CN102718870B - 一种胰岛素生物增敏剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，涉及一种胰岛素生物增敏剂及其应用。具体的，是一种增加胰岛素敏感性的多肽，以及该多肽在制备治疗胰岛素抵抗的药物中的应用。该多肽能特异地结合胰岛素，把细胞外游离胰岛素带入体细胞内，使得胰岛素发挥功效，治疗胰岛素抵抗相关的疾病或综合症。如糖尿病、肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、老化、老年痴呆、癌症等等。也可用于预防和延缓这些疾病或病症的发生与发展。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种胰岛素生物增敏剂及其应用。具体的，是一种增加胰岛素敏感性的多肽，以及该多肽在制备治疗胰岛素抵抗的药物中的应用。该多肽能特异地结合胰岛素，把细胞外游离胰岛素带入体细胞内，使得胰岛素发挥功效，治疗胰岛素抵抗相关的疾病或综合症。
背景技术
工业化提供丰富而廉价的食品和负担得起的运输方式如汽车等，一直在稳步改善和提高人们的生活水平。然而，人们往往吃得过多，体能活动过少，从而导致能量摄入和消耗不平衡。多余的能量则转化为多余的脂肪，其结果是肥胖。肥胖导致骨骼肌、脂肪组织及肝脏脂肪异位堆积，对胰岛素的敏感性及反应性降低或丧失，发展为胰岛素抵抗。这时，胰岛β细胞要分泌更多的胰岛素，以弥补胰岛素作用能力的不足，从而保证血糖水平正常，由此诱发β细胞功能受损，胰岛素的分泌能力下降，出现糖耐量损害，直至发展为II型糖尿病，及其他代谢性疾病如高血压、脂代谢紊乱、腹型肥胖、非酒精性脂肪肝、老年痴呆、哮喘、某些癌症等。
针对胰岛素抵抗，人们已经开发出数种胰岛素化学增敏剂，以增加组织细胞对胰岛素的敏感性，使血中葡萄糖进入细胞内，从而减少胰岛素的需要量，使现有的胰岛素（包括自己分泌的和注射的）发挥更大的作用，并减少高胰岛素血症的副作用。胰岛素化学增敏剂主要有二类：①罗格列酮类Rosiglitazone，包括马来酸罗格列酮 Rosiglitazone Maleate（商品名：文迪雅Avandia〈英国葛兰素史克〉），盐酸罗格列酮（商品名：维戈洛〈上海三维〉），罗格列酮钠（商品名：太罗〈重庆太极〉），等等。②吡格列酮类Pioglitazone，包括盐酸吡格列酮（商品名：艾可拓Actos〈日本武田〉、艾汀Actins〈北京太洋〉、卡司平〈杭州华东〉、瑞彤〈江苏恒瑞、德源〉、安可妥〈四川迪康〉），等等。
罗格列酮可通过激活过氧化物酶增殖体受体来减轻胰岛素抵抗，同时改善并保护胰岛β细胞功能。对于肥胖或超重并伴有胰岛素抵抗的II型糖尿病患者的血糖控制均有明显效果。然而，Nissen和Wolski在《新英格兰医学杂志》上发表的文章引发了人们对罗格列酮心血管安全性的关注。该文称服用罗格列酮增加了心肌梗死的发病风险。这样，被列为胰岛素增敏剂的主打品种罗格列酮因长时间服用会增加心肌梗死或中风等缺血性心血管意外的风险而备受业界诟病。美国FDA权衡利弊之后在2010年作出了严格限制罗格列酮使用的决定。其实，这等于宣告了胰岛素增敏剂需要重新研究与开发。
尽管DPP-4类肠促胰素引领着II型糖尿病治疗理念的变革，胰岛素抵抗在II型糖尿病中不解决，促进胰岛素分泌和增加血液中胰岛素的浓度的努力是徒劳无功的，难以达到预想的结果，反而这些措施会加重胰岛素抵抗，最终会加重糖尿病及其并发症。因此，减弱甚至去除胰岛素抵抗是II型糖尿病的治疗要点。目前全球市场已经留下了空白，正等待着这一类新型、划时代胰岛素增敏类药物的到来。
发明内容
为了解决背景技术中提到的治疗胰岛素抵抗的药物的需求，本发明的技术目的在于提供一种新的胰岛素生物增敏剂。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下。
一、本发明的新的胰岛素生物增敏剂的设计原理。
胰岛素自从胰岛β细胞分泌后，进入血液。在心脏搏动下，胰岛素通过血液循环流动到各个脏器组织。通过这些组织细胞表面的特殊蛋白受体（胰岛素受体），胰岛素与之结合后激活胰岛素信号传达系统而发挥其生物活性效应。胰岛素受体是一种酪氨酸特异蛋白激酶。胰岛素与其受体结合，可以促进受体的自身磷酸化，也就是将高能磷酸化合物的磷酸基团转移并结合于β-亚基的酪氨酸残基上。此一活化的受体可以转移信息到下游信号通路而放大其活性效应。因此，靶细胞表面的胰岛素受体决定着胰岛素生物活性效应的强弱。
胰岛素受体属于受体酪氨酸激酶家族。胰岛素受体（和有关的IGF-I受体）有一个二硫键相连的二聚体结构，有两个细胞外α亚基（含有胰岛素结合区域）和两个跨膜β亚基（含有酪氨酸激酶激活位点）。胰岛素受体是糖基化程度高的模块化结构。每个单体从N到C -末端先后含有两个富含亮氨酸的重复大领域（L1和L2，由富含半胱氨酸（CR）的区域联系），随后三个III型纤维连接蛋白区（FnIII-1 to 3）。
一个胰岛素受体只高亲和力地结合于一个胰岛素分子，但另外至少有一个，也许有额外的两个分子以低亲和力结合。胰岛素受体有两个主要的胰岛素结合位点：站点1和站点2，分别位于L1和FnIII-1功能区域。FnIII-2的C-端（CT）的12种氨基酸小肽段有辅助结合位点1的作用，虽然它相距于α亚基主要序列甚远。这些功能区域在胰岛素受体的非游离状态下使胰岛素能够发挥正常功效。本申请发明人研究发现，游离状态的胰岛素受体低亲和力地结合胰岛素。这种低亲和力结合可能能够降低胰岛素的功效。故而，游离胰岛素受体的增加似乎与糖尿病病人的血糖升高有关。
本申请发明人最近的结果表明，细胞外段可溶性胰岛素受体与免疫球蛋白的Fc（244个氨基酸）或伽玛链（103个氨基酸）的C-端恒定区表达的融合蛋白明显提高可溶性胰岛素受体对胰岛素的亲和力。胰岛素受体细胞外区域与来自于酿酒酵母转录激活因子GCN4的33亮氨酸残基锁链的融合表达，可使其与胰岛素的亲和力达到野生型胰岛素受体相当的水平。说明细胞外区域的构象变化决定其受体的高亲和力。
二、基于上述原理，本发明提供了一种新的胰岛素生物增敏剂，具体是将胰岛素结合序列InBP1或InBP2与人免疫球蛋白4的Fc片段融合表达得到的融合蛋白InBP-polyG-IgG4Fc；其中所述的胰岛素结合序列InBP1具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2；所述的胰岛素结合序列InBP2具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
三、本发明所述的胰岛素生物增敏剂的制备方法为：
（1）为使游离胰岛素受体能够高亲和力地结合胰岛素，并让游离胰岛素发挥生物效应，将胰岛素受体的胰岛素结合序列InBP1或InBP2与人免疫球蛋白4的Fc片段通过polyG连接并融合表达；在InBP的N-端融合加入人生长激素（hGH）分泌信号前导肽，并且在InBP分子和IgG4Fc分子之间引入富含甘氨酸序列（PolyG），以保证InBP与受体结合所需的空间，得到融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc（见附图1）。
整个完整的多肽（hGH-InBP1-polyG-IgG4Fc）的核苷酸序列示于SEQ ID NO：5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；同理，整个完整的多肽（hGH-InBP2-polyG-IgG4Fc）的核苷酸序列示于SEQ ID NO：7，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
其中，所述的InBP1和InBP2为：
InBP 1：Arg-Leu-Phe-Phe-Asn-Tyr-Ala-Leu-Val-Ile-Phe。
InBP 2：Phe-Glu-Asp-Tyr-Leu-His-Asn-Val-Val-Phe-Val。
其中，所述的人免疫球蛋白4的Fc片段为：
Thr-Lys-Thr-Tyr-Thr-Cys-Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg-Val-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Pro-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Ala-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys。
其中，所述的hGH为：
Met-Pro-Leu-Trp-Val-Phe-Phe-Phe-Val-Ile-Leu-Thr-Leu-Ser-Asn-Ser-Ser-His-Cys-Ser-Thr-Gly。
其中，所述的polyG为：
Glu-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly。
（2）融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc在哺乳动物细胞中表达分泌前其hGH前导肽被蛋白酶直接切除。因此，表达分泌后纯化获得的融合蛋白只有三个部分：InBP-PolyG-IgG4Fc。胰敏素的三个部分的功能和效应是各不相同的：InBP与胰岛素结合；PolyG给予InBP空间结合胰岛素；IgG4Fc可稳定整个融合分子并与A蛋白特异亲和，协助融合蛋白的分离纯化。
本发明所述的胰岛素生物增敏剂InBP-PolyG-IgG4Fc可以从哺乳动物细胞中提取纯化；可以提高胰岛素进入效应细胞，改善胰岛素的生物效应。可以应用于胰岛素抵抗的治疗。
四、本发明所述的胰岛素生物增敏剂在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
其中，所述的治疗胰岛素抵抗药物具体包括治疗肥胖症、I型糖尿病、II型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、老年痴呆症、癌症以及老化加速的药物。
五、本发明所述的胰岛素生物增敏剂修饰后在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明所述的胰岛素生物增敏剂InBP-PolyG-IgG4Fc命名为InSA（insulin signaling activator，胰岛素增敏素，简称胰敏素）。
本发明所述的胰敏素与胰岛素结合，使胰岛素绕过有胰岛素抵抗的胰岛素受体而进入靶细胞内，从而激活胰岛素通路而使胰岛素发挥正常功效。已经检测胰岛素通路被胰敏素激活五倍以上，这样就可以减少五倍以上的胰岛素用量，从而消除胰岛素诱导胰岛素抵抗的副作用。胰敏素是三种人自身蛋白的组合，注射或口服入体内后相互不脱离，可经过正常代谢降解失效，因此，无毒副作用。
本发明所述的胰敏素有十大优点与创新之处：
1）胰敏素是本申请发明人经过十余年的艰苦奋斗而制成的高、精、尖科研成果。它与胰岛素结合，使胰岛素绕过有胰岛素抵抗的胰岛素受体而进入靶标细胞内，从而激活胰岛素通路而使胰岛素发挥正常功效。
2）在胰岛素缺乏的I型糖尿病病人，胰敏素与胰岛素并用，显著减少胰岛素用量。而肥胖和II型糖尿病病人，因已有高胰岛素血症，不需要并用胰岛素，单用胰岛素增敏素就可以达到降低血糖的目的。
3）胰敏素能很好控制血糖，能调控脂代谢紊乱、降血压及改善血管内皮功能、抗炎、抗凝等作用。可以减少大血管病变的危险因素，以降低糖尿病大血管病变的发生率，延缓2型糖尿病出现并发症的时间，改善患者生活质量。
4）胰敏素能够减少胰岛素用量，这样减少胰岛素对机体细胞的危害作用，增强机体细胞的抗氧化及抗衰老机能。
5）胰敏素减少胰岛素的用量，减弱胰岛素对异位脂肪堆积的刺激效果，从而降低胰岛素抵抗的诱导效果，是II型糖尿病和肥胖理想的治疗剂。
6）胰敏素在治疗多囊卵巢综合征、降低尿白蛋白排泌等方面预期有强大的治疗效果。
7）效果好：已经检测器官特异的胰岛素通路被胰敏素激活五倍以上，这样就可以减少五倍以上的胰岛素用量。长期使用无胰岛素抵抗副作用的诱导发生。
8）副作用无或低：胰敏素是三种蛋白的组合，注射入体内后相互不脱离，可经过正常代谢降解失效。
说明书附图
图1是本发明所述胰岛素生物增敏剂的分子设计与构建原理图。
图2是本发明所述胰岛素生物增敏剂增强肝细胞胰岛素对Akt的激活作用。
备注：于1c1c7细胞的培养基中加入0.1 nm胰岛素和/或0.1 nM本发明所述胰岛素生物增敏剂作用1分钟后，肝细胞裂解于4℃。4～20%梯度胶SDS-PAGE 电泳分析检测磷酸化和总Akt。
图3是本发明所述胰岛素生物增敏剂明显增强胰岛素对肝细胞的激活作用。
备注：于肝肿瘤1c1c7细胞的培养基中加入0.1nm胰岛素与胰敏素共同或单独作用1分钟后，肝细胞裂解于4℃。4～20%梯度胶SDS-PAGE电泳分析，扫描后，计算激活的Akt蛋白占总蛋白的相对含量。实验表明0.1nM胰岛素不明显激活肝细胞Akt，然而，在0.1nM胰敏素的共同作用下，0.1nM胰岛素激活Akt五倍左右（数据来自于三次类似的实验，p值小于0.001，差别非常显著）。
图4是本发明所述胰岛素生物增敏剂降低高脂喂养鼠血糖。
备注：高脂饮食（Research Diets no. D12330: 每100卡路里中有58.0卡来自于脂肪，16.0卡蛋白，26卡碳水化合物）喂养C57BL/6鼠4周，断尾静脉测血糖后继续高脂喂养，同时腹腔内注射胰敏素（10mg/kg，每日一次）连续14日，断尾静脉检测血糖一次。
具体实施方式
实施例1 胰敏素融合蛋白的表达
1）hGH-InBP-polyG-IgG4Fc整合质粒的构建
把人生长激素分泌肽-胰岛素高亲和力结合序列-富含甘氨酸序列（PolyG）-人免疫球蛋白4的Fc片段融合表达的融合蛋白哺乳动物表达体系。
首先，体外合成人生长激素分泌肽的正向链hGH-F和反向互辅链hGH-R。
hGH-F：
GCGGAATTCACCATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTTGTGATCCTCACCCTCAGCAACAGCTCCCACTGCTCCACCGGT。
hGH-R：
ACCGGTGGAGCAGTGGGAGCTGTTGCTGAGGGTGAGGATCACAAAGAAGAACACCCAGAGTGGCATGGTGAATTCCGC。
其次，设计胰岛素高亲和力结合序列的正向链InBP-F和反向互辅链InBP-R。这二对重复寡核苷酸在体外进行退火和磷酸化处理后，加上polyG三片段连接入pEGFP-N1（购自Clontech）的EcoRI-BamHI位点之间，构建成功p208-InBP表达载体。
InBP-F：
GCTCCACCGGTTTTGAGGATTACCTGCACAACGTGGTTTTCGTCCTCGAGGGATCCGCG。
InBP-R：
CGCGGATCCCTCGAGGACGAAAACCACGTTGTGCAGGTAATCCTCAAAACCGGTGGAGC。
）人免疫球蛋白4Fc段的表达
为构建人免疫球蛋白4Fc段的表达载体，体外合成正向引物h4FcF和反向引物h4FcR。
h4FcF：
gcgGGATCCggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcACGAAGACCTACACCTGCAACGTAG。
h4FcR：
gcgGGTACCTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG。
以来自于健康人的外周血淋巴细胞的cDNA（来自于南京医科大学免疫学系）为模版，应用PCR法（条件为94℃30秒，54℃30秒，68℃2.5分，共50循环）扩增出人IgG4/Fc片段。IgG4/Fc扩增片段用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切。同时，将p208-InBP表达载体用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切。胶提纯化后将双酶切处理的PCR扩增片段亚克隆到质粒p208-InBP的BamHI和KpnI位点之间。构建成p208-InSA质粒。至此胰敏素融合蛋白哺乳动物表达质粒构建完成。
实施例2 胰敏素稳定表达细胞系的建立
为获得胰敏素（InSA）融合蛋白的稳定表达细胞系，本实施例首先将构建的整合质粒p208-InSA转染入CHO-K1细胞（购自ATCC）中。哺乳动物细胞CHO-K1细胞在35 mm细胞培养板中在完全培养基（DMEM）37℃和5%CO2下培养过夜。利用Lipofectamine 2000（购买自Invitrogen）转染试剂，将p208-InSA质粒DNA转染进入CHO-K1细胞。转染24小时后，将细胞转移到100 mm培养板中继续培养24小时。然后，将培养基更换为G418 (1000 μg/mL) 筛选培养基。待对照组细胞无存活细胞后更换为低G418 (100μg/mL) 培养基。维持培养2-4周后仔细挑选细胞克隆。细胞在12孔板中培养4周后，每孔抽取1μL培养上清，应用HRP标记羊抗人IgG抗体，进行Dot-blot免疫印迹快速分析。挑选密度较低而斑点信号相对较强的孔中的细胞克隆作为稳定、高效表达的细胞株。
实施例3胰敏素融合蛋白的放大化制备方法
筛选出的稳定高效表达细胞株继续放大培养直到10 cm培养皿中。液氮、-80℃分别保存后再放大培养直到10c m培养皿中100%铺满。然后，将细胞以便1×106/mL密度转移到250 mL滚瓶培养瓶中，以37℃，5%CO2 ，120转/分的转速下培养。当细胞密度达到6×106/mL后，细胞转移到1L滚瓶培养瓶中，同样条件下培养直至细胞不再明显增长为止（约一周左右）。低温下离心细胞悬液，留存细胞培养上清，进行SDS-PAGE和免疫印迹分析鉴定，同时细胞培养上清于-80℃条件下冷冻干燥保存。
实施例4 胰敏素融合蛋白的纯化制备方法
将实施例3的冷冻干燥品在4℃下用PBS溶解，通过0.45μm滤膜过滤。按1:1体积比与4℃预冷的抗体结合液体（1.5 M Glycine/NaOH, 3 M NaCl, pH 9.0）制成30 L 胰敏素融合蛋白粗制品。将所有粗制品以1 mL/min的速度稳定通过含有5mL蛋白A-琼脂糖凝胶的抗体纯化柱。再用相同体积洗涤液通过纯化柱以充分洗涤使UV检测洗涤峰值达到基本值。然后，用pH6.8的温和洗脱缓冲液洗脱抗体纯化柱，同时，密切鉴测洗脱液的UV检测峰值。在其峰值即将抬高时，以1mL每管收集洗脱峰值最大的洗脱液。合并后对PBS缓冲液，4℃条件下透析过夜，再脱水浓缩。然后，经冷冻干燥，制成粉针剂。
试验验证的设计
1）、胰敏素融合蛋白提高肝细胞对胰岛素的敏感性：
取1×106鼠1c1c7肝细胞（购自美国ATCC）铺板于12孔板中，过夜后暴露于无血清培养基4小时。於1c1c7细胞的培养基中加入0.1nm胰岛素和/或0.1nM胰敏素作用1分钟后，肝细胞裂解于4℃。4-20%梯度胶SDS-PAGE 电泳分析检测磷酸化和总Akt（图2）。扫描后，计算激活的Akt蛋白占总蛋白的相对含量。实验表明0.1nM胰岛素不明显激活肝细胞Akt，然而，在0.1nM胰敏素的共同作用下，0.1nM胰岛素激活Akt升高五倍左右（资料来自于三次类似的实验，p值小于0.001，差别非常显著）（图3）。
2）胰敏素降低高脂喂养鼠血糖：
C57BL/6小鼠（购自中国科学院）（30个，n=9）饮用高脂饮食（Research Diets no. D12330: 每100卡路里中有58.0卡来自于脂肪，16.0卡蛋白，26卡碳水化合物）4周，断尾静脉测血糖后继续高脂喂养，同时腹腔内注射胰敏素（10 mg/kg，每日一次）连续14日。断尾静脉检测血糖一次。胰敏素融合蛋白注射DIO小鼠的血糖浓度显著低于未处理组（P<0.01，P<0.05）（图4）。
序列表
<110> 马鞍山中美德康生物科技有限公司；南京美博生物科技有限公司
<120> 一种胰岛素生物增敏剂及其应用
<130> 20110524
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atg cca ctc tgg gtg ttc ttc ttt gtg atc ctc acc ctc agc aac agc 48
Pro Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser
1 5 10 15
tcc cac tgc tcc acc ggt cga ctg ttc ttt aac tac gcg ctg gtc atc 96
Ser His Cys Ser Thr Gly Arg Leu Phe Phe Asn Tyr Ala Leu Val Ile
20 25 30
ttc gga tcc ggc ggc ggc ggc agc ggc ggc ggc ggc agc ggc ggc ggc 144
Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
ggc acg aag acc tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc 192
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
50 55 60
aag gtg gac aag aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca 240
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
65 70 75
tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc 288
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
80 85 90 95
cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg 336
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
100 105 110
tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac 384
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
115 120 125
tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg 432
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
130 135 140
gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc 480
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
145 150 155
ctg cac cag gac tgg ctg ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aca 528
Leu His Gln Asp Trp Leu Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Thr
160 165 170 175
aag gcc tcc cgt cct cca tcg aga aaa cca tct cca agc caa ggg cag 576
Lys Ala Ser Arg Pro Pro Ser Arg Lys Pro Ser Pro Ser Gln Gly Gln
180 185 190
ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg 624
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
195 200 205
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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
210 215 220
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 720
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
225 230 235
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 768
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
240 245 250 255
tac agc agg cta acc gtg gac aag agc tgg cag gag ggg aat gtc ttc 816
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
260 265 270
tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag 864
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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290 295
Claims (4)
1. 一种胰岛素生物增敏剂，其特征在于其是将胰岛素结合序列InBP1或InBP2与人免疫球蛋白4的Fc片段融合表达得到的融合蛋白InBP-polyG-IgG4Fc；其中所述的胰岛素结合序列InBP1是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2；所述的胰岛素结合序列InBP2是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：4；
其制备方法为：
（1）将胰岛素受体的胰岛素结合序列InBP1或InBP2与人免疫球蛋白4的Fc片段通过polyG连接并融合表达；在InBP的N-端融合加入hGH分泌信号前导肽，并且在InBP分子和IgG4Fc分子之间引入PolyG，以保证InBP与受体结合所需的空间，得到融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc，其是SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8；
（2）融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc在哺乳动物细胞中表达后直接切除hGH前导肽，得到InBP-polyG-IgG4Fc融合蛋白。
2. 权利要求1所述的胰岛素生物增敏剂在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的治疗胰岛素抵抗药物包括治疗肥胖症、I型糖尿病、II型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、老年痴呆症、癌症以及老化加速的药物。
4. 权利要求1所述的胰岛素生物增敏剂在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
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