KR101238979B1 - Ｐｅｇ화된 인슐린 리스프로 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨병 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 고분자량 폴리(에틸렌 글리콜)로 PEG화되어 있고, 생리학적 pH에서 가용성이 높고, 장기간의 작용 지속 시간을 갖고, 약동학적 성질, 약력학적 성질, 및/또는 2 미만의 활성 정점 -저점 비를 특징으로 하는 것인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 분자를 제공하는 방법, 상기 화합물을 함유하는 제약 조성물, 및 상기 화합물의 치료상 용도에 관한 것이다.

Description

ＰＥＧ화된 인슐린 리스프로 화합물{PEGYLATED INSULIN LISPRO COMPOUNDS}
본 발명은 당뇨병 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 가용성이 높고, 장기간의 작용 프로파일을 갖는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 상기 분자를 제공하는 방법, 상기 화합물을 함유하는 제약 조성물, 및 상기 화합물의 치료상 용도에 관한 것이다.
혈당증이 정상이 되도록 하기 위한 목적으로 정상적인 개체에서 일어나는 내인성 인슐린 분비 패턴과 가능한 가깝게 유사하도록 만들기 위해서 디자인된 것이 인슐린 대체 요법이다. 인슐린에 대한 생리학적 1일 요구량은 변동적이며, 이는 2개의 단계: (a) 식사와 관련된 혈당 상승을 처리하기 위하여 인슐린 펄스를 필요로 하는 흡수 단계 및 (b) 공복 혈당을 최적의 상태로 유지시키기 위한 목적으로 간 글루코스 배출을 조절하기 위해 지속적인 양의 인슐린을 필요로 하는 흡수 후 단계로 분리될 수 있다. 따라서, 당뇨병에 대해 유효한 인슐린 요법은 일반적으로 2가지 유형의 외인성 인슐린 제제: 볼루스 주사에 의해서 식사 시간에 제공되는 초속효성 인슐린, 및 식사 시간 사이의 혈당 수준을 조절하기 위해 1일 1회 또는 2회에 걸쳐서 주사로 투여되는 지속형 인슐린을 조합하여 사용하는 병용 요법을 포함한다.
현재 이용가능한 인슐린 대체 요법은 하나 이상의 임상적으로 중요한 측면에서 부족함을 나타낸다. 예를 들면, 종래의 중간형- 및 지속형 인슐린 제제, 예로서, 기초 인슐린 유사체인 인슐린 디터머는 매일 투여되었을 때 하루 종일 기초 글루코스를 조절하기에는 불충분한 활성 지속 시간을 갖는다. 그 결과, 기초 인슐린의 작용 지속 시간은 종종 매일 이루어지는 단일 주사로는 고혈당증을, 및 더욱 특히, 흡수 후 단계의 필요조건을 적절히 조절하기에는 불충분하기도 하다. 추가로, 현 요법의 단일 주사를 생략하게 되면 약물의 "정점(peak)-대-저점(trough)" 수준은 현저히 증가할 수 있고, 이로써 글루코스 조절은 제 기능을 발휘하지 못하게 될 수 있다. 게다가, 예로서, 중성 프로타민 하게돈(NPH: Neutral Protamine Hagedorn) 및 울트라렌트?의 결정질 현탁액과 같은 종래의 중간형- 및 지속형 인슐린 제제에서 인슐린 방출을 연장시키기 위하여 불용성 전략법을 이용하거나, 또는 인슐린 글라진의 생체내 침전 전략법을 이용하게 되면 주사내 가변성을 증가하게 되고, 이로써 투여량-반응 프로파일의 가변성도 확장되게 된다. 더욱 특히, NPH 및 울트라렌트? 현탁액은 확실히 생성물을 균일하게 하기 위해서 기계적으로 혼합할 필요가 있고, 확장된 피험체내 가변성을 가지며, 장기간의 식사 시간 사이 동안 공복 혈당을 최적으로 유지시켜 주는데 필요한 이상적인 "편평한" 약력학적 프로파일을 제공하기보다는 정점에 도달하려는 경향이 더 크다. 따라서, 불용성 상태에 의존하여 인슐린 방출을 확장시키게 되는 인슐린 제제는 본래 가용성 제제보다는 예측이 어렵고, 혈당을 적절하게 조절하지 못하는 경향이 더 크며 생명을 위협하는 저혈당 에피소드에 대한 감수성이 더 커지게 된다. 추가로, 현 기초 인슐린 유사체는 초속효성 또는 즉각 작용형 인슐린과는 쉽게 혼합되지 않는다. 따라서, 현 인슐린 대체 요법은 여전히 당뇨볍 환자를 생명을 위협하는 저혈당 에피소드, 당뇨병과 관련된 심각한 장기간의 의학적 합병증에 대해 감수성이 큰 상태로 방치하며, 당뇨병과 관련된 심각한 장기간의 의학적 합병증을 일으키고/거나, 환자를 상당 수준 불편하게 만들고 삶의 질에 손실을 가져온다.
발명의 명칭이 "Non-Immunogenic Polypeptides"인 미국 특허 번호 제4,179,337호에는 분자량이 약 500 내지 약 20,000 Da 사이인 선형 PEG 분자에 접합된 인슐린이 개시되어 있다. 힌즈(Hinds) 및 킴(Kim)은 저분자량 (600 Da, 750 Da, 및 2000 Da) 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜) (문헌 [Hinds, K.D., and Kim, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54:505-530 (2002)])을 개시한 바 있다. 상기 논문에서 저자는 "고분자량 mPEG (5000 Da)가 부착되게 되면 접합체의 생체활성이 상당 수준 저하되는 것으로 종래에 밝혀진 바 있기 때문에" 저분자량 mPEG 인슐린 접합체로 그들의 연구를 제한하였다고 밝혔다. PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/079641에는 작은 분지형의 중합체와 인슐린 유도체 (인슐린 리스프로 포함)의 접합이 개시되어 있다. 특히, PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/091494에는 각각 PEG의 총 분자량이 약 10 kDa 내지 약 20 kDa 이하인 선형 및 분지형 PEG 분자에 접합된 인슐린 분자가 개시되어 있다. 특히, PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/015099 (2008년 2월 7일 공개) 및 WO 2008/084051 (2008년 7월 17일 공개)에는 공칭 분자량이 약 200 내지 약 40,000 Da 범위인 PEG 분자에 접합된 각종 인슐린 유사체가 개시되어 있다.
기초 인슐린 대체 요법에 대하여 보다 더 우수한 적합성을 띠는, 장기간 지속되는 인슐린이 여전히 중요하게 요구되고 있다는 것은 분명하다. 특히, 식사시 인슐린 제제와 혼합될 수 있고, 장기간의 시간-작용 프로파일 (즉, 1일 1회 이하의 빈도로 주사되어도 혈당 수준을 적절하게 조절할 수 있는 장기간의 시간-작용 프로파일), 보다 편평한 활성, 약동학적 프로파일 (즉, 보다 낮은 "정점-대-저점" 비), 감소된 환자내 가변성 (즉, 시간-작용 프로파일을 보다 쉽게 예측할 수 있고, 이는 저혈당증 및/또는 체중 증가의 발생 정도 감소로 해석된다)을 갖고/거나 주사 부위에 대한 자극 또는 주사시의 통증이 감소된 가용성 기초 인슐린이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 인슐린 리스프로를 고분자량 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체로 PEG화시킴으로써 치료학적으로 유효한 기초 인슐린 활성을 갖고, 장시간의 작용 프로파일을 갖고, 생리학적 pH에서 가용성이 높고, 및/또는 보편적으로 사용되는 기타 다른 식사시 인슐린 제제와 혼합될 수 있는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 제공할 수 있다는 것을 발견하게 되었고, 이를 보고하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112010081412179-pct00001
상기 식에서,
A는 인슐린 리스프로의 A-쇄이고 (서열 1);
B는 인슐린 리스프로의 B-쇄이고 (서열 3);
P는 분자량 범위가 약 20 kDa 내지 약 40 kDa인 PEG이고, 여기서 A 및 B는 적절히 가교결합되어 있고, P는, A의 1번 위치에 있는 글리신의 알파-아미노기에, B의 1번 위치에 있는 페닐알라닌의 알파-아미노기에 또는 B의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에, 공유 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 부착되어 있다.
본 발명은 또한 다수의 모노- 및 디-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 포함하되, 여기서 본 조성물 중의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 75％ 초과의 것은 화학식 I의 모노-PEG화된 화합물인 것인 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 I의 모노-PEG화된 인슐린 화합물을 포함하되, 여기서 본 조성물 중의 모노-PEG화된 화합물 중 약 50％ 초과의 것은 PEG가 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 직접 또는 간접적으로 부착되어 있는 것인 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 보존제, 등장제, 금속 이온, 또는 완충액을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 및 하나 이상의 제약상 허용되는 보존제, 등장제, 금속 이온, 또는 완충액을 포함하는 제약 조성물은 추가로 치료상 유효량의 인슐린 유사체를 포함한다.
본 발명은 또한 치료상 유효량의, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 포함하는 제약 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 고혈당증, 진성 당뇨병 또는 임신성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 치료상 용도도 포함한다.
본 발명은 또한 고혈당증, 진성 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 용도도 포함한다.
도 1은 래트 및 개로부터 얻은 PK 파라미터의 상대성장 스케일에 기초하여 작성된, 20 kDa PEG-B28-인슐린 리스프로, 40 kDa-PEG-B28-인슐린 리스프로, 및 인슐린 디터머에 대한 모의 인간 PK 프로파일을 그래프로 도시한 것이다. 프로파일은 1주간의 투여후 경과된 투약 간격을 나타낸다. 숫자는 평균 정점-저점 비이다.
도 2는 PEG20 kDa-B28 (≥~95％)/A1 (≤~5％)-인슐린 리스프로 (LY; 0.225 mg/kg) 또는 인슐린 글라진 (0.5 U/kg)을 피하 투여한 후, 인간에서의 글루코스 주입 속도 (GIR)에 관한 그래프이다. GIR 프로파일은 관찰된 데이타에 기초한 것이며, 릴리 리서치 라보라토리즈(Lilly Research Laboratories)에서 개발된 "뢰스 평활(loess smooth)" (문헌 [Splus 2000, Professional Edition, MathSoft, Inc]) 함수를 사용하여 관찰된 데이타를 피팅하였다.
본 발명의 상세한 설명
본원에서는 하기 약어가 사용된다: ACN: 아세토니트릴. Boc: t-부톡시카르보닐. BSA: 소 혈청 알부민. DCM: 디클로로메탄, 메틸렌클로라이드. DMF: N,N-디메틸포름아미드. DMSO: 디-메틸 설폭시드. DTT: 디티오트레이톨. EDTA: 에틸렌디아민 테트라아세트산. Et: 에틸. EtOH: 에탄올. Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐. HCl: 염산. Da: 달톤. kDa: 킬로달톤. 릴리(Lilly): 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company) (인디애나주 인디애나폴리스 소재). mAb: 모노클로날 항체. Me: 메틸. MeOH: 메탄올. PBS: 포스페이트 완충처리된 염수. RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피. SEC: 크기-배제 크로마토그래피. SEM: 평균의 표준 오차. SPA: 섬광 근접 측정법. TFA: 트리플루오로아세트산. 본 개시에서 사용된 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R. § 1.822(B)(2)에 기술된 바와 같이 미국 특허청(United States Patent and Trademark Office)으로부터 승인을 받은 것이다.
"인슐린"이라는 용어는 임의의 종으로부터 유래된 야생형 인슐린을 포함하는 것으로 하며, 돼지 인슐린, 소 인슐린, 및 인간 인슐린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연 또는 야생형 인슐린이란 인슐린의 아미노산 서열이 천연 상태에서 발견되는 아미노산 서열에 상응하는 것인 인슐린을 지칭한다. 다수의 상이한 종으로부터 유래된 인슐린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들면, 인간 인슐린은 21개의 아미노산으로 이루어진 A-쇄와, 30개의 아미노산으로 이루어진 B-쇄 (각각 서열 1 및 2)를 갖는다. 인슐린은 천연의 것 (즉, 천연 공급원으로부터 단리된 것), 생합성적으로, 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다. "인슐린"이란 용어는 또한 임의의 인슐린 유도체 및/또는 인슐린 유사체를 포함하는 것으로 한다.
본원에서 "인슐린 유사체" 또는 "인슐린 유도체"는 인슐린 활성을 가지며, 실질적으로는 인간 인슐린과 동일하지만, 인간 인슐린과 비교해서는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역위 또는 부가를 비롯한 변형에 의해 인간 인슐린과는 상이한 것인 아미노산 서열을 갖는 단백질로서 정의된다. 상기와 같은 화합물은 당업계에 주지되어 있다. 예로서, PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/15804 및 WO 03/053339; 미국 특허 번호 제3,528,960호, 제5,514,646호, 제5,618,913호, 제5,750,497호, 제6,011,007호, 제6,251,856호; 및 EP 특허 번호 제254,516호 및 제280,534호를 참조한다. 당업자에게 알려져 있는 인슐린 유사체에 대한 일례로, 완전하지는 않지만 그에 관한 목록에는 인슐린 아스파트, 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 디터머, 및 인슐린 글루리신이 포함되어 있다. 추가로, 본원에서 "인슐린"이라는 용어는 또한 인슐린 유도체 및 인슐린 유사체, 둘 모두로 간주될 수 있는 화합물도 포함한다. 그러한 화합물의 예는 미국 특허 번호 제5,750,497호 및 제6,011,007호에 기재되어 있다. 당업자에게 알려져 있는 상기와 같은 화합물의 구체적인 일례로는 인슐린 디터머가 있다.
각종 인슐린 유사체 및/또는 유도체는 "속효성" 또는 "초속효성" 인슐린 유사체인 것으로 알려져 있다. "속효성" 및 "초속효성"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "초속효성 인슐린 유사체"는 (a) 피하 투여 후 인간 인슐린보다 더 빠르게 시작하고/거나, (b) 피하 투여 후 인간 인슐린보다는 더 짧은 작용 지속 시간을 나타내는 식사시 글루코스 효과를 발휘한다. 속효성 인슐린 유사체의 일례로는 일반적으로 생리학적 조건하에서는 이량체화되거나 자가-결합하는 경향이 더 적기 때문에 속효성인 "단량체 인슐린 유사체"를 포함한다. 단량체 인슐린 유사체는 당업계에 공지되어 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제5,700,662호, 및 유럽 특허 번호 제214 826호를 참조한다. 인슐린 리스프로는 야생형 인슐린 B-쇄 (서열 2)의 28번 위치의 프롤린, 및 야생형 인슐린 B-쇄 (서열 2)의 29번 위치의 리신이 바뀐 초속효성 단량체 인슐린 유사체이다. 따라서, 인슐린 리스프로는 LysB28ProB29-인간 인슐린, LysB28ProB29-인간 인슐린, 및 B28Lys, B29Pro 인간 인슐린을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 명칭으로 당업계에 알려져 있다.
"가교-결합된"이라는 용어는 시스테인 잔기 사이에 존재하는 이황화 결합을 의미한다. 예를 들면, 적절하게 가교-결합된 인간 인슐린은 서열 1의 7번 위치에 있는 시스테인과 서열 2의 7번 위치에 있는 시스테인, 서열 1의 20번 위치에 있는 시스테인과 서열 2의 19번 위치에 있는 시스테인, 및 서열 1의 6번 위치에 있는 시스테인과 서열 1의 11번 위치에 있는 시스테인 사이에 이황화 결합을 포함한다. 유사하게, 적절하게 가교-결합된 인슐린 리스프로 화합물은 서열 1의 7번 위치에 있는 시스테인과 서열 3의 7번 위치에 있는 시스테인, 서열 1의 20번 위치에 있는 시스테인과 서열 3의 19번 위치에 있는 시스테인, 및 서열 1의 6번 위치에 있는 시스테인과 서열 3의 11번 위치에 있는 시스테인 사이에 이황화 결합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "PEG 접합된 인슐린 리스프로" 또는 "PEG화된 인슐린 리스프로"는 적어도 하나의 PEG에 공유 결합하고 있고, 생체내에서 인슐린 활성을 가지는 인간 인슐린 리스프로 또는 그의 유도체를 지칭한다.
인슐린 및 인슐린 리스프로의 생물학적 활성은 잘 확립되어 있다. 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물과 관련하여 "인슐린 활성"이라는 어구는 각각 하기 실시예 5 및 실시예 6에서 기술되는 1형 및 2형 당뇨병을 앓는 동물 모델을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 일반적으로 허용되는 적어도 1마리의 동물 모델의 체내에서 혈당 수준을 현저히 저하시킬 수 있는 능력을 의미하는 것으로 한다. 그러므로, 인슐린 활성은 STZ로 처리된 래트에서 568 nmol/kg의 투여량으로 단일 피하 주사된 후 약 4시간 내지 적어도 약 36시간 범위의 기간 동안 혈당을 100 mg/dL 이하의 수준으로 저하시킬 수 있는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 능력을 포함한다.
"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"라는 용어는 커플링화제를 포함하거나, 포함하지 않거나, 커플링 또는 활성화 부분과의 유도체화가 이루어져 있거나 그렇지 않은 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 지칭한다. 그의 전형적인 형태로 PEG는 말단 하이드록실기를 갖는 선형 중합체로서, 이는 식 HO-CH2CH2-(CH2CH2O) n -CH2CH2-OH를 갖는다. PEG에서 반복 서브유니트의 개수인 "n"은 대략적으로 달톤으로 기술되는 분자량에 가깝다. 전형적으로 PEG화된 화합물을 제조하는 데 사용되는 PEG 시약은 PEG 중합체 중 에틸렌 글리콜 서브유니트의 개수 (n)가 상이한 PEG의 이종성 혼합물을 포함한다. PEG의 단일 에틸렌 글리콜 서브유니트 (-(CH2CH2O))의 분자량은 약 44 달톤이다. 그러므로, PEG 중합체의 분자량은 개수 (n)에 따라 달라진다. 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 부착된 PEG는 약 400 내지 약 1000개 범위의 n개의 서브유니트를 가질 것이다. 바람직하게, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 부착된 PEG는 약 400 내지 약 750개 범위의 n개를 가질 것이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 부착된 PEG는 약 400 내지 약 550개 범위의 n개를 가질 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 부착된 PEG는 약 400 내지 약 500개의 n개를 가질 것이다.
다수의 PEG 유도체와, 상기를 제조하는 방법 및 상기를 단백질, 예로서, 인슐린 또는 인슐린 리스프로에 접합시키는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에서 사용하기에 적합한다. 예로서, (PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/62827, WO 2006/028745, WO 2006/096535, WO 2006/036825; 문헌 [Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995]; [Veronese, et al., Applied Biochem . and Biotech. 11:141-152, 1985]; 및 [Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002.])를 참조한다. 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 PEG는 중합체의 한쪽의 말단이 예로서, 저급 C1 -6 알콕시기와 같이 상대적으로 불활성기로 끝이 나는 것인 PEG이다. 바람직하게, PEG는 모노메톡시-PEG (통상 mPEG로 지칭된다)인 것으로서, 이는 중합체의 한쪽의 말단이 메톡시 (-OCH3) 기인 선형 형태의 PEG이다. 더욱더 바람직하게, 본 발명에서 사용되는 PEG는 선형 PEG의 한쪽의 말단이 메톡시기로 끝이 나고, 나머지 다른 한쪽의 말단은 인슐린 리스프로, 또는 인슐린 리스프로 분자의 특정 부위에서 원하는 활성화된 mPEG로 PEG화되는 것이 용이하게 이루어질 수 있도록 유도체화된 인슐린 리스프로 유도체 상의 원하는 부위와 커플링하는 데 적절한 반응기로 끝이 나는 것인 "활성화된 mPEG"이다.
PEG는 전형적으로 그의 분자량에 있어서 어느 정도는 다른 PEG 화합물의 혼합물로서 생성이 되고 사용이 되기 때문에 당업계의 숙련인은 일반적으로 특정의 PEG화된 화합물을 생성하는 PEG화 반응에서 사용이 되는 PEG 시약의 평균 크기를 기술함으로써 화합물에 부착되는 PEG의 분자량을 기술한다. 평균을 기록할 수 있는 다수의 가능한 방법들 중에서 3가지가 보편적으로 사용된다: 평균 개수, 평균 중량, 및 z-평균 분자량. 본원에서 사용되는 바, "평균 분자량"이라는 어구는 매트릭스-지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 (MALDI-TOF) 질량 분석법, 겔 투과 크로마토그래피 또는 기타 다른 액체 크로마토그래피 기법, 광 산란 기법, 초원심분리 및 점도 측정을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 주지되어 있는 기법을 사용하여 측정될 수 있는 질량-평균 분자량을 지칭하는 것으로 한다. 중량 평균 분자량을 계산하는 공식은
Figure 112010081412179-pct00002
(여기서, Ni은 혼합물 중 분자량이 Mi인 분자의 몰-분수 (또는 개수-분수)이다)으로 나타낼 수 있다. 개수 평균 분자량을 계산하는 공식은
Figure 112010081412179-pct00003
(여기서, Ni은 혼합물 중 분자량이 Mi인 분자의 몰-분수 (또는 개수-분수)이다)으로 나타낼 수 있다. 중량 평균 분자량과 개수 평균 분자량의 비는 다분산 지수 (PDI)로서 알려져 있으며, 이는 분포의 너비를 대략적으로 나타낸다. 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 제조하는 데 적합한 PEG 시약은 전형적으로 다분산성을 띤다 (즉, 중합체의 개수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 동일하지가 않다). 바람직하게, 본 발명의 화합물 또는 조성물을 제조하는 데 사용되는 PEG 시약의 PDI는 약 1.1 미만이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 화합물 또는 조성물을 제조하는 데 사용되는 PEG 시약의 PDI는 약 1.05 미만이다.
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물과 관련하여, 인슐린 리스프로 분자에 공유적으로 부착되는 PEG의 분자량 범위는 약 17.5 kDa 내지 약 40 kDa (n의 범위는 약 400 내지 약 1000)이거나, PEG의 평균 분자량은 약 17.5 kDa 내지 약 40 kDa이다. 바람직하게, 인슐린 리스프로 분자에 공유적으로 부착되는 PEG의 분자량 범위는 약 20 kDa 내지 약 30 kDa (n의 범위는 약 450 내지 약 750)이거나, PEG의 평균 분자량은 약 20 kDa 내지 약 30 kDa이다. 더욱 바람직하게, 인슐린 리스프로 분자에 공유적으로 부착되는 PEG의 분자량 범위는 약 17.5 kDa 내지 약 25 kDa (n의 범위는 약 400 내지 약 550)이거나, PEG의 평균 분자량은 약 17.5 kDa 내지 약 25 kDa이다. 가장 바람직하게, 인슐린 리스프로 분자에 공유적으로 부착되는 PEG의 분자량 범위는 약 17.5 kDa 내지 약 20 kDa (n의 범위는 약 400 내지 약 500)이거나, PEG의 평균 분자량은 약 17.5 kDa 내지 약 20 kDa이다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 원하는 평균 분자량을 갖는 활성화된 mPEG를 인슐린 리스프로에 공유적으로 부착시킴으로써 제조된다. 인슐린 리스프로를 PEG화시키는 반응 조건은 사용되는 특정 PEG, 인슐린 리스프로 상의 부착 부위, 부착의 표적이 되는 인슐린 리스프로 상의 특정 유형의 반응기, 원하는 PEG화 정도 등에 따라서 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정의 PEG화 전략을 위해 최적화된 실험 조건은 전형적으로는 통상의 실험을 통해서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 예로서, N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 (SATP) 및 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA)와 같이 "아민을 티올로 변형시키는" 개질제를 사용하여 인슐린 리스프로에 도입되어 있는 티올 관능기에 티올-선택성인 활성화된 mPEG를 접합시켜 상대적으로 티올-선택성을 띠는 활성화된 mPEG, 예로서, mPEG-말레이미드 (mPEG-MAL) 또는 mPEG-티올 (mPEG-SH)을 인슐린 리스프로에 간접적으로 접합시킴으로써 제조된다. 더욱 바람직하게, 인슐린 리스프로 상의 티올 (설프하이드릴) 기에 PEG를 공유적으로 부착시키는 데 사용되는 활성화된 mPEG는 예를 들면, 하기에 제시하는 (a), (b), 또는 (c)와 같은 mPEG-말레이미드이다.
Figure 112010081412179-pct00004
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 제조하는 바람직한 방법은 안정적인 티오에테르 결합을 형성하기 위하여 마이클 부가(Michael addition)를 사용한다. 상기 반응은 고도로 특이적이고, 기타 다른 작용기의 존재하에 온화한 조건하에서 발생한다. 예를 들면, mPEG-말레이미드는 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 접합체를 제조하는 데 있어서 활성화된 mPEG로서 유용하다. 바람직하게, PEG화 방법은 반응이 완전히 일어나도록 하기 위하여 mPEG-말레이미드와 비교하여 몰 과량의 티올-유도체화된 인슐린 리스프로를 사용한다. 바람직하게, 반응은 또한 실온에서 1 내지 40시간 동안 pH 4.0 내지 9.0에서 수행된다. 과량의, PEG화되지 않은 티올을 함유하는 펩티드는 통상의 분리 방법에 의해서 PEG화된 생성물로부터 용이하게 분리될 수 있다. 활성화된 mPEG-말레이미드를 사용하여 인슐린 리스프로를 PEG화시키는 데 필요한 조건의 일례가 실시예 1에 기술되어 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 상대적으로 아민에 대해 특이적인 활성화된 mPEG를 접합시킴으로써 제조된다. 인슐린 리스프로의, 우선적으로 아민에 특이적인 PEG화에 적합한 활성화된 mPEG로는 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA), mPEG 숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA), mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB), mPEG-숙신이미딜 카르보네이트 (mPEG-SC), mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 및 mPEG-p-니트로페닐 카르보네이트 (mPEG-NPC)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 인슐린 리스프로의 PEG화에 사용되는 활성화된 mPEG에 의해서 가수분해적으로 안정적인 공유 결합, 예로서, 아미드, 우레탄 (또한 카르바메이트로도 알려져 있다), 아민, 티오에테르 (또한 설피드로도 알려져 있다), 또는 우레아 (또한 카르바미드로도 알려져 있다) 결합을 통해 mPEG에 공유적으로 부착된 인슐린 리스프로를 얻을 수 있다. 더욱 바람직하게, 인슐린 리스프로의 PEG화에 사용되는 활성화된 mPEG는 mPEG-SC 또는 mPEG-NPC인데, 상기 둘 모두에 의해서 우레탄 (또는 카르바메이트) 결합을 통해 PEG에 공유적으로 부착된 인슐린 리스프로를 얻을 수 있다. 다양한 분자량을 갖는 mPEG-NPC를 사용하여 인슐린 리스프로를 PEG화하는데 있어서 유용한 조건의 일례는 실시예 2에 기술되어 있다.
Figure 112010081412179-pct00005
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 전형적으로 하나 이상의 정제 기법, 예로서, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 샘플 중 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 전반적인 이종성 (PEG화 반응으로부터 생성된 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 개수 및 비율)은 하기 방법들: 크로마토그래피, 전기영동, 질량 분석법, 및 특히, MALDI-MS, 및 NMR 분광법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 제조하는 데 사용되는 인슐린 리스프로는 용액상 방법, 고체상 방법, 반-합성 방법, 및 재조합 DNA 방법을 비롯한, 승인을 받은 다양한 펩티드 합성 기법들 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,700,662호 (챈스 등(Chance, et al.)) 및 유럽 특허 번호 214 826 (브랜지 등(Brange, et al.))은 각종의 인슐린 유사체의 제조에 관해 개시하고 있다. 인슐린 리스프로의 A- 및 B-쇄 또한 재조합 DNA 기법을 사용하여 프로인슐린-유사 전구체를 통해 제조될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 프로인슐린-유사 전구체는 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로를 제조하는 데 사용되는 인슐린 리스프로를 제조하는 데 사용된다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112010081412179-pct00006
상기 식에서,
A는 인슐린 리스프로의 A-쇄이고 (서열 1);
B는 인슐린 리스프로의 B-쇄이고 (서열 3);
P는 분자량 범위가 약 17.5 kDa 내지 약 40 kDa인 PEG이고, 여기서 A 및 B는 적절히 가교결합되어 있고, P는, A-쇄의 1번 위치에 있는 글리신의 알파-아미노기에, B-쇄의 1번 위치에 있는 페닐알라닌의 알파-아미노기에 또는 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에, 공유 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 부착되어 있다. 본 발명의 바람직한 화합물은 (a) P가 우레탄 또는 티오에테르 결합을 통해서 인슐린 리스프로에 공유적으로 부착되어 있고; (b) 본 화합물은 인간 인슐린 수용체에 대한 Ki가 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 또는 약 5 nM 이하이고, 약 568 nmol/kg으로 투여받은, STZ로 처리된 래트에서 소실 반감기가 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 또는 약 14시간 초과인 것을 특징으로 하거나, STZ로 처리된 래트에서 약 568 nmol/kg의 투여량으로 화합물이 단일 피하 주사된 후 약 4시간 내지 적어도 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간, 또는 약 120시간 범위의 기간 동안 혈당을 약 100 mg/dL 이하의 수준으로 저하시키는 활성을 특징으로 하는 것인 화합물이다. 더욱더 바람직한 화합물은 (a) P가 우레탄 결합을 통해서 인슐린 리스프로에 공유적으로 부착되어 있고; (b) 본 화합물은 인간 인슐린 수용체에 대한 Ki가 약 10 nM 이하인 것을 특징으로 하며; (c) 본 화합물은 약 568 nmol/kg으로 투여받은, STZ로 처리된 래트에서 소실 반감기가 6시간 초과인 것을 특징으로 하고; (d) 본 화합물은 STZ로 처리된 래트에서 약 568 nmol/kg의 투여량으로 화합물이 단일 피하 주사된 후 약 4시간 내지 적어도 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간, 또는 약 120시간 범위의 기간 동안 혈당을 약 100 mg/dL 이하의 수준으로 저하시키는 활성을 특징으로 하는 것인 화합물이다. 가장 바람직한 화합물은 (a) P가 우레탄 결합을 통해서 인슐린 리스프로에 공유적으로 부착되어 있고; (b) 본 화합물은 인간 인슐린 수용체에 대한 Ki가 약 10 nM 이하인 것을 특징으로 하며; (c) 본 화합물은 약 568 nmol/kg으로 투여받은, STZ로 처리된 래트에서 소실 반감기가 6시간 초과인 것을 특징으로 하고; (d) 본 화합물은 STZ로 처리된 래트에서 약 568 nmol/kg의 투여량으로 화합물이 단일 피하 주사된 후 약 4시간 내지 적어도 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 약 108시간, 또는 약 120시간 범위의 기간 동안 혈당을 약 100 mg/dL 이하의 수준으로 저하시키는 활성을 특징으로 하며; (e) 본 화합물은 인간에서 0.225 mg/kg의 투여량으로 단일 비경구적으로 투여되었을 때 소실 반감기가 약 24시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 38시간, 약 40시간, 또는 약 42시간 초과인 것을 특징으로 하는 것인 화합물이다.
본 발명과 일치하는 특징 및 원리에 따르면, 본 발명의 실시태양은 평균 분자량이 약 17.5 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 또는 약 40 kDa이고, 인슐린 리스프로의 A-쇄의 1번 위치에 있는 글리신의 알파-아미노기에 (PEG-GlyA1 인슐린 리스프로), 인슐린 리스프로의 B-쇄의 1번 위치에 있는 페닐알라닌의 알파-아미노기에 (PEG-PheB1 인슐린 리스프로), 또는 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 (PEG-LysB28 인슐린 리스프로) 직접 또는 간접적으로 공유적으로 부착되어 있는 PEG를 포함하는 모노-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 제공한다. 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 평균 분자량이 약 17.5 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 또는 약 40 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 1번 위치에 있는 페닐알라닌의 알파-아미노기에, 또는 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 직접 또는 간접적으로 공유적으로 부착되어 있는 PEG를 포함한다. 더욱 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 평균 분자량이 약 17.5 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 또는 약 40 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 부착되어 있는 PEG를 포함한다. 더욱더 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 평균 분자량이 약 17.5 kDa 또는 약 20 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 부착되어 있는 PEG를 포함한다 (20 kDa-PEG-LysB28 인슐린 리스프로). 가장 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 평균 분자량이 약 20 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 부착되어 있는 PEG를 포함한다 (즉, PEG20 kDa-LysB28 인슐린 리스프로).
본 발명의 다른 실시태양은 분자량이 약 17.5 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 또는 약 40 kDa이고, 인슐린 리스프로의 A-쇄의 1번 위치에 있는 글리신의 알파-아미노기에, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 1번 위치에 있는 페닐알라닌의 알파-아미노기에, 또는 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 직접 또는 간접적으로 공유적으로 부착되어 있는 PEG를 포함하는 모노-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 제공한다. 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 분자량이 약 17.5 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 또는 약 40 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 1번 위치에 있는 페닐알라닌의 알파-아미노기에, 또는 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 직접 또는 간접적으로 공유적으로 부착되어 있는 PEG를 포함한다. 더욱 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 분자량이 약 17.5 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 또는 약 40 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 부착되어 있는 PEG를 포함한다. 가장 바람직하게, 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 분자량이 약 20 kDa이고, 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 부착되어 있는 PEG를 포함하고, PEG-LysB28-인슐린 리스프로는 인간에서 0.225 mg/kg의 투여량으로 조성물이 단일 피하 투여되었을 때 소실 반감기가 약 24시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 또는 약 42시간 초과인 것을 특징으로 한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 PEG가 다른 부위에 부착되어 있는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물, 및/또는 모노-PEG화된, 디-PEG화된, 및 트리-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 예시적인 조성물은 i) PEG-GlyA1 인슐린 리스프로, ii) PEG-PheB1 인슐린 리스프로, iii) PEG-LysB28 인슐린 리스프로, iv) 디-PEG-GlyA1PheB1-인슐린 리스프로, v) 디-PEG-GlyA1LysB28-인슐린 리스프로, vi) 디-PEG-PheB1LysB28-인슐린 리스프로, 및 vii) 디-PEG-GlyA1PheB1-인슐린 리스프로로 구성된 군으로부터 선택되는 1 초과의 PEG화된-인슐린 리스프로 화합물을 포함하는 조성물이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 조성물은 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 97％ 초과의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 화학식 I의 모노-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물인 것인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 97％ 초과의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 모노-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물이고, 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 20％, 약 15％, 약 10％, 약 5％, 또는 약 3％ 미만은 디-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물인 것인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 97％ 초과의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 PEG-LysB28-인슐린 리스프로인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 97％ 초과의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 PEG-LysB28-인슐린 리스프로이고, 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 20％, 약 15％, 약 10％, 약 5％, 또는 약 3％ 미만은 PEG-GlyA1-인슐린 리스프로인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 97％ 초과의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 PEG-LysB28-인슐린 리스프로이고, 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 20％, 약 15％, 약 10％, 약 5％, 또는 약 3％ 미만은 PEG-GlyA1-인슐린 리스프로이며, 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 10％, 약 5％, 또는 약 3％ 미만은 디-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 80％가 PEG-LysB28-인슐린 리스프로이고, 약 10％는 PEG-GlyA1-인슐린 리스프로이고, 약 10％는 디-PEG-GlyA1LysB28-인슐린 리스프로인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 90％ 이상이 PEG-LysB28-인슐린 리스프로이고, 약 5％ 이하가 PEG-GlyA1-인슐린 리스프로이고, 약 5％ 이하가 디-PEG-GlyA1LysB28-인슐린 리스프로인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 조성물은 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 90％ 이상이 PEG-LysB28-인슐린 리스프로이고, 약 5％ 이하가 PEG-GlyA1-인슐린 리스프로이고, 약 5％ 이하가 디-PEG-GlyA1LysB28-인슐린 리스프로이며, PEG-LysB28-인슐린 리스프로는 인간에서 0.225 mg/kg의 투여량으로 조성물이 단일 피하 투여되었을 때 소실 반감기가 약 24시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 또는 약 42시간 초과인 것을 특징으로 하는 것인, PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 조성물은 총 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 중 약 95％ 이상이 PEG-LysB28-인슐린 리스프로이고, 약 5％ 이하가 PEG-GlyA1-인슐린 리스프로이고, PEG-LysB28-인슐린 리스프로는 인간에서 0.225 mg/kg의 투여량으로 조성물이 단일 피하 투여되었을 때 소실 반감기가 약 24시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36, 약 38시간, 약 40시간, 또는 약 42시간 초과인 것을 특징으로 하는 것인, PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "염기성 조건"이라는 용어는 PEG화 반응의 염기도를 나타내는 것이다. 인슐린 리스프로를 인슐린 리스프로의 B-쇄의 28번 위치에 있는 리신에서 더욱 선택적으로 PEG화시키기 위해서는 반응이 실질적으로 탈양성자화된 인슐린 리스프로의 알파-아미노기를 통해 이루어져야 한다. 수성 용매 또는 공-용매 중에서 염기성 조건이란 반응이 7.0 초과의 pH에서 수행된다는 것을 의미하는 것이다. 바람직하게, PEG화 반응은 pH 약 8.5 내지 약 11.5에서 수행된다. 유기 용매 중에서의 반응은 수중에서 10.75 이상의 pKa에 등가인 염기도를 갖는 염기의 존재하에서 수행된다.
본 발명은 또한 약 8.5 내지 약 11.5 사이의 pH, 및 약 25℃ 내지 약 30℃ 사이의 반응 온도하에 수성 용매 중에서 B의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기를 중량 평균 분자량이 약 20 kDa 내지 약 40 kDa 사이인 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜) p-니트로페닐 카르보네이트 (mPEG-NPC)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하는 방법을 포함한다:
Figure 112010081412179-pct00007
상기 식에서,
A는 인슐린 리스프로의 A-쇄이고 (서열 1);
B는 인슐린 리스프로의 B-쇄이고 (서열 3);
P는 분자량 범위가 약 20 kDa 내지 약 40 kDa인 PEG이고, 여기서 A 및 B는 적절히 가교결합되어 있고, P는 B의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아미노기에 우레탄 공유 결합을 통해 부착되어 있다. 바람직하게, 반응의 pH는 약 10.5 내지 약 11.1 사이로 유지되고, PEG화 반응은 약 2 내지 약 12시간 사이의 시간 기간 동안 약 25℃ 내지 약 30℃ 사이의 온도에서 수행되며, mPEG-NPC 대 인슐린 리스프로의 비 범위는 약 1.0 내지 약 5.0 사이이다. 더욱 바람직하게, mPEG-NPC의 중량 평균 분자량은 약 20 kDa이고, 반응의 pH는 약 10.5 내지 약 11.1 사이로 유지되며, PEG화 반응은 약 2 내지 약 12시간 사이의 시간 기간 동안 약 25℃ 내지 약 30℃ 사이의 온도에서 수행되며, mPEG-NPC 대 인슐린 리스프로의 비 범위는 약 1.0 내지 약 5.0 사이이다. 더욱더 바람직하게, PEG:인슐린 리스프로 몰비 범위는 약 2.5 내지 약 4.5 사이이고, mPEG-NPC의 중량 평균 분자량은 약 20 kDa이며, PEG화 반응의 pH는 약 10.5 내지 약 11.1 사이로 유지되고, PEG화 반응의 온도는 약 3 내지 약 6시간 사이의 시간 기간 동안 약 25℃ 내지 약 30℃ 사이로 유지된다. 가장 바람직하게, PEG:인슐린 리스프로 몰비 범위는 약 2.6 내지 약 4.5 사이이고, mPEG-NPC의 중량 평균 분자량은 약 20 kDa이며, PEG화 반응의 pH는 약 10.5 내지 약 11.0으로 유지되고, 반응의 온도는 약 3시간 동안 약 25℃ 내지 약 30℃ 사이로 유지된다.
원하는 경우, 분자량이 다른, 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 겔 여과 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지되어 있는 각종 기법을 사용함으로써 단리될 수 있다. 즉, 겔 여과 크로마토그래피를 사용함으로써 모노-PEG화된, 디-PEG화된, 및 트리-PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 상이한 그들의 분자량 (여기서, 상이한 차이는 본질적으로 PEG화 반응에서 사용되는 PEG의 평균 분자량에 상응하는 것이다)에 기초하여 분획화할 수 있다. 예를 들면, 인슐린 리스프로가 평균 분자량이 약 20 kDa인 활성화된 mPEG에 접합되는 일례의 반응에서, 생성된 반응 혼합물은 분자량이 약 5,808 달톤인 비변형된 인슐린 리스프로, 평균 분자량이 약 25,808 달톤인 모노-PEG화된 인슐린 리스프로, 평균 분자량이 약 45,808 달톤 kDa인 디-PEG화된 인슐린 리스프로, 및 평균 분자량이 약 65,808 달톤인 트리-PEG화된 인슐린 리스프로를 포함할 수 있다. 그러나, 겔 여과 기법은 유체력학적 크기에 기초하여 화합물을 분리하기 때문에 평균 분자량이 약 20 kDa인 mPEG에 접합된 모노-PEG화된 인슐린 리스프로는 평균 분자량이 약 25,808 달톤임에도 불구하고 겔 여과 동안 대략 82 kDa처럼 이동하게 될 것이다. 평균 분자량이 약 20 kDa인 mPEG로 PEG화된 디- 및 트리-PEG화된 종은 매우 다른 이동 또는 정체 시간을 갖게 될 것이며, 이를 통해 상기 종은 정제되고/거나 정량화될 수 있을 것이라고 당업자는 기대하고 있다.
"혈장 반감기"라는 어구는 체내에서 약물의 혈장 농도가 ½로 하락하게 되는 데 소요되는 시간을 지칭하는 것이다. 대안적으로 사용되는 용어는 "소실 반감기"가 있는데, 이는 최종 로그-선형 소실율에 상응하는 값이다. 당업자는 반감기가 제거 및 분포 부피, 둘 모두의 함수로서 변화되는 파생 파라미터임을 이해할 것이다. 혈장 반감기 또는 소실 반감기와 관련하여 사용되는 "장기간의," "더욱 긴", 또는 "연장된"이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 유사한 조건하에서 측정하였을 경우, 기준 분자 (예로서, 인슐린 리스프로)의 반감기와 비교하였을 때에 시험 화합물 (예로서, PEG화된 인슐린 리스프로)의 반감기가 통계학상 유의적으로 연장되었음을 의미하는 것으로 한다.
제거는 신체의 약물 제거 능력의 척도이다. 예를 들면, 약물에 대한 변형으로 인해 제거가 감소하게 되면, 반감기는 증가하게 될 것으로 기대할 수 있다. 그러나, 분포 부피에 변화가 없을 때에만 상기와 같은 역비례 관계가 정확하다. 최종 로그-선형 반감기 (t½), 제거 (CL), 및 분포 부피 (V) 사이의 유용한 대략적인 관계는 하기 식으로 나타낼 수 있다: t½ ~ 0.693 (V/CL). 제거는 얼마나 많은 약물이 제거되는지를 나타내는 것이 아니라, 소실 정도를 설명하기 위해 약물을 전혀 함유하지 않아야 하는 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 유체의 부피를 나타내는 것이다. 제거는 시간 단위당 부피로서 표현된다.
본원에서 사용되는 바, "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 당뇨병 또는 고혈당증, 또는 인슐린 투여가 상기 병태의 증상 및 합병증을 퇴치하거나 완화시키고자 하는 목적으로 지시되는 것인 기타 다른 병태를 앓는 환자를 관리하고 보호하는 것을 지칭한다. 치료하는 것은 증상 또는 합병증의 발병을 예방하기 위해 본 발명의 화합물 또는 조성물을 투여하는 것, 증상 또는 합병증을 완화시키는 것, 또는 질환, 병태, 또는 질병을 제거하는 것을 포함한다. 치료하고자 하는 환자는 포유동물, 및 바람직하게, 인간이다.
화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 그를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의, 하나 이상의 화학식 I의 화합물을 투여함으로써 고혈당증을 치료하는 데에 있어서 유효하다. 본원에서 사용되는 바, "치료상 유효량"이라는 어구는 환자에서의 혈당을 조절하는 데 충분한 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 또는 그의 조성물의 양을 지칭한다. 바람직하게, 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로의 치료상 유효량은 약 0.01 nmol/kg 내지 약 100 nmol/kg이다. 더욱 바람직하게, 치료상 유효량은 약 0.01 내지 약 50 nmol/kg이다. 더욱더 바람직하게, 치료상 유효량은 약 0.01 내지 약 20 nmol/kg이다. 더욱더 바람직하게, 치료상 유효량은 약 0.01 내지 약 10 nmol/kg이다. 더욱더, 바람직하게 치료상 유효량은 약 0.1 내지 약 7.5 nmol/kg이다. 더욱더, 바람직하게 치료상 유효량은 약 0.1 내지 약 5 nmol/kg이다. 가장 바람직하게, 치료상 유효량은 약 0.5 내지 약 5 nmol/kg이다. 그러나, 실제 투여되는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 양 또는 하나 이상의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 포함하는 조성물의 양은 치료하고자 하는 병태를 포함하는 관련된 환경 (즉, 고혈당증의 원인), 투여되는 PEG화된 인슐린 리스프로의 특정 종 또는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 특정 혼합물, 함께 투여되는 기타 다른 약물, 인슐린, 또는 기타 등등의 것, 선택된 비경구적인 투여 경로, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응 정도, 환자 증상의 중증도를 고려하여 의사에 의해 결정된다는 점을 이해하여야 한다. 그러므로, 상기 투여량 범위는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
"혈당을 조절하는 데 충분한"이라는 어구는 화합물 또는 조성물을 환자에게 투여함으로써 공복 혈장 혈당 수준이 정상화된다는 것을 의미한다. 임상적으로 정상적인 공복 혈장 혈당 수준은 70-110 mg/dL이다. 임상적으로 정상인 식사 후 혈장 혈당 수준은 140 mg/dL 미만이다.
저장하게 되면 인슐린 구조상의 공유결합에 화학적 변화가 일어난다는 것은 알려져 있다. 이로 인해 활성이 더 작아지고 잠재적으로는 면역원성도 더 작아진 분자, 예로서, 탈아미드화 생성물 및 고분자량 변환 생성물 (예로서, 이량체, 올리고머, 중합체)가 형성될 수 있다. 인슐린의 화학적 안정성에 관한 종합적인 연구는 문헌 [Jens Brange in "Stability of Insulin", Kluwer Academic Publishers, 1994]에 제시되어 있다. 전형적으로는 인슐린 조성물이, 예로서, 실온에서 저장하는 것과 비교하여 상당 수준으로 저장 기간을 개선시키는 온도인 약 2-8℃ 이하의 저온에서 저장된다는 사실에도 불구하고 인슐린 생성물의 저장 기간은 주로 시간이 경과함에 따라 가용성 응집체 (이량체, 올리고머, 및 중합체)가 형성되는 것에 의해 단축되게 된다. 추가로, 인슐린 생성물은 예로서, 환자가 주머니 속에서 넣고 가지고 다닐 때 또는 수송시의 진동 결과로서 불용성 응집체 (피브릴)로 형성된다. 화학적 또는 물리적인 영향의 결과로서 가용성 및 불용성 응집체가 형성되는 경향을 최저 수준으로 낮추는 것이 인슐린 생성물의 질에 있어서 중요하다. 그러므로, 치료학적으로 사용될 수 있도록 하기 위해서 인슐린 조성물은 허용되는 화학적 및 물리적 안정성의 특징들을 입증하여야 한다.
본원에서 사용되는 바, "안정성"이라는 용어는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 제제의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 지칭한다. 단백질 분자가 응집하여 고차 중합체 또는 심지어는 침전물이 형성되면 PEG화된 인슐린 리스프로 제제는 물리적으로 불안정하게 될 수 있다. "안정한" 제제는 단백질의 응집 정도가 허용가능하게 조절이 되며, 시간이 경과함에 따라 허용될 수 없을 정도로 증가하지는 않는 제제이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 응집도가 출발 물질에서 관찰되는 응집도의 약 1％, 2％, 3％, 4％, 5％, 10％, 15％, 20％, 25％ 또는 30％ 이내에 포함되어 있다면, PEG화된 인슐린 리스프로 제제는 특정 기간에 걸쳐서 안정한 것으로 간주된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 출발 물질에서 관찰되는 활성의 적어도 약 99％, 95％, 90％, 85％, 80％, 75％, 70％, 65％, 60％, 55％ 또는 50％라면, PEG화된 인슐린 리스프로 제제는 특정 기간에 걸쳐서 안정한 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바, "화학적 안정성"이라는 용어는 대략 2-8℃의 저온 또는 대략 20-40℃의 승온에서의 저장을 비롯한, 정적 조건하에서 저장하는 동안 PEG화된 인슐린 리스프로 조성물이 가용성 단백질 응집체를 형성하려는 경향을 나타낸다. 특정 기간에 걸쳐서 특정 온도 및 습도 조건과 같은 특정 조건하에서 제제의 분석적 속성을 측정함으로써 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 화학적 안정성을 측정할 수 있다. 측정가능한 분석적 속성으로는 예를 들면, 크기-배제 HPLC를 사용하는 고분자량 종의 형성을 포함한다. 이어서, 상기 결과를 모니터랑하고, 사전 명시된 파라미터와 비교할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "물리적 안정성"이라는 용어는 예로서, PEG화된 인슐린 리스프로 조성물의 진동과 같은 물리적 작용의 결과로서 PEG화된 인슐린 리스프로 조성물이 불용성 단백질 응집체를 형성하려는 경향을 나타낸다. 다양한 온도에서 정의된 시간 기간 동안 저장하였을 때, 각종 제약 제제 중의 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 물리적 안정성은 샘플의 겉보기 광 감쇠도 (흡광도 또는 광밀도) 측정을 비롯한, 당업계에 주지되어 있는 방법에 의해서 평가될 수 있다. 상기 광 감쇠도 측정은 제제의 탁도와 관련이 있다. 탁도는 제제 중 단백질 또는 복합체의 응집 또는 침전을 통해서 이루어진다. 물리적 안정성을 평가하는 기타 다른 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 그 예로는 입자의 존재 또는 부재를 시각적으로 평가하는 것, 또는 티오플라빈 T 형광 현미경 검사에 의해 피브릴/겔 형성을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양은 치료상 유효량의 적어도 하나의 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제, 완충액, 금속 이온, 또는 담체를 포함하는, 환자, 특히 인간에게 투여하기에 적합한 제약 조성물을 제공한다. 반드시 그러한 것을 아니지만, 상기 제약 조성물은 전형적으로는 본래는 비경구적으로 투여되며, 당업계에 주지되어 있는 비경구용 조성물을 위한 종래의 부형제, 완충액, 희석제, 금속 이온, 또는 담체를 사용하여 각종의 기법들 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 수용성이 높기 때문에, 본 발명의 제약 조성물은 1차 용매로서 물, 총 농도가 적어도 1 mg/mL, 적어도 2 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/mL, 적어도 20 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 30 mg/mL, 적어도 35 mg/mL, 적어도 40 mg/mL, 적어도 45 mg/mL, 적어도 50 mg/mL 이상인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 및 제약상 허용되는 완충액을 포함하는 조성물이고, 여기서 제약 조성물의 pH는 약 4.0 내지 약 8.5인 조성물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.5 사이이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 총 농도 범위가 약 2.5 mg/mL 내지 약 60 mg/mL인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및 완충액을 포함하되, 여기서 조성물의 pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.5이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 농도 범위가 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및 완충액을 포함하되, 여기서 제약 조성물의 pH 범위는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 농도 범위가 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및 완충액을 포함하되, 여기서 제약 조성물의 pH 범위는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 농도 범위가 약 15 mg/mL 내지 약 40 mg/mL인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및 완충액을 포함하되, 여기서 제약 조성물의 pH 범위는 약 7.0 내지 약 7.5, 또는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 추가로 치료상 유효량의 인슐린을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 인슐린은 인슐린 유사체이다. 더욱더 바람직하게, 인슐린 유사체는 초속효성 인슐린 유사체이다. 가장 바람직하게, 초속효성 인슐린 유사체는 인슐린 리스프로이다.
"완충액"이라는 용어는 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해서 pH 변화에 영향을 받지 않는 용액을 지칭한다. 바람직하게, 사용되는 완충액은 제약상 허용되는 완충액이다. "제약상 허용되는 완충액"이라는 어구는 인슐린 제제 중에서 사용하기에 안전하며, 제약 조성물의 pH를 바람직한 pH로 조절하는 효과를 갖는 용액을 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 완충액의 pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.5이다. 더욱 바람직하게, 완충액의 pH 범위는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 상기 범위에서 본 발명의 조성물의 pH를 조절하기 위한 것인 제약상 허용되는 완충액으로는 예로서, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아르기닌, TRIS, 및 히스티딘 완충액 뿐만 아니라, 그의 조합물과 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "TRIS"는 2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올, 및 약물학적으로 허용되는 그의 임의의 염을 의미한다. 유기 염기 및 하이드로클로라이드 형태 (즉, TRIS-HCl)가 TRIS의 일반적인 두가지 형태이다. TRIS는 또한 당업계에 트리메틸올 아미노메탄, 트로메타민, 및 트리스(하이드록시-메틸)아미노메탄으로서 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 2.5 mM 내지 약 50 mM의 포스페이트 또는 TRIS 완충액을 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 5 mM 내지 약 20 mM의 포스페이트 또는 TRIS 완충액을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 5 mM 내지 약 10 mM의 포스페이트 완충액을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 5 mM의 포스페이트 완충액을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 7.5 mM 내지 약 50 mM 사이의 TRIS 완충액을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 10 mM 내지 약 25 mM 사이의 TRIS 완충액을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 15 mM 내지 약 20 mM 사이의 TRIS 완충액을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 16 mM의 TRIS 완충액을 포함한다.
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및 조성물은 비경구적으로 환자에게 투여되는 공지의 인슐린 제제와 유사한 방식으로 제조될 수 있다. 상기 제제는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게, 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 휴마로그(HUMALOG)? 인슐린 리스프로 또는 휴물린(Humulin)? 제제와 유사한 방식으로 제조된다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 제약 조성물은 물, 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 등장제, 및 제약상 허용되는 완충액을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 추가로 제약상 허용되는 보존제를 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 추가로 2가 양이온, 예로서, 아연 및/또는 코발트를 포함하는데, 이러한 2가 양이온은 인슐린의 육량체화를 촉진시킬 수 있다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 추가로 적어도 하나의 육량체-안정화제를 포함한다. 추가로, 염산 및 수산화나트륨이 pH 조정을 위해 첨가될 수 있다.
"등장제"는 생리학적으로 내성을 띠며, 제형에 적합한 긴장도를 제공하여 투여된 제약 조성물과 접촉하는 세포막을 가로지르는 물의 순 흐름을 방해하는 화합물이다. 글리세롤은 또한 글리세린으로도 공지되어 있으며, 이것이 보편적으로 등장제로 사용된다. 기타 다른 등장제로는 i) 기타 다른 당 알코올, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 만니톨 및 소르비톨, (ii) 염, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, NaCl, iii) 덱스트로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 단당류, 및 iv) 락토스, 수크로스, 및 트레할로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이당류를 포함한다. 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 등장제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 제약 제제는 등장도 범위가 약 270 내지 약 330 mOsm인 제제를 생성하는 하나 이상의 등장제를 갖는다. 더욱 바람직하게, 등장제(들)는 글리세롤, 소르비톨, 수크로스, NaCl, 트레할로스, 및/또는 만니톨이다. 더욱더 바람직하게, 등장제는 글리세롤, 소르비톨, 수크로스, NaCl, 및/또는 트레할로스이다. 더욱더 바람직하게, 글리세롤, 소르비톨, 수크로스, NaCl, 또는 트레할로스는 약 100 내지 약 200 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 더욱더 바람직하게, 글리세롤은 약 100 내지 약 200 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 더욱더 바람직하게, 글리세롤은 약 150 내지 약 180 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 더욱더 바람직하게, 글리세롤은 약 130 내지 약 175 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 더욱더 바람직하게, NaCl은 약 50 내지 약 300 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 더욱더 바람직하게, NaCl은 약 100 내지 약 200 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 가장 바람직하게, NaCl은 약 150 mM의 농도로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 육량체-안정화 화합물을 포함할 수 있다. "육량체-안정화 화합물"이라는 어구는 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 육량체성 결합 상태로 안정화시키는 비단백질성의 작은 분자량 화합물을 지칭한다. 칼슘 이온, 아연, 코발트, 구리, 니켈, 철, 마그네슘, 망간, 음이온, 특히, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 티오시아네이트, 및 페놀성 화합물, 특히 페놀, 페놀성 보존제, 레조르시놀, 4'-하이드록시아세트아닐리드, 4-하이드록시벤즈아미드, 및 2,7-디하이드록시나프탈렌이 인슐린 분자에 대하여 공지되어 있는 육량체-안정화 화합물이다. 바람직하게, 육량체-안정화 화합물은 페놀, m-크레졸, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 메틸파라벤, 칼슘, 클로라이드, 또는 이들 화합물 중 2 이상의 조합물이다. 더욱 바람직하게, 육량체-안정화 화합물은 페놀, m- 크레졸, 칼슘, 클로라이드, 또는 그의 조합물이다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 1 mM 내지 75 mM 사이의 칼슘, 약 1 mM 내지 약 50 mM 사이의 칼슘, 약 1 mM 내지 약 25 mM 사이의 칼슘, 약 5 mM 내지 약 50 mM 사이의 칼슘, 약 2.5 mM 내지 약 30 mM 사이의 칼슘, 약 2.5 mM 내지 약 15 mM 사이의 칼슘, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM 사이의 칼슘, 약 5 mM 내지 약 30 mM 사이의 칼슘, 약 5 mM 내지 약 15 mM 사이의 칼슘을 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 약 2.5 mM 내지 10 mM 사이의 칼슘을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물의 다용도 제제는 또한 보존제를 포함할 수 있다. "보존제"라는 용어는 항균제로서 작용하기 위해 제약 제제에 첨가되는 화합물을 지칭한다. 비경구용 제제에서 유효하고, 허용될 수 있는 것으로서 당업계에 공지되어 있는 보존제 중에는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤,프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 페닐수은산 질산염, 티메로살, 벤조산 및 그의 다양한 혼합물이 있다. 특정 페놀성 보존제, 예로서, 메틸파라벤, 페놀, 및 m-크레졸은 인슐린 및 인슐린-유사 분자에 결합하여 형태학적 변화를 유도함으로써 물리적 또는 화학적 안정성, 또는 이 두가지 모두를 증가시키는 것으로 알려져 있다 (예로서, 문헌 ([Birnbaum, D. T., et al., Pharmaceutical . Res. 14:25-36 (1997)]; [Rahuel-Clermont, S., et al., Biochemistry 36:5837-5845 (1997)]) 참조). "페놀성 보존제"로는 화합물 페놀, m-크레졸, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 메틸파라벤 및 그의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 제제에 사용되는 보존제는 페놀성 보존제일 수 있으며, 이는 육량체-안정화 화합물과 동일하거나, 상이할 수 있다. 바람직하게, 페놀성 보존제는 m-크레졸 또는 페놀이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 pH 약 7.0 내지 약 pH 8.0에서 보존제로서 약 0.1 내지 약 75 mM 농도의 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 pH 약 7.0 내지 약 pH 8.0에서 보존제로서 약 1 내지 약 60 mM 농도의 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 pH 약 7.0 내지 약 pH 8.0에서 보존제로서 약 10 내지 약 40 mM 농도의 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 pH 약 7.0 내지 약 pH 8.0에서 보존제로서 약 30 mM 농도의 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물은 pH 약 7.3 내지 약 pH 7.5에서 보존제로서 약 30 mM 농도의 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물은 인슐린을 육량체화시키거나, 다르게는 인슐린 화합물을 안정화시키는 2가 금속 양이온, 예로서, 아연 또는 코발트를 포함할 수 있다. "2가 금속 양이온"이란 다양한 단백질 분자와 착체를 형성하는 데 관여하는 이온 또는 이온들을 의미한다. 전이 금속, 알칼리 금속, 및 알칼리토 금속이 인슐린 화합물과 착체를 형성하는 것으로 알려져 있는 금속의 예이다. 전이 금속이 바람직하다. 바람직하게, 2가 금속 양이온은 아연, 구리, 코발트, 니켈, 망간, 마그네슘, 카드뮴, 및 철로 구성된 군으로부터 선택되는 양이온들 중 하나 이상의 것이다. 더욱 바람직하게, 아연은 2가 금속 양이온이다. 아연은 인슐린과, 인슐린 리스프로를 비롯한, 각종의 인슐린 유사체 및/또는 유도체의 육량체 형성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 제약 조성물에서 2가 양이온, 예로서, 아연 또는 코발트의 가장 중요한 역할은 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 포함하는 제약 조성물 중에서 본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 및/또는 임의의 기타 다른 인슐린 또는 인슐린 유도체의 육량체 형성을 촉진시킨다는 것이다. 페놀성 보존제의 존재하에서 육량체 형성은, Zn(II) 이온의 존재하에서 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 용액의 pH를 중성 영역에 이르게 하거나, pH를 중성 영역으로 조정한 후에 Zn(II)을 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 바람직하게, 아연 대 인슐린 화합물, 인슐린 유사체, 및/또는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 비는 약 0.33의 하한치로, 즉, 인슐린 육량체, 인슐린 유사체 육량체 및/또는 PEG화된 인슐린 리스프로 육량체 1개당 2개의 아연 원자로 제한이 된다. 더욱 바람직하게, 아연 대 인슐린 화합물, 인슐린 유사체, 및/또는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 비는 약 0.33 내지 약 0.67이다. 예로서, 시트레이트 또는 포스페이트와 같이 아연 결합에 대하여 단백질과 경쟁을 하는 화합물이 존재한다면, 본 공정 동안에 더욱더 많은 아연이 사용될 수 있다. 예로서, 아연 대 인슐린 화합물, 인슐린 유사체, 및/또는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 비가 약 0.33 내지 약 0.83인 것과 같이, 더욱 강하게 육량체화가 일어나도록 하기 위해서는 육량체화에 필요한 양보다 더 많은 과량의 아연이 바람직할 수 있다. 또한, 육량체화에 필요한 양보다 더 많은 과량의 아연이 본 발명의 제약 조성물에 존재할 수 있고, 이는 화학적 및 물리적 안정성을 개선시키는 데, "현탁성"을 개선시키는 데, 및 가능하게는 추가로 시간-작용성을 더욱 연장시키는 데 바람직할 수 있다. 한편, 시트레이트 또는 포스페이트 완충액 중 과량의 아연은 각각 아연 시트레이트 또는 아연 포스페이트 뿐만 아니라, 인슐린이 침전되게 할 수 있다.
본 발명에 따라 아연은 인슐린, 인슐린 유사체, 및 PEG화된 인슐린 리스프로 육량체 1몰당 약 0.3몰 내지 약 3몰의 양으로 제제 중에 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게, 아연은 총 인슐린, 인슐린 유사체, 및 PEG화된 인슐린 리스프로 육량체 1몰당 약 0.3몰 내지 약 1몰의 양으로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 더욱더 바람직하게, 아연은 총 인슐린, 인슐린 유사체, 및 PEG화된 인슐린 리스프로 육량체 1몰당 약 0.3몰 내지 약 0.7몰의 양으로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 가장 바람직하게, 아연은 인슐린, 인슐린 유사체, 및 PEG화된 인슐린 리스프로 육량체 1몰당 약 0.3몰 내지 약 0.55몰의 양으로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재한다. 본 발명에 아연을 제공하는 아연 화합물은 임의의 제약상 허용되는 아연 화합물일 수 있다. 아연의 제약상 허용되는 공급원과 같이, 인슐린 제제에 아연을 첨가하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게, 아연은 예로서, 황산아연, 염화아연, 아세트산아연, 시트르산아연, 산화아연, 또는 질한아연과 같이 염으로서 제공된다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 본 발명의 제약 조성물은 추가로 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "계면활성제"라는 용어는 대기-액체 계면에 흡착하여 액체의 표면 장력을 감소시키는 물질을 포함한다. 계면활성제의 예로는, 제한없이 비이온성 계면활성제, 예로서, 폴리소르베이트 (예로서, 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20); 폴록사머 (예로서, 폴록사머 188); 트리톤(Triton)™ (예로서,트리톤™ X-100); 폴리에틸 글리콜; 폴리프로필 글리콜; 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예로서, 플루로닉스, PF68)를 포함한다. 예를 들면, 계면활성제는 약 0.001-0.5％, 예로서, 약 0.05-0.3％의 양으로 본 발명의 제약 조성물 중에 존재할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 계면활성제는 폴록사머 188이다. 더욱 바람직하게, 계면활성제는 약 0.5 내지 약 10 mg/mL 사이, 약 1 내지 약 10 mg/mL 사이, 약 2 내지 약 10 mg/mL 사이, 약 3 내지 약 10 mg/mL 사이, 약 4 내지 약 10 mg/mL 사이, 약 1 내지 약 5 mg/mL 사이, 약 2 내지 약 5 mg/mL 사이, 약 3 내지 약 5 mg/mL 사이, 약 4 내지 약 5 mg/mL 사이의 농도를 갖는 폴록사머 188이다.
본 발명은 또한 바람직하게 인간에서 고혈당증 및/또는 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
본 발명은 또한 바람직하게 인간에서의 고혈당증 및/또는 당뇨병 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 화학식 I의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
본 발명에 따른 PEG화된 인슐린 리스프로를 포함하는 제약 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 시린지, 임의로는 펜-유사 시린지, 또는 기계 구동식 인젝터를 수단으로 하여 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 비경구 투여는 주입 펌프를 수단으로 하여 수행될 수 있다.
제조 1
GlyA1 - HSCH 2 CH 2 CO -인슐린 리스프로 (3) 및 LysB28 - HSCH 2 CH 2 CO -인슐린 리스프로 (4)
각 Trt-SCH2CH2CO-OH, N-하이드록시숙신이미드 (NHS), 및 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 1 mmol씩을 2 mL의 DMF 중에서 30분 동안 혼합하여 Trt-SCH2CH2CO-NHS 에스테르를 제조하였다. 1/10 mmol의 인슐린 리스프로를 DMSO 중 10 mL의 5％ 트리에틸아민 (TEA) 중에 용해시켰다. 상기 용액에 0.2 mmol 활성화된 Trt-SCH2CH2CO-NHS를 첨가하였다. 실온에서 2시간이 경과한 후, 0.2 mL 에탄올아민을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 90 mL의 H2O로 희석시키고, 정제용 RP-C18 칼럼 상에 적용시켰다. LysB28-Trt-SCH2CH2CO-인슐린 리스프로 (2)의 원하는 분획을 풀링하고, 동결 건조시켰다. 별도로, GlyA1-Trt-SCH2CH2CO-인슐린 리스프로 (1)의 원하는 분획을 풀링하고, 동결 건조시켰다. 1/10 mmol의 (1) 또는 (2)를 0.2 mL의 티오아니솔 및 0.4 mL의 트리이소프로필-실란을 함유하는 5 mL TFA에 용해시켰다. 30분이 경과한 후, 증발시켜 TFA를 제거하고, 잔류하는 펩티드는 H2O 중 50 mL의 10％ ACN에 용해시켰다. 생성된 용액을 정제용 RP-C18 칼럼 상에 적용시켰다. (3) 또는 (4)의 원하는 분획을 풀링하고, 임의로 동결 건조시켰다.
제조 2
PheB1 - HSCH 2 CH 2 CO -인슐린 리스프로 (7)
1/10 mmol의 인슐린 리스프로를 DMSO 중 10 mL의 5％ TEA 중에 용해시켰다. 상기 용액에 DMSO 중 0.2 mmol의 디-t-부틸카르보네이트를 첨가하였다. 실온에서 1시간이 경과한 후, 0.2 mL 에탄올아민을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 90 mL의 H2O로 희석시키고, 정제용 RP-C18 칼럼 상에 적용시켰다. Boc-GlyA1, Boc-LysB28-인슐린 리스프로의 원하는 분획을 풀링하고, 동결 건조시켜 (5)를 수득한다. 1/10 mmol의 (5)를 DMSO 중 10 mL의 5％ TEA에 용해시켰다. 상기 용액에 0.2 mmol의 활성화된 Trt-SCH2CH2CO-NHS를 첨가하였다. 실온에서 2시간이 경과한 후, 0.2 mL 에탄올아민을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 90 mL의 H2O로 희석시키고, 정제용 RP-C18 칼럼 상에 적용시켰다. 원하는 분획을 풀링하고, 동결 건조시켜 Trt-SCH2CH2CO-PheB1, Boc-GlyA1, Boc-LysB28-인슐린 리스프로 (6)을 수득하였다. 1/10 mmol의 (6)을 0.2 mL의 티오아니솔 및 0.4 mL의 트리이소프로필실란을 함유하는 5 mL TFA 중에 용해시켰다. 30분이 경과한 후, 증발시켜 TFA를 제거하고, 잔류하는 펩티드는 H2O 중 50 mL의 10％ ACN에 용해시켰다. 생성된 용액을 정제용 RP-C18 칼럼 상에 적용시켰다. 원하는 분획을 풀링하고, 동결 건조시켜 (7)을 수득하였다.
실시예 1: 티올 - 유도체화된 인슐린 리스프로 중간체의 PEG 화
평균 분자량이 약 20 kDa (b), 30 kDa (a), 40 kDa (a), 또는 60 kDa (c)인 모노메톡시-PEG-MAL을 100 mM NH4Ac 완충액 (pH 4.69) 및 ACN의 1:1 혼합물에 용해시켰다. 티올-유도체화된 인슐린 리스프로, 예로서, 화합물 (3), (4), 또는 (7)의 동결건조된 분말을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 반응에 이어서 분석 RP-HPLC을 수행할 수 있었다. 반응이 완료되면 (보통은 대략 4시간이 경과하였을 때), 혼합물을 H2O로 희석시키고, 정제용 RP-HPLC 칼럼 상에 적용시켰다. 원하는 분획을 풀링하고, 동결 건조시켜 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물을 수득하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물의 일례를 하기에 (8(a)), (8(b)), (9(a)), (9(b)), (10(a)), (10(b)), 및 (15(c))로서 제시한다. 바람직하게, 이들 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 약 400 내지 약 1000 범위의 n을 갖게 될 것이다. 더욱 바람직하게, 이들 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 약 400 내지 약 750 범위의 n을 갖게 될 것이다. 더욱 바람직하게, 이들 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 약 400 내지 약 550 범위의 n을 갖게 될 것이다. 더욱더 바람직하게, 이들 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 약 400 내지 약 500의 n을 갖게 될 것이다. 더욱더 바람직하게, 이들 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 약 450 내지 약 500의 n을 갖게 될 것이다. 가장 바람직하게, 이들 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 약 450의 n을 갖게 될 것이다.
Figure 112010081412179-pct00008
Figure 112010081412179-pct00009
Figure 112010081412179-pct00010
실시예 2: 모노메톡시폴리 (에틸렌 글리콜) p- 니트로페닐 카르보네이트 (mPEG-NPC)를 사용한 인슐린 리스프로의 PEG 화
1/10 mmol의 인슐린 리스프로를 20 mL의 0.2 M 보레이트 완충액 (pH 10.5) 중에 용해시키고, 활발하게 교반시키면서 20 mL의 ACN 중, 평균 분자량이 약 20 kDa인 mPEG-NPC 1.98 g을 상기 용액에 첨가하였다. RP-HPLC 및 SEC에 의해 반응을 모니터링하였다. 대략 4시간이 경과한 후에 아세트산을 사용하여 반응 혼합물을 pH 5-7로 산성화시키고, 정제용 RP-HPLC 칼럼 상에 적용시켰다. 원하는 분획을 풀링시키고, 동결 건조시켜 20 내지 45％ 범위의 수율로 모노-PEG화된 PEG20K-인슐린 리스프로를 수득하였다. RP-HPLC, SEC, 및 MALDI-MS에 의해 아이덴티티 및 순도를 확인하였다. A-쇄 또는 B-쇄 상에 부착된 mPEG의 비는 생성된 접합체를 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP)로 처리한 후에 유리되는 유리 A-쇄 및 B-쇄의 면적 적분에 의해 측정하였다. mPEG-NPC 대 인슐린 리스프로의 비가 모노-PEG화된 및 디-PEG화된 종의 생성물 분포를 결정하였다. 반응의 pH가 PEG화의 부위-특이성을 지배하였다. pH가 약 8에서 약 12로 증가함에 따라서 화합물(11)이 주요 생성물이 되었다. pH 10.5에서 평균 분자량이 약 20 kDa (n = 약 450)인 mPEG-NPC와의 반응이 이루어질 경우, (11) 대 (12)의 비는 약 85:15였다.
상기 기술된 PEG화 반응은 또한 0.2 M NaOH를 연속적으로 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 유지시켜 줌으로써 비-완충처리된 수용액 중에서 수행될 수 있었다. pH가 약 pH 11.5로 유지되는 동안 평균 분자량이 약 20 kDa인 mPEG-NPC를 사용하여 비-완충처리된 수용액 중에서 반응이 수행될 경우, PEG화 반응 생성물은 약 92:8의 비로 (11) 및 (12)를 포함하였다. 바람직하게, 화합물(11)은 약 400 내지 약 1000 범위의 n을 갖게 될 것이다. 더욱 바람직하게, 화합물(11)은 약 400 내지 약 750 범위의 n을 갖게 될 것이다. 더욱더 바람직하게, 화합물(11)은 약 400 내지 약 550 범위의 n을 갖게 될 것이다. 더욱더 바람직하게, 화합물(11)은 약 400 내지 약 500의 n을 갖게 될 것이다. 더욱더 바람직하게, 화합물(11)은 약 450 내지 약 500의 n을 갖게 될 것이다. 가장 바람직하게, 화합물(11)은 약 450의 n을 갖게 될 것이다.
Figure 112010081412179-pct00011
실시예 3: 시험관내 수용체 친화성
인간 인슐린 수용체 (hIR) 또는 인간 IGF-1 수용체 (hIGF-1R)를 과다발현하는, 안정적으로 형질감염된 293 EBNA HEK 세포로부터 제조된 P1 막 상에서 수용체 결합 분석법을 수행하였다. 인간 재조합 (3-[125I]요오도티로실 A14)-인슐린 (2000 Ci/mmol) 또는 인간 재조합 [125I]인슐린 유사 성장 인자 1 (2000 Ci/mmol)을 사용하여 경쟁적 방사성-리간드 결합 분석법으로부터 결합 친화성을 측정하였다. 본 분석법은 PVT PEI로 처리된 A형 소맥 배아 아글루티닌과 커플링된 SPA 비드를 사용하는 SPA 방법과 함께 수행되었다. SPA 분석법 완충액 (50 mM TRIS-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1％ BSA)은 모든 시약 제조를 위해 사용되었다. 3배 희석된 일련의 화합물 희석액 (100 nM 내지 2 pM)은 프리덤/에보(Freedom/Evo) 로보트 (테칸(Tecan))를 사용하여 분석 완충액 중에서 제조하고, 이를 멀티멕(Multimek) (베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 96-웰의, 백색의 바닥이 투명한 마이크로플레이트 (코닝/코스타(Corning/Costar))에 첨가하였다. 멀티드롭 기기 (티텍테크(Titertek))를 사용하여 방사성리간드, 막 및 SPA 비드를 첨가하였다. 실온에서 10시간 동안 인큐베이션시킨 후, 마이크로베타 트리룩스(Microbeta Trilux) 섬광 계수기를 사용하여 방사성을 측정하였다. 비표지된 인슐린 리스프로 및 비표지된 IGF-1이 각각 각 실험에서 양성 및 음성 대조군으로서 포함되었다. IC50 값은 4-파라미터 로지스틱 비-선형 회귀 분석으로부터 측정하였다. 공식 Ki = IC50/(1 + D/Kd) (여기서, D = 실험에서 사용된 방사성리간드의 농도, Kd = 포화 결합 분석으로부터 측정된 방사성리간드의 평형 결합 친화 상수 (hIR 및 hIGF-1R에 대한 Kd는 각 0.124 및 0.130 nM이다))에 기초하여 IC50 값으로부터 친화 상수 (Ki)를 계산하였다. 하기 기록되어 있는 기하 평균 Ki은 10∧(평균 로그 Ki)이다 (여기서, 평균 로그 Ki = 평균 (Ki1+ Ki2 + Ki3 ...Kin), 및 독립 실험의 개수 (n)는 2를 초과한다). 그러나, 인간 IGF-1과 관련하여 하기에서 언급할 때 n은 2이다.
실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된 하기 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 상기 기술된 hIR 결합 분석법에서 30 nM 미만의 기하 평균 Ki를 가졌다: 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 10(a), 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 8(a), 평균 분자량이 약 60 kDa인, 두 갈래로 갈라진 분지형(bifurcated) mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 15(c), 평균 분자량이 약 30 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a), 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a), 및 평균 분자량이 20 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(b). hIR 및 hIGFR 결합 분석법에서, 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a)는 각각 3.07 nM ± .32 nM (±S.E.M; n = 6) 및 84.3 nM 초과 (SEM = 미측정; n=6)의 기하 평균 Ki를 가졌다. 추가로, 실시예 2에 기술된 바와 같이 40, 30, 또는 20 kDa의 선형 mPEG-NPC를 사용하여 생성된 이종성 PEG화된 인슐린 리스프로 생성물 또한 상기 기술된 hIR 결합 분석법에서 30 nM 미만의 기하 평균 Ki를 가졌다. 상기 기술된 hIR 결합 분석법에서, 인슐린 리스프로는 0.22 ± .072 nM (± SEM; n = 4)의 기하 평균 Ki를 가졌다. 상기 기술된 hIGFR 결합 분석법에서 상기 언급한 화합물 모두 75 nM 초과의 기하 평균 Ki를 갖고, 인간 IGF-1은 1.51 ± .23 nM (± SEM; n = 2)의 기하 평균 Ki를 가졌다.
이러한 데이타는 PEG화 위치 B28이 hIR 친화성을 약 10배 만큼 감소시키고, 이는 이러한 PEG화된 인슐린 리스프로 종을 hIR에 대한 약한 효현제로 만든다는 것을 보여준다. PEG화된 인슐린 리스프로 종은 또한 이러한 조건하에서는 상기 분석법으로 측정이 불가능한 IGFR-1 결합 특성을 가졌다.
실시예 4: 인슐린 수용체 인산화 전세포 분석법을 사용한 PEG화된 인슐린 리스프로 효능 평가
본 발명의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물은 상업적으로 이용가능한 (펄킨 엘머(Perkin Elmer)) 이종 시간-분해 형광측정 분석 방법인 DELFIA?를 사용하여 그의 작용적 활성에 대하여 평가할 수 있었다. 간략하면, 인간 인슐린 수용체를 과다발현하는 293HEK 세포를 트립신으로 처리하고, 무혈청 배지 (SFM), (0.1％의, 지방산-무함유 BSA를 포함하는 DMEM) 중 폴리-D-리신으로 코팅된 ½ 면적 코스타 96-웰 조직 배양 플레이트에 60,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포 배양 플레이트를 CO2 인큐베이터 중 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 코스타 ½ 면적 블랙 96-웰 미세역가 플레이트를 사용하기 전날 밤에 항-인슐린 수용체 A-쇄 mAb 8314 포획 플레이트 또한 준비하고, 이를 4℃에서 밤새도록 30 ㎕의 항-인슐린 수용체 A-쇄 mAb 8314 (문헌 [Soos, M.A., et al. Biochem J 235: 199-208 (1986)]; 매사츄세스주 캠브리지 소재의 에브캠, 인크(Abcam, Inc.)를 비롯하여 상업적으로 이용가능)로 처리하고, 10 mM 탄산나트륨 중에서 1 ㎍/mL로 희석하였다. 50 mM TRIS (pH 7.5), 150 mM NaCl, 및 0.1％ 트윈 (TBST)을 사용하여 mAb 8314 포획 플레이트를 4회에 걸쳐 세척하여 임의의 비결합 mAb 8314를 제거하였다. 이어서, 1시간 넘게 4℃에서 TBST 중 1％ BSA를 이용하여 mAb 8314 포획 플레이트를 차단시켰다. 차단시킨 후, 포획 플레이트를 TBST로 2회에 걸쳐 세척하여 과량의 BSA 용액을 제거하였다. 일단 포획 플레이트를 차단 완충액 중에 위치시킨 후에, 세포 배양 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 실온이 되도록 평형화시켰다. SFM으로 시험 화합물을 일련으로 희석시켰다. 인슐린 수용체의 자기인산화를 자극시키기 위해 희석된 시험용 제제 50 ㎕를 세포 단층에 첨가하였다. 실온에서 30분이 경과한 후, 시험 화합물을 흡인하여 제거하고, 다시 50 ㎕의 2x 용해 완충액 (2％ NP40, 100 mM TRIS (pH 7.4), 300 mM NaCl, EDTA를 포함하는 로슈 컴플리트(Roche Complete)™ 프로테아제 저해제, 및 4 mM 바나데이트)을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 용해 완충액 중 실온에서 30분이 경과한 후, 30 ㎕의 용해물을, 30 ㎕의 유로퓸-N1-항-포스포티로신 PY20-항체, Eu-N1-PY20 (펄킨 엘머)을 함유하는 차단된 포획 플레이트로 옮기고, 10 mM Hepes, 140 mM NaCl 및 0.1％ 트윈 중에서 50 ng/mL로 희석시켰다. 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, TBST로 6회에 걸쳐 세척하여 비결합 Eu-N1-PY20 및 세포 용해물을 제거하였다. 신호가 전개됨에 따라서 간헐적으로 진탕시키면서 10분 동안 50 ㎕의 증강액 (펄킨 엘머)과 함께 인큐베이션시켰다. 시간 분해 형광성 유로퓸 세팅을 사용하는 월랙 빅토르(Wallac Victor)를 사용하여 인산화된 인슐린 수용체를 정량하였다. 인슐린의 최고 자극 투여량 (100 nM)에 대한 반응율(％)로서 인산화 수준을 계산하였다. 인슐린 유사체의 효능은 투여 반응에 대한 4개의 파라미터 피트를 사용하여 EC50 투여량으로서 계산하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 것으로서, 실시예 4에 기술된 분석법에서 15 nM 미만의 EC50을 갖는 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물로는 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 10(a), 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 9(a), 평균 분자량이 약 30 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 9(a), 및 평균 분자량이 약 20 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 9(b)를 포함하였다. 실시예 4에 기술된 분석법에, 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 9(a)는 10.88 nM의 EC50을 가졌다. 평균 분자량이 약 40, 약 30, 또는 약 20 kDa인 선형 mPEG-NPC를 사용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 이종성 PEG화된 인슐린 리스프로 생성물은 또한 실시예 4에 기술된 분석법에서 15 nM 미만의 EC50을 가졌다. 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 8(a)와, 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a)의 50:50 및 70:30 혼합물 또한 실시예 4에 기술된 분석법에서 15 nM 미만의 EC50을 가졌다. 동일 분석법에서, 인간 인슐린 및 인슐린 리스프로는 각각 2.3 및 0.7 nM의 EC50을 가졌다.
상기 데이타는 PEG화 위치 B28이 hIR 시험관내 활성을 약 10- 내지 20-배만큼 감소시키고, 이는 이러한 PEG화된 인슐린 리스프로 종을 hIR에 대한 약한 효현제로 만든다는 것을 보여준다. PEG화된 인슐린 리스프로 종은 또한 측정이 불가능한 IGFR-1 결합 특성을 가졌다.
실시예 5: 1형 당뇨병을 앓는 래트 모델에서의 PEG화된 인슐린 리스프로에 대한 시험관내 효능 및 약동학적 프로파일 평가
연구 시작 3일 전에 체중이 250-280 g인, 10주령된 수컷 할란 스프라그-돌리(Harlan Sprague-Dawley) 래트 (인디아노폴리스 소재의 할란(Harlan))에게 그의 꼬리 정맥 내로 0.5 M 시트르산 (pH 4.5) 중 45 mg/kg 스트렙토조토신 (STZ)을 정맥내로 투여하였다. 연구 시작시, 체중과 혈당을 기준으로 하여 동물을 군으로 분류하였다. 혈당이 400-550 mg/dL 사이인 동물만을 본 연구에 포함시켰다. 연구 시작일 오전에 동물에게 미리 결정된 수개의 투여량들 중 하나로 시험 화합물을 단일 피하 주사하여 투여하였다. 주기적으로, 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 이중으로 채취하고, 이나트륨 EDTA를 함유하는 튜브 내로 수집하였다. 혈당측정기로 혈당 수준을 측정하였다. 또한, 정맥혈 샘플링으로부터 혈장을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 래트 인슐린 방사면역분석법을 사용하여 혈장 중에 존재하는 투여된 약물의 수준을 측정하였다. 시간 경과에 따른 혈당의 곡선하 면적 (mg*h/dL)을 각 개개의 동물에 대하여 계산하고, 이를 4-파라미터 로지스틱 회귀에 사용하여 ED50을 측정하였다. 상기 분석법에서, 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a), 평균 분자량이 약 30 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a), 및 평균 분자량이 약 20 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(b)는 전형적인 투여량 반응 곡선으로부터 각각 241, 138, 및 69 nmol/kg의 효능 (ED50)을 가졌다. 추가로, 상기 화합물들은 STZ로 처리된 래트에서 568 nmol/kg의 투여량으로 단일 피하 주사된 후 적어도 36시간 동안 혈당을 상기 래트 계통에서 정상인 (100 mg/dL 이하) 수준으로 저하시킬 수 있었다. 한편, 인슐린 디터머는 상기 분석법에서 568 nmol/kg의 단일 투여량으로 투여된 후 5-6시간 동안 글루코스를 정상화시켰다.
약력학적 파라미터를 평가하는 것 이외에도, 이중 혈액 샘플을 사용하여 시험 화합물에 대한 래트의 평균 약동학적 파라미터 값도 측정하였다. 약동학적 파라미터는 모델-독립형 방법 (윈노늘린 프로(WinNonlin Pro))을 사용하여 계산하였다. 생성된 약동학적 파라미터 값은 투여량의 함수로서 비선형성을 나타내었다. 기록된 값의 범위는 시험관 최고 투여량 (568 nmol/kg)과 최저 투여량 (5.6 nmol/kg) 사이에서 생성된 약동학적 파라미터 값에 상응하였다.
평균 분자량이 약 20 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(b) 에 대한 약동학적 결과는 6-12 h 범위의 최대 농도에 대한 시간 (Tmax), 0.05-0.14 L/h/kg 범위의 겉보기 제거율 (CL/F), 0.6-7.2 L/kg 범위의 겉보기 분포 부피 (V/F), 및 8.5-34.5 h 범위의 소실 반감기 (t½)를 나타내었다.
평균 분자량이 약 30 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a) 에 대한 약동학적 결과는 12시간의 Tmax, 0.05-0.13 L/h/kg 범위의 CL/F, 0.6-2.0 L/kg 범위의 V/F, 및 8.3-11.0 h 범위의 t½을 나타내었다.
평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a) 에 대한 약동학적 결과는 12-24시간의 Tmax, 0.06-0.2 L/h/kg 범위의 CL/F, 1.0-7.5 L/kg 범위의 V/F, 및 11.1-48.5 h 범위의 t½을 나타내었다.
인슐린 리스프로를 568 nmol/kg의 투여량으로 STZ로 처리된 수컷 래트에 유사한 방식으로 투여하였을 때, t½은 약 1 h이고, CL/F는 약 1.2 L/h/kg인 것으로 측정되었다.
인슐린 디터머를 18.9-568 nmol/kg 범위의 투여량으로 STZ로 처리된 수컷 래트에 유사한 방식으로 투여하였을 때, t½의 범위는 1.9-3.1 h이고, CL/F는 약 0.8- 1.7 L/h/kg인 것으로 관찰되었다.
약동학적 성질이 복잡하기 때문에, 디터머와 예시적인 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 사이의 겉보기 CL 비는 측정에 사용되는 투여량에 따라 달랐다. 그러나, 실시예 5에 기술된 연구에서는 일례의, 20- 또는 40 kDa PEG에 접합된 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물이 STZ로 유도된 당뇨병에 걸린 래트에서 디터머보다 약 5- 내지 30-배 더 느린 제거를 하는 것으로 나타났다.
실시예 6: 2형 당뇨병을 앓는 래트 모델에서의 PEG화된 인슐린 리스프로에 대한 시험관내 작용 지속 시간 및 약동학적 특징 평가
비히클 대조군 (PBS), 또는 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 9(a) 517 nmol/kg을 단일 피하 주사한 후, 수컷 ZDF fa/fa 래트 (n=4 래트/군)에서 40 kDa 선형 PEG를 갖는 화합물 9(a)의 당역학적 활성을 평가하였다. 약동학적 및 약력학적 특징, 둘 모두를 규명하기 위해 일련의 샘플을 수집하였다. 수컷 ZDF fa/fa 래트에게 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 9(a) 517 nmol/kg을 단일 피하 투여한 것은 적어도 7일 동안 지속되는, 통계학적으로 유의적인 글루코스 저하 (위약과 비교; p<0.05)와 관련이 있었다. 평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-MAL을 사용하여 제조된 화합물 9(a)의 노출은 또한 7일간에 걸쳐서 증명될 수 있었다.
실시예 7: 코발트 이온 존재하에서 페놀을 사용한 PEG -B28 (92.4％) /A1 (7.6％) -인슐린 리스프로, 인슐린 리스프로, 또는 그의 혼합물 (70％ PEG 20 kDa -B28 (92.4％) /A1 (7.6％) -인슐린 리스프로:30％ 인슐린 리스프로)의 페놀성 보존제 적정
70％ PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로 또는 인슐린 리스프로를, 20 mM KSCN 및 50 mM TRIS-ClO4를 함유하는 용액 (pH 8.0)에 용해시켰다. 어느 단백질이든 그의 표적 농도는 단백질 함량 (ε280 = 1.05 (mg/mL)-1cm-1)을 기준으로 약 4 mg/mL였다. 염화코발트 (41.9 mg)를 1 mL의 물로 용해시켜 코발트 이온 농도가 0.176 M인 스톡 용액을 수득하였다. 분취량의 코발트 스톡 용액 (단백질 농도에 따라서 약 2 ㎕)을 0.8 mL 단백질 용액을 첨가하여 코발트 이온 대 인슐린 육량체의 최농 몰비가 4가 되도록 하였다. 육량체화를 평가하기 위해 페놀성 보존제 농도의 함수로서 574 nm에서 코발트 배위 화학물질에서의 왜곡을 모니터링하였다. 특히, 진한 페놀 용액 (0.564 M)을 마이크로리터의 분취량을 사용하여 0.8 mL의 단백질 용액으로 적정함으로써 적정 종결시의 최종 부피가 0.84 mL를 초과하지 않도록 하였다. 각각 페놀을 분취한 후 최소 20분 동안 최종 용액을 교반하고, 400 nm 내지 800 nm로부터 용액의 가시 스펙트럼을 수집하였다. HisB10-배위된 코발트 몰 농도, 즉, 인슐린 육량체의 HisB10 부분이 2개의 2가 금속 이온을 배위시킨다는 지식에 기초하여 2를 곱한 육량체성 단백질 농도로 흡광도를 나눔으로써 574 nm에서 기록된 흡광도를 몰 흡광 계수로 전환하였다. PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로 및 인슐린 리스프로의 70/30 혼합물 (몰:몰) 제제를 제조하기 위해, 먼저 혼합물을 혼합한 후, 코발트를 첨가하고, 이어서 페놀성 보존제로 적정하였다.
인슐린 리스프로에서, B28 위치에 있는 프롤린과, B29 위치에 있는 리신의 천연 서열을 야생형 인간 인슐린과 비교함으로써 역전시켰다. 이러한 역전을 통해, 리스프로 인슐린 단량체가 이량체를 형성할 수 있는 능력을 입체적으로 방해하는 B 쇄의 C-말단 종단부의 형태상의 변화가 일어났다. 이로써, 이량체 결합 상수는 야생형 인간 인슐린의 것과 비교하면 300배로 감소하였다. 표 I에 제시한 결과는, 야생형 인간 인슐린과 비교하여 이미 약화되어 있는, 인슐린 리스프로의 이량체화 도메인에 가깝게 접합된 6개의 20 kDa PEG 부분이 존재함에도 불구하고 PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로는 놀랍게도 예상밖으로 휴마로그?에 사용되는 제조 조건과 유사하게 2가 금속 이온 및 페놀성 보존제의 존재하에서 육량체성 복합체로서 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 게다가, PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로 및 인슐린 리스프로의 70/30 혼합물 또한 육량체성 복합체를 형성할 수 있는 능력을 입증하는데, 이는 기초 인슐린 및 초속효성 인슐린의 즉석 및/또는 안정한 사전혼합형 제제의 제조를 뒷받침한다.
[표 I]
Figure 112010081412179-pct00012
실시예 8: Zn , 페놀, 및/또는 칼슘과 함께 제조된 PEG 20 kDa -B28 (92.4％) /A1 (7.6％) -인슐린 리스프로의 육량체성 상태 분석
인슐린 및 몇몇 인슐린 유사체의 화학적 저장 기간 및 사용시 안정성은 용액 중 분리된 육량체성 복합체를 형성할 수 있는 능력으로부터 이익을 얻게 되는 것이다. 2가 금속 이온 (Zn+2 또는 Co+2) 및 페놀성 보존제 (페놀 또는 m-크레졸)의 존재하에서 인슐린 또는 인슐린 리스프로를 육량체화시킬 수 있는 능력을 통해 AsnA21의 탈아미드화 속도는 느려지고, 이어서 고분자량 입자 (HMWP)의 형성은 최소화된다.
육량체를 형성할 수 있는 PEG20 kDa-LysB28-인슐린 리스프로의 능력을 평가하기 위하여, pH 6.7에서 A276 nm에 기초한 출발 단백질 농도가 8.6 mg의 인슐린 리스프로/mL 또는 38.2 mg의 PEG화된 인슐린 리스프로 접합체/mL인 것으로 하여, PEG20 kDa-B28 (92 4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로를 밤새도록 물 중에서 투석하였다. 이어서, 투석시킨 단백질을 물로 희석하여 단백질 농도를 4.6 mg/mL 또는 20.6 mg의 PEG화된 단백질 접합체/mL로 조정하였다. pH 7.0에서 포스페이트 완충액의 최종 농도는 40 mM이고, m-크레졸은 12.8 mg/mL로 하여 4x 완충액 스톡 용액을 제조하였다. 0.5 mL의 1 N HCl 중에 산화아연을 용해시킨 후, 최종 아연 농도가 0.097 M이 되도록 물로 희석함으로써 산화아연 스톡 용액을 제조하였다. 단백질 농도가 4.6 mg/mL인 PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 450 ㎕를 분취량의 아연 스톡 용액 (첨가되는 아연 스톡 용액의 최대 총 부피 = 2.5 ㎕ 또는 PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 육량체 1개당 4개의 아연 이온에 상당하는 등가량), 및 150 ㎕의 4x 포스페이트 완충액 스톡 용액과 혼합하여 아연 농도가 다양한 (0 내지 400 μM), 근거리-UV 원편광 2색성 (CD) 분석용의 용액 샘플을 제조하였다. 필요할 경우, 최종 pH를 pH 약 7.0으로 조정하였다. 0.2 cm 셀을 사용하여, 이황화물 변화에 민감한 대역인 250 nm에서 근거리-UV 원편광 2색성으로 PEG20 kDa-B28 (96％)/A1 (4％)-인슐린 리스프로 또는 인슐린 리스프로의 육량체성 결합을 모니터링하였다. 육량체 1몰당 아연 1몰의 비율에 대한 평균 잔기 타원율을 플롯팅하였다.
표 II에 제시한 결과는 추가로, 야생형 인간 인슐린과 비교하여 이미 약화되어 있는, 인슐린 리스프로의 이량체화 도메인에 가깝게 접합된 6개의 20 kDa PEG 부분이 존재함에도 불구하고 PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로는 놀랍게도 예상밖으로 휴마로그?에 사용되는 제조 조건과 유사하게 2가 금속 이온 및 페놀성 보존제의 존재하에서 육량체성 복합체로서 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
CD 열적 변성 실험을 통해 육량체화 및 리간드 결합이 육량체 촉진 시험 제제 중 PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린의 열적 안정성에 미치는 효과 또한 조사하였다. Zn2 + 결합 연구에서 사용된 250 nm에서보다는 240 nm에서 전반적인 신호 변화가 더 크게 나타났지만, 총 용액의 흡광도는 양질의 CD 데이타를 확보하기에 충분할 정도로 낮기 때문에 240 nm의 파장을 열적 변성 연구에 사용하였다. 1 mm 큐베트 중 240 nm에서의 열적 스캔 데이타를 5℃ 내지 대략 95℃ (최종 온도는 각 샘플에 따라서 약간씩 달랐다)에서 수집하였으며, 스캔 속도 및 데이타 피치는 1℃/분이고, 대역폭은 1.5 nm이고, 반응 시간은 8초였다. 열적 변성 데이타는 원신호 (240 nm에서의 mdeg)와, 겉보기상 언폴딩된 것의 분수값 (Funf) (이는 Funf(T)= [Yobs(T) - Ynat(T)]/[Yunf(T)-Ynat(T)] (여기서, Yobs(T)는 온도에 대한 함수로서 관찰된 신호값이고, Ynat(T) 및 Yunf(T)는 각각 천연 기준선 및 언폴딩된 것의 기준선에 대한 선형 외삽값이다)에 의해 제공된다), 이 두가지 모두로서 플롯팅될 수 있었다. 언폴딩 개시 온도는 Funf가 천연 기준선 (Funf = 0)으로부터 증가하기 시작하는 온도로서 정의되며, 중간점은 Funf = 0.5인 온도이다.
PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 육량체 및 인슐린 리스프로 육량체, 이 둘 모두가 16 mM TRIS (pH 7.2), 3.1 mg/ml m-크레졸, 및 아연 중에서 유사한 방식으로 제조되었을 때, PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 육량체의 열적 안정성은 인슐린 리스프로 육량체와 비교하여 상당히 감소하였다는 것이 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 수행된 CD 열적 변성 실험을 통해서 나타났다. 추가로, CD 열적 변성 연구를 통해 PEG20 kDa-B28 (92.4％)/A1 (7.6％)-인슐린 리스프로에 대한 융점에서 칼슘 및 클로라이드 이온 농도에 의존하여 현저히 증가한 것이 검출되었다 (데이타를 나타내지 않음). 더욱 특히, 언폴딩의 개시 온도는 16 mM TRIS (pH 7.2), 3.1 mg/ml m-크레졸, 및 아연 중에서 약 30℃인 것으로 관찰되었지만, 이는 75 mM 염화칼슘을 함유하는 동일의 제제 중에서는 약 50℃로 현저하게 증가한 것으로 관찰되었다. 제제에 염화칼슘보다는 NaCl (25 mM 내지 150 mM NaCl)을 첨가하였을 때에 r로서 유사한 효과가 관찰되었다. 그러므로, 저장시 제약 조성물의 화학적 및/또는 물리적 안정성을 증가시키기 위해서는 PEG20 kDa-B28-인슐린 리스프로 화합물을 포함하는 제약 조성물 중에서 칼슘 및/또는 클로라이드가 매우 유용한 육량체-촉진 부형제일 수 있다.
[표 II]
Figure 112010081412179-pct00013
실시예 9: PEG 20 kDa -B28 (~95％) /A1 (~5％) -인슐린 리스프로 생성
약 4 내지 6℃의 온도에서 150 mM의 2염기성 인산나트륨 및 50 mM의 EDTA를 함유하는 완충액 용액을 150 mM의 3염기성 인산나트륨과 혼합하여 pH가 10.85 내지 11.10 사이인 완충액 용액을 수득하였다. 약 4 내지 6℃ 사이의 온도에서 인슐린 리스프로 결정 (30-60 mg/mL)을 온화하게 교반시키면서 천천히 완충액에 첨가하여 결정이 분해되는 동안 응집체가 형성되지 않도록 하였다.
베쓸 중에 필요한 양만큼 냉수를 넣고, 교반시켜 와동을 형성하고, mPEG-NPC 분말을 와동의 눈에 서서히 부어 적절하고 신속하게 확실히 분산될 수 있게 하여 중량 평균 분자량이 약 20 kDa ± 약 2 kDa인 PEG를 포함하는 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜) p-니트로페닐 카르보네이트 (mPEG-NPC)를 냉수 (4-6℃) 중에 60-120 mg/mL의 농도로 용해시켰다. mPEG-NPC 분말은 미세 분말이고, 분산시 상당량의 기포가 베쓸로 방출되었다. 부피에 따라 30 내지 60분 사이에 걸쳐서 베쓸 중 mPEG-NPC 용액에서 기포가 제거될 수 있도록 하였다.
상기 제조된 인슐린 리스프로 용액을 기계 장치를 통해 교반되는 자켓형 베쓸로 옮겼다. 베쓸은 온도와 pH를 측정하기 위한 장치이다. 난류 영역에서 레이놀즈 수로 작동하는 표준 임펠러에 의해 교반하였다. 총 PEG 첨가 시간이 3 내지 5시간이 되게 하는 속도로 mPEG-NPC (PEG) 용액을 베쓸 내로 계량하였다. 자켓의 온도는 4℃ 내지 6℃ 사이로 유지시키고, 계속하여 혼합하였다. 150 mM의 3염기성 인산나트륨 완충액을 필요한 만큼 첨가하여 반응물의 pH를 10.85 내지 11.10으로 유지시켰다. 최종 PEG:인슐린 리스프로 몰비의 범위가 2.5 내지 4.5 사이가 될 때까지 PEG를 첨가하였다.
PEG 첨가 종결시, 자켓 온도를 25℃ 내지 30℃ 사이로 60분 내에 승온시키고, pH를 약 10.7 내지 약 11.0로 유지시키면서 반응 혼합물을 상기 온도에서 약 3 내지 약 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 종결시, 2x 완충액 (100 mM 산성 산/아세트산나트륨 (pH 4.0))을 첨가하여 반응 혼합물을 퀸칭시키고, 동일 2x 완충액을 사용하여 희석하여 그의 전도도 (2.5 mS/cm) 및 농도 (3-5 mg/mL)를 조정하였다.
적절한 수지 (예로서, 패스트 플로우 SP 세파로스 수지(Fast Flow SP Sepharose resin))로 패킹된 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 칼럼을 사용하여 반응 혼합물을 정제하였다. 상 높이가 약 15 내지 약 30 cm 사이가 될 때까지 칼럼을 패킹하고, 100 mM 아세트산Na (완충액 A)으로 평형화시키고, 약 50 내지 약 90 cm/h 사이의 적절한 유속으로 낮은 pH (약 2.5 내지 약 4.0)에서 묽은 반응 혼합물 (5-8 gm 생성물/수지 1L)을 로딩하였다. 모노-PEG화된 생성물 및 비반응성 단백질은 우선적으로 수지에 결합한 반면, 다중-PEG화된 부산물 및 과량의 시약은 대개는 칼럼을 통과하였다. 묽은 염 농도 (20-30 mM)를 갖는 완충액 A를 사용하여 약하게 흡착된 다중-PEG화된 부산물은 세척하여 제거하고, 이어서, 농도가 확장된 (50-70 mM) 완충액 (8-12 CV)을 사용하여 구배 용리를 수행하여 칼럼 상의 임의의 비반응성 단백질은 유지시키면서 우선적으로 PEG화된 생성물을 수지로부터 제거하였다. 생성물을 수집하고 (3-5 CV), 칼럼을 고염농도 (100 mM)를 갖는 완충액 A로 세척하여 비반응성 단백질을 제거하였다.
CEX 칼럼 주류 (3-5 CV)를 3-5 mg/mL으로 표준 편판형 막 (3-5 kDa 분자량 컷-오프)를 사용하여 접선 유동 여과시킴으로써 그의 농도를 40-80 mg/mL로 증가시켰다. 초기 농축을 수행한 후, 완충액을 교환하고, 필요한 농도로 최종적으로 농축시킴으로써 본 공정을 수행하였다. 전 공정 과정 동안 작동 유량은 시간당 필터 면적 1 ㎡당 10-20 ℓ(LMH) 사이, 및 약 15 내지 약 35 psi 사이의 막차압 (TMP)으로 유지시켰다.
최종의 진한 농도를 갖는 대량의 활성을 띠는 제약 성분 용액을 적절한 온도 (-20℃ 내지 -70℃)에서 냉동시키고, 적절한 온도 (-20℃ 내지 -70℃)에서 저장하였다.
실시예 10: 개에서의 PEG화된 인슐린 리스프로에 대한 약동학적 프로파일
체중이 7-10 kg인, 24살된 암컷 비글(Beagle) 개에게 18.9 nmol/kg의 예시적인 시험 화합물을 피하로 투여하였다. 주기적으로, 요측피 정맥 또는 대복재 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하고, 이나트륨 EDTA를 함유하는 튜브 내로 수집하였다. 정맥혈 샘플링으로부터 혈장을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 인슐린 방사면역분석법을 사용하여 혈장 중에 존재하는 투여된 약물의 수준을 측정하였다. 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 하기의 예시적인 화합물 각각에 대한 약동학적 프로파일 및 파라미터를 측정하였다: 평균 분자량이 약 40 kDa, 약 30 kDa, 및 약 20 kDa인 선형 mPEG-NPC를 사용하여 제조된 화합물 11.
약동학적 파라미터는 모델-독립형 방법 (윈노늘린 프로)을 사용하여 계산하였다. 평균 분자량이 약 20 kDa인 선형 mPEG-NPC를 사용하여 제조된 화합물 11은 대략 12시간의 최대 농도에 대한 시간 (Tmax), 대략 0.046 L/h/kg의 겉보기 제거율 (CL/F), 대략 14 nM의 최대 농도 (Cmax), 및 대략 14시간의 소실 반감기 (t½)를 나타내었다.
평균 분자량이 약 30 kDa인 선형 mPEG-NPC를 사용하여 제조된 화합물 11은 대략 24시간의 Tmax, 대략 0.027 L/h/kg의 CL/F, 대략 18 nM의 Cmax, 및 대략 23시간의 t½를 나타내었다.
평균 분자량이 약 40 kDa인 선형 mPEG-NPC를 사용하여 제조된 화합물 11은 대략 24시간의 Tmax, 대략 0.026 L/h/kg의 CL/F, 대략 15 nM의 Cmax, 및 대략 20시간의 t½를 나타내었다.
인슐린 디터머를 18.9 nmol/kg의 투여량으로 암컷 비글 개에 유사한 방식으로 투여하였을 때, 대략 1.3시간의 Tmax, 대략 0.12 L/h/kg의 CL/F, 대략 23 nM의 Cmax, 및 대략 3.5시간의 t½를 나타내었다. 표 III에는 개에서의 비교가능한 파라미터가 열거되어 있다. 본 연구에 사용된, 인슐린에 특이적인 RIA를 통해 PEG화된 인슐린 리스프로 및 내인성 인슐린, 두가지 모두 검출되었다.
[표 III]
Figure 112010081412179-pct00014
실시예 11: 인간에서의 평균 "편평도 값" 및 투여량의 예측
개선된 기초 인슐린 요법에 대하여 기준이 되는 중요한 단서는, 환자에서 1일 1회 투여하는 것으로 수정될 수 있는, 실제로 편평한 프로파일을 달성할 수 있는 능력이다. 충분히 편평하다는 것은 정점-저점 (PT) 비가 <2인 것으로 정의된다. 비교 목적으로, 공개된 PK 프로파일로부터 계산된 PT 비는 디터머의 경우 약 4-9 범위이고, 글라진의 경우 약 1.2-2.6이었다. 18.9 nmol/kg의 투여량의 예시적인 화합물 및 인슐린 디터머에 대한 래트 및 개의 PK 데이타 (각각 실시예 5 및 10 참조)를 1-CMT PK 모델로 적합화시키고, ka, CL/F 및 V/F에 의해 파라미터로 나타내었다. 이어서, 각각의 PK 파라미터 (P)를 상대성장 공식 P = aBW b (여기서, b는 ka, CL/F 및 V/F에 대하여 각각 -0.25, 0.75 및 1로 고정된 값이고, a는 적합화된 파라미터이다)에 적합화시켰다. 각 PK 파라미터에 대하여 평균 인간 예측치를 수득하고, 모의 실험을 통해 인간에서 매일 투여한 후 평균 프로파일을 작성하였다. 30 kDa 및 40 kDa PEG화된 인슐린 리스프로 접합체 사이는 서로 유사하기 때문에 모의 실험을 통해서는 오직 20 kDa PEG화된 인슐린 리스프로, 40 kDa PEG화된 인슐린 리스프로 및 인슐린 디터머만을 나타내었다. 작성된 모의 실험을 통해서는 20 kDa 및 40 kDa PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 대한 정점-저점 (PT) 비가 인슐린 디터머에 대한 것보다 편평성이 더욱더 큰 것으로 나타났다. 모의 실험 결과는 도 1에 제시되어 있다.
효능에 필요한 것으로서, 인간에게 투여되는 PEG화된 인슐린 리스프로의 투여량을 예측하기 위한 전략법은, 래트 모델에서 PEG화된 인슐린 리스프로와 인슐린 디터머 사이의 상대적인 효능은 진료소에서의 상대적인 효능과 유사하다는 가정하에 래트에서의 효능 모델에서 내부 대조군으로서 공지된 임상 비교측정자 (인슐린 디터머)를 사용하는 것이다. 진료소에서의 PEG화된 인슐린 리스프로의 1일 필요 투여량은 하기 공식을 사용함으로써 얻을 수 있다:
Figure 112010081412179-pct00015
각 PEG화된 인슐린 리스프로 접합체에 대한 상대적인 효능비는 표 IV에서 수득할 수 있다. 래트, 개 및 인간 (예측치)에서의 예시적인 PEG화된 인슐린 리스프로/디터머에 대한 상대적인 겉보기 제거비는 표 V에 컴파일링되어 있다.
[표 IV]
Figure 112010081412179-pct00016
[표 V]
Figure 112010081412179-pct00017
표 IV로부터 얻은 상대적인 효능 예측치와, 표 V로부터 얻은 상대적인 CL/F 예측치를 사용하여 얻은 인간에서의 PEG화된 인슐린 리스프로 접합체에 대한 평균 투여량 예측치는 20 kDa 및 40 kDa PEG화된 인슐린 리스프로 화합물에 대하여 각각 4.2 및 6.9 nmol/kg이었다. 이러한 예측치는 디터머 표지가 사용된 2형 당뇨병 환자에 대하여 보고된, 인슐린 디터머의 임상적인 1일 평균 투여량이 18.5 nmol/kg인 것에 기초한 것이다. 시간 함수와 효능을 고려할 때, 임상적인 최대 평균 투여량 예측치는 인슐린 디터머보다 약 3배 더 낮다. 최적의 경우, 20 kDa, 30 kDa, 및 40 kDa PEG화된 인슐린 리스프로 접합체에 대한 임상적인 평균 투여량 예측치는 인슐린 디터머보다 약 20- 내지 약 45-배 더 낮다.
실시예 12: 건강한 지원자에서의 단일 투여후 글루코스 주입 속도: PEG 20 kDa -B28 (≥~95％) /A1 (≤~5％) -인슐린 리스프로 및 글라진 투여
본질적으로 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조된 단일 투여량의 PEG20 kDa-B28 (≥~95％)/A1 (≤~5％)-인슐린 리스프로 (LY)를 사용함으로써 3부 1차-인간-투여량 연구를 수행하였다. 파트 A는 3개의 연구 기간을 포함하였는데, 여기서 피험체는 1차 기간에 LY 투여량을 피하 (SC) 주사를 통해 투여받은 후, 2차 기간에는 인슐린 글라진 투여량 (0.5 U/kg)을 주사를 통해 투여받았고, 이어서, 3차 기간에는 추가의 LY 투여량을 주사를 통해 투여받았다. 파트 B는 개방 표지형의 단일 투여로 이루어진, 2개의 복제형 기간 연구인데, 여기서 피험체는 24- 및 36-시간 글루코스 클램프를 사용하여 두 기간에 LY를 단일 투여량으로 투여받았다. 파트 C는 개방 표지형의 2 기간의 단일 투여로 이루어진, 순서가 고정된, 비교측정자로 조절되는 연구인데, 여기서 피험체는 한 기간에는 0.5 mg/kg의 LY를 SC로 단일 투여받았고, 나머지 한 기간에는 0.8 U/kg의 인슐린 글라진을 SC로 단일 투여받았다. 파트 A 및 C에서 피험체는 각 기간 동안 24시간 글루코스 클램프 방법을 받았고, 파트 B에서는 각 기간 동안 더욱 장기간 지속되는 (36시간 이하) 글루코스 클램프 방법을 받았다. 파트 A, B 및 C에서는 하기와 같은 투여량으로 LY를 피하 투여하였다:
파트 A 투여량: 0.0025, 0.0125, 0.075, 0.325 mg/kg (체중)
파트 B 투여량: 0.15, 0.225 mg/kg
파트 C 투여량: 0.5 mg/kg
피험체는 3차 기간에 비교측정자로서 단일 투여량의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물 또는 비교측정자로서 단일 투여량의 인슐린 글라진 (0.5 U/kg), 및 다른 단일 투여량의 LY를 투여받았다. 모든 처리 기간에 피험체는 각각의 인슐린 화합물 주사후 24/36시간 이하의 기간 동안 정상혈당 클램프 방법을 받았다. 글루코스 주입 속도 (GIR)를 조절하여 정상혈당을 유지하였는데, 시간 경과에 따라 기록된 GIR이 인슐린 작용의 GD 척도를 제공하였다. 정상혈당 글루코스 클램프의 목적은 일정 투여량의 인슐린 화합물 투여 후 글루코스 주입을 통해 정상혈당을 유지시키고자 하는 것이다. 내인성 인슐린 분비 및 간 글루코스 배출은 최소로 이루어지며, 글루코스 공간 밖으로 이동하게 되는 임의의 글루코스 (즉, 대사로 변화가 이루어진 글루코스)는 투여된 외인성 인슐린의 직접적인 결과물인 것으로 가정하였다. 이러한 경우, GIR이 시간의 경과에 따른 인슐린 작용의 당역학적 (GD) 척도가 될 것이다. 모든 글루코스 클램프 연구는 밤새도록 이루어진 대략 8시간 동안의 금식 이후에 수행하였다. 연구 당일날 아침, 정량 펌프의 제어하에 (거의 중성인 pH로 완충처리된) 20％의 덱스트로스 용액을 투여하기 위하여 작은 카테터를 한쪽 팔, 이상적으로는 전완부에 있는 정맥 내로 위치시켰다. 정맥 글루코스를 샘플링하기 위하여 또다른 카테터를, 이상적으로는 손목 또는 손에 위치시켰다. 동맥혈화된 정맥혈을 샘플링하기 위하여 가온 장치를 사용하여 상기 부위를 대략 55-60℃까지 가열하였다. 자동화된 글루코스 옥시다제 기법을 사용하여 전체 혈당 농도를 즉시 측정하기 위하여 혈액 샘플을 침대 곁에서 수득하였다. 기초 혈액을 샘플링하고, 대략 30분간의 안정화 기간이 경과한 후에 각 피험체에 일정 투여량의 인슐린 화합물을 피하 투여하였다. 인슐린 화합물을 피함 주사한 개시점을 시간 0으로 정의하였다. 혈당 측정을 위해 빈번하게 혈액을 샘플링하면서 투여를 실시하여 이러한 투여를 종결한 후, 인슐린 투여 후 24 또는 36시간 이하의 시간 동안 정상혈당을 유지하기 위하여 가변적인 속도로 글루코스를 정맥내로 주입하였다.
투여하기 전에 대략 30분 동안 대략 매 10분마다 혈액을 샘플링하고, 투여 후 처음 2시간 동안에는 매 5-10분마다 계속하여 혈액 샘플링을 실시하고 (임의로는 매 2.5분마다 빈번하게 샘플링할 수 있다), 이후 클램프 종결시까지 10-30분 간격으로 단축시켰다.
글루코스 클램프를 하는 동안 각개의 피험체에 대하여 미리 결정된 표적 혈당 농도를 유지시키기 위하여 글루코스 주입 속도를 조정하였다. 바람직하게, 표적 농도는 공복 혈당에 가까웠다. 글루코스 클램프 방법의 목적은 혈당 농도를 투여 이전의 표적 값 (이는 평균 공복 혈당보다 5 mg/dL 작은 값으로 정의된다)의 +5％ 이내로 유지시키는 것이다. 따라서, GIR이 변하는 동안 혈당 농도는 일정하게 유지된다. 따라서, 변화하는 글루코스 주입 속도가 시험 인슐린 화합물의 활성을 반영한다. 샘플링하여 얻은 혈당 수준과 클램프 동안에 일어난 주입 속도 변화를 기록하였다.
본질적으로 실시예 12에 기술된 바와 같이 수행된 연구를 통해서 LY는 인간에서 장기간의 작용 지속 시간, 24-44시간 범위의 겉보기 반감기, 및 기초적인 특징들, 정점-저점의 비가 2 미만 (도 2)이라는 이상적인 "기초" 인슐린의 특징을 갖는 것으로 입증되었다. 추가로, LY의 작용 지속 시간은 인슐린 글라진의 것보다 더 길었다 (도 2). 피험체 내에서 당역학적 성질의 가변성은 30％ 미만인데 (데이타로 나타내지 않음), 이는 글라진과 유사하거나, 또는 이보다 우수한 것이다. 마지막으로, 파트 C 연구 (0.5 mg/kg)로부터 얻은 당역학적 데이타를 통해 "정점이 없고," 36시간을 초과하는 시간 동안 GD를 유지하고, 글라진에 대한 정점 GIR 반응을 초과하는 (0.5 U/kg; 데이타로 나타내지 않음) LY의 GIR 프로파일을 얻었다.
실시예 13: PEG 20 kDa -B28 (~95％) /A1 (~5％) -인슐린 리스프로 제약 조성물의 화학적 및 물리학적 안정성
상기 실시예 7 및 8에서 기술한 바와 같이, PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로는 휴마로그?의 것과 유사한 제조 조건에서 2가 금속 이온 및 페놀성 보존제의 존재하에 육량체성 복합체로서 결합할 수 있다. 따라서, 시판 중인 인슐린 리스프로 용액 제제 (즉, 휴마로그? 용액 제제)와 유사한 PEG20 kDa-B28-인슐린 리스프로 제제에 대한 화학적 및 물리적 안정성 연구를 수행하였다. 다른 온도에서 지정된 저장 기간 동안 초기 시점으로부터 검출되는, 다양한 분석적 특성상의 유의적인 변화가 없었다면 시험 제약 제제의 화학적 안정성은 허용되는 것으로 간주하였다. 시각적으로 평가하였을 때 어떤 입자도 관찰되지 않았다면, 그리고 티오플라빈 T 형광 현미경 검사에 의해 평가하였을 때 어떤 피브릴 또는 겔 형성도 관찰되지 않았다면 시험 제약 제제의 물리학적 안정성도 허용되는 것으로 간주하였다.
각각 pH 7.0 또는 pH 6.5의 포스페이트 또는 시트레이트로 완충처리된, PEG20 kDa-B28-인슐린 리스프로 1몰당 0.5몰의 아연, 16 mg/mL 글리세린, 3.15 mg/mL m-크레졸을 함유하는 PEG20 kDa-B28-인슐린 리스프로 제제를 제조하고, 화학적 및 물리적 안정성, 이 두가지 모두에 대하여 시험하였다. 아연을 포함하지 않는 유사한 제제는 아연이 안정성에 미치는 효과를 평가하기 위해서 시험하였다. 35℃에서의 샘플은 대략 1개월간의 저장 기간 이후에 겔 입자를 형성하였고, 25℃에서의 샘플은 대략 2개월간의 저장 기간 이후에 현저히 많은 입자/기포를 형성하는 것으로 나타났다. 시각적으로 평가하였을 때에 시트레이트 완충처리된 샘플이 포스페이트 완충처리된 샘플보다는 화학적/물리적 안정성이 나쁜 것처럼 보이기는 하였지만, 시트레이트 및 포스페이트 완충처리되었을 뿐만 아니라, 아연/아연 비함유 제제, 두가지 모두가 35℃의 가속 조건하에서 유사한 화학적/물리적 안정성을 나타내었다. 인슐린 리스프로 대조군 제제는 투명한 상태로 남아있었다. 시트레이트 및 포스페이트 완충처리된 제제, 두가지 모두가 적어도 13개월 동안 5℃에서 허용되는 화학적 안정성을 입증하였다.
후속 연구에서는 페놀성 보존제인 m-크레졸이 PEG20 kDa-B28-인슐린 리스프로와 함께 조합되어 구성되고 고온 (> 25℃)에 노출되었을 때, 게화를 촉진시키는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, m-크레졸이 단독으로 mPEG에 첨가된 경우에는 고온에 노출되었을 때에도 (활성화된 또는 비-활성화된) 겔 입자는 생성되지 않았다.
승온하에서 인슐린 리스프로의 원형 제제가 PEG20 kDa-B28-인슐린 리스프로 화합물에 허용되는 안정성을 부여하지 않은 경우, 화학적 및 물리적 안정성이 개선되고, 비경구적으로 투여되는 제약 제제로서 상업화하기에 적합한 것으로 입증된, PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 화합물을 포함하는 제약 조성물이 개발되었다.
하기와 같은 PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 (15 mg/mL) 제제가 40℃에서 1주 동안, 30℃에서 1개월 동안, 25℃에서 3개월 동안 허용되는 화학적 및 물리적 안정성을 갖는 것으로 입증되었다:
1) 16 mM TRIS 완충액 (pH 7.0-8.0), 10 mM 염화칼슘, 20 mg/mL 당 (수크로스 또는 트레할로스), 3 mg/mL (28 mM) m-크레졸, 및 PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 1.0몰당 0.5몰의 아연
2) 16 mM TRIS 완충액 (pH 7.0-8.0), 10 mM 염화칼슘, 3 mg/mL 폴록사머, 3 mg/mL (28 mM) m-크레졸, 및 PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 1.0몰당 0.5몰의 아연
3) 5 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0), 130 mM 글리세린, 3 mg/mL (28 mM) m- 크레졸, 3 mg/mL 폴록사머, PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 1.0몰당 0.3몰의 아연
육량체를 촉진시키는 부형제, 예로서, 아연, m-크레졸, 및 칼슘을 함유하는 PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 제제는 일반적으로 특히, 승온하에서 보다 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 나타내었다. 아연 및 m-크레졸을 함유하는 PEG20 kDa-B28 (~95％)/A1 (~5％)-인슐린 리스프로 제제에 칼슘, 클로라이드 및/또는 NaCl을 첨가한 경우, 이는 추가로 제제가 40℃ 이상의 온도에 노출되었을 때 제제의 물리적 안정성을 증진시켰다. 추가로, 포스페이트 및 시트레이트 완충처리된 제제는 일반적으로 TRIS 완충처리된 제제보다 더 낮은 물리적 안정성을 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> PEGYLATED INSULIN LISPRO COMPOUNDS <130> X-18199.OUSnationalphaseseqlist.21-Nov-2010.Seqs123only <140> PCT/US2009/046704 <141> 2009-06-09 <150> 61/061,281 <151> 2008-06-13 <150> 61/121,394 <151> 2008-12-10 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30

Claims (36)

  1. 하기 화학식의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure 112012089200567-pct00022

    상기 식에서,
    A는 인슐린 리스프로의 A-쇄이고 (서열 1);
    B는 인슐린 리스프로의 B-쇄이고 (서열 3);
    P는 분자량 범위가 17.5 kDa 내지 40 kDa인 PEG이고, 여기서 A 및 B는 A (서열 1)의 7번 위치에 있는 시스테인과 B (서열 3)의 7번 위치에 있는 시스테인, A (서열 1)의 20번 위치에 있는 시스테인과 B (서열 3)의 19번 위치에 있는 시스테인, 및 A (서열 1)의 6번 위치에 있는 시스테인과 B (서열 3)의 11번 위치에 있는 시스테인 사이에 이황화 결합을 함유하고, P는 B의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아민기에 공유 결합을 통해 부착되어 있다.
  2. 제1항에 있어서, PEG 분자량이 17.5 kDa 내지 25 kDa 범위인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, PEG 분자량이 20 kDa 내지 25 kDa 범위인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, PEG 분자량이 20 kDa인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료상 유효량의 화합물을 환자에게 비경구적으로 투여하였을 때, 혈장 PK 프로파일의 정점 대 저점 비가 2 미만인 것을 추가의 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함하는, 고혈당증 또는 당뇨병의 치료를 위한 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 치료상 유효량의 인슐린 리스프로를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  8. 하기 화학식의 PEG화된 인슐린 리스프로 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하는 방법.
    Figure 112012089200567-pct00024

    상기 식에서,
    A는 인슐린 리스프로의 A-쇄이고 (서열 1);
    B는 인슐린 리스프로의 B-쇄이고 (서열 3);
    P는 분자량 범위가 17.5 kDa 내지 40 kDa인 PEG이고, 여기서 A 및 B는 A (서열 1)의 7번 위치에 있는 시스테인과 B (서열 3)의 7번 위치에 있는 시스테인, A (서열 1)의 20번 위치에 있는 시스테인과 B (서열 3)의 19번 위치에 있는 시스테인, 및 A (서열 1)의 6번 위치에 있는 시스테인과 B (서열 3)의 11번 위치에 있는 시스테인 사이에 이황화 결합을 함유하고, P는 B의 28번 위치에 있는 리신의 엡실론-아민기에 공유 결합을 통해 부착되어 있다.
  9. 제8항에 있어서, 반응의 pH가 10.5 내지 11.5 사이로 유지되는 것인 방법.
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