MX2010013837A - Compuestos de insulina lispro pegilada. - Google Patents

Compuestos de insulina lispro pegilada.

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John Michael Beals
Shun Li
Ryan John Hansen
Gordon Butler Cutler
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Abstract

La presente invención se refiere al campo de la diabetes. Más particularmente, la invención se refiere a compuestos de insulina lispro PEGilada que son PEGilados con poli(etilenglicol) de alto peso molecular, son altamente solubles a pH fisiológico, tienen una duración de acción extendida, y se caracterizan por relaciones pico-canal de farmacocinética, farmacodinámica, y/o actividad de menos de 2. La invención también se refiere a métodos para proporcionar tales moléculas, a composiciones farmacéuticas que los contienen, y a sus usos terapéuticos.

Description

COMPUESTOS DE INSULINA LISPRO PE6ILADA La presente invención se refiere al campo de la diabetes. Más particularmente, la invención se refiere a compuestos de insulina lispro PEGilada que son altamente solubles y tienen un perfil de acción extendido, y a métodos para proporcionar tales moléculas, a composiciones farmacéuticas que los contienen, y al uso terapéutico de tales compuestos.
Para lograr glicemia normal, la terapia de reemplazo de insulina es diseñada paralelamente tan cercanamente como sea posible, al patrón de secreción de insulina endógena en individuos normales. La demanda fisiológica diaria para insulina fluctúa y puede ser separada en dos fases: (a) la fase absorptiva que requiere un pulso de insulina para disponer del aumento de glucosa en la sangre relacionado con el alimento, y (b) la fase post-absorptiva que requiere una cantidad sostenida de insulina para regular el rendimiento de glucosa hepática para mantener la glucosa en la sangre en ayunos óptima. Por consiguiente, la terapia de insulina efectiva para diabetes en general, involucra el uso combinado ¦ de dos tipos de formulaciones de insulina exógena: una insulina a la hora de comer, de acción rápida, proporcionada por inyecciones de bolo, y una insulina de acción prolongada, administrada por inyección una vez o dos veces diariamente para controlar los niveles de glucosa en la sangre entre alimentos.
Las terapias de reemplazo de insulina actualmente disponibles, son deficientes en uno o más aspectos clínicamente importantes. Por ejemplo, las formulaciones de insulina tradicionales intermediarias y de acción prolongada, tales como el análogo de insulina basal, insulina detemir, posee una duración de actividad que es insuficiente para proporcionar el control de glucosa basal para un día completo cuando se administra diariamente. Como un resultado, la duración de acción de insulina basal es algunas veces, insuficiente para controlar adecuadamente la hiperglicemia y, más específicamente, los requerimientos de fase post-adsorptiva, con una inyección diaria única. Además, la omisión de una inyección única de terapias actuales puede conducir a un incremento significante en niveles "pico a canal" del fármaco, que resulta en control de glucosa deteriorado. Sin embargo, la utilización de estrategias de insolubilidad para prolongar la liberación de insulina en formulaciones de insulina tradicional intermedias y de acción prolongada, por ejemplo, suspensiones cristalinas de insulina Neutral Protamina Hagedorn (NPH) y ULTRALENTE®, o la estrategia de precipitación in vivo de insulina glargina, incrementan la variabilidad de intra-inyección que resulta en variabilidad incrementada en el perfil de respuesta de dosis.
Más específicamente, las suspensiones NPH y ULTRALENTE® requieren mezclado mecánico para asegurar uniformidad de producto, tienen variabilidad intra-sujeto incrementada y tienden a maximizar en lugar de proporcionar un perfil de farmacodinámica "plano" ideal necesario para mantener la glucosa en la sangre en ayunos óptima por un periodo extendido de tiempo entre alimentos. Por lo tanto, las formulaciones de insulina que dependen de un estado insoluble para prolongar la distribución de insulina son inherentemente menos predecible que las formulaciones solubles y resultan en menos que el control adecuado de glucosa en la sangre y una mayor susceptibilidad a episodios hipoglicémicos que amenazan la vida. Adicionalmente, los análogos de insulina basal moderna no son fácilmente mezclables con formulaciones de insulina de acción o inmediata. De este modo, las terapias de reemplazo de insulina actual, todavía dejan pacientes diabéticos susceptibles a episodios hipoglicémicos que amenazan la vida, complicaciones médicas de largo término serias de diabetes y/o imponen considerable de desventajas de inconveniencia y calidad de vida al paciente.
La Patente Estadounidense 4,179,337 titulada "Polipéptidos no Inmunogénicos" describe conjugados de insulina a moléculas PEG lineales que tienen un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 20,000 Da. Hinds and Kim, describen conjugados de insulina con bajo peso molecular (600 Da, 750 Da, y 2000 Da) monometoxipoü ( etilen glicol) (Hinds, K.D., and Kim, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54:505-530 (2002)) . En tal artículo, los autores declaran que restringen su estudio a conjugados de insulina mPEG de bajo peso molecular "debido a que la unión de mPEG de elevado peso molecular (5000 Da) fue [previamente] encontrada por presionar la bioactividad del conjugado". La Publicación de Solicitud de Patente Internacional de PCT No. WO 2006/079641, describe la conjugación de derivados de insulina, que incluyen insulina lispro, con pequeños polímeros ramificados. La Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT No. WO 2004/091494 describe, entre otros, moléculas de insulina conjugadas a moléculas PEG lineales o ramificadas que tienen un peso molecular total de PEG hasta aproximadamente 10 ka y aproximadamente 20 kDa, respectivamente. Las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional de PCT Nos. WO 2008/015099 (publicada el 7 de Febrero de 2008) y WO 2008/084051 (publicada el 17 de Julio 2008) describen, entre otras cosas, varios análogos de insulina conjugados a moléculas PEG que tienen un peso molecular nominal en el intervalo desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 40,000 Da.
Claramente, existe todavía la necesidad crítica para insulinas de acción prolongada que sean más adecuadas para regímenes de reemplazo de insulina basal. En particular, las insulinas básales solubles que son mezclables con formulaciones de insulina prandial, tienen perfiles de acción de tiempo extendido (es decir, capaz de controlar adecuadamente los niveles de glucosa en la sangre con inyección una vez diariamente o menos frecuente) , actividad plana, perfiles farmacocinéticos (es decir, relaciones inferiores "pico a canal") , variabilidad intra-paciente reducida (es decir, perfil de tiempo de acción más predecible que se traduce en incidencia reducida de hipoglicemia y/o ganancia de peso) y/o reducir la irritación o dolor del sitio de inyección después de la inyección, son necesarios.
Se reporta aquí, el descubrimiento que la insulina lispro puede ser PEGilada con derivados de poli ( etilenglicol ) de alto peso molecular para proporcionar compuestos de insulina lispro PEGilada que tienen actividad insulina basa terapéuticamente efectiva, perfiles de tiempo de acción extendidos, son altamente solubles a pH fisiológicos y/o sin mezclables con otras formulaciones de insulina prandial comúnmente usadas.
Breve descripción de la invención La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I: P- [(A) -(B)], o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde: A es la cadena A de insulina lispro (SEC ID N0:1); B es la cadena B de insulina lispro (SEC ID N0:3); y P es un PEG que tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa, y en donde A y B son apropiadamente reticulados y P está unido ya sea directamente o indirectamente via un enlace covalente al grupo alfa-amino de la glicina en la posición 1 de A, el grupo alfa-amino de la fenilalanina en la posición 1 de B, o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una pluralidad de compuestos de insulina lispro mono y di-PEGilados, en donde más de aproximadamente 75% de los compuestos de insulina lispro PEGilada en la composición, son compuestos mono-PEGilados de Fórmula I.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden compuestos de Fórmula I de insulina mono-PEGilada, en donde más de aproximadamente 50% de los compuestos mono-PEGilados en la composición, tienen un PEG covalentemente unido ya sea directamente o indirectamente, al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden insulina lispro PEGilada de Fórmula I y uno o más conservadores, agentes de isotonicidad, iones metálicos o amortiguadores, farmacéuticamente aceptables. En ciertas modalidades de la invención, composiciones farmacéuticas que comprenden una insulina lispro PEGilada de Fórmula I, y uno o más conservadores, agentes de isotonicidad, iones metálicos o amortiguadores farmacéuticamente aceptables, además comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de insulina.
La presente invención también proporciona los métodos para tratar hiperglicemia, diabetes mellitus o diabetes gestacional que comprende, administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende, un compuesto de insulina lispro PEGilada de la presente invención.
La presente invención también incluye el uso de un compuesto de insulina lispro PEGilada de la presente invención para terapia.
La presente invención también incluye el uso de un compuesto de insulina lispro PEGilada de la presente invención para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de hipoglicemia, diabetes mellitus o diabetes gestacional .
Breve descripción de las figuras La Figura 1, representa gráficamente perfiles PK humanos estimulados para insulina lispro PEG-B28 de 20 kDa, insulina lispro PEG-B28 de 40 kDa, e insulina detemir, basado en escalación alométrica de parámetros de PK a partir de ratas y perros. Los perfiles representan un intervalo de dosificación después de una semana de dosificación. Los números son relaciones medias de pico-canal.
La Figura 2 es una gráfica de relaciones de infusión de glucosa (GIR) en humanos después de una dosis subcutánea de ya sea insulina lispro de PEG2okDa_ B28 (=~95%) /Al ( ~5%) (LY; 0.225 mg/kg) o insulina glargina (0.5 U/kg) . Los perfiles GIR se basan en datos observados y una función "loess suave" (Splus 2000, Professional Edition, MathSoft, Inc) , desarrollada con Lilly Research Laboratories se usó para ajustar los datos observados.
Descripción detallada de la invención Las siguientes abreviaturas son usadas en la presente: ACN: Acetonitrilo . Boc: ter-Butoxicarbonilo . BSA: albúmina de suero bovino. DCM: diclorometano, metilencloruro. DMF: N, N-dimetilformamida . DMSO: Di-metil sulfóxido. DTT: Ditiotreitol . EDTA: ácido etilendiamina tetraacético Et : Etilo. EtOH: Etanol . Fmoc : 9- Fluorenilmetiloxicarbonilo . HC1 : ácido clorhídrico. Da: Dalton. kDa: kilodalton. Lilly: Eli Lilly and Company ( Indianápolis , IN) . mAb: anticuerpo monoclonal. Me : Metilo. MeOH: Metanol. PBS: salina amortiguada de fosfato. RP-HPLC: cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. SEC: cromatografía de exclusión de tamaño. SEM: error estándar de la media. SPA: ensayo de proximidad de escintilación . TFA: ácido trifluoroacético . Todas las abreviaturas de aminoácido usadas en esta descripción, son aquellas aceptadas por la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos como se expone en el 37 C.F.R. § 1.822(B) (2).
El término "insulina", está propuesto para abarcar la insulina de tipo nativo a partir de cualquier especie que incluye, pero no se limita a, insulina porcina, insulina bovina, e insulina humana. La insulina nativa o de tipo silvestre, se refiere a insulina que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido de la insulina como se encuentra en la naturaleza. Las secuencias de aminoácido y polinucleótido que codifican la insulina a partir de un número de diferentes especies, son bien conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Por ejemplo, la insulina humana tiene una cadena A de veintiún aminoácidos y una cadena B de treinta aminoácidos (SEC ID NOS: 1 y 2, respectivamente). La insulina puede ser natural (es decir, aislada a partir de una fuente natural), biosintéticamente o sintéticamente producida. El término "insulina" está también propuesto para incluir cualquier derivado de insulina y/p análogo de insulina.
Un "análogo de insulina" o "derivado de insulina", es definido aquí como proteína que tiene actividad de insulina y sustancialmente la misma secuencia de aminoácido como la insulina humana, pero diferente de la insulina humana por una modificación con relación a la insulina humana que incluye, una o más sustituciones, supresiones, inversiones o adiciones de aminoácido. Tales compuestos son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional PCT Nos. WO 96/15804 y WO 03/053339; Patentes Estadounidenses Nos. 3,528,960, 5,514,646, 5,618,913, 5,750,497, 6,011,007, 6,251,856; y Patentes EP Nos. 254,516 y 280,534. Una lista ejemplar pero no exhaustiva de análogos de insulina conocidos por un experto en la técnica incluyen, insulina aspart, insulina lispro, insulina glargina, insulina detemir, e insulina glulisina. Además, el término "insulina" aquí, también cubre compuestos los cuales pueden ser considerados por ser tanto un derivado de insulina como un análogo de insulina. Ejemplos de tales compuestos son descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,750,497, y 6,011,007. Un ejemplo específico de tal compuesto conocido por uno de habilidad en la técnica, es una insulina detemir.
Varios análogos y/o derivados de insulina, son conocidos por ser análogos de insulina de "acción acelerada" o "acción rápida". Los términos de "acción acelerada" y "rápida acción", son usados intercambiablemente en la presente. Un "análogo de insulina de rápida acción", produce un efecto de glucosa prandial que (a) comienza prontamente después de la administración subcutánea que la insulina humana, y/o (b) exhibe una duración de acción más corta que la insulina humana después de la administración subcutánea. Los análogos de insulina de acción acelerada ejemplares incluyen, "análogos de insulina monomérica" que son de acción acelerada debido a que son en general, menos propensos a dimerización o auto-asociación bajo condiciones fisiológicas. Los análogos de insulina monoméricos son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,700,662, y Patente Europea No. 214 826. La insulina lispro es un análogo de insulina monomérica de acción rápida en la cual, la prolina en la posición 28 de la cadena B de insulina de tipo nativa (SEC ID NO: 2) y la lisina en la posición 29 de la cadena B de insulina de tipo nativa (SEC ID NO:2), han sido cambiadas. Por consiguiente, la insulina lispro se conoce en la técnica por varias designaciones que incluyen, pero no se limitan a, insulina humana LysB28ProB29, insulina humana LysB28ProB29, e insulina humana B28Lys, B29Pro.
El término "reticulado" significa enlaces disulfuro que existen entre residuos de cisteina. Por ejemplo, la insulina humana reticulada apropiadamente contiene un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 7 de la SEC ID NO: I y la cisteína en la posición 7 de la SEC ID NO: 2, entre la cisteína en la posición 20 de la SEC ID NO. 1 y la cisteína en la posición 19 de la SEC ID NO: 2, y entre la cisteína en la posición 6 de la SEC ID NO: 1 y la cisteína en la posición II de la SEC ID NO: 1. De manera similar, un compuesto de insulina lispro apropiadamente reticulado, contiene un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 7 de la SEC ID NO: I y la cisteína en la posición 7 de la SEC ID NO: 3, entre la cisteína en la posición 20 de la SEC ID NO. 1 y la cisteína en la posición 19 de la SEC ID NO: 3, y entre la cisteína en la posición 6 de la SEC ID NO: 1 y la cisteína en la posición II de la SEC ID NO: 3.
Como se usa en la presente, "insulina lispro conjugada a PEG", o "insulina lispro PEGilada", se refiere a insulina lispro humana o un derivado del mismo covalentemente unido en al menos, un PEG y que posee actividad de insulina in vivo.
Las actividades biológicas de insulina e insulina lispro están bien establecidas. La frase "actividad de insulina" con respecto a un compuesto de insulina lispro PEGilada de la presente invención, está propuesta por significar la capacidad para reducir significantemente los niveles de glucosa en la sangre en al menos, un modelo de animal in vivo generalmente aceptado que incluye, pero no se limita a, los modelos animales de diabetes Tipo 1 y Tipo 2 descritos abajo en el Ejemplo 5 y Ejemplo 6, respectivamente. Por lo tanto, la actividad de insulina incluye la capacidad de un compuesto de insulina lispro PEGilada para reducir la glucosa en la sangre a un nivel de 100 mg/dl o por debajo de una rata tratada con STZ por un periodo que varia desde aproximadamente 4 horas por al menos aproximadamente 36 horas después de una inyección subcutánea única a una dosis de 568 nmol/kg .
El término "polietilenglicol" o "PEG", se refiere a un compuesto polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatización con porciones de acoplamiento o activación. En su forma típica, el PEG es un polímero lineal con grupos hidroxilo terminales y tiene la fórmula HO-CH2CH2- (CH2CH20) n-CH2CH2-OH . El número de unidades de repetición "n" en el PEG es aproximadamente para la masa molecular descrita en Daltons. Típicamente, los reactivos PEG usados para preparar compuestos PEGilados comprenden, una mezcla heterogénea de PEGs que tienen un número diferente (n) de unidades de etilenglicol en el polímero PEG. Una subunidad de etilenglicol única (-(CH2CH20)) de PEG, tiene un peso molecular de aproximadamente 44 Daltons. Por lo tanto, el peso molecular del polímero PEG depende del número (n) . Los PEGs unidos a los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, tendrán n en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1000 subunidades. Preferiblemente, los PEGs unidos a los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, tendrán un n en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 750. Más preferiblemente, los PEGs unidos a los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, tendrán un n en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 550. Más preferiblemente, los PEGs unidos a los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, tendrán un n de aproximadamente 400 y aproximadamente 500.
Numerosos derivados de PEG y métodos para elaborarlos y conjugarlos a una proteina tal como una insulina o insulina lispro, son conocidos en la técnica y son adecuados para uso en la presente invención. Véase por ejemplo, Pubs. de Solicitud de Patente Internacional PCT Nos. WO 01/62827, WO 2006/028745, WO 2006/096535, WO 2006/036825; Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995; Veronese, et al., Applied Biochem. and Biotech. 11:141-152, 1985; y Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002. Un PEG particularmente preferido para uso en la invención, es un PEG que tiene un extremo del polímero que termina con un grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi Ci~6 inferior. Preferiblemente, el PEG es un monometoxi-PEG (comúnmente referido como mPEG) , el cual está en una forma lineal de PEG, en donde un término del polímero es un grupo metoxi (-OCH3) . Aún más preferiblemente, el PEG usado en la invención, es un "mPEG activado", en el cual, un extremo del PEG lineal termina con un grupo metoxi y el otro extremo termina con un grupo reactivo apropiado para acoplamiento a un sitio deseado en una insulina lispro o en un derivado de insulina lispro derivatizado para facilitar la PEGilación con un mPEG activado deseado en un sitio específico de la molécula de insulina lispro.
Debido a que los PEGs son típicamente generados y usados como mezclas de compuestos PEG que varían en algún grado en su peso molecular, uno de habilidad ordinaria en la técnica en general, describe el peso molecular de un PEG unido a un compuesto describiendo el tamaño promedio del reactivo PEG usado en la reacción de PEGilación que genera el compuesto PEGilado particular. Entre las muchas formas posibles de reportar promedios, existen tres comúnmente usados: el número promedio, el peso promedio y los pesos molecular z-promedios. Como se usa en la presente, la fase "peso molecular promedio", está propuesta para referirse al peso molecular promedio en peso, el cual puede ser medido usando técnicas bien conocidas en el arte que incluyen, pero no se limitan a, Espetrometría de masas de desorción asistida por láser y tiempo de ionización de vuelo (MALDI-TOF) , cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida, técnicas de dispersión de luz, ultracentrifugación y viscometría. La fórmula para calcular el peso molecular promedio ponderado, puede ser representada como ? (MÍ2NÍ) /? (MÍ Í) en donde Ni es la fracción en mol (o la fracción en número) de moléculas con peso molecular Mi en la mezcla. La fórmula para calcular el número en peso de la molécula promedio puede ser representada como ? (MÍNÍ) /? (Ni) en donde Ni es la fracción en mol (o fracción en número) de moléculas con peso molecular M± en la mezcla. La relación del peso molecular promedio ponderado y número de peso molecular promedio ponderado, se conoce como el índice de polidispersidad (PDI), y proporciona una basta indicación de la amplitud de la distribución. Los reactivos PEG adecuados para preparar los compuestos de insulina lispro PEGilada de la invención, son típicamente polidispersos (es decir, número de peso molecular promedio y peso molecular promedio ponderado de los polímeros no son iguales) . Preferiblemente, el PDI para reactivos PEG usados para preparar los compuestos o composiciones de la presente invención, es menos de aproximadamente 1.1. Más preferiblemente, el PDI para reactivos PEG usados para preparar los compuestos o composiciones de la presente invención es menos de aproximadamente 1.05.
Con respecto a los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, el PEG covalentemente unido a una molécula de insulina lispro, tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 17.5 kDa hasta aproximadamente 40 kDa (n está en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1000) o el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa y aproximadamente 40 kDa. Preferiblemente, el PEG covalentemente unido a una molécula de insulina lispro tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 30 kDa (n está en el intervalo desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 750) o el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 30 kDa. Más preferiblemente, el PEG covalentemente unido a una molécula de insulina lispro tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 17.5 kDa hasta aproximadamente 25 kDa (n está en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 550) o el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa y aproximadamente 25 kDa. Mayormente preferiblemente, el PEG covalentemente unido a una molécula de insulina lispro tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 17.5 kDa hasta aproximadamente 20 kDa (n está en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 500) o el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa hasta aproximadamente 20 kDa.
En ciertas modalidades, los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, son preparados uniendo covalentemente un mPEG activado de un peso molecular promedio deseado a la insulina lispro. Las condiciones de reacción para PEGilación de la insulina lispro variarán, dependiendo del PEG particular empleado, el sitio de unión en la insulina lispro, el tipo particular de grupo reactivo en la insulina lispro que es el objetivo para unión, el grado deseado de PEGilación, y similares, y pueden fácilmente ser determinados por uno de habilidad en la técnica. Las condiciones experimentales optimizadas para una estrategia de PEGilación particular pueden ser fácilmente determinadas, típicamente por experimentación de rutina, por un experto en la técnica.
En modalidades preferidas, los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, son preparados conjugando indirectamente un mPEG activado que es relativamente tiol-selectivo tal como un mPEG-maleimida (mPEG-MAL) o un mPEG-tiol (mPEG-SH) a la insulina lispro, conjugando el mPEG activado tiol-selectivo a una funcionalidad tiol que ha sido introducida en la insulina lispro usando modificadores de "amina-a-tiol", tales como N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) y N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) . Más preferiblemente, el mPEG activado empleado para unir covalentemente un PEG a un grupo tiol ( sulfhidrilo) en una insulina lispro, es un mPEG-maleimida tal como (a), (b) , o (c) mostrado abajo, Un método preferido para preparar compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, utiliza la adición Michael para formar un enlace tioéter estable. La reacción es altamente especifica y toma lugar bajo condiciones medias en la presencia de otros grupos funcionales. Por ejemplo, la mPEG-maleimida es útil como un mPEG activado para preparar conjugados de insulina lispro PEGilada de la presente invención. Preferiblemente, el procedimiento de PEGilación usa un exceso molar de una insulina lispro derivada de tiol con relación a mPEG-maleimida para accionar la reacción a terminación, Preferiblemente, las reacciones también son realizadas entre pH 4.0 y 6.9 a temperatura ambiente por 1 a 40 horas. El exceso de péptido que contiene tiol no PEGilado, es fácilmente separado del producto PEGilado por métodos de separación convencional. Condiciones ejemplares requeridas para PEGIlación de insulina lispro usando mPEG-maleimida activada, son descritas en el Ejemplo 1.
En ciertas modalidades, los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, son preparados conjugado un mPEG activado que es relativamente especifico para aminas. Los mPEG activados adecuados para principalmente PEGilación especifica de amina de insulinas lispro incluyen, mPEG-succinimidil propionato (mPEG-SPA) , succinimidil butanoato de mPEG (mPEG-SBA) , mPEG-succinimidil a-metilbutanoato (mPEG-SMB) , mPEG-succinimidil carbonato (mPEG-SC) , mPEG-carbonato de benzotriazol, y mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-NPC) .
En modalidades preferidas de la invención, el mPEG activado usado para PEGilación de insulina lispro resulta en una insulina lispro covalentemente unida a un mPEG a través de un enlace covalente hidroliticamente estable, tal como un enlace amida, uretano (también conocido como un carbamato) , amina, tioéter (también conocido como disulfuro), o urea (también conocido como carbamida) . Más preferiblemente, el mPEG activado usado para PEGilación de insulina lispro es mPEG-SC o mPEG-NPC, ambos de los cuales resultan en una insulina lispro siendo covalentemente unida al PEG a través de un enlace uretano (o carbamato) . Condiciones ejemplares empleadas para PEGilación de insulina lispro usando mPEG-NPC de varios pesos moleculares se exponen en el Ejemplo 2. mPEG-SC: niPEG-NPC compuestos de insulina lispro PEGilada invención, son típicamente purificados usando una o más técnicas de purificación tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica, y/o cromatografía de fase inversa. La heterogeneidad total de compuestos de insulina lispro PEGilada (número y proporción de compuestos de insulina lispro PEGilada generados a partir de una reacción de PEGilación) en una muestra, puede ser valorada usando uno o más de los siguientes métodos: cromatografía, electroforesis, espectrometría de masas, y en particular, MALDI-MS, y espectroscopia de NMR.
La insulina lispro usada para preparar los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, pueden ser preparados por cualquiera de una variedad de técnicas de síntesis peptídicas reconocidas que incluyen, métodos de solución de fase, métodos de fase sólida, métodos semi-sintéticos y métodos de ADN recombinante . Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,700,663 (Chance, et al.) y Patente Europea No. 214 826 (Brange et al.), describen la preparación de varios análogos de insulina. Las cadenas A y B de insulina lispro, también pueden ser preparadas vía una molécula precursora similar a proinsulina usando técnicas de ADN recombinante. En modalidades preferidas, un precursor similar a proinsulina es usado para hacer la insulina lispro usada para elaborar la insulina lispro PEGilada de la presente invención.
La presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I: P- [(A) -(B)], o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde: A es la cadena A de insulina lispro (SEC ID NO: 1); B es la cadena B de insulina lispro (SEC ID NO: 3) ; y P es un PEG que tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 17.5 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, y en donde A y B son apropiadamente reticulados y P está unido ya sea directamente o indirectamente vía un enlace covalente al grupo alfa-amino de la glicina en la posición 1 de la cadena A, del grupo alfa-amino de la fenilalanina en la posición 1 de la cadena B, o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B. Compuestos preferidos de la invención, son aquellos en los cuales (a) P está covalentemente unido a insulina lispro vía un enlace uretano o tioéter; y (b) el compuesto es caracterizado por tener un Ki para el receptor de insulina humana de aproximadamente 30 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 5 nM o menos, una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 6 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, o aproximadamente 14 horas en una rata tratada con STZ dosificada a aproximadamente 568 nmol/kg, o por la actividad de reducción de glucosa en la sangre a un nivel de aproximadamente 100 mg/dL o por abajo en una rata tratada con STZ por un periodo que varia desde aproximadamente 4 horas hasta al menos aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 108 horas, o aproximadamente 120 horas después de una inyección subcutánea única del compuesto a una dosis de aproximadamente 568 nmol/kg. Compuestos aún más preferidos, son aquellos en los cuales: (a) P está covalentemente unido a insulina lispro vía un enlace uretano; (b) el compuesto es caracterizado por tener un Ki para el receptor de insulina humana de aproximadamente 10 nM o menos; (c) el compuesto es caracterizado por tener una vida media de eliminación mayor de 6 horas en una rata tratada con STZ dosificada a aproximadamente 568 nmol/kg; y (d) el compuesto es caracterizado por la actividad de reducción de glucosa en la sangre a un nivel de aproximadamente 100 mg/dL o por abajo en una rata tratada con STZ por un periodo que varia desde aproximadamente 4 horas hasta al menos aproximadamente 48 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 108 horas, o aproximadamente 120 horas después de una inyección subcutánea única del compuesto a una dosis de aproximadamente 568 nmol/kg. Compuestos más preferidos son aquellos en los cuales: (a) P está covalentemente unido a insulina lispro via un enlace uretano; (b) el compuesto es caracterizado por tener un Ki para el receptor de insulina humana de aproximadamente 10 nM o menos; (c) el compuesto es caracterizado por tener una vida media de eliminación mayor de 6 horas en una rata tratada con STZ dosificada a aproximadamente 568 nmol/kg; (d) el compuesto es caracterizado por la actividad de reducción de glucosa en la sangre a un nivel de aproximadamente 100 mg/dL o por abajo en una rata tratada con STZ por un periodo que varia desde aproximadamente 4 horas hasta al menos aproximadamente 48 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 108 horas, o aproximadamente 120 horas después de una inyección subcutánea única del compuesto a una dosis de aproximadamente 568 nmol/kg, y (e) el compuesto es caracterizado por tener una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 36 horas, 38 horas, aproximadamente 40 horas, o aproximadamente 42 horas en un humano, después de la administración de una dosis parenteral única a 0.225 mg/kg .
De conformidad con características y principios consistentes con la invención, una modalidad de la invención proporciona un compuesto de insulina lispro mono-PEGilada que comprende un PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 25 kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa covalentemente unido directamente o indirectamente, al grupo alfa-amino de glicina en la posición 1 de la cadena A de insulina lispro (insulina lispro PEG-GlyAl), del grupo alfa-amino de la fenilalanina en la posición 1 de la cadena B de insulina lispro (insulina lispro PEG-PheBl), o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro (insulina lispro PEG-LysB28). Preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 25 , kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa unido ya sea directamente o indirectamente, al grupo alfa-amino de fenilalanina en la posición 1 de la cadena B de insulina lispro o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro. Más preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 25 kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa unido al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro. Aún más preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 17.5 kDa; o aproximadamente 20 kDa unido al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro (insulina lispro de 20 kDa-PEG-LysB28) . Más preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa unido al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro (es decir, insulina lispro PEG2o kD¾_LysB28 ) .
Otras modalidades de la invención, proporcionan un compuesto de insulina lispro mono-PEGilada que comprende un PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 17.5 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 25 kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa covalentemente unido directamente o indirectamente, al grupo alfa-amino de glicina en la posición 1 de la cadena A de insulina lispro, del grupo alfa-amino de la fenilalanina en la posición 1 de la cadena B de insulina lispro, o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro. Preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 17.5 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 25 kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa unido ya sea directamente o indirectamente, al grupo alfa-amino de fenilalanina en la posición 1 de la cadena B de insulina lispro o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro. Más preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 17.5 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente 40 kDa unido al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro. Más preferiblemente, la insulina lispro mono-PEGilada comprende un PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa unido al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro y la insulina lispro PEG-LysB28- es caracterizada por tener una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 40 horas, o aproximadamente -42 horas en un humano, después de la administración de una dosis subcutánea única de la composición a 0.225 mg/kg.
En otra modalidad, la invención proporciona composiciones que comprenden, una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGiladas en donde la unión del PEG ocurre a diferentes sitios y/o a una mezcla de compuestos de insulina lispro mono-PEGilada, di-PEGilada y tri-PEGilada . Composiciones ejemplares de conformidad con la invención, son aquellas que comprenden más de un compuesto de insulina lispro PEGilada, seleccionados a partir del grupo que consiste de i) insulina lispro PEG-GlyAl, ii) insulina lispro PEG-PheBl, iii) insulina lispro PEG-LysB28, iv) insulina lispro di-PEG-GlyAlPheBl, v) insulina lispro di-PEG-GlyAlLysB28 , vi) insulina lispro di-PEG-PheBlLysB28, y vii) insulina lispro di-PEG-GlyAlPheBl . Más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de Compuestos de insulina lispro PEGilada en donde mayor de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 97% de los compuestos de insulina lispro PEGilada son compuestos de insulina lispro mono-PEGilada de Fórmula I. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde mayor de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 97% de los compuestos de insulina lispro PEGilada son compuestos de insulina lispro mono-PEGilada y menos de aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son di-pegilados. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde mayor de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 97% de los compuestos de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde mayor de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 97% de los compuestos de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28 y menos de aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-GlyAl. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde mayor de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 97% de los compuestos de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28, menos de aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-GlyAl y menos de aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son compuestos de insulina lispro di-PEGilada. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde aproximadamente 80% de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28, aproximadamente 10% son insulina lispro PEG-GlyAl, y aproximadamente 10% es insulina lispro di-PEG-GlyAlLysB28. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde aproximadamente 90% o más de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28, aproximadamente 5% o menos son insulina lispro PEG-GlyAl, y aproximadamente 5% o menos es insulina lispro di-PEG-GlyAlLysB28. Aún más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde aproximadamente 90% o más de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28, aproximadamente 5% o menos son insulina lispro PEG-GlyAl, aproximadamente 5% o menos es insulina lispro di-PEG-GlyAlLysB28 y en donde la insulina lispro PEG-LysB28 es caracterizada por tener una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 40 horas, o aproximadamente 42 horas en un humano, después de la administración de una dosis subcutánea única de la composición a 0.225 mg/kg. Más preferiblemente, composiciones de la presente invención comprenden una mezcla de compuestos de insulina lispro PEGilada en donde aproximadamente 95% o más de los compuestos totales de insulina lispro PEGilada son insulina lispro PEG-LysB28, aproximadamente 5% o menos son insulina lispro PEG-GlyAl, y la insulina lispro PEG-LysB28 es caracterizada por tener una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 36, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 40 horas, o aproximadamente 42 horas en un humano, después de la administración de una dosis subcutánea única de la composición a 0.225 mg/kg.
El término "condiciones básicas" como se usa en la presente, se refiere a la basicidad de la reacción de PEGilación. A insulina lispro más selectivamente PEGilada en la lisina en la posición 28 de la cadena B de insulina lispro, la reacción debe llevarse a cabo con el grupo alfa-amino de insulina lispro sustancialmente desprotonados. En un solvente acuoso o co-solvente, las condiciones básicas significan que la reacción se lleva a cabo a un pH mayor de 7.0. Preferiblemente, la reacción de PEGilación se conduce a pH desde aproximadamente 8.5 hasta aproximadamente 11.5. En un solvente orgánico, la reacción se lleva a cabo en la presencia de una base con una basicidad equivalente a un pKa mayor de o igual a 10.75 en agua.
La presente invención también incluye un proceso para elaborar un compuesto de insulina lispro PEGilada de la fórmula : P- [(A) -(B)], o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde : A es la cadena A de insulina lispro (SEC ID NO: 1); B es la cadena B de insulina lispro (SEC ID NO: 3) ; y P es un PEG que tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, y en donde A y B son apropiadamente reticulados y P está unido via un enlace covalente uretano al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B, el cual comprende hacer reaccionar el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B, con monometoxipoli (etilen glicol) p-nitrofenil carbonato (mPEG-NPC) , que tiene un peso molecular promedio ponderado entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 40 kDa en un solvente acuoso a un pH entre aproximadamente 8.5 y aproximadamente 11.5 y a una temperatura de reacción entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C. Preferiblemente, el pH de la reacción se mantiene entre aproximadamente 10.5 y aproximadamente 11.1, la reacción de pegilación se conduce a una temperatura entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C por un periodo de tiempo entre 2 y aproximadamente 12 horas y la relación de mPEG-NPC a insulina lispro está en el intervalo entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 5.0. Más preferiblemente, el peso molecular promedio ponderado del mPEG-NPC es aproximadamente 20 kDa, el pH de la reacción se mantiene entre aproximadamente 10.5 y aproximadamente 11.1, la reacción de pegilación se conduce a una temperatura entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 30 °C por un periodo de tiempo entre aproximadamente 2 y aproximadamente 12 horas, y la relación de mPEG-NPC a insulina lispro está en el intervalo entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 5.0. Aún más preferiblemente, la relación molar de PEG: insulina lispro está en el intervalo entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 4.5, el peso molecular promedio ponderado del mPEG-NPC es aproximadamente 20 kDa, el pH de la reacción se mantiene entre aproximadamente 10.5 y aproximadamente 11.1, la reacción de pegilación se mantiene entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C por un periodo de tiempo entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6 horas. Más preferiblemente, la relación molar de PEG: insulina lispro está en el intervalo entre aproximadamente 2.6 y aproximadamente 4.5, el peso molecular promedio ponderado del mPEG-NPC es aproximadamente 20 kDa, el pH de la reacción se mantiene entre aproximadamente 10.5 y aproximadamente 11.0, y la temperatura de la reacción se mantiene entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C por aproximadamente 3 horas.
Si se desea, compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención que tienen diferentes pesos moleculares, pueden ser aislados usando varias técnicas conocidas por un experto en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de filtración en gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, la cromatografía de filtración en gel, puede ser usada para fraccionar compuestos mono-PEGilados, di-PEGilados y tri-PEGilados de insulina lispro PEGilada, en base a sus diferentes pesos moleculares (en donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio del PEG usado en la reacción de PEGilación) . Por ejemplo, en una reacción ejemplar en donde una insulina lispro es conjugada a un mPEG activado que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa, la mezcla de reacción resultante puede contener insulina lispro no modificada que tiene un peso molecular de aproximadamente 5,808 Daltons, insulina lispro mono-PEGilada que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 25,808 Daltons, insulina lispro di-PEGilada que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 45,808 Daltons kDa, e insulina lispro tri-PEGilada que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 65,808 Daltons. Sin embargo, debido a que las técnicas de filtración en gel separan compuestos basados en tamaño hidrodinámico, la insulina lispro mono-PEGilada conjugada a un mPEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa, migrará durante la filtración de gel como una proteina de aproximadamente 82 kDa, debido a que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 25,808 Daltons. Un experto en la técnica podría esperar especies di y tri-PEGiladas con un peso molecular promedio mPEG de aproximadamente 20 kDa por tener una migración muy diferente o tiempos de retención que permiten su purificación y/o cuantificación .
La frase "vida media del plasma", se refiere al tiempo tomado para que la concentración de plasma del fármaco en el cuerpo caiga por la mitad. Un término alternativamente usado es "vida media de eliminación", el cual corresponde a la relación lineal log terminal de eliminación. Aquellos de habilidad en la técnica, aprecian que la vida media es un parámetro derivado que cambia como una función de tanto separación como volumen de distribución. Los términos "extendido", "prolongado" o "incrementado", usados en el contexto de vida media del plasma o vida media de eliminación, son usados intercambiablemente en la presente, y están propuestos por significar que existe un incremento estadísticamente significante en la vida media de un compuesto de prueba (por ejemplo, una insulina lispro PEGilada) con relación a aquella de la molécula de referencia (por ejemplo, insulina lispro), como determinada bajo condiciones comparables.
La separación es la medida de la capacidad del cuerpo para eliminar un fármaco. Una separación reduce debido a, por ejemplo, modificaciones a un fármaco, la vida media podría esperarse que incremente. Sin embargo, esta relación recíproca es exacta solamente cuando no existe cambio en el volumen de distribución. Una relación aproximada útil entre la vida media lineal-log terminal (t^) , separación (CL) , y volumen de distribución (V), se da por la ecuación: t¾ ~ 0.693 (V/CL) . La separación no indica cuanto fármaco está siendo removido sino, preferentemente, el volumen de fluido biológico tal como sangre o plasma que podría haber estado completamente libre de fármaco para considerar la eliminación. La separación es expresada como un volumen por unidad de tiempo.
El término "tratamiento" o "tratar" como se usa en la presente, se refiere al manejo y cuidado de un paciente que tiene diabetes o hiperglicemia, u otra condición por la cual la administración de insulina está indicada para propósitos de combatir o aliviar síntomas y complicaciones de estas condiciones. El tratamiento incluye, administrar compuestos o composiciones de la presente invención para prevenir el comienzo de síntomas o complicaciones, aliviar los síntomas o complicaciones, o eliminar la enfermedad, condición o trastorno. El paciente a ser tratado es un mamífero, y preferiblemente, un ser humano.
Los compuestos de insulina lispro PEGilada de Fórmula I, son efectivos en el tratamiento de hiperglicemia administrando a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos de Fórmula I. Como se usa en la presente, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva", se refiere a tal cantidad de un compuesto de insulina lispro PEGilada de Fórmula I, o composiciones de la misma, suficientes para regular la glucosa en la sangre en un paciente. Preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina lispro PEGilada de Fórmula I, es desde aproximadamente 0.01 nmol/kg hasta aproximadamente 100 nmol/kg. Más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva es desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50 nmol/kg. Aún más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva es desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 20 nmol/kg. Aún más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva es desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10 nmol/kg. Aún más, preferiblemente una cantidad terapéuticamente efectiva es desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 7.5 nmol/kg. Aún más, preferiblemente una cantidad terapéuticamente efectiva es desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 5 nmol/kg. Más preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva es desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 nmol/kg. Sin embargo, se entiende que la cantidad del compuesto o composición de insulina lispro PEGilada que comprende uno o más compuestos de insulina lispro PEGilada actualmente administrada, será determinado por un especialista en vista de las circunstancias relevantes que incluyen, la condición a ser tratada (es decir, la causa de la hiperglicemia ) , las especies particulares de insulina lispro PEGilada o mezcla particular de compuestos de insulina lispro PEGilada a ser administrada, otros fármacos, insulinas o de otro modo, a ser co-administrada , la ruta parenteral de administración elegida, la edad, peso y respuesta del paciente individual y la severidad de los síntomas del paciente. Por lo tanto, los intervalos de dosificación anteriores no están propuestos para limitar el campo de la invención en cualquier manera .
La frase "suficiente para regular la glucosa en la sangre", significa que la administración de un compuesto o composición a un paciente, resulta en un nivel de glucosa de plasma en ayunas normal. Un nivel de glucosa de plasma en ayunas clínicamente normal es 70-110 mg/dL. Un nivel de glucosa en el plasma postprandial clínicamente normal es menos de 140 mg/dL.
Los cambios químicos covalentes en la estructura de insulina son conocidos por ocurrir después del almacenamiento. Esto puede conducir a la formación de moléculas la cuales son menos activas y potencialmente inmunogénicas tales como productos de desaminación y productos de transformación de peso molecular superior (por ejemplo, dímeros, oligómeros, polímeros) . Un estudio comprehensivo sobre la estabilidad química de la insulina se da en Jens Brange in "Stability of Insulin", Klu er Academic Publishers, 1994. La vida media de los productos de insulina es principalmente comprometida por la formación de agregados solubles (dimeros, oligómeros y polímeros) con el tiempo, debido al hecho de que las composiciones de insulina son típicamente almacenadas a una temperatura baja de no más de aproximadamente 2-8 °C, la cual mejora la vida de anaquel considerablemente comparada con el almacenaje, por ejemplo, a temperatura ambiente. Además, los productos de insulina son sometidos a la formación de agregados insolubles (fibrillas), como un resultado de sacudimiento, por ejemplo, cuando se lleva a cabo en la bolsa de un paciente o durante el transporte. Es esencial para la calidad de un producto de insulina, que la tendencia a formar tales agregados solubles e insolubles como un resultado de influencias químicas o físicas, se reduzca a un mínimo absoluto. Por lo tanto, las composiciones de insulina deben demostrar características de estabilidad química y física para ser usadas terapéuticamente .
El término "estabilidad", como se usa en la presente, se refiere a la estabilidad física y/o química de las formulaciones de compuestos de insulina lispro PEGilada. La inestabilidad física de una formulación de insulina lispro PEGilada, puede ser causada por agregación de las moléculas de proteína para formar polímeros de orden superior o aún precipitados. Una formulación "estable" es una en donde el grado de agregación de proteínas es aceptablemente controlado, y no incrementa inaceptablemente con el tiempo. En ciertas modalidades de la invención, una formulación de insulina lispro PEGilada es considerada estable durante un cierto periodo de tiempo si el grado de agregación está dentro de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% o 30% del grado de agregación observado en el material de partida. En ciertas modalidades de la invención, una formulación de insulina lispro PEGilada es considerada estable durante un cierto periodo de tiempo si la actividad biológica del polipéptido es al menos aproximadamente 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50% de la actividad observada con el material de partida.
El término "estabilidad química" como se usa en la presente, se refiere a la tendencia de una composición de insulina lispro PEGilada para formar agregados de proteína soluble durante el almacenaje a bajas temperaturas de aproximadamente 2-8°C o a temperaturas elevadas de aproximadamente 20-40°C. La estabilidad química de un compuesto de insulina lispro PEGilada de la invención, puede ser medida determinando los atributos analíticos en la formulación bajo condiciones específicas, tales como a una temperatura particular y condición de humedad durante un cierto periodo de tiempo. Los atributos analíticos que pueden ser medidos incluyen, la formación de especies de alto peso molecular usando HPLC de exclusión de tamaño por ejemplo. Los resultados pueden entonces ser monitoreados y comparados contra parámetros pre-especificados .
El término "estabilidad física" como se usa en la presente, se refiere a la tendencia de una composición de insulina lispro PEGilada para formar agregados de proteína insoluble como un resultado de una acción física tal como sacudimiento de una composición de insulina lispro PEGilada. La estabilidad física de compuestos de insulina lispro PEGilada de la invención después del almacenaje por un periodo definido de tiempo a varias temperaturas en varias formulaciones farmacéuticas, puede ser valorada por métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen medición de una atenuación de luz aparente de la muestra (absorbancia o densidad óptica) . Tal medición de atenuación de luz se refiere a la turbidez de una formulación. La turbidez se produce por agregación o precipitación de proteínas o complejos en la formulación. Otros métodos para valorar la estabilidad física son bien conocidos en la técnica, e incluyen valoraciones visuales de presencia o ausencia de partículas detectando formación de fibrilla/gel por microscopio de fluorescencia de Tioflavina T.
Otras modalidades de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un paciente, particularmente a un ser humano, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto de insulina lispro PEGilada de Fórmula I y uno o más excipientes, diluyentes, amortiguadores, iones metálicos o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas son típicamente, aunque no necesariamente, parenterales en naturaleza y pueden ser preparadas por cualquiera de una variedad de técnicas usando excipientes, amortiguadores, diluyentes, iones metálicos o portadores convencionales, para productos parenterales los cuales son bien conocidos en el arte.
Debido a que los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención son muy solubles en agua, una composición farmacéutica de la presente invención, incluye una composición que comprende agua como el solvente primario, compuestos de insulina lispro PEGilada a una concentración total de al menos 1 mg/mL, al menos 2 mg/mL, al menos 5 mg/mL, al menos 10 mg/mL, al menos 15 mg/mL, al menos 20 mg/mL, al menos 25 mg/mL, al menos 30 mg/mL, al menos 35 mg/mL, al menos 40 mg/mL, al menos 45 mg/mL, al menos 50 mg/mL, o más y un amortiguador farmacéuticamente aceptable en donde la composición farmacéutica tiene un pH desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.5.
Preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención tiene un pH entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 8.5. Más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, comprende compuestos de insulina lispro PEGilada a una concentración total en el intervalo desde aproximadamente 2.5 mg/mL hasta aproximadamente 60 mg/mL y un amortiguador en donde la composición tiene un pH en el intervalo desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 8.5. Más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, comprende compuestos de insulina lispro PEGilada a una concentración en el intervalo desde aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 50 mg/mL y un amortiguador, en donde la composición farmacéutica tiene un pH en el intervalo desde aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, comprende compuestos de insulina lispro PEGilada a una concentración en el intervalo desde aproximadamente 10 mg/mL hasta aproximadamente 40 mg/mL y un amortiguador, en donde la composición farmacéutica tiene un pH en el intervalo desde aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, comprende compuestos de insulina lispro PEGilada a una concentración en el intervalo desde aproximadamente 15 mg/mL hasta aproximadamente 40 mg/mL y un amortiguador, en donde la composición farmacéutica tiene un pH en el intervalo desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 7.5, o desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 8.0. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, además comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina. Aún más preferiblemente, la insulina es un análogo de insulina. Aún más preferiblemente, el análogo de insulina es un análogo de insulina de rápida acción. Más preferiblemente, el análogo de insulina de rápida acción es insulina lispro.
El término "amortiguador", se refiere a una solución que resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. Preferiblemente, los amortiguadores empleados son amortiguadores farmacéuticamente aceptables. La frase "amortiguador farmacéuticamente aceptable", se refiere a una solución que es segura para usar en formulaciones de insulina y que tiene el efecto de controlar el pH de la composición farmacéutica al pH deseado. En modalidades preferidas, el amortiguador tiene un pH en el intervalo desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 8.5. Más preferiblemente, el amortiguador tiene un pH en el intervalo desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 8.0. Amortiguadores farmacéuticamente aceptables para controlar el pH de las composiciones de la presente invención en este intervalo incluyen, pero no se limitan a, agentes tales como amortiguadores de fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS e histidina, asi como también a combinaciones de los mismos. "TRIS" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-1, 3, -propandiol, y a cualquier sal del mismo farmacológicamente aceptable. La base libre y la forma de clorhidrato (es decir, TRIS-HC1) , son dos formas comunes de TRIS. El TRIS también es conocido en la técnica como trimetilol aminometano, trometamina, y tris (hidroxi-metil ) aminometano . Preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende desde aproximadamente 2.5 mM hasta aproximadamente 50 mM de amortiguador de fosfato o TRIS. Más preferiblemente, composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 20 mM de amortiguador de fosfato o TRIS. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 10 mM de amortiguador de fosfato. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende aproximadamente 5 mM de amortiguador de fosfato. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende aproximadamente 7.5 mM y aproximadamente 50 mM de amortiguador TRIS. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 25 mM de amortiguador TRIS. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende entre aproximadamente 15 mM y aproximadamente 20 mM de amortiguador TRIS. Muy preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende aproximadamente 16 mM de amortiguador TRIS.
Los compuestos y composiciones de insulina lispro PEGilada de la invención, pueden ser formulados análogamente con formulaciones conocidas de insulinas que son administradas a pacientes parenteralmente . Tales formulaciones son conocidas por un experto en la técnica. Preferiblemente, los compuestos de insulina lispro PEGilada de Fórmula I, son formulados análogamente con la formulación de insulina lispro HUMALOG® o Humulin®. Por lo tanto, una composición farmacéutica preferida de la presente invención puede comprender agua, un compuesto de insulina lispro PEGilada de Fórmula I, un agente de isotonicidad y un amortiguador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, además comprende un conservador farmacéuticamente aceptable. Más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, además comprende un catión divalente tal como zinc y/o cobalto, el cual puede facilitar la hexamerización de insulina. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, además comprende al menos un agente estabilizante de hexámero. Además, el ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio, pueden ser agregados para ajustar el pH .
Un "agente de isotonicidad", es un compuesto que es fisiológicamente tolerado e imparte tonicidad adecuada a una formulación para prevenir el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con una composición farmacéutica administrada. El glicerol, el cual es también conocido como glicerina, es comúnmente usado como un agente de isotonicidad. Otros agentes de isotonicidad incluyen i) otros alcoholes de azúcar tales como pero no limitado a, manitol y sorbitol, ii) sales tales como pero no limitadas a, NaCl, iii) monosacáridos que incluyen, pero no se limitan a, dextrosa y iv) disacáridos que incluyen, pero no se limitan a lactosa, sacarosa y trehalosa. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir uno o más agentes de isotonicidad. Preferiblemente, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, tienen uno o más agentes de isotonicidad los cuales producen una formulación con una isotonicidad en el intervalo de aproximadamente 270 y aproximadamente 330 mOsm. Más preferiblemente, el (los) agente (s) de isotonicidad es glicerol, sorbitol, sucrosa, NaCl, trehalosa y/o manitol. Aún más preferiblemente, el agente de isotonicidad es glicerol, sorbitol, sucrosa, NaCl, y/o trehalosa. Aún más preferiblemente, glicerol, sorbitol, sucrosa, NaCl, o trehalosa a una concentración desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Aún más preferiblemente, glicerol a una concentración desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Aún más preferiblemente, glicerol a una concentración desde aproximadamente 150 hasta aproximadamente 180 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Aún más preferiblemente, glicerol a una concentración desde aproximadamente 130 hasta aproximadamente 175 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Aún más preferiblemente, NaCl a una concentración desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 300 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Aún más preferiblemente, NaCl a una concentración desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Más preferiblemente, NaCl a una concentración de aproximadamente 150 mM está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también contener un compuesto estabilizante de hexámero. Las frases "compuesto estabilizante de hexámero", se refiere a un compuesto de peso molecular menor, no proteináceo que estabiliza los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención en un estado de asociación hexámérica. Los iones de calcio, zinc, cobalto, cobre, níquel, hierro, magnesio, manganeso, aniones, particularmente, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato y compuestos fenólicos, particularmente fenil, conservadores fenólicos, resorcinol, ' -hidroxiacetaniluro, 4-hidroxibenzamida, y 2, 7-dihidroxinaftaleno, son compuestos estabilizantes de hexámero conocidos por moléculas de insulina. Preferiblemente, el compuesto estabilizante de hexámero es fenol, m-cresol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, metilparabeno, calcio, cloruro, o una combinación de dos o más de estos compuestos. Más preferiblemente, el compuesto estabilizante de hexámero es fenol, m-cresol, calcio, cloruro o una combinación de los mismos. Preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, comprende entre aproximadamente 1 mM y 75 mM calcio, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM calcio, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 25 mM calcio, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 50 mM calcio, entre aproximadamente 2.5 mM y aproximadamente 30 mM calcio, entre aproximadamente 2.5 mM y aproximadamente 15 mM calcio, entre aproximadamente 2.5 mM y aproximadamente 10 mM calcio, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 30 mM calcio, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 15 mM calcio. Más preferiblemente, una composición farmacéutica de la invención, comprende entre aproximadamente 2.5 mM y 10 mM de calcio.
Las formulaciones de uso múltiple de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden también contener un conservador. El término "conservador", se refiere a un compuesto agregado a una formulación farmacéutica para actuar como un agente antimicrobiano. Entre conservadores conocidos en la técnica por ser efectivos y aceptables en formulaciones parenterales son están, cloruro de benzalconio, bencetonio, clorohexidina, fenol, m-cresol, alcohol bencílico, metilparabeno, propilparabeno, clorobutanol , o-cresol, p-cresol, clorocresol, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido benzoico y varias mezclas de los mismos. Ciertos conservadores fenólicos, tales como metilparabeno, fenol y m-cresol, son conocidos por enlazarse a la insulina y a moléculas similares a insulina y con ello, inducir los cambios conformacionales que incrementan ya sea la estabilidad física o química, o ambos {Véase, por ejemplo, Birnbaum, D. T., et al., Pharmaceutical. Res. 14:25-36 (1997); Rahuel-Clermont, S., et al., Biochemistry 36:5837-5845 (1997)). "Conservador fenólico", incluye los compuestos fenol, m-cresol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, metilparabeno, y mezclas de los mismos. El conservador usado en las formulaciones de los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, puede ser un conservador fenólico, y puede ser el mismo como, o diferente del compuesto estabilizante de hexámero. Preferiblemente, el conservador fenólico es m-cresol o fenol. Más preferiblemente, composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden fenol y/o m-cresol, a una concentración desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 75 mM como un conservador a un pH desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente pH 8.0. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende fenol y/o m-cresol a una concentración desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 60 mM como un conservador a un pH desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente pH 8.0. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende fenol y/o m-cresol a una concentración desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40 mM como un conservador a un pH desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente pH 8.0. Aún más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende fenol y/o m-cresol a una concentración de aproximadamente 30 mM a un pH desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente pH 8.0. Más preferiblemente, una composición farmacéutica de la presente invención comprende fenol y/o m-cresol a una concentración de aproximadamente 30 mM a un pH desde aproximadamente 7.3 hasta aproximadamente pH 7.5.
Como se mencionó anteriormente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender cationes metálicos divalentes tales como zinc o cobalto,' que accionan la hexamerización de insulina o de otro modo, estabilizan los compuestos de insulina. "Catión metálico divalente", significa el ión o iones que participan para formar un complejo con una multiplicidad de moléculas de proteina. Los metales de transición, los metales alcalinos y los metales alcalino térreos, son ejemplos de metales que son conocidos por formar complejos con compuestos de insulina. Los metales de transición son preferidos. Preferiblemente, el catión de metal divalente es uno o más de los cationes seleccionados del grupo que consiste de zinc, cobre, cobalto, níquel, manganeso, magnesio, cadmio, y hierro. Más preferiblemente, el zinc es el catión de metal divalente. El zinc es conocido por facilitar la formación de hexámeros de insulina y de varios análogos y/o derivados de insulina, que incluyen insulina lispro. El papel primario de cationes divalentes tales como zinc o cobalto en composiciones farmacéuticas de la presente invención, es facilitar la formación de hexámeros de los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención y/o cualquiera de otras insulinas o análogos de insulina en una composición farmacéutica que comprende un compuesto de insulina lispro PEGilada de la presente invención. En la presencia de un conservador fenólico, la formación de hexáitiero puede ser facilitada llevando el pH de una solución que comprende formulaciones farmacéuticas de la presente invención, en la región neutral en la presencia de iones de Zn(II), o agregando Zn(II) después que el pH ha sido ajustado a la región neutral. Preferiblemente, la relación de zinc a compuesto de insulina, análogo de insulina y/o compuesto lispro de insulina PEGilada, es unido al limite inferior por aproximadamente 0.33, esto es, dos átomos de zinc por hexámero de insulina, hexámero análogo de insulina y/o hexámero de insulina lispro PEGilada. Más preferiblemente, la relación de zinc a compuesto de insulina, análogo de insulina, y/o compuesto de insulina lispro PEGilada es desde aproximadamente 0.33 hasta aproximadamente 0.67. Aún más, el zinc puede ser usado durante el proceso si un compuesto que compite con la proteina para enlace de zinc, tal como citrato o fosfato, está presente. El exceso de zinc arriba de la cantidad necesaria para hexamerización, puede ser deseable para accionar más fuertemente la hexamerización, por ejemplo, una relación de compuesto de zinc a insulina, análogo de insulina, y/o compuesto de insulina lispro PEGilada desde aproximadamente 0.33 hasta aproximadamente 0.83. También, el exceso de zinc arriba de la cantidad necesaria para hexamerización puede estar presente en una composición farmacéutica de la presente invención, y puede ser deseable para mejorar la estabilidad química y física, para mejorar la "suspendabilidad" , y posiblemente para extender la acción del tiempo además. Por otro lado, cantidades excesivas de zinc en amortiguadores de citrato o fosfato, podría conducir a precipitación de citrato de zinc o fosfato de zinc, respectivamente, así como también insulina.
De conformidad con la presente invención, el zinc puede estar presente en la formulación en una cantidad desde aproximadamente 0.3 moles hasta aproximadamente 3 moles por mol de insulina, análogo de insulina y hexámero de insulina lispro PEGilada. Más preferiblemente, el zinc está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención en una cantidad desde aproximadamente 0.3 mol hasta aproximadamente 1 mol por mol de insulina total, análogo de insulina, y hexámero de insulina lispro PEGilada. Aún más prefe iblemente, el zinc está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención en una cantidad desde aproximadamente 0.3 mol hasta aproximadamente 0.7 mol por mol de insulina total, análogo de insulina, y hexámero de insulina lispro PEGilada. Más preferiblemente, el zinc está presente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención en una cantidad desde aproximadamente 0.3 mol hasta aproximadamente 0.55 mol por mol de insulina, análogo de insulina, y hexámero de insulina lispro PEGilada. El compuesto de zinc que proporciona zinc para la presente invención, puede ser cualquier compuesto de zinc farmacéuticamente aceptable. La adición de zinc a las preparaciones de insulina se conoce en la técnica, como son fuentes farmacéuticamente aceptables de zinc.
Preferiblemente, el zinc se proporciona como una sal, tal como sulfato de zinc, cloruro de zinc, acetato de zinc, citrato de zinc, óxido de zinc o nitrato de zinc.
En una modalidad adicional de invención, la composición farmacéutica de la presente invención además comprende uno o más tensoactivos. El término "tensoactivo" como se usa en la presente, incluye agentes que reducen la tensión de superficie de un liquido por adsorción en la interfaz aire-liquido. Ejemplos de tensoactivos incluyen, sin limitación, tensoactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 80 o polisorbato 20) ; poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón™ (por ejemplo, TritonT"X-100 ) ; polietil glicol; polipropil glicol; y copolimeros de etileno y propilen glicol (por ejemplo, pluronics, PF68). Por ejemplo, el tensoactivo puede estar presente en una composición farmacéutica de la presente invención en una cantidad desde aproximadamente 0.001-0.5%, por ejemplo, desde aproximadamente 0.05-0.3%. Preferiblemente, el tensoactivo usado en la composición farmacéutica de la presente invención es poloxámero 188. Más preferiblemente, el tensoactivo es poloxámero 188 a una concentración entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 10 mg/mL, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/mL, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mg/mL, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10 mg/mL, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10 mg/mL, entre aproximadamente i y aproximadamente 5 mg/mL, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 mg/mL, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5 mg/mL, y entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5 mg/mL.
La invención también proporciona un compuesto de insulina lispro PEGilada de Fórmula I, o un sal del mismo farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de hipoglicemia y/o diabetes, preferiblemente, en humanos.
La invención también proporciona un compuesto de insulina lispro PEGilada de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable para uso en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de hipoglicemia y/o diabetes, preferiblemente, en humanos.
Composiciones farmacéuticas que comprenden una insulina lispro PEGilada de conformidad con la presente invención, pueden ser administradas parenteralmente a pacientes en necesidad de tal tratamiento. La administración parenteral puede ser realizada por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa similar a pluma, o inyector de impulso mecánico. Alternativamente, la administración parenteral puede ser realizada por medio de una bomba de infusión.
Preparación 1 Insulina lispro GlyAl-HSCH2CH2CO (3) e insulina lispro LysB28-HSCH2CH2CO- (4) Una mmol cada una de Trt-SCH2CH2CO-OH, N-hidroxisuccinimida (NHS), y diisopropilcarbodiimida (DIC), se mezcla en 2 mL DMF por 30 minutos para preparar éster de Trt-SCH2CH2CO-NHS . Un décimo de mmol de insulina lispro se disuelve en 10 mL de trietilamina al 5% (TEA) en DMSO. A la solución se agregan 0.2 mmol de Trt-SCH2CH2CO-NHS activado. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se agregan 0.2 mL de etanolamina para terminar la reacción. La mezcla de reacción entonces se diluye con 90 mL de H20 y se aplica sobre una columna RP-C18 para purificación. Las fracciones deseadas de insulina lispro-LysB28-Trt-SCH2CH2CO (2) , son combinadas y liofilizadas . Separadamente, las fracciones deseadas de insulina lispro-GlyAl-Trt-SCH2CH2CO (1), son combinadas y liofilizadas . Un décimo de mmol de (1) o (2) se disuelve en 5 mi de TFA que contiene 0.2 mi de tioanisol y 0.4 mi de triisopropil-silano . Después de 30 minutos, se remueve el TFA por evaporación y el péptido residual se toma en 50 mL de ACN al 10% en H20. La solución restante es aplicada a una columna RP-C18 por purificación. Las fracciones deseadas de (3) o (4) son combinadas y, opcionalmente , liofilizadas .
Preparación 2 Insulina lispro-PheBl-HSCH2CH2CO (7) Un décimo de mmol de insulina lispro se disuelve en 10 mL de 5% de TEA en DMSO. A la solución se agregan 0.2 mmol de di-ter-butilcarbonato en DMSO. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se agregan 0.2 mi de etanolamina para terminar la reacción. La mezcla de reacción es entonces diluida con 90 mL de H20 y aplicada sobre una columna RP-C18 para purificación. Las fracciones deseadas de Boc-GlyAl, insulina lispro-Boc-LysB28 , son combinadas y liofilizadas para proporcionar (5) . Un décimo de (5) se disuelve en 10 mL de 5% de TEA en DMSO. A la solución se agregan 0.2 mmol de Trt-SCH2CH2CO-NHS activado. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se agregan 0.2 mi de etanolamina para terminar la reacción. La mezcla de reacción es entonces diluida con 90 mL de H20 y aplicada sobre una columna RP-C18 por purificación. Las fracciones deseadas son combinadas y liofilizadas para proporcionar Trt-SCH2CH2CO-PheBl , Boc-GlyAl, insulina lispro-Boc-LysB28 (6) . Un décimo mmol de (6) se disuelve en 5 mi de TFA que contiene 0.2 mi de tioanizol y 0.4 mi de triisopropilsilano . Después de 30 minutos, el TFA se remueve por evaporación y el péptido residual se toma en 50 mi de ACN al 10% en H20. La solución resultante se aplica a una columna RP-C18 por purificación. Las fracciones deseadas son combinadas y liofilizadas para proporcionar (7) .
Ejemplo 1: PEGilación de intermediarios de insulina lispro derivatizados de tiol Monometoxi-PEG-MAL que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa (b) , 30 kDa (a), 40 kDa (a), o 60 kDa (c) , se disuelve en una mezcla 1:1 de 100 mM de amortiguador NH4Ac (pH 4.69) y ACN. Un polvo liofilizado de una insulina lispro derivatizada de tiol, por ejemplo, el compuesto (3), (4), o (7), se agrega a la solución. La reacción puede ser seguida por RP-HPLC analítico. Cuando la reacción se completa (usualmente después de aproximadamente 4 horas), la mezcla se diluye con H2O y se aplica sobre una columna RP-HPLC por purificación. Las fracciones deseadas con combinadas y liofilizadas para proporcionar los compuestos de insulina lispro PEGilada. Los compuestos de insulina lispro PEGilada ejemplares preparados como se describe en el Ejemplo 1 son mostrados abajo como (8(a)), (8(b)), (9(a)), (9(b)), (10(a)) , (10(b)) , y (15(c)) . Preferiblemente, estos compuestos de insulina lispro PEGiladas tendrán n en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1000. Más preferiblemente, estos compuestos de insulina lispro PEGiladas tendrán n en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 750. Más preferiblemente, estos compuestos de insulina lispro PEGiladas tendrán n en el intervalo desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 550. Aún más preferiblemente, estos compuestos de insulina lispro PEGiladas tendrán n de aproximadamente 400 y aproximadamente 500. Aún más preferiblemente, estos compuestos de insulina lispro PEGiladas tendrán n de aproximadamente 450 y aproximadamente 500. Más preferiblemente, estos compuestos de insulina lispro PEGiladas tendrán n de aproximadamente 450. insulina lispro GlyAl[N(alfa )] insulina lispro LysB28[N(epsilon)] insulina lispro P eB 1 [N(alfa )] (8(a)) insulina lispro GlyAl[N(alfa )] (8(b)) insulina lispro GlyAl[N(alfa )] <¾ (»)) insulina lispro LysB28[N(e sílon)] (9(b)) NH insulina lispro Ly s B 28 [ N (e p si 1 on) ] ?? Ejemplo 2: PEGilación de insulina lispro usando monometoxipoli (etilen glicol) p-nitrofenil carbonato (mPEG-NPC) Un décimo mmol de insulina lispro se disuelve en 20 mi de amortiguador de borato 0.2M, pH 10.5 y 1.98 g de mPEG-NPC que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa en 20 mi de ACN, se agrega a la solución con agitación vigorosa. La reacción se monitorea por RP-HPLC y SEC . Después de aproximadamente 4 horas, la mezcla de reacción se acidifica a pH 5-7 usando ácido acético y se aplica en una columna RP-HPLC para purificación. Las fracciones deseadas se combinaron y liofilizaron para proporcionar insulina lispro PEG20K mono-PEGILADA en un rendimiento que varía de 20 hasta 45%. Se confirmaron la identidad y pureza por RP-HPLC, SEC, y MALDI-MS. Se determina la proporción de mPEG unida en una cadena A o cadena B por las áreas de integración de cadena A y cadena B libre liberada después del tratamiento del conjugado resultante con clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) . La proporción de mPEG-NCP a insulina lispro determina la distribución de producto de especies mono-PEGilada y di-PEGilada. El pH de la reacción rige la especificidad del sitio de PEGilación. Como el pH se incrementa de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12, el compuesto (11) llega a ser el producto principal. Cuando se conduce la reacción a pH 10.5 con mPEG-NPC que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa (n es aproximadamente 450), la proporción de (11) a (12) es aproximadamente 85:15.
La reacción de PEGilación descrita anteriormente también se puede conducir en una solución acuosa no amortiguada manteniendo el pH de la mezcla de reacción por adición continua de 0.2 M de NaOH. Cuando se conduce en una solución acuosa no amortiguada usando mPEG-NPC que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa mientras el pH se mantiene a aproximadamente pH 11.5, los productos de reacción de PEGilación (11) y (12) es una proporción de aproximadamente 92:8. Preferiblemente, el compuesto (11) puede tener n en el intervalo de aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1000. Más preferiblemente, el compuesto (11) puede tener n en el intervalo de aproximadamente 400 hasta aproximadamente 750. Aún más preferiblemente, el compuesto (11) puede tener n en el intervalo de aproximadamente 400 hasta aproximadamente 550. Aún más preferiblemente, el compuesto (11) puede tener n de aproximadamente 400 hasta aproximadamente 500. Aún más preferible, el compuesto (11) puede tener n de aproximadamente 450 y aproximadamente 500. Más preferible, el compuesto (11) puede tener n de aproximadamente 450. (11) insulina lispro LysB 28[N(ep silon)] (12) o O .0 ¦o NH I insulina Espro G lyA 1 [N (alf )] (13) insulina lispro P h eB 1 [N (alfa ) ] (14) insulina LysB 28[N(epsilon)] Ejemplo 3: Afinidad del Receptor in vitro Se realizaron ensayos de enlace al receptor en membranas PI preparadas a partir de células HE 293 EBNA establemente transfectadas que sobre-expresan el receptor de insulina humano (hIR) o receptor IGF-1 humano (hIGF-lR) . Se determinan afinidades de enlace a partir de un ensayo de enlace radio-ligando competitivo usando ya sea insulina (3- [125I] yodotrirosil A14) (200 Ci/mmol)o insulina [125I] recombinante humano similar al Factor de Crecimiento I (200 Ci/mmol) . El ensayo se realiza con un método SPA usando perlillas SPA acopladas a aglutinina de germen de trigo Tipo A tratado con PVT PEI. Se usa amortiguador de ensayo SPA (50 m de TRIS-HC1, pH 7.5, 150 mM de NaCl, 0.1% de BSA) para todas las preparaciones del reactivo. Se prepararon diluciones de compuestos seriales tres veces (100 nM a 2 pM) en amortiguador de ensayo usando un robot Freedom/Evon (Tecan) , se agrega a microplacas de fondo claro de 96 cavidades (Corning/Costar) con un Multimek (Beckman Coulter) . Se agregaron radioligando, membranas y perlillas SPA usando un instrumento de multigota (Titertek) . Después de una incubación de 10 horas a temperatura ambiente, se determina la radioactividad usando un contador de escintilación Microbeta Trilux. Se incubaron insulina lispro no etiquetado ' e IGF-I no etiquetado en cada experimento como controles positivo y negativo. Se determinaron valores IC5o a partir de análisis de regresión no lineal logisticos de 4 parámetros. La constante de afinidad (Ki) se calcula a partir del valor IC50 en base a la ecuación Ki = IC50/1 + D/Kd) en donde D iguala la concentración de radioligando usando en el experimento y Kd iguala el equilibrio de constante de afinidad de enlace del radioligando determinado a partir de la saturación de análisis de enlace (Kd por hIR y hIGF-IR es 0.124 y 0.130 nM, respectivamente). El Ki medio reportado es por debajo de 10A (Ki Log Medio) , en donde Ki Log Medio = Promedio (Kil + Ki2 + Ki3 ...Kin) y el número de experimentos independientes (n) es mayor de dos. Sin embargo, se nota abajo con respecto a IGF-1 humano, n es dos.
Se prepararon los siguientes compuestos de insulina lispro PEGilada preparados como se describe en el Ejemplo 1 que tiene un Ki medio geométrico menos de 30 nM en el ensayo de enlace hIR descrito anteriormente: el compuesto 10(a) se prepara usando mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40kDa, el compuesto 8(a) preparado usando mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa, el compuesto 15(c) preparado usando mPEG-MAL bifucardo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 60 kDa, el compuesto 9(a) preparado usando mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa, el compuesto 9(a) preparado usando mPEG-MAL lineal que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa y el compuesto 9(b) preparado usando mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de 20 kDa. En los ensayos de enlace hIR y hIGFR, el compuesto 9(a) preparado usando mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa que tiene un Ki medio geométrico de 3.07 nM ± .32 nM (±S.E.M; n = 6) y mayor que 84.3 nM (SEM = no determinado; n = 6) , respectivamente. Adicionalmente, productos de insulina lispro PEGilada heterogéneos generados como se describe en el Ejemplo 2 usando un mPEG-NPC lineal de ya sea 40, 30 o 20 kDa también tienen un Ki medio geométrico de menos que 30 nM en el ensayo de enlace hIR descrito anteriormente. En el ensayo de enlace descrito hIR descrito anteriormente, la insulina lispro tiene un Ki medio geométrico de 0.22 ± .072 nM (±SEM; n = 4). En el ensayo de enlace hIGFR descrito anteriormente, todos los compuestos mencionados anteriormente tienen un Ki medio geométrico mayor que 75 nM y el IGF-1 humano tiene un Ki medio geométrico de 1.51 ± .23 nM (± SEM; n = 2).
Estos datos muestran que la posición PEGilante B28 reduce la afinidad hIR por abajo de 10 veces, haciendo estas especies de insulina lispro PEGilada débiles en contra de hIR. Las especies de insulina lispro PEGilada también poseen propiedades de enlace IGFR-1 no medibles en este ensayo bajo estas condiciones.
Ejemplo 4: Evaluación de la Potencia de Insulina Lispro PEGilada usando un Ensayo de Célula Completa de Fosforilación del Receptor de Insulina Los compuestos de insulina lispro PEGilada de la presente invención, se puede evaluar para actividad funcional usando DELFIA®, un método de ensayo fluorométrico de tiempo resuelto heterogéneo comercialmente disponible (Perkin-Elmer) . Brevemente, las células 293HEK que sobre-expresan el receptor de insulina humano son tripsinizadas y colocadas a 60,000 células/cavidad en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades Costar de media área, recubiertas con poli-D-lisina en medio libre de suero (SFM), (DMEM con 0.1% de ácido graso libre de BSA) . Las placas de cultivo celular se incuban durante la noche a 37 °C en un incubador de C02. Las placas de captura mAb 8314 de cadena A del receptor anti-insulina también se preparan en la noche antes de usar la placa microtituladora de 96 cavidades de 1/2 área negra Costar, tratada durante la noche a 4°C con 30 µ? de mAb 8314 de cadena A del receptor anti-insulina (Soos, M.A., et al. Biochem J 235:199-208 (1986); comercialmente disponible incluidos a partir de Abcam, Inc., Cambridge, A) , diluido a 1 g/ml en 10 mM de carbonato de sodio. Las placas de captura mAb se lavan cuatro veces con 50 mM de TRIS, pH 7.5, 150 mM de NaCl, y 0.1% de Tween (TBST) para remover cualquier mAb 8314 no enlazado. La placa de captura mAb 8314 después se bloquea por más de 1 hora a 4°C con BSA al 1% en TBST. Después del bloqueo, la placa de captura se lava dos veces con TBST para remover exceso de la solución BSA. Una vez que la placa de captura está en el amortiguador de bloqueo, las placas de cultivo celular se remueven a partir del incubador y se equilibran a temperatura ambiente. Los compuestos de prueba son serialmente diluidos en SF . Para estimular al autofosforilación del receptor de insulina, se agregan 50 µ? del agente de prueba diluido a la monocapa celular. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detiene aspirando los compuestos de prueba y agregando posteriormente 50 µ? de un amortiguador de lisis 2x (NP40 al 2%, 10 nM de TRIS, pH 7.4, 300 nM de HaCl, inhibidor de proteasa Roche Complete™ con EDTA, y 4 mN de vanadato) . Después de 30 minutos en amortiguador lisis a temperatura ambiente, se transfirieron 30 µ? de lisado a la placa de captura bloqueada que contiene 30 µ? de un anticuerpo PY20 anti-fosfotirosina Europio NI, Eu-Nl-PY20 (Perkin Elmer), diluido a 50 ng/ml en 10 mM de Hepes, 140 nM de NaCl y Tween al 0.1%. Esta mezcla se incubó por 1 hora a temperatura ambiente seguida por 6 lavados con TBST para remover Eu-Nl-PY20 y lisado celular. Después de la incubación con 50 µ? de Solución Intensificadora (Perkin Elmer) por 10 minutos con agitación intermitente como la señal desarrollada. El receptor de insulina fosforilada se cuantifica usando un allac Víctor usando Tiempo de Resolución de Fluorescencia de Europio fijo. Se calcula el nivel de fosforilación como un % de la respuesta para una dosis de estimulación máxima de insulina (100 nM) . Se calculan las potencias de los análogos de insulina como la dosis EC50 usando un cuarto parámetro fijo de la respuesta a dosis. Compuestos de insulina lispro PEGilada preparados como se describe en el Ejemplo 1 que tiene un EC50 de menos de 15 nM en el ensayo descrito en el Ejemplo 4, incluyen 10(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa, 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa, 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa, y 9(b) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa. En el ensayo descrito en el Ejemplo 4, el compuesto 9(a) preparado usando mPEG-MAL lineal tiene un EC50 de 10.88 nM. Productos de insulina lispro PEGilada heterogéneos generados como se describe en el Ejemplo 2 usando un mPEG-NPC lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40, hasta aproximadamente 30, o aproximadamente 20 kDa también tiene un EC50 de menos de 15 nM en el ensayo descrito en el Ejemplo 4. Una mezcla 50:50 y una 70:30 del compuesto 8(a) preparada usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa y el compuesto 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa, también tiene un EC50 de menos de 15 nM en el ensayo descrito en el Ejemplo 4. En el mismo ensayo, la insulina e insulina lispro humanas tienen un EC50 de 2.3 y 0.7 nM, respectivamente.
Los datos muestran que la posición B28 PEGilante reduce la actividad de hIR in vitro por aproximadamente 10 a 20 veces, haciendo estas especies de insulina lispro PEGilada agonistas débiles de hIR. Las especies de insulina lispro PEGilada también poseen propiedades de enlace IGFR-1 no medibles .
Ejemplo 5. Evaluación de Potencia y Perfiles de Farmacocinética in vivo de Insulina Lispro PEGilada en un Modelo de Rata de Diabetes Tipo 1 Ratas Harían Sprague-Dawley machos de diez semanas de edad (Harían, Indianápolis ) 250-280 g de peso corporal, se dosifican intravenosamente en su vena de cola con 45 mg/kg de estreptozocotina (STZ) en Ácido Cítrico 0.5M, pH 4.5, tres días antes del inicio del estudio. Al inicio del estudio, los animales se clasificaron en grupos en base al peso corporal y glucosa de sangre. Únicamente los animales con glucosa en sangre entre 400-550 mg/dl se incluyen en el estudio. En la mañana del inicio del estudio, los animales reciben una inyección subcutánea única del compuesto de prueba a una de varias dosis predeterminadas. Periódicamente, se extraen muestras de sangre por duplicado de la vena de la cola y se recolectan en tubos que contienen EDTA de disodio. Se miden los niveles de glucosa en la sangre con un glucómetro.
También, se recolecta plasma a partir del muestreo de sangre de la vena y se usa un radioinmunoensayo de insulina para rata comercialmente disponible para determinar los niveles del fármaco administrado en el plasma. Se calcula el área bajo la curva para glucosa en la sangre sobre tiempo (mg*h/dl ) para cada animal individual y se usa para una regresión logística de cuatro parámetros para determinar el ED50. En este ensayo, se prepara el compuesto 9(a) usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa, se prepara el compuesto 9(a) usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa, y se prepara el compuesto 9(b) usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa que tiene una potencia (ED50) de 241, 138 y 69 nmol/kg, respectivamente, a partir de una curva de respuesta a dosis típica. Adicionalmente, aquellos compuestos son capaces de disminuir glucosa en la sangre en ratas tratadas con STZ a un nivel que es normal en esta variedad de ratas (100 mg/dl o por debajo) por al menos 36 horas con una inyección subcutánea única de 568 nmol/kg. La insulina detemir por otra parte normaliza la glucosa por 5-6 horas en el ensayo anterior con una dosis única de 568 nmol/kg.
Además de la valoración de parámetros farmacodinámicos, se determinan los valores de parámetro de farmacocinética medios en ratas para compuestos de prueba usando la muestra de sangre duplicada. Se calculan los parámetros de farmacocinética usando métodos independientes del modelo (WinNonlin Pro) . Los valores de parámetro de farmacocinética resultantes no muestran linealidad como función de dosis. El intervalo de valores reportados corresponde a valores de parámetro de farmacocinética generados entre la dosis mayor probada (568 nmol/kg) y la dosis menor (5.6 nmol/kg).
Los resultados de farmacocinética para el compuesto 9(b) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa indica un tiempo a concentración máxima (Tmax) que varia de 6-12 horas, una proporción de separación aparente de (CL/F) que varia de 0.05-0.14 1/h/kg, un volumen aparente de distribución (V/F) que varia de 0.6-7.2 1/kg y una vida media de eliminación (ti/2) que varia de 8.5-34.5 horas.
Los resultados de farmacocinética para el compuesto 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa indica una Tmax de 12 horas, una CL/F que varia de 0.05-0.13 1/h/kg, una V/F que varia de 0.6-2.0 1/kg, y una t1/2 que varia de 8.3-11.0 horas .
Los resultados de farmacocinética para el compuesto 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa indica una Tmax que varía de 12-24 horas, una CL/F que varia de 0.06-0.2 l/h/kg, una V/F que varía de 1.0-7.5 1/kg, y una ti2 que varía de 11.1-48.5 horas.
Cuando la insulina lispro es similarmente administrada a ratas macho tratadas con STZ a 568 nmol/kg, se mide una ti2 de aproximadamente 1 hora y una CL/F de aproximadamente 1.2 l/h/kg.
Cuando la insulina detemir es similarmente administrada a ratas macho tratadas con STZ a dosis que varía de 18.9-568 nmol/kg, se observa una tl/2 que varía de 1.9-3.1 horas y una CL/F de aproximadamente 0.8-1.7 l/h/kg.
Debido a las comple idades en las farmacocinéticas, las proporciones CL aparentes entre detemir y compuestos insulina lispro ejemplarmente PEGilada son diferentes dependiendo de la dosis usada para la determinación. Sin embargo, los estudios descritos en el Ejemplo 5 indican que los compuestos de insulina lispro ejemplarmente PEGilada conjugadas a 20 o 40 kDa de PEG tienen aproximadamente una separación aparentemente menor de 5 a 30 veces que la detemir en la rata diabética inducida con STZ.
Ejemplo 6: Evaluación de Duración ín vivo de la Acción y Características de Farmacocinética de insulina lispro PEGilada en un Modelo de Rata de Diabetes Tipo 2 Se evaluó la actividad glucodinámica del compuesto 9(a) con un PEG lineal de 40 kDa en ratas macho fa/fa ZDF (n = 4 ratas/grupo) después de una inyección subcutánea única del vehículo control (PBS) o 517 nmol/lg de 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa. Se recolectan muestras seriales para caracterización tanto farmacocinética como farmacodinámica . Una administración subcutánea única de 517 nmol/kg de 9(a) preparada usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa para ratas macho fa/fa ZDF está asociada con disminución de glucosa estadísticamente significante que es sostenida por al menos siete días (en relación al placebo; p > 0.05) . El compuesto 9(a) preparado usando un mPEG-MAL lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa de exposición también es verificable durante siete días.
Ejemplo 7: Titulación del conservador Fenólico de insulina lispro PEG-B28 (92.4 )A1 (7.6¾) , insulina lispro o una mezcla (insulina lispro PEG20kDa~B28 o2. %)Al <7.6%) al 70%: insulina lispro al 30%) del mismo con fenol en la presencia de iones de cobalto Se disuelve la insulina lispro PEG20kDa_ B28 (92.4%)Al (7.6%) o insulina lispro en una solución que contiene 20 mM de KSCN y 50 mM de TRIS-CI04 a pH 8.0. La concentración objetivo de ya sea proteína es ~4 mg/ml, en base al contenido de proteína (e280 = 1.05 (mg/ml) "1cm"1) . Se disuelve cloruro de cobalto (41.9 mg) con 1 mi de agua para proporcionar una solución base con una concentración del ión de cobalto de 0.176 M. Se agrega una alícuota de solución base de cobalto (~2 µ? dependiendo de la concentración de proteína) a 0.8 mi de solución de proteína de forma que la proporción final de ión de cobalto a hexámero de insulina es igual a 4. Para valorar la hexamerización, se monitorean las distorsiones en la química de coordinación de cobalto a 574 nm como una función de concentración de conservador fenólico. Específicamente, se titula una solución de fenol concentrada (0.564 M) en 0.8 mi de solución de proteína usando alícuotas microtituladoras de forma que el volumen final en el final de la titulación no excede 0.84 mi. Se agita la solución final por un mínimo de 20 minutos después de cada alícuota de fenol y se recolecta el espectro visible de la solución de 400 nm a 800 nm. La absorbancia registrada a 574 nm se convierte a coeficiente de extinción molar dividiendo la absorbancia por la concentración molar de cobalto coordinada HisB1°, es decir, la concentración de proteína hexámérica multiplicada por dos bases en el conocimiento que las porciones HisB1° de hexámeros de insulina coordina dos iones de metal divalente. Para la preparación de formulaciones de mezclas 70/30 (mol:mol) de insulina lispro PEG2okDa-B28 (92.4%)A1 (7.6%) e insulina lispro, se agrega la proteína de la primera mezcla y después cobalto por titulación con conservador fenólico.
En insulina lispro, la secuencia natural de prolina en la posición B28 y lisina en posición B29 es reservada comparada a insulina humana tipo nativa. Esta reversión conduce a un cambio conformacional en el extremo C-terminal de la cadena B que estéricamente detienen la capacidad de los monómeros de insulina lispro para formas dimeros. De esta forma, la constante de asociación de dimero se reduce por un factor de 300 comparado con el de la insulina humana tipo nativo. Los resultados, mostrados en la Tabla I, indican que la insulina lispro PEG20kDa~B2802.4%)Al (7.6¾) puede sorprendentemente e inesperadamente asociarse como complejo hexámérico en la presencia de iones de metal divalentes y análogos conservadores fenólicos para condiciones de formulación usadas en Humalog®, debido a la presencia de seis porciones PEG de 20 kDa conjugadas cerca de la ya debilitada, insulina humana tipo nativa vis-a-vis, dominio de dimerización de insulina lispro. Sin embargo, mezclas 70/30 de insulina lispro PEG20kDa-B28 (92.4%)Al (7.6%) ß insulina lispro también demuestra la capacidad para formar complejos hexáméricos, los cuales soportan la preparación de formulaciones extemporáneas y/o premezcladas estables de una insulina basal e insulina de acción rápida.
Tabla I: 23.7 736 26.9 903 725 764 Ejemplo 8: Análisis del Estado Hexámérico de insulina lispro PEG20kDa_B28 (92.4%) /Al (7.6%) Formulada con Zn, Fenol y/o Calcio La vida de anaquel química y estabilidades en uso de insulina y algunos análogos de insulina benefician la capacidad para formar complejos hexáméricos discretos en solución. La capacidad para hexámerizar insulina o insulina lispro, en la presencia de iones de metal divalente (Zn+2 o Co+2) y conservadores fenólicos (fenol o m-cresol), disminuye la desaminación de AsnA21 y subsecuentemente minimiza la formación de partícula de peso molecular alto (HMWP) .
Para valorar la capacidad de insulina lispro PEG20kDa-LysB28 para formar hexámeros, insulina lispro PEG20kDa~B28 (92.4*) /Al (7.6%) i con una concentración de proteína de partida en base a A276nm = 8.6 mg de insulina lispro/ml o 38.2 mg de conjugado de insulina lispro PEGilada/ml, a pH 6.7 es dializada en agua durante la noche a 4.6 mg/ml o 20.6 mg de conjugado de proteína PEGilada/ml. Se prepara una solución base amortiguada 4x a pH 7.0, con las concentraciones finales del amortiguador de fosfato a 40 mM y m-cresol a 12.8 mg/ml. Se prepara la solución base de óxido de zinc disolviendo óxido de zinc en 0.5 mi de HC1 1N, después diluyendo con agua a una concentración de zinc final de 0.097 M. Se preparan muestras de solución para análisis de dicroismo circular (CD) próximo a UV variando concentraciones de zinc (0 hasta 400 µ?) mezclando 450 µ? de insulina PEG20kDa-B28 (92.4%) /Al (7.6%) a una concentración de proteina de 4.6 mg/ml con alícuotas de solución base de zinc (el volumen máximo total de solución base de zinc agregada = 2.5 µ? o equivalente a 4 iones de zinc por hexámero de insulina PEG2okDa_B2802.4%) /Al ( .6%) ) , y 150 µ? de la solución base amortiguada de fosfato 4x. El pH final se ajusta, si es necesario a pH ~7.0. La asociación hexámérica de la insulina lispro PEG20kDa~B2802.4%)Al (7.6%) o insulina lispro se monitorea en el dicroismo circular próximo a UV a 20 nm, una región sensible a cambios de disulfuro, usando una celda de 0.2 cm. El residuo medio elípticamente se traza contra una proporción de moles de zinc por moles de hexámero.
Los resultados, mostrados en la Tabla II, además indican que la insulina PEG20kDa~B2802.4%) /Al (7.6%) puede sorprendentemente e inesperadamente asociarse como complejo hexámérico en la presencia de iones de metal divalente y conservador fenólico en condiciones de formulación análogas a aquellas de Humalog ®, debido a la presencia de seis porciones PEG de 20 kDa conjugadas cerca de la ya debilitada, en relación a insulina humana tipo nativa, dominio de insulina lispro.
También se investigan el impacto de hexamerización y enlace de ligando en estabilidad térmica de insulina PEG20kDa_B28 (92.4%) /Al (7.6%) en hexámero que promueve las formulaciones de prueba con experimentos de desnaturalización térmica CD. La longitud de onda usada para los estudios de desnaturalización térmica es 240 nm, debido a que se encuentra que el cambio de señal total es mayor a 240 nm que la 250 nm usada en los estudios de enlace Zn2+, aún la absorbancia de solución total seria lo suficientemente baja para los datos CD de alta calidad a ser obtenidos. Se recolectan los datos de exploración térmica a 240 nm en un tubo de 1 mm de 5°C hasta aproximadamente 95°C (temperatura final variada ligeramente para cada muestra) , con una proporción de exploración y datos montados de l°C/minuto, ancho de banda de 1.5 nm y tiempo de respuesta de 8 segundos. Los datos de desnaturalización térmica se trazan tanto como señal en bruto (mdeg a 240 nm) asi como la fracción desdoblada aparente (Funf), la cual se da por: FdeSd(T) = [ Y0bs(T) - Ynat(T) ] / [ Ydesd(T) -Ynat(T) ] en donde Y0bs ( T ) es la señal observada como una función de temperatura, y Ynat ( T ) y Ydesd ( T ) son extrapolaciones lineales de las lineas bases nativa y desdoblada, respectivamente. La temperatura del principio del desdoblamiento se define como la temperatura a la cual Fdesd empieza a incrementar a partir de la linea base nativa (Fdesd = 0), y la temperatura del punto medio es la temperatura a la cual Fdesd = 0.5.
Los experimentos de desnaturalización térmica CD se realizan esencialmente como se describe anteriormente, indicando que la estabilidad térmica de hexámeros de insulina PEG20kDa_B28 (92.4%) /Al (7.6%) es sustancialmente reducida comparada a los hexámeros de insulina lispro cuando ambas son similarmente formuladas en 16 mM de TRIS, pH 7.2, 3.1 mg/ml de m-cresol y zinc. Además, los estudios de desnaturalización térmica CD detectan una concentración de ión de calcio y cloruro significante dependiente del incremento en temperatura de fusión para insulina lispro PEG2okDa~ B28 (92.4 ) /Al (7.6%) (datos no mostrados) . Más específicamente, la temperatura de inicio del desdoblamiento se observa ser ~30°C en 16 mM de TRIS, pH 7.2, 3.1 mg/ml de m-cresol y zinc, pero incrementa dramáticamente a ~50°C en la misma formación que tiene 75 mM de cloruro de calcio. Se observa un efecto similar como la r en la adición de NaCl (25 nM a 150 nM de NaCl) en lugar de cloruro de calcio a la formulación. Por lo tanto, el calcio y/o cloruro pueden ser excipientes que promueven hexámero muy útiles en composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de insulina lispro PEG20kDa~ B28 (92. %) /Al (7.6%) para incrementar la estabilidad química y/o física de la composición farmacéutica en almacenaje.
Tabla II: Cambios de Elipticidad en Residuo Medio (MRE) como una función de proporción Zn/hexámero Ejemplo 9: Generación de insulina lispro PEG2oicDa~B28(_95%)/Al(-5%) Se mezcla una solución amortiguadora que contiene 150 mM de fosfato de sodio dibásico y 50 mM de EDTA con 150 mM de fosfato de sodio tribásico para proporcionar una solución amortiguadora con un pH entre 10.85 y 11.10 a una temperatura entre aproximadamente 4 y 6°C. A una temperatura entre aproximadamente 4 y 6°C, los cristales de insulina lispro (30-60 mg/ml) lentamente se agregan al amortiguador con agitación suave para evitar la formación de aglomerados durante la disolución del cristal.
Se disuelve monometoxipoli ( etilen glicol) p-nitrofenil carbonato (mPEG-NPC) que tiene PEG de un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa ± aproximadamente 2 kDa a una concentración de 60-120 mg/ml en agua enfriada (4-6°C) colocando la cantidad requerida de agua enfriada en un recipiente, agitándola para crear un vórtice, y lentamente verter el polvo de mPEG-NPC en el ojo del vórtice para asegurar la adecuada y rápida dispersión. El polvo de mPEG-NPC es un polvo fino y en dispersión se liberan considerables burbujas de aire en el recipiente. La solución mPEG-NPC en el recipiente se deja des-airear entre 30 a 60 minutos, dependiendo del volumen.
La solución de insulina lispro preparada anteriormente se transfiere a un recipiente enchaquetado mecánicamente agitado. El recipiente es instrumentado para medición de temperatura y pH. Se proporciona agitación por un impulsor estándar que opera a un número Reynolds en el régimen turbulento. La solución mPEG-NPC (PEG) se mide en el recipiente a proporción para dar un tiempo de adición PEG total de entre 3 a 5 horas. La temperatura de la chaqueta se mantiene entre 4°C y 6°C, y el mezclado se continúa. El pH de la reacción se mantiene entre 10.85 a 11.10 por la adición de la cantidad requerida de los 150 mM de amortiguador tribásico de fosfato de sodio. Se agrega el PEG hasta que la proporción molar PEG: insulina lispro final está en el intervalo de entre 2.5 a 4.5.
Al final de la adición de PEG, la temperatura de la chaqueta se eleva dentro de los 60 minutos a entre 25°C y 30°C, y la mezcla de reacción se incuba a esta temperatura por aproximadamente 3 a aproximadamente 6 horas, mientras se mantiene el pH a entre aproximadamente 10.7 hasta aproximadamente 11.0. Al final del periodo de incubación, la mezcla de reacción se apaga por la adición de amortiguador 2x (100 mM de ácido acidico/acetato de sodio, pH 4.0) y se diluye con el mismo amortiguador 2x para ajustar su conductividad (2.5 mS/cm) y concentración (3-5 mg/ml) .
La mezcla de reacción se purifica usando una columna empacada de cromatografía de intercambio catiónico (CEX) con una resina apropiada (por ejemplo, resina de Sefarosa SP de Flujo Rápido) . La columna se empaca con resina para una altura de lecho entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 cm, equilibrada con 100 mM de Acetato de Na (amortiguador A) y cargada con la mezcla de reacción diluida (5-8 gm producto/1 de resina) a pH inferior (2.5-3.5) a una velocidad de flujo apropiada de entre aproximadamente 50 a aproximadamente 90 cm/h. El producto mono-PEGilado y la proteína sin reaccionar preferentemente enlazada en la resina, mientras los derivados multi-PEGilados y exceso de reactivos en su mayor parte pasan a través de la columna. Se usa el amortiguador A, con concentración de sal diluida (20-30 mM) para lavar afuera cualquier derivado multi-PEGilado débilmente absorbido, seguido por gradiente de elución usando un amortiguador (8-12 CV) con concentración de sal incrementada (50-70 mM) para preferencialmente remover el producto PEGilado lejos de la resina, mientras se mantiene la proteina sin reaccionar en la columna. El producto se recolecta (3-5 CV) y la columna se lava con amortiguador A con alta concentración de sal (100 mM) para remover la proteina sin reaccionar.
El flujo principal de la columna CEX (3-5 CV) a 3-5 mg/ml se somete a una filtración de flujo tangencial para incrementar su concentración a 40-80 mg/ml usando una membrana de lámina plana estándar (valor limite de peso molecular 3-5 kDa) . El proceso se lleva a cabo vía una concentración inicial, seguido por intercambios de amortiguador y concentración final a la concentración requerida. El flujo que opera a lo largo del proceso se mantiene entre 10-20 litros por metro cuadrado del área de filtro por hora (LMH) y presión de transmembrana (TMP) entre aproximadamente 15 a aproximadamente 35 psi.
La solución de ingrediente farmacéutico activo de volumen concentrado final se congela a una temperatura apropiada (-20°C hasta -70°C) y se almacena a una temperatura apropiada (-20°C hasta -70°C) .
Ejemplo 10: Perfiles de Farmacocinética de Insulina Lispro PEGilada en Perros.
Se dosifican subcutáneamente perros Beagle hembras de dos a cuatro años de edad, 7-10 kg de peso corporal, con 18.9 nmol/kg de compuestos de prueba ejemplares. Periódicamente, muestras de sangre se extraen de la vena cefálica o safena y se recolectan en tubos que contienen EDTA de disodio. Se recolecta el plasma del muestreo de la sangre de la vena y se usa un radioinmunoensayo de insulina comercialmente disponible para determinar los niveles del fármaco administrado en el plasma. Se determinan los perfiles y parámetros de farmacocinética para cada uno de los siguientes compuestos ejemplares, preparados esencialmente como se describe en el Ejemplo 2: el compuesto 11 preparado usando un mPEG-NPC lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa, aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 20 kDa.
Se calculan los parámetros de farmacocinética usando métodos de modelo independiente (WinNonlin Pro.). El compuesto 11 se prepara usando un mPEG-NPC lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa que exhibe un tiempo de concentración máximo (Tmax) de aproximadamente 12 horas, una velocidad de separación aparente (CL/F) de aproximadamente 0.046 1/h/kg, una concentración máxima (Cmax) de aproximadamente 14 nM, y una vida media de eliminación (ti2) de aproximadamente 14 horas .
El compuesto 11 preparado usando un mPEG-NPC lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa exhibe una Tmax de aproximadamente 24 horas, una CL/F de aproximadamente 0.027 1/h/kg, una Cmax de aproximadamente 18 nM, y una ti/2 de aproximadamente 23 horas.
El compuesto 11 preparado usando un mPEG-NPC lineal que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kDa exhibe una Tmax de aproximadamente 24 horas, una CL/F de aproximadamente 0.026 1/h/kg, una Cmax de aproximadamente 15 nM, y una ti2 de aproximadamente 20 horas.
La insulina detemir es similarmente administrada a perros beagle hembras a una dosis de 18.9 nmol/kg, y exhibe una Tmax de aproximadamente 1.3 horas, una CL/F de aproximadamente 0.12 1/h/kg, una Cmax de aproximadamente 23 nM, y una ti2 de aproximadamente 3.5 horas.
La Tabla III lista los parámetros comparables en el perro. La RIA especifico a insulina utilizada para estos estudios detecta tanto insulina lispro PEGilada como insulina endógena .
Tabla III. Parámetros PK para insulina lispro PEGilada en perros Dosis subcutánea 18.9 nmol/kg; n = 3/grup Ejemplo 11: Proyección de "aplanado" medio y dosis en humanos Un criterio clave para terapia de insulina basal intensificada es la capacidad para lograr un perfil verdaderamente plano, sensible a una dosificación diaria en pacientes. El aplanado suficiente se define como una proporción de caída del pico (PT) de < 2. Para propósitos de comparación, las proporciones PT se calculan a partir del intervalo de perfiles PK publicados a partir de -4-9 para detemir y ~1.2-2.6 para glargina. Los datos de PK de rata y perro (véase, Ejemplos 5 y 10, respectivamente) para la dosis 18.9 nmol/kg de compuestos ejemplares e insulina detemir se fija a modelos PK de 1-CMT, formado en parametrizado en términos de ka, CL/F y V/F. Cada parámetro PK (P) después se fija a una ecuación alométrica de la forma P = oBWfe, en donde b se fija a -0.25, 0.75 y 1 para ka, CL/F y V/F, respectivamente, y a es un parámetro fijado. Se obtienen estimados humanos medios para cada parámetro PK, y simulaciones generan perfiles medios después de la dosificación diaria en humanos. Debido a las similitudes entre los conjugados de insulina lispro PEGilada de 30 kDa y 40 kDa, las simulaciones se muestran únicamente para insulina lispro PEGilada de 20 kDa, insulina lispro PEGilada de 40kDa e insulina detemir. Las simulaciones generadas indican que las proporciones de caída del pico (PT) para compuestos de insulina lispro PEGilada de 20 kDa y 40 kDa son dramáticamente más plana que para insulina detemir. Los resultados de estimulaciones se muestran en la Figura 1.
Una estrategia para estimación de la dosis humana de una insulina lispro PEGilada requerida para eficacia es usar un comparado clínico conocido (insulina detemir) como un control interno en el modelo de eficacia de la rata, con la suposición que la potencia relativa entre la insulina lispro PEGilada e insulina detemir en el modelo de rata es similar a la potencia relativa en la clínica. La dosis diaria requerida de insulina lispro PEGilada en la clínica se puede obtener usando la siguiente ecuación: Dosisja _ SC8M ^ CLÍ Dosis PSG ^5<¡.PEG CLIFÍSG La proporción de potencia relativa para cada uno de los conjugados de insulina lispro PEGilada se puede obtener en la Tabla IV. Las proporciones de separación aparente relativa para insulina lispro/detemir PEGilada en la rata, perro y humano (proyectada) se recopilan en la Tabla v.
Tabla IV. Potencia en base a la concentración relativa de conjugados insulina lispro PEGilada e insulina detemir en la rata Tabla V. Proporciones CL/F relativas para compuestos insulina determir/insulina lispro PEGilada Usando los estimados de potencia relativa de la Tabla IV y los estimados CL/F relativos de la Tabla V, las proyecciones de dosis media para conjugados de insulina lispro PEGilada en humanos es 4.2 y 6.9 nmol/kg para los compuestos de insulina lispro PEGilada de 20 kDa y 40 kDa, respectivamente. Estas proyecciones se basan en una dosis clínica diaria media de 18.5 nmol/kg de insulina detemir como se reporta para pacientes diabéticos de Tipo 2 en la etiqueta detemir. Cuando se consideran tanto acción como potencia de acción, la predicción de dosis clínica media máxima es ~3 veces menos que la insulina detemir. En el mejor caso, el estimado de dosis clínica media para el conjugado de insulina lispro PEGilada de 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa es aproximadamente 20 y aproximadamente 45 veces menos que la insulina detemir.
Ejemplo 12: Proporciones de Infusión de Glucosa después de la Administración Única en Voluntarios Saludables: Insulina lispro PEG2okDa-B28 (=~95%) /Al (=~5%) y Administración de Glargina Se conduce un estudio de primera dosis humana de tres partes usando una dosis única de insulina lispro PEG2okDa-B28 <=~95%) /Al (=~5%) (LY) preparada esencialmente como se describe en el Ejemplo 9. La parte A incluye tres periodos de estudio, en la cual el sujeto recibe una inyección subcutánea (SC) de la dosis LY en el primer periodo, seguido por una inyección de dosis de insulina glargina (0.5 U/kg) en el segundo periodo, y después seguido por una inyección de otra dosis LY en el tercer periodo. La parte B es una etiqueta abierta, dosis única, dos periodos de estudio por duplicado en los cuales los sujetos reciben una dosis única de LY en ambos periodos, utilizando agarres de glucosa de 24 y 36 horas. La parte C es una etiqueta abierta, dos periodos, dosis única, secuencia fija, estudio de comparador controlado en el cual los sujetos reciben una dosis SC de 0.5 mg/kg única de LY en un periodo y una dosis SC de 0.8 U/kg única de insulina glargina en el otro periodo. Los sujetos experimentan un procedimiento de agarre de glucosa por 24 horas en cada periodo en las Partes A y C y una duración más larga (hasta 36 horas) de procedimiento de agarre de glucosa en cada periodo en la Parte B. Se administra LY subcutáneamente como una dosis única en las Partes A, B y C como sigue: Dosis parte A: 0.0025, 0.0125, 0.075, 0.325 mg/kg de peso corporal Dosis parte B: 0.15, 0.225 mg/kg Dosis parte C: 0.5 mg/kg Se administra a los sujetos una dosis única del compuesto de insulina lispro PEGilada o una dosis única de insulina glargina (0.5 U/kg) como un comparador y otra dosis única de LY en el 3er periodo. En todos los periodos de tratamiento, los sujetos sufren un procedimiento de agarre euglicémico por hasta 24/36 horas después de cada inyección del compuesto de insulina. Se ajustan las proporciones de infusión de glucosa (GIR) para mantener la euglicémica, con e GIR documentado durante un tiempo, proporcionando la medición GD de acción de insulina. La meta del agarre de glucosa euglicémica es para mantener la euglicémica a través de la infusión de glucosa después de la administración de una dosis de un compuesto de insulina. Se asume que la secreción de insulina endógena y glucosa hepática resulta ser mínima y que cualquier glucosa que es translocada fuera del espacio de glucosa (es decir, glucosa metabolizada ) es la secuencia directa de la insulina exógena administrada. La GIR en este caso puede ser la medición glucodinámica (GD) de la acción de insulina durante un tiempo. Se realizan todos los estudios de agarre de glucosa después de un ayuno durante la noche de aproximadamente 8 horas. En la mañana del estudio, se coloca un pequeño catéter en una vena de un brazo, idealmente en la fosa ante-cubital, para administración de solución de dextrosa al 20% (amortiguada a casi pH neutral) bajo el control de una bomba volumétrica. Se coloca otro catéter, idealmente en la muñeca o mano para muestreo de glucosa venosa. Esta área se calienta con un dispositivo de calentamiento a aproximadamente 55-60°C para muestreo de sangre venosa arterializada . Se obtienen muestras de sangre en el lado del lecho para determinación inmediata de concentraciones de glucosa en sangre completa usando una técnica de oxidasa de glucosa automatizada. Después del muestreo de sangre basal y un periodo de estabilización de aproximadamente 30 minutos, cada sujeto recibe una dosis del compuesto de insulina administrado subcutáneamente. El inicio de la inyección subcutánea de un compuesto de insulina se define como tiempo cero. Después de la terminación de la dosificación, en conjunto con el muestreo de sangre frecuente para medición de glucosa en sangre, la glucosa se infunde intravenosamente a una velocidad variable para mantener la euglicémia por hasta 24 o 36 horas después de la administración de insulina.
El muestreo de sangre ocurre aproximadamente cada 10 minutos por aproximadamente 30 minutos antes de la dosificación y continúa cada 5-10 minutos por las primeras 2 horas después de la dosificación (con la opción para muestrear más frecuentemente como cada 2.5 minutos), y después se reduce a intervalos de 10-30 minutos hasta el final de agarre.
La duración del agarre de glucosa, la velocidad de infusión de glucosa se ajusta para mantener una concentración de glucosa en la sangre objetivo pre-determinada para el sujeto individual. Preferiblemente, la concentración objetivo se cierra para la glucosa de sangre en ayuno. La meta del procedimiento de agarre de glucosa es para mantener las concentraciones de glucosa en sangre dentro de +5% del valor objetivo de pre-dosis, el cual se define como 5 mg/dl debajo de la glucosa en sangre en ayuno media. De esta forma, las concentraciones de glucosa en sangre se mantienen constantes mientras el GIR es variado. Por lo tanto, la velocidad de infusión de glucosa variante refleja la actividad del compuesto de prueba de insulina. Se documentan los niveles de glucosa en sangre del muestreo y cambios de velocidad de infusión en todo el agarre.
Se conduce un estudio esencialmente como se describe en el Ejemplo 12 demostrando, en humanos que LY tiene características de una insulina "basal" ideal: una duración prolongada de acción, una vida media aparente que varía de 24-44 horas y características básales, es decir, una proporción de caída del pico de menos de 2 (Figura 2). Adicionalmente, la duración de acción para LY es mayor que el de insulina glargina (Figura 2). La variabilidad dentro del sujeto en los glucodinámicos s menos del 30% (datos no mostrados) lo cual es similar a, o mejor que la glargina. Finalmente, los datos glucodinámicos de la Parte C del estudio (0.5 mg/kg) resulta en un perfil GIR para LY que es "el punto más importante", GD mantenido por más de 36 horas, y excede la respuesta GIR del pico para glargina (0.5 U/kg; datos no mostrados).
Ejemplo 13: Estabilidad Química y Física de Composiciones Farmacéuticas de insulina lispro PEG20kDa~B28 (=~95%) /Al <=-5%) Como se describe en los Ejemplos 7 y 8 anteriores, la insulina lispro PEG20kDa-B28 (=~95 ) /Al (=.5%) se puede asociar como un complejo hexámérico en la presencia de iones de metal divalente y conservador fenólico en condiciones de formulación análogas a aquellas de Humalog®. Por lo tanto, se conducen estudios de estabilidad química y física en formulaciones de insulina lispro PEG20kDa-B28 similar a las formulaciones de solución comercial de insulina lispro (es decir, formulaciones de solución Humalog®) . La estabilidad química de una formulación farmacéutica de prueba se considera aceptable si no se detectan cambios significantes en varias propiedades analíticas a partir del punto de tiempo inicial para el periodo de almacenaje indicado a diferentes temperaturas. La estabilidad física de una formulación farmacéutica de prueba se considera aceptable si en la valoración visual no se observan partículas y en mediciones por microscopía fluorescente de Tioflavina T no se observa formación de gel o fibrilla.
Se preparan formaciones de insulina lispro PE G20kDa_ B28 que contiene 0.5 mol de zinc por mol de insulina lispro PEG20kDa~B28, 16 mg/ml de glicerina, 3.15 mg/ml de m-cresol, amortiguado con ya sea citrato o fosfato a pH 7.0 a pH 6.5, respectivamente, y se prueba para estabilidad tanto química como física. Se prueban formulaciones similares sin zinc para evaluar el impacto de zinc en estabilidad. Las muestras a 35 °C forman partículas de gel después de aproximadamente 1 mes de almacenaje y las muestras a 25°C muestran número significante de formación de partículas/burbujas después de aproximadamente dos meses de almacenaje. Tanto citrato como fosfato amortiguado, así como formulaciones con zinc/sin zinc muestran estabilidad química/física similar en las condiciones aceleradas a 35°C aunque las muestras amortiguadas de citrato parecen ser las peores que las muestras amortiguadas de fosfato cuando se valoran visualmente. La formulación de control de insulina lispro permanece clara. Las formulaciones amortiguadas tanto de citrato como de fosfato demuestran una estabilidad química aceptable a 5°C por al menos 13 meses.
Investigaciones subsecuentes indican que el conservador fenólico, m-cresol, promueven la gelificación cuando se combinan con insulina lispro PEG20kDa~B28 compuesta y expuesta a temperatura elevadas (>25°C). Interesantemente, cuando se agrega m-cresol a mPEG solo (activado o no activado) , las partículas de gel no resulta en la exposición a alta temperatura.
Cuando las formulaciones prototípicas de insulina lispro no confiere estabilidad aceptable a compuestos de insulina lispro PEG20kDa~B28 a temperaturas elevadas, se desarrollan las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de insulina lispro PEG20 koa-B28 ¡=~95% ) /Al (=~5% ) que demuestra estabilidad química y física intensificada y adecuadas para comercialización como una formulación farmacéutica parenteralmente administrada.
Las siguientes formulaciones de insulina lispro PEG20kDa~B28 (=~95%) /Al (=~5%) (15 mg/ml) demuestran estabilidad química y física aceptable por una semana a 40°C, por un mes a 30°C, por tres meses a 25°C y durante ocho meses a 5°C: 1) 16 mM de amortiguador TRIS, pH 7.0-8.0, 10 mM de cloruro de calcio, 20 mg/ml de azúcar (sacarosa o trehalosa), 3 mg/ml (28 mM) de m-cresol y 0.5 mol de zinc por 1.0 mol de insulina lispro PEG20kDa-B28 (=~95 ) /Al(=-5%) 2) 16 mM de amortiguador TRIS, pH 7.0-8.0, 10 mM de cloruro de calcio, 3 mg/ml de poloxámero, 3 mg/ml (28 mM) de m-cresol y 0.5 moles de zinc por 1.0 moles de insulina lispro PEG20kDa~B28 (=~95%) /Al (=~5%) 3) 5 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.0, 13 mM de glicerina, 3 mg/ml (28 mM) de m-cresol, 3 mg/ml de poloxámero, 0.3 moles de zinc por 1.0 moles de insulina lisp o PEG20kDa~B28 (=~95%) /Al Las formulaciones de insulina lispro EG20kDa~ B28 (_:~95%) /Al (=~5%) que contienen excipientes que promueven hexámero, por ejemplo, zinc, m-cresol y calcio, generalmente exhiben mayor estabilidad química y física, especialmente a temperaturas elevadas. Además al cloruro de calcio y/o NaCl para formulaciones de insulina lispro PEG2okDa_B28 <=~95%) /Al <=~5%) que contienen zinc y m-cresol además intensifican la estabilidad física de las formulaciones expuestas a temperaturas de 40°C o mayor. Además, las formulaciones amortiguadas de fosfato y citrato generalmente exhiben menos estabilidad física que las formulaciones amortiguadas con TRIS.

Claims (36)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de insulina lispro PEGilada de la fórmula: P- [(A) -(B)], o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque: A es la cadena A de insulina lispro (SEC ID NO: 1); B es la cadena B de insulina lispro (SEC ID NO: 3); y P es un PEG que tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, y en donde A y B son apropiadamente reticulados y P está unido vía un enlace covalente de uretano o tioéter al grupo alfa-amino de la glicina en la posición 1 de A, el grupo alfa-amino de la fenilalanina en la posición 1 de B, o el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B.
2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PEG se une vía un enlace covalente de uretano o tioéter al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B.
3. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, adicionalmente caracterizado porque tiene una Ki para el receptor de insulina humana de aproximadamente 30 nM o menos.
4. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, adicionalmente caracterizado porque tiene una Ki para el receptor de insulina humana de aproximadamente 20 nM o menos.
5. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, adicionalmente caracterizado porque tiene una Ki para el receptor de insulina humana de aproximadamente 10 nM o menos.
6. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, adicionalmente caracterizado porque tiene una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 6 horas en ratas tratadas con STZ dosificadas a aproximadamente 568 nmol/kg.
7. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es suficiente para reducir la glucosa en la sangre a por debajo de 100 mg/dL en una rata tratada con STZ por un periodo que varia desde aproximadamente 4 horas hasta al menos aproximadamente 36 horas después de una inyección subcutánea única del compuesto a una dosis de aproximadamente 568 nmol/kg.
8. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque es suficiente para reducir la glucosa en la sangre a por debajo de 100 mg/dL en una rata tratada con STZ por un periodo que varia desde aproximadamente 4 horas hasta al menos aproximadamente 48 horas después de una inyección subcutánea única del compuesto a una dosis de aproximadamente 568 nmol/kg.
9. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, adicionalmente caracterizado porque tiene una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 30 horas en un humano en una dosis subcutánea única a aproximadamente 0.225 mg/kg.
10. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, adicionalmente caracterizado porque tiene una vida media de eliminación mayor de aproximadamente 36 horas en humanos en una dosis subcutánea única a aproximadamente 0.225 mg/kg.
11. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 17.5 kDa a aproximadamente 25 kDa.
12. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 25 kDa.
13. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el enlace covalente es un enlace de uretano.
14. El compuesto de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, adicionalmente caracterizado porque tiene un pico de farmocinética, farmacodinámica, o actividad a través de la relación de menos de 2 en la administración parenteral a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto.
15. El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para uso en terapia.
16. El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de hipoglicemia o diabetes.
17. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque más de aproximadamente 95% de los compuestos de insulina lispro PEGilada son mono-PEGilados .
19. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, caracterizada porque más de aproximadamente 90% de los compuestos de insulina lispro PEGilada tienen un PEG covalentemente unido al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B.
20. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque adicionalmente comprende un amortiguador TRIS a una concentración en el intervalo desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 25 mM de TRIS, en donde el pH de la composición farmacéutica es desde aproximadamente pH 7.0 hasta aproximadamente pH 8.0 y al menos un agente de isotonicidad que -produce una solución con una isotonicidad de entre aproximadamente 270 mOsm y aproximadamente 330 mOsm.
21. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizada porque adicionalmente comprende un amortiguador de fosfato a una concentración en el intervalo desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 10 mM y en donde el pH de la composición farmacéutica es desde aproximadamente pH 7.0 hasta aproximadamente pH 7.5 y al menos un agente de isotonicidad que produce una solución con una isotonicidad de entre aproximadamente 270 mOsm y aproximadamente 330 mOsm.
22. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizada porque la concentración total de compuestos de insulina lispro PEGilada es desde aproximadamente 15 mg/mL hasta aproximadamente 40 mg/mL.
23. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, caracterizada porque adicionalmente comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de insulina lispro.
24. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, caracterizada porque adicionalmente comprende aproximadamente 130 mM de m- cresol, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4 moles de zinc por mol de hexámeros totales de insulina, análogo de insulina, e insulina lispro PEGilada, entre aproximadamente 2.5 mM y aproximadamente 25 mM de calcio, y un tensioactivo.
25. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizada porque adicionalmente comprende un conservador fenólico farmacéuticamente aceptable y una cantidad de zinc suficiente para causar que los compuestos de insulina lispro PEGilada sean hexámerizados .
26. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizada porque adicionalmente comprende entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 150 nM de NaCl, entre aproximadamente 2.5 nM y aproximadamente 25 nM de calcio, y entre aproximadamente .5 mg/ml y aproximadamente 5 mg/ml de poloxámero 188.
27. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, caracterizada porque comprende entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 5 mg/ml de poloxámero 188.
28. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, caracterizada porque comprende entre aproximadamente 0.3 y 5 moles de zinc por mol de insulina lispro PEGilada.
29. Un método para tratar hiperglicemia o diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque el método comprende administrar a un paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 28.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el paciente es tratado para diabetes mellitus .
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el paciente es tratado para diabetes gestacional .
32. Un proceso para hacer un compuesto de insulina lispro PEGilada de la fórmula: P- [(A) -(B)], o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque: A es la cadena A de insulina lispro (SEC ID NO: 1); B es la cadena B de insulina lispro (SEC ID NO: 3) ; y P es un PEG que tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, y en donde A y B son apropiadamente reticulados y P se une vía un enlace covalente de uretano al grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B, el cual comprende hacer reaccionar el grupo épsilon-amino de la lisina en la posición 28 de B con monometoxipoli (etilen glicol) p- nitrofenil carbonato (mPEG-NPC) que tiene un peso molecular promedio ponderado de entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 40 kDa en un solvente acuoso a un pH de entre aproximadamente 8.5 y aproximadamente 11.5 y entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30° por un período de tiempo entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6 horas.
33. El proceso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la relación molar de PEG: insulina lispro está en el intervalo entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 5.0.
34. El proceso de conformidad con la reivindicación 32 o 33, caracterizado porque el peso molecular promedio ponderado del mPEG-NPC es aproximadamente 20 kDa.
35. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizado porque el pH de la reacción se mantiene entre aproximadamente 10.5 y aproximadamente 11.5.
36. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, caracterizado porque la reacción se conduce entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C por aproximadamente 3 horas.
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