CN101736008B - 一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法。本发明所提供的制备N-乙酰化胸腺素α1的方法，包括以下步骤：1)用基因工程大肠杆菌制备含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽；2)内肽酶酶切上述步骤1)的含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽，纯化得到N-乙酰化胸腺素α1。本发明的制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法，具有成本低廉，可以提高N-乙酰化胸腺素α1的表达量，简化切割，方便N-乙酰化胸腺素α1的纯化，从而提高N-乙酰化胸腺素α1的生产效率，具有广阔的临床应用前景等优点。

Description

一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法
技术领域
本发明涉及一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法。
背景技术
胸腺素α是一族具有相同或相似N-端序列的免疫调节多肽，包括胸腺素α原、胸腺素α1和胸腺素α11等。其中，胸腺素α1和胸腺素α11是胸腺素α原在体内降解的产物。天然来源的胸腺素α的N-端都具有N-乙酰化修饰，N-乙酰化修饰对胸腺素α1的体内稳定性具有重要作用。采用化学方法合成的N-乙酰化胸腺素α1已经上市，商品名为“日达仙”，用于治疗病毒性肝炎等，疗效显著。但是采用化学方法合成N-乙酰化胸腺素α1成本高、污染大，制约了该药的广泛使用。利用基因工程大肠杆菌制备多肽具有成本低、安全性好、适合于规模化生产等优势，但利用大肠杆菌生产的多肽一般没有N-乙酰化修饰，因此目前已经报道的基因工程方法制备的胸腺素α1均为非乙酰化的。目前已发现用基因工程大肠杆菌可以制备N-乙酰化胸腺素α原(Wu J，Chang S，Gong X，Liu D，Ma.Q.Identification ofN-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli.BiochimBiophys Acta.2006；1760(8)：1241-7.)，并发现将N-乙酰化胸腺素α原通过羟胺切割可以获得N-乙酰化胸腺素α1的类似物，但该N-乙酰化胸腺素α1类似物的C-端为羟胺化修饰的，与天然的N-乙酰化胸腺素α1的游离羧基端不同，这种不同，在N-乙酰化胸腺素α1作为药物时可能造成具有免疫原性、影响生物活性等问题。
由于胸腺素α原具促进正常细胞转化和异常增生的作用，因此具有潜在的致瘤性(Rodriguez P，Vinnuela JE.Overexpression of prothymosin α accelerates proliferation andretards differentiation in HL-60cells.Biochem J，1998，331：753-761.)，这种致瘤性是由胸腺素α原C端的核定位序列(TKKQKTDEDD)介导的，缺失或替换该C端核定位序列后，胸腺素α原就不再具有致瘤性(Freire J，Covelo G，Sarandeses C，et al.Identification ofnuclear-import and cell-cycle regulatory proteins that bind to prothymosin alpha.Biochem CellBiol，2001，79：123-31；Steven A，Enkemann，RH Wang.Functional Discontinuities inProthymosin α Caused by Caspase Cleavage in Apoptotic Cells.Journal of Cellular Physiology，2000，182：256-68)。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法。
本发明所提供的制备N-乙酰化胸腺素α1的方法，包括以下步骤：
1)用基因工程大肠杆菌制备含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽；
2)内肽酶酶切上述步骤1)的含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽，纯化得到N-乙酰化胸腺素α1。
上述方法中，所述含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽可以是含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的融合蛋白或多肽，也可以是含N-乙酰化胸腺素α1序列的N-乙酰化胸腺素α原或其突变体。
在保持N-乙酰化胸腺素α1序列不变的条件下，可以通过改变其它部分的序列来提高表达、方便纯化和减少这些蛋白进入人体后潜在的副作用。上述方法中，所述含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的融合蛋白或多肽，可以是为了方便N-乙酰化胸腺素α1的表达和纯化，在含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的蛋白或多肽上融合多聚组氨酸标签(His tag)、Myc标签、HA标签、谷胱甘肽转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP)等。具体可为N-乙酰化胸腺素α1与谷胱甘肽转移酶形成的融合蛋白。这些标签序列的编码基因可以用人工合成的方法制备，也可以从商业化的载体上获得，这些标签序列的编码基因与上述含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的蛋白或多肽的编码序列可以用常规的分子生物学方法连接，如用连接酶连接或PCR方法等。
上述方法中，所述胸腺素α原突变体，是至少满足下述条件之一的多肽：
1)缺失序列表中序列3的自氨基末端第100—109位的氨基酸残基；
2)将序列表中序列3的自氨基末端第100—109位这10个氨基酸残基中至少一个氨基酸残基进行替换；
3)将序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替换为丙氨酸；
4)将序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位这5个位置的Asn中的至少一个替换或缺失；
5)缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸残基；
6)缺失序列表中序列3的自氨基末端第69-109位的氨基酸残基。
上述胸腺素α原变异体是下述多肽之一：
1)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第100—109位的氨基酸残基得到的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列4所示；
2)是将序列表中序列3的自氨基末端第100—109位这10个氨基酸残基中至少一个氨基酸残基进行替换得到的多肽；
3)是将序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替换为丙氨酸得到的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列5所示；
4)是将序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位这5个位置的Asn中的至少一个替换或缺失得到的多肽；
5)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸残基得到的多肽；
6)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位和第69-109位的氨基酸残基得到的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列9所示。
上述方法中，所述N-乙酰化胸腺素α1是指至少具有一种与天然或化学合成的N-乙酰化胸腺素α1相同或相似的免疫调节功能，且序列与其同源的多肽。不同哺乳动物来源的N-乙酰化胸腺素α1的序列略有差别，且即使是人源的胸腺素α1也存在一定的序列多态性，如大多数人的胸腺素α1具有序列表中序列1的氨基酸序列(Goodall，G.J.，Dominguez，F.，and Horecker，B.L.Molecular cloning of cDNA for humanprothymosin.Proc Natl Acad Sci USA.(1986)，83：8926-8928.)，但少数人的胸腺素α1的第13位苏氨酸被异亮氨酸替代(Rubtsov IuP，Vartapetian AB.New intronless members of humanprothymosin alpha genes.(1995)Mol Biol(Mosk)29(6)：1320-5)，即具有序列表中序列2的氨基酸序列。但这些序列略有差别的胸腺素α1具有相同或相似的免疫调节功能。所述胸腺素α1包括这些胸腺素α1，优选为与序列表中序列1或序列2具有90％以上同源性的多肽，更优选的为与序列表中序列1或序列2具有95％以上同源性的多肽，具体可为序列1或序列2的多肽。
上述N-乙酰化胸腺素α原或其变异体的氨基酸序列如序列3-9所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列10—18所示。
这些变异体具有以下优点：
1)序列3的自氨基末端第100—109位的氨基酸残基为胸腺素α原的C-端核定位序列。由于胸腺素α原具有促进正常细胞转化和异常增生的作用，因此具有潜在的致癌性。这种促细胞异常增生的作用是通过胸腺素α原C端核定位序列介导的核定位发生的，去除或改变了C端核定位序列的胸腺素α原不再具有致瘤性，而且又不影响N-乙酰化胸腺素α1的制备，因而即使在最后的N-乙酰化胸腺素α1制品中含微量的胸腺素α原也不会存在安全隐患，因而明显提高了本发明方法产物的临床适用性。
2)胸腺素α原序列上除第28位的天冬酰胺(N28)位点外，还有N35、N37、N39、N42和N49等多个天冬酰胺位点，这些位点均可以被天冬酰胺内肽酶切割，因此切割产物较为复杂，纯化困难。本发明提供了用这些位点突变或缺失(如序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸残基的缺失)的胸腺素α原制备N-乙酰化胸腺素α1的方法，使切割产物的复杂性明显降低，方便了纯化。
3)G36A和G43A突变可以提高胸腺素α原的表达水平，从而提高N-乙酰化胸腺素α1的生产效率。
4)去除了部分胸腺素α原中的非胸腺素α1部分的序列，提高了表达的蛋白或多肽中N-乙酰化胸腺素α1的比例(如序列表中序列3的自氨基末端第69位以后的氨基酸残基的缺失)。
上述N-乙酰化胸腺素α原或其变异体的编码基因可以用PCR、RT-PCR、人工合成或构建筛选cDNA文库等方法获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等，如从人胚胎胸腺获得；也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样可以提高产物的表达。可用现有的PCR、酶切连接等方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入或与其它多聚核苷酸连接等。
本发明的制备N-乙酰化胸腺素α1的方法中，所述N-乙酰化胸腺素α原或其变异体是将含有N-乙酰化胸腺素α原或其变异体的编码基因导入表达载体中构建重组表达载体，再将构建好的重组表达载体转入宿主细胞中表达得到的；所述表达载体上可以带有复制位点、筛选标记等，具体可为pET系列、PBV220载体等，所述表达载体上还可以带有各种诱导型或组成型启动子，具体可为诱导型启动子，这样有利于提高重组大肠杆菌的稳定性。其中诱导型启动子具体可为化学诱导启动子，如T7、Lac、Tac、Trp等及温敏启动子，如PLPR启动子。所述宿主细胞可为大肠杆菌细胞，如DH5a、BL21(DE3)等。重组大肠杆菌细胞具有生长快、培养成本低廉、易于大规模生产、已成功用于大量重组药用蛋白的生产等优势，因此在工业生产上具有明显的优势。可以用摇瓶或生物反应器等培养上述重组菌，生产时具体可使用生物反应器；培养基应能提供菌体生长和产物表达所需的各种营养物质，包含氮源、碳源、pH缓冲成份等。重组菌的培养分两个阶段，第一阶段主要用于菌体的生长，第二阶段主要用于合成产物。从培养物中分离含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的蛋白或多肽的方法可以用各种蛋白分离的方法，如破菌、萃取、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。液相层析可以用离子交换、凝胶排阻、亲和、疏水、反相等层析技术。
本发明所提供的制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法中，所述内肽酶为天冬酰胺内肽酶，天冬酰胺内肽酶是一类广泛存在于生物界的内肽酶，又被称为legumain或VPE(vacuolar processing enzyme)，它特异性切割多肽或蛋白中天冬酰胺的C端，在植物、动物中均有发现，Abe，Y(JBC1993，3525-3529)报道了从刀豆(canavalia ensiformis)种子中提取天冬酰胺内肽酶的方法及刀豆天冬酰胺内肽酶的核苷酸和氨基酸序列(GenBankL05515)。Dalton，JP(Parasitology，1995，111：575-580)等报道了曼森血吸虫(Schistosomamansoni)的天冬酰胺内肽酶，chen JM(JBC1997，272：8090-8098)报道了人的天冬酰胺内肽酶。各物种的天冬酰胺内肽酶的编码序列及其对应的氨基酸序列可以从美国国立卫生研究院的GenBank或欧洲的EMBL等公开的基因或蛋白数据库中直接获得(在GenBank中人、小鼠、大鼠的天冬酰胺内肽酶基因收录号分别为NM_005606、NM_011175、NM_022226)。或者根据人、曼森血吸虫、刀豆等物种的天冬酰胺内肽酶序列，在上述数据库中通过同源比对获得。本发明优选的天冬酰胺内肽酶为人天冬酰胺内肽酶。天冬酰胺内肽酶可以用基因工程制备或从各物种提取，优选的是用基因工程方法制备，包括用基因工程酵母、昆虫细胞、大肠杆菌或哺乳动物细胞等制备得到。其中用基因工程酵母制备天冬酰胺内肽酶具有表达水平高、蛋白可溶、不需要复性、制备成本低廉、适合于规模生产等优势。天冬酰胺内肽酶可以先以酶原形式制备，以提高其在表达和制备过程中的稳定性，使用前通过调节溶液的pH至酸性，使其自活化。为了提高酶活性、表达量、稳定性及方便酶纯化等，天冬酰胺内肽酶还可以进行替换、缺失和融合等改造。
本发明制备的N-端乙酰化修饰胸腺素α1还可以有各种衍生物，这些衍生物可以但不局限于其不同形式的盐或修饰产物等。所述修饰剂可以但不局限于聚乙二醇、葡聚糖或及其衍生物等。
本发明制备的N-端乙酰化修饰胸腺素α1可用于制备治疗和/或预防各种传染病和肿瘤的药物，如治疗和/或预防病毒性肝炎、流行性感冒或肝癌等。
本发明的制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法具有成本低廉，适合于规模生产等优点，制备的基因工程N-乙酰化胸腺素α1具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为N-乙酰化胸腺素α原粗制品的SDS-PAGE分析结果。
图2为N-乙酰化胸腺素α原粗制品的RP-HPLC分析结果。
图3为人天冬酰胺内肽酶原活化分析。
图4为人天冬酰胺内肽酶对胸腺素α原切割效果分析。
图5为N-乙酰化胸腺素α1纯化的色谱图。
图6为N-乙酰化胸腺素α1的RP-HPLC分析。
图7为利用本发明方法制备的N-乙酰化胸腺素α1的质谱分子量分析
图8为天然基因和人工合成基因表达C-端缺失或G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的工程菌的SDS-PAGE分析。
图9为用人工合成基因表达自氨基末端第32-52位区段缺失或截短的G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的工程菌的SDS-PAGE分析。
图10为以de153/G68胸腺素α原变异体为原料制备的N-乙酰化胸腺素α1的纯化色谱图。
图11为以de153/G68胸腺素α原变异体为原料制备的N-乙酰化胸腺素α1的RP-HPLC分析。
具体实施方式
实施例1、以N-乙酰化胸腺素α原制备N-乙酰化胸腺素α1
实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、试剂盒等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司。
1、表达N-乙酰化胸腺素α原的基因工程菌的构建
取流产的人胎儿胸腺，用总RNA制备试剂盒，按试剂盒提供的方法制备总RNA；用RT-PCR试剂盒，按试剂盒提供的方法将mRNA逆转录成cDNA；以该cDNA为模板，以Prot1：5’-CCCATATGTCTGATGCAGCTGTAGATACC-3’和Prot2：5’-CGGGATCCCTAGTCATCCACGTCGGTCTTCTG-3’为引物，PCR扩增胸腺素的cDNA。100μl反应体系中加入1μl cDNA，20μmol/L的Prot1、Prot2引物各3μl，2mmol/L的dNTP10ul，10X反应缓冲液10ul，pfu DNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为：先94℃变性1分钟，然后52℃退火30秒，最后72℃延伸1分钟，共35个循环。将PCR产物纯化回收后用NdeI和BamHI进行双酶切，酶切产物与经同样酶切的载体PET22b(购自Novagen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。对阳性克隆进行酶切鉴定并测序，测序结果表明，扩增得到的胸腺素基因与天然人胸腺素α原(其脱氧核糖核苷核酸序列如序列表中序列10所示，所编码的氨基酸残基序列如序列表中序列3所示)的序列一致，将得到的重组质粒命名为pET-NproT，将得到的阳性克隆命名为BL21(DE3)(pET-NproT)。
将BL21(DE3)(pET-NproT)单菌落接种于100ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，然后转接至含3L培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氢钠20mM，磷酸氢二钠30mM，葡萄糖10g/L)的B5发酵罐中(购自德国贝朗公司)，37℃培养，通过搅拌和通气控制溶氧大于20％。培养4h后，加入3ml0.2mol/L的IPTG诱导，继续培养4-8h，发酵液离心，收集菌体。
将收集的菌体用水重悬(每克菌加10ml水)，超声波破壁，离心收集上清，在上清液中加入冰乙酸调节pH至4.5，静置30分钟，离心收集上清，即为含有N-乙酰化胸腺素α原的粗提液。将该粗提液用SP FFΦ2.5X30cm柱(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)进行纯化。具体条件为：A液(20mM乙酸钠和乙酸组成的缓冲液，pH4.5)，B液(A液+1M NaCl)，SP FF柱先用A液平衡，然后从A通道将上述含有N-乙酰化胸腺素α原的粗提液上样至SP FF柱中，再用A液洗去未结合的蛋白，最后在0→30分钟：A从100％→0％；B从0％→100％线性梯度洗脱，分段收集洗脱液。将收集到的各级份洗脱液取样作SDS-PAGE分析，合并含12KDa胸腺素α原的洗脱液(30％-60％B洗脱液中)，获得N-乙酰化胸腺素α原的粗制品，取样作SDS-PAGE和RP-HPLC分析，结果如图1和图2所示。图1为SDS-PAGE结果，其中，1为N-乙酰化胸腺素α原的粗制品，2为分子量标准。RP-HPLC分析采用HP1090高压液相色谱仪，C18柱(4.6×250mm，中科院大连化学物理所，A液为含0.1％TFA(体积百分含量)的纯水；B液为含0.1％TFA(体积百分含量)的色谱纯乙腈，梯度洗脱：0min，A液100％，B液0％；→30min，A液10％，B液90％)，RP-HPLC结果如图2所示。其中，A峰为非乙酰化胸腺素α原，B峰为N-乙酰化胸腺素α原(Wu J，Chang S，GongX，Liu D，Ma.Q.Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosinalpha in Escherichia coli.Biochim Biophys Acta.2006；1760(8)：1241-7.)。结果表明，上述得到的胸腺素α原粗制品中，70％以上为N-乙酰化胸腺素α原。
2、制备天冬酰胺内肽酶
取人肝癌细胞HepG2(购于中国科学院上海细胞库)，用总RNA制备试剂盒，按试剂盒提供的方法制备总RNA，用RT-PCR试剂盒，按试剂盒提供的方法将mRNA逆转录成cDNA，以该cDNA为模板，以leg1：5’-AGAGTCGACAAAAGAGTTCCTATAGATGATCCTGAAG-3’和leg2：5’-TATGTCGACGCGGCCGCTTAGTAGTGACCAAGGCACACGTG-3’为引物，PCR扩增人天冬酰胺内肽酶原基因的cDNA。50μl反应体系中加入1μl cDNA，20μmol/L的leg1、leg2引物各1μl，2.5mmol/L的dNTP4ul，10X反应缓冲液5ul，pfu DNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为：先94℃变性1分钟，然后52℃退火30秒，最后72℃延伸2分钟，共35个循环。将PCR产物纯化回收后用XhoI和NotI进行双酶切，酶切产物与经同样酶切的载体pPIC9(购自Invitrogen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用氨苄青霉素筛选抗性菌落，对阳性克隆提取质粒进行测序。将测序结果与人天冬酰胺内肽酶原基因(序列表中序列19)的核苷酸序列一致的质粒转化毕赤酵母GS115(购自Invitrogen公司)，采用MD培养基(1.34％YNB(质量百分含量)，4×10-5％生物素(质量百分含量)，2％葡萄糖(质量百分含量)，1.5％琼脂(质量百分含量))平板进行筛选；然后将转化子转至YPD培养基(1％酵母提取物(质量百分含量)，2％蛋白胨(质量百分含量)，2％葡萄糖(质量百分含量))中，30℃条件下250rpm培养24h；然后再以4％(体积百分含量)的接种量接种于25mL BMGY(1％酵母提取物(质量百分含量)，2％蛋白胨(质量百分含量)，1％甘油(质量百分含量)，1.34％YNB(质量百分含量)，4×10-5％生物素(质量百分含量)，100mMpB，pH6.0)培养基中，30℃ 250rpm培养24h，然后在培养基中加入甲醇，使其在培养基中的体积百分含量达0.05％，进行适应性诱导；12h后再将培养基中的甲醇含量升至0.5％进行诱导，其后每隔12h每升培养基中补加5ml甲醇；诱导72h后，离心取上清，SDS-PAGE电泳分析，取表达量较高的克隆作为制备人天冬酰胺内肽酶原的基因工程酵母。
取上述基因工程酵母的单克隆，接种到5ml YPD培养基中，30℃250rpm培养24h；然后以2％的接种量接种于200mL YPD培养基中，30℃250rpm培养24h；再以5％的接种量接种于4L BMGY培养基中，30℃250rpm培养24h；最后在培养基中加入甲醇，使其在培养基中的体积百分含量达0.5％，进行诱导；其后每隔12h每升培养基中补加5ml甲醇；诱导72h后，离心取上清，用冰乙酸调pH至5.5，用SP FFΦ5.0X30cm柱(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂购自GE公司)纯化。具体条件为：A液(20mM乙酸钠和乙酸组成的缓冲液，pH5.0)，B液(A液+1M NaCl)各2L，SP FF柱先用A液平衡，然后从A通道将上述含有人天冬酰胺内肽酶原的培养上清上样至SP FF柱中，再用A液洗去未结合的蛋白，最后在0→30分钟：A从100％→0％；B从0％→100％线性梯度洗脱，收集紫外吸收主峰(50-70％B)即为人天冬酰胺内肽酶原。取上述收集到的浓度为0.1mg/ml的人天冬酰胺内肽酶原1ml，加入0.1ml1mol/L pH4.5柠檬酸钠溶液、1μl1mol/L DTT，37℃孵育，分别于0.25、1和2小时取样进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。其中，人天冬酰胺内肽酶原由416个氨基酸组成，有4个N-糖基化位点，分子量约为56KDa；而活化的人天冬酰胺内肽酶由298个氨基酸组成，分子量约为46KDa。结果表明，随着孵育时间的增加，56KDa的人天冬酰胺内肽酶原逐渐减少，46KDa的人天冬酰胺内肽酶逐渐增加，2小时后人天冬酰胺内肽酶原基本转化为活性形式的人天冬酰胺内肽酶。
3、以N-乙酰化胸腺素α原制备N-乙酰化胸腺素α1
将上述步骤2的活化2小时的1ml人天冬酰胺内肽酶加入到50ml上述步骤1的N-乙酰化胸腺素α原粗制品溶液中，再加5ml1mol/L pH4.5柠檬酸钠和50μl1mol/L DTT，37℃孵育切割N-乙酰化胸腺素α原，分别于0.25、1和4小时取样进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示。其中，1、2、3分别为孵育0.25、1和4小时的样品，M为分子量标准。其余样品孵育过夜。结果表明，随着孵育时间的增加，N-乙酰化胸腺素α原逐渐减少，而生成了N-乙酰化胸腺素α1。
4、N-乙酰化胸腺素α1的纯化及鉴定
取上述步骤3的经过天冬酰胺内肽酶酶切的反应液，用C18Φ2.0X20cm柱(购自大连化学物理研究所)进行纯化，A液为水+0.1％体积百分含量TFA，B液为50％体积百分含量乙腈+0.1％体积百分含量TFA的水溶液。先用A液平衡，然后以5ml/min的流速上样，上样完成后，再用A液平衡，然后进行线性梯度洗脱，程序为0→5分钟：A液从100％→70％，B液从0％→30％；5→20分钟：A液从70％→40％，B液从30％→60％。214nm紫外检测，色谱图见图5所示。收集40-45％B组份为制备的N-乙酰化胸腺素α1。
采用C18Φ4.6X250mm柱(购自大连化学物理所)，A液(水+0.1％体积百分含量三氟乙酸)，B液(乙腈+0.1％体积百分含量三氟乙酸)。HP1090色谱仪，梯度洗脱：0→5min，B液：0％→15％，A液100％→85％；5→20min，B液15％→30％，A液85％→70％；20→25min，B液30％→100％，A液70％→0％；25→26min，B液100％。参考品为化学合成的N-乙酰化胸腺素α1(商品名Zadaxin，购自解放军302医院)，浓度160μg/ml，上样量均为10ul。
结果如图6所示。其中，A为N-乙酰化胸腺素α1参考品的色谱图，保留时间为15.4分钟，B为上述步骤3纯化后的N-乙酰化胸腺素α1。其在HPLC上的保留时间也是15.4分钟，说明纯化的是N-乙酰化胸腺素α1，且该组份为均一的单峰(5分钟前的峰为纯化组份中的盐和乙酸的吸收峰)。进一步将A、B溶液以1：1的体积比混合后再用HPLC分析，结果发现，其为均一的单峰(C)，说明两者为同一物质。
将上述步骤3制备的N-乙酰化胸腺素α1作Edman降解法测序，结果未能测到降解的氨基酸峰，说明样品的N-端已被修饰。测定上述步骤3制备的N-乙酰化胸腺素α1的质谱分子量(国家生物医学分析中心分析)，结果如图7所示。结果表明其分子量为3107.66，与N-乙酰化胸腺素α1的理论分子量3107.33一致(差别小于仪器误差1Da)，比非乙酰化胸腺素α1的理论分子量3065Da大42Da(乙酰基修饰的分子量)。表明上述步骤3制备的为N-乙酰化胸腺素α1。
实施例2、N-乙酰化胸腺素α1(Ile13)(序列表中序列2)的制备
以上述实施例1构建的重组质粒pET-NproT为模板，以Prot3：5’-cccatatgtctgatgcagctgtagataccagctccgaaatcaccatcaaggactta-3’和Prot2为引物，进行PCR扩增，获得的脱氧核糖核苷酸序列所编码的氨基酸残基为自氨基末端第13位氨基酸为异亮氨酸的胸腺素α原，将该基因命名为NproT(Ile13)。
采用与上述实施例1相同的方法将NproT(Ile13)插入到载体PET22b的NdeI和BamHI酶切位点间，得到重组质粒pET-NproT(Ile13)；再将重组质粒pET-NproT(Ile13)转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用与上述实施例1相同的筛选方法得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-NproT(Ile13))，培养BL21(DE3)(pET-NproT(Ile13))，表达得到自氨基末端第13位为异亮氨酸的N-乙酰化胸腺素α原。
将得到的自氨基末端第13位为异亮氨酸的N-乙酰化胸腺素α原用上述实施例1步骤2制备的天冬酰胺内肽酶进行酶切，纯化获得N-乙酰化胸腺素α1(Ile13)。具体方法同实施例1。
实施例3、用天然基因和人工合成基因表达C-端缺失和/或自氨基末端第36位由G替换为A、自氨基末端第43位由G替换为A的胸腺素α原变异体，制备N-乙酰化胸腺素α1
1、表达C-端缺失的胸腺素α原变异体的工程菌的构建
以上述实施例1构建的重组质粒pET-NproT为模板，以Prot1和Prot4：5’-gtggatccttaATCGACATCGTCATCCTCATC-3’为引物，PCR扩增获得C-端缺失的胸腺素α原变异体的基因(NproT-C)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列11所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
采用与上述实施例1相同的方法将NproT-C插入到载体PET22b的BamHI和NdeI酶切位点间，得到重组质粒pET-NproT-C；再将重组质粒pET-NproT-C转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用与上述实施例1相同的筛选方法得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-NproT-C)。
2、表达G36A和G43A替换(即胸腺素α原自氨基末端第36位和第43位的甘氨酸(G)替换为丙氨酸(A))的胸腺素α原变异体的工程菌的构建
以上述实施例1构建的重组质粒pET-NproT为模板，以Prot1和Prot5：5’-ATTGTCAGCCTCCTGCTCagcATTTTCCTCATTAGCATTagcGTTAGCAGGGGCGTCTCT-3’为引物，PCR扩增含G36A和G43A编码序列的约150bp的核酸片段；以该150bp的核酸片段为megprimer，以Prot2为反向引物，以pET-NproT为模板，PCR扩增含G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体基因(NproT G36A，G43A)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列12所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
采用与上述实施例1相同的方法将NproT G36A，G43A插入到载体PET22b的NdeI和BamHI酶切位点间，得到重组质粒pET-NproT G36A，G43A；再将重组质粒pET-NproTG36A，G43A转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用与上述实施例1相同的筛选方法得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-NproT G36A，G43A)。
3、表达C-端缺失且G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的工程菌的构建
以上述步骤2获得的pET-NproTG36A，G43A为模板，以Prot1和Prot4为引物，PCR扩增G36A和G43A替换且C-端缺失的胸腺素α原变异体基因(NproT G36A，G43A-C)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列13所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
采用与上述实施例1相同的方法将NproT G36A，G43A-C插入到载体PET22b的NdeI和BamHI酶切位点间，得到重组质粒pET-NproT G36A，G43A-C；再将重组质粒pET-NproTG36A，G43A-C转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用与上述实施例1相同的筛选方法得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-NproT G36A，G43A-C)。
4、用人工合成基因表达G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的工程菌的构建
根据大肠杆菌偏爱密码，优化mRNA的二级结构，减少发卡结构，设计出编码G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的DNA序列(序列表中序列14)。为了合成该基因，我们采用分段合成，PCR拼接的方法。即先合成序列3的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互补序列，每段58bp，每条反向片段分别与正向序列前一段和后一段各有29bp互补。所有DNA片段各取1pmol，混合作为模板，以Prot6：5’-CCCATATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3’和proT7：5’-cgggatccTTAGTCGTCTTCGTCAGTTTTCTG-3’为正向和反向引物，PCR扩增拼接基因。PCR反应体系为：模板1pmol，Prot6和proT7各100pmol，10mmol/L的dNTP1μl，10X反应缓冲液5μl，pfu DNA聚合酶5U，加水到50μl。PCR条件为：先94℃变性30秒，然后54℃退火30秒，最后72℃延伸30秒，共35个循环。获得人工合成的G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的基因(SproT G36A，G43A)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列14所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
采用与上述实施例1相同的方法将SproT G36A，G43A插入到载体PET22b的NdeI和BamHI酶切位点间，得到重组质粒pET-SproT G36A，G43A；再将重组质粒pET-SproTG36A，G43A转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用与上述实施例1相同的筛选方法得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A)。
5、用人工合成基因表达C-端缺失且G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的工程菌的构建
以上述步骤4获得的pET-SproT G36A，G43A为模板，以Prot6和Prot8：5’-cgggatccTTAGTCAACGTCGTCGTCTTCGTC-3’为引物，PCR扩增G36A和G43A替换且C-端缺失的胸腺素α原变异体的基因(SproT G36A，G43A-C)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列18所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
采用与上述实施例1相同的方法将SproT G36A，G43A-C插入到载体PET22b的NdeI和BamHI酶切位点间，得到重组质粒pET-SproT G36A，G43A-C；再将重组质粒pET-SproTG36A，G43A-C转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用与上述实施例1相同的筛选方法得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A-C)。
6、制备N-乙酰化胸腺素α1
分别取上述实施例1构建的BL21(DE3)(pET-NproT)与上述步骤1—5构建的工程菌BL21(DE3)(pET-NproT-C)、BL21(DE3)(pET-NproT G36A，G43A)、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A-C)、BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A)和BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A-C)的单菌落，分别接种到5ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；然后再转接至100ml培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氢钠20mM，磷酸氢二钠30mM，葡萄糖2g/L)中，37℃培养4h，分别加入100μl 0.2mo1/L的IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)继续培养4-8h，各取1ml菌液，离心收集菌体，加50μl水重悬，再和50μl 2XSDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水浴裂解菌体，裂解液离心取上清，进行SDS-PAGE分析，结果如图8所示。其中，1为BL21(DE3)(pET-NproT)的SDS-PAGE结果，2为BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)的SDS-PAGE结果，3为BL21(DE3)(pET-NproT-C)的SDS-PAGE结果，4为BL21(DE3)(pET-NproT G36A，G43A)的SDS-PAGE结果，5为BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A)的SDS-PAGE结果，6为BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)的SDS-PAGE结果，M为分子量标准。
结果表明，BL21(DE3)(pET-NproT-C)(图中样品3)与BL21(DE3)(pET-NproT)(图中样品1)的表达水平相似、BL21(DE3)(pET-NproT G36A，G43A)(图中样品4)的表达水平高于BL21(DE3)(pET-NproT)(图中样品1)，而BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A)(图中样品2和样品5)和BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A-C)(图中样品6)的表达水平最高，即C端核定位序列的缺失不影响胸腺素α原的表达，G36A和G43A替换可以明显提高胸腺素α原的表达，人工合成的基因比天然基因更有利于胸腺素α原的表达。
采用与上述实施例1相同的方法培养上述各工程菌，表达得到胸腺素α原变异体。将得到的各胸腺素α原变异体用上述实施例1步骤2方法制备的天冬酰胺内肽酶进行酶切，制备得到N-乙酰化胸腺素α1。具体的方法同实施例1。
由于BL21(DE3)(pET-SproT G36A，G43A)(图中样品5)和BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)(图中样品6)的表达量较高，因此单位体积的培养物制备的N-乙酰化胸腺素α1也较多。
实施例4、用部份天冬酰胺内肽酶酶切位点缺陷的胸腺素α原变异体或截短的胸腺素α原变异体制备N-乙酰化胸腺素α1
1、用人工合成基因表达自氨基末端第32-52位氨基酸残基序列缺失，并截短的胸腺素α原变异体的工程菌的构建
以上述实施例3构建的pET-SproT G36A，G43A-C为模板，以Prot10：
5’-ggcatATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3’和Prot9：
5’-ACCACCTTCTTCCTCTTCTTCGTCACGACCGTTTTCAGCTTC-3’为引物，PCR扩增编码自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失(含多个天冬酰胺位点)的约110bp的核酸片段；以该110bp的核酸片段为megprimer，以Prot8为反向引物，pET-SproT G36A，G43A-C为模板，PCR扩增编码自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，并缺失C-端核定位序列的胸腺素α原变异体基因(de153-C)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列17所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
将扩增得到的de153-C基因用NdeI和BamHI双酶切后，与经同样酶切的载体PET-22b(购自Novagen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(PET-de153-C)。采用同样的方法，以Prot11：
5’-cgggatccTTAACCTTCTTCCTCTTCTTCCTC-3’代替Prot8，PCR扩增编码自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，且C-端截短至G68的胸腺素α原变异体基因(de153/G68)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列16所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列9所示。
将扩增得到的de153/G68基因用NdeI和BamHI双酶切后，与经同样酶切的载体PET-22b(购自Novagen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(PET-de153/G68)。
以上述实施例3构建的pET-SproT G36A，G43A为模板，以Prot10和Prot11为引物，PCR扩增C-端截短至G68的胸腺素α原变异体基因(G68基因)，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列15所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
将扩增得到的G68基因分别用NdeI和BamHI双酶切后，与经同样酶切的载体PET22b(购自Novagen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(PET-G68)。
2、制备N-乙酰化胸腺素α1
将上述重组大肠杆菌BL21(DE3)(PET-G68)、BL21(DE3)(PET-de153/G68)、BL21(DE3)(PET-de153-C)及实施例3构建的BL21(DE3)(PET-Sprot G36A，G43A)、BL21(DE3)(PET-Sprot G36A，G43A-C)的单菌落分别接种到100ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，然后再接种至含3L培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氢钠20mM，磷酸氢二钠30mM，葡萄糖10g/L)的B5发酵罐中(购自德国贝朗公司)，37℃培养，通过搅拌和通气控制溶氧大于20％。培养4后，溶氧突然回升，提示葡萄糖已耗尽，每升培养物加入1ml0.2mol/L的IPTG进行诱导，继续培养4-8和小时，各取50μl菌液，离心收集菌体，加50μl水重悬，再和50μl2XSDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水浴裂解菌体。裂解上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图9所示。其中，M为分子量标准，1为表达G36A和G43A替换的胸腺素α原变异体的工程菌BL21(DE3)(PET-Sprot G36A，G43A)的SDS-PAGE结果，2为表达C端截断至G68的胸腺素α原变异体的工程菌BL21(DE3)(PET-G68)的SDS-PAGE结果，3为表达自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，且C-端截短至G68的胸腺素α原变异体的工程菌BL21(DE3)(PET-de153/G68)的SDS-PAGE结果，4为表达自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，且C-端核定位序列缺失的胸腺素α原变异体的工程菌BL21(DE3)(PET-de153—C)的SDS-PAGE结果，5为表达C-端核定位序列缺失的胸腺素α原变异体的工程菌BL21(DE3)(PET-Sprot G36A，G43A-C)的SDS-PAGE结果。
图9结果表明，BL21(DE3)(PET-Sprot G36A，G43A)、BL21(DE3)(PET-Sprot G36A，G43A-C)、BL21(DE3)(PET-G68)和BL21(DE3)(PET-de153/G68)的表达较高，而BL21(DE3)(PET-de153--C)的表达较低。由于de153/G68的分子量最小，因此其中含的胸腺素α1比例最高。
为了进一步比较这些工程菌的N-乙酰化胸腺素α1的产率，各取1L上述工程菌的培养产物，用上述实施例1步骤2制备的天冬酰胺内肽酶进行酶切，制备N-乙酰化胸腺素α1。具体方法同实施例1。
将得到的N-乙酰化胸腺素α1进行RP-HPLC分析，具体方法同实施例1。各工程菌所获得的N-乙酰化胸腺素α1的分析结果见表1。
表1 N-乙酰化胸腺素α1的含量
 
工程菌 N-乙酰化胸腺素α1的含量(μg/ml)
BL21(DE3)(PET-Sprot) 81
BL21(DE3)(PET-G68) 126
BL21(DE3)(PET-de153/G68) 197
BL21(DE3)(PET-de153--C) 60
BL21(DE3)(PET-G68) 51
可见工程菌BL21(DE3)(PET-de153/G68)的N-乙酰化胸腺素α1产率最高，其纯化过程的色谱图如图10所示。比较图10与图5可以发现，用工程菌BL21(DE3)(PET-de153/G68)表达胸腺素α变异体制备N-乙酰化胸腺素α1时，杂峰明显减少，因此更易于纯化，方便大规模生产。图11为其制备的N-乙酰化胸腺素α1的RP-HPLC分析，保留时间与图6中化学合成的N-乙酰化胸腺素α1参考品一致，且纯度良好。
实施例5、用含N-乙酰化胸腺素α1的谷胱甘肽转移酶融合蛋白制备N-乙酰化胸腺素α1
1、表达含N-乙酰化胸腺素α1的谷胱甘肽转移酶融合蛋白工程菌的构建
以上述实施例3构建的pET-SproT G36A，G43A-C为模板，以Ta5：
5’-GGCATATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3’和Ta3：5’-GTTTTCAGCTTCTTCAACAAC-3’为引物，PCR扩增得到约100bp的编码胸腺素α1的DNA片段，电泳回收该片段。以GST5：5’-GTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGTATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3’：和GST3：5’-AGGGATCCTTAACGCGGAACCAGATCCGATTT-3；为引物，以pGEX-4T-1载体(构自美国GE公司)为模板，PCR扩增得到约680bp的编码谷胱甘肽转移酶的DNA片段，电泳回收该片段。以这两个DNA片段为模板，以Ta5和GST3为引物，PCR扩增获得用于表达含N-乙酰化胸腺素α1的谷胱甘肽转移酶融合蛋白的基因(其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列20所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列21所示)。该基因用NdeI和BamHI双酶切后，与经同样酶切的载体PET-22b(购自Novagen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)(PET-TaGST)。
将上述重组大肠杆菌BL21(DE3)(PET-TaGST)的单菌落接种到100ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，然后再接种至含3L培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氢钠20mM，磷酸氢二钠30mM，葡萄糖10g/L)的B5发酵罐中(购自德国贝朗公司)，37℃培养，通过搅拌和通气控制溶氧大于20％。培养4-6h后，溶氧突然回升，提示葡萄糖已耗尽，每升加入1ml0.2mol的IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)进行诱导，继续培养4-8和小时，离心收集菌体64g。
将20g收集的菌体用水重悬(每克菌加10ml水)，超声波破壁，离心收集上清，为含有N-乙酰化胸腺素α1-谷胱甘肽转移酶融合蛋白的粗提液。将该粗提液用GlutathioneSepharose 4 Fast Flow Φ2.5X30cm柱(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)进行纯化。具体条件为：A液(20mMTri-HCl，pH7.0)，B液(A液+10mM还原型谷胱甘肽)，层析柱先用A液平衡，然后从A通道将上述含有N-乙酰化胸腺素α1-谷胱甘肽转移酶融合蛋白的粗提液上样，再用A液洗去未结合的蛋白，最后用100％B洗脱，收集洗脱液30ml，为纯化的N-乙酰化胸腺素α1-谷胱甘肽转移酶融合蛋白。用G25 Φ2.5X50cm柱(介质购自美国GE公司，空柱购自华美实验仪器厂)层析更换缓冲体系，具体条件为，流动相：20mM乙酸-乙酸钠缓冲液，pH4.5。流速5ml/min。收集17-35min的组分为N-乙酰化胸腺素α1-谷胱甘肽转移酶融合蛋白。
用上述实施例1步骤2的方法制备活化的天冬酰胺内肽酶，在上述N-乙酰化胸腺素α1-谷胱甘肽转移酶融合蛋白组分中加入2ml活化的天冬酰胺内肽酶和40μl1mol/L DTT，37℃孵育切割融合蛋白12小时。切割产物用C18Φ2.0X20cm柱(购自大连化学物理研究所)进行纯化。A液为水+0.1％体积百分含量TFA，B液为50％体积百分含量乙腈+0.1％体积百分含量TFA的水溶液。先用A液平衡，然后以5ml/min的流速上样，上样完成后，再用A液平衡，然后从30％A液到60％进行线性梯度洗脱。收集40-45％B组份(25ml)为制备的N-乙酰化胸腺素α1(浓度为0.9mg/ml)。用实施例1相同的方法分析，在HPLC上的保留时间是15.4分钟，与化学合成的N-乙酰化胸腺素α1的保留时间一致。
实施例6、制备的N-乙酰化胸腺素α1的活性分析
采用T细胞-E玫瑰花试验(方法见国家食品药品监督管理局。WS1-XG-042-2000-2003，附录-T细胞活性测定法-脱E受体法。《国家药品标准》第十六册，2003版；夏天瑶等，T淋巴细胞-E玫瑰花试验检测胸腺肽生物学活性影响因素的探讨，药物生物技术，2007，14(3)：215-217。)，分析上述实施例1—5制备的N-乙酰化胸腺素α1的生物学活性，参考品为化学合成的N-乙酰化胸腺素α1(商品名Zadaxin，购自解放军302医院)。试验结果见表2。根据国家相关规定，E-花环形成率大于10％为活性合格，即有明显的活化T细胞的作用。
表2 N-乙酰化胸腺素α1的活性分析
 
制品 所用工程菌 制备方法 E-花环形成率
参考品N-乙酰化胸腺素α1 化学合成 24％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(pET-NproT) 实施例1 25％
N-乙酰化胸腺素α1(Ile13) BL21(DE3)(pET-NproT(I1e13) 实施例2 24％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(pET-NproT-C) 实施例3 23％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A) 实施例3 25％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A-C) 实施例3 24％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A) 实施例3 24％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C) 实施例3 27％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(PET-de153—C) 实施例4 25％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(PET-de153/G68) 实施例4 27％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(PET-G68) 实施例4 25％
N-乙酰化胸腺素α1 BL21(DE3)(PET-TaGST) 实施例5 25％
结果表明，上述实施例1—5制备的N-乙酰化胸腺素α1与参考品均具有活化T细胞的作用，且生物活性相似。
序列表
<160>21
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Figure G2008102265139D00151
<210>2
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Figure G2008102265139D00152
<210>3
<211>109
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>99
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Figure G2008102265139D00162
<210>5
<211>109
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
Figure G2008102265139D00171
<210>6
<211>99
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
Figure G2008102265139D00172
Figure G2008102265139D00181
<210>7
<211>68
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
Figure G2008102265139D00182
<210>8
<211>78
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
Figure G2008102265139D00183
<210>9
<211>47
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
Figure G2008102265139D00192
<210>10
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
Figure G2008102265139D00193
Figure G2008102265139D00201
<210>11
<211>303
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>11
Figure G2008102265139D00202
<210>12
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>12
<210>13
<211>303
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>13
Figure G2008102265139D00211
<210>14
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
Figure G2008102265139D00212
<210>15
<211>210
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
Figure G2008102265139D00213
Figure G2008102265139D00221
<210>16
<211>147
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>16
<210>17
<211>240
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
Figure G2008102265139D00223
<210>18
<211>303
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>18
Figure G2008102265139D00224
<210>19
<211>1251
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>19
Figure G2008102265139D00232
<210>20
<211>765
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>20
Figure G2008102265139D00241
<210>21
<211>253
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21
Figure G2008102265139D00242
Figure G2008102265139D00251

Claims (5)

1.一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法，包括以下步骤：
1)用基因工程大肠杆菌制备含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽；
2)内肽酶酶切上述步骤1)的含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽，纯化得到N-乙酰化胸腺素α1；
所述内肽酶为天冬酰胺内肽酶；
所述含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前体蛋白或多肽为N-乙酰化胸腺素α原或其变异体；
所述N-乙酰化胸腺素α原或其变异体的氨基酸序列是序列表中序列3-9中任一所述的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述内肽酶为人天冬酰胺内肽酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述人天冬酰胺内肽酶是利用基因工程方法制备得到的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因工程方法所用的宿主菌为酵母。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰化胸腺素α原或其变异体的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列10-18中任一所述的核苷酸序列。
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