BR112020026777A2 - Proteínas de fusão, composição farmacêutica, método para reduzir o nível de glicose, célula e cdna - Google Patents

Proteínas de fusão, composição farmacêutica, método para reduzir o nível de glicose, célula e cdna Download PDF

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Abstract

a presente divulgação fornece proteínas de fusão de insulina de ação ultralonga ? fc fabricadas de forma recombinante para uso no tratamento da diabetes canina e felina. as proteínas de fusão ?insulina?fc? compreendem um polipeptídeo de insulina ligado por um ligante peptídico a um fragmento fc de origem canina ou felina. com base nos resultados obtidos, a criação de um tratamento que é passível de fabricação de baixo custo, que exibe bioatividade in vivo suficiente, que exibe longa duração da bioatividade, que não induz anticorpos antifármaco e que retém substancialmente sua potência ao longo de múltiplas administrações, requer uma combinação não óbvia de polipeptídeo insulina, ligantes peptídicos e fragmento fc espécie-específico, além de mutações seletivas em um ou mais desses componentes. são fornecidas proteínas de fusão insulina de ação ultralonga?fc exemplares, polinucleotídeos que codificam essas proteínas de fusão insulina?fc e formulações farmacêuticas das proteínas de fusão insulina?fc exemplares, além de métodos de uso e de preparação das mesmas.

Description

1 / 175 “PROTEÍNAS DE FUSÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA REDUZIR O NÍVEL DE GLICOSE SANGUÍNEA, CÉLULA E cDNA”
PRIORIDADE DE PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade e está relacionado ao Pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/837.188, depositado em 22 de abril de 2019, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/827.809, depositado em 1 de abril de 2019, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/824.176, depositado em 26 de março de 2019, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/781.378, depositado em 18 de dezembro de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/781.368, depositado em 18 de dezembro de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/774.682, depositado em 3 de dezembro de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/743.358, depositado em 9 de outubro de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/740.735, depositado em 3 de outubro de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/719.347, depositado em 17 de agosto de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/702.167, depositado em 23 de julho de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/698.648, depositado em 16 de julho de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/696.645, depositado em 11 de julho de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/693.814, depositado em 3 de julho de 2018, ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/692.507, depositado em 29 de junho de 2018, e ao pedido Provisório de Patente dos EUA nº US 62/692.498, depositado em 29 de junho de 2018. O teor de cada um dos pedidos de patente mencionados acima está integralmente incorporado ao presente pedido por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente tecnologia está relacionada a composições de
2 / 175 proteínas de fusão insulina-Fc e ao uso das mesmas para tratar o diabetes em animais de companhia, por exemplo, cães ou gatos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A descrição a seguir dos antecedentes da presente tecnologia é fornecida meramente para auxiliar na compreensão da presente tecnologia e não é admitida para descrever ou estabelecer a arte anterior da presente tecnologia.
[004] O diabetes é uma condição crônica, caracterizada por uma deficiência de insulina e/ou utilização ineficaz da insulina. Os diabéticos com deficiência absoluta de insulina são classificados como portadores de diabetes mellitus tipo 1 ou insulino-dependente (IDDM). Acredita-se que os diabéticos tipo 1 tenham uma predisposição genética combinada com a destruição imunológica das células β do pâncreas produtoras de insulina. Em comparação, os diabéticos que ainda podem produzir alguma insulina, mas têm uma deficiência relativa devido à resistência à insulina ou outra disfunção, são classificados como indivíduos possuindo diabetes mellitus tipo 2 ou não insulino-dependentes (NIDDM). O diabetes tipo 2 está relacionado à predisposição genética, obesidade e certos medicamentos.
[005] Quando um cão ou gato não produz insulina ou não pode usá-la normalmente, os níveis de açúcar no sangue se elevam, resultando em hiperglicemia. Os cães geralmente exibem um fenótipo de glicemia atípica com fortes semelhanças com o diabetes tipo 1 humano. Os cães também exibem ocasionalmente glicemia atípica com fortes semelhanças com o diabetes tipo 2 em humanos. As cadelas também podem desenvolver resistência temporária à insulina durante o cio ou gravidez. Em todos os casos, os cães são tratados com terapia de injeção de insulina crônica. Os gatos geralmente exibem um fenótipo de glicemia atípica com fortes semelhanças com o diabetes tipo 2 humano (ou seja, resistência à insulina), mas no momento em que a doença é
3 / 175 diagnosticada por um veterinário, ela progride para se assemelhar a uma condição de diabetes tipo 1 (doença inflamatória no pâncreas com significativa perda de massa de células beta), e o gato se torna dependente de insulina exógena. Alguns gatos diabéticos podem ser tratados com mudanças na dieta e medicação oral, mas a maioria dos gatos diabéticos recebe terapia de injeção de insulina crônica para manter a regulação adequada. Se não for tratada, a diabetes em cães e gatos pode levar à perda de peso, perda de apetite, vômitos, desidratação, problemas com a função motora, coma e até a morte.
[006] Aproximadamente 0,24% dos cães e cerca de 0,68% dos gatos nos Estados Unidos são afetados pelo diabetes. Terapias atuais em cães e gatos para o diabetes incluem o uso de insulina, tais como Vetsulin ® para cães (Intervet Inc., d.b.a. MERCK Animal Health, Summit, NJ) e ProZinc ® para gatos (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Duluth, Georgia) que são administradas uma ou duas vezes ao dia. O fardo das injeções frequentes sobre os proprietários frequentemente resulta em uma falta de cumprimento do regime de tratamento e subdosagem, levando a maus resultados de saúde a longo prazo. Na verdade, o custo da terapia com insulina e a praticidade de administrar doses em seus animais de estimação por até 14 vezes por semana levam uma porcentagem significativa de proprietários a escolher a eutanásia para seus animais de estimação como alternativa ao tratamento intensivo do diabetes. Portanto, há uma necessidade de opções de tratamento econômicas e menos onerosas para esta doença.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA PRESENTE TECNOLOGIA
[007] Em um aspecto, a presente divulgação provê uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, em que o polipeptídeo insulina e fragmento Fc estão ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, e em que o fragmento Fc é de origem animal não humano e compreende a seguinte sequência:
4 / 175
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF VDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALP SPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQS
NGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALH NHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 16). Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6), em que X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente ou é N. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6), em que X1 é H, X2 é T, e X3 está ausente ou é N. Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc de ligação estão conectados por um ligante de insulina, como um ligante peptídico, compreendendo a sequência GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
[008] Em exemplos de realização, a proteína de fusão compreende a sequência
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 32). Em exemplos de realização, a proteína de fusão compreende a sequência
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP
5 / 175
KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFN GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV
LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 34).
[009] Em um aspecto, a presente divulgação provê uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, em que o fragmento Fc compreende a sequência:
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF VDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALP SPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQS
NGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALH NHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 22). Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYC (SEQ ID NO: 10), em que X1 não é D e X2 não é H. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYC (SEQ ID NO: 10), em que X1 é H e X2 é T. Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estão conectados por um ligante, tal como um ligante peptídico, compreendendo a sequência GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
[010] Em exemplos de realização, a proteína de fusão compreende a sequência
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
6 / 175
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 36).
[011] Em um aspecto, a presente divulgação provê uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, em que o polipeptídeo insulina e fragmento Fc estão ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, e em que o fragmento Fc é de origem animal não humano e compreende a sequência
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF VDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP IERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 20). Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6), em que X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente. Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6), em que X1 é H, X2 é T, e X3 está ausente. Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estão conectados por um ligante, tal como um ligante peptídico, compreendendo a seguinte sequência GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
[012] Em exemplos de realização, a proteína de fusão compreende a sequência
7 / 175
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 38).
[013] Em um aspecto, a presente divulgação provê uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, em que o fragmento Fc compreende a sequência
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF VDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP IERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 23). Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina da proteína de fusão compreende a sequência FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYC (SEQ ID NO: 10), em que X1 não é D e X2 não é H. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo insulina compreende a seguinte sequência FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCS LDQLENYC (SEQ ID NO: 10), em que X1 é H e X2 é T. Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estão conectados por um ligante, tal como um ligante peptídico, compreendendo a sequência GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
[014] Em exemplos de realização, a proteína de fusão
8 / 175 compreende a sequência
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 40).
[015] Em aspectos, as proteínas de fusão descritas na presente invenção compreendem um homodímero. Nos exemplos de realização, a porcentagem de homodímero da proteína de fusão é maior que 90%. Em exemplos de realização, as proteínas de fusão descritas na presente invenção são feitas usando células HEK293 e o título de homodímero resultante após purificação usando esferas de Proteína A ou coluna de Proteína A é superior a 50 mg/L. Em exemplos de realização, a IC50 do receptor de insulina para as proteínas de fusão descritas na presente invenção é menor ou igual a 5000 nM.
Em exemplos de realização, a meia-vida sérica das proteínas de fusão descritas na presente invenção no sangue ou soro de um animal alvo após a administração é superior a cerca de 3 dias. Em exemplos de realização, para as proteína de fusão descritas na presente invenção, o tempo durante o qual há uma diminuição estatisticamente significativa do nível de glicose no sangue de um sujeito em relação a um nível de pré-dose é superior a 2 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 18 horas, 1 dia, 1,5 dias, 2 dias, 2,5 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais.
[016] Em aspectos, para as proteínas de fusão descritas na presente invenção, a NAOC após a primeira injeção subcutânea em um animal alvo é superior a 150 %FBGL dias kg/mg. Em exemplos de realização, para as proteínas de fusão descritas na presente invenção, a relação entre a NAOC
9 / 175 após a terceira injeção subcutânea semanal das proteínas de fusão no animal alvo e a NAOC após a primeira injeção subcutânea da proteína de fusão no animal alvo ser maior que 0,50.
[017] Em alguns aspectos, as proteínas de fusão descritas na presente invenção são formuladas como uma composição farmacêutica. Em exemplos de realização, na composição farmacêutica, a proteína de fusão está presente em uma concentração de cerca de 3 mg/mL ou maior. Nos exemplos de realização, a composição é adequada para administração subcutânea.
[018] Em alguns aspectos, um método é descrito para diminuir o nível de glicose no sangue de um animal alvo, cujo método compreende a administração de uma quantidade fisiologicamente eficaz de uma proteína de fusão como descrito na presente invenção ou uma composição farmacêutica da referida proteína de fusão ao paciente. Em exemplos de realização, o animal alvo é diagnosticado com diabetes. Em exemplos de realização, o animal alvo é um cachorro ou gato. Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão é administrada por via subcutânea. Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão é administrada diariamente, duas vezes por semana, ou uma vez por semana ao animal alvo. Em exemplos, a proteína de fusão é administrada uma vez por semana ao animal alvo em uma dose entre 0,025 e 0,5 mg/kg/semana. Em alguns aspectos, é descrita uma célula manipulada para expressar uma proteína de fusão, conforme descrita na presente invenção. Em exemplos, a célula é transfectada com um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão. Em exemplos, a célula é uma célula HEK293 ou uma célula CHO.
[019] Em um aspecto, é descrito um cDNA que codifica uma proteína de fusão, conforme descrito no presente documento. Em exemplos de realização, o cDNA compreende a sequência de ácido nucleico atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg
10 / 175 cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagccc aaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagacc ccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaag agcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaag caattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggg gccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagc cttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggag cccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaatt gagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataa ccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 31).
[020] Em exemplos de realização, o cDNA compreende a sequência de ácido nucleico atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcaacggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggc gggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaag cccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaag accccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccggg aagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaagggg aagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggcca ggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtc agccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcag gagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagca aattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgc
11 / 175 ataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 33).
[021] Em exemplos de realização, o cDNA compreende a sequência de ácido nucleico atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagccc aaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagacc ccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaag agcagttctcaggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagc aattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccagggg ccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagcc ttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagc ccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaatt gagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataa ccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 35),
[022] Em exemplos de realização, o cDNA compreende a sequência de ácido nucleico atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaa ggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctga cgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagtt caacagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttca agtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagc
12 / 175 cgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtga catgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagccc gagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgag cgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacag ccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag (SEQ ID NO: 37).
[023] Em exemplos de realização, o cDNA compreende a sequência de ácido nucleico atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaa ggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctga cgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagtt cagcagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttca agtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagc cgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtga catgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagccc gagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgag cgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacag ccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag (SEQ ID NO: 39).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[024] A FIG. 1A mostra uma representação esquemática de uma proteína de fusão insulina-Fc homodimérica exemplar.
[025] A FIG. 2 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 3 para N = 3 cães que receberam por via intravenosa no Dia 0 a 0,2 mg/kg o homodímero de SEQ ID NO: 42.
[026] A FIG. 3 ilustra uma comparação de sequência lado a lado
13 / 175 das SEQ ID NOs: 42, 44, 46, 48 e 50. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[027] A FIG. 4 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 42, 52, 54 e 56. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[028] A FIG. 5 mostra a % média dos níveis de glicose sanguínea em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para N = 3 cães que receberam por via intravenosa no Dia 0 a 0,2 mg/kg do homodímero de SEQ ID NO: 52.
[029] A FIG. 6 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para N = 6 cães que receberam por via subcutânea no Dia 0 a 0,33 mg/kg do homodímero de SEQ ID NO: 52.
[030] A FIG. 7 mostra os títulos médios de anticorpos antifármaco (µg/mL) para N = 3 cães que receberam por via subcutânea no dia 0 (0,30 mg/kg), dia 28 (0,33 mg/kg), dia 35 (0,33 mg/kg), dia 42 (0,50 mg/kg), Dia 49 (1,00 mg/kg) e Dia 56 (1,00 mg/kg) o homodímero de SEQ ID NO: 52.
[031] A FIG. 8 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 58, 60, 62 e 64. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[032] A FIG. 9 mostra os títulos médios de anticorpos
14 / 175 antifármaco (µg/mL) para N = 1 cão que recebeu por via subcutânea no dia 0 (0,33 mg/kg), dia 7 (0,50 mg/kg), dia 14 (0,50 mg/kg), dia 21 (0,50 mg/kg), o homodímero de SEQ ID NO: 64.
[033] A FIG. 10 mostra os títulos médios de anticorpos antifármaco (µg/mL) para um cão (N = 1) que recebeu por via subcutânea no dia 0 (0,33 mg/kg), e dia 14 (0,16 mg/kg) o homodímero de SEQ ID NO: 66.
[034] A FIG. 11 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para N = 2 cães que receberam por via subcutânea no Dia 0 a 0,33 mg/kg do homodímero de SEQ ID NO: 66.
[035] A FIG. 12 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 66, 68, 70, 72, 74 e 76. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[036] A FIG. 13 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 66, 78, 80, 82 e 84. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[037] A FIG. 14 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 66, 76 e 86. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[038] A FIG. 15 ilustra uma comparação de sequência lado a
15 / 175 lado das SEQ ID NOs: 66, 82, 84 e 88. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[039] A FIG. 16 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 32, 34, 66, 90, 92 e 94. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[040] A FIG. 17 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um cão (N = 1) tratado por via subcutânea no Dia 0 a 0,16 mg/kg com o homodímero de SEQ ID NO: 34.
[041] A FIG. 18 mostra os títulos médios de anticorpos antifármaco (µg/mL) para um cão (N = 1) que recebeu por via subcutânea no dia 0 (0,16 mg/kg), dia 14 (0,16 mg/kg), dia 28 (0,16 mg/kg) e dia 42 (0,16 mg/kg) o homodímero de SEQ ID NO: 34.
[042] A FIG. 19 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um cão (N = 1) tratado por via subcutânea no Dia 0 a 0,33 mg/kg com o homodímero de SEQ ID NO: 32.
[043] A FIG. 20 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 60 para um cão (N = 1) tratado por via subcutânea no Dia 0 (0,33 mg/kg), Dia 15 (0,16 mg/kg), Dia 31 (0,16 mg/kg) e Dia 45 (0,15 mg/kg) com o homodímero de SEQ ID NO: 32.
[044] A FIG. 21 mostra os títulos médios de anticorpos antifármaco (µg/mL) para um cão (N = 1) que recebeu por via subcutânea no dia 0 (0,33 mg/kg), dia 15 (0,16 mg/kg), dia 31 (0,16 mg/kg) e dia 45 (0,15
16 / 175 mg/kg) o homodímero de SEQ ID NO: 32.
[045] A FIG. 22 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um cão (N = 1) tratado por via subcutânea no Dia 0 a 0,16 mg/kg com o homodímero de SEQ ID NO: 96.
[046] A FIG. 23 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um cão (N = 1) tratado por via subcutânea no Dia 0 a 0,16 mg/kg com o homodímero de SEQ ID NO: 98.
[047] A FIG. 24 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 102 e 104. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[048] A FIG. 25 mostra a % dos níveis de glicose no sangue em jejum desde o dia 0 ao dia 7 para N = 1 cão tratado por via subcutânea no dia 0 com 0,16 mg/kg com o homodímero de SEQ ID NO: 102, e % dos níveis de glicose no sangue em jejum desde o dia 0 ao dia 7 para N = 1 cão tratado por via subcutânea no dia 0 com 0,16 mg/kg com o homodímero de SEQ ID NO:
104.
[049] A FIG. 26 mostra o % dos níveis de glicose sanguínea em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para N = 1 cão tratado por via subcutânea com o homodímero de SEQ ID NO: 36, além das vezes que o cão foi alimentado.
[050] A FIG. 27 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para N = 3 gatos que receberam por via subcutânea no Dia 0 a 0,8 mg/kg o homodímero de SEQ ID NO: 106.
[051] A FIG. 28 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 106, 108, 110 e 112. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto
17 / 175 “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[052] A FIG. 29 mostra os títulos médios de anticorpos antifármaco (g/mL) para N = 3 gatos que receberam por via subcutânea no dia 0 (0,8 mg/kg), dia 28 (0,6 mg/kg), dia 35 (0,6 mg/kg), dia 42 (0,6 mg/kg) e Dia 48 (0,8 mg/kg) do homodímero de SEQ ID NO: 106.
[053] A FIG. 30 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 108, 114, 116 e 118. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[054] A FIG. 31 ilustra uma comparação de sequência lado a lado das SEQ ID NOs: 106, 112 e 122. “*” representa homologia completa em todas as sequências em uma determinada posição de sequência, enquanto “:”, “.” ou espaços referem-se a mutações de aminoácidos conservadoras, moderadas ou muito diferentes nas sequências em uma determinada posição de sequência, respectivamente.
[055] A FIG. 32 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um hato (N = 1) que recebeu por via subcutânea no Dia 0, 0,16 mg/kg do homodímero de SEQ ID NO: 122.
[056] A FIG. 33 mostra o % dos níveis de glicose sanguínea em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um gato (N = 1) tratado por via subcutânea no dia 0 (0,16 mg/kg) com o homodímero de SEQ ID NO: 38, além das vezes que o gato foi alimentado.
[057] A FIG. 34 mostra os títulos médios de anticorpos antifármaco (µg/mL) para um gato (N = 1) que recebeu por via subcutânea no
18 / 175 dia 0 (0,16 mg/kg), dia 14 (0,16 mg/kg), dia 28 (0,11 mg/kg) e dia 42 (0,09 mg/kg) o homodímero de SEQ ID NO: 38.
[058] A FIG. 35 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para um gato (N = 1) que recebeu por via subcutânea no Dia 0, 0,16 mg/kg do homodímero de SEQ ID NO: 124.
[059] A FIG. 36 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 0 ao Dia 7 para N = 3 gatos que receberam por via subcutânea no Dia 0 (0,10 mg/kg) com o homodímero de SEQ ID NO: 40.
[060] A FIG. 37 mostra a % média dos níveis de glicose no sangue em jejum do Dia 7 ao Dia 14 para N = 3 gatos que receberam por via subcutânea no Dia 7 (0,20 mg/kg) com o homodímero de SEQ ID NO: 40.
[061] A FIG. 38 ilustra a “sequência de aa completa” de uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 32) e sua sequência de ácido nucleico correspondente (SEQ ID NO: 31).
[062] A FIG. 39 ilustra a “sequência de aa completa” de uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 34) e sua sequência de ácido nucleico correspondente (SEQ ID NO: 33).
[063] A FIG. 40 ilustra a “sequência de aa completa” de uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 36) e sua sequência de ácido nucleico correspondente (SEQ ID NO: 35).
[064] A FIG. 41 ilustra a “sequência de aa completa” de uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 38) e sua sequência de ácido nucleico correspondente (SEQ ID NO: 37).
[065] A FIG. 42 ilustra a “sequência de aa completa” de uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 40) e sua sequência de ácido nucleico correspondente (SEQ ID NO: 39).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[066] Um tratamento com insulina que requer dosagens menos
19 / 175 frequentes (por exemplo, injeções uma vez por semana) seria menos onerosa para os proprietários, conduzindo a uma melhor adesão, menos casos de eutanásia, e melhores resultados para os animais de estimação.
Para uma determinada espécie (por exemplo, cão ou gato), uma molécula adequada para um tratamento de ação ultralonga para diabetes deve ser fabricada em células de mamíferos, por exemplo, células de rim embrionário humano (HEK, por exemplo, HEK293), com um título aceitável de produto homodímero desejado
(por exemplo, título de homodímero maior que 50 mg/L de células HEK transitoriamente transfectadas, maior que 75 mg/L de células HEK transitoriamente transfectadas ou maior que 100 mg/L de células HEK transitoriamente transfectadas, etc.). Apenas os candidatos com um título de homodímero maior que 50 mg/L são considerados úteis na presente invenção,
pois a experiência tem demonstrado que títulos de homodímero menores do que este nível provavelmente não irão resultar na produção comercial de homodímero em células de ovário de hamster chinês (CHO) que atendem aos requisitos de baixo custo de fabricação para produtos veterinários.
Além disso,
a molécula deve se ligar ao receptor de insulina com uma notável afinidade
(por exemplo, IC50 menor que 5000 nM, IC50 menor que 4000 nM, IC50 menor que 3000 nM, IC50 menor que 2500 nM, etc.) conforme medido no Ensaio de ligação ao receptor de insulina IM-9 à 4ºC.
Com base no experimento, apenas moléculas que exibem atividade sobre o receptor de insulina com valores de
IC50 inferiores a 5000 nM são consideradas com a probabilidade de apresentar o requisito bioatividade na espécie em questão.
A molécula também deve demonstrar bioatividade sustentada in vivo (por exemplo, demonstrar atividade de redução da glicose superior a cerca de 2 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas,
18 horas, 1 dia, 1,5 dias, 2 dias, 2,5 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais) para justificar a dosagem menos frequente.
A molécula também deve demonstrar tempo de residência prolongado do sistema no animal alvo (por
20 / 175 exemplo, a meia-vida sérica deve ser maior que 3 dias ou mais). A potência bioativa e duração da bioatividade pode ser representada quantitativamente pelo cálculo da área sobre a curva da porcentagem de glicemia em jejum (%FBGL) normalizada para uma determinada dose em mg/kg (NAOC) com unidades de %FBGL dias kg/mg conforme descrito no Exemplo 11. A NAOC aumenta com uma queda maior da %FBGL, que é o caso em que a molécula demonstra aumento da bioatividade, e quando a %FBGL demora mais para retornar a 100%, que é o caso em que a proteína de fusão insulina-Fc demonstra aumento na duração de ação. Para ser útil, conforme descrito no presente documento, uma molécula deve demonstrar um valor NAOC suficientemente alto (por exemplo, preferencialmente uma NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg, mais preferencialmente uma NAOC maior que 200 %FBGL dias kg/mg, e ainda mais preferencialmente uma NAOC maior que 250 %FBGL dias kg/mg). Com base nos experimentos, em valores de NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg, os requisitos de dose nas espécies-alvo serão suficientemente baixos para atingir um custo de tratamento aceitável.
Finalmente, para ser útil para o tratamento de uma doença crônica, tal como a diabetes, a molécula não deve induzir a produção de anticorpos antifármaco, especialmente anticorpos que neutralizam a bioatividade da molécula, após administração repetida. Portanto, a molécula deve demonstrar duração e extensão de bioatividade semelhantes (ou seja, NAOC) após múltiplas doses repetidas no animal alvo (por exemplo, a proporção da NAOC após a terceira injeção subcutânea semanal para a NAOC após a primeira injeção subcutânea semanal da molécula (isto é, a razão NAOC (NAOCR) após a terceira dose) é, na ordem de preferência, maior que 0,50, maior que 0,60, maior que 0,70, maior que 0,80 ou maior que 0,90 ou mais).
[067] Os tratamentos propostos com insulina de ação ultralonga para uso clínico humano compreendem uma proteína de fusão insulina-Fc que
21 / 175 faz uso de um fragmento Fc humano para prolongar a sua ação in vivo.
Como é esperado que um fragmento Fc humano fosse imunogênico e,
consequentemente, capaz de induzir a produção de anticorpos antifármaco em animais de companhia (por exemplo, cães ou gatos), o fragmento Fc humano deve ser substituído por um fragmento Fc espécie-específico (por exemplo,
canino ou felino). No entanto, descobriu-se de maneira bastante inesperada que uma simples troca entre o fragmento Fc humano e o fragmento Fc espécie-
específico (por exemplo, canino ou felino) não se obtém um produto com um título de homodímero aceitável (por exemplo, um título de homodímero maior que 50 mg/L) ou um valor de NAOC suficientemente alto (por exemplo, uma
NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg). Por exemplo, em alguns casos,
apenas um isotipo específico (por exemplo, IgGB canina ou IgG1b felina) para o fragmento Fc resultou em uma proteína de fusão insulina-Fc com um título de homodímero alto o suficiente (por exemplo, um título de homodímero maior que
50 mg/L) e um valor NAOC aceitavelmente alto (por exemplo, um NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg). Em outros casos, aminoácidos específico do polipeptídeo insulina foram encontrados como sendo imunogênicos nas espécies alvo, exigindo deste modo mutações sítio-dirigidas para encontrar o número relativamente pequeno de exemplos de realização que eram não imunogênicos e bioativos nas espécies alvo com aceitavelmente alta NAOC
(por exemplo, valores de NAOC superiores a 150 %FBGL.dias.kg/mg) e valores NAOCR após a terceira semana por via subcutânea da dose que eram superiores a 0,5. Em outros casos, quando os fragmentos Fc foram mutados para impedir a glicosilação e assim reduzir ainda mais a imunogenicidade da proteína de fusão insulina-Fc, inesperadamente descobriu-se que apenas mutações de aminoácidos específicas no fragmento Fc levam aos títulos de homodímeros desejados (por exemplo, títulos de homodímeros maiores que 50 mg/L) e valores NAOC (por exemplo, valores NAOC maiores que 150 %FBGL
22 / 175 dias kg/mg). Além disso, foi descoberto que uma mutação adicional no componente insulina era necessária para produzir essas proteínas de fusão insulina-Fc mutadas e não glicosiladas com os títulos de homodímero desejados (por exemplo, títulos de homodímero maiores que 50 mg/L) e valores de NAOC (por exemplo, valores de NAOC maiores que 150 %FBGL dias kg/mg), ao mesmo tempo em que valores de NAOCR após a terceira dose subcutânea semanal maiores que 0,5 eram atingidos. Portanto, a invenção provê proteínas de fusão insulina-Fc de alta pureza, de ação prolongada, bioativas e não imunogênicas, capazes de serem fabricadas, com títulos de homodímeros aceitavelmente altos (por exemplo, títulos de homodímeros maiores do que 50 mg/L), valores NAOC (por exemplo, valores NAOC maiores que 150 %FBGL dias kg/mg) e valores NAOCR após a terceira dose subcutânea semanal maiores que 0,5, adequados para o tratamento de diabetes em animais de companhia (por exemplo, cães ou gatos), cada um dos quais compreende um polipeptídeo insulina, um fragmento Fc e um ligante entre o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc.
DEFINIÇÕES
[068] Conforme utilizado na presente invenção, os artigos “um” e “uma” referem-se a um ou mais do que um do objeto gramatical do artigo. O uso das palavras “um” ou “uma” quando usadas em conjunto com o termo “compreendendo” no presente documento pode significar “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um”, e “um ou mais de um”.
[069] Conforme utilizado na presente invenção, “cerca de” e “aproximadamente” significam, em geral, um grau de erro aceitável para a quantidade medida, dada a natureza ou precisão das medições. Graus exemplares de erro estão dentro de 20 por cento (%), normalmente, dentro de 10% e, mais tipicamente, dentro de 5% de um determinado intervalo (faixa) de
23 / 175 valores.
[070] Conforme utilizado na presente invenção, uma quantidade de uma molécula, composto, conjugado ou substância eficaz para tratar um distúrbio (por exemplo, um distúrbio descrito na presente invenção), “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade da molécula, composto, conjugado ou substância que é eficaz, mediante administração(ões) de dose única ou múltipla(s) a um sujeito, no tratamento de um sujeito, ou na cura, alívio, atenuação ou melhora de um sujeito com um distúrbio (por exemplo, um distúrbio descrito na presente invenção) além do esperado na ausência de tal tratamento.
[071] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “análogo” refere-se a um composto ou conjugado (por exemplo, um composto ou conjugado como descrito na presente invenção, por exemplo, insulina) possuindo uma estrutura química semelhante à de outro composto ou conjugado, mas diferindo deste em pelo menos um aspecto.
[072] Conforme utilizado no presente pedido, o termo “anticorpo” ou “molécula de anticorpo” refere-se a uma molécula de imunoglobulina (Ig), porções imunologicamente ativas de uma molécula de imunoglobulina (Ig), ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente, por exemplo, imunorreage com um antígeno. Conforme usado neste documento, o termo “domínio de anticorpo” refere-se a uma região variável ou constante de uma imunoglobulina. Conforme usado neste documento, o termo “domínio de anticorpo” refere-se a uma região variável ou constante de uma imunoglobulina. Está documentado na técnica que os anticorpos compreendem várias classes, por exemplo, IgA, IgM ou IgG no caso de mamíferos (por exemplo, humanos e felinos). As classes de imunoglobulinas podem ser classificadas em diferentes isotipos, como IgGa, IgGb, IgGc e IgGd para caninos, ou IgG1a, IgG1b e IgG2 para felinos. Os
24 / 175 versados na técnica reconhecerão que os isotipos de imunoglobulina de uma determinada classe de imunoglobulina compreenderão diferentes sequências de aminoácidos, estruturas e propriedades funcionais (por exemplo, diferentes afinidades de ligação para receptores Fc(gama)). “Liga-se especificamente” ou “imunorreage com” significa que o anticorpo reage com um ou mais determinantes antigênicos do antígeno desejado e tem uma afinidade mais baixa para outros polipeptídeos, por exemplo, não reage com outros polipeptídeos.
[073] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “área- sob-a-curva” ou “AUC” refere-se à área sob curva integrada de %FBGL versus curva de tempo para um sujeito depois de uma determinada dose de proteína de fusão insulina-Fc ser administrada. Conforme usado neste documento, o termo “área sobre a curva” ou “AOC” é usado como uma medida da potência biológica de uma proteína de fusão insulina-Fc de modo que a AOC seja igual à diferença entre a área sob curva total possível da %FBGL vs. curva do tempo e o valor AUC. Conforme usado neste documento, a “área sobre a curva normalizada”, “AOC normalizada” ou “NAOC” é o valor da AOC dividido pela dose real de proteína de fusão insulina-Fc administrada. Conforme usado no presente documento, o termo “razão da AOC normalizada” ou “NAOCR” é a razão da NAOC resultante de uma administração particular de uma proteína de fusão insulina-Fc para a NAOC resultante da primeira administração de uma proteína de fusão insulina-Fc em uma série de administrações. A NAOCR fornece, assim, uma medida da mudança na atividade biológica de uma proteína de fusão insulina-Fc após administrações repetidas.
[074] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “bioatividade”, “atividade”, “atividade biológica”, “potência”, “potência bioativa” ou “potência biológica” refere-se à extensão em que uma proteína de fusão de insulina-Fc ativa o receptor da insulina e/ou exerce uma redução nos níveis de
25 / 175 glicose no sangue em um sujeito alvo. Conforme utilizado na presente invenção, “atividade in vitro” ou “atividade sobre o receptor de insulina” refere- se à afinidade com a qual uma proteína de fusão insulina-Fc se liga ao receptor de insulina e é tipicamente medida pela concentração na qual uma proteína de fusão insulina-Fc desloca metade de um padrão de referência de insulina a partir do receptor de insulina em um ensaio de ligação competitivo (ou seja, IC50). Conforme utilizado na presente invenção, “atividade in vivo” refere-se à extensão e duração da redução no nível de glicose no sangue em jejum de um sujeito alvo após a administração de uma proteína de fusão insulina-Fc.
[075] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “biossíntese”, “síntese recombinante” ou “feito de forma recombinante” refere- se ao processo pelo qual uma proteína de fusão insulina-Fc é expressa dentro de uma célula hospedeira por transfecção da célula com uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, vetor) que codifica a proteína de fusão insulina-Fc (por exemplo, onde toda a proteína de fusão insulina-Fc é codificada por uma única molécula de ácido nucleico). Células hospedeiras exemplares incluem células de mamíferos, por exemplo, células HEK293 ou células CHO. As células podem ser cultivadas usando métodos padrão na técnica e a proteína de fusão insulina-Fc expressa pode ser coletada e purificada a partir da cultura de células usando métodos padrão na técnica.
[076] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “receptor de superfície celular” refere-se a uma molécula tal como uma proteína, geralmente encontrada na superfície externa da membrana celular e que interage com moléculas solúveis, por exemplo, moléculas que circulam no fornecimento de sangue. Em alguns exemplos de realização, um receptor de superfície celular pode incluir um receptor de hormônio (por exemplo, um receptor de hormônio da insulina ou receptor de insulina (IR)) ou um receptor Fc que se liga a um fragmento Fc ou região Fc de um anticorpo (por exemplo,
26 / 175 receptor Fc(gama), por exemplo, receptor Fc(gama)I, ou um receptor Fc neonatal, por exemplo FcRn). Conforme utilizado na presente invenção, “atividade in vitro” ou “atividade sobre o receptor Fc(gama)” ou “ligação ao receptor Fc(gama)” ou “atividade sobre o receptor FcRn” ou “ligação ao FcRn” refere-se à afinidade com a qual uma proteína de fusão insulina-Fc liga-se ao receptor Fc (por exemplo, receptor Fc(gama) ou receptor FcRn) e é tipicamente medida pela concentração de uma proteína de fusão insulina-Fc que faz com que a proteína de fusão insulina-Fc alcance metade de sua ligação máxima (ou seja, valor EC50) conforme medido em um ensaio (por exemplo, um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)) usando valores de OD450 nm medidos em um leitor de microplaca.
[077] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “nível de glicose no sangue em jejum” ou “FBGL” refere-se ao nível médio de glicose no sangue em um sujeito-alvo no final de um período durante o qual nenhum alimento é administrado e imediatamente antes do momento em que uma proteína de fusão insulina-Fc é administrada. Conforme usado neste documento, o termo “percentual de nível de glicose no sangue em jejum”, “% nível de glicose no sangue em jejum” ou “%FBGL” refere-se à razão de um determinado nível de glicose no sangue pelo nível de glicose no sangue em jejum multiplicado por 100.
[078] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “imunogênico” ou “imunogenicidade” refere-se à capacidade de uma determinada molécula (por exemplo, uma proteína de fusão insulina-Fc da presente invenção) provocar o sistema imunológico de um sujeito alvo de modo que após administrações repetidas da molécula, o sujeito desenvolve anticorpos capazes de ligar especificamente à molécula (ou seja, anticorpos antifármacos). Conforme utilizado na presente invenção, o termo de “neutralizante”, “anticorpos neutralizantes”, ou “anticorpos neutralizantes
27 / 175 antifármaco” referem-se à capacidade de anticorpos para interferir com o composto de atividade biológica no objeto alvo. Conforme utilizado na presente invenção, os termos “epítopos imunogênicos”, “pontos quentes (hotspots) imunogênicos” ou simplesmente hot spots, referem-se às mutações ou epítopos de uma determinada molécula (por exemplo, uma proteína de fusão insulina-Fc da presente invenção) que são responsáveis por ligação moderada ou forte dos anticorpos antifármaco.
[079] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “padrão de referência de insulina” é qualquer um de: (i) uma insulina de ocorrência natural de um mamífero (por exemplo, um humano, um cão ou um gato); (ii) um polipeptídeo insulina que não compreende um fragmento Fc; ou (iii) uma insulina padrão de tratamento (por exemplo, uma insulina comercialmente disponível).
[080] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “monômero” refere-se a uma proteína ou uma proteína de fusão que compreende um único polipeptídeo. Em exemplos de realização, o “monômero” é uma proteína ou uma proteína de fusão, por exemplo, um único polipeptídeo, compreendendo um polipeptídeo insulina e um polipeptídeo de fragmento Fc, em que os polipeptídeos de insulina e de fragmento Fc são unidos por ligações de peptídeos para formar o único polipeptídeo. Em exemplos de realização, o monômero é codificado por uma única molécula de ácido nucleico.
[081] Conforme utilizado na presente invenção, “N-terminal” refere-se ao início de uma proteína ou polipeptídeo que é iniciado por um aminoácido contendo um grupo amino livre que é o grupo alfa-amino do aminoácido (por exemplo, o amino livre que está covalentemente ligado a um átomo de carbono que está localizado adjacente a um segundo átomo de carbono, em que o segundo átomo de carbono é parte do grupo carbonil do aminoácido). Conforme utilizado na presente invenção, “C-terminal” refere-se à
28 / 175 extremidade de uma proteína ou polipeptídeo que é terminado por um aminoácido contendo um grupo de ácido carboxílico, em que o átomo de carbono do grupo de ácido carboxílico está localizado adjacente ao grupo alfa- amino do aminoácido.
[082] Conforme utilizado na presente invenção, “farmacodinâmica” ou “PD” refere-se, em geral, aos efeitos biológicos de uma proteína de fusão insulina-Fc em um sujeito. Especificamente, aqui PD refere- se à medida da redução do nível de glicose no sangue em jejum ao longo do tempo em um sujeito após a administração de uma proteína de fusão insulina- Fc.
[083] Conforme utilizado na presente invenção, “farmacocinética” ou “PK” refere-se geralmente às interações características de uma proteína de fusão insulina-Fc e o corpo do sujeito em termos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção. Especificamente, aqui a PK refere-se à concentração de uma proteína de fusão insulina-Fc no sangue ou soro de um sujeito em um determinado momento após a administração da proteína de fusão insulina-Fc.
Conforme utilizado na presente invenção, “meia-vida” refere-se ao tempo gasto para a concentração da proteína de fusão insulina-Fc no sangue ou soro de um sujeito atingir a metade de seu valor original calculado a partir de um modelo de decaimento exponencial de primeira ordem para eliminação de drogas.
Proteínas de fusão insulina-Fc com maiores valores de “meia-vida” demonstram maior duração de ação no sujeito alvo.
[084] Os termos “identidade de sequência”, “homologia de sequência”, “homologia” ou “idêntica” em sequências de aminoácidos ou nucleotídeos, utilizados na presente invenção, descrevem que os mesmos nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos são encontrados dentro das sequências variantes e de referência quando um segmento contíguo especificado da sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos da
29 / 175 variante é alinhada e comparada com a sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos da sequência de referência.
Os métodos para alinhamento de sequência e para determinar identidade entre sequências são conhecidos no estado da técnica, incluindo o uso do Clustal Omega, que organiza, alinha e compara sequências por similaridade, em que o software destaca cada posição de sequência e compara em todas as sequências nessa posição e atribui uma das seguintes pontuações: um “*” (asterisco) para posições de sequência que têm um único resíduo totalmente conservado; “:”
(dois pontos) indica conservação entre grupos de propriedades fortemente semelhantes com pontuação maior que 0,5 na matriz Gonnet PAM 250; e um
“.” (ponto) indica conservação entre grupos de propriedades fracamente semelhantes com pontuação menor ou igual a 0,5 na matriz Gonnet PAM 250;
um “-” (traço) indica uma lacuna de sequência, o que significa que não existe homologia local dentro de um determinado conjunto de comparações dentro de um certo intervalo de sequências, e um espaço vazio “ ” indica pouca ou nenhuma homologia de sequência para essa posição particular entre as sequências comparadas.
Consulte, por exemplo, Ausubel et al., eds. (1995)
Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing & Wiley-
Interscience, New York); e o programa ALIGN (Dayhoff (1978) em Atlas of
Polypeptide Sequence and Structure 5: Supl. 3 (National Biomedical Research
Foundation, Washington, DC)). No que diz respeito ao alinhamento ótimo de duas sequências nucleotídicas, o segmento contíguo da sequência nucleotídica variante pode ter nucleotídeos adicionais ou nucleotídeos suprimidos em relação à sequência nucleotídica de referência.
De forma similar, para fins de alinhamento ótimo de duas sequências de aminoácidos, o segmento contíguo da sequência de aminoácidos variante pode ter resíduos de aminoácidos adicionais ou resíduos de aminoácidos deletados em relação à sequência de aminoácidos de referência.
Em alguns exemplos de realização, o segmento
30 / 175 contíguo utilizado para comparação com a sequência de nucleotídeos de referência ou sequência de aminoácidos de referência compreenderá pelo menos 6, 10, 15 ou 20 nucleotídeos, ou resíduos de aminoácidos, contíguos e pode ser de 30, 40, 50, 100 ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos.
Podem ser feitas correções para uma maior identidade de sequência associada à inclusão de lacunas (gaps) na sequência nucleotídica ou sequência de aminoácidos variante atribuindo penalizações de lacunas (gap penalty). Os métodos de alinhamento de sequências são conhecidos no estado da técnica.
[085] Em exemplos de realização, a determinação da percentagem de identidade ou “homologia” entre duas sequências é realizada utilizando um algoritmo matemático. Por exemplo, a percentagem de identidade de uma sequência de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisa affine 6 gap com penalidade por abertura de lacunas (gap open penalty) de 12 e penalidade por extensão de lacunas (gap extension penalty) de 2, e utilizando a matriz BLOSUM 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é descrito em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489, incorporado ao presente por referência. Em exemplos de realização, a porcentagem de identidade de uma sequência nucleotídica é determinada utilizando o algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman, utilizando gap open penalty de 25 e gap extension penalty de 5. Tal determinação de identidade de sequência pode ser realizada usando, por exemplo, DeCypher Hardware Accelerator da TimeLogic.
[086] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “homologia” é usado para comparar duas ou mais proteínas, localizando características estruturais comuns e distribuição espacial comum de, por exemplo, fitas beta, hélices e dobras (enovelamentos). Consequentemente, as estruturas de proteínas homólogas são definidas por análises espaciais. A
31 / 175 medição da homologia estrutural envolve computar as características geométricas-topológicas de um espaço. Uma abordagem usada para gerar e analisar estruturas tridimensionais (3D) de proteínas é a modelagem de homologia (também chamada de modelagem comparativa ou modelagem baseada em conhecimento), que funciona encontrando sequências semelhantes com base no fato de que a similaridade 3D reflete a similaridade 2D. Estruturas homólogas não implicam similaridade de sequência como condição necessária.
[087] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “sujeito” e “paciente” se destinam a incluir animais caninos e felinos. Sujeitos caninos e felinos exemplares incluem cães e gatos com uma doença ou um distúrbio, por exemplo, diabetes ou outra doença ou distúrbio descrito na presente invenção, ou sujeitos normais.
[088] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “título” ou “rendimento” refere-se à quantidade de um produto de proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção) resultante da biossíntese (por exemplo, em uma célula de mamífero, por exemplo, em uma célula HEK293 ou célula CHO) por volume da cultura de células. A quantidade de produto pode ser determinada em qualquer etapa do processo de produção (por exemplo, antes ou depois da purificação), mas o rendimento ou título é sempre determinado por volume da cultura de células original. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “rendimento de produto” ou “rendimento total de proteína” refere-se à quantidade total de proteína de fusão insulina-Fc expressa por células e purificada por meio de pelo menos uma etapa de cromatografia de afinidade (por exemplo, proteína A ou proteína G) e inclui monômeros da proteína de fusão insulina-Fc, homodímeros da proteína de fusão insulina-Fc e agregados moleculares de ordem superior de homodímeros da proteína de fusão insulina-Fc. Conforme
32 / 175 utilizado na presente invenção, o termo “percentual de homodímero” ou “% homodímero” refere-se à proporção de um produto de proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção) que é o homodímero desejado. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “título de homodímero” refere-se ao produto da % de homodímero e o rendimento total de proteína após a etapa de purificação em Proteína A divulgada por volume de cultura de células.
[089] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “tratar” ou “tratamento” de um paciente portador de uma doença ou um distúrbio referem-se a submeter o indivíduo a um regime de tratamento, por exemplo, a administração de uma proteína de fusão tal como uma proteína de fusão descrita na presente invenção, de modo que pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio é curado, sanado, aliviado, atenuado, alterado, remediado ou melhorado. O tratamento inclui a administração de uma quantidade eficaz para aliviar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, ou afetar a doença ou distúrbio, ou os sintomas da doença ou distúrbio. O tratamento pode inibir a deterioração ou agravamento de um sintoma de uma doença ou distúrbio.
COMPONENTES E ESTRUTURA DA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC
[090] A presente divulgação refere-se a uma composição de uma proteína de fusão (ou seja, uma proteína de fusão insulina-Fc) compreendendo um polipeptídeo insulina ligado por meio de um ligante peptídico a um fragmento Fc espécie-específico, e ao seu uso para tratar o diabetes em animais de companhia (por exemplo, cães ou gatos). Conforme utilizado na presente invenção, os termos “proteína de fusão” e “proteína de fusão insulina-Fc” referem-se a uma proteína compreendendo mais de uma parte, por exemplo, de diferentes fontes (por exemplo, diferentes proteínas, polipeptídeos, células, etc.), covalentemente ligada por ligações peptídicas. As proteínas de fusão insulina-Fc são covalentemente ligadas pela (i) conexão dos
33 / 175 genes que codificam cada parte em uma única molécula de ácido nucleico e (ii) expressão em uma célula hospedeira (por exemplo, HEK ou CHO) da proteína para a qual a molécula de ácido nucleico codifica como segue: (N-terminal)- polipeptídeo insulina - ligante - fragmento Fc - (C-terminal). A abordagem de síntese totalmente recombinante é preferida em relação aos métodos em que o polipeptídeo insulina e os fragmentos Fc são sintetizados separadamente e, em seguida, quimicamente conjugados. A etapa de conjugação química e o processo de purificação subsequente aumentam a complexidade da fabricação, reduzem o rendimento do produto e aumentam os custos.
[091] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “dímero” refere-se a uma proteína ou proteína de fusão compreendendo dois polipeptídeos ligados covalentemente. Em exemplos de realização, dois polipeptídeos idênticos são ligados covalentemente (por exemplo, através de ligações dissulfeto) formando um “homodímero” (representado em diagrama na FIG.1). As ligações de dissulfeto são mostradas como linhas pontilhadas na FIG. 1; o número total de ligações de dissulfeto na realidade pode ser maior ou menor do que o número mostrado na FIG. 1. Em exemplos de realização, o homodímero é codificado por uma única molécula de ácido nucleico, em que o homodímero é feito de forma recombinante dentro de uma célula, formando primeiro monômeros de proteína de fusão insulina-Fc e, em seguida, montando dois monômeros de proteína de fusão insulina-Fc idênticos no homodímero após processamento adicional dentro da célula.
[092] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “multimérico”, “multimérico” ou “estado multimérico” referem-se a formas não covalentes associadas de dímeros de proteína de fusão Fc que podem estar em equilíbrio com dímeros de proteína de fusão Fc ou podem atuar como versões permanentemente agregadas de dímeros de proteína de fusão Fc (por exemplo, dímeros de homodímeros de proteína de fusão Fc, trímeros de
34 / 175 homodímeros de proteína de fusão Fc, tetrâmeros de homodímeros de proteína de fusão Fc ou agregados de ordem superior contendo cinco ou mais homodímeros de proteína de fusão Fc). Pode-se esperar que as formas multiméricas das proteínas de fusão Fc possam ter atividades físicas, de estabilidade ou farmacológicas diferentes daquelas dos homodímeros da proteína de fusão insulina-Fc.
POLIPEPTÍDEO INSULINA
[093] Um polipeptídeo insulina pode ser, por exemplo, um análogo de insulina ou insulina produzida por células β nas ilhotas de Langerhans no pâncreas. A insulina funciona regulando a absorção de glicose a partir do sangue. Após um estímulo, como o aumento dos níveis de proteína e glicose, a insulina é liberada a partir das células β e se liga ao receptor de insulina (IR), iniciando uma cascata de sinalização que afeta muitos aspectos do metabolismo de mamíferos (por exemplo, humano, canino ou felino). A interrupção desse processo está diretamente relacionada a diversas doenças, notavelmente o diabetes, insulinoma, resistência à insulina, síndromes metabólicas e síndrome dos ovários policísticos. Os análogos de insulina da presente divulgação podem ser relacionados com a estrutura da insulina e conter ainda uma ou mais modificações. Em alguns exemplos de realização, o análogo da insulina compreende pelo menos uma substituição, deleção, adição ou modificação química de aminoácido em relação à insulina, que pode impactar um determinado recurso ou característica da proteína de fusão insulina-Fc. Por exemplo, as modificações ou alterações descritas na presente invenção podem impactar a estrutura, estabilidade, sensibilidade ao pH, bioatividade ou afinidade de ligação da proteína de fusão insulina - Fc a um receptor de superfície celular (por exemplo, um receptor de hormônio da insulina) em relação a um padrão de referência.
[094] A sequência de aminoácidos da insulina é fortemente
35 / 175 conservada ao longo da evolução, particularmente em vertebrados. Por exemplo, a insulina canina nativa difere em apenas um aminoácido da insulina humana, e a insulina felina nativa difere em apenas quatro aminoácidos da insulina humana. Conforme usado neste documento, os termos “cadeia B”, “peptídeo C” ou “cadeia C” e “cadeia A” referem-se aos segmentos de peptídeo de um polipeptídeo insulina como ilustrado na FIG. 1. A insulina é um hormônio de 51 aminoácidos contendo duas cadeias peptídicas (ou seja, uma cadeia B e uma cadeia A) conectadas por ligações dissulfeto (por exemplo, ligações dissulfeto formadas por um ou mais tióis de cadeia lateral de cisteína de cadeia B e um ou mais tióis de cadeia lateral de cisteína de cadeia A). A cadeia A da insulina tem 21 aminoácidos de comprimento e a cadeia B da insulina tem 30 aminoácidos de comprimento. Na forma nativa de insulina, a cadeia A contém uma ligação de dissulfeto intracadeia formada por dois tióis de cadeia lateral de cisteína de cadeia A. Para fins de referência, as sequências para a cadeia A da insulina humana de SEQ ID NO: 1 e a cadeia B da insulina humana e SEQ ID NO: 2 são mostradas abaixo: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 1) GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 2)
[095] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “insulina” ou “polipeptídeo insulina” engloba a insulina madura, pré-pró-insulina, pró-insulina, e insulina de ocorrência natural ou análogos destas. Em exemplos de realização, um polipeptídeo insulina pode ser um polipeptídeo insulina de comprimento total ou um fragmento do mesmo. Em exemplos de realização, um polipeptídeo insulina pode compreender um ou mais fragmentos de insulina madura, pré-pró-insulina, pró-insulina ou insulina de ocorrência natural.
[096] A insulina é normalmente construída como um N-terminal - cadeia B : cadeia C: cadeia A - polipeptídeo C-terminal, em que a cadeia C é clivada a fim de torná-la bioativa. Para fins de referência, a sequência de toda a
36 / 175 molécula de insulina humana incluindo a cadeia C (ou seja, a pró-insulina humana) é mostrada abaixo com a cadeia C sublinhada:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAG SLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 3)
[097] A transformação de um polipeptídeo insulina de cadeia simples em um polipeptídeo de duas cadeias bioativa é normalmente realizada dentro das células beta das ilhotas de Langerhans, antes da secreção de insulina estimulada por glicose por duas endoproteases, endoproteases Tipo I, PC1 e PC3, que interrompem a ligação do peptídeo C cadeia B e PC2, e uma endoprotease tipo II, que cliva a ligação do peptídeo C cadeia A nos sítios exatos. No entanto, os sistemas celulares usados para a biossíntese de moléculas terapêuticas como a insulina (por exemplo, bactérias, leveduras e sistemas celulares de mamíferos (por exemplo, HEK e CHO)) não possuem esta via e, portanto, a transformação deve ocorrer após a expressão e coleta do polipeptídeo de cadeia simples usando métodos químicos ou enzimáticos.
Técnicas bem conhecidas para a clivagem da cadeia C após expressão e coleta baseiam-se em primeiramente modificar a cadeia C de tal modo que ela termine em uma lisina, pouco antes do N-terminal da cadeia A. Em seguida, usando uma enzima selecionada a partir de tripsina ou famílias Lys-C, que corta ligações peptídicas especificamente nos C-terminais de resíduos de lisina, o polipeptídeo de cadeia única de insulina é clivada na lisina C-terminal da cadeia C e na lisina na 29ª posição da extremidade C-terminal a partir da extremidade N-terminal da cadeia B. Em alguns casos, as duas cadeias de insulina bioativas resultantes são utilizadas sem recolocar o aminoácido recortado na 30ª posição a partir do N-terminal da cadeia B, e em alguns casos o aminoácido recortado na 30ª posição do N-terminal da cadeia B é adicionado de volta à molécula usando um método enzimático adicional. Esse processo funciona bem com a insulina, porque contém apenas uma lisina em toda a sua
37 / 175 forma polipeptídica de duas cadeias. No entanto, este processo não pode ser usado nas proteínas de fusão aqui insulina-Fc contidas, pois todos os fragmentos Fc conhecidos contêm vários resíduos de lisina. O processo de clivagem enzimática iria, portanto, digerir o fragmento Fc em partes não funcionais, eliminando assim a capacidade do fragmento Fc de prolongar a ação do polipeptídeo insulina in vivo. Portanto, uma proteína de fusão insulina- Fc da presente invenção deve compreender um polipeptídeo insulina que não requer clivagem da cadeia C e é, portanto, bioativa em sua forma de cadeia única.
[098] Vários polipeptídeos insulina de cadeia única bioativos têm sido descritos na técnica. Em todos os casos, os polipeptídeos insulina de cadeia única contêm a cadeia C de comprimento e composição específicos, bem como as cadeias A e B mutadas em sítios de aminoácidos específicos, a fim de alcançar o equilíbrio eletrostático, evitar a agregação, e aumentar a ligação ao receptor de insulina (IR) e/ou sinalização a jusante para atingir bioatividade em níveis comparáveis aos da insulina nativa de duas cadeias.
Aqui, as localizações (sítios) das mutações em segmentos de peptídeo são anotadas usando o nome do segmento (por exemplo, cadeia B, cadeia C, cadeia A) e o número de aminoácidos contando a partir do N-terminal do segmento. Por exemplo, a anotação “B16” refere-se ao 16º aminoácido a partir do N-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia B. A anotação “A8” refere-se ao 8º aminoácido a partir do N-terminal da cadeia A. Além disso, se um aminoácido sofre mutação a partir de sua forma nativa para um novo aminoácido em um local específico, o local é anexado com o código de aminoácido de uma letra para o novo aminoácido. Por exemplo, B16A refere-se a uma mutação de alanina na posição do 16º aminoácido a partir do N-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia B e A8H refere-se a uma mutação de histidina na posição do 8º aminoácido a partir do N-terminal da sequência de
38 / 175 aminoácidos da cadeia A.
[099] Em um exemplo, um análogo de insulina de cadeia única com uma cadeia C da sequência GGGPRR e substituições adicionais na cadeia A e na cadeia B (SEQ ID NO: 4) foi desenvolvido pelo The Department of Biochemistry, Case Western Reserve University School of Medicine and the Department of Medicine, University of Chicago (vide Hua, Q.-x, Nakagawa, SH, Jia, W., Huang, K., Phillips, NB, Hu, S.-q., Weiss, MA, (2008) J. Biol. Chem Vol.
283, No. 21 págs. 14703-14716). Neste exemplo, na posição 8 da cadeia A (isto é, A8), histidina é substituída por treonina; na posição 10 da cadeia B (isto é, B10), o ácido aspártico é substituído por histidina; na posição 28 da cadeia B (isto é, B28), o ácido aspártico é substituído por prolina; e na posição 29 da cadeia B (isto é, B29), a prolina é substituída por lisina. A SEQ ID NO: 4 está listada abaixo com cada um dos aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSDLVEALYLVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCN (SEQ ID NO: 4)
[0100] Em exemplos de realização, a alanina pode ser substituída por tirosina na posição 16 a partir do N-terminal da cadeia B (isto é, B16) na SEQ ID NO: 4 para produzir a SEQ ID NO: 5, pois uma substituição de alanina nesta posição é conhecido por ser menos capaz de ativar células T insulina- específicas (Alleva, DG, Gaur, A., Jin, L., Wegmann, D., Gottlieb, PA, Pahuja, A., Johnson, EB, Motheral, T., Putnam, A., Crowe, PD, Ling, N., Boehme, SA, Conlon, PJ, (2002) Diabetes Vol. 51, No. 7 págs. 2126-2134). A SEQ ID NO: 5 está listada abaixo com cada um dos aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCN (SEQ ID NO: 5)
[0101] Em alguns exemplos de realização, foi inesperadamente descoberto que aminoácidos específicos na SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, levou ao desenvolvimento de anticorpos antifármaco de neutralização após
39 / 175 repetidas injeções subcutâneas no animal alvo (por exemplo, cão ou gato). Os anticorpos antifármacos levaram a uma redução inaceitável na NAOC após múltiplas injeções (por exemplo, um valor NAOCR após a terceira injeção de menos de 0,5), tornando as proteínas de fusão insulina-Fc associadas não viáveis. Especificamente, foi descoberto nas etapas que levaram à invenção da presente divulgação que a mutação A8 para histidina e a mutação B10 para ácido aspártico representaram a grande maioria da especificidade do anticorpo antifármaco e, portanto, representaram “pontos quentes” (hot spots) imunogênicos (por exemplo, epítopos imunogênicos) no polipeptídeo insulina.
Portanto, em exemplos de realização preferidos, o polipeptídeo insulina não contém histidina na posição A8 ou ácido aspártico na posição B10 do polipeptídeo insulina.
[0102] Em um exemplo de realização, foi confirmado que simplesmente mantendo os aminoácidos A8 e B10 como na forma nativa de treonina e histidina, respectivamente, elimina-se a resposta de anticorpos antifármaco, mas a proteína de fusão de insulina-Fc resultante não é bioativa nas espécies alvo (por exemplo, NAOC inferior a 150 %FBGL dias kg/mg).
Portanto, foi necessário experimentar várias variações da cadeia A, cadeia B e cadeia C para encontrar uma solução adequada. A maioria das variantes não conseguiu atingir títulos de homodímero maiores que 50 mg/L, e muitas daquelas que atenderam a esses objetivos não alcançaram níveis aceitáveis de bioatividade nas espécies-alvo (por exemplo, valores NAOC aceitáveis de mais de 150 %FBGL dias kg/mg). Tendo rastreado mais de 120 variantes, o seguinte polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 6_NULL foi considerado adequado em relação à obtenção de títulos de homodímero maiores que 50 mg/L, valores de NAOC nas espécies alvo maiores que 150 %FBGL dias kg/mg, imunogenicidade mínima, e valores NAOCR após a terceira injeção nas espécies alvo de maiores que 0,5 das proteínas de fusão insulina-Fc
40 / 175 associadas (aminoácidos não nativos sublinhado e os aminoácidos nativos excluídos representado com um sublinhado Z): FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2S TCSLDQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6_NULL) onde X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente ou é N.
[0103] Em exemplos de realização específicos, na SEQ ID NO: 6_NULL, X1 representa H, X2 é T, e X3 está ausente ou é N, originando a seguinte SEQ ID NO: 7_NULL (com aminoácidos não nativos sublinhados e aminoácidos nativos excluídos representados com um Z sublinhado):
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTST CSLDQLENYCX3 (SEQ ID NO: 7_NULL) em que X3 está ausente ou é N.
[0104] Em um exemplo de realização específico, na SEQ ID NO: 7_NULL, X3 está ausente resultando na seguinte SEQ ID NO: 8_NULL (com aminoácidos não nativos sublinhados e aminoácidos nativos deletados representados com um Z sublinhado):
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTST CSLDQLENYCZ (SEQ ID NO: 8_NULL)
[0105] Em um exemplo de realização específico, na SEQ ID NO: 7_NULL, X3 é N resultando na seguinte SEQ ID NO: 9_NULL (com aminoácidos não nativos sublinhados e aminoácidos nativos deletados representados com um Z sublinhado):
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTST CSLDQLENYCN (SEQ ID NO: 9_NULL)
[0106] Em alguns exemplos de realização, o fragmento Fc foi mutado para evitar a glicosilação durante a síntese e potencialmente reduzir a imunogenicidade da proteína de fusão insulina-Fc resultante no animal alvo (por exemplo, cão ou gato). Inesperadamente, foi descoberto que havia uma
41 / 175 interação entre o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc mutado, de modo que outra mutação de aminoácido era necessária no polipeptídeo insulina para tornar a proteína de fusão insulina-Fc suficientemente fabricável (por exemplo, com um homodímero título superior a 50 mg/L) e não imunogênico com um valor NAOC na espécie alvo maior que 150 %FBGL dias kg/mg e um valor NAOCR após a terceira injeção na espécie alvo maior que 0,5.
Especificamente, foi descoberto que a mutação do aminoácido B16 em uma alanina no polipeptídeo insulina era necessária quando ele estava ligado a fragmentos Fc específicos, mutados e não glicosilados, resultando no seguinte polipeptídeo insulina SEQ ID NO: 10_NULL (com aminoácidos não nativos sublinhados e aminoácidos nativos deletados representados com um Z sublinhado): FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2S TCSLDQLENYCZ (SEQ ID NO: 10_NULL) onde X1 não é D e X2 não é H.
[0107] Em um exemplo de realização específico, na SEQ ID NO: 10_NULL, X1 é H e X2 é T resultando na seguinte SEQ ID NO: 11_NULL (com aminoácidos não nativos sublinhados e aminoácidos nativos deletados representados com um Z sublinhado):
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTST CSLDQLENYCZ – SEQ ID NO: 11_NULL
[0108] A seguir estão as reapresentações das sequências mostradas acima, mas com os aminoácidos ausentes do símbolo Z removidos da notação das sequências do polipeptídeo insulina. Novamente, em todos os casos os aminoácidos não nativos estão sublinhados. Para evitar confusão, cada sequência original contendo símbolos Z é listada acima da nova sequência com os símbolos Z removidos. Apesar das duas notações separadas, as sequências pareadas referem-se exatamente ao mesmo
42 / 175 polipeptídeo insulina.
SEQ ID NO: 6_NULL reformulada como: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6) onde X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente ou é N.
SEQ ID NO: 7_NULL reformulada como:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCX3 (SEQ ID NO: 7) em que X3 está ausente ou é N.
SEQ ID NO: 8_NULL reformulada como:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYC (SEQ ID NO: 8) SEQ ID NO: 9_NULL reformulada como:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCN (SEQ ID NO: 9) SEQ ID NO: 10_NULL reformulada como: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYC (SEQ ID NO: 10) onde X1 não é D e X2 não é H.
SEQ ID NO: 11_NULL reformulada como:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYC (SEQ ID NO: 11)
LIGANTE
[0109] A construção bem-sucedida de uma proteína de fusão insulina-Fc feita de forma recombinante requer um ligante que conecte o polipeptídeo insulina ao fragmento Fc. Em exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção compreende um ligante peptídico entre o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc compreendendo
43 / 175 aminoácidos (por exemplo, aminoácidos naturais ou não naturais). Em exemplos de realização, o ligante peptídico pode ser codificado por uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, de modo que uma única molécula de ácido nucleico pode codificar os vários peptídeos dentro de um polipeptídeo insulina, bem como o ligante peptídico e o fragmento Fc. A escolha do ligante peptídico (por exemplo, o comprimento, composição, hidrofobicidade e estrutura secundária) pode impactar a capacidade de fabricação (ou seja, o título do homodímero), a estabilidade química e enzimática, a bioatividade (ou seja, o valor NAOC) e o imunogenicidade da proteína de fusão insulina-Fc (Chen, X., Zaro, J., Shen, W.C., Adv Drug Deliv Rev. 15 de outubro de 2013; 65(10): 1357-1369). A Tabela 1 lista vários ligantes usados no projeto de uma proteína de fusão insulina-Fc com o objetivo de melhorar o título de homodímero e a bioatividade.
TABELA 1
PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO ENTRE A CADEIA A E FRAGMENTO FC DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC GGGGAGGGG GGGGSGGGG GGGGGAGGGG GGGGSGGGGSGGGGSGGGG GGGGKGGGGKGGGGKGGGG GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG GGGGGAGGGGAGGGGAGGGGG SGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG HGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
PGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG Em exemplos de realização, o ligante peptídico compreende a sequência: GGGGAGGGG (SEQ ID NO: 12).
Em outro exemplo de realização, o ligante peptídico compreende a sequência:
44 / 175 GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 13).
Em exemplos de realização preferidos, o ligante peptídico compreende a sequência: GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
[0110] Ao construir uma proteína de fusão de insulina-Fc recombinante feita com um ligante peptídico como aquele de SEQ ID NO: 14, deve ser dada atenção à possibilidade de clivagem enzimática indesejada entre o C-terminal da cadeia A da insulina e o N-terminal do ligante peptídico. A clivagem do ligante e do fragmento Fc do polipeptídeo insulina tornaria a proteína de fusão insulina-Fc incapaz de fornecer uma duração prolongada de bioatividade. Existe um sítio de clivagem enzimática conhecido entre as ligações asparagina-glicina (Vlasak, J., Ionescu, R., (2011) MAbs Vol. 3, No. 3 págs 253-263). Em muitos exemplos de realização de ligação do peptídeo, incluindo o ligante peptídico preferido de SEQ ID NO: 14, o aminoácido N- terminal é uma glicina. Além disso, o C-terminal da cadeia A da insulina, isto é (o 21º aminoácido do N-terminal da cadeia A (o seja, A21)) é uma asparagina.
Portanto, a asparagina A21 é omitida nos polipeptídeos de insulina de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 para eliminar a ligação asparagina- glicina potencialmente clivável enzimaticamente que se formaria entre a cadeia A e o ligante peptídico. Inesperadamente, uma proteína de fusão insulina-Fc construída a partir do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 9, que retém a asparagina no C-terminal da cadeia A, demonstra capacidade de fabricação em células de mamíferos com um título de homodímero aceitável (ou seja, um título de homodímero maior que 50 mg/L), uma bioatividade in vivo aceitável (ou seja, NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg no animal alvo) e níveis sustentados de bioatividade após múltiplas doses (ou seja, valores NAOCR após a terceira injeção no animal alvo acima de 0,5). Os resultados indicam que, ao contrário das expectativas baseadas em ensinamentos anteriores, não
45 / 175 há risco de clivagem enzimática ou desativação das proteínas de fusão insulina-Fc contendo a ligação asparagina-glicina entre o polipeptídeo insulina e o ligante peptídico, pelo menos para proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo as sequências de fragmentos Fc aqui divulgadas.
FRAGMENTO FC
[0111] Os termos “fragmento Fc”, “região Fc”, “domínio Fc”, ou “polipeptídeo Fc”, são utilizados no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O fragmento, região, domínio ou polipeptídeo Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante/mutante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, eles geralmente compreendem parte ou toda a região de dobradiça da cadeia pesada, a região CH2 da cadeia pesada e a região CH3 da cadeia pesada. A região de dobradiça de um fragmento Fc de cão ou gato compreende sequências de aminoácidos que conectam o domínio CH1 da cadeia pesada à região CH2 da cadeia pesada e contém uma ou mais cisteínas que formam uma ou mais pontes de dissulfeto intercadeias pesadas para formar um homodímero de uma proteína de fusão Fc a partir de dois monômeros idênticos, mas separados, da proteína de fusão Fc. A região de dobradiça pode compreender toda ou parte de uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural ou uma sequência de aminoácidos de ocorrência não natural.
[0112] Um receptor de Fc (FcR) refere-se a um receptor que se liga a um fragmento Fc ou região Fc de um anticorpo. Em exemplos de realização, o FcR é uma sequência nativa de FcR canino ou felino. Em exemplos de realização, o FcR é aquele que se liga a um fragmento Fc ou à região Fc de um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui, sem limitação, receptores do receptor Fc(gama)I, receptor Fc(gama)IIa, Fc(gama) receptor IIb, e subclasses de receptor Fc(gama)III, incluindo variantes alélicas e formas de
46 / 175 splicing alternativo desses receptores. “FcR” também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de moléculas IgGs maternas para o feto (Guyer et al ., 1976 J. Immunol., 117: 587; e Kim et al., 1994, J.
Immunol., 24: 249) e também é responsável para a meia-vida de eliminação in vivo prolongada dos anticorpos e proteínas de fusão Fc in vivo. Em exemplos de realização, o FcR de origem humana são usados in vitro (por exemplo, em um ensaio) para medir a ligação de proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos Fc de origem canina ou felina, de modo a avaliar suas propriedades de ligação ao FcR. Os versados na técnica entenderão que FcR de mamífero de uma espécie (por exemplo, FcR de origem humana) são algumas vezes capazes de ligação in vitro aos fragmentos Fc de uma segunda espécie (por exemplo, FcR de origem canina ou felina). Em exemplos de realização, o FcR de origem canina são usados in vitro (por exemplo, em um ensaio) para medir a ligação de proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos Fc de origem canina ou felina, de modo a avaliar suas propriedades de ligação ao FcR. Os versados na técnica entenderão que FcR de mamífero de uma espécie (por exemplo, FcR de origem canina) é capaz de ligar in vitro às proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos Fc da mesma espécie (por exemplo, de origem canina) e, às vezes, também às proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos Fc originários de outra espécie de mamífero (por exemplo, de origem felina).
[0113] Em exemplos de realização, o fragmento Fc compreende a região Fc (por exemplo, região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3) de um IgG de mamífero, por exemplo, um fragmento Fc de IgGA canino (SEQ ID NO: 15), um fragmento Fc de IgGB canino (SEQ ID NO: 16), um fragmento Fc de IgGC canino (SEQ ID NO: 17), ou um fragmento Fc de IgGD canino (SEQ ID NO: 18) ou um fragmento de IgG1a felino (SEQ ID NO: 19), um fragmento Fc de IgG1b felino (SEQ ID NO: 20), ou um fragmento Fc de IgG2 felino (SEQ
47 / 175 ID NO: 21). Em exemplos de realização, a lisina C-terminal que é frequentemente encontrado nativa canino ou felino isotipo IgG Fc fragmento de sequência de aminoácidos (ou seja, a lisina que representa o último aminoácido da sequência de fragmento Fc) é omitido para evitar a produção acidental de sequência de aminoácidos indesejados variantes durante a fabricação (por exemplo, fragmentos Fc contendo a lisina C-terminal tornam-se misturados com fragmentos Fc em que a lisina C-terminal está omitida, o que pode ocorrer durante a produção da proteína desejada dentro das células (Dick, L.W., (2008) Biotechnol Bioeng. 15 de agosto; 100 (6) págs. 1132-43).
Portanto, nos exemplos de realização, as sequências do fragmento Fc canino e felino sem uma lisina C-terminal são:
RCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQIS WFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDL PSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQ
SNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHE TLQNHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 15)
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF VDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALP SPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQS
NGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALH NHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 16)
CNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQIS WFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKA LPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEW
QSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHE ALHNHYTQISLSHSPG (SEQ ID NO: 17)
CISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFV DGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPI
48 / 175
ERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNG
QPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQN HYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 18)
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF VDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP IERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 19)
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF VDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP IERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 20)
GEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITW FVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLP SAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEI
TGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEAL HSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 21)
[0114] A substituição da Fc humana por de IgGa de cão é preferível para minimizar qualquer imunogenicidade indesejada em cães devido à ausência da função efetora Fc(gama) do isotipo IgGa em cão (muito similar ao isotipo IgG2 humana nos seres humanos). No entanto, em um exemplo de realização contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12, foi inesperadamente descoberto que a proteína de fusão insulina-Fc compreendendo o fragmento IgGa de cão (SEQ ID NO: 15) era altamente agregada com baixos títulos do homodímero desejado (ou seja, os títulos de homodímeros menores do que 50 mg/L). Além disso, o composto não era bioativo em cães (ou seja, o valor NAOC era inferior a 150
49 / 175 %FBGL dias kg/mg), presumivelmente devido ao seu alto nível de agregação (por exemplo, baixo % de homodímero). Apesar da mutação do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5, o fragmento Fc de IgGA canino (SEQ ID NO: 15) e/ou o ligante, não houve exemplo de realização com base no fragmento Fc de IgGA canino com um grau de agregação suficientemente baixo e um título suficientemente alto do homodímero desejado. Por outro lado, a substituição do fragmento Fc de IgGA canino (SEQ ID NO: 15) pelo fragmento Fc de IgGB canino (SEQ ID NO: 16) rendeu um composto com muito menos agregado com um título comparativamente alto do homodímero desejado. Além disso, o composto contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o fragmento Fc de IgGB canino (SEQ ID NO: 16) foi bioativo em cães, exibindo bioatividade de redução de glicose ao longo de vários dias (ou seja, o valor NAOC foi maior que 150 %FBGL dias kg/mg).
[0115] A preferência pelo fragmento Fc de IgGB canino em relação ao fragmento Fc de IgGA canino foi confirmada em exemplos de realização contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 14, ambos os quais variam consideravelmente do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12.
As proteínas de fusão insulina-Fc contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 14 foram sintetizados usando fragmentos Fc de IgGA canina (SEQ ID NO: 15), IgGB canina (SEQ ID NO: 16), imunoglobulinas IgGC canina (SEQ ID NO: 17) ou IgGD canina (SEQ ID NO: 18). Usando o método de purificação convencional, apenas os compostos compreendendo a IgGA canina e a IgGB canina mostraram qualquer rendimento proteico apreciável. No entanto, assim como antes, a versão de IgGA canina do composto foi altamente agregada com baixos níveis de bioatividade, enquanto a versão de IgGB canina do composto exibiu um baixo grau de agregação (ou seja, alta% de homodímero), um alto título do
50 / 175 homodímero desejado (isto é, um título de homodímero maior que 50 mg/L) e níveis apreciáveis de bioatividade de redução da glicose de longa duração em cães (isto é, o valor NAOC foi maior que 150 %FBGL dias kg/mg). Usando um método de purificação alternativo, a versão de IgGC canina do composto foi recuperada com baixos graus de agregação, mas era minimamente bioativa em cães (ou seja, o valor NAOC era inferior a 150 %FBGL dias kg/mg), presumivelmente devido à sua baixa afinidade para o receptor FcRn. Portanto, com respeito a um produto específico para cães, a IgGB canina (SEQ ID NO: 16) é o fragmento Fc preferido para todas as proteínas de fusão insulina-Fc usadas em cães, independentemente da escolha do polipeptídeo insulina.
[0116] A substituição da Fc humana por de IgG2 de gato é preferível para minimizar qualquer imunogenicidade indesejada em gatos devido à ausência da função efetora Fc(gama) do isotipo IgG2 em gatos (muito similar ao isotipo IgG2 humana nos seres humanos). Ao contrário do caso com os cães, em exemplos de realização contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4, descobriu-se que a proteína de fusão de insulina-Fc compreendendo fragmento de IgG2 de felino (SEQ ID NO: 21) e fragmento IgG1b de felino (SEQ ID NO: 20) apresentou rendimento similarmente alto com baixos graus de agregação (isto é, títulos de homodímero maiores que 50 mg/L) e afinidade para o receptor de insulina apreciável (isto é, valores de IC 50 do receptor de insulina menores que 5000 nM). No entanto, inesperadamente quando o polipeptídeo insulina foi alterado para SEQ ID NO: 7, a proteína de fusão insulina-Fc compreendendo o fragmento IgG2 de felino (SEQ ID NO: 21) não era bioativa em gatos (ou seja, NAOC foi inferior a 150 %FBGL dias kg/mg), enquanto a proteína de fusão insulina-Fc compreendendo o fragmento IgG1b de felino (SEQ ID NO: 20) exibiu um baixo grau de agregação (ou seja, alta % de homodímero), um alto título do homodímero desejado (ou seja, um título de homodímero maior que 50 mg/L) e níveis apreciáveis de bioatividade de
51 / 175 redução da glicose de longa duração em gatos (ou seja, o valor NAOC foi maior que 150 %FBGL dias kg/mg). Portanto, no que diz respeito a um produto específico para gatos, o fragmento de IgG1b de felino (SEQ ID NO: 20) é o fragmento Fc preferido quando a sequência do polipeptídeo insulina compreende a SEQ ID NO: 7.
[0117] Levando-se em consideração que os isotipos IgGB canina e IgG1b felina interagem com seus respectivos receptores de Fc(gama) espécie-específicos com afinidades mais elevadas do que a sua contraparte de isotipo IgGA canina e IgG2 felino, que pode ou não ser um risco de imunogenicidade indesejada após injeções repetidas. Um método para reduzir a interação Fc(gama) envolve a desglicosilação ou prevenção da glicosilação do fragmento Fc durante a síntese na célula hospedeira. Cada fragmento de IgG contém um sítio conservado (N)-glicosilação da asparagina no domínio CH2 de cada cadeia pesada da região Fc. Aqui, a anotação usada para se referir ao sítio de N-glicosilação conservado é “cNg”. Uma forma de remover os glicanos ligados a partir de uma proteína de fusão de insulina-Fc sintetizada é mutando o sítio cNg para prevenir completamente a ligação de glicanos durante a produção na célula hospedeira. Aqui, a anotação usada para descrever uma mutação cNg é cNg- (aminoácido substituído). Por exemplo, se a asparagina no sítio cNg é mutada para serina, esta mutação é anotada como “cNg-S”.
[0118] A posição absoluta do sítio cNg no N-terminal da cadeia B da proteína de fusão insulina-Fc varia dependendo do comprimento do polipeptídeo insulina, do comprimento do ligante e quaisquer aminoácidos omitidos no fragmento Fc antes do sítio cNg. Aqui, a notação usada para se referir à posição absoluta do sítio cNg em uma determinada sequência de proteína de fusão insulina-Fc (medida contando a partir do N-terminal da cadeia B da proteína de fusão insulina-Fc) é “NB (número)”. Por exemplo, se o
52 / 175 sítio cNg é encontrado na 151ª posição de aminoácido contada a partir da extremidade N-terminal da cadeia B, a posição absoluta deste sítio é referida como GNC-NB151. Como outro exemplo, se o sítio cNg é encontrado na 151ª posição de aminoácido contada a partir da extremidade N-terminal da cadeia B, e a asparagina neste sítio é mutada para serina, esta mutação é conhecida como “cNg-NB151-S”.
[0119] Em exemplos de realização contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o fragmento Fc de IgGB canino com as mutações cNg-Q, cNg-S, cNg-D e cNg-K, foi descoberto inesperadamente que apenas o composto contendo as mutações CNG-K e CNG-s exibiram o requisito de título maior de homodímero de 50 mg/L e afinidades mais baixas de ligação ao Fc(gama)RI. Por outro lado, em um exemplo de realização contendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e o fragmento Fc de IgGB canina com a mutação cNg-S, descobriu-se inesperadamente que o composto resultante foi significativamente menos bioativo em cães comparado com a contraparte nativa contendo Fc de IgGB canina (ou seja, o valor NAOC foi significativamente menor para a contraparte contendo o aminoácido do sítio de glicosilação nativo, por exemplo, cNg-N). A bioatividade foi inesperadamente restaurada na forma mutante cNg-S (ou seja, o valor NAOC aumentou significativamente) quando o aminoácido B16 foi mutado para alanina, conforme descrito acima para o polipeptídeo insulina SEQ ID NO: 11. Tomados em conjunto, existe uma inesperada e significativa interação entre a escolha da mutação gNc e a composição do polipeptídeo insulina de modo que é necessária a experimentação para identificar os exemplos de realização preferidos. Em exemplos de realização específicos, a Fc de IgGB canina mutante contendo a mutação cNg-S é preferida e a sequência com cNg-S sublinhada é mostrada como:
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF
53 / 175
VDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALP SPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQS
NGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALH NHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 22) Em exemplos de realização específicos, a Fc de IgG1b felina mutante contendo a mutação cNg-S é preferida:
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF VDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP IERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 23) PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC
[0120] A presente invenção provê proteínas de fusão de insulina- Fc compreendendo um polipeptídeo insulina, um fragmento Fc, e um agente de ligação entre o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc. Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina compreende domínios na seguinte orientação do N-terminal para C-terminal: (N-terminal) - cadeia B - cadeia C - cadeia A - (C-terminal). Em exemplos de realização, o polipeptídeo insulina está localizado no lado N-terminal do fragmento Fc. Em exemplos de realização, a proteína de fusão compreende domínios na seguinte orientação de N- para C-terminal: (N-terminal) - polipeptídeo insulina - ligante - fragmento Fc - (C-terminal) (por exemplo, (N-terminal)) - cadeia B - cadeia C - cadeia A - ligante - fragmento Fc - (C-terminal)) como ilustrado na FIG. 1
[0121] Eu exemplos de realização preferidos, o polipeptídeo bioativo insulina, preferencialmente não imunogênico, de SEQ ID NO: 6 é combinado com o fragmento Fc de IgGB canina de SEQ ID NO: 16, usando o ligante preferido de SEQ ID NO: 14 para produzir uma família de proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto
54 / 175 rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 24 que apresentam títulos de homodímeros maiores do que 50 mg/L, valores NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg em cães e valores NAOCR maiores que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 24 com aminoácidos não nativos sublinhados: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYCX3GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIF
PPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQF NGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVY
VLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDE DGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 24) onde X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente ou é N.
[0122] Em exemplos de realização preferidos compreendendo a SEQ ID NO: 24, X1 é H, X2 é T, e X3 está ausente ou é N. As seleções produzem proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 25 que apresentam títulos de homodímeros maiores do que 50 mg/L, valores NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg em cães e valores da NAOCR maiores que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 25 com aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCX3GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP
KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFN GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV
LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 25)
55 / 175 em que X3 está ausente ou é N.
[0123] Em exemplos de realização preferidos, X3 está ausente na SEQ ID NO: 25 para produzir proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 32 que exibe um título de homodímeros maior que 50 mg/L, valor da NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg em cães e valor da NAOCR maior que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 32 com aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 32)
[0124] Em exemplos de realização preferidos, X3 é N na SEQ ID NO: 25 para produzir proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 34 que exibe um título de homodímeros maior que 50 mg/L, valor da NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg em cães e valor da NAOCR maior que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 34 com aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFN GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID
56 / 175 NO: 34)
[0125] Em exemplos de realização preferidos, o fragmento Fc de IgGB canina com a mutação cNg-S, não glicosilado, preferido de SEQ ID NO: 22 é combinado com a sequência do polipeptídeo insulina mutada B16A preferida de SEQ ID NO: 10, usando o ligante preferido de SEQ ID NO: 14 para produzir uma família de proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 26 que exibe títulos de homodímeros maiores do que 50 mg/L, valores da NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg em cães, e valores da NAOCR maiores que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 26 com aminoácidos não nativos sublinhados: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL
DQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFS GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV
LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 26) onde X1 não é D e X2 não é H.
[0126] Em um exemplo de realização preferido, X1 é H e X2 é T na SEQ ID NO: 26 para produzir proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 36 que exibe um título de homodímeros maior que 50 mg/L, valor da NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg em cães e valor da NAOCR maior que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 36 com aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
57 / 175
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 36)
[0127] Eu exemplos de realização preferidos, o polipeptídeo bioativo insulina, preferencialmente não imunogênico, de SEQ ID NO: 6, em que X3 está ausente, é combinado com o fragmento Fc de IgG1b felina de SEQ ID NO: 20, usando o ligante preferido de SEQ ID NO: 14 para produzir uma família de proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 27 que apresentam títulos de homodímeros maiores do que 50 mg/L, valores NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg em felinos e valores NAOCR maiores que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em felinos. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 27 com aminoácidos não nativos sublinhados: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL
DQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPK PKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNST YRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLP
PAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGT YFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 27) onde X1 não é D e X2 não é H.
[0128] Em um exemplo de realização preferido, X1 é H e X2 é T na SEQ ID NO: 27 para produzir proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 38 que exibe um título de homodímeros maior que 50 mg/L, valor da
58 / 175 NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg em felinos e valor da NAOCR maior que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em felinos.
O seguinte mostra a SEQ ID NO: 38 com aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 38)
[0129] Em exemplos de realização preferidos, o fragmento Fc de IgG1b felina com a mutação cNg-S, não glicosilado, preferido de SEQ ID NO: 23 é combinado com a sequência do polipeptídeo insulina mutada B16A preferida de SEQ ID NO: 10, usando o ligante preferido de SEQ ID NO: 14 para produzir uma família de proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 28 que exibe títulos de homodímeros maiores do que 50 mg/L, valores da NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg em felinos, e valores da NAOCR maiores que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em felinos. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 28 com aminoácidos não nativos sublinhados: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL
DQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPK PKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSST YRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLP PAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGT YFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID
59 / 175 NO: 28) onde X1 não é D e X2 não é H.
[0130] Em um exemplo de realização preferido, X1 é H e X2 é T na SEQ ID NO: 28 para produzir proteínas de fusão insulina-Fc, não agregadas, bioativas, não imunogênicas e com alto rendimento de homodímero de SEQ ID NO: 40 que exibe um título de homodímeros maior que 50 mg/L, valor da NAOC maior que 150 %FBGL dias kg/mg em felinos e valor da NAOCR maior que 0,5 após a terceira injeção em uma série de injeções repetidas em cães. O seguinte mostra a SEQ ID NO: 40 com aminoácidos não nativos sublinhados:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 40)
[0131] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção não inclui uma sequência de aminoácidos líder na porção N-terminal. Em outros exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção inclui uma sequência líder, por exemplo, na porção N-terminal. Uma sequência líder exemplar inclui a sequência de aminoácidos MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 30). Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção é codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência líder, por exemplo, para expressão (por exemplo, expressão recombinante) em células (por exemplo, células eucarióticas, por exemplo, células de mamífero). Em determinados exemplos de realização, a sequência líder é clivada, por exemplo, na cultura
60 / 175 celular, durante a expressão. Uma sequência de ácido nucleico exemplar que codifica uma sequência líder inclui a sequência de ácido nucleico: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcc (SEQ ID NO: 29).
[0132] Também são divulgadas sequências de ácido nucleico (por exemplo, cDNA) codificantes das proteínas de fusão insulina-Fc de SEQ ID NOs: 032, 034, 036, 038, e 040.
[0133] No exemplo de realização que compreende a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32, a sequência de ácido nucleico (sequência líder sublinhada) é: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagccc aaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagacc ccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaag agcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaag caattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggg gccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagc cttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggag cccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaatt gagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataa ccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 31)
[0134] No exemplo de realização que compreende a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34, a sequência de ácido nucleico (sequência líder sublinhada) é: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag
61 / 175 gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcaacggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggc gggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaag cccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaag accccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccggg aagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaagggg aagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggcca ggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtc agccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcag gagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagca aattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgc ataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 33)
[0135] No exemplo de realização que compreende a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 36, a sequência de ácido nucleico (sequência líder sublinhada) é: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagccc aaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagacc ccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaag agcagttctcaggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagc aattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccagggg ccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagcc ttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagc ccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaatt gagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataa
62 / 175 ccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 35)
[0136] No exemplo de realização que compreende a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38, a sequência de ácido nucleico (sequência líder sublinhada) é: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaa ggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctga cgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagtt caacagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttca agtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagc cgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtga catgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagccc gagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgag cgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacag ccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag (SEQ ID NO: 37)
[0137] No exemplo de realização que compreende a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40, a sequência de ácido nucleico (sequência líder sublinhada) é: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaa ggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctga cgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagtt
63 / 175 cagcagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttca agtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagc cgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtga catgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagccc gagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgag cgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacag ccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag (SEQ ID NO: 39) PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC
[0138] Em exemplos de realização, uma proteína de fusão pode ser expressa por uma célula, conforme descrito em mais detalhes na seção de Exemplos.
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO
[0139] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc pode ser expressa de forma recombinante, por exemplo, em uma célula eucariótica, por exemplo, célula de mamífero ou célula de não mamífero.
Células de mamífero exemplares usadas para expressão incluem células HEK (por exemplo, células HEK293) ou células CHO. As células CHO podem ser subdivididas em várias cepas ou subclasses, (por exemplo, CHO DG44, CHO- H, e células CHO-K1), e algumas destas cepas podem ser geneticamente manipuladas para uma utilização ótima com um tipo particular de molécula de ácido nucleico (por exemplo, um vetor que compreende DNA) ou uma composição de meio de crescimento celular particular, conforme descrito na seção de Exemplos. Em exemplos de realização, as células são transfectadas com uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, vetor, codificando a proteína de fusão insulina-Fc (por exemplo, onde toda a proteína de fusão insulina-Fc é codificada por uma única molécula de ácido nucleico). Nos exemplos de realização, as células HEK293 são transfectadas com um vetor que codifica para a proteína de fusão insulina-Fc, mas apenas resulta na
64 / 175 expressão temporária da proteína de fusão insulina-Fc por um período de tempo (por exemplo, 3 dias, 4 dias, 5, dias, 7 dias, 10 dias, 12 dias, 14 dias ou mais) antes de a célula hospedeira parar de expressar níveis apreciáveis da proteína de fusão insulina-Fc (ou seja, transfecção transitória). As células HEK293 que são transitoriamente transfectadas com sequências de ácido nucleico que codificam para proteínas de fusão insulina-Fc muitas vezes permitem uma produção mais rápida de proteínas recombinantes que facilita a produção e triagem de vários candidatos à proteína de fusão insulina-Fc. Em exemplos de realização, as células CHO são transfectadas com um vetor que é permanentemente incorporado no DNA da célula hospedeira e leva à expressão consistente e permanente (ou seja, transfecção estável) da proteína de fusão insulina-Fc, desde que as células sejam cultivadas de forma adequada. As células CHO e linhagens de células CHO que são transfectadas de forma estável com ácidos nucleicos que codificam para proteínas de fusão insulina-Fc frequentemente demoram mais tempo para desenvolver, mas frequentemente produzem rendimentos mais elevados de proteína e são mais adequadas para a fabricação de produtos de baixo custo (por exemplo, produtos para uso em mercado farmacêutico veterinário). As células e linhagens celulares podem ser cultivadas usando métodos padrão do estado da técnica. Em exemplos de realização preferidos, as células HEK que compreendem qualquer um das sequências de cDNA de SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, e 39 são utilizadas para expressar proteínas de fusão insulina-Fc. Em exemplos de realização preferidos, as células CHO que compreendem qualquer um das sequências de cDNA de SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, e 39 são utilizadas para expressar proteínas de fusão insulina-Fc.
[0140] Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão insulina-Fc é purificada ou isolada a partir das células (por exemplo, por lise das células). Em outros exemplos de realização, a proteína de fusão insulina-
65 / 175 Fc é secretada pelas células e purificada ou isolada a partir do meio de cultura celular no qual as células foram cultivadas. A purificação da proteína de fusão insulina-Fc pode incluir a utilização de cromatografia em coluna (por exemplo, cromatografia de afinidade) ou utilizar outros métodos de separação baseados em diferenças no tamanho, carga e/ou afinidade para certas moléculas. Em exemplos de realização, a purificação da proteína de fusão insulina-Fc envolve a seleção ou enriquecimento de proteínas contendo um fragmento Fc, por exemplo, usando esferas de Proteína A ou uma coluna de Proteína A que faz com que as proteínas contendo um fragmento Fc se tornem ligadas com alta afinidade em solução de pH neutro na proteína A covalentemente conjugada com as esferas de proteína A. A proteína de fusão insulina- Fc ligada pode então ser eluída das esferas de Proteína A por uma mudança em uma variável de solução (por exemplo, uma diminuição no pH da solução). Outros métodos de separação, como cromatografia de troca iônica e/ou cromatografia de filtração em gel, também podem ser empregados alternativamente ou adicionalmente. Em exemplos de realização, a purificação da proteína de fusão insulina-Fc compreende ainda a filtração ou a centrifugação da preparação de proteínas. Em exemplos de realização, a purificação adicional da proteína de fusão insulina-Fc compreende dialfiltração, ultrafiltração e filtração através de membranas porosas de vários tamanhos, bem como formulação final com excipientes.
[0141] A proteína de fusão insulina-Fc purificada pode ser caracterizada, por exemplo, quanto à pureza, rendimento da proteína, estrutura e/ou atividade, usando uma variedade de métodos, por exemplo, absorbância a 280 nm (por exemplo, para determinar o rendimento da proteína), eletroforese capilar ou de exclusão por tamanho (por exemplo, para determinar o peso molecular, porcentagem de agregação e/ou pureza), espectrometria de massa (MS) e/ou cromatografia líquida (LC-MS) (por exemplo, para determinar pureza
66 / 175 e/ou glicosilação), e/ou ELISA (por exemplo, para determinar a extensão da ligação, por exemplo, afinidade, a um anticorpo anti-insulina). Também são descritos métodos exemplificativos de caracterização na seção de Exemplos.
[0142] Em exemplos de realização, o rendimento de proteína de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células HEK transitoriamente transfectadas e purificação em proteína A é maior do que 5 mg/L, 10 mg/L ou 20 mg/L. Em exemplos de realização preferidos, o rendimento de proteína de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células HEK transitoriamente transfectadas e purificação em proteína A é maior que 50 mg/L (por exemplo, maior do que 60 mg/L, maior do que 70 mg/L, maior do que 80 mg/L, maior do que 90 mg/L, maior do que 100 mg/L). Em exemplos de realização, a % de homodímero de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células HEK transitoriamente transfectadas e purificação em proteína A é maior que 70% (por exemplo, maior que 80%, maior que 85%, maior que 90%, maior que 95%, maior que 96%, maior que 97%, maior que 98%, maior que 99%). Em exemplos de realização, o título de homodímero de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células HEK transitoriamente transfectadas e purificada em proteína A, calculado como o produto entre o rendimento da proteína de fusão insulina-Fc e a % de homodímero é maior que 50 mg/L (por exemplo, maior que 60 mg/L, maior que 70 mg/L, maior que 80 mg/L, maior que 90 mg/L, maior que 100 mg/L). Apenas os candidatos com um título de homodímero maior que 50 mg/L foram considerados úteis na presente invenção, pois a experiência tem demonstrado que títulos de homodímero menores do que este nível provavelmente não irão resultar em títulos de produção comercial em células CHO que atendam aos requisitos de baixo custo de fabricação para produtos veterinários.
[0143] Em exemplos de realização, o rendimento da proteína de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células CHO
67 / 175 transfectadas de forma estável (por exemplo, linhagens de células CHO ou clones de células CHO) e a purificação da proteína A é superior a 100 mg de proteína de fusão insulina-Fc por L (por exemplo, mg/L de meio de cultura). Em exemplos de realização preferidos, o rendimento da proteína de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células CHO transfectadas de forma estável (por exemplo, linhagens de células CHO ou clones de células CHO) e a purificação da proteína A é superior a 150 mg de proteína de fusão insulina- Fc/L de meio de cultura (por exemplo, maior que 200 mg/L, maior que 300 mg/L, maior que 400 mg/L, maior que 500 mg/L, maior que 600 mg/L ou mais).
Nos exemplos de realização, a % de homodímero de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células CHO transfectadas de forma estável (por exemplo, linhagens de células CHO ou clones de células CHO) e a purificação da proteína A é superior a 70% (por exemplo, superior a 80%, superior a 85%, maior que 90%, maior que 95%, maior que 96%, maior que 97%, maior que 98%, maior que 99%). Em exemplos de realização, o título de homodímero de uma proteína de fusão insulina-Fc após a produção em células CHO transfectadas de forma estável (por exemplo, linhagens de células CHO ou clones de células CHO) e purificação em proteína A, calculada como o produto entre o rendimento da proteína de fusão insulina-Fc e a % homodímero é maior que 150 mg/L (por exemplo, maior que 200 mg/L, maior que 300 mg/L, maior que 400 mg/L, maior que 500 mg/L, maior que 600 mg/L ou mais).
CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC
[0144] São descritos métodos para a interação com receptores de insulina para baixar a glicose sanguínea em animais de companhia (por exemplo, cães ou gatos), em que o método compreende a administração a um sujeito de uma proteína de fusão insulina-Fc, por exemplo, uma proteína de fusão descrita na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, o sujeito foi diagnosticado com diabetes (por exemplo, diabetes canina ou
68 / 175 diabetes felina).
[0145] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção liga-se ao receptor de insulina com uma afinidade apreciável, conforme medido pela IC50 no ensaio de ligação ao receptor de insulina IM-9 4ºC descrito no Exemplo 7 (por exemplo, IC50 inferior a 5000 nM, IC50 inferior a 4000 nM, IC50 inferior a 3000 nM, IC50 inferior a 2500 nM). Com base no experimento, apenas compostos que exibem atividade sobre o receptor de insulina com valores de IC50 inferiores a 5000 nM são considerados com a probabilidade de apresentar bioatividade na espécie em questão. Em geral, a ligação ao receptor de insulina de maior afinidade (isto é, com valores de IC50 mais baixos) é preferida. No entanto, é bem conhecido que a depuração da insulina e de seus análogos (por exemplo, polipeptídeos de insulina descritos na presente invenção) é governada principalmente pela ligação ao receptor de insulina seguida pela internalização e degradação do receptor de insulina na célula. Portanto, as proteínas de fusão insulina-Fc com afinidade de ligação ao receptor de insulina muito alta (ou seja, IC50 muito baixa) podem ser eliminadas muito rapidamente da circulação, resultando em uma duração inferior à desejada de bioatividade de redução de glicose no animal alvo.
[0146] Em exemplos de realização, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção é capaz de baixar os níveis de glicose (por exemplo, níveis de glicose sanguíneos) após administração em um sujeito. Em exemplos de realização, a atividade de redução da glicose da proteína de fusão insulina-Fc é maior do que a de um padrão de referência de insulina. Em alguns exemplos de realização, a duração da atividade da proteína de fusão insulina-Fc pode ser medida por uma diminuição, por exemplo, uma diminuição estatisticamente significativa, na glicose no sangue em jejum em relação a um nível de glicose sanguínea em jejum de pré-dose.
69 / 175 Em exemplos de realização, a duração da atividade da proteína de fusão insulina-Fc (por exemplo, o tempo durante o qual há uma diminuição estatisticamente significativa no nível de glicose no sangue em jejum em um sujeito em relação a um nível de pré-dose) é maior do que cerca de 2 horas.
Em exemplos de realização, a duração da atividade da proteína de fusão insulina-Fc (por exemplo, o tempo durante o qual há uma diminuição estatisticamente significativa no nível de glicose no sangue em um sujeito em relação a um nível de pré-dose) é superior a cerca de 6 horas, 9 horas, 12 horas, 18 horas, 1 dia, 1,5 dias, 2 dias, 2,5 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais. Em exemplos de realização, a proteína de fusão insulina-Fc é de ação prolongada (por exemplo, tem uma meia-vida longa, por exemplo, no soro).
[0147] Em exemplos de realização, a meia-vida sérica da proteína de fusão insulina-Fc no animal alvo (por exemplo, cão ou gato) é maior do que a de um padrão de referência de insulina ou formulação de controle. Em exemplos de realização, a meia-vida sérica da proteína de fusão insulina-Fc (por exemplo, no sangue de um sujeito após a administração) no animal alvo (por exemplo, cão ou gato) é maior do que cerca de 2 horas. Em exemplos de realização, a meia-vida sérica da proteína de fusão insulina-Fc no animal alvo (por exemplo, cão ou gato), é cerca de 0,5 dia, 1 dia, 2 dias, ou 2,5 dias. Em exemplos de realização preferidos, a meia-vida sérica da proteína de fusão insulina-Fc no animal alvo (por exemplo, cão ou gato) é de cerca de 3 dias ou mais.
[0148] Em exemplos de realização, a combinação de potência e duração de bioatividade pode ser quantificada pelo cálculo da área sobre a curva de porcentagem de glicose no sangue em jejum (%FBGL) normalizada para uma determinada dose em mg/kg (NAOC) com unidades de %FBGL dias kg/mg. Em exemplos de realização, a NAOC da proteína de fusão insulina-Fc é
70 / 175 maior que 150 %FBGL dias kg/mg (por exemplo, maior que 200 %FBGL dias kg/mg, maior que 250 %FBGL dias kg/mg ou mais). Novamente, com base na experiência, em valores NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg, os requisitos de dose nas espécies alvo serão suficientemente baixos para atingir um custo de tratamento aceitável. Em exemplos de realização, a NAOC da proteína de fusão insulina-Fc deve ser mantida após a dosagem repetida nas espécies alvo (ou seja, a proporção da NAOC após a terceira dose para a NAOC após a primeira dose da proteína de fusão insulina-Fc é maior que 0,50, por exemplo, maior que 0,60, maior que 0,70. maior que 0,80, maior que 0,90 ou mais).
[0149] Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão insulina-Fc descritos na presente invenção liga-se ao receptor Fc(gama) com uma afinidade que é menor do que o de um padrão de referência de insulina proteína de fusão-Fc tal como medido de acordo com o Exemplo 8. Em alguns exemplos de realização, a razão da afinidade do receptor Fc(gama) da proteína de fusão insulina-Fc para aquela de um padrão de referência de proteína de fusão insulina-Fc é menor que 0,50 (por exemplo, menor que 0,40, menor que 0,30, menor que 0,20)
MÉTODOS DE TRATAMENTO E CARACTERÍSTICAS DA SELEÇÃO DE SUJEITOS
[0150] São descritos na presente invenção métodos para o tratamento do diabetes (por exemplo, diabetes canino ou diabetes felino), cujos métodos compreendem a administração de uma proteína de fusão insulina-Fc (por exemplo, uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção) a um sujeito.
[0151] Em exemplos de realização, um padrão de referência usado em qualquer método aqui descrito compreende um tratamento de referência ou terapia de referência. Em alguns exemplos de realização, a referência compreende um agente de cuidado padrão para o tratamento do
71 / 175 diabetes (por exemplo, um agente padrão de cuidado para diabetes canino ou um agente padrão de cuidado para diabetes felino). Em alguns exemplos de realização, o padrão de referência é uma insulina ou análogo de insulina disponível comercialmente. Em alguns exemplos de realização, o padrão de referência compreende uma insulina de longa duração, insulina de duração intermediária, insulina de curta duração, insulina de ação rápida, insulina de ação curta, ação intermediária e de ação longa. Em alguns exemplos de realização, o padrão de referência compreende Vetsulin®, Prozinc®, insulina NPH, insulina glargina (Lantus®), ou insulina humana recombinante.
[0152] Em exemplos de realização, um padrão de referência usado em qualquer método descrito inclui um resultado, por exemplo, o resultado aqui descrito, de uma terapia de diabetes (por exemplo, uma terapia de diabetes canino ou uma terapia de diabetes felino).
[0153] Em exemplos de realização, um padrão de referência é um nível de um marcador (por exemplo, glicose no sangue ou frutosamina) no sujeito antes do início de uma terapia, por exemplo, uma terapia de proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção; onde o sujeito tem diabetes.
Em exemplos de realização, o nível de glicose no sangue em um animal de companhia (por exemplo, cão ou gato) é maior que 200 mg/dL (por exemplo, maior que 250 mg/dL, 300 mg/dL, 350 mg/dL, 400 mg/dL ou mais) antes do início da terapia. Em exemplos de realização, o nível de frutosamina em um animal de companhia (por exemplo, cão ou gato) é maior que 250 micromoles/L, 350 micromoles/L (por exemplo, maior que 400 micromoles/L, 450 micromoles/L, 500 micromoles/L, 550 micromoles/L, 600 micromoles/L, 650 micromoles/L, 700 micromoles/L, 750 micromoles/L ou mais) antes do início da terapia. Em exemplos de realização, um padrão de referência é uma medida da presença progressão ou da severidade da doença. Em exemplos de realização, um padrão de referência é uma medida da presença ou da
72 / 175 gravidade dos sintomas da doença antes do início de uma terapia, por exemplo, uma terapia com a proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção, por exemplo, quando o sujeito tem diabetes.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO
[0154] São fornecidas composições farmacêuticas contendo uma proteína de fusão insulina-Fc descrita na presente invenção que pode ser usada para diminuir a glicose sanguínea em animais de companhia (por exemplo, cães ou gatos). A quantidade e concentração da proteína de fusão insulina-Fc nas composições farmacêuticas, bem como a quantidade da composição farmacêutica administrada a um sujeito, podem ser selecionadas com base em fatores clinicamente relevantes, tais como características medicamente relevantes do sujeito (por exemplo, idade, peso, gênero, outras condições médicas e semelhantes), a solubilidade dos compostos nas composições farmacêuticas, a potência e atividade dos compostos e o modo de administração das composições farmacêuticas. Para mais informações sobre as Rotas de Administração e Dosagem, o leitor deve consultar o Capítulo
25.3 no Volume 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Presidente do Conselho Editorial), Pergamon Press 1990.
[0155] As formulações da presente divulgação incluem aquelas adequadas para administração parenteral. As frases “administração parenteral” e “administrado parenteralmente”, tal como utilizadas na presente invenção, significam modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção intravenosa ou subcutânea.
[0156] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de
73 / 175 etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos, por exemplo, tensoativos similares ao Tween. Em alguns exemplos de realização, a composição farmacêutica (por exemplo, como a descrita na presente invenção) compreende um tensoativo tipo Tween, por exemplo, polissorbato 20, Tween- 20, ou Tween-80. Em alguns exemplos de realização, a composição farmacêutica (por exemplo, como a descrita na presente invenção) compreende um tensoativo tipo Tween, por exemplo, Tween-80, a uma concentração entre cerca de 0,001% e cerca de 2%, ou entre cerca de 0,005% e cerca de 0,1% ou entre cerca de 0,01% e cerca de 0,5%.
[0157] Em alguns exemplos de realização, a concentração da proteína de fusão insulina-Fc no transportador (veículo) aquoso é de cerca de 3 mg/mL. Em alguns exemplos de realização, a concentração da proteína de fusão insulina-Fc no transportador aquoso é de cerca de 6 mg/mL. Em alguns exemplos de realização, a concentração da proteína de fusão insulina-Fc no transportador aquoso é de cerca de 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 12 mg/mL, 15 mg/mL ou mais.
[0158] Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão insulina-Fc é administrada como um bolus, infusão ou um impulso intravenoso.
Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão é administrada por injeção utilizando seringa, bomba, caneta, agulha ou cateter permanente. Em alguns exemplos de realização, a proteína de fusão insulina-Fc é administrada como um bolus, infusão ou injeção intravenosa. Os métodos de introdução também podem ser fornecidos por dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis. Vários dispositivos poliméricos de liberação lenta foram desenvolvidos e testados in vivo nos últimos anos para o fornecimento controlado de medicamentos, incluindo biofármacos de proteína. Pode ser
74 / 175 utilizada uma variedade de polímeros biocompatíveis (incluindo hidrogéis), incluindo tanto polímeros biodegradáveis como não degradáveis, para formar um implante para a libertação prolongada de um composto em um determinado local alvo.
DOSAGENS
[0159] Os níveis de dosagem reais da proteína de fusão insulina- Fc podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um sujeito particular (por exemplo, cão ou gato). O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade da proteína de fusão particular empregada, ou o éster, sal ou amida do mesmo, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular a ser empregado, da duração do tratamento, de outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com a proteína de fusão empregada, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico prévio do sujeito a ser tratado, de fatores semelhantes também conhecidos nas artes médicas.
[0160] Em geral, uma dose adequada de uma proteína de fusão insulina-Fc será a quantidade que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. Geralmente, as doses intravenosas e subcutâneas da proteína de fusão insulina-Fc para um cão ou gato irão variar de cerca de 0,001 a cerca de 1 mg por quilograma (por exemplo, mg/kg) de peso corporal por dia, por exemplo, cerca de 0,001 a 1 mg/kg/dia, cerca de 0,01 a 0,1 mg/kg/dia, cerca de 0,1 a 1 mg/kg/dia, ou cerca de 0,01 a 1 mg/kg/dia. Em outros exemplos de realização, a proteína de fusão é administrada em uma dose entre 0,025 e 4 mg por quilograma de peso corporal por semana, por exemplo, entre 0,025 e 0,5 mg/kg/semana.
75 / 175
[0161] A presente divulgação contempla a formulação da proteína de fusão insulina-Fc em qualquer uma das composições farmacêuticas e preparações mencionadas acima. Além disso, a presente divulgação contempla a administração através de qualquer uma das vias de administração anteriores.
Um especialista versado na técnica pode selecionar a formulação e via de administração apropriadas com base na condição a ser tratada e na saúde geral, idade e tamanho do paciente a ser tratado.
EXEMPLOS
[0162] A presente tecnologia é adicionalmente ilustrada pelos Exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como limitantes da invenção.
MÉTODOS GERAIS, ENSAIOS E MATERIAIS EXEMPLO 1 SÍNTESE E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC EM CÉLULAS HEK293
[0163] As proteínas de fusão insulina-Fc foram sintetizadas da seguinte forma. Uma sequência gênica de interesse foi construída utilizando o software proprietário (LakePharma, Belmont, CA) e foi clonada em um vetor de alta expressão em mamíferos. As células HEK293 foram semeadas em um frasco com agitação por 24 horas antes da transfecção e cresceram utilizando meio quimicamente definido sem soro. Uma construção de expressão de DNA que codifica a proteína de fusão insulina-Fc foi transitoriamente transfectada em uma suspensão de 2 L de células HEK293 utilizando o procedimento de operação padrão (LakePharma, Belmont, CA) para transfecção transitória.
Após 20 horas, as células foram contadas para determinar a viabilidade e contagem de células viáveis, e o título foi medida com o kit FortéBio® Octeto® (Pall FortéBio LLC, Fremont, CA). Leituras adicionais foram tomadas ao longo do ciclo de produção da transfecção transitória. A cultura foi coletada no ou
76 / 175 após o dia 5.
EXEMPLO 2 SÍNTESE E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC EM
CÉLULAS CHO
[0164] Uma linhagem de células CHO foi originalmente derivada da CHO-K1 (LakePharma, Belmont, CA), e os genes da glutamina sintetase endógena (GS) foram deletados por tecnologia recombinante utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Vetores de DNA de expressão estável foram concebidos e otimizados para expressão em CHO e seleção por GS e incorporados em um vetor para células de mamíferos de alta expressão (LakePharma, Belmont, CA). A sequência de cada construção completa foi confirmada antes do início dos experimentos de expansão. As células CHO adaptadas para cultivo em suspensão foram cultivadas em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37ºC em um meio quimicamente definido (CD OptiCHO™, Invitrogen, Carlsbad, CA). Nenhum soro ou outros produtos derivados de animais foram utilizados na cultura de células CHO.
[0165] Aproximadamente 80 milhões de células CHO adaptadas para cultivo em suspensão, crescendo em meio CD OptiCHO™ durante a fase de crescimento exponencial foram transfectadas por eletroporação utilizando o sistema MaxCyte® STX® (MaxCyte, Inc., Gaithersburg, MD) com 80 μg de DNA para um criar uma linhagem de células CHO estável para cada proteína de fusão insulina-Fc (a construção de DNA contém a sequência completa da proteína de fusão insulina-Fc). Após vinte e quatro horas, as células transfectadas foram contadas e colocadas sob seleção para integração estável dos genes de fusão insulina-Fc. As células transfectadas foram semeadas em meio de seleção CD OptiCHO contendo 0-100 μM de metionina sulfoximina (MSX) em densidade celular de 0,5 x 106 células/mL em frasco agitador e incubadas a 37ºC com 5% CO2. Durante um processo de seleção, as células
77 / 175 foram centrifugadas e resuspensas em meios de seleção frescos a cada 2-3 dias até que o pool de células CHO estáveis recuperasse sua taxa de crescimento e viabilidade. A cultura celular foi monitorada quanto ao crescimento e título.
[0166] As células foram cultivadas até uma densidade de 2,5 × 106 células por mL. No momento da coleta para o banco de celular, a viabilidade estava acima de 95%. As células foram então centrifugadas e o sedimento celular foi resuspenso em meio CD OptiCHO com 7,5% de dimetil sulfóxido (DMSO) para uma contagem de células de 15 × 10 6 células por mL por frasco. Os frascos foram criopreservados por armazenamento em nitrogênio líquido.
[0167] Uma produção em pequena escala foi realizada usando as células CHO da seguinte forma. As células foram submetidas a um aumento de escala para produção em meio de crescimento CD OptiCHO contendo 100 μM de MSX a 37ºC e alimentadas cada 2-4 dias conforme necessário, com meio de crescimento CD OptiCHO suplementado com glicose e aminoácidos adicionais conforme necessário por aproximadamente 14- 21 dias. O sobrenadante dos meios condicionados coletados do pool estável de produção foi clarificado por centrifugação. A proteína foi passada por uma coluna de Proteína A (MabSelect, GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) pré- equilibrada com tampão de ligação. O tampão de lavagem foi então passado através da coluna até que o valor OD280 (NanoDrop, Thermo Scientific) foi medido para estar no nível ou próximo aos níveis de fundo. A proteína de fusão insulina-Fc foi eluída utilizando um tampão de eluição de pH baixo, e as frações foram coletadas, e o valor de cada fração de OD280 foi registrado. As frações contendo a proteína de fusão insulina-Fc alvo foram agrupadas e, opcionalmente, ainda filtradas usando um filtro de membrana de 0,2 μM.
[0168] A linhagem de células foi opcionalmente subclonada para
78 / 175 monoclonalidade e opcionalmente adicionalmente selecionada para clones com alta expressão da proteína de fusão insulina-Fc utilizando o método de diluição limitante, um método conhecido pelos especialistas na técnica. Após a obtenção de uma linhagem de células monoclonal expressando a proteína de fusão insulina-Fc em altos títulos, a produção da proteína de fusão insulina-Fc foi realizada conforme descrito acima em meio de crescimento sem MSX, ou opcionalmente em meio de crescimento contendo MSX, para a obtenção de um sobrenadante de cultura celular contendo a proteína de fusão insulina-Fc recombinante produzida com CHO. A concentração de MSX foi opcionalmente aumentada ao longo do tempo para exercer seletividade adicional para clones capazes de render títulos de produto mais elevados.
EXEMPLO 3 PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC
[0169] A purificação de uma proteína de fusão insulina-Fc foi realizada da seguinte forma. Os sobrenadantes dos meios condicionados contendo a proteína de fusão insulina-Fc secretada foram coletados a partir das culturas de produção de células HEK transfectadas de maneira estável ou transitória e foram clarificados por centrifugação. O sobrenadante contendo a proteína de fusão insulina-Fc desejada foi passado em uma coluna de Proteína A ou Proteína G e eluído usando um gradiente de pH baixo. Opcionalmente, a recuperação das proteínas de fusão insulina-Fc pôde ser reforçada pelo recarregamento do eluente de Proteína A ou Proteína G inicial novamente em uma segunda coluna de Proteína A ou Proteína G. Posteriormente, as frações eluídas foram reunidas e o tampão foi trocado por 200 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 50 mM de NaOAc, pH 7,0. Uma etapa final de filtração foi realizada usando um filtro de membrana de 0,2 μm. A concentração final de proteína foi calculada a partir da densidade óptica da solução a 280 nm. A purificação adicional opcional por cromatografia de troca iônica (por exemplo, usando uma
79 / 175 resina em esfera de troca aniônica ou de troca catiônica), cromatografia de filtração em gel ou outros métodos, foi realizada conforme necessário.
EXEMPLO 4 CONFIRMAÇÃO DE ESTRUTURA POR CE-SDS SOB CONDIÇÕES REDUTORAS E NÃO
REDUTORAS
[0170] A análise por eletroforese capilar de dodecil sulfato de sódio (CE-SDS) foi realizada em um LabChip® GXII (Perkin Elmer, Waltham, MA) em uma solução de uma proteína de fusão insulina-Fc purificada dissolvida em HEPES 200 mM, NaCl 100 mM, NaOAc 50 mM, pH 7,0 e o eletroferograma foi plotado. Sob condições não redutoras, a amostra foi corrida contra padrões de proteína de peso molecular (PM) conhecidos, e o pico de eluição representou o PM 'aparente' do homodímero de proteína de fusão insulina-Fc.
[0171] Sob condições redutoras (por exemplo, utilizando beta- mercaptoetanol para quebrar ligações de bissulfeto do homodímero de fusão insulina-Fc), o PM aparente do monômero da proteína de fusão insulina-Fc resultante foi comparado com metade do peso molecular do homodímero da proteína de fusão insulina-Fc como uma maneira de determinar que a pureza estrutural da proteína de fusão insulina-Fc provavelmente está correta.
EXEMPLO 5 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA POR LC-MS COM REMOÇÃO DE GLICANO
[0172] Para obter uma estimativa precisa da massa de insulina-Fc via espectroscopia de massa (MS), a amostra é primeiramente tratada para remover o glicano de ocorrência natural que poderia interferir com a análise de MS. 100 µL de uma proteína de fusão insulina-Fc a 2,5 mg/mL em tampão HEPES 200 mM, NaCl 100 mM, NaOAc 50 mM, pH 7,0, são primeiramente trocados de tampão por Tris 0,1 M, pH 8,0 contendo 5 mM de EDTA usando um Coluna de dessalinização Zeba (Pierce, ThermoFisher Scientific, Waltham,
80 / 175 MA). 1,67 µL de enzima PNGase F (Prozyme N-glicanase) são adicionados a esta solução a fim de remover o glicano N-ligado presente na proteína de fusão (por exemplo, glicano ligado à cadeia lateral da asparagina localizada no sítio cNg-N), e a mistura é incubada a 37ºC durante a noite em uma incubadora. A amostra é então analisada por LC-MS (NovaBioassays, Woburn, MA) resultando em uma massa molecular da molécula que corresponde ao homodímero desejado sem o glicano. Esta massa é então adicionalmente corrigida, uma vez que o processo enzimático usado para clivar o glicano a partir da asparagina cNg também desamina a cadeia lateral de asparagina para formar um ácido aspártico, e ao fazê-lo o homodímero tratado enzimaticamente ganha 2 Da totais, correspondente a uma massa de 1 Da para cada cadeia presente no homodímero. Portanto, a massa molecular real é a massa medida menos 2 Da para corrigir a modificação enzimática da estrutura da proteína de fusão insulina-Fc na amostra analítica.
EXEMPLO 6 % DE HOMODÍMERO POR CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO
[0173] A cromatografia de exclusão por tamanhos (SEC-HPLC) das proteínas de fusão insulina-Fc foi realizada utilizando um sistema HPLC Waters 2795HT (Waters Corporation, Milford, MA) com arranjo de fotodiodo 2998 Photodiode a um comprimento de onda de 280 nm. 100 μL ou menos de uma amostra contendo uma proteína de fusão insulina-Fc de interesse foi injetada em uma coluna MAbPac SEC-1, 5 μm, 4 x 300 mm (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) operando a uma velocidade de fluxo 0,2 mL/min e com uma fase móvel compreendendo 50 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl e 0,05% p/v de azida sódica, pH 6,2. A coluna MAbPac SEC-1 opera no princípio da separação de tamanho molecular. Assim, os agregados de insulina-Fc solúveis maiores (por exemplo, multímeros de homodímeros da proteína de fusão insulina-Fc) eluíram em tempos de retenção mais precoces e
81 / 175 os homodímeros não agregados eluíram em tempos de retenção posteriores.
Ao separar a mistura de homodímeros a partir de homodímeros multiméricos agregados através da SEC-HPLC analítica, determinou-se a pureza da solução de proteína de fusão insulina-Fc em termos da percentagem de homodímero não agregado.
EXEMPLO 7 LIGAÇÃO AO RECEPTOR DE INSULINA DE IM-9 IN VITRO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC EXEMPLAR À 4ºC
[0174] As células IM-9 humanas (ATTC# CCL-159) que expressam o receptor de insulina humana foram cultivadas e mantidas em meio RPMI com 5% de SBF completo a 70-80% de confluência. As culturas de células IM-9 foram centrifugadas a 250×g (~ 1000 rpm) por 10 min para sedimentar as células. As células foram lavadas uma vez com HBSS ou tampão PBS, ressuspensas em meio de coloração FACS frio (HBSS/2mM EDTA/0,1% Na-azida + 4% soro de cavalo) a uma concentração de 8 × 10 6 células/mL e mantidas em gelo ou 4ºC até que as soluções teste fossem feitas.
A proteína insulina-Fc foi diluída em tampão FACS em diluições seriadas 1:3 como 2 × concentrações em tubos de 1,2 mL (aprox. 60 μL de volume de cada diluição), e as soluções foram mantidas frias em gelo até estarem prontas para a pipetagem.
[0175] RHI biotinilado foi diluído em meio de coloração FACS para uma concentração de 1,25 μg/mL. 40 µL do composto teste diluído em série e 8 µL de Biotina-RHI a 1,25 µg/mL foram adicionados a cada poço de uma placa de microtitulação de fundo em V, misturados em vortex lento e colocados em gelo. 40 µL de uma suspensão de células IM-9 (8 × 106 células/mL) foram então adicionados a cada poço por pipeta multicanal, misturados novamente suavemente e incubados em gelo por 30 min para permitir a ligação competitiva no receptor de insulina sobre IM-9 células. As células foram então
82 / 175 lavadas duas vezes com 275 µL de tampão de lavagem FACS gelado (HBSS/EDTA 2 mM/Na-azida 0,1% + soro de cavalo 0,5%) por centrifugação das placas de poços com fundos em V a 3000 rpm por 3 min e aspiração do sobrenadante. As células foram então ressuspensas em 40 µL de meio de coloração FACS contendo estreptavidina-PE diluída 1:100 (Life Technologies) por 20 min em gelo. As células foram então lavadas uma vez com 275 µL de tampão FACS gelado e finalmente fixadas com paraformaldeído a 3% durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas uma vez com 275 µL de tampão FACS gelado e ressuspensas em 250 µl de tampão FACS para análise.
[0176] As placas de fundo em V contendo células foram então analisadas em um citômetro de fluxo Guava 8-HT (Millipore). A ligação de RHI biotinilada ao receptor de insulina foi quantificada pela intensidade de fluorescência média (MFI) das células no FACS canal FL-2 para cada concentração do composto teste. Os poços de controle foram marcados apenas com RHI biotinilado e foram usados para calcular a percentagem (%) de inibição resultante de cada concentração de composto de teste. A % de inibição por compostos teste da ligação de RHI biotinilada em células IM-9 foi representada graficamente contra as concentrações (em log) do composto teste, e as IC50 resultantes foram calculadas utilizando o programa GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) para os compostos teste. Assim, os valores de IC50 mais baixos do composto teste indicam níveis mais elevados de inibição de RHI biotinilada em concentrações mais baixas que indicam forte ligação da proteína de fusão insulina-Fc para o receptor de insulina. Um composto de controle, tal como insulina humana recombinante (RHI) não marcada, também foi usado como padrão interno para gerar uma IC 50 da RHI contra a qual uma IC50 de um determinado composto poderia ser comparada (IC50 (composto)/IC50 (RHI)). Razões de IC50 mais baixas têm ligação mais
83 / 175 semelhante a da RHI (ligação mais forte ao receptor de insulina), enquanto razões de IC50 mais altas têm ligação mais fraca ao receptor de insulina em relação à RHI.
EXEMPLO 8 ENSAIO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC(GAMA)I IN VITRO
[0177] A ligação da proteína de fusão insulina-Fc ao receptor Fc(gama)I em pH 7,4 foi conduzida usando um ensaio ELISA da seguinte forma. Uma vez que nem o receptor Fc(gama)I canino nem receptor Fc(gama)I de felino está disponível comercialmente, o receptor Fc(gama) I humano (isto é, receptor rhFc(gama)I), foi usado como um receptor de mamífero substituto. Os compostos insulina-Fc foram diluídos para 10 µg/mL em tampão de bicarbonato de sódio a pH 9,6 e revestidos em placas de microtitulação Maxisorp (Nunc) durante a noite à 4ºC, em seguida as tiras de microplaca foram lavadas 5 vezes com PBST (PBS/Tween-20 a 0,05%) tampão e bloqueado com reagente de bloqueio Superblock (ThermoFisher). As diluições seriadas do receptor rhFc(gama)I biotinilado (Fc(gama) RI humano recombinante; R&D Systems) foram preparadas em PBST/10% de tampão Superblock de 6000 ng/mL até 8,2 ng/mL e carregadas a 100 μL/poço nas tiras de microplacas revestidas com a proteína de fusão insulina-Fc. A placa de microtitulação foi incubada durante 1 hora em temperatura ambiente e em seguida as tiras da microplaca foram lavadas 5 vezes com PBST e depois carregadas com 100 µL/poço de estreptavidina-HRP diluído 1:10.000 em PBST/tampão Superblock a 10%.
Após incubação por 45 min, as tiras da microplaca foram novamente lavadas por 5 vezes com PBST. TMB foi adicionado para revelar as proteínas do receptor Fc(gama)I ligadas e a reação foi interrompida com o reagente de parada de ELISA (Boston Bioproducts). A leitura da placa foi realizada em um leitor de placas de ELISA a 450 nm, e os valores de OD (proporcionais à ligação do receptor rhFc(gama)I à proteína insulina-Fc) foram representados
84 / 175 graficamente contra as concentrações log de receptor rhFc(gama)I adicionado a cada poço para gerar curvas de ligação usando o software GraphPad Prism.
EXEMPLO 9 MEDIÇÃO IN VITRO DA AFINIDADE DA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC PARA O
RECEPTOR FCRN DE CÃO
[0178] A afinidade de ligação in vitro da proteínas de fusão insulina-Fc contendo fragmentos Fc de IgG de origem canina ou felina para o receptor FcRn canino foi medida através de uma técnica de ELISA conduzida a um pH de 5,5. O pH ligeiramente ácido é o ambiente de ligação preferido para que as moléculas contendo fragmentos de Fc se liguem ao receptor FcRn. In vivo, as células expressam FcRn em suas superfícies e internamente nos endossomos. À medida que as moléculas contendo fragmentos Fc são trazidas para a célula por meio de processos naturais (por exemplo, pinocitose ou endocitose), o pH muda para um pH mais baixo nos endossomos, onde o receptor FcRn liga-se às moléculas contendo fragmentos Fc que de outra forma seriam degradados no endossoma - compartimentos lisossômicos, permitindo assim que essas moléculas reciclem de volta para a superfície celular, onde o pH está mais próximo do neutro (por exemplo, pH 7,0-7,4). O pH neutro desfavorece a ligação ao receptor FcRn e permite a liberação das moléculas contendo o fragmento Fc de volta para a circulação. Este é um mecanismo primário pelo qual moléculas contendo fragmentos Fc exibem meias-vidas farmacocinéticas circulatórias prolongadas in vivo.
[0179] Proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos de Fc canina ou origem felina foi diluída para 10 μg/mL em tampão bicarbonato de sódio pH 9,6 e revestidas em duplicatas em tiras de placas de ELISA Maxisorb por 1 - 2 horas à TA. As tiras foram então lavadas 4 vezes com tampão PBST (PBS/0,1% Tween-20) e bloqueadas com reagente de bloqueio Superblock (ThermoFisher). As tiras para ligação de FcRn foram então lavadas
85 / 175 novamente duas vezes com tampão MES/NaCl/Tween-20, pH 5,5 (MES 50 mM/NaCl 150 mM/Tween - 20 0,1%) antes da adição do reagente FcRn (FcRn canino biotinilado; Immunitrack). Uma vez que nenhum FcRn felino reagente comercialmente disponível foi encontrado, as proteínas de fusão insulina-Fc contendo ou um fragmento Fc canino ou um fragmento Fc felino foram usadas no ensaio para a ligação ao FcRn canino. As diluições em série (diluições 1:3X) de reagente FcRn biotinilado foram preparadas em tampão MES/NaCl/Tween/10% Superblock pH 5,5 em concentrações de 1000 ng/mL a 0,45 ng/mL e carregadas a 100 µL/poço usando um pipetador multicanal nas tiras revestidas com os compostos de proteína de fusão insulina-Fc. Em seguida, o ensaio final foi incubado durante 1 hora em temperatura ambiente.
As tiras de ligação ao FcRn foram lavadas 4 vezes com tampão MES/NaCl/Tween pH 5,5 e depois carregadas com 100 µL/poço de estreptavidina-HRP diluída 1:10000 em tampão MES/NaCl/Superblock 10%, pH 5,5. Após incubação durante 45 minutos, as tiras foram lavadas novamente 4 vezes com tampão MES/NaCl/Tween pH 5,5. TMB foi finalmente adicionado para revelar o reagente FcRn canino biotinilado ligado, e o desenvolvimento da cor foi interrompido com o reagente de parada ELISA. A placa foi lida em um leitor de placas de ELISA em um comprimento de onda de 450 nm. Os valores de densidade óptica (OD) (proporcional para a ligação de FcRn canino aos compostos teste de proteína de fusão insulina-Fc) foram representados graficamente contra as concentrações log de FcRn adicionados a cada poço para gerar curvas de ligação utilizando o software GraphPad Prism. Os valores de EC50 para cada curva de ligação foram calculados para a comparação entre os diferentes compostos.
EXEMPLO 10
PROCEDIMENTO GENERALIZADO PARA A DETERMINAÇÃO DA FARMACODINÂMICA (PD) IN VIVO APÓS ÚNICA ADMINISTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC
86 / 175 EM CÃES OU GATOS.
[0180] As proteínas de fusão insulina-Fc foram avaliadas quanto aos seus efeitos sobre os níveis de glicose sanguínea em jejum da seguinte forma. N = 1, 2, 3 ou mais cães, saudáveis, naïves para anticorpos, pesando aproximadamente 10-15 kg ou gatos pesando aproximadamente 5 kg foram usados para cada proteína de fusão insulina-Fc. Os animais também foram observados duas vezes ao dia quanto aos sinais de anafilaxia, letargia, angústia, dor, etc., e, opcionalmente para alguns compostos, o tratamento foi continuado por três injeções subcutâneas semanais adicionais ou mais para observar se a capacidade de redução da glicose dos compostos diminuía ao longo do tempo, um sinal chave da potencial indução de anticorpos antifármacos neutralizantes. No dia 0, os animais receberam uma injeção única por administração intravenosa ou subcutânea de uma composição farmacêutica contendo um homodímero de proteína de fusão insulina-Fc a uma concentração entre 1 e 10 mg/mL em uma solução de hidrogenofosfato de sódio entre 10-50 mM, 50-150 mM de cloreto de sódio, 0,005- 0,05% v/v de Tween-80, e, opcionalmente, um bacteriostato (por exemplo, fenol, m-cresol ou metilparabeno) a uma concentração de entre 0,02 - 1,00 mg/mL, em um pH de solução entre 7,0-8,0, a uma dose de 0,08-0,80 mg de proteína de fusão insulina-Fc / kg (ou aproximadamente equivalente a 1,2-12,3 nmol/kg ou aproximadamente equivalente a 0,4-4,0 U/kg de equivalente de insulina em base molar). No dia 0, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 dias após a injeção.
[0181] Para cada momento, foi coletado no mínimo 1 mL de sangue total. A leitura do nível de glicose foi realizada imediatamente em um glicosímetro (ACCU-CHEK® Aviva Plus), o que exigiu aproximadamente uma gota de sangue. As médias da % dos níveis de glicose sanguínea em jejum
87 / 175 (%FBGL) do dia 0 ao dia 7 foram representadas graficamente para avaliar a bioatividade de uma determinada proteína de fusão insulina-Fc.
EXEMPLO 11 PROCEDIMENTO GENERALIZADO PARA A DETERMINAÇÃO DA FARMACODINÂMICA (PD) IN VIVO APÓS ADMINISTRAÇÕES REPETIDAS DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC EM CÃES OU GATOS.
[0182] As proteínas de fusão insulina-Fc foram avaliadas quanto aos seus efeitos sobre os níveis de glicose sanguínea em jejum após injeções repetidas da seguinte forma. Foram utilizados cães ou gatos saudáveis, naïves para anticorpos, pesando aproximadamente entre 5 e 20 kg, e cada animal recebeu doses de uma proteína de fusão insulina-Fc. Os animais foram observados duas vezes ao dia quanto a sinais de anafilaxia, letargia, angústia, dor e outros efeitos colaterais negativos e, opcionalmente, para alguns compostos, o tratamento foi continuado por até duas a cinco injeções subcutâneas adicionais para observar se a capacidade de redução da glicose pelos compostos diminuíra ao longo do tempo, indicando uma possível presença de anticorpos antifármaco neutralizantes in vivo. No dia 0, os animais receberam uma injeção subcutânea única de uma composição farmacêutica contendo um homodímero de proteína de fusão insulina-Fc em uma solução de 10-50 mM de hidrogenofosfato de sódio, 50-150 mM de cloreto de sódio, 0,005- 0,05% v/v de Tween-80, e, opcionalmente, um bacteriostato (por exemplo, fenol, m-cresol ou metilparabeno) a uma concentração de entre 0,02 - 1,00 mg/mL, em um pH de solução entre 7,0-8,0, a uma dose de 0,08-0,80 mg de proteína de fusão insulina-Fc / kg (ou aproximadamente equivalente a 1,2-12,3 nmol/kg ou aproximadamente equivalente a 0,4-4,0 U/kg de equivalente de insulina em base molar). No dia 0, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 dias após a injeção.
88 / 175
[0183] As injeções subcutâneas subsequentes foram dadas não mais frequentemente do que uma vez por semana, e, em alguns casos, as injeções foram dadas em intervalos diferentes com base na farmacodinâmica de uma dada formulação da proteína de fusão insulina-Fc. As injeções subsequentes para cada proteína de fusão insulina-Fc foram ajustadas para doses maiores ou menores, dependendo da farmacodinâmica demonstrada da proteína de fusão insulina-Fc. Por exemplo, se a dose de uma primeira injeção no dia 0 foi considerada ineficaz na redução da glicose no sangue, os níveis de dose subsequentes da proteína de fusão insulina-Fc injetada foram ajustados para cima. De um modo semelhante, se a dose de uma primeira injeção no dia 0 foi encontrada por baixar a glicose de maneira muito forte, então a dose subsequente da proteína de fusão insulina-Fc injetada foi ajustada para baixo.
Também se verificou que as doses intermediárias ou finais podem ser ajustadas de maneira semelhante, conforme necessário. Para cada dose, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias (e opcionalmente 14 dias) após a injeção. Para cada momento, foi coletado no mínimo 1 mL de sangue total. A leitura do nível de glicose foi realizada imediatamente em um glicosímetro (ACCU-CHEK® Aviva Plus), o que exigiu aproximadamente uma gota de sangue. As médias da % do nível de glicose sanguínea em jejum (%FBGL) ao longo do estudo foram representadas graficamente em relação ao tempo, o que permite que a bioatividade de uma proteína de fusão seja determinada.
[0184] Para determinar a bioatividade de cada dose, uma análise de área sobre a curva (AOC) foi conduzida da seguinte forma. Após construir os dados de %FBGL versus tempo, os dados foram então inseridos em um software de análise de dados (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego CA). O software foi primeiro usado para conduzir uma análise da área
89 / 175 sob a curva (AUC) para integrar a área sob a %FBGL vs. curva de tempo para cada dose. Para converter os dados AUC nos dados AOC desejados, foi usada a seguinte equação: AOC = TPA - AUC; onde TPA é a área total possível obtida multiplicando-se cada dose de vida (por exemplo, 7 dias, 14 dias, etc.) por 100% (onde 100% representa y = 100% da %FBGL vs. curva de tempo).
Por exemplo, dada uma vida útil da dose de 7 dias e uma AUC calculada de 500 %FBGL / dias, resulta no seguinte para AOC: AOC = (100 %FBGL x 7 dias) - (500 %FBGL / dias) = 200 %FBGL dias. A análise pode ser realizada para cada dose injetada em uma série de doses injetadas para obter os valores de AOC para injeção 1, injeção 2, injeção 3, etc.
[0185] Como as doses da proteína de fusão insulina-Fc podem variar conforme discutido anteriormente, é frequentemente mais conveniente normalizar todos os valores calculados de AOC para uma dada proteína de fusão insulina-Fc para uma dose particular dessa proteína de fusão insulina-Fc.
Isso permite uma comparação conveniente da potência de redução da glicose de uma proteína de fusão insulina-Fc em várias injeções, mesmo se mudarem os níveis de dose nas injeções de um determinado estudo. A AOC normalizada (NAOC) para uma determinada dose é calculada da seguinte forma: NAOC = AOC / D com unidades de %FBGL dias kg/mg; onde D é a dose real injetada no animal em mg/kg. Os valores da NAOC podem ser calculados para cada injeção de uma série de injeções para um determinado animal e pode ser uma média entre um grupo de animais que receberam a mesma formulação de proteína de fusão insulina-Fc.
[0186] A razão NAOC (NAOCR) também pode ser calculada para cada injeção de uma série de injeções para um determinado animal, tomando os valores de NAOC para cada injeção (por exemplo, injeções de 1, 2, 3,... N) e dividindo cada NAOC para uma determinada injeção pela NAOC a partir da injeção 1 da seguinte forma: NAOCR = (NAOC (Nésima injeção) / NAOC (injeção
90 / 175 1)). Ao avaliar a NAOCR de uma determinada formulação de homodímero de proteína de fusão insulina-Fc para a enésima injeção de uma série de injeções, é possível determinar se a atividade in vivo de diminuição da glicose de uma dada proteína de fusão de insulina-Fc reteve substancialmente a sua bioatividade ao longo de uma série de N doses (por exemplo, NAOCR para a Nésima dose maior que 0,5) ou se a atividade de redução da glicose in vivo de uma determinada proteína de fusão insulina-Fc perdeu uma porção substancial de sua potência (por exemplo, NAOCR da Nésima dose é inferior a 0,5) ao longo de um curso de N doses, indicando a potencial formação de anticorpos antifármaco neutralizantes in vivo. Em exemplos de realização preferidos, a proporção (razão) de NAOC após a terceira injeção subcutânea para a NAOC após a primeira injeção subcutânea é maior que 0,5 (ou seja, a NAOCR da terceira injeção subcutânea é maior do que 0,5).
EXEMPLO 12 PROCEDIMENTO GENERALIZADO PARA A DETERMINAÇÃO DA FARMACOCINÉTICA (PK)
IN VIVO EM SORO CANINO E FELINO
[0187] Foi construído um ensaio para medir as concentrações de proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos Fc de um isotipo canino em soro canino da seguinte forma. O ensaio compreende um formato de ELISA em sanduíche no qual os compostos terapêuticos em amostras de soro foram capturados por um anticorpo monoclonal (mAb) anti-insulina/pró- insulina revestido nas placas de ELISA e, em seguida, detectado por um anticorpo específico para porção Fc de IgG canina conjugado com HRP seguido pelo uso de um sistema de substrato TMB para o desenvolvimento de cor. As placas Maxisorp ELISA (Nunc) são revestidas com o clone mAb anti- insulina D6C4 (Biorad) em tampão de revestimento (pH = 9,6 tampão carbonato de sódio-biocarbonato de sódio) a 5 µg/mL durante a noite à 4ºC. As placas são então lavadas 5x com PBST (PBS + Tween 20 a 0,05%) e
91 / 175 bloqueadas por um mínimo de uma hora à temperatura ambiente (ou durante a noite à 4ºC) com solução de bloqueio Superblock (ThermoFisher). As amostras de soro teste são diluídas a 1:20 em PBST/SB/tampão de diluição de amostra HS 20% (PBS + Tween 20 0,1% + Superblock 10% + soro de cavalo 20%).
Para fazer uma curva padrão, a proteína de fusão insulina-Fc de interesse é diluída em tampão de diluição de amostra (PBST/SB/20% HS) + 5% de soro de beagle agrupado (BioIVT) a partir de uma faixa de concentração de 200 ng/mL até 0,82 ng/mL em diluições seriadas de 1:2,5. Os padrões e as amostras de soro diluídas são adicionados às placas bloqueadas a 100 µL/poço em duplicatas e são incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as amostras e padrões são lavados 5x com PBST. O anticorpo de detecção de cabra anti-Fc de IgG canina conjugado com HRP (Sigma) diluído a cerca de 1:15.000 em PBST/SB/20% de tampão SH e 100 μL é adicionado a todos os poços e incubado durante 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. As placas são lavadas 5x com PBST e uma vez com água deionizada e reveladas pela adição de 100 µL/poço de TMB (Invitrogen) durante 8-10 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor é então interrompido pela adição de 100 µL/poço de ELISA Stop Solution (Boston Bioproducts) e a absorbância é lida a 450 nm usando um leitor de placas SpectraMax (Molecular Devices) em 30 minutos. As concentrações de compostos de proteína de fusão insulina-Fc nas amostras são calculadas por interpolação em uma curva 4-PL usando o software SoftMaxPro.
[0188] De forma similar, foi construído um ensaio para medir as concentrações de proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo fragmentos Fc de um isotipo felino em soro de gato da seguinte forma. O ensaio compreende um formato de ELISA em sanduíche no qual os compostos terapêuticos em amostras de soro foram capturados por um mAb anti- insulina/pró-insulina revestido nas placas de ELISA e, em seguida, detectado
92 / 175 por um anticorpo de cabra específico para porção Fc de IgG felina conjugado com HRP seguido pelo uso de um sistema de substrato TMB para o desenvolvimento de cor. As placas Maxisorp ELISA (Nunc) são revestidas com o clone mAb anti-insulina D6C4 (Biorad) em tampão de revestimento (pH = 9,6 tampão carbonato de sódio-biocarbonato de sódio) a 5 µg/mL durante a noite à 4ºC. As placas são então lavadas 5x com PBST (PBS + Tween 20 a 0,05%) e bloqueadas por um mínimo de uma hora à temperatura ambiente (ou durante a noite à 4ºC) com solução de bloqueio Superblock (ThermoFisher). As amostras de soro teste são diluídas a 1:20 em PBST/SB/tampão de diluição de amostra HS 20% (PBS + Tween 20 0,1% + Superblock 10% + soro de cavalo 20%).
Para fazer uma curva padrão, o composto da proteína de fusão insulina-Fc de interesse é diluído em tampão de diluição de amostra (PBST/SB/20% HS) + 5% de soro de gato (Jackson Immunoresearch) a partir de uma faixa de concentração de 200 ng/mL até 0,82 ng/mL em diluições seriadas de 1:2,5. Os padrões e as amostras de soro diluídas são adicionados às placas bloqueadas a 100 µL/poço em duplicatas e são incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as amostras e padrões são lavados 5x com PBST. O anticorpo de detecção de cabra anti-Fc de IgG felina conjugado com HRP (Bethyl Lab) diluído a cerca de 01:20:00.000 em PBST/SB/20% de tampão SH e 100 μL é adicionado a todos os poços e incubado durante 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. As placas são lavadas 5x com PBST e uma vez com água deionizada e reveladas pela adição de 100 µL/poço de TMB (Invitrogen) durante 8-10 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor é então interrompido pela adição de 100 µL/poço de ELISA Stop Solution (Boston Bioproducts) e a absorbância é lida a 450 nm usando um leitor de placas SpectraMax (Molecular Devices) em 30 minutos. As concentrações de compostos de proteína de fusão insulina-Fc nas amostras são calculadas por interpolação em uma curva 4-PL usando o software
93 / 175 SoftMaxPro.
EXEMPLO 13
PROTOCOLO DE ENSAIO PARA A MEDIÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFÁRMACOS EM SORO CANINO
[0189] As placas de ELISA Maxisorp (Nunc) são revestidas com a proteína de fusão insulina-Fc de interesse diluída em tampão de revestimento (pH = 9,6 tampão carbonato – biocarbonato) a 10 µg/mL durante a noite à 4ºC para medição de anticorpos antifármacos (ADAs) contra o composto de teste.
Para medir ADAs contra a porção de insulina da proteína de fusão insulina-Fc contendo um fragmento Fc de origem IgG canina, as placas são revestidas com insulina purificada a 30 µg/mL em tampão de revestimento. As placas são então lavadas 5x com PBST (PBS + Tween 20 a 0,05%) e bloqueadas durante pelo menos 1 hora (ou durante a noite) com solução de bloqueio Superblock (ThermoFisher, Waltham MA). Para calcular os ADAs em unidades de IgG canina, as tiras são revestidas diretamente com diluições seriadas 1:2 de IgG canina (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA) em tampão de revestimento Carb-Biocarb pH = 9,6 em concentrações entre 300-4,69 ng/mL durante a noite à 4ºC e usadas para criar uma curva pseudo-padrão de 7 pontos. As tiras da placa padrão também são lavadas e bloqueadas com solução de bloqueio Superblock por pelo menos 1 hora (ou durante a noite).
[0190] As amostras de soro de teste são diluídas para uma concentração maior ou igual a 1:100 (normalmente testado como 1:200) em tampão de diluição de amostra PBST/SB/HS 20% (PBS + Tween 20 0,1% + Superblock 10% + soro de cavalo 20%) e, em seguida, as amostras foram adicionadas à proteína de fusão de insulina-Fc revestida (ou RHI revestida) a 100 μL/poço em duplicatas. Tiras em duplicadas de IgG canina padrão também são adicionadas a cada placa e preenchidas com tampão PBST/SB (PBS + 0,1% Tween 20 + 10% Superblock) a 100 µL/poço. As placas são incubadas
94 / 175 durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas 5x com PBST. Para a detecção de ADAs, anticorpo de cabra anti- F(ab')2 de IgG felina (reagente anti- F(ab')2 de IgG felina reage cruzadamente aos anticorpos canino; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA), que é diluído para 1:10000 em PBST/SB e adicionado a 100 µL/poço à amostra e aos poços padrão, foi incubado por 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. As placas são lavadas 5x com PBST e, em seguida, uma vez com água deionizada e, em seguida, a reação é desenvolvida através da adição de 100 μL/poço de substrato TMB (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham MA) durante 15- 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. O desenvolvimento da cor é então interrompido pela adição de 100 µL/poço de ELISA Stop Solution (Boston Bioproducts) e a absorbância é lida a 450 nm usando um leitor de placas SpectraMax em 30 minutos. A concentração de anticorpo antifármaco é determinada pela interpolação dos valores de OD na curva pseudo-padrão 4- PL usando o programa SoftMax Pro Software (Molecular Devices, San Jose CA).
[0191] Para demonstrar a especificidade dos ADAs detectados é realizado um ensaio de “inibição”. No ensaio de inibição de ADA, as amostras de soro são diluídas 1:100 em tampão PBST/SB/20%HS e misturadas com um volume igual de 300 µg/mL do composto terapêutico relevante (diluição final da amostra de 1:200 e composto inibidor final a 150 µg/mL) e incubadas durante 30-40 minutos à temperatura ambiente para permitir que os anticorpos antifármaco se liguem ao inibidor livre (isto é, o composto terapêutico). Após a pré-incubação, as amostras são adicionadas às tiras revestidas com proteína de fusão insulina-Fc (ou revestidas com RHI) a 100 µL/poço em duplicatas. As amostras diluídas 1:200 em tampão PBST/SB/20%HS sem o composto inibidor também são testadas nas placas de amostra juntamente com tiras de padrões revestidos com IgG canina em duplicatas. As etapas restantes do procedimento
95 / 175 de ensaio são realizadas como descrito acima. Os ADAs medidos nos poços inibidos pelo fármaco são combinados com as concentrações de ADA não inibidas para avaliar a especificidade dos ADAs. Se uma inibição significativa de sinais ADA é observada nos poços inibidos com fármaco, isto significa que os ADAS são específicos para o composto terapêutico.
EXEMPLO 14
PROTOCOLO DE ENSAIO PARA A MEDIÇÃO DE ANTICORPOS ANTIFÁRMACOS EM SORO FELINO
[0192] As placas de ELISA Maxisorp (Nunc) são revestidas com a proteína de fusão insulina-Fc de interesse diluída em tampão de revestimento (pH = 9,6 tampão carbonato-biocarbonato) a 10 µg/mL durante a noite à 4ºC para medição de ADAs contra a proteína de fusão insulina-Fc contendo um fragmento Fc de origem de IgG felina. Para medir ADAs contra a porção de insulina da proteína de fusão insulina-Fc, as placas são revestidas com insulina purificada a 30µg/mL em tampão de revestimento. As placas são então lavadas 5x com PBST (PBS + Tween 20 a 0,05%) e bloqueadas durante pelo menos 1 hora (ou durante a noite) com solução de bloqueio Superblock (ThermoFisher, Waltham MA). Para calcular os ADAs em unidades de IgG felina, as tiras são revestidas diretamente com diluições seriadas 1:2 de IgG felina (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA) em tampão de revestimento de carbonato de sódio - bicarbonato de sódio pH = 9,6 em concentrações entre 300-4,69 ng/mL durante a noite à 4ºC e usadas para criar uma curva pseudo- padrão de 7 pontos. As tiras da placa padrão também são lavadas e bloqueadas com solução de bloqueio Superblock por pelo menos 1 hora (ou durante a noite).
[0193] As amostras de soro de teste são diluídas para uma concentração maior ou igual a 1:100 (normalmente testado como 1:200) em tampão de diluição de amostra PBST/SB/HS 20% (PBS + Tween 20 0,1% +
96 / 175 Superblock 10% + soro de cavalo 20%) e, em seguida, as amostras foram adicionadas à proteína de fusão de insulina-Fc revestida (ou RHI revestida) a 100 μL/poço em duplicatas. Tiras em duplicadas de IgG felina padrão também são adicionadas a cada placa e preenchidas com tampão PBST/SB (PBS + 0,1% Tween 20 + 10% Superblock) a 100 µL/poço. As placas são incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas 5x com PBST. Para a detecção de ADAs, anticorpos de cabra anti-F(ab’)2 de IgG felina conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA) é diluído em PBST/SB por um fator de diluição de 1:10000 e adicionado a 100 µL/poço para amostras e poços com padrão e incubados durante 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. As placas são lavadas 5x com PBST e, em seguida, uma vez com água deionizada e, em seguida, a reação é desenvolvida através da adição de 100 μL/poço de substrato TMB (Invitrogen) durante 15-20 minutos à temperatura ambiente no escuro. O desenvolvimento da cor é então interrompido pela adição de 100 µL/poço de ELISA Stop Solution (Boston Bioproducts, Ashland MA) e a absorbância é lida a 450 nm usando um leitor de placas SpectraMax em 30 minutos. A concentração de anticorpo antifármaco (ADA) é determinada pela interpolação dos valores de OD na curva pseudo-padrão 4-PL usando o programa SoftMax Pro Software (Molecular Devices, San Jose CA).
EXEMPLO 15
PROCEDIMENTO DE ENSAIO PARA IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPO IMUNOGÊNICO
[0194] Microlacas de ELISA Maxisorp (Nunc) foram revestidas com uma biblioteca de compostos da proteína de fusão insulina-Fc homodimérica com sequências de aminoácidos conhecidas, e as placas revestidas são bloqueadas de uma maneira semelhante ao procedimento descrito no ensaio ELISA para anticorpo antifármaco dos Exemplos 13 e 14, exceto que cada composto na biblioteca é revestido em uma tira de poços
97 / 175 individual separada da microplaca de ELISA. Os compostos na biblioteca compreendem um intervalo de proteínas de fusão insulina-Fc com diferentes composições de aminoácidos de polipeptídeo insulina, incluindo várias mutações de aminoácidos de cadeia B, cadeia C e A, diferentes composições de ligantes e diferentes composições de fragmentos de Fc, incluindo alguns de origem humana. Separadamente, alguns poços da tira da placa são diretamente revestidos com diluições em série 1:2 de IgG canina ou felina (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA) para calcular os anticorpos antifármacos (ADA) em unidades de IgG canina ou felina, respectivamente, conforme descrito nos Exemplos 13 e 14.
[0195] O soro obtido a partir de cães ou gatos individuais recebendo doses repetidas de uma proteína de fusão insulina-Fc é primeiro rastreado no ensaio ELISA para anticorpo antifármaco (Exemplo 13 para cães e Exemplo 14 para gatos). As amostras de soro que demonstram positividade moderada ou elevada (por exemplo, moderada ou títulos elevados de anticorpos) nos ensaios do Exemplo 13 ou Exemplo 14, são diluídas em série (1:200 a 1:8000) em tampão de diluição de amostra PBST/SB/20%HS (PBS + 0,1% Tween 20 + 10% Superblock + 20% soro de cavalo) e adicionadas às placas revestidas com a biblioteca de compostos de proteína de fusão insulina- Fc por 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas são lavadas 5 vezes com PBST. Para a detecção de anticorpos caninos ou felinos capazes de reação cruzada com a biblioteca de compostos revestidos, anticorpos de cabra anti-F(ab')2 de IgG felina conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA), que apresenta reação cruzada tanto para IgGs de cães quanto para IgGs de gatos, é diluído em PBST/SB para 1:10.000 e adicionados à 100 μL/poço nos poços de amostra e padrão e incubados durante 45 min à temperatura ambiente no escuro. As placas são lavadas 5 vezes com PBST e uma vez com água deionizada, e a reação de cor
98 / 175 foi desenvolvida pela adição de 100 μL/poço de substrato TMB (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham MA) durante 15-20 min à temperatura ambiente no escuro. O desenvolvimento da cor é então interrompido pela adição de 100 µL/poço do reagente ELISA Stop Solution (Boston Bioproducts, Ashland MA) e a absorbância é lida a 450 nm usando um leitor de placas SpectraMax em 30 min. As concentrações de anticorpos anticompostos de reação cruzada presentes nas amostras de soro são determinadas pela interpolação dos valores de OD na curva pseudo-padrão 4-PL contra os controles de anticorpos IgG caninos ou felinos diretamente revestidos usando o Software SoftMax Pro (Molecular Devices, San Jose CA).
[0196] Ao correlacionar as concentrações de anticorpos resultantes do ensaio com as composições conhecidas de aminoácidos da biblioteca de proteínas de fusão de insulina-Fc revestidas, pode-se determinar se determinadas mutações ou epítopos de aminoácidos são responsáveis por não causar nenhum, alguns, a maioria, ou todos os sinais de anticorpo total no ensaio, indicando nenhuma ligação, ligação fraca, ou ligação forte a vários homodímeros de proteínas de fusão de insulina-Fc. As mutações ou epítopos responsáveis pela ligação moderada ou forte são aqui referidas como “pontos quentes” (hot spots) imunogênicos.
EXEMPLO 16 PROCESSO DE CONCEPÇÃO PARA A OBTENÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-
FC COM TÍTULOS ALTOS DE HOMODÍMERO E NÍVEIS ACEITÁVEIS DE BIOATIVIDADE EM DOSE AGUDA E REPETIDA NAS ESPÉCIES ALVO
[0197] O processo para o cumprimento dos objetivos do projeto descritos na Descrição Detalhada da Invenção compreendem as seguintes etapas. Em primeiro lugar, o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 foi combinado com um fragmento Fc espécie-específico de um isotipo IgG particular e um ligante de modo que a proteína de fusão insulina-Fc
99 / 175 resultante provavelmente produzisse um produto de bioatividade de longa ação com imunogenicidade mínima (por exemplo, um isotipo IgG espécie-específico foi escolhido com ligação mínima ao receptor Fc(gama)I). A sequência de DNA que codifica a proteína de fusão desejada foi preparada, clonada em um vetor
(LakePharma, San Carlos, CA) e o vetor foi então usado para transfectar células HEK de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A proteína de fusão insulina-Fc foi então purificada de acordo com o Exemplo 3 e o rendimento global da proteína e a % de homodímero foi mensurada de acordo com o Exemplo 6. Apenas os candidatos com um título de homodímero maior que 50 mg/L foram considerados aceitáveis, pois títulos inferiores a este nível provavelmente não resultam em títulos de produção comerciais que satisfazem os requisitos rigorosamente de baixo custo de fabricação de produtos veterinários.
Em seguida, as proteínas de fusão insulina-Fc selecionadas foram triadas para indicadores de bioatividade através de estudos in vitro de ligação ao receptor de insulina, conforme descrito no Exemplo 7. Com base no experimento, apenas compostos que exibem atividade de receptor de insulina
(IR) com valores de IC50 inferiores a 5000 nM são considerados com a probabilidade de apresentar bioatividade na espécie em questão.
Apesar do valor IC50 in vitro de IR ser uma ferramenta de rastreio qualitativo útil, essa abordagem utiliza célula IM-9 humanas que expressam o receptor humano de insulina e, consequentemente, não podem capturar algumas das pequenas diferenças na afinidade entre o IR canino ou felino e o IR humano.
Além disso,
outros fatores além da ligação ao receptor de insulina podem influenciar a bioatividade de um composto in vivo (por exemplo, afinidade para FcRn canino ou felino para permitir meia-vida de eliminação farmacocinética prolongada in vivo). Portanto, as proteínas de fusão insulina-Fc selecionadas que eram aceitáveis de um ponto de vista de valor de IC50 da atividade de IR e de fabricação foram adicionalmente rastreadas quanto a bioatividade no animal de
100 / 175 interesse (por exemplo, cão ou gato) para rastrear quaisquer materiais com menos do que a potência desejada e/ou duração de bioatividade (por exemplo, NAOC menor do que 150 %FBGL dias kg/mg). Novamente, com base na experiência, em valores NAOC superiores a 150 %FBGL dias kg/mg, os requisitos de dose nas espécies alvo serão suficientemente baixos para atingir um custo de tratamento aceitável. Por último, foi adicionado um critério de avaliação adicional que raramente ou nunca é mencionado no estado da técnica. Como discutido em mais detalhe nos exemplos abaixo, muitos exemplos de realização da proteína de fusão insulina-Fc que exibem níveis NAOC aceitáveis em espécies alvo após a primeira dose, inesperadamente não conseguem manter esse nível de bioatividade depois de doses repetidas.
Além disso, na maioria dos casos, a redução da bioatividade de dose repetida nas espécies-alvo está correlacionada com o desenvolvimento de anticorpos antifármacos neutralizantes. Esta propensão para gerar anticorpos antifármaco e a falha em manter a atividade tornam essas proteínas de fusão insulina-Fc impraticáveis para uso no tratamento de uma doença crônica, como diabetes canino ou diabetes felino. Por esse motivo, apenas as proteínas de fusão insulina-Fc que exibem níveis aceitáveis de bioatividade em doses repetidas (por exemplo, valores NAOCR maiores do que 0,50 para a terceira dose em relação à primeira dose) com níveis mínimos de anticorpos antifármaco foram consideradas aceitáveis para uso na presente invenção.
RESULTADOS - PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO UM
FRAGMENTO FC CANINO EXEMPLO 17 PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC CANINA COMPREENDENDO FC DO ISOTIPO IGGA
CANINO
[0198] Foi feita uma tentativa de produzir uma proteína de fusão insulina-Fc compreendendo a sequência do polipeptídeo insulina de SEQ ID
101 / 175 NO: 5 e o fragmento Fc do isotipo IgGA canino (SEQ ID NO: 15) usando o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12. A sequência de aminoácidos completa (de comprimento total) para a proteína de fusão insulina-Fc resultante é a seguinte:
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVT CVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQD WLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSI
TCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 42)
[0199] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42 foi sintetizada em células HEK de acordo com o Exemplo 1 e purificada de acordo com o Exemplo 3. O rendimento da proteína foi de 22 mg/L após a etapa de purificação em proteína A. A estrutura da proteína de fusão insulina-Fc foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e a sequência foi adicionalmente identificada por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. A % de homodímero foi mensurada por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6 e determinada como sendo de 24%, indicando um alto grau de agregados de homodímeros. O título de homodímeros resultante foi, portanto, de apenas 5 mg/L. Em resumo, a fabricação da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42 em células HEK resultou em um alto nível de agregados e um baixo título de homodímeros (5 mg/L), que não atendeu ao objetivo do projeto de um título de homodímero superior a 50 mg/L.
[0200] No entanto, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42 foi avaliada quanto à bioatividade. Em primeiro lugar, a ligação ao receptor da proteína de fusão de insulina-Fc de SEQ ID NO: 42 mensurada de acordo com o Exemplo 7, que resulta em um valor IC50 de 2733 nM, indica que o composto é susceptível de ser bioativo in vivo (ou seja, uma IC50 menor que
102 / 175
5.000 nM).
[0201] Em seguida, a farmacodinâmica (PD) in vivo da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42 foi medida após uma única administração intravenosa do composto em N = 3 cães, de acordo com o Exemplo 10. A FIG. 2 mostra a porcentagem do nível de glicose no sangue em jejum da SEQ NO: 42 em função do tempo. A NAOC para a SEQ ID NO: 42 foi calculada como sendo 105 %FBGL dias kg/mg de acordo com o procedimento do Exemplo 11. A meia-vida in vivo de SEQ ID NO: 42 foi calculada como sendo inferior a um dia usando o método do Exemplo 12. A NAOC relativamente baixa era provavelmente o resultado da grande quantidade de agregados na amostra (ou seja, baixa % de homodímero), mas o homodímero solúvel que ainda permaneceu em circulação tinha apenas uma meia-vida de eliminação farmacocinética de menos de um dia, o que foi considerado um apoio improvável de uma única administração uma vez por semana.
EXEMPLO 18 MUTAÇÕES DA REGIÃO DO FRAGMENTO FC DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC
COMPREENDENDO O ISOTIPO IGGA CANINO
[0202] Em uma tentativa de aumentar a % de teor de homodímero, melhorar a bioatividade, e aumentar a meia-vida da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42, as mutações foram inseridas no fragmento Fc da região CH3 para tentar impedir associação intermolecular (por exemplo, interações fragmento Fc – fragmento Fc entre moléculas) e encorajar uma ligação mais forte ao receptor FcRn (por exemplo, maior afinidade para o FcRn) para aumentar a reciclagem e o tempo de circulação sistêmica. As seguintes proteínas de fusão insulina-Fc que foram sintetizadas em células HEK de acordo com o Exemplo 1, purificadas de acordo com o Exemplo 3, e testadas de acordo com os Exemplos 4-7, são mostradas abaixo. O alinhamento de sequência das SEQ ID NOs: 44, 46, 48 e 50 contra a SEQ ID
103 / 175 NO: 42 e as diferenças nas sequências de aminoácidos são mostradas na Fig.
3.
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVT CVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQD WLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSI
TCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQQGDPFTCAVLHEALHSHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 44)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVT CVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQD WLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSI
TCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQQGDPFTCAVLHETLQSHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 46)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVT CVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQD WLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSI
TCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQQGDPFTCAVMHETLQSHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 48)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVT CVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQD WLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSI
TCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQQGDPFTCAVLHETLQNHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 50)
[0203] As proteínas de fusão insulina-Fc com base em variantes de IgGA canina estão listadas na Tabela 2, juntamente com os rendimentos de
104 / 175 proteína correspondentes, a % de homodímeros e títulos de homodímeros. Os resultados mostram que diversas mutações no fragmento Fc de IgGA, em vez de melhorarem a % de homodímeros e os títulos de homodímeros, deram origem a proteínas altamente agregadas com títulos de homodímeros extremamente baixos menores do que 5 mg/L. Assim, a bioatividade in vivo e a farmacocinética dos compostos não puderam ser avaliadas.
TABELA 2 TÍTULOS DE HOMODÍMEROS PARA SEQUÊNCIAS QUE UTILIZAM UMA REGIÃO CH3 DE
FRAGMENTO FC DE IGGA CANINA MUTADO SEQ ID NO: Rendimento % de homodímero Título de de proteína homodímero (mg/L) (mg/L) SEQ ID NO: 42 22 24% 5 SEQ ID NO: 44 33 0% 0 SEQ ID NO: 46 57 0% 0 SEQ ID NO: 48 67 0% 0 SEQ ID NO: 50 80 0% 0 EXEMPLO 19 PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC CANINA USANDO FRAGMENTO FC DE OUTROS
ISOTIPOS CANINOS
[0204] Conforme descrito acima, acredita-se que IgGA canina seja o isotipo preferido para o fragmento Fc para produzir proteína de fusão insulina-Fc não imunogênica para cães devido à sua falta de função efetora de Fc(gama)I canino (muito similar ao Isotipo IgG2 em humanos). Entretanto, as proteínas de fusão insulina-Fc fabricadas com um fragmento Fc de IgGa canina foram altamente agregadas com um título de homodímeros inaceitavelmente baixo e níveis de bioatividade e duração de ação aceitavelmente baixos. Portanto, os fragmentos Fc de outros isotipos de IgG canina (IgGB canina de
105 / 175 SEQ ID NO: 16), IgGC canina de SEQ ID NO: 17 e IgGD canina de SEQ ID NO: 18) foram avaliados como substituições para o fragmento Fc de IgGA canina da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42. As três proteínas de fusão insulina-Fc contendo fragmentos Fc com base nos isotipos IgGB, IgGC e IgGD caninos foram sintetizadas usando o mesmo polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12 como foram usados para fazer o proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42. As proteínas foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1. As proteínas de fusão insulina-Fc foram então purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. A estrutura da proteína de fusão insulina-Fc foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. A % de homodímero foi mensurada por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6. Suas sequências são mostradas abaixo e a comparação de alinhamento de sequências contra a SEQ ID NO: 42 é mostrada na Fig. 4:
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 52)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTC VVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQD WLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTL
TCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPG (SEQ ID NO: 54)
106 / 175
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVL DLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTG KEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIK
DFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQ GDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 56)
[0205] O rendimento de proteína resultante, a % homodímero, e os títulos de homodímeros são fornecidos na Tabela 3. Inesperadamente, apenas a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 compreendendo um fragmento Fc baseado no isotipo IgGB canino demonstrou um título de homodímero que atendeu aos critérios do projeto, ou seja, acima de 50 mg/L. A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 54 compreendendo um fragmento Fc baseado no isotipo IgGC canino não produziu nenhum composto, e a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 56 compreendendo um fragmento Fc baseado no isotipo IgGD canino demonstrou um rendimento de proteína apreciável, mas com um alto grau de agregação e, portanto, um título de homodímero inaceitavelmente baixo.
[0206] A ligação do receptor de insulina in vitro para as proteínas de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 56 foi testada de acordo com o procedimento do Exemplo 7. A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 56 demonstrou uma IC50 maior que 5.000 nM, indicando que o composto era altamente improvável de mostrar bioatividade in vivo. No entanto, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 demonstrou uma IC50 de 28 nM, indicando que esta sequência provavelmente era bioativa in vivo.
TABELA 3
TÍTULOS DE HOMODÍMERO PARA AS SEQUÊNCIAS UTILIZANDO FRAGMENTOS FC DE IGGB, IGGC, E IGGD CANINAS NATIVAS
107 / 175 Rendimento Título de IC50 da SEQ ID Fragmento % de de proteína homodímero Ligação ao NO: de IgG homodímero (mg/L) (mg/L) IR (nM)
SEQ ID NO: 42 IgGA 21 24% 5 2,733 (Exemplo 17)
SEQ ID IgGB 80 93% 74 28 NO: 52
SEQ ID IgGC 0 0% 0 DNM* NO: 54
SEQ ID IgGD 134 12% 16 >5000 NO: 56 *DNM = não mensurado EXEMPLO 20 EFICÁCIA IN VIVO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 5 COM UM FRAGMENTO FC DO ISOTIPO
IGGB CANINO
[0207] Devido aos resultados promissores do título de homodímeros e da atividade sobre o receptor de insulina obtidos no Exemplo 19, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 foi testada quanto a bioatividade in vivo de acordo com o Exemplo 10 seguindo uma injeção intravenosa em cada um dos N = 3 cães Beagle saudáveis, virgens (naïves) para anticorpos, pesando aproximadamente 10 kg. Em um experimento separado, o composto foi administrado por via subcutânea a N = 3 cães Beagle naïves. FIG. 5 mostra a %FBGL versus tempo para uma única administração intravenosa da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52, e a FIG. 6 mostra a %FBGL vs. tempo para uma única administração subcutânea da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52, ambas demonstram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 é significativamente bioativa em cães.
108 / 175
[0208] A NAOC foi calculada de acordo com o procedimento do Exemplo 11 para determinar a bioatividade relativa e a duração da ação da proteína de fusão insulina-Fc. A NAOC da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 injetada intravenosamente foi 399 %FBGL dias kg/mg, resultado que foi 3,8 vezes o da NAOC da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 42 injetada por via intravenosa, ilustrando uma bioatividade significativamente aumentada da proteína de fusão insulina-Fc compreendendo o fragmento Fc de IgGB canina em relação à proteína de fusão insulina-Fc compreendendo o fragmento Fc de IgGA canina. A NAOC da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 administrada subcutaneamente foi de 366 %FBGL dias kg/mg, o que demonstra um nível de bioatividade pela administração subcutânea semelhante ao nível obtido pela administração intravenosa.
EXEMPLO 21
TRIAGEM DA IMUNOGENICIDADE IN VIVO APÓS REPETIDAS DOSES POR VIA SUBCUTÂNEA DA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 5 COM UM FRAGMENTO FC DO ISOTIPO
IGGB CANINO
[0209] Em seguida, a bioatividade subcutânea de dose repetida da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 foi testada em cães de acordo com o método descrito no Exemplo 11. N = 3 animais foram administrados por via subcutânea no dia 0, no dia 35 e no dia 42, e a %FBGL foi medida para a janela de 7 dias após cada dose de acordo com o Exemplo
11. A NAOC e NAOCR foram calculadas de acordo com o procedimento do Exemplo 11 para cada injeção subcutânea repetida. Conforme ilustrado na Tabela 4, a dosagem subcutânea repetida em cães revelou inesperadamente uma queda significativa na bioatividade pela terceira dose, medida por uma diminuição significativa na NAOCR (ou seja, a NAOC para a terceira injeção foi
109 / 175 de apenas 0,40, ou 40% da NAOC para a primeira injeção).
TABELA 4 NAOC POR DOSE E NAOCR PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 52 NAOC NAOCR (proporcional à Número de Injeções de SEQ ID NO: 52 (%FBGL·dias·kg/mg) semana 1) 1 330 1,0 2 339 1,1 3 115 0,4
[0210] Sem estar ligado a qualquer explicação particular, postulou-se que a causa da redução significativa na bioatividade da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52, após a terceira dose repetida por via subcutânea em cães, foi devido ao desenvolvimento de anticorpos antifármacos que neutralizam a atividade biológica das proteínas de fusão. Os anticorpos antifármacos podem ser direcionados contra o polipeptídeo insulina, ligante ou fragmentos Fc de uma proteína de fusão insulina-Fc. A resposta imunogênica se manifesta como interações entre células apresentadoras de antígenos, células T auxiliares, células B e suas citocinas associadas, que podem levar à produção de anticorpos endógenos contra a droga (por exemplo, anticorpos antifármacos). Os anticorpos de ligação são todos os isotipos capazes de se ligar à proteína de fusão insulina-Fc e estes podem ser detectados em um imunoensaio, conforme descrito no Exemplo 13. Os anticorpos neutralizantes que inibem a atividade funcional da proteína de fusão insulina-Fc são geralmente direcionados contra um epítopo que é necessário para a bioatividade. Para avaliar se este foi o caso, os soros coletados antes da administração de cada dose, e no final do experimento descrito nos Exemplos 11 e 12 foram testados para quantificar os níveis de anticorpos antifármaco de acordo com o Exemplo 13. Como mostrado na FIG. 7, os níveis de anticorpos antifármaco de fato aumentaram com múltiplas administrações subcutâneas do composto, indicando que a geração de anticorpos antifármaco neutralizantes
110 / 175 foi a causa provável para a redução na NAOCR após a terceira injeção da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52.
EXEMPLO 22 PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC NÃO GLICOSILADA COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 5 COM FRAGMENTOS FC DO ISOTIPO IGGB
CANINO PARA REDUZIR O POTENCIAL RISCO DE IMUNOGENICIDADE
[0211] Conforme mostrados nos Exemplos 19 e 20, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 mostrou aceitável % de teor de homodímero, título de homodímeros, e bioatividade em cães; entretanto, a sua utilização para uma doença crônica, tal como o diabetes, é comprometida pela redução na bioatividade (Exemplo 21) e geração de anticorpos antifármacos (Exemplo 21) causadas pela administração subcutânea repetida. Sem estar ligado a qualquer teoria específica, a possível causa da geração de anticorpos antifármaco e a redução da bioatividade é o aumento da interação do fragmento Fc de IgGB canina com inúmeros receptores do sistema imunológico canino (por exemplo, receptores Fc(gama), por exemplo, FcγRI). No entanto, o isotipo IgGB canino foi o único isotipo dentre os quatro isotipos de IgG canina que, quando usado para o fragmento Fc, resultou em uma proteína de fusão insulina-Fc que atendia os objetivos do desenho do estudo de produtibilidade e bioatividade em dose única (Exemplo 16). Conforme descrito na Descrição Detalhada da Invenção, um método para reduzir a interação ao Fc(gama)RI envolve a mutação do sítio cNg do fragmento Fc para prevenir a glicosilação durante a síntese na célula hospedeira. Portanto, foram feitas mutações no sítio cNg na região do fragmento Fc de SEQ ID NO: 52 para reduzir a afinidade de ligação do fragmento Fc para os receptores Fc(gama) in vivo, conforme medido por um ensaio in vivo de ligação ao Fc(gama)RI humano descrito no Exemplo 8. A verificação da falta de glicano foi realizada utilizando o método de LC-MS do Exemplo 5, mas com a omissão da etapa de tratamento com
111 / 175 PNGase F. A posição do sítio cNg na proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 é cNg-NB139. As mutações para SEQ ID NO: 52 incluíram a SEQ ID NO: 58 compreendendo uma mutação cNg-NB139-Q, SEQ ID NO: 60 compreendendo uma mutação cNg-NB139-S, SEQ ID NO: 62 compreendendo uma mutação cNg - NB139-D e SEQ ID NO: 64 compreendendo uma mutação cNg-NB139-K. As sequências de aminoácidos completas das proteínas de fusão insulina-Fc mutadas nos sítios cNg estão listadas abaixo (com a posição NB139 sublinhada) e os alinhamentos de sequência resultantes são mostrados na Fig. 8 (Clustal Omega):
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFQGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 58)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 60)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFDGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 62)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL
112 / 175
ENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFKGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 64)
[0212] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. A estrutura da proteína de fusão insulina-Fc foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5.
A % de homodímero foi mensurada por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6. Como mostrado na Tabela 5, os títulos de homodímeros das proteínas de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 atenderam o objetivo do desenho do estudo, enquanto inesperadamente a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 58 contendo a mutação cNg - NB139-Q não satisfez o objetivo para o título de homodímero.
TABELA 5 TÍTULOS DE HOMODÍMEROS PARA VARIAÇÕES DE CNG DE SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: Mutação Rendimento de % de Título de cNg proteína (mg/L) homodímero homodímero (mg/L) SEQ ID NO: 58 cNg-Q 37 98% 36 SEQ ID NO: 60 cNg-S 77 98% 75 SEQ ID NO: 62 cNg-D 88 98% 86 SEQ ID NO: 64 cNg-K 68 98% 67
[0213] Para determinar qual dos três compostos restantes tinha maior probabilidade de exibir imunogenicidade reduzida, a ligação do receptor
113 / 175 Fc(gama) foi medida de acordo com o procedimento do Exemplo 8. A baixa ligação ao receptor Fc(gama) tem maior probabilidade de se correlacionar com a imunogenicidade mínima. A Tabela 6 compara a ligação ao receptor Fc(gama)I dessas proteínas de fusão insulina-Fc com a ligação ao receptor Fc(gama) da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 demonstrando inesperadamente que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 62, contendo a mutação cNg-D, exibe uma atividade de ligação ao receptor Fc(gama) que é aproximadamente o dobro das proteínas de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 60, contendo a mutação cNg-S e SEQ ID NO: 64 contendo a mutação cNg-K. Portanto, apenas as proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo os últimos dois compostos contendo a mutação cNg-S e mutação cNg-K foram consideradas adequadas para o teste de bioatividade para doses repetidas em cães.
TABELA 6 LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC(GAMA) PARA VARIAÇÕES DE CNG DE SEQ ID NO: 52 OD450nm OD450nm Menos Mutação Razão para SEQ ID NO: Log[Fc(gama) o valor Fundo cNg SEQ ID NO: 52 RI] (ng/mL) do Ensaio cNg SEQ ID NO: 52 0,386 0,323 1,00 Nativo SEQ ID NO: 60 cNg-S 0,140 0,077 0,24 SEQ ID NO: 62 cNg-D 0,204 0,141 0,44 SEQ ID NO: 64 cNg-K 0,126 0,063 0,20 Valor de fundo do ensaio (sem N/A 0,063 0,000 N/A composto) EXEMPLO 23
AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE E IMUNOGENICIDADE IN VIVO DE POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 5 COM FRAGMENTOS FC DE ISOTIPO IGGB CANINO CNG-K E CNG-S NÃO GLICOSILADOS
[0214] Para determinar se a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ
114 / 175 ID NO: 60, contendo a mutação cNg-S, melhorou o desempenho de bioatividade de dose repetida em cães, o composto foi administrado por via subcutânea em N = 1 cão no dia 0, dia 7, dia 14 e no dia 28 de acordo com o procedimento do Exemplo 11. Quando a %FBGL do cão caiu muito, o cão recebeu comida para elevar a glicose sanguínea a um nível seguro. A NAOC para a primeira injeção foi de 191 %FBGL dias kg/mg, mostrando que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 60 era satisfatoriamente bioativa in vivo. A NAOC e NAOCR também foram medidas para cada dose subsequente de acordo com o procedimento geral do Exemplo 11, calculada a partir do momento em que a dose foi administrada até imediatamente antes de a próxima dose ser administrada. A NAOC e NAOCR mostradas na Tabela 7 ilustram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 60 exibiu uma NAOCR que diminuiu significativamente nas doses 3 e 4 de um regime de quatro doses. Portanto, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 60, contendo a mutação cNg-S, não foi capaz de demonstrar bioatividade em doses repetidas em cães, apesar de ter uma ligação ao Fc(gama)RI baixo, isto é, quatro vezes menor do que a da Proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52.
TABELA 7 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 60 Número de
NAOC Injeções de SEQ NAOCR (%FBGL·dias·kg/mg) ID NO: 60 1 191 1,0 2 240 1,3 3 0 0,0 4 39 0,2
[0215] Para determinar se a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ
115 / 175 ID NO: 64, contendo a mutação cNg-K, melhorou o desempenho de bioatividade de dose repetida em cães, o composto foi administrado por via subcutânea em N = 1 cão no dia 0, dia 7, dia 14 e no dia 28 de acordo com o procedimento do Exemplo 11. Quando a %FBGL do cão caiu muito, o cão recebeu comida para elevar a glicose sanguínea a um nível seguro. A NAOC para a primeira injeção foi de 449 %FBGL dias kg/mg, mostrando que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 64 era satisfatoriamente bioativa in vivo. O perfil farmacocinético do composto também foi medido pelo método do Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos foi ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação que era de cerca de 0,9 dia. A NAOC e NAOCR também foram medidas para cada dose subsequente de acordo com o procedimento geral do Exemplo 11, calculada a partir do momento em que a dose foi administrada até imediatamente antes de a próxima dose ser administrada. A NAOC e NAOCR mostradas na Tabela 8 ilustram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 64 mantém uma NAOCR maior que 0,6 ao longo das quatro doses. Portanto, inesperadamente, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 64, contendo a mutação cNg-K, foi a única proteína de fusão insulina-Fc mutante não glicosilada da SEQ ID NO: 52 que resultou em bioatividade com doses repetidas significativamente melhorada em cães.
TABELA 8 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 64 Número de Injeções NAOC
NAOCR de SEQ ID NO: 64 (%FBGL·dias·kg/mg) 1 449 1,0 2 361 0,8 3 259 0,6 4 638 1,4
116 / 175
[0216] Os níveis de anticorpos antifármaco e anti-insulina também foram medidos ao longo do curso do tratamento (28 dias) e por mais duas semanas de acordo com o Exemplo 13. A FIG. 9 ilustra que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 64 ainda gerou anticorpos antifármaco com a administração subcutânea repetida em cães, mas os títulos de anticorpos antifármaco eram muito mais baixos do que aqueles gerados pela proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 (Exemplo 19).
EXEMPLO 24
RASTREIO DE SORO CANINO CONTENDO ANTICORPOS ANTIFÁRMACOS E IDENTIFICAÇÃO DE POTENCIAIS EPÍTOPOS IMUNOGÊNICOS NAS POSIÇÕES B10D E A8H DO POLIPEPTÍDIO INSULINA
[0217] A mutação do sítio cNg do fragmento Fc de IgGB canina para uma Lys (ou seja, cNg-K) melhorou a bioatividade em doses repetidas da proteína de fusão insulina-Fc compreendendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12 (Exemplo 23), mas a proteína de fusão insulina-Fc resultante de SEQ ID NO: 64 ainda deu origem a anticorpos antifármaco (Exemplo 23). Foi hipotetizado, portanto, que o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 pode conter inesperadamente epítopos específicos (ou seja, “hot spots” imunogênicos) contra os quais o sistema imunológico do cão é direcionado. Portanto, a especificidade de ligação dos anticorpos presentes nas amostras de soro descritas no Exemplo 13 foi avaliada de acordo com o procedimento geral do Exemplo 15. A análise das amostras de soro contendo anticorpos da dosagem repetida da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 (Exemplo 19) contra a biblioteca de proteína de fusão insulina-Fc revestida demonstrou que havia inesperadamente dois “pontos quentes” (hot spots) primários presentes na sequência do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5: a mutação do ácido aspártico na 10ª posição do N-terminal da cadeia B (ou seja, B10), e, separadamente, a
117 / 175 mutação da histidina na 8ª posição da extremidade N-terminal da cadeia A (ou seja, A8). Os resultados sugerem que as proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo composições de aminoácidos de polipeptídeo insulina contendo essas duas mutações de aminoácidos particulares são provavelmente imunogênicas em cães e, portanto, provavelmente darão origem a anticorpos antifármaco que neutralizam a bioatividade após injeções repetidas. Portanto, foi determinado que os polipeptídeos insulina que não contêm o ácido aspártico B10 e histidina A8 são preferidos para proteínas de fusão insulina-Fc que precisam ser administradas repetidamente em cães por longos períodos em longo prazo (por exemplo, para tratar o diabetes canino).
EXEMPLO 25 PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC QUE COMPREENDE O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 5 E UM FRAGMENTO DE IGGB CANINA NÃO GLICOSILADO EM QUE AS MUTAÇÕES B10D E A8H DO POLIPEPTÍDEO INSULINA SÃO RESTAURADAS PARA AS
COMPOSIÇÕES NATIVAS PARA REDUZIR O POTENCIAL RISCO DE IMUNOGENICIDADE
[0218] Para avaliar se a substituição das mutações “hot spots” melhoraria a imunogenicidade e a bioatividade em doses repetidas da proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o fragmento Fc do isotipo IgGB canino, uma proteína de fusão insulina-Fc exemplar (SEQ ID NO: 66) foi sintetizada na qual os aminoácidos B10 e A8 do polipeptídeo insulina foram restaurados às suas composições nativas de histidina e treonina, respectivamente (SEQ ID NO: 125) listadas abaixo com os aminoácidos não nativos sublinhados).
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCN (SEQ ID NO: 125)
[0219] Adicionalmente, devido aos potenciais benefícios adicionais das formas mutantes de cNg não glicosiladas, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 continha a mutação cNg-Q. A sequência de
118 / 175 aminoácidos completa da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 é fornecida abaixo:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVV VDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFQGTYRVVSVLPIGHQDWL KGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTC
LIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW QRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 66)
[0220] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 foi fabricada em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificada usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. O rendimento de proteína resultante foi de apenas 21 mg/L. A estrutura foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e a sequência foi adicionalmente identificada por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. A % de homodímero mensurada por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, foi de 98,0%, indicando que a proteína estava relativamente livre de agregados.
[0221] Apesar do título de homodímero relativamente baixo, de 21 mg/L, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 foi avaliada em cães quanto a bioatividade e imunogenicidade in vivo de acordo com os procedimentos dos Exemplos 11-13, respectivamente. A FIG. 10 demonstra que a restauração das mutações B10D e A8H em seus aminoácidos nativos (ou seja, B10H e A8T) na proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 reduziu significativamente a imunogenicidade do composto original (SEQ ID NO: 52).
[0222] Entretanto, como mostrado na Fig. 11, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 contendo os aminoácidos B10 e A8 nativos não era bioativa (ou seja, a NAOC era essencialmente zero).
119 / 175 EXEMPLO 26
TENTATIVAS DE INCORPORAR MUTAÇÕES ADICIONAIS DA CADEIA B E CADEIA A NO POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 125 PARA MELHORAR A BIOATIVIDADE DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC ASSOCIADAS QUE CONTÊM O FRAGMENTO FC DE
IGGB CANINA
[0223] O fato da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 não gerar anticorpos antifármaco (Exemplo 25) em comparação com a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 (Exemplo 20) fornece uma forte evidência para a teoria de que as mutações B10D e A8H no polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 são provavelmente os epítopos imunogênicos responsáveis pela produção de anticorpos antifármaco. No entanto, a falta de potência in vivo da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 em comparação com a da SEQ ID NO: 52 indica que essas duas mutações de aminoácidos também são responsáveis por atingir níveis aceitáveis de bioatividade. A falta de potência in vivo para a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 correlaciona-se com sua alta IC50 (mostrada na Tabela 9 abaixo) conforme medido pelo ensaio de ligação ao receptor de insulina de acordo com o método do Exemplo 7. Portanto, esforços adicionais foram necessários para aumentar a bioatividade da proteína de fusão insulina-Fc (ou seja, diminuir o valor de IC50 no ensaio de ligação ao receptor de insulina para menos de 5000 nM, ou mais preferencialmente menos de 4000 nM, ou ainda mais preferencialmente menos de 3000 nM) enquanto mantém um baixo grau de imunogenicidade, mantendo os aminoácidos B10 e A8 nativos no polipeptídeo insulina.
[0224] É sabido que várias porções da cadeia B da insulina e cadeia A são necessários para a ligação forte ao IR (Hubbard S.R., “Structural biology: Insulin meets its receptor”, Nature 2013; 493 (7431): 171- 172).
Portanto, as porções da cadeia B ou da cadeia A foram modificadas enquanto
120 / 175 B10 e A8 foram mantidos iguais aos da insulina nativa e a cadeia C e o ligante peptídico constantes. Muitas dessas proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. Suas sequências são mostradas abaixo, e os alinhamentos de sequência resultantes contra SEQ ID NO: 66 são mostrados na Fig. 12 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSHLVQALYLVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQL ENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVV VDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWL KGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTC
LIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW QRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 68)
FVNQHLCGSELVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVV DLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLK GKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLI
KDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ RGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 70)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGEAGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVV DLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLK
121 / 175
GKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLI
KDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ RGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 72)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFYYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVV DLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLK GKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLI
KDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ RGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 74)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVV DLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLK GKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLI
KDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ RGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 76) TABELA 9 % DE HOMODÍMERO, TÍTULOS DE HOMODÍMEROS, E VALORES DE IC50 IR PARA VÁRIAS SEQ ID NOS. Título de % de IC50 IR SEQ ID NO: homodímero HEK homodímero (nM) (mg/L) SEQ ID NO: 66 98,0% 21 >5000 SEQ ID NO: 68 97,6% 9 2624 SEQ ID NO: 70 81,4% 17 633 SEQ ID NO: 72 99,1% 22 >5000 SEQ ID NO: 74 96,6% 25 2402 SEQ ID NO: 76 98,0% 6 >5000
[0225] Em apenas três casos (SEQ ID NOs: 68, 70, e 74 que as mutações propostas melhoram a ligação ao IR (ou seja, há diminuição no valor
122 / 175 de IC50), em comparação com a SEQ ID NO: 66. Entretanto, nenhuma das mutações resultou em compostos que satisfazem o objetivo do desenho do estudo de produzir um maior título de homodímero, acima de 50 mg/L, e, em alguns casos, a mutações levou a uma produção significativamente reduzida (por exemplo, título de homodímero menor do que 20 mg/L).
EXEMPLO 27
TENTATIVAS DE INCORPORAR MUTAÇÕES DE CADEIA C NO POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 125 PARA MELHORAR A BIOATIVIDADE DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC ASSOCIADAS CONTENDO O FRAGMENTO FC DE IGGB CANINA
[0226] Os resultados obtidos no Exemplo 26 mostram que todas as tentativas de mutação da cadeia A e cadeia B do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 125 resultaram em títulos de homodímero em células HEK inaceitavelmente baixos da fusão insulina-Fc associada (ou seja, títulos de homodímero menores ou iguais a 25 mg/L). Portanto, havia necessidade de mais experimentação. No presente exemplo, a composição de cadeia C de um polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 125 foi mutada, tornando-a maior ou aumentando a sua flexibilidade. Foi demonstrado que a insulina nativa (por exemplo, insulina humana) sofre uma mudança conformacional significativa que envolve o movimento da cadeia B e o dobramento da cadeia A à medida que ela se liga ao receptor de insulina (por exemplo, conforme descrito por Menting, et al., Nature, 2013; 493 (7431): págs 241-245). A insulina nativa, ao contrário dos polipeptídeos insulina da presente invenção, é livremente capaz de passar por esta alteração conformacional no receptor de insulina, uma vez que é um polipeptídeo de cadeia dupla na sua forma nativa, ligadas unicamente por meio de duas ligações de dissulfeto sem que a cadeia C restrinja a mobilidade das cadeias A e B. Sem estar limitado por qualquer teoria particular, foi levantada a hipótese de que a cadeia C contida no polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 125 era muito inflexível (por exemplo, uma composição
123 / 175 de aminoácidos e sequência que não permite movimento fácil entre a cadeia B e Cadeia A) e/ou muito curta (por exemplo, aminoácidos insuficientes entre o C-terminal da cadeia B e o N-terminal da cadeia A), evitando assim que o polipeptídeo insulina sofra a mudança necessária na forma molecular necessária para uma forte ligação ao receptor de insulina. Portanto, várias proteínas de fusão insulina-Fc foram sintetizadas com base na proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 com variações na cadeia C do polipeptídeo insulina conforme mostrado abaixo com os alinhamentos de sequência resultantes contra a SEQ ID NO: 66 mostrada na Fig. 13 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSHLVQALYLVCGERGFFYTDPTQRGGGGGQRGIVEQCCTSICSL YQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVT CVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQD WLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSL
TCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 78)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSI CSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTP EVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIG HQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNT
VSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVD KSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 80)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQ LENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 82)
124 / 175
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQL ENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVV VDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWL KGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTC
LIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW QRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 84) TABELA 10 % DE HOMODÍMERO, TÍTULOS DE HOMODÍMEROS, E VALORES DE IC50 IR PARA VÁRIAS SEQ ID NOS. Título de % de homodímero em IC50 IR SEQ ID NO: homodímero HEK (mg/L) (nM) SEQ ID NO: 66 98,0% 21 >5000 SEQ ID NO: 78 94,0% 8 4176 SEQ ID NO: 80 99,6% 37 1609 SEQ ID NO: 82 98,3% 42 >5000 SEQ ID NO: 84 98,6% 33 4720
[0227] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As % de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. Em apenas um caso, (SEQ ID NO: 80) que compreende a cadeia C mais longa (GGGGGGSGGGG), a mutação da cadeia C melhorou significativamente a afinidade de ligação ao receptor de insulina (IC50 inferior a 3000 nM) em comparação com a afinidade
125 / 175 de ligação ao receptor de insulina da proteína de fusão Fc de SEQ ID NO: 66.
No entanto, nenhuma das proteínas de fusão insulina-Fc com cadeia C mutada exibiu um título de homodímero maior do que o objetivo do estudo de produção de 50 mg/L. Na verdade, num caso (SEQ ID NO: 78) a mutação da cadeia C inesperadamente levou a títulos de homodímeros significativamente inferiores.
EXEMPLO 28
TENTATIVAS DE INCORPORAR MUTAÇÕES NO LIGANTE PEPTÍDICO NAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC CONTENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 125 E O
FRAGMENTO FC DE IGGB CANINA PARA MELHORAR A BIOATIVIDADE
[0228] Sem estar ligado a qualquer teoria específica, foi suposto que outra possível razão para a fraca ligação ao receptor de insulina da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 envolvia o impedimento estereoquímico entre o polipeptídeo insulina e o receptor de insulina, resultante da proximidade da molécula do fragmento Fc muito maior ligada ao polipeptídeo insulina pelo ligante peptídico. Acreditava-se que ligantes peptídicos mais curtos ou ligantes peptídicos mais firmemente dobrados potencialmente exacerbavam este problema, enquanto que ligantes peptídicos mais longos ou ligantes peptídicos que são resistentes à dobragem (enovelamento) sobre si mesmos (por exemplo, ligantes com rigidez mais molecular) pode aliviar este problema criando mais espaço entre o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc. O espaço aumentado entre o polipeptídeo insulina e o fragmento Fc também aumentaria a distância entre o receptor de insulina e o fragmento Fc levando a menos interferência durante a ligação ao receptor de insulina. Foi levantada a hipótese de que o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12 (ou seja, GGGGAGGGG) utilizado para construir a proteína de fusão insulina- Fc de SEQ ID NO: 66 é potencialmente muito curto e/ou demasiado flexível, pois os aminoácidos que compreendem o ligante não contém cadeias laterais (ou seja, contém apenas os aminoácidos glicina e alanina). Portanto, para
126 / 175 testar esta hipótese, foram sintetizadas duas outras variantes da proteína de fusão insulina-Fc a partir da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66. A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 76 continha o mesmo ligante peptídico que foi usado para construir a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66, mas com um polipeptídeo insulina em que a asparagina na 21ª posição N-terminal da cadeia A (ou seja, A21) estava ausente (ou seja, des- A21). Esta mutação particular foi incorporada para ver se a junção entre a cadeia A e o ligante peptídico afeta o rendimento de proteína e/ou a bioatividade da molécula. A outra proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 86 contém esta mutação na cadeia A (des-A21N) e um ligante peptídico que tem um comprimento duas vezes maior do que o ligante peptídico utilizado para construir a proteína de fusão insulina-Fc de ID SEQ NO: 66. Neste ligante peptídico mais longo, a alanina é desfavorecida e, em vez disso, é substituída por uma glutamina, que contém uma cadeia lateral de amida polar. Era esperado que as substituições de glutamina aumentassem a natureza hidrofílica do ligante peptídico e, potencialmente, evitassem que o ligante dobrasse em si mesmo. As sequências são mostradas abaixo com os alinhamentos de sequência resultantes contra a SEQ ID NO: 66 exibida na Fig.
14 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKD TLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYR VVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPS
REELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYF LYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 86)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVV
127 / 175
DLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLK GKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLI
KDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ RGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 76) TABELA 11 % DE HOMODÍMERO, TÍTULOS DE HOMODÍMEROS, E VALORES DE IC50 IR PARA VÁRIAS SEQ ID NOS. Título de % de IC50 IR SEQ ID NO: homodímero em homodímero (nM) HEK (mg/L) SEQ ID NO: 66 98,0% 21 >5000 SEQ ID NO: 76 98,0% 6 >5000 SEQ ID NO: 86 99,6% 11 1281
[0229] As duas proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC- MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. Suas % de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. A incorporação de um longo ligante peptídico de diferente composição (GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG para SEQ ID NO: 86 vs. GGGGAGGGG para SEQ ID NO: 66) fez melhorar a ligação, conforme medido pela significativa redução nos valores de IC50 para o receptor de insulina, indicando que ligantes mais longos podem ser uma estratégia para aumentar a ligação ao receptor de insulina em outras proteínas de fusão insulina-Fc. No entanto, a incorporação de um ligante mais longo ainda não melhorou os títulos de
128 / 175 homodímero para acima do objetivo do estudo de fabricação superior a 50 mg/L.
EXEMPLO 29
TENTATIVAS DE DELETAR PORÇÕES DA CADEIA B DO POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 125 PARA MELHORAR O TÍTULO DE HOMODÍMERO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC ASSOCIADAS CONTENDO O FRAGMENTO FC DE IGGB CANINA
[0230] Os resultados do Exemplo 28 demonstram que o ligante peptídico pode ser modificado para aumentar a afinidade de ligação ao receptor de insulina da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66, que contém os aminoácidos B10 e A8 nativos. Entretanto, a mutação do ligante peptídico não conseguiu aumentar o título de homodímero o suficiente para atender ao objetivo do projeto de fabricação. Como o título do homodímero é uma função de várias propriedades, incluindo a síntese intracelular e o processamento dentro das células, foi hipotetizado que talvez a molécula de insulina-Fc fosse autoassociada (ou seja, agregada) intramolecularmente durante e após a síntese entre os dois monômeros do homodímero ou intermolecularmente entre dois ou mais homodímeros separados. Esta agregação levaria a títulos de homodímero inaceitavelmente baixos obtidos a partir dos sobrenadantes da cultura de células durante o processo de produção descrito nos Exemplos 1, 3 e 6. Essa interação potencial entre as moléculas da proteína de fusão insulina-Fc pode ser devido, em parte, à conhecida propensão da insulina de se autoassociar e formar agregados. Um método conhecido no estado da técnica para reduzir a e propensão da insulina em se autoassociar envolve a mutação dos aminoácidos próximos da extremidade C- terminal da cadeia B. Por exemplo, a insulina lispro (B28K; mutações B29P) e a insulina aspart (mutação B28D) são insulinas comerciais de duas cadeias bem conhecidas com mutações na cadeia B não nativa que impedem a associação e agregação, assim, dando origem a uma forma predominantemente
129 / 175 monomérica de insulina em solução. Outra abordagem para prevenir a agregação envolve deleções estruturais de aminoácidos. Por exemplo, uma insulina de duas cadeias conhecida como insulina despentapeptídeo (DPPI; consulte Brange J., Dodson G.G., Edwards J., Holden P.H., Whittingham J.L.
1997b. “A model of insulin fibrils derived from the x-ray crystal structure of a monomeric insulin (despentapeptide insulin)” Proteins 27 507-516), é idêntica à insulina humana de duas cadeias nativa, exceto que os cinco aminoácidos C- terminais da cadeia B (YTPKT) são removidos. A DPPI tem uma menor afinidade de ligação para o receptor de insulina, em comparação com a insulina humana de cadeia dupla nativa, mas é completamente monomérica em solução, o que significa que não há associação ou agregação significante entre as moléculas de DPPI. Portanto, em uma tentativa de diminuir o potencial para autoassociação intramolecular e intermolecular e melhorar o título do homodímero da proteína de fusão insulina-Fc, várias variantes da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 66 foram construídas usando truncamentos de aminoácidos da cadeia B parcial e mutações de aminoácidos na cadeia B conforme descrito acima para DPPI, insulina lispro e insulina aspart. As sequências são mostradas abaixo com os alinhamentos de sequência resultantes contra a SEQ ID NO: 66 exibida na Fig. 15 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQ LENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCV VVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDW LKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLT
CLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 82)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQL ENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVV VDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWL
130 / 175
KGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTC
LIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW QRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 84)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTQGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQL ENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVV VDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWL KGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTC
LIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW QRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 88) TABELA 12 % DE HOMODÍMERO, TÍTULOS DE HOMODÍMEROS, E VALORES DE IC50 IR PARA VÁRIAS SEQ ID NOS. Título de % de SEQ ID NO: homodímero em IC50 IR (nM) homodímero HEK (mg/L) SEQ ID NO: 66 98,0% 21 >5000 SEQ ID NO: 82 98,3% 42 1915 SEQ ID NO: 88 99,4% 22 2195 SEQ ID NO: 84 98,6% 33 1930
[0231] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. O título de homodímero dos compostos resultantes só foi significativamente aumentado
131 / 175 em um caso (SEQ ID NO: 82), mas inesperadamente, a afinidade do receptor de insulina foi melhorada para todos os compostos mutados (SEQ ID NOs: 82, 88 e 84).
EXEMPLO 30 TENTATIVAS DE COMBINAR MUTAÇÕES NA CADEIA B, CADEIA C E CADEIA A,
TRUNCAMENTO DA CADEIA B E MUTAÇÕES DE LIGAÇÃO À PROTEÍNA DE FUSÃO DE INSULINA-FC DE SEQ ID NO: 66 PARA MELHORAR AINDA MAIS A TITULAÇÃO E
BIOATIVIDADE DE HOMODÍMERO
[0232] Conforme mostrados nos Exemplos 26, 27, 28, e 29, nenhuma estratégia única incorporou com sucesso um polipeptídeo insulina compreendendo os aminoácidos B10 e A8 nativos não imunogênicos com o fragmento Fc de IgGB canina para formar uma proteína de fusão insulina-Fc com atividade sobre o receptor de insulina e títulos de homodímero aceitáveis.
Portanto, os conceitos de uma cadeia C mais longa, um ligante peptídico mais longo e o truncamento dos aminoácidos C-terminais da cadeia B foram combinados. Além disso, para diminuir potencialmente ainda mais a tendência de autoassociação e agregação, as mutações pontuais adicionais foram introduzidas aos sítios de resíduos de aminoácido hidrofóbicos da insulina nativa utilizando aminoácidos menos hidrofóbicos, incluindo aqueles com grupos laterais que são negativamente ou positivamente carregados em pH fisiológico. Exemplos de tais mutações incluem alterações de tirosina para alanina, tirosina para ácido glutâmico, isoleucina para treonina e fenilalanina para histidina. Além disso, para simplificar a análise, em todos os casos o sítio cNg do fragmento Fc de IgGB canina foi restaurado à sua asparagina nativa.
As sequências para essas proteínas de fusão insulina-Fc variantes são mostradas abaixo com os alinhamentos de sequência resultantes contra a SEQ ID NO: 66 mostrados na Fig. 16 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFFYTPKTGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQ
132 / 175
LENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKP KDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGT YRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLP
PSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGS YFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 90)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCNHGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFN GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV
LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 92)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFN GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV
LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 34)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 32)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFFYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
133 / 175
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 94) TABELA 13 % DE HOMODÍMERO, TÍTULOS DE HOMODÍMEROS, E VALORES DE IC50 IR PARA VÁRIAS SEQ ID NOS. Título de % de IC50 da Ligação SEQ ID NO: homodímero em homodímero ao IR (nM) HEK (mg/L) SEQ ID NO: 66 98,0% 21 >5000 SEQ ID NO: 90 97,9% 69 3869 SEQ ID NO: 92 99,5% 101 554 SEQ ID NO: 34 99,7% 107 1247 SEQ ID NO: 94 99,7% 128 2043 SEQ ID NO: 32 99,4% 187 2339
[0233] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. Os resultados mostram que uma combinação de diminuição da hidrofobicidade de determinados aminoácidos da cadeia B e cadeia A, usando sequências de
134 / 175 peptídeo C maiores e mais flexíveis, vários truncamentos de aminoácidos C- terminais da cadeia-B, e utilizando um ligante peptídico maior resultou em várias proteínas de fusão insulina-Fc úteis que atendem os critérios do projeto em relação ao título mínimo de homodímero e a atividade de ligação ao receptor de insulina. As SEQ ID NOs: 92, 34, 32 e 94 (368d), (366d), (218d) e (375d) mostraram valores de IC50 para o receptor de insulina mais preferíveis (menos de 3000 nM) e valores de título de homodímero em células HEK mais preferíveis (títulos superiores a 100 mg/L) do que a SEQ ID NO: 66 ou SEQ ID NO: 90. Surpreendentemente, a mudança de apenas alguns aminoácidos leva a uma melhora multifacetada na afinidade do receptor de insulina e, no caso da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32, um aumento dramático no título de homodímero em relação à proteína de fusão insulina-Fc original de SEQ ID N O: 66.
EXEMPLO 31 BIOATIVIDADE IN VIVO, BIOATIVIDADE EM DOSES REPETIDAS E IMUNOGENICIDADE DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC CONSTRUÍDAS A PARTIR DO POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 7, O LIGANTE PEPTÍDICO DE SEQ ID NO: 14, E O FRAGMENTO FC DE IGGB CANINA DE SEQ ID NO: 16
[0234] Devido o título de homodímero positivo e resultados da atividade de ligação ao receptor de insulina do Exemplo 30, duas das proteínas de fusão insulina-Fc mais promissoras (SEQ ID NOs: 32 e 34) foram testadas em cães para avaliar a bioatividade e imunogenicidade em doses repetidas.
Cada composto compreende o ligante peptídico mais longo e hidrofílico de SEQ ID NO: 14 e o fragmento Fc de IgGB canina mais fabricável e menos agregado de SEQ ID NO: 16. De modo mais importante ainda, ambas as proteínas de fusão insulina-Fc compreendem polipeptídeos insulina com os aminoácidos B10 e A8 nativos putativamente menos imunogênicos (ou seja, em geral de SEQ ID NO: 7). No caso da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ
135 / 175 ID NO: 3 4, a asparagina na posição A21 está presente (isto é, o polipeptídeo insulina compreende a SEQ ID NO: 9). No caso da proteína de fusão insulina- Fc de SEQ ID NO: 3 2, a asparagina na posição A21 está ausente (isto é, o polipeptídeo insulina compreende a SEQ ID NO: 8).
[0235] A bioatividade in vivo da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 foi testada em N = 1 cão de acordo com o procedimento do Exemplo 10. Os resultados mostrados na FIG. 17 para uma única dose subcutânea demonstram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 é de fato bioativa in vivo, com uma NAOC de 1,076 %FBGL dias kg/mg calculada de acordo com o procedimento do Exemplo 11. O perfil farmacocinético da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 foi medido pelo método do Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos foi ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação que era de cerca de 3,5 dias.
[0236] A bioatividade das doses repetidas foi então avaliada continuando a administrar subcutaneamente a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 em N = 1 cão no dia 14, dia 28 e dia 42 após a injeção inicial de acordo com o procedimento do Exemplo 8. Quando a %FBGL do cão caiu muito, o cão recebeu comida para elevar a glicose sanguínea a um nível seguro. A NAOC e NAOCR foram medidas para cada dose subsequente de acordo com o procedimento geral do Exemplo 11, calculada a partir do momento em que a dose foi administrada até imediatamente antes de a próxima dose ser administrada. A NAOC e NAOCR mostradas na Tabela 14 ilustram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 mantém uma NAOCR maior que 0,8 ao longo das quatro doses, satisfazendo, assim, o objetivo do desenho do estudo de exibir bioatividade em doses repetidas. TABELA 14 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 34
136 / 175 Injeção nº Dia NAOC (%FBGL·dias·kg/mg) NAOCR 1 0 1076 1,0 2 14 1005 0,9 3 28 900 0,8 4 42 838 0,8
[0237] A imunogenicidade da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 foi testada de acordo com o procedimento do Exemplo 13. A FIG. 18 demonstra que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 não exibe imunogenicidade in vivo aparente de acordo com a manutenção da bioatividade in vivo ao longo do experimento de doses repetidas.
[0238] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32, com a asparagina em A21 da cadeia do polipeptídeo insulina ausente, também foi avaliada quanto ao desempenho de bioatividade em doses repetidas em cães.
O composto foi administrado por via subcutânea a N = 1 cão no dia 0, dia 14, dia 28 e no dia 42 de acordo com o procedimento do Exemplo 11. Quando a %FBGL do cão caiu muito, o cão recebeu comida para elevar a glicose sanguínea a um nível seguro. A NAOC para a primeira injeção foi um valor impressionante de 2278 %FBGL dias kg/mg, que mostra que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 era satisfatoriamente bioativa in vivo, em quase duas vezes a potência da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO:
34. O perfil farmacocinético da proteína de fusão insulina-Fc foi medido pelo método do Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos foi ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação que era de 4,1 ± 0,7 dias. As Figs. 19 e 20 mostram o controle de glicose sanguínea de dose única e controle de glicose sanguínea multidose de várias semanas para animais que receberam o homodímero de SEQ ID NO: 32. A NAOC e NAOCR também foram medidas para cada dose subsequente de acordo com o procedimento geral do Exemplo 11, calculada a partir do momento em que a
137 / 175 dose foi administrada até imediatamente antes de a próxima dose ser administrada. A NAOC e NAOCR mostradas na Tabela 15 ilustram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 mantém uma NAOCR maior ou igual a 1,0 ao longo das quatro doses, satisfazendo, assim, o objetivo do desenho do estudo de exibir bioatividade em doses repetidas descrito no exemplo 16.
[0239] A imunogenicidade da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 foi testada de acordo com o procedimento do Exemplo 13. A FIG. 21 demonstra que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 não exibe imunogenicidade in vivo aparente de acordo com a manutenção da bioatividade in vivo ao longo do experimento de doses repetidas.
TABELA 15 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 32 Injeção nº Dia NAOC (%FBGL·dias·kg/mg) NAOCR 1 0 2278 1,0 2 14 4029 1,8 3 28 3450 1,5 4 42 3257 1,4
[0240] Conforme discutidos na Descrição Detalhada da invenção, existe um sítio de clivagem enzimática conhecido entre as ligações asparagina- glicina (Vlasak, J., Ionescu, R., (2011) MAbs Vol. 3, No. 3 págs 253-263). A omissão da asparagina no 21º aminoácido na cadeia A (ou seja, A21) no polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 contido na proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 com o ligante peptídico de SEQ ID NO: 14, elimina a possibilidade de clivagem enzimática da ligação asparagina-glicina entre o C- terminal da cadeia A e o N-terminal do ligante peptídico. Entretanto, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 3 4 compreende o ligante peptídico de SEQ ID NO: 14 e o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8, que mantém a
138 / 175 asparagina em A21. Portanto, seria de se esperar que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 fosse digerida enzimaticamente durante a síntese ou in vivo após a administração subcutânea. No entanto, ao invés disso, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 34 foi inesperadamente produzida em HEK células com um título de homodímeros aceitável e demonstrou bioatividade in vivo aceitável sem sinais de digestão enzimática que pudesse comprometer sua bioatividade.
EXEMPLO 32
CONFIRMAÇÃO DO FRAGMENTO FC DO ISOTIPO IGGB CANINO PARA A CAPACIDADE
DE FABRICAÇÃO IN VIVO E EFICÁCIA IN VIVO ÓTIMAS DA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA PREFERIDO DE SEQ ID NO: 8 E O LIGANTE PEPTÍDICO PREFERIDO DE SEQ ID NO: 14
[0241] Tendo descoberto uma nova combinação de polipeptídeos insulina e ligantes peptídicos resultando em proteínas de fusão insulina-Fc não imunogênicas, de alto rendimento, alta pureza, e altamente bioativas, tal como descrito nos Exemplos 30 e 31, restava saber se o fragmento Fc de IgGB canina ainda era o isotipo preferido com relação ao título de homodímero e bioatividade, como foi o caso das proteínas de fusão insulina-Fc nos Exemplos 19 e 20. Portanto, foram projetadas proteínas de fusão insulina-Fc adicionais nas quais o polipeptídeo insulina (SEQ ID NO: 8) e o ligante peptídico (SEQ ID NO: 14) da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 foram mantidos constantes, e o fragmento Fc de IgGB canina de SEQ ID NO: 16 foi substituído pelo fragmento Fc de IgGA canina de SEQ ID NO: 15, fragmento Fc de IgGC canina de SEQ ID NO: 17, ou fragmento Fc de IgGD canina de SEQ ID NO: 18.
As sequências para essas variantes resultantes da proteína de fusão insulina- Fc são mostradas abaixo:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK
139 / 175
PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 32)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIF PPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQF NGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYV
LPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDE DGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 96)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPP KPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSN GTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYV
LPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDE DGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPG (SEQ ID NO: 98)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKP KDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYR VVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSP
KELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYF LYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPG (SEQ ID NO: 100)
[0242] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando colunas de
140 / 175 Proteína A ou Proteína G de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC- MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. Além disso, as afinidades da proteína de fusão insulina-Fc para o receptor FcRn canino foram medidas de acordo com o Exemplo 8. Conforme é mostrado na Tabela 16, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 compreendendo o fragmento Fc de IgGB canina demonstrou o maior título de homodímero dessas sequências. A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 96 compreendendo o fragmento Fc de IgGA canina exibiu um título de homodímero pobre quando purificada usando uma coluna de Proteína A; no entanto, quando foi purificada usando uma coluna de proteína G, o título do homodímero foi significativamente melhorado, excedendo a meta do estudo de títulos maiores que 50 mg/L. O mesmo foi verdadeiro para a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 98 compreendendo o fragmento Fc de IgGC canina.
A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 100 compreendendo o fragmento Fc de IgGD canina não produziu nenhum composto quando purificada com uma coluna de Proteína A ou Proteína G. Portanto, como foi demonstrado com a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 contendo um polipeptídeo insulina diferente (SEQ ID NO: 5) e ligante peptídico (SEQ ID NO: 12), o fragmento Fc de IgGB canina foi preferido com relação ao título de homodímero (consulte o Exemplo 19).
TABELA 16 TÍTULOS DE HOMODÍMERO, LIGAÇÃO AO IR E LIGAÇÕES AO FCRN PARA SEQUÊNCIAS UTILIZANDO FRAGMENTOS FC DE IGGA, IGGB, IGGC, E IGGD CANINAS NATIVAS
141 / 175 Fragmento Fc do EC50 da Ligação Rendimento de IC50 da Ligação primeira dose homodímero homodímero (Proteína G) (Proteína G) dias·kg/mg) Proteína A / Proteína A / SEQ ID NO: Isotipo IgG ao IR (nM) Porteína - NAOC na (%FBGL· Título de ao FcRn (ng/mL) (mg/L) (mg/L) % de 187 / 99% / 32 IgGB 185 2339 599 2278 (DNM) (DNM) 45% / 96 IgGA 10 / (69) 62‡ 2586# 1610 174 (91%) 0% / 2084‡ 98 IgGC 0 / (86) 81‡ >200000 39 (94%) (DNM)/ 100 IgGD 0 / (0) 0 DNM DNM DNM (DNM) DNM = não mensurado; # = purificado por proteína A; ‡ = purificado por Proteína G.
[0243] A bioatividade in vivo da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 96 compreendendo o fragmento Fc de IgGA canina que foi purificada via Proteína G foi testada de acordo com o procedimento do Exemplo 10. Os resultados ilustrados na FIG. 22 mostram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 96 é apenas um pouco bioativa in vivo com uma NAOC de apenas 174 %FBGL dias kg/mg calculada de acordo com o Exemplo 11.
[0244] A bioatividade in vivo da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 98 compreendendo o fragmento Fc de IgGC canina foi purificada via Proteína G e testada de acordo com o procedimento do Exemplo 10. Os resultados ilustrados na FIG. 23 mostram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 98 é apenas um pouco bioativa in vivo com uma NAOC de apenas 39 %FBGL dias kg/mg calculada de acordo com o Exemplo 11.
[0245] Portanto, como foi demonstrado com a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 contendo um polipeptídeo insulina diferente (SEQ ID NO: 5) e ligante peptídico (SEQ ID NO: 12), o fragmento Fc de IgGB
142 / 175 canina foi o fragmento Fc preferido com relação à bioatividade (vide os Exemplos 19 e 20 e a tabela 6 acima).
EXEMPLO 33 PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC NÃO GLICOSILADAS QUE COMPREENDEM O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 8, O LIGANTE PEPTÍDICO DE SEQ ID NO: 14 E O FRAGMENTO FC DE IGGB CANINA PARA REDUZIR O POTENCIAL RISCO DE
IMUNOGENICIDADE
[0246] Embora a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 satisfaça todos os objetivos do desenho do estudo (Exemplo 16), pode haver ou não um risco de imunogenicidade ao longo de períodos prolongados de tratamento (por exemplo, 6 meses, 1 ano, 2 anos ou mais), o que poderia comprometer o uso desta proteína de fusão insulina-Fc para o tratamento do diabetes, caso isso ocorresse. Como descrito na Descrição Detalhada da Invenção e nos Exemplos 21 e 22, uma possível causa de uma redução da bioatividade após doses repetidas é a interação indesejada do fragmento Fc de IgGB canina com o sistema imune do cão resultando na produção de anticorpos antifármacos neutralizantes. No entanto, os resultados mostrados no Exemplo 32 demonstram que, inesperadamente, o isotipo IgGB canino foi a única opção dos quatro isotipos IgG caninos que produziu a capacidade de fabricação e bioatividade desejadas. Portanto, outras mutações Fc foram exploradas para alcançar proteínas de fusão insulina-Fc não glicosiladas com baixa ligação ao receptor Fc(gama)RI, o que deve reduzir o risco de imunogenicidade crônica de longo prazo.
[0247] Conforme descrito na Descrição Detalhada da Invenção, um método para reduzir a interação do Fc(gama)RI envolve a mutação do sítio cNg do fragmento Fc para prevenir a glicosilação durante a síntese na célula hospedeira. Portanto, foram feitas mutações no sítio cNg na região do fragmento Fc de SEQ ID NO: 32 para reduzir a afinidade de ligação do
143 / 175 fragmento Fc para os receptores Fc(gama) in vivo, conforme medido por um ensaio in vivo de ligação ao Fc(gama)RI humano descrito no Exemplo 8. A posição do sítio cNg na proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 é cNg- NB151. Mutações na SEQ ID NO: 32 incluíram a SEQ ID NO: 104 compreendendo uma mutação cNg-NB151-S e SEQ ID NO: 102 compreendendo a mesma mutação cNg-NB151-S, bem como uma mutação NB119-A. A NB119-A foi incorporada em uma tentativa adicional de reduzir a interação com Fc(gama)RI, como foi descrito apenas para uso em anticorpos de camundongos por Lo, M. et al. “Effector attenuating substitutions that maintain antibody stability and reduce toxicity in mice”, J. Biol. Chem. (2017), págs. 1-20. As sequências de aminoácidos completas das proteínas de fusão insulina-Fc resultantes estão listadas abaixo (sítios NB119 e NB151 sublinhados para maior clareza), juntamente com seus alinhamentos de sequência (Clustal Omega) que são mostrados na Fig. 24:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGT YRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLP
PSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGS YFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 102)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 104)
144 / 175
[0248] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. Como mostrado na Tabela 17, a incorporação das mutações cNg-NB151-S no fragmento Fc diminuiu a % de homodímero, indicando um nível inaceitavelmente alto de agregação (isto é, a % de homodímero caiu para pouco acima de 70%).
TABELA 17 TÍTULOS DE HOMODÍMEROS PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC NÃO GLICOSILADAS DE SEQ ID NO: 102 E 104 proteína (mg/L) IC50 da Ligação Rendimento de Fragmento de homodímero homodímero SEQ ID NO: Relevantes ao IR (nM) Mutações Título de (mg/L) % de IgG 32 IgGB cNg-NB-151-N 187 99% 185 2339 102 IgGB cNg-NB-151- 78 73% 57 3093 S, NB119-A 104 IgGB cNg-NB151-S 130 71% 93 2302
[0249] A bioatividade in vivo das proteínas de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 104 foi testada em N = 1 cão de acordo com o procedimento do Exemplo 10. Os resultados mostrados na Fig. 25 para uma dose subcutânea única demonstram que ambos os compostos foram
145 / 175 significativamente menos bioativos in vivo do que a proteína de fusão insulina- Fc de SEQ ID NO: 32 (NAOC para a SEQ ID NO: 104 = 574 %FBGL dias kg/mg; NAOC para a SEQ ID NO: 102 = 921 %FBGL dias kg/mg). Os resultados indicam que a incorporação de mutações cNg-NB151-S no fragmento Fc para produzir versões não glicosiladas da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 32 inesperadamente diminuiu a bioatividade in vivo dos compostos resultantes.
[0250] Em uma tentativa para diminuir o grau de agregação e melhorar a bioatividade da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 104, contendo o sítio de mutação cNg-NB151-S, diversas variantes de cadeia B do polipeptídeo insulina foram investigadas com mutações em a região considerada responsável pela agregação. As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. Suas % de teor de homodímero foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6. Dentre as variantes de cadeia B testadas, descobriu-se inesperadamente que a proteína de fusão insulina-Fc (SEQ ID NO: 36) contendo uma substituição de tirosina para alanina no 16° aminoácido a partir do N-terminal da cadeia B (isto é, B16) possui títulos de homodímero elevados (105 mg/L) com baixa agregação (homodímero de 99%), resultando em um título de homodímero de 104 mg/L. A ligação ao receptor de insulina medida de acordo com o Exemplo 7 foi aceitável com um valor de IC 50 de 2040 nM. O valor de EC50 da afinidade de ligação ao receptor FcRn medido de acordo com o Exemplo 9 foi de 1194 ng/mL. O perfil farmacocinético da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 36 foi medido pelo método do
146 / 175 Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos foi ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação que era de 4,1 ± 0,7 dias. A sequência de SEQ ID NO: 36 é mostrada abaixo (mutações B16A e cNg-NB151-S sublinhadas para maior clareza).
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSG TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 36)
[0251] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 36 foi, em seguida, avaliada quanto o desempenho de bioatividade em doses repetidas em cães. O composto foi administrado por via subcutânea a N = 1 cão no dia 0, dia 7, dia 14, e dia 28 de acordo com o procedimento do Exemplo 11. Quando a %FBGL do cão caiu muito, o cão recebeu comida para elevar a glicose sanguínea a um nível seguro. Inesperadamente, em comparação com a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 104, a NAOC para a primeira injeção da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 36 contendo a mutação B16A foi significativamente maior (1185 %FBGL dias kg/mg). O gráfico de bioatividade da primeira dose in vivo é mostrado na Fig. 26. O perfil farmacocinético do composto também foi medido pelo método do Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos foi ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação que foi de 3,5 dias. A NAOC e NAOCR também foram medidas para cada dose subsequente de acordo com o procedimento geral do Exemplo 11, calculada a partir do momento em que a dose foi administrada até imediatamente antes de a próxima dose ser administrada. A NAOC e NAOCR mostradas na Tabela 18 ilustram que a
147 / 175 proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 36 mantém uma NAOCR maior ou igual a 0,6 ao longo das quatro doses, satisfazendo, assim, o objetivo do desenho do estudo de exibir bioatividade em doses repetidas. Tomados em conjunto, os resultados indicam que foi necessário mutar a sequência da cadeia B da insulina para obter uma variante cNg-S não glicosilada adequada de SEQ ID NO: 32. Portanto, o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 11 foi preferido para as proteínas de fusão insulina-Fc não glicosiladas compreendendo fragmentos Fc de IgGB canina com sítio cNg mutado.
TABELA 18 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 36 Injeção nº Dia NAOC (%FBGL·dias·kg/mg) NAOCR 1 0 1185 1,0 2 7 954 0,8 3 14 764 0,6 4 28 991 0,8
[0252] Por fim, os compostos selecionados foram testados quanto à probabilidade de interagir com o sistema imunológico pela medição de suas atividades de ligação ao receptor Fc(gama) de acordo com o procedimento do Exemplo 8. A Tabela 19 compara a ligação do receptor Fc(gama)I dessas proteínas de fusão insulina-Fc com a ligação ao receptor Fc(gama) da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52. Pode ser observado que as proteínas de fusão insulina-Fc não glicosiladas (alcançadas através de uma mutação no sítio cNg-S) exibiram uma razão de ligação ao receptor Fc(gama) mais baixa para SEQ ID NO: 52.
TABELA 19 LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC(GAMA) PARA VARIAÇÕES DE CNG DE SEQ ID NO: 52
148 / 175 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Mutação de Razão para concentraç Fc(gamma) Glicosilaçã RI de 3000 Isotipo do OD450nm Espécies/ Fundo do Menos o em uma (ng/mL) OD450nm Ensaio ão de valor Fc 52 o Canina / CNg SEQ ID NO: 52 0,428 0,371 1,00 IgGB nativa Canina / CNg SEQ ID NO: 32 0,368 0,311 0,84 IgGB nativa Canina / CNg SEQ ID NO: 96 0,253 0,196 0,53 IgGA nativa Canina / SEQ ID NO: 104 cNg-S 0,175 0,118 0,32 IgGB Canina / cNg-S e SEQ ID NO: 102 0,166 0,109 0,29 IgGB NB119-A Canina / cNg-S e SEQ ID NO: 36 0,177 0,120 0,32 IgGB B16A EXEMPLO 34
EXEMPLOS DE EXECUÇÕES DE PRODUÇÃO BASEADA EM CÉLULAS CHO UTILIZANDO PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC PREFERIDAS QUE COMPREENDEM FRAGMENTOS FC DE IGGB CANINA PRODUZIDAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS CHO TRANSFECTADAS DE FORMA ESTÁVEL
[0253] Linhagens de células CHO separadas estavelmente transfectadas com vetores que codificam SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 36 foram construídas como descrito no Exemplo 2. Culturas de produção de 14 dias em balões em sistema descontínuo-alimentado (ou “Fed-Batch”) agitadas (escala de meio 0,5-2,0 L) foram semeadas a 0,5 milhões de células/mL em uma incubadora-agitadora ajustada à 37ºC e 5% de dióxido de carbono, e as culturas foram conduzidas conforme descrito em Exemplo 2, exceto que o meio CD OptiCHO foi substituído por Dynamis como meio de crescimento (ThermoFisher) e Efficient Feed C (ThermoFisher) foi usado como suplemento.
A suplementação foi adicionada a 3% v/v começando no dia 3 da produção e no dia 4, a temperatura do frasco de agitação foi ajustada para 32ºC e a concentração de dióxido de carbono da incubadora-agitadora foi reduzida de 5% para 2%. Durante a execução, as células aumentaram para entre 8-14 milhões de células/mL e no Dia 14 a produção foi coletada para remover as
149 / 175 células e o sobrenadante da cultura foi purificado e testado para obter a proteína de fusão insulina-Fc conforme descrito nos Exemplos 3, 4, 5 e 6. A Tabela 20 descreve os dados de produção obtidos a partir das execuções com a linhagem de células CHO estavelmente transfectadas.
TABELA 20 TÍTULOS DE HOMODÍMEROS PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC NÃO GLICOSILADAS DE SEQ ID NO: 32 E SEQ ID NO: 36 Título de Rendimento de % de SEQ ID NO: homodímero proteína (mg/L) homodímero (mg/L) SEQ ID NO: 32 485 99,3% 482 SEQ ID NO: 36 260 99,0% 257 EXEMPLO 35
EXEMPLOS DE EXECUÇÕES DE PRODUÇÃO BASEADA EM CÉLULAS CHO UTILIZANDO PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC PREFERIDAS QUE COMPREENDEM FRAGMENTOS FC DE IGGB CANINA PRODUZIDAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS CHO TRANSFECTADAS DE FORMA ESTÁVEL
[0254] Uma linhagem de células CHO estavelmente transfectada com vetores que codificam a SEQ ID NO: 34 é construída conforme descrito no Exemplo 2. Culturas de produção de 14 dias em balões em sistema descontínuo-alimentado (ou “Fed-Batch”) agitadas (escala de meio 0,5-2,0 L) são semeadas a 0,5 milhões de células/mL em uma incubadora-agitadora ajustada à 37ºC e 5% de dióxido de carbono, e as culturas são conduzidas conforme descrito em Exemplo 2, exceto que o meio CD OptiCHO é substituído por Dynamis como meio de crescimento (ThermoFisher) e Efficient Feed C (ThermoFisher) é usado como suplemento. A suplementação é adicionada a 3% v/v começando no dia 3 da produção e no dia 4, a temperatura do frasco de agitação é ajustada para 32ºC e a concentração de dióxido de carbono da
150 / 175 incubadora-agitadora é reduzida de 5% para 2%. No Dia 14, a execução de produção é coletada para remover as células e o sobrenadante de cultura é purificado e testado para obter a proteína de fusão insulina-Fc conforme descrito no Exemplo 3, 4, 5 e 6. A produção resultante de SEQ ID NO: 34 dá um rendimento de proteína acima de 200 mg/L, teor de homodímero acima de 95% e título de homodímero acima de 190 mg/L.
RESULTADOS - PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO UM
FRAGMENTO FC FELINO EXEMPLO 36 PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO UM FRAGMENTO FC DO ISOTIPO IGG2 FELINO
[0255] Para desenvolver um produto adequado para uso em gatos, foi feita uma tentativa de produzir uma proteína de fusão insulina-Fc compreendendo a sequência do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4 e o fragmento Fc do isotipo IgG2 de gato (SEQ ID NO: 21) com a seguinte sequência de aminoácidos:
FVNQHLCGSDLVEALYLVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGSGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCL VVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWL KGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVT
CLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHW QRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 106)
[0256] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 foi sintetizada em células HEK de acordo com o Exemplo 1 e purificada de acordo com o Exemplo 3. A estrutura da proteína de fusão insulina-Fc foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e a sequência foi adicionalmente identificada por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. A % de homodímero do
151 / 175 composto resultante, medida por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, foi de 88%. O título de homodímero resultante foi de apenas 20 mg/L, resultante da incapacidade das células HEK produzir o produto em alto rendimento (o rendimento da proteína após a purificação da proteína foi de apenas 23 mg/L). Em resumo, a fabricação da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 em células HEK resultou em um nível moderado de agregados e um baixo título de homodímeros de 20 mg/L, que não atendeu ao objetivo do projeto de um título de homodímero superior a 50 mg/L.
[0257] No entanto, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 foi avaliada quanto à bioatividade. Em primeiro lugar, a ligação ao receptor da proteína de fusão de insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 mensurada de acordo com o Exemplo 7, que resulta em um valor IC50 de 22 nM, indica que o composto é susceptível de ser bioativo in vivo (ou seja, uma IC50 menor que
5.000 nM).
[0258] Em seguida, a farmacodinâmica (PD) in vivo da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 foi medida após uma única administração subcutânea do composto em N = 3 gatos na dose de 0,8 mg/Kg, de acordo com o Exemplo 10. A FIG. 27 mostra a porcentagem do nível de glicose sanguínea em jejum para a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ NO: 106 (106c) em função do tempo. A NAOC para a proteína de fusão insulina-Fc foi calculada como sendo 215 %FBGL dias kg/mg de acordo com o procedimento do Exemplo 11. Surpreendentemente, ao contrário da proteína de fusão insulina-Fc análoga para cães de SEQ ID NO: 42 compreendendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 12, a proteína de fusão insulina-Fc para gatos de SEQ NO: 106 foi considerada muito menos agregada e significativamente mais bioativa no animal alvo.
[0259] Uma vez que a NAOC era aceitável e os dados
152 / 175 farmacocinéticos eram favoráveis a uma administração semanal, os gatos receberam doses subcutâneas adicionais no dia 28, dia 35, dia 42 e dia 49 e a %FBGL foi medida para a janela de 7 dias após cada dose de acordo com o Exemplo 11. A NAOC e NAOCR foram calculadas de acordo com o procedimento do Exemplo 11 para cada injeção subcutânea repetida.
Conforme ilustrado na Tabela 21, a dosagem subcutânea repetida em gatos revelou inesperadamente uma queda significativa na bioatividade pela terceira dose, medida por uma diminuição significativa na NAOCR (ou seja, a NAOC para a terceira injeção foi de apenas 0,40, ou 40% da NAOC para a primeira injeção, e a NAOC para a quarta injeção foi de apenas 0,10, ou 10%, da NAOC para a primeira injeção). A queda significativa na bioatividade para a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 após dosagem repetida em gatos foi semelhante à observada para a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 52 em cães mostrada no Exemplo 20.
TABELA 21 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 106 Injeção nº Dia NAOC (%FBGL·dias·kg/mg) NAOCR 1 0 215 1,0 2 28 161 0,7 3 35 120 0,6 4 42 80 0,4 5 49 21 0,1 EXEMPLO 37
AVALIAÇÃO DAS MUTAÇÕES EM POLIPEPTÍDEOS INSULINA E A ESCOLHA DE FRAGMENTOS FC DE IGG1B OU IGG2 DE GATOS EM RELAÇÃO AO RENDIMENTO PROTEICO, PUREZA E ATIVIDADE SOBRE O RECEPTOR DE INSULINA
[0260] Em uma tentativa de aumentar a % de teor de homodímero e rendimento de proteína da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID N O: 106,
153 / 175 foram inseridas mutações nas sequências da cadeia B do polipeptídeo insulina (por exemplo, a mutação B16A) e ligante peptídico. Além disso, o fragmento Fc da IgG1b de gato (SEQ ID N O: 20) foi avaliado além do fragmento Fc de IgG2 de gato (SEQ ID N O: 21) que foi usado para construir a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID N O: 106. As sequências de proteína de fusão insulina- Fc resultantes são mostradas abaixo com os alinhamentos de sequência resultantes contra a SEQ ID NO: 106 mostrados na Fig. 28 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGSGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLV VDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLK GKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLI
EGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQR GNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 108)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGAGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCL VVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWL KGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVT
CLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHW QRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 110)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQL ENYCNGGGGSGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCL VVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWL KGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVT
CLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHW QRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 112)
[0261] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas
154 / 175 de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. As proteínas de fusão insulina-Fc variantes estão listadas na Tabela 22, juntamente com os rendimentos de proteína, % de homodímeros e títulos de homodímeros correspondentes. Os resultados mostram que as várias mutações, quando combinadas com o fragmento Fc do isotipo IgG1b felino para produzir a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 108, deram origem a um rendimento de proteína muito maior, mas a proteína resultante era mais agregada (por exemplo, menor % de homodímero do que a de SEQ ID NO: 106). Isto foi surpreendente, pois a IgG1b felina é mais semelhante na função ao fragmento Fc do isotipo IgGB de cão, que era o isotipo Fc altamente preferido para a produção de proteínas de fusão insulina-Fc caninas (Exemplo 32). Das composições mutadas para felinos contendo o isotipo IgG2 felino, àquelas que compreendem uma mutação B16 na cadeia B do polipeptídeo insulina (isto é, SEQ ID NO: 110 e SEQ ID NO: 112) levou a um rendimento de proteína e títulos de homodímero melhorados. No entanto, o ligante mutado presente nas SEQ ID NO: 110 (isto é, GGGGAGGGG) parece ter fornecido uma duplicação adicional no rendimento de proteína e título de homodímero em comparação com a SEQ ID NO: 112.
TABELA 22 PRODUÇÃO E LIGAÇÃO AO IR PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC UTILIZANDO FRAGMENTOS FC DE IGG1B E IGG2 FELINA
155 / 175 SEQ Fragment Rendimento % de Título de IC50 da ID o de IgG de proteína homodímero homodímero Ligação ao NO: (mg/L) (mg/L) IR (nM) 106 IgG2 23 88,0% 20 22 108 IgG1b 127 49,0% 62 62 110 IgG2 122 89,7% 109 41 112 IgG2 64 80,4% 51 53 EXEMPLO 38
TRIAGEM DA IMUNOGENICIDADE IN VIVO APÓS REPETIDAS DOSES POR VIA SUBCUTÂNEA DA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 4 COM UM FRAGMENTO FC DO ISOTIPO IGG2
FELINO
[0262] Sem estar ligado a qualquer explicação particular, postulou-se que a causa da redução significativa na bioatividade da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106, após a quarta dose repetida por via subcutânea em gatos (Exemplo 36), foi devido ao desenvolvimento de anticorpos antifármacos que neutralizam a atividade biológica das proteínas de fusão. Os anticorpos antifármacos podem ser direcionados contra o polipeptídeo insulina, ligante ou fragmentos Fc de uma proteína de fusão insulina-Fc. A resposta imunogênica se manifesta como interações entre células apresentadoras de antígenos, células T auxiliares, células B e suas citocinas associadas, que podem levar à produção de anticorpos endógenos contra a droga (por exemplo, anticorpos antifármacos). Os anticorpos de ligação são todos os isotipos capazes de se ligar à proteína de fusão insulina- Fc e estes podem ser detectados em um imunoensaio, conforme descrito no Exemplo 14. Os anticorpos neutralizantes que inibem a atividade funcional da proteína de fusão insulina-Fc são geralmente direcionados contra um sítio biologicamente ativo. Para avaliar se este foi o caso, o soro coletado antes da administração de cada dose, e no final do experimento descrito no Exemplo 11
156 / 175 foi testado para quantificar os níveis de anticorpos antifármaco de acordo com o Exemplo 14. Como mostrado na FIG. 29, os níveis de anticorpos antifármaco de fato aumentaram com múltiplas administrações subcutâneas do composto, indicando que a geração de anticorpos antifármaco neutralizantes foi a causa provável para a redução na NAOCR após a quarta injeção da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106.
EXEMPLO 39
RASTREIO DE SORO FELINO CONTENDO ANTICORPOS ANTIFÁRMACOS E IDENTIFICAÇÃO DE POTENCIAIS EPÍTOPOS IMUNOGÊNICOS NAS POSIÇÕES B10D E A8H DO POLIPEPTÍDIO INSULINA
[0263] Conforme observado para a SEQ ID NO: 52 em cães (Exemplo 20), a bioatividade de repetidas doses da proteína de fusão de SEQ ID NO: 106 compreendendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4 e ligante peptídico de SEQ ID NO: 13 deu origem ainda a anticorpos antifármacos (Exemplo 38). Foi hipotetizado, portanto, que o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4 pode conter inesperadamente epítopos específicos (ou seja, “hot spots” imunogênicos) contra os quais o sistema imunológico do gato é direcionado.
Portanto, a especificidade de ligação dos anticorpos presentes nas amostras de soro descritas no Exemplo 38 foi avaliada de acordo com o procedimento geral do Exemplo 15. A análise das amostras de soro de gato contendo anticorpos da dosagem repetida da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 106 (Exemplo 38) contra a biblioteca de proteína de fusão insulina-Fc revestida demonstrou que havia inesperadamente dois “pontos quentes” (hot spots) primários presentes na sequência do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4: a mutação do sítio B10D (ou seja, a mutação do ácido aspártico na 10ª posição do N-terminal da cadeia B (ou seja, B10)), e, separadamente, a mutação do sítio A8H (ou seja, a mutação da histidina na 8ª posição da extremidade N-terminal da cadeia A (ou seja, A8)). Os resultados sugerem que
157 / 175 as proteínas de fusão insulina-Fc compreendendo composições de aminoácidos de polipeptídeo insulina contendo essas duas mutações de aminoácidos particulares são provavelmente imunogênicas em gatos e, portanto, provavelmente darão origem a anticorpos antifármaco que neutralizam a bioatividade após injeções repetidas. Portanto, foi determinado que os polipeptídeos insulina que não contêm B10D e A8H são preferidos para proteínas de fusão insulina-Fc que precisam ser administradas repetidamente em gatos por longos períodos em longo prazo (por exemplo, para tratar o diabetes).
EXEMPLO 40 PROTEÍNAS DE FUSÃO DE INSULINA-FC QUE COMPREENDEM O POLIPEPTÍDEO INSULÍNICO DE SEQ ID NO: 4 E FRAGMENTOS FC DO ISOTIPO IGG1B E IGG2 FELINO GLICOSILADOS E NÃO GLICOSILADOS NOS QUAIS B10, A8 E OUTROS SÍTIOS DO
POLIPEPTÍDEO INSULINA ESTÃO MUTADOS PARA REDUZIR O RISCO DE POTENCIAL IMUNOGENICIDADE
[0264] Para avaliar se a substituição das mutações “hot spots” melhoraria a imunogenicidade e a bioatividade de proteínas de fusão insulina- Fc compreendendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4 e o fragmento Fc do isotipo IgG2 felino em doses repetidas, as proteínas de fusão insulina-Fc exemplares de SEQ ID NOs: 114, 116 e 118 foram sintetizadas nos quais os aminoácidos B10 e A8 do polipeptídeo insulina foram restaurados às suas composições nativas de histidina e alanina, respectivamente, e a histidina em B16 foi substituída por alanina (ou seja, B16A) como foi o caso do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 5 usado para muitas das proteínas de fusão insulina-Fc caninas. O sítio A21N da insulina nativa também foi excluído. Para este exemplo, outros aminoácidos do polipeptídeo insulina foram mutados para tornar a estrutura mais semelhante à insulina felina nativa (por exemplo, B30A, A8A, A10V e A18H). A sequência do polipeptídeo insulina resultante (SEQ ID
158 / 175 NO: 120) está listada abaixo com os aminoácidos não ativos para a insulina felina sublinhados.
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQL EHYC (SEQ ID NO: 120)
[0265] Além disso, devido aos potenciais benefícios adicionais dos mutantes cNg não glicosilados discutidos nos Exemplos 22 e 33, duas das proteínas de fusão insulina-Fc avaliadas (SEQ ID NOs: 116 e 118) contêm a mutação cNg-S. As sequências de aminoácidos completas das proteínas de fusão insulina-Fc são mostradas abaixo com os alinhamentos de sequência resultantes contra a SEQ ID NO: 108 mostrados na Fig. 30 (Clustal Omega).
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQL EHYCGGGGAGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLV VDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLK GKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCL
IKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQ RGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSP (SEQ ID NO: 114)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQL EHYCGGGGAGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLV VDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLK GKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCL
IKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQ RGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 116)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQL EHYCGGGGAGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVV ALGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKG KEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIE
GFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRG NTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 118)
159 / 175
[0266] As proteínas de fusão insulina-Fc foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. A Tabela 23 abaixo ilustra a capacidade de fabricação e os parâmetros de ligação ao IR in vitro para os compostos resultantes.
TABELA 23 PRODUÇÃO E LIGAÇÃO AO IR PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC UTILIZANDO FRAGMENTOS FC DE IGG1B E IGG2 FELINA SEQ ID Fragmento Rendimento % de Título de IC50 da NO: de IgG de proteína homodímero homodímero Ligação ao (mg/L) (mg/L) IR (nM) 108 IgG1b 127 48,6% 62 62 118 IgG1b 18 97,5% 18 >5000 114 IgG2 25 90,5% 23 3,480 116 IgG2 1 73,0% 1 707
[0267] Inesperadamente, todas as três proteínas de fusão insulina-Fc deram rendimentos de proteína muito mais baixas em comparação com o rendimento da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 108. Na verdade, embora tivesse uma afinidade de ligação do receptor de insulina suficientemente elevada (IC50 de 707 nM), a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 116 quase não forneceu produção de proteína. A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 118 atingiu um rendimento de proteína e título de homodímero inaceitavelmente baixos e foi considerada improvável de ser
160 / 175 bioativa in vivo devido ao alto valor de IC50 de ligação ao IR superior a 5000 nM. A proteína de SEQ ID NO: 114 também atingiu um rendimento de proteína inaceitavelmente baixo e uma afinidade de ligação ao receptor de insulina mais baixa ainda (valor IC50 mais alto) em comparação com a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 108.
EXEMPLO 41 PROTEÍNA DE FUSÃO DE INSULINA-FC QUE COMPREENDE O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 8, LIGANTE DO SEQ ID NO: 14 E UM FRAGMENTO FC DO ISOTIPO IGG2 FELINO
[0268] Em uma tentativa de obter um rendimento de proteína aceitável de uma proteína de fusão insulina-Fc compreendendo uma sequência do polipeptídeo insulina sem as mutações imunogênicas “hot spot” (ou seja, B10D e A8H), foram obtidas aprendizagens a partir do desenvolvimento simultâneo e paralelo de proteínas de fusão insulina-Fc caninas que mostraram que o uso de um polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e um ligante peptídico de SEQ ID NO: 14 em um fragmento Fc do isotipo IgGB de cão resultou em altos títulos proteicos e homodímeros e afinidade de ligação ao IR aceitável.
Portanto, uma proteína de fusão insulina-Fc felina foi construída usando o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e o ligante peptídico de SEQ ID NO: 14 em um fragmento Fc de IgG2 de gato de SEQ ID NO: 21 para produzir a seguinte sequência:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPK PKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNST YRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLP
PTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGT YFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 122)
161 / 175
[0269] Os alinhamentos entre a sequencia de SEQ ID NO: 122 contra as sequências de SEQ ID NOs: 106 e 112 do Exemplo 37 são mostrados na Fig. 31 (Clustal Omega).
TABELA 24 PRODUÇÃO E LIGAÇÃO AO IR PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC UTILIZANDO FRAGMENTOS FC DE IGG1B E IGG2 FELINA SEQ ID Fragmento Rendimento % de Título de IC50 da NO: de IgG de proteína homodímero homodímero Ligação (mg/L) (mg/L) ao IR (nM) 106 IgG2 23 88,0% 20 22 112 IgG2 64 80,4% 51 53 122 IgG2 146 99,0% 145 2,536
[0270] As proteínas de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 122 foram fabricadas em células HEK293 de acordo com o Exemplo 1 e purificadas usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. Suas estruturas foram confirmadas de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. As porcentagens (%) de teor de homodímeros foram mensuradas por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6, e as suas afinidades de ligação ao receptor de insulina foram mensuradas de acordo com o Exemplo 7. A afinidade de ligação ao receptor FcRn foi medida de acordo com o Exemplo 9. O rendimento da proteína foi de 146 mg/L, e a % de homodímero foi determinada como 99%, resultando em um título de homodímero de 145 mg/L que atende ao objetivo do projeto de fabricação. O valor IC50 da afinidade de ligação ao IR foi de 2.536 nM, indicando que o composto é provavelmente bioativo in vivo. O valor de EC50 da afinidade de ligação ao receptor FcRn foi de 3.114 n g/mL. Portanto, a proteína de fusão
162 / 175 insulina-Fc de SEQ ID NO: 122 foi um potencial candidato para mais testes in vivo.
EXEMPLO 42 BIOATIVIDADE IN VIVO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC CONSTRUÍDA A PARTIR DO POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 8, LIGANTE PEPTÍDICO DE SEQ ID NO: 14, E O FRAGMENTO FC DE IGG2 DE GATO DE SEQ ID NO: 21
[0271] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 122 foi testada quanto à bioatividade in vivo de acordo com o Exemplo 10. Foi utilizado um gato saudável, naïve para anticorpos, pesando aproximadamente 5 kg. No dia 0, o gato recebeu uma única injeção de uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 122. No dia 0, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 dias após a injeção. Se a glicose sanguínea do sujeito caísse para níveis considerados perigosos, eram administradas injeções de dextrose e/ou comida era fornecida para prevenir a hipoglicemia sintomática.
[0272] A Fig. 32 mostra a %FBGL para uma única administração, mostrando que, inesperadamente, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 122 foi apenas marginalmente bioativa in vivo (NAOC de essencialmente 0 %FBGL dias kg/mg). Este resultado foi surpreendente, especialmente porque a proteína de fusão insulina-Fc não agregou (isto é, tinha uma elevada % de teor de homodímero), e a molécula exibiu uma afinidade para o IR em um intervalo semelhante ao das proteínas de fusão insulina-Fc de cão que foram encontradas por exibirem significativa bioatividade em cães (Exemplo 31).
Devido à falta de bioatividade na primeira administração, as administrações repetidas não foram realizadas. EXEMPLO 43 AVALIAÇÃO DA SUBSTITUIÇÃO DO FRAGMENTO FC DA IGG1B FELINA POR IGG2
163 / 175 FELINA NO RENDIMENTO, PUREZA, BIOATIVIDADE E IMUNOGENICIDADE DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 8 E O LIGANTE PEPTÍDICO DE SEQ ID NO: 14
[0273] Como os programas de pesquisa sobre insulina de longa ação em cão e gato foram conduzidos em paralelo, alguns dos aprendizados a partir do programa de investigação da proteína de fusão insulina-Fc canina foram aplicados ao programa de pesquisa da proteína de fusão insulina-Fc felina. Um aprendizado chave a partir do programa de pesquisa insulina-Fc em cães foi como a seleção fragmentos Fc a partir de diferentes isotipos de IgG (por exemplo, isotipos IgGA canina, IgGB canina, IgGC canina, e IgGD canina) levou ao desempenho de fabricação e de eficácia in vivo dramaticamente diferentes. Portanto, o fragmento Fc de IgG2 felina de SEQ ID NO: 122 foi substituído pelo fragmento Fc de IgG1b felina de SEQ ID NO: 20, mantendo o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e ligante peptídico de SEQ ID NO: 14 resultando nas seguintes sequências de aminoácidos:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 38)
[0274] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 foi sintetizada em células HEK293 de acordo com o procedimento do Exemplo 1 e purificada usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. A estrutura foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por LC-MS em condições redutoras e não redutoras, e as sequências foram adicionalmente identificadas por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. O rendimento
164 / 175 da proteína foi de 158 mg/L nesta fase. A % de homodímero para a sequência foi medida por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6 e foi determinada como sendo de 99,5%, resultando em um título de homodímero de 157 mg/L que atende ao objetivo do projeto. O valor IC50 de ligação ao receptor de insulina IM-9 in vitro, medido de acordo com o Exemplo 7, foi de 2398 nM, o que também cumpre o objetivo do projeto. O valor EC50 da afinidade de ligação ao receptor FcRn foi medido de acordo com o Exemplo 9, e foi de 1552 n g/mL.
[0275] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 foi então testada quanto à bioatividade in vivo de acordo com o Exemplo 10. Um gato saudável, naïve para anticorpos, pesando aproximadamente 5 kg, recebeu uma única injeção subcutânea de uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 a uma dose de 0,16 mg de proteína de fusão insulina-Fc/kg. No dia 0, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 dias após a injeção. Se a glicose sanguínea do sujeito caísse para níveis considerados perigosos, eram administradas injeções de dextrose e/ou comida era fornecida para prevenir a hipoglicemia sintomática.
[0276] A Figura 33 mostra a %FBGL após a primeira administração. O alimento foi dado ao animal regularmente para evitar hipoglicemia sintomática, ilustrando que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 foi significativamente bioativa in vivo com uma NAOC de 1,838 %FBGL dias kg/mg. O perfil farmacocinético do composto também foi medido pelo método do Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos foi ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação que foi de 6,3 ± 0,5 dias. A diferença na atividade biológica (in vitro e in vivo) entre a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 e aquela de
165 / 175 SEQ ID NO: 122 demonstra que, inesperadamente, o isotipo IgG1b felino é preferido em relação ao isotipo IgG2 felino para o fragmento Fc quando a sequência do polipeptídeo insulina é modificada como na SEQ ID NO: 8.
[0277] Uma vez que a NAOC foi aceitável e os dados farmacocinéticos apoiaram uma administração uma vez por semana, o gato recebeu doses subcutâneas adicionais no dia 14, dia 28 e no dia 42, e a %FBGL foi medida para a janela de 7 dias após cada dose de acordo com o Exemplo 11. A NAOC e NAOCR foram calculadas de acordo com o procedimento do Exemplo 11 para cada injeção subcutânea repetida. Como ilustrado na Tabela 25, a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 3 8 demonstra bioatividade aceitável in vivo após a administração de doses múltiplas.
TABELA 25 NAOC POR DOSE, PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 38 Injeção nº Dia NAOC (%FBGL·dias·kg/mg) NAOCR 1 0 1838 1,0 2 14 1431 0,8 3 28 1900 1,0 4 42 2400 1,3
[0278] Além disso, o soro foi coletado antes da administração de cada dose e uma vez por semana durante duas semanas após o final do experimento, a fim de testar a presença e quantificar os níveis de quaisquer anticorpos antifármaco de acordo com o Exemplo 14. Conforme mostrado na Fig. 34, não houve aumento mensurável nos anticorpos antifármaco acima dos valores basais após múltiplas administrações do composto. Portanto, para obter uma proteína de fusão insulina-Fc felina candidata (por exemplo, de SEQ ID NO: 38) que atendesse aos critérios de título de homodímero, bioatividade in vivo e bioatividade sustentada aceitáveis após repetidas injeções semanais em gatos, foi necessário substituir o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 4 pelo
166 / 175 polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 8 e utilizar o fragmento Fc de IgG1b felina de SEQ ID NO: 20 em vez do fragmento Fc de IgG2 felina de SEQ ID NO: 21.
EXEMPLO 44 PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC NÃO GLICOSILADAS QUE COMPREENDEM O POLIPEPTÍDEO INSULINA DE SEQ ID NO: 8, O LIGANTE PEPTÍDICO DE SEQ ID NO: 14 E O FRAGMENTO FC DE IGG1B FELINA PARA REDUZIR O POTENCIAL RISCO DE
IMUNOGENICIDADE
[0279] Embora a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 satisfaça todos os objetivos do desenho do estudo (Exemplo 43), pode haver ou não um risco de imunogenicidade ao longo de períodos prolongados de tratamento (por exemplo, 6 meses, 1 ano, 2 anos ou mais), o que poderia comprometer o uso desta proteína de fusão insulina-Fc para o tratamento do diabetes, caso isso ocorresse. Como descrito na Descrição Detalhada da Invenção, uma possível causa de uma redução da bioatividade após doses repetidas é a interação indesejada do fragmento Fc de IgG1b felina com o sistema imune do gato, resultando na produção de anticorpos antifármacos neutralizantes. No entanto, os resultados mostrados no Exemplo 43 demonstram, inesperadamente, que o isotipo IgG1b felino era preferível ao isotipo IgG2 felino menos imunogênico no que diz respeito a bioatividade in vivo. Portanto, outras mutações Fc foram exploradas para alcançar proteínas de fusão insulina-Fc não glicosiladas com baixa ligação ao receptor Fc(gama)RI, o que deve reduzir o risco de imunogenicidade crônica de longo prazo.
[0280] Conforme descrito na Descrição Detalhada da Invenção, um método para reduzir a interação ao Fc(gama)RI envolve a mutação do sítio cNg do fragmento Fc para prevenir a glicosilação durante a síntese na célula hospedeira. Portanto, foram feitas mutações no sítio cNg na região do fragmento Fc de SEQ ID NO: 38 para reduzir a afinidade de ligação do
167 / 175 fragmento Fc para os receptores Fc(gama) in vivo, conforme medido por um ensaio in vivo de ligação ao Fc(gama)RI humano descrito no Exemplo 8. A posição do sítio cNg na proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 é cNg- NB151. Novamente, capitalizando os aprendizados das proteínas de fusão insulina-Fc caninas descritas no Exemplo 33, uma mutação cNg-NB151-S foi introduzida no fragmento Fc de SEQ ID NO: 38. A sequência de aminoácidos completa da proteína de fusão insulina-Fc resultante está listada abaixo (cNg- NB151-S sublinhado para maior clareza):
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 124)
[0281] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 124 foi sintetizada em células HEK293 de acordo com o procedimento do Exemplo 1 e purificada usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. A estrutura da proteína de fusão insulina-Fc foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por LC-MS em condições redutoras e não redutoras, e a sequência foi adicionalmente identificada por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. O rendimento da proteína foi de 202 mg/L nesta fase. A % de homodímero para a sequência foi medida por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6 e foi determinada como sendo de 99%, resultando em um título de homodímero de 200 mg/L que atende ao objetivo do projeto. No entanto, o valor IC50 da ligação in vitro ao receptor de insulina IM-9, medido de acordo com o Exemplo 7, foi maior que 5000 nM, o que está fora do objetivo do estudo para a bioatividade in vitro. O valor de EC50 da afinidade de
168 / 175 ligação ao receptor FcRn foi mensurado de acordo com o Exemplo 9 e foi de
6.922 ng/mL.
[0282] Embora a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 124 não satisfez os objetivos de ligação ao receptor de insulina, ela foi testada quanto a bioatividade in vivo de acordo com o Exemplo 10. Foi utilizado um gato saudável, naïve para anticorpos, pesando aproximadamente 5 kg. No dia 0, o gato recebeu uma única injeção de uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 124 a uma dose de 0,16 mg de proteína de fusão insulina-Fc/kg. No dia 0, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 dias após a injeção. Se a glicose sanguínea do sujeito caísse para níveis considerados perigosos, eram administradas injeções de dextrose e/ou comida era fornecida para prevenir a hipoglicemia sintomática.
[0283] A Fig. 35 mostra a %FBGL para uma única administração, ilustrando que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 124 foi pouco bioativa in vivo, com uma NAOC de 65 %FBGL dias kg/mg. Devido à falta de bioatividade na primeira administração, as administrações repetidas não foram realizadas.
[0284] Inesperadamente, como foi o caso no Exemplo 33 para a proteína de fusão Fc de insulina canina de SEQ ID NO: 36, verificou-se que a mutação na sequência do polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 124 de tal forma que o 16º aminoácido N-terminal da cadeia B (B16) foi mutado de tirosina para alanina (ou seja, B16A) tornou bioativa a proteína de fusão Fc de insulina resultante de SEQ ID NO: 40. A sequência de aminoácidos da proteína de fusão insulina-Fc resultante é exibida abaixo (mutações B16A e cNg-NB151- S sublinhadas para maior clareza):
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
169 / 175
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTY RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 40)
[0285] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40 foi sintetizada em células HEK293 de acordo com o procedimento do Exemplo 1 e purificada usando uma coluna de Proteína A de acordo com o Exemplo 3. A estrutura da proteína de fusão insulina-Fc foi confirmada de acordo com o Exemplo 4 por CE-SDS em condições redutoras e não redutoras, e a sequência foi adicionalmente identificada por LC-MS com remoção de glicano de acordo com o Exemplo 5. O rendimento da proteína foi de 174 mg/L nesta fase. A % de homodímero para a sequência foi medida por cromatografia de exclusão por tamanho de acordo com o Exemplo 6 e foi determinada como sendo de 98,9%, resultando em um título de homodímero de 172 mg/L que atende ao critério do projeto. O valor de IC50 da ligação ao receptor de insulina IM-9 in vitro, medido de acordo com o Exemplo 7, também cumpre o objetivo do estudo. A atividade sobre o receptor Fc(gama) foi medida de acordo com o Exemplo 8 e encontrada como sendo aproximadamente quatro vezes menor do que a atividade obtida para a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 38 usando o mesmo procedimento, indicando assim que a proteína de fusão insulina-Fc tem menos probabilidade de interagir adversamente com o sistema imunológico do gato. O valor de EC50 da afinidade de ligação ao receptor FcRn foi mensurado de acordo com o Exemplo 9 e foi de 8.157 ng/mL.
[0286] A proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40 foi testada quanto à bioatividade in vivo de acordo com o Exemplo 11. Foi utilizado um gato saudável, naïve para anticorpos, pesando aproximadamente 5 kg. No
170 / 175 dia 0, dia 7 e dia 21, o gato recebeu uma única injeção subcutânea de uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40, a uma dose de 0,1 mg de proteína de fusão insulina-Fc/kg. No dia 0, o sangue foi coletado de uma veia adequada imediatamente antes da injeção e aos 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360 e 480 min e aos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 dias após a injeção. Se a glicose sanguínea do sujeito caísse para níveis considerados perigosos, eram administradas injeções de dextrose e/ou comida era fornecida para prevenir a hipoglicemia sintomática.
[0287] A Fig. 36 mostra a %FBGL após a primeira administração, ilustrando que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40 é bioativa in vivo com uma NAOC de 159 %FBGL dias kg/mg para uma dose subcutânea de 0,1 mg de proteína de fusão insulina-Fc/kg. Uma segunda dose subcutânea mais elevada de 0,2 mg de proteína de fusão insulina-Fc/kg deu uma NAOC muito maior de 702 %FBGL dias kg/mg, mostrada na Fig. 37. O perfil farmacocinético é medido pelo método do Exemplo 12 usando ELISA, e um modelo de dois compartimentos é ajustado aos dados para determinar sua meia-vida de eliminação, que é maior que 3 dias. Estes resultados estão em contraste com os resultados obtidos com a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 124, que mostrou que o mesmo composto compreendendo uma tirosina em B16 em vez de uma alanina era apenas fracamente bioativo aproximadamente na mesma dose (0,16 mg de proteína de fusão insulina- Fc/kg). Portanto, o polipeptídeo insulina de SEQ ID NO: 11 foi preferido para proteínas de fusão insulina-Fc não glicosiladas compreendendo fragmentos Fc de IgG1b felina com sítio cNg mutado.
[0288] Para analisar a bioatividade reprodutível, após administração em doses múltiplas, o gato recebeu uma dose adicional da proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40 no dia 7, dia 21, e dia 35.
Quando a %FBGL do gato caiu muito, o gato recebeu comida para elevar a
171 / 175 glicose sanguínea a um nível seguro. A NAOC e NAOCR foram medidas para cada dose subsequente de acordo com o procedimento geral do Exemplo 11, calculada a partir do momento em que a dose foi administrada até imediatamente antes de a próxima dose ser administrada. A NAOC e NAOCR apresentadas na Tabela 26 ilustram que a proteína de fusão insulina-Fc de SEQ ID NO: 40 é bioativa in vivo após a administração de múltiplas doses.
TABELA 26 NAOC POR DOSE PARA DOSES REPETIDAS DE SEQ ID NO: 40 Injeção nº Dia NAOC (%FBGL·dias·kg/mg) NAOCR 1 0 159 1,0 2 7 702 4,4 3 21 462 2,9 4 35 670 4,2
[0289] Além disso, o soro foi coletado antes da administração de cada dose e ao final do experimento, a fim de testar a presença e quantificar os níveis de quaisquer anticorpos antifármaco de acordo com o Exemplo 14. Não há aumento mensurável em anticorpos antifármaco acima dos valores basais após múltiplas administrações do composto. Portanto, a fim de obter uma proteína de fusão insulina-Fc felina que atendesse aos critérios do projeto de fabricação e bioatividade com atividade sobre o receptor Fc(gama) significativamente reduzida, era necessário não apenas mutar o cNg para serina, mas também mutar o aminoácido B16 para alanina no polipeptídeo insulina.
EXEMPLO 45
EXEMPLOS DE EXECUÇÕES DE PRODUÇÃO BASEADA EM CÉLULAS CHO UTILIZANDO PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC PREFERIDAS QUE COMPREENDEM FRAGMENTOS FC DE IGG1B FELINA PRODUZIDAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS CHO
TRANSFECTADAS DE FORMA ESTÁVEL
172 / 175
[0290] Uma linhagem de células CHO estavelmente transfectada com vetores que codificam a SEQ ID NO: 38 foi construída conforme descrito no Exemplo 2 acima. Culturas de produção de 14 dias em balões em sistema descontínuo-alimentado (ou “Fed-Batch”) agitadas (escala de meio 0,5-2,0 L) foram semeadas a 0,5 milhões de células/mL em uma incubadora-agitadora ajustada à 37ºC e 5% de dióxido de carbono, e as culturas foram conduzidas conforme descrito em Exemplo 2, exceto que o meio CD OptiCHO foi substituído por Dynamis como meio de crescimento (ThermoFisher) e Efficient Feed C (ThermoFisher) foi usado como suplemento. A suplementação foi adicionada a 3% v/v começando no dia 3 da produção e no dia 4, a temperatura do frasco de agitação foi ajustada para 32ºC e a concentração de dióxido de carbono da incubadora-agitadora foi reduzida de 5% para 2%.
Durante a execução, a densidade celular aumentou para entre 8-14 milhões de células/mL e no Dia 14 a produção foi coletada para remover as células, e o sobrenadante da cultura foi purificado e caracterizado para obter a proteína de fusão insulina-Fc conforme descrito nos Exemplos 3, 4, 5 e 6. A Tabela 27 descreve os dados de fabricação para a proteína de fusão insulina-Fc obtida através dessas culturas de produção com linhagem de células CHO estavelmente transfectadas.
TABELA 27 TÍTULOS DE HOMODÍMEROS PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC NÃO GLICOSILADAS DE SEQ ID NO: 38 Título de Rendimento de % de SEQ ID NO: homodímero proteína (mg/L) homodímero (mg/L) SEQ ID NO: 38 633 96,3% 610 EXEMPLO 46
EXEMPLOS DE EXECUÇÕES DE PRODUÇÃO BASEADA EM CÉLULAS CHO UTILIZANDO
173 / 175 PROTEÍNAS DE FUSÃO INSULINA-FC PREFERIDAS DE IGG1B FELINA PRODUZIDAS EM
LINHAGENS DE CÉLULAS CHO TRANSFECTADAS DE FORMA ESTÁVEL
[0291] Uma linhagem de células CHO estavelmente transfectada com vetores que codificam a SEQ ID NO: 40 é construída conforme descrito no Exemplo 2 acima. Culturas de produção de 14 dias em balões em sistema descontínuo-alimentado (ou “Fed-Batch”) agitadas (escala de meio 0,5-2,0 L) são semeadas a 0,5 milhões de células/mL em uma incubadora-agitadora ajustada à 37ºC e 5% de dióxido de carbono, e as culturas são conduzidas conforme descrito em Exemplo 2 acima, exceto que o meio CD OptiCHO é substituído por Dynamis como meio de crescimento (ThermoFisher) e Efficient Feed C (ThermoFisher) é usado como suplemento. A suplementação é adicionada a 3% v/v começando no dia 3 da produção e no dia 4, a temperatura do frasco de agitação é ajustada para 32ºC e a concentração de dióxido de carbono da incubadora-agitadora é reduzida de 5% para 2%. No Dia 14, a execução de produção é coletada para remover as células e o sobrenadante de cultura é purificado e caracterizado para obter a proteína de fusão insulina-Fc conforme descrito no Exemplo 3, 4, 5 e 6. A produção resultante de SEQ ID NO: 40 dá um rendimento de proteína acima de 200 mg/L, teor de homodímero acima de 95% e título de homodímero acima de 190 mg/L.
EXEMPLO 47 DOMÍNIOS E SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA DE FUSÃO INSULINA-FC EXEMPLARES
[0292] As sequências de aminoácidos da proteína de fusão insulina-Fc exemplares e as sequências de DNA correspondentes usadas nos Exemplos acima são mostradas nas Figs. 38, 39, 40, 41 e 42.
EQUIVALENTES
[0293] Nas reivindicações, artigos como “um/uma”, e “o/a” podem indicar um ou mais do que um, a menos que seja indicado o contrário ou que
174 / 175 de outra forma seja evidente a partir do contexto. As reivindicações ou descrições que incluem “ou” entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um, ou todos os membros do grupo estiverem presentes, forem utilizados ou de outra forma relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que indicado em contrário ou que de outra forma seja evidente a partir do contexto. A divulgação inclui exemplos de realização nas quais exatamente um membro do grupo está presente, é empregado ou é relevante para um determinado produto ou processo. A divulgação inclui exemplos de realização nas quais mais do que um ou todos os membros do grupo estão presentes, são empregados ou são relevantes para um determinado produto ou processo.
[0294] Além disso, a divulgação abrange todas as variações, combinações e permutações na qual uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, e termos descritivos de uma ou mais das reivindicações listadas são introduzidos na outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação de base. Quando os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato de grupo Markush, cada subgrupo dos elementos também é divulgado, e qualquer(quaisquer) elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Deve ser entendido que, em geral, quando a divulgação, ou aspectos da divulgação, é/são referidos como compreendendo elementos e/ou características específicas, certos exemplos de realização da divulgação ou aspectos da divulgação consistem, ou consistem essencialmente, em tais elementos e/ou características. Por razões de simplicidade, esses exemplos de realização não foram especificamente estabelecidos in haec verba no presente documento. Convém ainda salientar que os termos “compreende”, “compreendendo”, “contém(s)” e “contendo”
175 / 175 destinam-se a ser abertos e o uso dos mesmos permite a inclusão de elementos ou etapas adicionais.
Quando são fornecidos intervalos, as extremidades estão incluídas.
Além disso, a menos que indicado de outra forma, ou que de outra forma seja evidente a partir do contexto e compreensão por um profissional versado na técnica, os valores que são expressos como intervalos podem assumir qualquer valor específico ou subintervalo dentro dos intervalos declarados em diferentes exemplos de realização da presente divulgação, até o décimo da unidade do limite inferior do intervalo, a menos que o contexto indique claramente de outra forma.

Claims (47)

1 / 11 REIVINDICAÇÕES
1. PROTEÍNA DE FUSÃO compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, em que o fragmento Fc é de origem animal não humano e compreende a seguinte sequência:
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF
VDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALP
SPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQS
NGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALH NHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 16).
2. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6).
onde X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente ou é N.
3. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6).
onde X1 é H, X2 é T, e X3 está ausente ou é N.
4. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, que compreende a seguinte sequência: GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
5. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a seguinte sequência:
2 / 11
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK
PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG
TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 32).
6. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a seguinte sequência:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
QLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPP
KPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFN
GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYV
LPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 34).
7. PROTEÍNA DE FUSÃO compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, em que o fragmento Fc compreende a seguinte sequência:
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF
VDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALP
SPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQS
NGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALH NHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 22).
8. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL
3 / 11 DQLENYC (SEQ ID NO: 10).
onde X1 não é D e X2 não é H.
9. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYC (SEQ ID NO: 10).
onde X1 é H e X2 é T.
10. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, que compreende a seguinte sequência: GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
11. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender a seguinte sequência:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPK
PKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSG
TYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVL
PPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDG SYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG (SEQ ID NO: 36).
12. PROTEÍNA DE FUSÃO compreendendo um polipeptídeo insulina e um fragmento Fc, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, em que o fragmento Fc é de origem animal não humano e compreende a seguinte sequência:
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF
VDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP
4 / 11
IERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 20).
13. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6).
onde X1 não é D, X2 não é H, e X3 está ausente.
14. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYCX3 (SEQ ID NO: 6).
onde X1 é H, X2 é T, e X3 está ausente.
15. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, que compreende a seguinte sequência: GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
16. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender a seguinte sequência:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP
KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTY
RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 38).
17. PROTEÍNA DE FUSÃO compreendendo um polipeptídeo
5 / 11 insulina e um fragmento Fc, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, em que o fragmento Fc compreende a seguinte sequência:
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWF
VDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSP
IERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITG
QPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHS HHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 23).
18. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYC (SEQ ID NO: 10).
onde X1 não é D e X2 não é H.
19. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo polipeptídeo insulina compreender a seguinte sequência: FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSL DQLENYC (SEQ ID NO: 10).
onde X1 é H e X2 é T.
20. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 19, caracterizada pelo polipeptídeo insulina e o fragmento Fc estarem ligados por um ligante, tal como um ligante peptídico, que compreende a seguinte sequência: GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO: 14).
21. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por compreender a seguinte sequência:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLD
QLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKP
KDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTY
6 / 11
RVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPP
AQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTY FLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG (SEQ ID NO: 40)
22. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada por ser um homodímero.
23. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pela porcentagem de homodímero da proteína de fusão ser superior a 90%.
24. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pela proteína de fusão ser feita usando células HEK293, e o título de homodímeros resultante após purificação usando esferas de proteína A ou uma coluna de proteína A é superior a 50 mg/L.
25. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pela IC50 do receptor da insulina para a proteína de fusão ser inferior a ou igual a 5000 nM.
26. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pela meia-vida sérica da proteína de fusão no sangue ou soro de um animal alvo após administração ser superior a cerca de 3 dias.
27. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o tempo durante o qual há uma diminuição estatisticamente significativa do nível de glicose no sangue de um sujeito em relação a um nível de pré-dose é superior a 2 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 18 horas, 1 dia, 1,5 dias, 2 dias, 2,5 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais.
28. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pela NAOC após a primeira injeção
7 / 11 subcutânea em um animal alvo ser maior do que 150%FBGL dias kg/mg.
29. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pela relação entre a NAOC após a terceira injeção subcutânea semanal da proteína de fusão no animal alvo e a NAOC após a primeira injeção subcutânea da proteína de fusão no animal alvo ser maior do que 0,50.
30. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizada pela proteína de fusão ser formulada como uma composição farmacêutica.
31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 30, caracterizada pela proteína de fusão estar presente na composição farmacêutica em uma concentração de cerca de 3 mg/mL ou maior.
32. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por ser adequada para a administração subcutânea.
33. MÉTODO PARA REDUZIR O NÍVEL DE GLICOSE SANGUÍNEA de um animal alvo, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade fisiologicamente eficaz da proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações de 1 a 21 ou de uma composição farmacêutica da mesma ao paciente.
34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo animal alvo ser diagnosticado com diabetes.
35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo animal alvo ser um cão ou um gato.
36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela proteína de fusão ser administrada por via subcutânea.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pela proteína de fusão ser administrada diariamente, duas vezes
8 / 11 por semana, ou uma vez por semana ao animal alvo.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela proteína de fusão ser administrada uma vez por semana ao animal alvo, em uma dose entre 0,025 e 0,5 mg/kg/semana.
39. CÉLULA, caracterizada por ser manipulada para expressar uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 21.
40. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por ser transfectada com um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão.
41. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada por ser uma célula HEK293 ou célula CHO.
42. cDNA, caracterizado por codificar uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 21.
43. cDNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por compreender a seguinte sequência de ácido nucleico: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagccc aaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagacc ccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaag agcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaag caattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggg gccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagc cttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggag cccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaatt gagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataa
9 / 11 ccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 31)
44. cDNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por compreender a seguinte sequência de ácido nucleico: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcaacggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggc gggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaag cccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaag accccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccggg aagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaagggg aagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggcca ggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtc agccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcag gagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagca aattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgc ataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 33)
45. cDNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por compreender a seguinte sequência de ácido nucleico: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagccc aaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagacc ccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaag agcagttctcaggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagc aattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccagggg
10 / 11 ccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagcc ttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagc ccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaatt gagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataa ccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag (SEQ ID NO: 35)
46. cDNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por compreender a seguinte sequência de ácido nucleico: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaa ggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctga cgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagtt caacagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttca agtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagc cgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtga catgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagccc gagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgag cgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacag ccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag (SEQ ID NO: 37)
47. cDNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por compreender a seguinte sequência de ácido nucleico: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtg cggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggag gaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaa actactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcggg ggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaa
11 / 11 ggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctga cgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagtt cagcagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttca agtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagc cgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtga catgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagccc gagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgag cgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacag ccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag (SEQ ID NO: 39)
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Fig. 1
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Fig. 2
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Fig. 39
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Fig. 41
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Fig. 42
BR112020026777-5A 2018-06-29 2019-06-28 Proteínas de fusão, composição farmacêutica, método para reduzir o nível de glicose, célula e cdna BR112020026777A2 (pt)

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US62/693,814 2018-07-03
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US62/696,645 2018-07-11
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US62/698,648 2018-07-16
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