramificada, bifurcada ou composta por múltiplos braços. Diferentes polietileno glicóis podem ter diferentes comprimentos da cadeia de polímero e estruturas de polímero.
[085] Na presente invenção, não há limitação em particular no peso molecular do PEG, e seu peso molecular pode variar de 0,1 a 200 kDa, tais como 1 a 150 kDa, 2 a 100 kDa, 3 a 80 kDa, 4 a 50 kDa, ou 5 a 40 kDa. Outro PEG usado inclui, por exemplo, aqueles revelados em WO 03/040211, US 6.566.506, US 6.864.350 e US 6.455.639. Em particular, o PEG tem a fórmula geral HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, em que o faixa de n é cerca de 5 a 4.000. Da forma supramencionada, o PEG da presente invenção inclui o PEG com outros grupos terminais, tais como metóxi PEG, PEG ramificado, PEG bifurcado e congêneres. Os PEGs ramificados adequados podem ser preparados da forma descrita na Patente US 5.932.462, cuja íntegra da revelação é aqui incorporada pela referência. O PEG bifurcado se refere a um PEG que tem uma ramificação próxima de uma extremidade da cadeia de polímero, e a cadeia principal do PEG bifurcado pode ser linear ou ramificada.
[086] É conhecido pelos versados na técnica que, em uma molécula bioativa conjugada com um grupo de polímeros, à medida que o peso molecular do grupo de polímeros aumenta, a atividade biológica do conjugado diminui gradualmente (Bailon et al. al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon α-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001; 12: 195-202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony- stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425-32; e Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16). Também é conhecido pelos versados na técnica que, à medida que o peso molecular do grupo de polímeros aumenta, a meia-vida biológica e/ou a meia-vida plasmática do conjugado aumentam desta maneira.
[087] A fim de prover um efeito terapêutico estável durante um longo período, e para reduzir a frequência da administração para melhorar a conformidade do paciente, é desejável estender a meia-vida biológica do conjugado da proteína de fusão GLP-1 o tanto quanto possível, ao mesmo tempo em que se retém a significativa atividade do agonista de receptor de GLP-1. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção provê para os conjugados da proteína de fusão GLP-1 a meia-vida biológica estendida e a significativa atividade de agonista de receptor de GLP-1.
[088] Em uma modalidade específica, no conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção, o peso molecular do um ou mais grupos de polímeros (tal como PEG) é ≥ 1, ≥ 10, ≥ 20, ≥ 30, ≥ 40, ≥ 50, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, ≥ 90, ≥ 100, ≥ 110, ≥ 120, ≥ 130, ≥ 140, ≥ 150, ou ≥ 160 kDa, por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 kDa, ou um valor entre quaisquer dois dos valores expostos. Deve-se notar que, durante a descrição do peso molecular do grupo de polímeros conjugado em um conjugado da proteína de fusão GLP-1, se houver múltiplos grupos de polímeros conjugados no conjugado, a soma dos pesos moleculares de todos os grupos de polímeros conjugados no conjugado é calculada, a menos que de outra forma especificada.
[089] O polímero usado na presente invenção é conhecido na tecnologia anterior, e o mesmo pode ser obtido através de uma variedade de maneiras, incluindo, por exemplo, rotas comerciais, tais como CarboMer, Inc., JT Baker, The Dow Chemical Company, etc., ou o mesmo pode ser preparado por alguém de acordo com os métodos conhecidos na tecnologia, por exemplo, da forma descrita em EP1245608. A presente invenção não é limitada a polímeros feitos por qualquer método específico.
[090] Depois da reação de conjugação, o conjugado pode ser separado por um método adequado, incluindo, por exemplo, ultrafiltração, diálise ou cromatografia, etc., todos os quais estão dentro das capacidades daqueles versados na técnica.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
[091] A proteína de fusão GLP-1 ou o conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção podem ter múltiplas aplicações, incluindo, por exemplo, para uso na redução da glicose sanguínea. Portanto, a presente invenção também provê uma composição farmacêutica para reduzir a glicose sanguínea, que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de fusão ou do conjugado da presente invenção, e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a composição farmacêutica pode ser usada para o tratamento de diabetes, mais preferivelmente, para o tratamento de diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II, e, particularmente preferivelmente, para o tratamento de diabetes tipo II.
[092] A quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de fusão ou do conjugado da presente invenção dependem da rota de administração, do tipo dos sujeitos e das características físicas do mamífero específico considerado. Estes fatores e seus relacionamentos com a determinação da quantidade são bem conhecidos pelos versados na técnica do campo médico. A quantidade e o método de administração podem ser ajustados para alcançar a eficácia ideal para liberar o peptídeo para o sujeito, mas, dependendo de fatores bem conhecidos por aqueles versados na técnica no campo médico, tais como peso corporal, dieta, medicação concomitante e ainda outros fatores.
[093] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em terapia em combinação, isto é, em combinação com um ou mais outros agentes, em que a composição farmacêutica e os outros agentes são administrados em conjunto ou sequencialmente. Em outras modalidades, os outros agentes podem ser administrados antes, durante ou depois da administração de um ou mais da proteína de fusão, do conjugado ou da composição farmacêutica da mesma da presente invenção. Os outros agentes que podem ser usados na presente invenção incluem, por exemplo, agentes capazes de reduzir a glicose sanguínea, tais como a insulina, os análogos de insulina, os agonistas de dextrina, e colecistocinina e/ou outros compostos ou composições para o tratamento de doenças. Preferivelmente, uma administração em combinação como esta pode alcançar efeitos combinados ou até mesmo sinérgicos.
[094] Da forma aqui usada, "carreador farmaceuticamente aceitável" ou "carreador fisiologicamente aceitável" podem ser usados intercambiavelmente, incluindo um ou mais de todos e quaisquer sais, solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e atraso de absorção, etc. fisiologicamente compatíveis. Em algumas modalidades, o carreador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o agente terapêutico pode ser revestido com certos materiais pra proteger o agente terapêutico da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o agente terapêutico.
[095] Quando administrada, a preparação farmacêutica da presente invenção é administrada em uma quantidade farmaceuticamente aceitável em uma composição farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa uma substância não tóxica que não interfere com a eficácia biologicamente ativa dos componentes ativos. Tais preparações, no geral, contêm sais, tampões, conservantes, carreadores compatíveis, e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos, tais como intensificadores de imunidade complementares, incluindo adjuvantes, quimiocinas e citocinas. Quando usado nos medicamentos, o sal deve ser farmaceuticamente aceitável. Entretanto, os sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente usados para preparar os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, assim, os mesmos não são excluídos do escopo da presente invenção.
[096] Se necessário, a proteína de fusão GLP-1 ou conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção podem ser combinados com carreadores farmaceuticamente aceitáveis. O termo "carreadores farmaceuticamente aceitáveis" aqui usado se refere a um ou mais de cargas, diluentes, ou substâncias de encapsulação sólidos ou líquidos compatíveis, que são adequados para administração a mamíferos, tais como seres humanos. O termo "carreador" significa componentes orgânicos ou inorgânicos, naturais ou sintéticos, que são combinados com os componentes ativos para facilitar a aplicação. Os componentes da composição farmacêutica também podem ser mesclados em uma forma em que não há interações que podem perturbar significativamente o efeito terapêutico do fármaco desejado.
[097] Preferivelmente, a composição farmacêutica da presente invenção pode conter um sistema de tampão e, preferivelmente, o sistema de tampão é uma solução de tampão de acetato com um pH de cerca de 3,0 até cerca de 6,0, ou uma solução de tampão de fosfato com um pH de cerca de 5,0 até cerca de 9,0. Em algumas modalidades específicas, os tampões adequados incluem acetato, citrato, borato e fosfato.
[098] Opcionalmente, a composição farmacêutica também pode conter conservantes adequados, tais como cloreto de benzalcônio, cloro-terc-butanol, parabenos e timerosal.
[099] A composição farmacêutica pode ser convenientemente apresentada em uma forma de dosagem unitária e pode ser preparada por qualquer método conhecido no campo farmacêutico. O método compreende a etapa de combinar o agente ativo com um carreador, que contém um ou mais ingredientes acessórios. No geral, a composição é preparada pela combinação intimamente do composto ativo com um ou ambos de um carreador líquido e um carreador sólido finamente dividido, seguido pela modelagem do produto, se necessário.
[0100] As composições farmacêuticas adequadas para a administração parenteral podem ser as formulações aquosas ou não aquosas estéreis que contêm uma ou mais proteínas de fusão ou conjugados. Em algumas modalidades, a formulação é isotônica com o sangue do sujeito. Esta preparação pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos usando adequados agentes de dispersão ou umedecimento e agentes de suspensão. A preparação de injeção estéril também pode ser uma solução ou suspensão de injeção estéril em um diluente ou solvente não tóxicos parenteralmente aceitáveis, por exemplo, uma solução em 1,3-butanodiol. Os carreadores e solventes aceitáveis que podem ser usados incluem água, solução de Ringer, e solução de cloreto de sódio isotônica. Além do mais, óleos fixos estéreis são convencionalmente usados como solventes ou meio de suspensão. Por este motivo, qualquer óleo fixo brando pode ser usado, incluindo monoglicerídeos ou diglicerídeos sintéticos. Também, ácidos graxos, tais como ácido oleico, podem ser usados como as formulações injetáveis. As formulações de carreador adequadas para administração oral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc. podem ser encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
[0101] A proteína de fusão ou o conjugado da presente invenção podem ser preparados com carreadores que protegem os mesmos da rápida liberação, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para preparar tais formulações são conhecidos na tecnologia anterior, veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, etc.
[0102] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por qualquer rota convencional, incluindo injeção ou infusão gradual durante o tempo. Por exemplo, a administração pode ser oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitária, intratumoral ou transdérmica.
[0103] A composição farmacêutica da presente invenção é administrada em uma quantidade efetiva. Uma "quantidade efetiva" é a quantidade de qualquer proteína de fusão ou conjugado aqui providos, individualmente ou com doses adicionais e/ou outros agentes terapêuticos, que produz uma resposta desejada (por exemplo, reduzindo os níveis da glicose sanguínea em sujeitos). Isto pode incluir apenas desacelerar temporariamente o desenvolvimento de diabetes, ou, em algumas modalidades, interromper permanentemente o desenvolvimento de diabetes.
[0104] Certamente, uma quantidade como esta irá depender da doença específica a ser tratada, da severidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente (incluindo idade, condição física, altura e peso corporal), duração do tratamento, a natureza do tratamento concorrente (se houver), a rota de administração específica,
e fatores similares no conhecimento de trabalhadores médicos e da saúde. Estes fatores são bem conhecidos pelos versados na técnica, e podem ser conhecidos apenas pelo uso de experimentos de rotina. No geral, é preferido usar a dose máxima de cada componente ou combinação do mesmo, isto é, a mais alta dose segura com base em julgamento médico razoável. Entretanto, os versados na técnica podem entender que os pacientes podem exigir doses mais baixas ou doses permissíveis por motivos médicos, psicológicos ou, basicamente, quaisquer outros motivos.
[0105] A composição farmacêutica usada no método exposto é preferivelmente estéril e contém uma quantidade efetiva da proteína de fusão ou conjugado individualmente ou em combinação com uma outra preparação em uma unidade em peso ou unidade em volume adequadas para administração aos pacientes para produzir a resposta desejada, tal como uma diminuição na glicose sanguínea.
[0106] A dosagem da proteína de fusão ou do conjugado administrados no sujeito pode ser selecionada de acordo com diferentes parâmetros, especialmente, de acordo com o modo de administração e o estado do sujeito. Outros fatores incluem o período de tratamento exigido. Se a resposta no sujeito na dose inicial aplicada for insuficiente, uma dose mais alta (ou uma dose mais alta efetiva alcançada por uma rota de liberação diferente, mais localizada) dentro da tolerância do paciente pode ser aplicada.
[0107] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção contém 0,20 mg/mL ~ 5 mg/mL de proteína de fusão GLP-1 e/ou 4 mg/mL ~ 40 mg/mL de conjugado da proteína de fusão GLP-1, preferivelmente 0,20 mg/mL ~ 5 mg/mL de proteína de fusão GLP-1 e/ou 4 mg/mL ~ 40 mg/mL de conjugado da proteína de fusão GLP-1, mais preferivelmente, 0,5 mg/mL ~ 2 mg/mL de proteína de fusão GLP-1 e/ou 10 mg/mL ~ 20 mg/mL de conjugado da proteína de fusão GLP-1. No geral, a dosagem da proteína de fusão GLP-1 ou do conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção pode variar de cerca de 10 μg/kg do peso corporal do paciente até cerca de 100.000 μg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a dosagem pode variar de cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 20 mg/kg.
Em outras modalidades, a dosagem pode variar de cerca de 0,1 mg/kg até 5 mg/kg, 0,1 mg/kg até 10 mg/kg, ou 0,1 mg/kg até 15 mg/kg. Em outras modalidades, a dosagem pode variar de cerca de 1 mg/kg até 5 mg/kg, 5 mg/kg até 10 mg/kg, 10 mg/kg até 15 mg/kg, ou 15 mg/kg até 20 mg/kg. Em outras modalidades, a dosagem é de cerca de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, ou 30 mg/kg. Em uma outra modalidade, a dosagem é de cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, ou 6 mg/kg. Com base na propriedade da composição, a dose pode ser liberada continuamente (por exemplo, por uma bomba contínua) ou em intervalos periódicos. Em algumas modalidades, quando administrada intravenosamente, a dosagem da proteína de fusão GLP-1 ou do conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção pode ser 0,1 até 20 mg/kg ou qualquer valor nos mesmos. O intervalo de tempo ideal para múltiplas administrações de uma composição em particular pode ser determinado pelos versados na técnica sem experimentação indevida. Outros regimes de dosagem da composição provida são conhecidos pelos versados na técnica, em que a dosagem, a agenda de administração, o sítio de administração, o modo de administração, etc. podem ser diferentes do exposto. Em uma modalidade, a dosagem é administrada intravenosamente. Em uma outra modalidade, o regime de dosagem é uma única administração intravenosa.
[0108] Um kit que compreende a proteína de fusão GLP-1 ou o conjugado da proteína de fusão GLP-1 (por exemplo, na composição farmacêutica) e as instruções para uso também estão no escopo da presente invenção. O kit pode conter adicionalmente pelo menos um dos outros agentes, tais como um ou mais de outros agentes que reduzem a glicose sanguínea. Em uma outra modalidade, o kit pode incluir um carreador que é compartimentalizado para conter de forma estanque um ou mais dispositivos de contêiner ou uma série de dispositivos de contêiner (tais como tubos de ensaio, tubos, frascos, garrafas, seringas, etc.). Os componentes do kit podem ser acondicionados em um meio aquoso ou em uma forma liofilizado.
[0109] A composição pode ser provida em uma forma liofilizada ou em um meio aquoso.
[0110] Preferivelmente, o sujeito é um vertebrado, mais preferivelmente, um mamífero, o mais preferivelmente, um ser humano, mas o sujeito também pode ser outros animais, tais como animais domésticos (por exemplo, cães, gatos, etc.), animais de pecuária (por exemplo, gado, ovelhas e cabras, porcos, cavalos, etc.) ou animais experimentais (por exemplo, macacos, ratos, camundongos, coelhos, porquinhos da Índia, etc.).
[0111] A proteína de fusão GLP-1 e/ou o conjugado da proteína de fusão GLP-1 da presente invenção podem ser administrados individualmente, mas são preferivelmente administrados como uma composição farmacêutica, que usualmente contém excipientes, diluentes ou carreadores farmacêuticos adequados selecionados de acordo com a rota de administração planejada, e a mesma pode ser aplicada no paciente/sujeito com necessidade de tratamento de qualquer maneira adequada. A dosagem precisa irá depender de inúmeros fatores, incluindo a natureza precisa da proteína de fusão GLP-1 e do conjugado da proteína de fusão GLP-1.
[0112] Algumas maneiras adequadas de administração incluem (sem limitações) administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), transdérmica, vaginal ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural).
[0113] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção contém um modificador isotônico e/ou um conservante, preferivelmente, o modificador isotônico é um ou mais de sacarose, manitol, cloreto de sódio e glicerol, e o conservante é selecionado a partir de m-cresol, álcool benzílico, metil p- hidroxibenzoato, etil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato e butil p- hidroxibenzoato. Os versados na técnica podem preparar as soluções adequadas para a proteína de fusão GLP-1 ou a proteína de fusão GLP-1 da presente invenção pelo uso, por exemplo, de excipientes isotônicos, tais como salino fisiológico, injeção de Ringer e injeção de Ringer com lactato. De acordo com as exigências, os estabilizadores, os tampões, os antioxidantes e/ou ainda outros aditivos também podem ser adicionados. A composição farmacêutica para a administração oral pode ser na forma de comprimidos, cápsulas, pós ou líquidos orais. Os comprimidos podem incluir carreadores sólidos, tais como gelatina ou adjuvantes. As composições farmacêuticas líquidas usualmente incluem um carreador líquido, tais como água, petróleo, óleo animal ou vegetal, óleo mineral ou óleo sintético, e também pode incluir solução salina fisiológica, glicose ou outras soluções de açúcar ou glicóis, tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é na forma de uma preparação líquida e/ou uma preparação liofilizada. Preferivelmente, a preparação liofilizada contém um lioprotetor, e, mais preferivelmente, o lioprotetor é selecionado a partir de sacarose, lactose, manitol, trealose e outros açúcares.
[0114] A proteína de fusão GLP-1 e/ou o conjugado da proteína de fusão GLP-1 aqui descritos são preferivelmente administrados em um sujeito em uma "quantidade terapeuticamente efetiva" ou "quantidade efetiva". A composição é preferivelmente administrada no sujeito em uma "quantidade terapeuticamente efetiva", e a quantidade terapeuticamente efetiva ou a quantidade efetiva são suficientes para mostrar seu benefício ao sujeito. A real quantidade administrada, bem como a taxa e curso temporal da administração, irão depender da condição e da severidade do sujeito a ser tratado. A prescrição do tratamento (tal como a determinação da dosagem) é determinada pela equipe médica e, usualmente, a doença a ser tratada, a condição do paciente individual, o sítio de liberação, a rota de administração, e outros fatores conhecidos pelos médicos estão em consideração.
[0115] Em algumas modalidades, a faixa de dosagem da proteína de fusão GLP- 1 e/ou do conjugado da proteína de fusão GLP-1 pode ser 30 mg/kg de peso corporal/dia até 0,00001 mg/kg de peso corporal/dia, 3 mg/kg/dia até 0,0001 mg/kg/dia, ou 0,3 mg/kg/dia até 0,01 mg/kg/dia.
[0116] A presente invenção também provê um método para o tratamento de doenças, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína de fusão GLP-1 e/ou do conjugado da proteína de fusão GLP-1 em um sujeito com necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em: síndrome de dumping pós-prandial, hiperglicemia pós-prandial, reduzida tolerância à glicose, obesidade, disfunções alimentares, síndrome da resistência à insulina, diabetes, e hiperglicemia. Em uma modalidade preferida, a doença é diabetes tipo II.
[0117] A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitações adicionais de nenhuma maneira. A íntegra dos conteúdos de todas as referências citadas neste pedido (incluindo referências de artigo, patentes concedidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) é expressamente aqui incorporada pela referência. Nos seguintes exemplos, se não especificamente notado, os reagentes e os materiais usados são produtos comercialmente disponíveis com pelo menos pureza analítica ou níveis equivalentes.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO GLP-1
1. CONSTRUÇÃO DO VETOR DA EXPRESSÃO EUCARIÓTICA DA PROTEÍNA DE FUSÃO GLP-1
[0118] A proteína de fusão GLP-1 construída neste exemplo tem uma estrutura de GLP-1-L1-Fc-L2-ST, em que GLP-1 representa várias formas de GLP-1 ou análogos da mesma, preferivelmente, a sequência de GLP-1 é com a mesma de dulaglutida (Trulicity™). L1 e L2 representam o primeiro e o segundo adaptadores, respectivamente, em que a sequência de L1 é GGGGSGGGGSGGGGSA, e a sequência de L2 é GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, ou GSGGGSGGGGSGGGGS, ou não há L2. Fc representa a região Fc da imunoglobulina, que é derivada a partir de IgG2 (também representando como Fc2 na presente invenção) ou IgG4 (também representando como Fc4 na presente invenção) humanos. Preferivelmente, a região Fc é a mesma de dulaglutida (Trulicity™), que é uma variante de IgG4 (Fc4) humano. ST representa o sítio de reconhecimento sortase A com a sequência de ST de LPETG ou LPETGGG.
[0119] As sequências de aminoácido de diferentes proteínas de fusão GLP-1 foram reversamente traduzidas em sequências de nucleotídeo de acordo com a preferência de códão das células CHO.
O fragmento de DNA de comprimento completo da proteína de fusão GLP-1 foi obtido por síntese genética completa e amplificação PCR, e, então, clonado no vetor da expressão eucariótica pFRL-DHFR através dos sítios de restrição HindIII-EcoRI em ambas as extremidades.
O vetor pFRL-DHFR continha o promotor de citomegalovírus humano (Promotor hCMV-MIE), SV40 PolyA, DHFR (di-hidrofolato redutase) e outros elementos, que podem auxiliar na expressão eficiente e estável de genes externos em células eucarióticas (figura 1A). Tabela 1 Lista de diferentes proteínas de fusão GLP-1 construídas no Exemplo Tabela 1. Características da sequência de aminoácido de diferentes proteínas de fusão GLP-1 Nome da GLP-1 L1 Fc L2 ST proteína
GLP1-L1- Consistent GGGGSGG IgG4 Não LPETG Fc4-ST e com GGSGGGG humano, dulaglutid SA consistente a com dulaglutida
GLP1-L1- Consistent GGGGSGG IgG4 GGGGSG LPETG Fc4-L2-ST e com GGSGGGG humano, GGGSGG dulaglutid SA consistente GGS a com dulaglutida
GLP1-L1- Consistent GGGGSGG IgG2 GSGGGS LPETG Fc2-L2-ST e com GGSGGGG humano GGGGSG dulaglutid SA GGGS a GLP1-L1- Consistent GGGGSGG IgG2 Não LPETG Fc2-ST e com GGSGGGG humano dulaglutid SA a GLP1-L1- Consistent GGGGSGG IgG4 GGGGSG LPETGG Fc4-L2- e com GGSGGGG humano, GGGS G STG3 dulaglutid SA consistente a com dulaglutida
1. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE GLP1-L1-FC4-ST
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSA ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGLPETG (SEQ ID NO: 1) SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE GLP1-L1-FC4-ST:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGA GCAGGCCGCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGA GGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGT ACGGACCTCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCT GTGTTCCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCT GAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGC GAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCA CCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGGCC TGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGC CTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGT CCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTGGAGTGG GAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCTCGA CAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTG
GCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACC ACTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCCTGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 2)
2. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE GLP1-L1-FC4-L2-ST
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSA ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSLPETG (SEQ ID NO: 3) SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE GLP1-L1-FC4-L2-ST:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGA GCAGGCCGCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGA GGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGT ACGGACCTCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCT GTGTTCCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCT GAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGC GAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCA CCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGGCC TGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGC CTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGT CCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTGGAGTGG GAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCTCGA CAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTG GCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACC
ACTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGTGGCGGCTCTGGA GGCGGAGGTAGTGGTGGCGGCGGTTCACTGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 4)
3. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE GLP1-L1-FC2-L2-ST
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSA VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GSGGGSGGGGSGGGGSLPETG (SEQ ID NO: 5) SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE GLP1-L1-FC2-L2-ST:
CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGG AGCAGGCCGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGG AGGAGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGT CCTCCATGTCCAGCTCCACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCA AAGCCTAAGGACACCCTGATGATATCTCGTACCCCTGAGGTGACCTGTGTCGTA GTGGATGTGAGTCATGAAGATCCAGAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGT GTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACC TTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTCCATCAAGATTGGTTAAACGGTAAA GAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGGATTGCCTGCCCCTATTGAGAAGACC ATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAAGTGTATACTCTACCCCCA AGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGTGTCTTGTCAAAGGT TTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTCAACCCGAGAAT AATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTTCTTGTACT CTAAACTTACTGTCGACAAATCCCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCCTGTTC CGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTCT
CCAGGGGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGA TCACTGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 6)
4. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE GLP1-L1-FC2-ST
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSA VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KLPETG (SEQ ID NO: 7) SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE GLP1-L1-FC2-ST:
CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGG AGCAGGCCGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGG AGGAGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGT CCTCCATGTCCAGCTCCACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCA AAGCCTAAGGACACCCTGATGATATCTCGTACCCCTGAGGTGACCTGTGTCGTA GTGGATGTGAGTCATGAAGATCCAGAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGT GTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACC TTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTCCATCAAGATTGGTTAAACGGTAAA GAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGGATTGCCTGCCCCTATTGAGAAGACC ATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAAGTGTATACTCTACCCCCA AGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGTGTCTTGTCAAAGGT TTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTCAACCCGAGAAT AATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTTCTTGTACT CTAAACTTACTGTCGACAAATCCCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCCTGTTC
CGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTCT CCAGGGAAACTGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 8)
5. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE GLP1-L1-FC4-L2-STG3:
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSA ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSLGGGGGSGGGGSLPETGGG (SEQ ID NO: 22) SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE GLP1-L1-FC4-L2-STG3:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGA GCAGGCCGCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGA GGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGT ACGGACCTCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCT GTGTTCCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCT GAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGC GAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCA CCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGGCC TGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGC CTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGT CCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTGGAGTGG GAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCTCGA CAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTG GCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACC
ACTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGAGGTGGATCTGGT GGAGGCGGATCTCTGCCCGAAACTGGGGGTGGA (SEQ ID NO: 23)
2. TRIAGEM E FERMENTAÇÃO DAS LINHAS CELULARES ESTÁVEIS
2.1 TRIAGEM DAS LINHAS CELULARES ESTÁVEIS
[0120] Cada plasmídeo construído anteriormente foi transfectado na célula hospedeira CHO DG44 por eletrotransfecção com a densidade celular de 6 x 10 6 células/mL, o volume de 0,8 mL, e a quantidade de plasmídeo de 40 µg. O plasmídeo e as células foram suavemente misturados e, então, adicionados em cuvetas de eletroporação (Bio-Rad, 4 mm). O eletroporador aqui usado foi proveniente de Bio- Rad (GENE PULSER XCELL) e os parâmetros de eletroporação foram como segue: voltagem 290 V e duração do pulso 20 ms.
[0121] Depois da eletroporação, as células foram transferidas para placas de Petri contendo 15 mL de meio de recuperação por 48 horas de cultura e, então, inoculadas em placas de 96 poços com meio de triagem contendo 50 nM MTX. Quando a confluência da célula alcançou mais do que 50 %, as linhas celulares foram triadas para alta expressão pelo método dot blotting e o anticorpo usado foi IgG Fc anti- humano de cabra. Os clones selecionados com níveis de expressão relativamente altos foram sequencialmente transferidos para placas de 24 poços, placas de 6 poços, frascos de cultura celular T25 e frascos de agitação de cultura celular para expansão.
[0122] A fim de aumentar a produção da proteína de fusão, as células foram cultivadas sob pressão com concentração de MTX crescente. Através da inibição do gene DHFR por MTX, a coamplificação do gene DHFR e do gene da proteína de fusão foi realizada.
2.2 FERMENTAÇÃO
[0123] As células foram inoculadas em um volume de 8 L e uma densidade de 0,8 - 1,6 x 106 células/mL em um biorreator de 15 L (Applikon, Biobundle 15L). Os parâmetros de cultura foram definidos como segue: pH 6,95 ± 0,15, DO 45 %, suprimento de oxigênio: ventilação com grande bolha, e velocidade de rotação: 80 - 140 rpm. Quando a densidade celular era cerca de 10 - 12 x 106 células/mL no 5º dia de cultura, a temperatura de cultura foi abaixada para 33 °C. A alimentação foi iniciada a partir do quarto dia de cultura, e o conteúdo de glicose residual foi medido a cada dia. O açúcar foi suplementado para alcançar uma concentração de 3 g/L cada dia antes de abaixar a temperatura, e 4 g/L depois de abaixar a temperatura. Durante a fermentação, a contagem e a viabilidade das células foram medidas a cada dia. No dia 13, as células foram coletadas quando a viabilidade era cerca de 90 %.
[0124] A figura 1B até a figura 4 mostram a curva de crescimento, a viabilidade da célula, os resultados do exame microscópico e vários parâmetros do processo da linha celular estável GLP1-L1-Fc2-L2-ST (número de clone: P1-3G3C2) durante a fermentação. Pode-se ver, a partir da figura 1B, que, no nono dia de fermentação, a densidade celular foi a mais alta com 20,5 x 10 6/mL e, no 13º dia, quando as células foram coletadas, a densidade celular foi 15,5 x 10 6/mL e a viabilidade da célula foi
86,6 %. Os exames microscópicos mostram que as morfologias das células foram boas sem células mortas óbvias (figura 2A e figura 2B). A figura 3 e a figura 4 mostram o metabolismo da glicose, NH4+ e ácido lático (Lac) durante a fermentação.
[0125] A figura 11 até a figura 14 mostram a curva de crescimento, a viabilidade da célula, os resultados do exame microscópico e vários parâmetros do processo de GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 durante a fermentação em batelada alimentada. Pode-se ver, a partir da figura 11B, que, no oitavo dia de fermentação, a densidade celular foi a mais alta com 19,9 x 106 células/mL e, no 14º dia, quando as células foram coletadas, a densidade celular foi de 16,0 x 106 células/mL e a viabilidade da célula foi 92 %. Os exames microscópicos mostram que as morfologias das células foram boas sem células mortas óbvias (figura 12A e figura 12B). A figura 13 e a figura 14 mostram as mudanças do metabolismo da glicose e do pH durante a fermentação.
[0126] O conteúdo da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST no supernatante da fermentação foi 1,8 g/L e o conteúdo de GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 foi 1,19 g/L por instrumento de interação molecular (Pall Life Science, Qke). A eletroforese SDS- PAGE foi usada para detectar a integridade da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST. A GLP1- L1-Fc2-L2-ST é uma proteína de fusão Fc de cadeia dupla com um peso molecular de 61,6 kDa (sem cadeias de açúcar). Da forma mostrada na figura 5, o peso molecular de GLP1-L1-Fc2-L2-ST foi basicamente o mesmo peso molecular teórico nos estados não reduzido e reduzido. Ao mesmo tempo, a eletroforese SDS-PAGE foi usada para detectar as mudanças da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (figura 15). Pode-se ver que a produção da proteína alvo aumentou significativamente do 12º dia até o 14º dia de fermentação, e, no supernatante, a proteína alvo estava em maioria, com apenas uma pequena quantidade de impureza restante. A proteína expressada foi identificada por ELISA, e o resultado foi positivo.
2.3 PURIFICAÇÃO E DETECÇÃO
[0127] GLP1-L1-Fc2-L2-ST e GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 no supernatante do caldo de fermentação foram purificados em duas etapas: cromatografia por afinidade (Uni mab, NanoMicro) e cromatografia por troca de ânion (QHP, BXK). A proteína purificada foi detectada por SDS-PAGE e SEC (cromatografia por exclusão de tamanho). De acordo com os resultados de SDS-PAGE (figura 6A e figura 16A), o tamanho da proteína alvo foi basicamente o mesmo do peso molecular teórico. A SEC foi realizada em coluna Agilent Advancebio SEC 300 A, 2,7 μm, 7,8 * 300 mm, eluição gradiente foi realizada usando 50 mM Tris + 150 mM NaCl + 10 % acetonitrila, pH 7,0 (temperatura da coluna: 30 °C, vazão: 0,5 mL/min, temperatura do injetor de amostra: 4,0 °C, volume da injeção de amostra: 50 μg, e tempo de análise da amostra: 35 min). Pode-se ver, a partir da figura 6B, que o tempo de retenção da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST foi 14,6 min, e a pureza depois da purificação em duas etapas foi 97,2 %. Pode-se ver, a partir da figura 16B, que o tempo de retenção da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 foi 14,49 min, e a pureza depois da purificação em duas etapas foi 98,412 %. EXEMPLO 2 LIGAÇÃO DE 20 KDA DE PEG E 40 KDA DE PEG NA PROTEÍNA DE FUSÃO GLP1-FC
[0128] Os C-terminais de todas as proteínas de fusão GLP1-Fc construídas continham sequência de reconhecimento do núcleo de sortase A LPETG, que pode ser especificamente reconhecida pela sortase A. Sob a ação de sortase A, a ligação de amida entre T e G foi cortada, e T reagiu com o grupo sulfidrila de C na posição de sortase 184 para formar um intermediário da ligação de tioéster, que foi, então, atacado por GGGAA-PEG com poli-Gly no N-terminal. Finalmente, os PEGs de diferentes pesos moleculares foram ligados no C-terminal da proteína.
[0129] Os sistemas de reação de PEGuilação das proteínas GLP1-L1-Fc2-L2-ST e GLP1-L1-Fc2-ST foram como segue: 20 kDa ou 40 kDa de GGGAA-PEG (GGGAA foi comprado a partir de Shanghai GL Biochem Co., Ltd., e 20 kDa ou 40 kDa de GGGAA-PEG foram sintetizados por Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram dissolvidos em uma solução de tampão e ajustados em pH 8,0, e, então, a proteína foi adicionada no sistema de tampão 50 mM Tris 150 mM NaCl pH 8,0 em uma razão de alimentação de 1:15 e 1:10, respectivamente. A seguir, sortase A e 10 mM CaCl 2 foram adicionados. A amostragem foi realizada em diferentes pontos no tempo da reação e, depois de 90 minutos, EDTA foi adicionado para interromper a reação.
[0130] O sistema de reação de PEGuilação da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 foi como segue: 40 kDa de GGGAA-PEG (GGGAA foi comprado a partir de Shanghai GL Biochem Co., Ltd., e 40 kDa GGGAA-PEG foi sintetizado por Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram dissolvidos em uma solução de tampão e ajustados em 7,0, e, então, a proteína e o PEG foram adicionados no sistema de tampão 20 mM Tris 150 mM NaCl pH 7,0 em uma razão de alimentação de 1:15 (razão molar). A seguir, sortase A e CaCl2 (10 mM) foram adicionados, 50 enzima IU por mg da proteína alvo, e a concentração final da proteína alvo foi 6 mg/mL. Depois de 30 minutos, EDTA foi adicionado para interromper a reação.
[0131] Os supramencionados produtos depois da ligação foram detectados por SDS-PAGE e cromatografia de fase reversa (RPC) para detectar a taxa de ligação (taxa de reticulação). A reticulação única significa que significa que apenas um monômero do dímero da proteína de fusão é ligado em PEG, e a reticulação dupla significa que ambos os monômeros do dímero da proteína de fusão são ligados em PEG. O teste da cromatografia de fase reversa foi realizado na coluna cromatográfica Waters Xbridge® proteína BEH C4, 3,5 μm, 4,6 * 250 mM com eluição gradiente com 0,1 % água TFA e 0,1 % acetonitrila TFA, nas condições: temperatura da coluna de 50 °C, comprimento de onda de detecção de 280 nm, vazão de 0,5 mL/min, temperatura do injetor da amostra de 4,0 °C, volume da injeção de amostra de 20 μg e tempo de análise da amostra de 50 min. Os resultados do teste das proteínas GLP1- L1-Fc2-L2-ST e GLP1-L1-Fc2-ST são mostrados na figura 7. À medida que tempo de reação aumentou, os produtos de PEGuilação com 20 kDa ou 40 kDa de PEG gradualmente aumentaram. Em 90 min, os produtos de PEGuilação alcançaram o máximo e a reação de terminação foi prosseguida, e, neste momento, a taxa de reticulação total da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST com 20 kDa de PEG foi 75,62 %, da qual a reticulação única respondeu por 55,57 % e a reticulação dupla respondeu por 20,05 %. A taxa de reticulação total da proteína GLP1-L1-Fc2-L2-ST com 40 kDa de PEG foi 40,15 %, da qual a reticulação única constituiu 36,36 % e a reticulação dupla constituiu 3,79 %. A taxa de reticulação total da proteína GLP1-L1-Fc2-ST com 40 kDa de PEG foi 60,83 %, da qual a taxa de reticulação única foi 48,46 % e a taxa de reticulação dupla foi 12,37 %. Pode-se ver a partir dos resultados da reticulação de 40 kDa de PEG que, sob as mesmas condições de reação, a eficiência de reticulação de GLP1-L1-Fc2-ST foi muito mais alta do que aquela de GLP1-L1-Fc2-L2-ST.
[0132] Os resultados do teste da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 são mostrados na figura 17. À medida que o tempo de reação aumentou, os 40 kDa do produto de PEGuilação aumentaram gradualmente. Em 30min, o produto de PEGuilação alcançou o máximo e a reação foi terminada, e, neste momento, a taxa de reticulação total da proteína GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 com 40 kDa de PEG foi 80,86 %, da qual a reticulação única respondeu por 44,087 % com tempo de pico de 10,543 min e a reticulação dupla respondeu por 36,782 % com tempo de pico de 9,698 min.
PURIFICAÇÃO E DETECÇÃO DEPOIS DA RETICULAÇÃO
[0133] Depois da reticulação com 40 kDa de PEG, GLP1-L1-Fc2-L2-ST foi sujeita a cromatografia hidrofóbica Butil HP para remover GGGAA-PEG não reagido e sortase A, e sujeito a cromatografia por troca de ânion para remover a proteína do substrato não reticulado para controlar a quantidade residual do substrato em 1 %. Da forma mostrada na figura 8A, a GLP1-L1-Fc2-L2-ST reticulada com 40 kDa de PEG pode ser dividida em dois picos P1 e P2 pela cromatografia por troca de ânion. Os resultados do teste RPC mostram (figura 8B) que o pico P1 compreendeu, principalmente, produtos reticulados duplos (produto de reticulação dupla 90,84 %, produto de reticulação única 8,4 %, substrato 0,15 %), e o pico P2 compreendeu, principalmente, produtos reticulados únicos (produto de reticulação dupla 8,56 %, produto de reticulação única 90,12 %, substrato 0,73 %). O tempo de retenção da GLP1-L1-Fc2-L2-ST não reticulada foi 17,3 min, e os tempos de retenção dos produtos reticulados único e duplo foram 22,5 e 23,2 min, respectivamente.
[0134] Depois da reticulação com 40 kDa de PEG, a GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 pode ser separada em reticulação única, reticulação dupla e substratos pela cromatografia por troca de ânion (SuperQ 5PW, TOSOH). A cromatograma é mostrada na figura 18A. De acordo com os resultados do teste SEC (figuras 18B e C), o pico P1 compreendeu, principalmente, produto reticulado duplo (produto de reticulação dupla 97,172 %, produto de reticulação única 2,766 %, substrato 0 %), e o pico P2 compreendeu, principalmente, produto reticulado único (produto de reticulação dupla 19,722 %, produto de reticulação única 79,754 %, substrato 0,158 %). Os tempos de retenção dos produtos reticulados único e duplo foram 10,63 e 9,8 min, respectivamente. EXEMPLO 3 DETECÇÃO DA ATIVIDADE DA PROTEÍNA GLP1-L1-FC2- L2-ST RETICULADA
[0135] A GLP-1 pode ativar adenilato ciclase (AC) pela ligação no receptor de GLP-1 (GLP-1R) para produzir cAMP, e cAMP ativa adicionalmente o fator de transcrição dependente de cAMP, isto é, a proteína de ligação do elemento de resposta cAMP (CREB), que ativa a transcrição dos genes à jusante depois da ligação no elemento de resposta cAMP (CRE).
[0136] A detecção, neste exemplo, incluiu as seguintes etapas. As células HEK293/CRE-Luc/GLP1R (compradas a partir de GenScript, #M00562) foram cultivadas até a fase de crescimento logarítmico, digeridas com tripsina e ressuspensas em meio completo para ajustar a densidade celular em 1 x 106 células/mL e, então, as células foram adicionadas em placas de 96 poços brancas, 50 μL/poço. A dulaglutida e a substância em teste foram diluídas com meio completo até 400 ng/mL, e adicionalmente diluídas em uma razão de 4 vezes com um total de 9 gradientes, e, então, adicionadas nas células, 50 μL/poço. As células foram incubadas em 37 °C, 5 % CO2 por 5 h. Posteriormente, Bright-Glo Luciferase (promega) foi adicionado em 100 μL por poço e blindado da luz por 10 min. Um leitor de microplaca com fluorescência em banda completa (TECAN, 200PRO) foi usado para medir o valor da fluorescência.
[0137] Os dados foram processados para se adequar a uma equação de quatro parâmetros pelo software de análise Softmax como os valores de fluorescência do padrão e as substâncias de teste sendo a ordenada e o valor logarítmico das concentrações sendo a abscissa. A atividade relativa da substância em teste foi calculada de acordo com a seguinte equação:
[0138] A figura 9 mostra os resultados do teste de atividade de GLP1-L1-Fc2-L2- ST reticulada com 20 kDa de PEG e 40 kDa de PEG, respectivamente. Comparada com a dulaglutida, a atividade relativa do substrato não reticulado (GLP1-Fc) foi 98,10 %. As atividades de ambos os produtos reticulados com PEG diminuíram, em que a atividade relativa do produto reticulado com 20 kDa de PEG (indicado como PEG (20 kDa)-GLP1-Fc na figura) foi 40,38 % e a atividade relativa de 40 kDa do produto reticulado (indicado como PEG (40 kDa)-GLP1-Fc na figura) foi 32,85 %.
[0139] A figura 19 mostra os resultados do teste de atividade de GLP1-L1-Fc4-L2- STG3 reticulada com 40 kDa de PEG. Similar ao PEG-conjugado GLP1-L1-Fc2-L2- ST, comparado com dulaglutida, a atividade de 40 kDa de PEG-conjugado GLP1-L1- Fc4-L2-STG3 (indicado como PEG (40 kDa)-GLP1-Fc) na figure) foi reduzida, com a atividade relativa de 21,51 %. EXEMPLO 4 ATIVIDADE HIPOGLICÊMICA IN VIVO DA PROTEÍNA DE FUSÃO GLP-1 OU PEG CONJUGADO DA MESMA
[0140] Os camundongos C57BL/6 (comprados a partir de Beijing Vital River Co., Ltd.) foram criados com 5 camundongos por gaiola, alimentado com ração de crescimento de camundongo normal e ingestão de água livre. O tempo de luz foi 12 h (8h00 - 20h00) e o tempo escuro foi 12 h (20h00 - 08h00). (1) RESULTADOS EXPERIMENTAIS DE GLP1-L1-FC2-L2-ST
[0141] 40 camundongos C57BL/6 machos saudáveis com idade de 6-8 semanas foram divididos em 5 grupos com 8 camundongos em cada grupo. Estes grupos incluem: (1) grupo GLP1-Fc (substrato GLP-1-L1-Fc2-L2-ST antes da reticulação); (2) grupo dulaglutida; (3) grupo 40 kDa de PEG GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST reticulado com 40 kDa de PEG); (4) grupo 20 kDa de PEG GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST reticulado com 20 kDa de PEG); e (5) grupo de controle. Os grupos (1) a (4) foram administrados com 3 mg/kg, e ao grupo de controle foi dado salino normal. O experimento IPGTT foi realizado em 24, 144, 168, 192, 216, e 240 h depois da administração. O procedimento experimental foi como segue. Os camundongos jejuaram por 6 h, e o nível da glicose sanguínea e peso corporal foram medidos. Durante o período de jejum, os camundongos têm livre acesso à água. Depois de 6 horas, os camundongos foram administrados com 2,0g/kg de solução de glicose com o volume de 10mL/kg intraperitonealmente, e os valores da glicose sanguínea em 10, 30, 60, 90, 120 min depois da carga de glicose foram medidos. De acordo com os valores, a curva de tolerância à glicose foi desenhada e a área sob a curva (AUC) da glicose sanguínea foi calculada. Os dados foram representados como a média ± erro padrão (Média ± SEM) e analisados pelo software estatístico Graphpad prism7.0. As diferenças foram analisadas com estatística Mann-Whitney.
[0142] Da forma mostrada nas figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, e 10F, tanto a glicose sanguínea quanto a área sob a curva (AUC) no teste de tolerância à glicose de cada grupo experimental reduziram significativamente, se comparadas com aquelas no grupo de controle em 6 dias depois de uma única administração. Depois de 7 dias, não houve diferença significativa entre os grupos de dulaglutida e de GLP1- Fc e o grupo de controle, indicando que a eficácia de GLP1-Fc e de dulaglutida pode ser mantida por 6 dias. Da forma mostrada nas figuras 10G, 10H, 10I, 10J, 10K e 10L, PEG (20 kDa)-GLP1-Fc ainda teve um significativo efeito de tolerância à glicose no 8º dia depois de uma única administração. Depois de 9 dias, a área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose não teve diferença, se comparado com o grupo de controle, indicando que o efeito do fármaco pode ser mantido por 8 dias. O PEG (40 kDa)-GLP1-Fc ainda teve um significativo efeito de tolerância à glicose até o dia 9 depois de uma única administração. Depois de 10 dias, a área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose não teve diferença, se comparada com o grupo de controle, indicando que o efeito do fármaco pode ser mantido por 9 dias.
[0143] A figura 10M mostra as mudanças diárias do peso corporal de camundongos C57BL/6J depois da administração. Comparado com o grupo de controle, os pesos corporais dos camundongos em cada grupo diminuíram em 24 horas, especialmente, no grupo de dulaglutida e no grupo de GLP1-Fc não reticulado com PEG grupo. É valioso notar que tanto PEG (20 kDa)-GLP1-Fc quanto PEG (40 kDa)-GLP1-Fc podem reduzir significativamente a rápida perda de peso corporal causada por fármacos, indicando que a PEGuilação pode melhorar significativamente os efeitos colaterais de tais fármacos nas aplicações clínicas, e, assim, ter melhor propriedade de segurança. (2) RESULTADOS EXPERIMENTAIS DE GLP1-L1-FC4-L2-STG3
[0144] 18 camundongos C57BL/6 machos saudáveis com idade de 8-10 semanas foram divididos em 3 grupos com 6 camundongos em cada grupo. Estes grupos incluem: (1) grupo de controle; (2) grupo de dulaglutida; e (3) grupo de PEG (40 kDa)- GLP1-Fc (GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 reticulado com 40 kDa de PEG). Os grupos (2) e (3) foram administrados com atividade igual (isto é, realização de conversão em massa com base na atividade in vitro detectada na figura 19), em que a dose da dulaglutida foi 0,76 mg/kg, PEG (40 kDa)-GLP1-Fc foi 3,5 mg/kg, e ao grupo de controle foi dado salino. O experimento IPGTT foi realizado em 1, 5, 6, 7, e 8 dias depois da administração, e o procedimento experimental foi como segue. Os camundongos jejuaram por 6 h, e o nível da glicose sanguínea e o peso corporal foram medidos. Durante o período de jejum, os camundongos têm livre acesso à água. Depois de 6 horas, aos camundongos foi administrada 2,0 g/kg da solução de glicose com o volume de 10 mL/kg intraperitonealmente, e os valores da glicose sanguínea em 10, 30, 60, 90, 120 min depois da carga de glicose foram medidos. De acordo com os valores, a área sob a curva (AUC) da glicose sanguínea foi calculada. Os dados foram representados como a média ± erro padrão (Média ± SEM) e analisados pelo software estatístico Graphpad prism7.0. As diferenças foram analisadas com a estatística Mann-Whitney.
[0145] Da forma mostrada na figura 20A, tanto a glicose sanguínea quanto a área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose dos camundongos em cada grupo experimental reduziram significativamente, se comparadas com aquelas no grupo de controle em 5 dias depois de uma única administração. Depois de 5 dias, não houve diferença significativa entre os grupos de dulaglutida e de controle, indicando que a eficácia da dulaglutida pode ser mantida por 5 dias. O PEG (40 kDa)-GLP1-Fc ainda teve um significativo efeito de tolerância à glicose até o dia 7 depois de uma única administração. Depois de 8 dias, a área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose não teve diferença, se comparado com o grupo de controle, indicando que a eficácia de PEG (40 kDa)-GLP1-Fc pode ser mantida por 7 dias.
[0146] A figura 20B mostra as mudanças do peso corporal dos camundongos C57BL/6 depois da administração. Comparado com o grupo de controle, o peso corporal dos camundongos em ambos os grupos diminuiu em 24 horas, especialmente, no grupo de dulaglutida. É valioso notar que PEG (40 kDa)-GLP1-Fc também pode reduzir significativamente a rápida perda de peso corporal causada pelos fármacos, o que ilustra adicionalmente que a PEGuilação pode melhorar significativamente os efeitos colaterais de tais fármacos do agonista de receptor de GLP-1 em aplicações clínicas. EXEMPLO 5 DETECÇÃO DE ATIVIDADE HIPOGLICÊMICA DE GLP1- L1-FC4-L2-STG3 RETICULADA EM CAMUNDONGOS DIABÉTICOS TIPO II
INDUZIDOS POR STZ CONSTRUÇÃO DO MODELO DE CAMUNDONGO DIABÉTICO TIPO I
[0147] Os camundongos C57BL/6 (comprados a partir de Beijing Vital River Co., Ltd.) foram criados com 5 camundongos por gaiola, alimentados com ração de crescimento de camundongo normal e livre ingestão de água. O tempo de luz foi 12 h (08h00 - 20h00) e o tempo escuro foi 12 h (20h00 - 08h00). 30 camundongos C57BL/6 fêmeas saudáveis com idade de 8-10 semanas foram induzidos com 60 mg/kg de STZ, administrado continuamente por 4 dias, e os valores da glicose sanguínea forma medidos depois de 2 semanas. Os camundongos com valores da glicose sanguínea sem jejum ≥ 16,7 mmol/L foram considerados como os camundongos diabéticos tipo II estabelecidos com sucesso.
PROTOCOLO
[0148] 24 camundongos diabéticos tipo II foram divididos em 4 grupos com 6 camundongos em cada grupo. Estes grupos incluem: (1) grupo de controle; (2) grupo dulaglutida-1mg/kg; (3) grupo PEG (40 kDa)-GLP1-Fc (GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 reticulado com 40 kDa de PEG)-1mg/kg; e (4) grupo PEG (40 kDa)-GLP1-Fc (GLP1- L1-Fc4-L2-STG3 reticulado com 40 kDa de PEG)-3mg/kg. A dosagem da dulaglutida foi 1 mg/kg, a dosagem de PEG (40 kDa)-GLP1-Fc foi 1 mg/kg ou 3 mg/kg, e ao grupo de controle foi dado salino normal. Os valores da glicose sanguínea e os pesos corporais nos dias 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, e 12 foram medidos sem jejum e ingestão livre de bebida. Os dados foram representados como a média ± erro padrão (Média ± SEM) e analisados pelo software estatístico Graphpad prism7.0. As diferenças foram analisadas com estatística Mann-Whitney.
RESULTADOS
[0149] Da forma mostrada na figura 21A, a glicose sanguínea de camundongos em cada grupo experimental reduziu significativamente, se comparada com aquela no grupo de controle depois de uma única administração. A diferença na glicose sanguínea entre o grupo dulaglutida-1mg/kg e o grupo de controle ainda foi significativa (P = 0,0022) no dia 6, mas, no dia 7, não havia diferença significativa (P = 0,9654), o que indicou que o efeito hipoglicêmico da dulaglutida pode ser mantido por até 6 dias.
[0150] Por outro lado, depois de uma única administração, PEG (40 kDa)-GLP1- Fc-1mg/kg ainda tinha um significativo efeito hipoglicêmico até o dia 10 (P = 0,0381), cujo resultado não foi próximo do grupo de controle até o dia 11 (P = 0,1143); e PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-3mg/kg ainda tinha um significativo efeito hipoglicêmico no dia 11 depois de uma única administração (P = 0,0381), e cuja diferença em relação ao grupo de controle não foi significativa até o dia 12 (P = 0,0762). Os resultados expostos indicaram que PEG (40 kDa)-GLP1-Fc teve um efeito hipoglicêmico de longo prazo significativamente melhor e pode ser usado no tratamento de diabetes tipo II.
[0151] As mudanças de peso corporal dos camundongos diabéticos depois da administração foram adicionalmente observadas. Da forma mostrada na figura 21B, o peso corporal dos camundongos em todos os grupos experimentais diminuiu, se comparado com aquele no grupo de controle, especialmente no grupo de dulaglutida, em que o peso corporal dos camundongos foi reduzido no máximo em 2,5 g, se comparado com o grupo de controle. Os grupos de duas doses de PEG (40 kDa)- GLP1-Fc tiveram um efeito muito menor no peso corporal, em que o peso corporal dos camundongos no grupo PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-1mg/kg foi reduzido em 0,3 g, no máximo, se comparado com o grupo de controle, e o peso corporal dos camundongos no grupo PEG (40 kDa)-GLP1-3mg/kg foi reduzido em 1,1 g, no máximo, se comparado com o grupo de controle. Estes resultados demonstram que o PEG (40 kDa)-GLP1-Fc em várias doses pode melhorar significativamente a rápida perda de peso corporal causada pelos fármacos quando usado no tratamento de diabetes, indicando que as modificações de PEGuilação podem melhorar significativamente os efeitos colaterais de tais fármacos nas aplicações clínicas, e melhorar efetivamente a conformidade do paciente ao mesmo tempo.
[0152] Em resumo, GLP1-Fc PEGuilado pode promover a secreção da insulina pelas células β da ilhota, inibir o aumento temporário na glicose sanguínea causado pela ingestão de glicose exógena, e promover a utilização de glicose. Depois da modificação de PEG, a proteína GLP1-Fc mostra efeito hipoglicêmico duradouro mais longo, e menos efeitos colaterais, o que evita a rápida perda de peso corporal frequentemente causada por fármacos de redução de peso corporal tipo GLP-1, e tem um bom prospecto de aplicação clínica.
[0153] A presente invenção foi exemplificada por várias modalidades específicas. Entretanto, entende-se pelos versados na técnica que a presente invenção não é limitada às modalidades específicas, e que aqueles versados na técnica podem fazer várias modificações e variações no escopo da presente invenção sem fugir do espírito e do escopo da presente invenção. Tais modificações e variações estão todas no escopo da presente invenção.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado caracterizado por um, dois ou mais polímeros hidrofílicos serem anexados na extremidade de uma proteína de fusão do agonista de receptor de GLP-1, em que a proteína de fusão do agonista de receptor de GLP-1 compreende um agonista de receptor de GLP-1 e um parceiro de fusão (FP) capaz de aumentar a meia-vida da proteína de fusão in vivo, em que o agonista de receptor de GLP-1 e o parceiro de fusão são ligados diretamente ou através um primeiro adaptador L1; o primeiro adaptador L1 é um peptídeo que contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácidos; e o primeiro adaptador L1 é um peptídeo flexível que contém A, T, G, e/ou S, tal como (GS) n, em que n é um número inteiro de 1 até 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o primeiro adaptador L1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 13), PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14), SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15), SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16), SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 17) e GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista de receptor de GLP-1 ser uma forma em comprimento completo, truncada ou variante de GLP-1 ou análogo de GLP-1, preferivelmente, Exendina- 4, GLP-1(1-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, ou semaglutida.
4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o parceiro de fusão (FP) ser uma forma em comprimento completo, truncada ou variante de fragmento Fc de imunoglobulina, albumina, XTEN ou transferrina; preferivelmente, o fragmento Fc ser derivado a partir de um fragmento
Fc de imunoglobulina humana; preferivelmente, o fragmento Fc ser composto por um até quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em domínio CH1, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CH4; preferivelmente, o fragmento Fc ser derivado a partir do fragmento Fc de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM, mais preferivelmente, do fragmento Fc de IgG; mais preferivelmente, o fragmento Fc ser derivado a partir do fragmento Fc de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, e mais preferivelmente, o fragmento Fc de IgG ter reduzido efeito ADCC e/ou efeito CDC e/ou afinidade de ligação intensificada a FcRn.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o parceiro de fusão (FP) também ser ligado diretamente ou por meio de um segundo adaptador L2 a uma sequência de aminoácido ST que contém um sítio de reconhecimento de sortase, preferivelmente, a sortase ser sortase A ou sortase B; preferivelmente, o ST conter o sítio de reconhecimento central LPXTG de sortase A, em que X é qualquer aminoácido, e o ST é tais como LPETG, LPETGG ou LPETGGG; mais preferivelmente, o ST conter adicionalmente uma etiqueta de afinidade ligada ao sítio de reconhecimento de sortase, e o ST ser, por exemplo, LPETGGHHHHHH ou LPETGGWSHPQFEK; e em que o segundo adaptador L2 é um peptídeo que contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácidos; mais preferivelmente, o segundo adaptador L2 é um peptídeo flexível que contém A, T, G, e/ou S, tal como (GS)n, em que n é um número inteiro de 1 até 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10.
6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o segundo adaptador L2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18), GGGGS (EQ ID NO: 19), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20), e GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21).
7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a proteína de fusão ter uma estrutura de GLP-1-L1-FP-L2-ST, e qualquer um ou ambos de L1 e L2 podem não estar presentes.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os um, dois ou mais polímeros hidrofílicos serem, cada qual, independentemente selecionados a partir de polissacarídeo e polialquileno glicol, tais como polipropileno glicol e polietileno glicol; o polialquileno glicol poder ser capeado na extremidade, por exemplo, capeado com grupo alcóxi, tal como o grupo metóxi, e/ou o polialquileno glicol ser linear ou ramificado, e, por exemplo, o grupo de polialquileno ser ramificado, tal como polietileno glicol ramificado, especialmente, polietileno glicol ramificado capeado com grupo metóxi; o peso molecular do polialquileno glicol poder ser ≥ 1, ≥ 10, ≥ 20, ≥ 30, ≥ 40, ≥ 50, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, ≥ 90, ≥ 100, ≥ 110, ≥ 120, ≥ 130, ≥ 140, ≥ 150, ou ≥ 160 kDa, por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 kDa, ou um valor entre quaisquer dois dos valores; e, preferivelmente, o peso molecular do polímero hidrofílico ser 20 kDa ou 40 kDa.
9. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma quantidade efetiva do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável.
10. Uso do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para reduzir a glicose sanguínea ou o peso corporal, preferivelmente, para o tratamento de diabetes, incluindo diabetes tipo I e diabetes tipo II, especialmente, diabetes tipo II.
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