CN101870735A

CN101870735A - 一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白

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Publication number: CN101870735A
Application number: CN201010189811A
Authority: CN
Inventors: 程虹; 杨思仪; 马金伟; 李桂珠; 刘芳杰; 扈艳红; 胡品良; 李先钟; 喻志爱; 林峰; 何丽华; 白先宏
Original assignee: BEIJING JINGYI TAIXIANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; Biotech Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: BEIJING JINGYI TAIXIANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; Biotech Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN101870735B

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程方法研制的新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，是由新红细胞生成刺激蛋白(NESP，New ErythropoietinStimulating Protein)与人IgG2-Fc融合而成的二聚体蛋白质NESP-Fc，编码该免疫融合蛋白的多核苷酸以及制备和纯化该免疫融合蛋白的方法。该免疫融合蛋白可在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简单，有利于进一步的大规模制备。本发明的NESP-Fc免疫融合蛋白具有与天然EPO相似的生物学活性，但具有更长的血清半衰期，可用于治疗EPO水平低下引起的贫血症。

Description

一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白

技术领域：

本发明涉及一种用于贫血的免疫融合蛋白，特别是涉及一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，属于生物工程技术领域。

背景技术：

贫血是指单位容积循环血液内的血红蛋白量、红细胞数和红细胞压积低于正常的病理状态。造成贫血的原因很多，临床上发现心血管疾病、慢性肾功能疾病患者常常伴有贫血。

据世界卫生组织统计：全球约有30亿人患不同程度的贫血，每年因贫血引致各类疾病而死亡的人数达上千万。中国患贫血的人口概率高于西方国家，在患贫血的人群中，女性明显高于男性，老年人和儿童高于中青年。

目前，促红细胞生成素(EPO，Erythropoietin)已广泛应用于临床上各种贫血的治疗，可用于由慢性肾衰、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合征和艾滋病引起的贫血，其中最有效的是对肾衰、尿毒症所伴随贫血的治疗。此外，EPO对肿瘤相关性贫血，早产儿和孕产妇贫血，围手术期减少异源性输血等方面也有良好的疗效。多年来的研究发现EPO除了具备作为激素的基本功效外，它还有众多的生理功能，例如：促进造血细胞前体增生分化，代谢应激时保护神经元，促进肠黏膜发育等。随着研究的不断深入和临床试验的开展，EPO必将在更多领域里发挥更大的作用。

促红细胞生成素(EPO，Erythropoietin)是由人体肾脏和肝脏分泌的一种糖蛋白激素，90％由肾脏的间质或近端小管的特殊细胞生成，10％在肝脏的Kuper氏细胞产生。前体EPO由193个氨基酸组成，成熟EPO切除信号肽后含有166个氨基酸，分子量约34.4kD，含蛋白60％，碳水化合物40％。EPO的糖基化程度很高，并有2个二硫键连接(Maront AM.EPO Biochemicalcharacteristics，biological dffects，indications and results of use in hematology.Tumori.1997.Jul-Aug.83：3-15)。根据碳水化合物含量的不同可以把天然存在的EPO分成两种类型：α型(34％)和β型(26％)。两种类型EPO在生物学特性，抗原性及临床应用效果上均相同(YoshimursA.TheEPO-receptorand signal transduction.Oncologist.1996.1：337-339)。这两种类型的EPO均能促进骨髓中红系造血祖细胞的增殖，分化及血红蛋白合成，从而达到增加人体血液中红细胞的数量以及提高血液含氧量的作用。胎儿时EPO主要由肝脏和肾脏合成，成人体内则主要来自肾脏，极小部分来自肝脏(KouryMJ，Bondurant MC.Control of red cell production the roles of programmed cell death(apoptosis)and erythropoietin.Transfusion.1990；30：673-674)。正常情况下，人血清中EPO的平均浓度为14.9mU/ml，在贫血和低氧状态下，EPO的含量将增加，但肾脏贫血时含量却非常低。肾功能受到损害时(如慢性肾衰竭)，促红细胞生成素的产生受到阻碍，可导致贫血的发生。

1977年，人们首次成功地从再生障碍性贫血患者尿中纯化出少量EPO，1983年，EPO基因克隆和表达获得成功。近年来EPO的临床应用逐年增加，且增长速度较快，仅次于抗血栓形成药，已上升为世界头号畅销生物工程药品。

目前，商购可获得三种类型的EPO，即rHuEPO-α、rHuEPO-β和darbepoetinα(Weiss G，Goodnough LT.Anemia of chronic disease.N Engl J Med.2005 Mar 10；352(10)：1011-23)，均为EPO单体药物。

但由于EPO单体药物药效短，rhEPO在人体内的半衰期仅为4～8小时，用药频繁，给病人带来不便和痛苦。因此，各种长效的EPO药物开始出现，如聚乙二醇(PEG)修饰的EPO。PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积。当PEG偶联到蛋白分子表面时，可在其修饰的蛋白质周围产生空间位阻，减少蛋白酶对其的水解作用，阻止蛋白分子疏水区域相互作用，增加了EPO的稳定性、溶解性，从而降低了肾脏的清除作用，延长了EPO的半衰期。目前已上市的代表药物有Roche开发的PEG-EPO，即PEG化的重组促红细胞生成素，商品名为Anemia。

另一方面，糖基对EPO的生物学活性、水溶性、热稳定性及生物合成均有较大的影响。糖基化发生在特定的氨基残基序列上，分为两类：N-连接糖基化，寡糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH₂基连接到特征序列Asn-X-Ser/Thr(X代表任何一种氨基酸)中的天冬酰胺上；O-连接糖基化是将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基的氧原子上。

去除N-连接糖基后的EPO基本丧失体内生物学活性，而O-连接糖基对EPO体内生物学活性几乎没有影响(Wasley LC The importance of N-andO-linked oligosaccharides for the biosynthesis and in vitro andin vivo biologicactivities of erythropoietin.Blood 1991，77(12)：2624-2632)。

EPO分子有4个糖基化位点，其中3个N端糖链(Asn24，38，83)和1个O端糖链(Ser126)。126位O-糖链的主要组成为N-NeuNACα-2→3Galβ1→3

(NeuNACα-6)Gal NAcOH-Ser。各种N连接寡糖链结构占总含糖量的百分率分别为：双末梢糖链1.4％，三末梢糖链10％，带有一个N-乙酰氨基半乳糖重复单位的三末梢糖链3.5％，四末梢糖链31.8％，带有一个、两个和三个N-乙酰氨基半乳糖重复单位四末梢糖链分别为32.1％，16.5％和4.7％。

所有这些寡糖链都被以α2→3连接方式唾液酸化。其中四末梢糖键被2个或3个唾液酸残基唾液酸化。另外还发现天然和rhEPO仅在唾液酸含量上有微小差异，其它糖键结构并无不同。N糖基化不完全的rhEPO体外活性正常，而体内活性则降低到体外活性的1/500，其体内被清除的速率也明显加快。糖基化EPO对热和pH变化稳定，等电点为4.2～4.6。

2001年，美国Amgen公司研制的长效贫血治疗药新红细胞生成刺激蛋白(NESP，New Erythropoietin Stimulating Protein)，商品名为Darbepoetin alfa(见PCT NO.US94/09257)，于2001年6月获得欧洲药物评审委员会批准。

NESP是一种高糖基化rhEPO类似物(Hyperglycosylated rhEPO analogues)，具有与rhEPO相似的作用机制。NESP含5个N端糖链，比rhEPO高2倍的唾液酸残基，从而达到较大的代谢稳定性和3倍于rhEPO(半衰期为4～8小时)的半衰期，达36小时，因此可减少给药次数。

本发明在现有技术的基础上，采用新红细胞生成刺激蛋白(NESP)的策略，即突变了天然EPO的5个氨基酸残基，分别是Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn，Pro90Thr。与天然的EPO相比增加了30和88位的N糖基化位点。另一方面，通过NESP和IgG2表达基因的连接，使表达的蛋白形成同源二聚体，增加免疫融合蛋白的分子量，能够显著延长生物半衰期。

IgG型免疫球蛋白是人血液中最丰富的蛋白，半衰期长达21天，将人IgG的Fc段与其他蛋白融合表达可使得融合蛋白表现出和人IgG相当的药物代谢动力特征，从而延长了融合蛋白的半衰期。本发明在Haak FM等(参见Haak FM等，J Immunol，1993，151：351)研究工作的基础上，将NESP与IgG2的铰链区、CH2和CH3进行融合表达。为进一步降低IgG2的CH2区可能具有的较弱的丝裂原活性，将IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala(氨基酸编号参照Kabat数据库)，以降低其与FcγRII的结合活性(参见Cole MS等，J Immunol.1997，159(7)：3613-21)。新红细胞生成刺激蛋白(NESP)抗原性较弱，迄今为止尚未检测出NESP抗体，融合蛋白中IgG2氨基酸残基序列与人体IgG2基本一致，这两方面保证了所产生的融合蛋白可能具有较低的免疫原性。另外，IgG2的稳定区CH2和CH3仍保留与Protein A的结合特性，为将来产品的纯化和检测提供了便利。

本发明表达的新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白具有与天然EPO同样的生物活性，由于蛋白分子量的增加，生物半衰期显著延长，用于EPO水平低下所致的贫血症，可减少患者注射次数，减轻患者痛苦和经济负担，给临床治疗带来了极大的便利。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新型的高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，编码该融合蛋白的多核苷酸，制备和纯化该融合蛋白的方法及应用。本发明的免疫融合蛋白是由新红细胞生成刺激蛋白(NESP)与人IgG2-Fc融合而成的二聚体蛋白质，见附图1。用于各种原因所致的贫血症，包括慢性肾衰、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合征和艾滋病引起的贫血，肿瘤相关性贫血，早产儿和孕产妇贫血及类风湿性关节炎引起的贫血，尤其是对肾衰、尿毒症所伴随贫血的治疗最为有效。由于EPO单体药效短，rhEPO在人体内的半衰期仅为4～8小时，用药频繁，给病人带来不便和痛苦。之后开发的高糖基化rhEPO类似物NESP，虽然含有5个N端糖链，比rhEPO高2倍的唾液酸残基，从而具有较大的代谢稳定性，但半衰期也仅为36小时，仍需1-2天注射一次，因此目前的促红细胞生成素类药物普遍存在半衰期短的问题，临床应用受到很大的限制。本申请人在现有技术的基础上，对其进行了进一步的研究，研制开发了本发明的新型的高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，该免疫融合蛋白可在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简单，有利于进一步的大规模制备，具有与天然EPO相似的生物学活性，能与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞上的特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增值、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中红细胞的释放量，具有更长的血清半衰期，达到有效治疗贫血的疗效。

本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供了是由新红细胞刺激蛋白NESP与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成的一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，命名为NESP-Fc免疫融合蛋白。

所述的NESP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的IgG的Fc部分包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域的人IgG分子的二聚化Fc部分，其中二聚化Fc部分中的每一条链通过其C末端直接与NESP分子的N末端相连。

本发明的NESP-Fc免疫融合蛋白具有5个N端糖链和1个O端糖链，所述的N糖基化位点包含Asn-X-Ser/Thr的氨基酸序列，5个N糖基化位点发生在24、30、38、83和88位。

本发明中所述的IgG是人源的；

优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其突变体中的任意一种；

更优选为人IgG2及其突变体的任意一种；

人IgG2的突变体为IgG2序列中的Val234和Gly237突变为Ala，氨基酸序列见序列表中SEQ ID NO：2所示；。

本发明一方面提供了一种NESP-Fc免疫融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO：3所示。

本发明一方面提供了编码NESP-Fc免疫融合蛋白的多核苷酸序列。

本发明一方面提供了包含编码NESP-Fc免疫融合蛋白的多核苷酸序列的载体；

所述的载体为真核表达载体；

所述的载体是pBT-NESP-Fc。

本发明一方面提供了一种转染上述载体的宿主细胞，所述的宿主细胞优选为CHO细胞或NS0细胞。

本发明一方面提供了NESP-Fc融合蛋白的制备方法，包括以可检测量表达免疫融合蛋白的条件下转录和翻译所述的的多核苷酸，经亲和层析法纯化的步骤。

本发明一方面提供了一种药物组合物，其含有所述的NESP-Fc免疫融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。这些药物组合物可用于刺激红细胞产生并预防和治疗由于EPO水平低下所致的贫血症。

所述的药物组合物可以制成各种制剂，制剂包含NESP-Fc免疫融合蛋白、缓冲液以及液体或固体形式的表面活性剂。固体制剂包括但不限于冷冻干燥、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥制剂。液体制剂优选的基质为水，但还可以包含其他成分，例如乙醇、丙醇、丙二醇或甘油等。

缓冲液成分包括能够调节pH的任何生理可用物质，例如柠檬酸盐、醋酸盐。组氨酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐及其各自的酸或混合物。通常使用的缓冲液成分是柠檬酸盐和/或其游离酸。表面活性剂是可以在药物组合物中用作表面活性剂的任何赋形剂，如聚乙烯山梨聚糖酯类(Tweens)等。

所述的药物组合物通过局部给药、气雾剂、注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射和静脉注射的方式施用。

本发明一方面提供了一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白在制备治疗贫血症的药物中的应用。

附图说明：

图1为NESP-Fc免疫融合蛋白结构示意图

图2为NESP-Fc免疫融合蛋白表达载体的构建

图2A为PCR扩增NESP-Fc基因，其中条带1为NESP-Fc基因；条带2为NESP-Fc基因；条带3为分子量标准DL2000

图2B为HindIII-EcoRI双酶切鉴定。其中，条带1为分子量标准DL2000；条带2为切出预期大小的片段；条带3为切出预期大小的片段；条带4为切出预期大小的片段

图3为PBL表达载体示意图

图4为人IgG标准曲线

图5为NESP-Fc免疫融合蛋白纯化产物电泳分析

图6为NESP-Fc免疫融合蛋白体外活性检测

具体实施方式：

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：NESP-Fc免疫融合蛋白表达载体的构建

1、NESP-Fc免疫融合蛋白表达基因的优化

影响细胞蛋白表达产量的因素是多方面的，当基因中含有大量的稀有密码子时，会降低蛋白的表达产量。因为融合蛋白将在细胞中进行表达，根据CHO表达的偏性密码子表(参见Holm L.Nucleic Acids Res.1986Apr 11；14(7)：3075-87)对新红细胞生成刺激蛋白(NESP)和IgG2编码的DNA序列进行优化，并保证所编码的蛋白氨基酸残基保持不变。新红细胞生成刺激蛋白(NESP)的蛋白氨基酸残基序列参见专利US20030104996，IgG2蛋白氨基酸残基序列参见＞gi|243169|gb|AAB21082.1|。为了保证蛋白的高效表达，本发明中融合蛋白信号肽序列为适于抗体类蛋白表达的抗体轻链κ信号肽，该信号肽氨基酸残基序列为“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”，并在起始密码子“ATG”前加入有利于蛋白表达的Kozak序列“CGCCACC”。由于涉及多个碱基的突变，不能采用逐一突变的方法，只能用人工合成全序列，我们对表达的蛋白cDNA进行全合成：

CGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGCCCCTCCTCGCCTGATCTGCGACTCCCGCGTGCTGGAGCGCTACCTGCTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCAACGAGACCTGCTCCCTGAACGAGAACATCACCGTGCCTGACACCAAGGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGCATGGAGGTGGGCCAGCAGGCCGTGGAGGTGTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCCGAGGCCGTGCTGCGCGGCCAGGCCCTGCTGGTGAACTCCTCCCAGGTGAACGAGACCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCCGTGTCCGGCCTGCGCTCCCTGACCACCCTGCTGCGCGCCCTGGGCGCCCAGAAGGAGGCCATCTCCCCTCCTGACGCTGCCTCCGCTGCTCCCCTGCGCACCATCACCGCCGACACCTTCCGCAAGCTGTTCCGCGTGTACTCCAACTTCCTGCGCGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCCTGCCGCACCGGCGACCGCGACAAGACCGTGGAGCGCAAGTGCTGTGTGGAGTGCCCTCCCTGCCCTGCTCCTCCTGCTGCCGCTCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCTGGAAAGTAA

其中“CGCCACC”为Kozak序列，“ATG”和“TAA”分别为起始密码子和终止密码子。

该系列所表达的免疫融合蛋白一级序列为：

APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCNETCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNS SQVNETLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRDKTVERKCCVECPPCPAPPA AAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

斜体氨基酸序列为抗体轻链κ信号肽，下划线氨基酸序列为IgG2的铰链区、CH2和CH3区，IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala(236位氨基酸缺失)，新红细胞生成刺激蛋白(NESP)的蛋白氨基酸残基序列中与天然EPO的序列相比较，对以下氨基酸进行了突变：Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn，Pro90Thr。

通过http://www.expasy.ch/tools/提供的软件对免疫融合蛋白N糖基化位点进行预测，NESP-IgG2免疫融合蛋白共有六个N糖基化位点，其中五个在NESP氨基酸残基中，一个在IgG2中，如表1所示。

表1免疫融合蛋白N糖基化位点预测

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCNETCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA 80

VEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQVHETLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTERK 160

LFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRDKTVERKCCVECPPCPAPPAAAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE 240

DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY 320

TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH 400

EALHNHYTQKSLSLSPGK

...........................................N.....N.......N...................... 80

......................N....N.................................................... 160

................................................................................ 240

...........................N.................................................... 320

................................................................................ 400

.................. 480

(Threshold＝0.5)

--------------------------------------------------------------------------------

SeqName Position Potential Jury N-Glyc

agreement result

123456 44 NITT 0.6764 (9/9) ++

123456 50 NETC 0.5551 (6/9) +

123456 58 NITV 0.7980 (9/9) +++

123456 103 NSSQ 0.7374 (9/9) ++

123456 108 NETL 0.6410 (9/9) ++

123456 268 NSTF 0.5453 (5/9) +

2、NESP-Fc免疫融合蛋白表达载体的构建

设计上游引物：5’-CCCAAGCTTCCGCCACCATGGAGAC-3’，下游引物5-CCGGAATTCTTACTTTCCAGGAGACAGGGACAGG-3，其中下划线部分分别为HindIII和EcoRI的酶切位点。采用PCR的方法对NESP-Fc的cDNA进行扩增，扩增的反应条件为：95℃预变性5分钟，以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增30个循环，再以72℃延伸10分钟，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果见附图2A。将目的条带切下，用DNA试剂盒回收扩增产物。

NESP-Fc基因PCR产物大小约为1250bp，该产物和表达载体PBL分别用HindIII和EcoRI双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，将连接产物转入DH5α感受态细菌中，在LB(氨苄酶素抗性)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用HindIII和EcoRI双酶切鉴定，结果如附图2B所示。

本发明采用的是谷氨酰胺(GS)筛选表达体系，如附图3所示。目前，抗体和融合蛋白表达系统方面国内研究和使用较多的是二氢叶酸还原酶(DHFR)系统。GS系统是近年来发展的一种基因扩增筛选系统，GS系统较DHFR系统有明显的优越性：进入大规模细胞培养生产后，培养基中无需加入谷氨酰胺，降低因谷氨酰胺分解产生的氨对细胞生长的毒性，可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间；所需细胞为DHFR缺陷型细胞，该类细胞生长往往较慢，GS表达系统可用正常的细胞进行筛选；DHFR系统的缺陷表现为筛选高表达株所需时间长，GS表达系统筛选高表达株所需时间短，且容易筛选到高表达细胞株。

实施例2：NESP-Fc免疫融合蛋白的表达及纯化

1、NESP-Fc免疫融合蛋白表达载体转染293F细胞

293F(购自Invitrogen公司，Cat No.11625-019)细胞悬浮培养于无血清CD293培养液(购自Invitrogen公司，Cat No.11913-019)中，转染前离心更换新鲜培养基，细胞浓度调整为1×10⁶细胞/ml。以100ml细胞为例，分别将DNA(250ug)和PEI(500ug，Sigma，Cat.No：408727)加入1ml 293培养液中混匀，静置5min。室温放置8min。将PEI/DNA混悬液逐滴加入摇瓶中，轻轻混匀，置于5％CO₂、37℃摇床培养(115rpm)5天后收集培养上清。

2、免疫融合蛋白浓度的检测

采用夹心ELISA法检测收集培养上清中免疫融合蛋白的瞬时表达。96孔板包被3μg/ml抗人IgG(Sigma，Cat.No：I3382)，50μl/孔，4℃过夜；0.25％BSA的PBST(0.05％Tween-20)洗涤96孔板4次；1％BSA-PBS封闭(50μl/孔)，37℃，封闭1小时；PBST洗涤4次后，加入0.25％BSA的PBST稀释转染细胞上清液和蛋白标准品，50μl/孔，37℃孵育1h；洗板4次后，加入1∶2000稀释碱性磷酸酶标记抗人IgG(Sigma，Cat.No：A3188)，50μl/孔；洗板4次后，加1mg/ml用二乙醇胺新鲜配制底物对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)50μl/孔，避光反应30min加终止液3M NaOH(50μl/孔)，405nm和490nm双波长读数。

根据标准品的结果绘制标准曲线，进行x(浓度)，y(吸光度)的直线拟合；求出细胞上清液中免疫融合蛋白的浓度，如附图4所示。培养上清液中NESP-IgG2免疫融合蛋白的瞬时表达量约为1.03μg/ml。

3、亲和层析法纯化NESP-Fc免疫融合蛋白

转染细胞5天后，收集上清做纯化。用pH 7.4的PBS溶液平衡HiTrap MabSelectSuRe 1ml柱(GE Healthcare Life Sciences产品，Cat.No：11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；将经转染得到的60ml上清液用0.45μm滤膜过滤上样。流速为0.5ml/min；用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。

透析置换纯化样品中的洗脱液。把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段；在大体积的2％碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟；用蒸馏水彻底清洗透析袋；放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟；冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内；用去离子水清洗透析袋，将纯化样品装入透析袋中，两端用透析夹夹好；放入装有缓冲液的烧杯中搅拌透析；透析3个小时，中间需要更换缓冲液一次，透析实验缓冲液为pH为7的磷酸缓冲液。

实施例3：NESP-Fc免疫融合蛋白的结构确证：

取纯化后的融合蛋白进行蛋白质电泳，分析纯化产物。

透析前后对蛋白分子量没有变化，还原和非还原条件下融合蛋白的分子量分别为72kDa，～200kDa。见附图5。

实施例4：NESP-Fc融合蛋白生物学活性检测

1、EPO依赖生长细胞株UT-7细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，编号3111C0001CCC000120)悬浮培养于含10％胎牛血清PRMI 1640培养基中，并含10u/ml Epo(购自沈阳三生)，37℃，5％CO₂培养。

2、试验前用胎盼蓝检测细胞活力，活细胞比率数大于95％时进行下面的试验。计数细胞，96孔培养板中加入UT-7细胞1×10⁴/孔。

3、用不含EPO的10％FBS的1640细胞培养基稀释转染上清，使其终浓度为：0.198ng/mL、0.395ng/mL、0.791ng/mL、1.582ng/mL、3.164ng/mL、4.745ng/mL、9.491ng/mL、28.472ng/mL、113.889ng/mL。每个稀释度做3个复孔，对照组培养基为不含EPO的10％FBS的1640。37℃，5％CO₂孵箱中培养。

4、直至对照组(不含EPO)细胞全部死亡(凋亡)结束培养。每孔再加入10μL CCK-8试剂(购自日本株式会社同仁化学研究所)，37℃培养2.5h后测450nm处吸光度，参比波长630nm，将浓度对数与吸光度(OD)作图，见附图6。

结果，UT-7细胞增殖实验显示，NESP-Fc融合蛋白分别在0.198ng/mL～113.889ng/mL范围内，体外活性随浓度的升高而增强，表现出明显的量效关系，如下表2所示。NESP-Fc的ED₅₀为0.00735ng/mL。

表2NESP-Fc融合蛋白的浓度与活性的量效关系

序列表

<110>北京精益泰翔技术发展有限公司百泰生物药业有限公司

<120>一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白

<160>4

<210>1

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>2

<211>232

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

100 105 110

Leu Pro Ala Pro lle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>3

<211>398

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val

165 170 175

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe

180 185 190

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

195 200 205

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

210 215 220

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

225 230 235 240

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val

245 250 255

Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

260 265 270

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

275 280 285

Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

290 295 300

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

305 310 315 320

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

325 330 335

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp

340 345 350

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

355 360 365

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

370 375 380

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385 390 395

<210>4

<211>1197

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<400>4

gcccctcctc gcctgatctg cgactcccgc gtgctggagc gctacctgct ggaggccaag 60

gaggccgaga acatcaccac cggctgcaac gagacctgct ccctgaacga gaacatcacc 120

gtgcctgaca ccaaggtgaa cttctacgcc tggaagcgca tggaggtggg ccagcaggcc 180

gtggaggtgt ggcagggcct ggccctgctg tccgaggccg tgctgcgcgg ccaggccctg 240

ctggtgaact cctcccaggt gaacgagacc ctgcagctgc acgtggacaa ggccgtgtcc 300

ggcctgcgct ccctgaccac cctgctgcgc gccctgggcg cccagaagga ggccatctcc 360

cctcctgacg ctgcctccgc tgctcccctg cgcaccatca ccgccgacac cttccgcaag 420

ctgttccgcg tgtactccaa cttcctgcgc ggcaagctga agctgtacac cggcgaggcc 480

tgccgcaccg gcgaccgcga caagaccgtg gagcgcaagt gctgtgtgga gtgccctccc 540

tgccctgctc ctcctgctgc cgctccttct gtgttcctgt tcccccctaa gcccaaggac 600

accctgatga tctcccggac ccctgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag 660

gaccccgagg tgcagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa tgccaagaca 720

aagccacggg aggagcagtt caacagcacg ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg 780

caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa gggcctgcct 840

gcccccatcg agaagaccat ctccaagacc aagggacagc cccgcgagcc tcaggtgtac 900

accctgcccc cttcccggga ggagatgacc aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 960

aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatggcca gcctgagaac 1020

aactacaaga ccacccctcc catgctggac tccgacggct ccttcttcct gtacagcaag 1080

ctgaccgtgg acaagagccg ctggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1140

gaggctctgc acaaccacta cacccagaag agcctgtccc tgtctcctgg aaagtaa 1197

Claims

1.一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，是由新红细胞刺激蛋白NESP与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成；

所述的NESP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述IgG的Fc部分是包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域的IgG分子的二聚化Fc部分，其中二聚化Fc部分中的每一条链通过其C末端直接与NESP分子的N末端相连。

2.根据权利要求1所述的新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白，其特征在于，所述的N糖基化位点包含Asn-X-Ser/Thr的氨基酸序列，所述的N糖基化位点有5个，发生在NESP氨基酸序列的第30，32，87，88，90位。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的IgG是人源的；优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其突变体中的任意一种；更优选为人IgG2及其突变体的任意一种。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的IgG2突变体为IgG2序列中的Val234和Gly237突变为Ala，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示。

6.多核苷酸序列，其编码如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白。

7.一种载体，其包含如权利要求6所述的多核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的载体为真核表达载体；所述的载体是pBT-NESP-Fc。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞经如权利要求7所述的载体转染。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为CHO细胞或NS0细胞。

11.根据权利要求1所述的一种免疫融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以可检测量表达融合蛋白的条件下转录和翻译权利要求7的多核苷酸，培养权利要求9所述的宿主细胞，经Protein A方法纯化的步骤。

12.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-5中任一项所述的免疫融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物通过局部给药、气雾剂、注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射和静脉注射的方式施用。

14.根据权利要求1-5、12中任一项所述的一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白在制备治疗贫血症的药物中的应用。