CN111172213A

CN111172213A - 一种用双酶串联制备l-2-氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN111172213A
Application number: CN202010058267.1A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 刘中美; 刘宇锋; 周丽; 崔文璟; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-01-18
Filing date: 2020-01-18
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-01-18
Also published as: WO2021143356A1; CN111172213B; US20210403895A1

Abstract

本发明公开了一种用双酶串联制备L‑2‑氨基丁酸的方法，属于生物工程领域。本发明通过分别培养表达L‑谷氨酸变位酶和L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的重组大肠杆菌，获得L‑谷氨酸变位酶和L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶。将两种酶以一定质量比添加到反应体系中，以L‑谷氨酸为底物，进行酶反应制备L‑2‑氨基丁酸，当L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的用量为2mg/mL，反应24h，转化生成8.5mmol/L L‑2氨基丁酸，摩尔转化率为85.00％。此法与化学生产法相比，生产工艺安全，无环境污染。与以苏氨酸为底物的多酶合成体系相比，底物价格更便宜，工艺更简单。

Description

一种用双酶串联制备L-2-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及一种用双酶串联制备L-2-氨基丁酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非蛋白质氨基酸，是重要的药物中间体，被广泛用于医药、农药及食品领域，例如，可用来合成抗癫痫药物左乙拉西坦和抗结核药物乙胺丁醇、布瓦西坦等。目前L-2-氨基丁酸的合成方法主要包括化学合成法、生物合成法两种。L-2-氨基丁酸的化学不对称合成需用到剧毒化学试剂氰化物和溴素等作为合成原料，再使用化学手性拆分剂实现消旋型中间产物的拆分。反应过程存在剧毒化合物、环境污染严重、产品手性纯度低以及高温高压等反应条件苛刻等缺点。与化学合成法相比，生物催化法合成L-2-氨基丁酸具有无可比拟的优势。生物合成主要有两种，一种是酶拆分法，混旋型DL-2-氨基丁酸被相应的酶催化生成L-2-氨基丁酸，但是理论产量只有50％；另一种是酶合成法，底物是苏氨酸，苏氨酸在苏氨酸脱氢酶的作用下生成2-酮丁酸，2-酮丁酸在转氨酶或脱氢酶作用下被还原成L-2-氨基丁酸，该方法存在需要大量的氨基供体、辅因子再生系统和底物价格高的缺点，不适合工业生产。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种生物合成L-2-氨基丁酸的方法，是以L-谷氨酸为底物，以双酶串联体系催化L-谷氨酸生成L-2-氨基丁酸；所述双酶是L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶；所述双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度为10-30mmol/L；L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶按照4-6:1的质量比例添加到双酶串联体系中，其中，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为0.5-5mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度是10-20mmol/L，L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶按照4-6:1的质量比添加到双酶串联体系中。

在本发明的一种实施方式中，L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为2-3mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述的双酶串联体系中还含有0.5-1.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5-1mmol/L的磷酸吡哆醛、0.01-0.02mmol/L的腺苷钴胺素、1-1.5mmol/Lα-酮戊二酸以及18-22mM pH 6.5-7.5的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，催化反应的温度为35-39℃，反应10-30h。

在本发明的一种实施方式中，编码所述L-谷氨酸变位酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶包括K18A/V287I、K18A/V287L、K18S/V287I和K18S/V287L，其中，K18A/V287I的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；K18A/V287L的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；K18S/V287I的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；K18S/V287L的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-谷氨酸变位酶的制备方法，是将核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示的编码L-谷氨酸变位酶的基因连接到质粒pET-28a，获得重组质粒pET-28a-GlmES，将该重组质粒装入大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-GlmES，以重组大肠杆菌BL21/pET-28a-GlmES生产得到L-谷氨酸变位酶。

在本发明的一种实施方式中，所述生产是：向OD₆₀₀为0.6-0.8的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-GlmES的菌株培养物中，加入IPTG，28-32℃诱导培养15-30h得到菌体。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的制备方法，是将核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因连接到质粒pET-28a，获得重组质粒pET-28a-K18A/V287I或pET-28a-K18A/V287L或pET-28a-K18S/V287I或pET-28a-K18S/V287L，将该重组质粒转入大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-K18A/V287I或BL21/pET-28a-K18A/V287L或BL21/pET-28a-K18S/V287I或BL21/pET-28a-K18S/V287L，以该重组菌生产得到L-天冬氨酸-β-脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述生产是：向OD₆₀₀为0.6-0.8的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-K18A/V287I或BL21/pET-28a-K18A/V287L或BL21/pET-28a-K18S/V287I或BL21/pET-28a-K18S/V287L的菌株培养物中，加入IPTG，28-32℃诱导培养15-30h得到菌体。

在本发明的一种实施方式中，L-谷氨酸变位酶、L-天冬氨酸-β-脱羧酶的制备方法，还包括：收集培养得到的菌体，进行破碎，分离纯化目的酶蛋白，获得电泳纯的酶。

本发明的有益效果：本发明首次实现以L-谷氨酸为底物，通过双酶串联体系转化为L-2-氨基丁酸，当L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为2mg/mL，反应24h，转化生成8.5mmol/LL-2氨基丁酸，摩尔转化率为85.00％。本发明采用底物价格低廉，工艺简单，能降低L-2-氨基丁酸的生产成本。

附图说明

图1：L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸反应历程。

图2：双酶串联反应示意图。

具体实施方式

L-2-氨基丁酸含量的测定：反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：500μL样品中加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置1h，加入500μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置60min，吸取下层溶液，用0.45μm有机滤膜过滤。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L。

2YT培养基：蛋白胨16g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl 5g/L。

L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活的测定方法：反应体系为20mM pH 7.0的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液、0.2mg/mL L-天冬氨酸-β-脱羧酶、20mmol/L DL-3-甲基天冬氨酸、0.5mmol/L磷酸吡哆醛、1mmol/Lα酮戊二酸，反应体积为0.5mL，于37℃条件下反应30min后，置于100℃灭活10min。12000rpm离心2min，取上清衍生后检测L-2-氨基丁酸产量。酶活定义为每分钟产生1mM L-2-氨基丁酸所需的酶量为一个活力单位。

L-谷氨酸变位酶酶活的测定方法：反应体系为20mM pH 7.0的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液、0.1mg/mL L-谷氨酸变位酶、10mmol/L L-谷氨酸、0.01mmol/L的腺苷钴胺素、1mmol/L二硫苏糖醇、10mmol/L KCl、1mmol/L MgCl₂、0.2mg/mL 3-甲基天冬氨酸裂解酶、0.2mmol/LATP，反应体积为0.5mL，于37℃条件下反应3min后，置于100℃灭活10min。12000rpm离心2min，取上清在OD₂₄₀测量。酶活定义为每分钟产生1mM 3-甲基天冬氨酸所需的酶量为一个活力单位。

实施例1重组大肠杆菌BL21/pET-28-GlmES的构建

融合性L-谷氨酸变位酶是由来自Clostridium tetanomorphum的glmE亚基和来源于Clostridium cochlearium的mutS亚基通过(甘氨酸-谷氨酰胺)重复的十肽连接，核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，该基因由苏州金唯智公司合成并连接到pET-28a。将重组质粒pET-28a-glmES转化到大肠杆菌BL21菌株，获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-glmES。

实施例2表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶的重组大肠杆菌的构建

将核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体的基因连接到质粒pET-28a，获得重组质粒pET-28a-K18A/V287I或pET-28a-K18A/V287L或pET-28a-K18S/V287I或pET-28a-K18S/V287L，将该重组质粒转入大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-K18A/V287I或BL21/pET-28a-K18A/V287L或BL21/pET-28a-K18S/V287I或BL21/pET-28a-K18S/V287L。

实施例3L-谷氨酸变位酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-glmES接种于5mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基，37℃、200rpm振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量(V/V)接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的2YT培养基，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，30℃诱导培养20h左右得到菌体。6000rpm离心收菌后，超声破碎，采用His Trap HP亲合柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE检测目标蛋白。

实施例4L-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-K18A/V287I、BL21/pET-28a-K18A/V287L、BL21/pET-28a-K18S/V287I、BL21/pET-28a-K18S/V287L分别接种于5mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基，37℃、200rpm振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的2YT培养基，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，30℃诱导培养20h左右得到菌体。6000rpm离心收菌后，超声破碎，采用His Trap HP亲合柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE检测目标蛋白。

实施例5双酶串联制备L-2-氨基丁酸

双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度是10mmol/L，两种酶按照质量比L-谷氨酸变位酶：L-天冬氨酸-β-脱羧酶为4:1的比例添加到1mL反应体系中，其中L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为1mg/mL，L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活力为0.15U，谷氨酸变位酶活力为2.4U，反应体系中还含有1mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/L的磷酸吡哆醛、0.01mmol/L的腺苷钴胺素、1mmol/Lα-酮戊二酸以及20mM pH 7.0的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液。37℃，反应24h(反应示意图见图2)。每隔1-2h取样，HPLC检测反应液中的L-2氨基丁酸。结果如图1所示，转化生成5.6mmol/L L-2氨基丁酸，摩尔转化率为56.00％。当L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为2mg/mL，反应24h，转化生成8.5mmol/L L-2氨基丁酸，摩尔转化率为85.00％。

对比例1

双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度是10mmol/L，两种酶按照质量比L-谷氨酸变位酶：L-天冬氨酸-β-脱羧酶为1:1的比例添加到1mL反应体系中，其中L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为1mg/mL，L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活力为0.15U，谷氨酸变位酶活力为0.6U，反应体系中还含有1mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/L的磷酸吡哆醛、0.01mmol/L的腺苷钴胺素、1mmol/Lα-酮戊二酸以及20mM pH 7.0的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液。37℃，反应24h，转化生成2.8mmol/L L-2氨基丁酸，摩尔转化率为28.00％。

对比例2

双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度是10mmol/L，两种酶按照质量比L-谷氨酸变位酶：L-天冬氨酸-β-脱羧酶为2:1的比例添加到1mL反应体系中，其中L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为1mg/mL，L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活力为0.15U，谷氨酸变位酶活力为1.2U，反应体系中还含有1mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/L的磷酸吡哆醛、0.01mmol/L的腺苷钴胺素、1mmol/Lα-酮戊二酸以及20mM pH 7.0的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液。37℃，反应24h，转化生成4.5mmol/L L-2氨基丁酸，摩尔转化率为45.00％。

对比例3

双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度是10mmol/L，两种酶按照质量比L-谷氨酸变位酶：L-天冬氨酸-β-脱羧酶为1:2的比例添加到1mL反应体系中，其中L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为2mg/mL，L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活力为0.3U，谷氨酸变位酶活力为0.6U反应体系中还含有1mmol/L二硫苏糖醇，0.5mmol/L的磷酸吡哆醛，0.01mmol/L的腺苷钴胺素，1mmol/Lα-酮戊二酸以及20mM pH 7.0的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液。37℃，反应24h，转化生成4.6mmol/L L-2氨基丁酸，摩尔转化率为46.00％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种用双酶串联制备L-2-氨基丁酸的方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Asn Val Asp Tyr Ser Lys Tyr Ser Lys Leu Ser Pro Phe Glu

1 5 10 15

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35 40 45

Arg Arg Ala Phe Phe Gln Leu Gly Leu Phe Ser Ala Thr Glu Ser Glu

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Gln Leu Gly Leu Asp Pro Asp Met Phe Leu Leu Glu Met Val Glu Gly

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325 330 335

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225 230 235 240

Leu Glu Asp Pro Ser Ile Lys Ala Phe Phe Leu Val Asn Pro Ser Asn

245 250 255

Pro Pro Ser Val Lys Ile Ser Asp Glu Gly Leu Leu Ile Leu Ala Asp

260 265 270

Ile Val Arg Lys Arg Pro Asp Leu Ile Ile Leu Thr Asp Asp Ile Tyr

275 280 285

Gly Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Ser Leu Phe Ala Ile Cys Pro Asn

290 295 300

Asn Thr Ile Leu Val Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Phe Gly Ala Thr Gly

305 310 315 320

Trp Arg Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ile Asp Gln

325 330 335

Lys Ile Ala Ala Leu Ser Asp Gln Glu Lys Gln Glu Leu Glu Glu Arg

340 345 350

Tyr Ser Ser Leu Thr Thr Glu Pro Glu Lys Ile Lys Phe Ile Asp Arg

355 360 365

Leu Val Ala Asp Ser Arg Asn Val Ala Leu Asn His Thr Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Thr Pro Gln Gln Val Gln Met Val Leu Phe Ala Leu Phe Asn Met

385 390 395 400

Met Asp Ser Arg Gln Ala Tyr Lys Lys Ala Val Lys Ser Val Val Arg

405 410 415

Glu Arg Asp Ala Ala Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Val Glu Val Pro Glu

420 425 430

Asp Leu Asn Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Leu Val Asp Leu Glu Arg Thr

435 440 445

Ala Arg Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Phe Ala Asn Trp Val Met Val Asn

450 455 460

Lys Asn Pro Thr Glu Leu Leu Phe Arg Val Ala Asp Glu Thr Gly Val

465 470 475 480

Val Leu Leu Pro Gly Ser Gly Phe Gly Val Ser His Pro Ser Ala Arg

485 490 495

Ala Ser Leu Ala Asn Leu Asn Ala Tyr Gln Tyr Ala Ala Ile Gly Asp

500 505 510

Ser Leu Arg Arg Phe Ala Glu Asp Ala Tyr Gln Glu Tyr Leu Gly Thr

515 520 525

Lys Lys Asp Glu Ser

530

<210> 4

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Asn Val Asp Tyr Ser Lys Tyr Ser Lys Leu Ser Pro Phe Glu

1 5 10 15

Leu Ser Asp Ser Leu Ile Ala Leu Ala Gln Ser Lys Arg Asp Arg Leu

20 25 30

Met Leu Asn Ala Gly Arg Gly Asn Pro Asn Phe Leu Ala Thr Leu Pro

35 40 45

Arg Arg Ala Phe Phe Gln Leu Gly Leu Phe Ser Ala Thr Glu Ser Glu

50 55 60

Phe Ser Phe Ser Tyr Met Pro Glu Gly Leu Gly Gly Phe Pro Arg Pro

65 70 75 80

Val Gly Leu Gln Ser Arg Phe Asp Asn Phe Leu Met Gln Asn Arg Asp

85 90 95

Lys Pro Gly Val Leu Phe Leu Gly Lys Ala Val Ser Tyr Val Arg Asp

100 105 110

Gln Leu Gly Leu Asp Pro Asp Met Phe Leu Leu Glu Met Val Glu Gly

115 120 125

Ile Leu Gly Cys Asn Tyr Pro Val Pro Asp Arg Met Leu Arg Val Ser

130 135 140

Glu Thr Ile Ile Lys Glu Tyr Leu Leu Gln Glu Met Gly Val Lys Ser

145 150 155 160

Met Pro Lys Glu Gly Leu Asp Leu Phe Ala Val Glu Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Ala Met Ala Tyr Ile Phe Asn Ser Leu Lys Glu Asn Lys Ile Ile Asn

180 185 190

Thr Asp Asp Arg Ile Ala Ile Gly Arg Pro Ile Phe Thr Pro Tyr Leu

195 200 205

Glu Ile Pro Lys Leu Asn Asp Tyr Gln Leu Glu Glu Ile Phe Ile Glu

210 215 220

Ala Asp Pro Asn Leu Gly Trp Gln Tyr Pro Glu Ser Glu Leu Arg Lys

225 230 235 240

Leu Glu Asp Pro Ser Ile Lys Ala Phe Phe Leu Val Asn Pro Ser Asn

245 250 255

Pro Pro Ser Val Lys Ile Ser Asp Glu Gly Leu Leu Ile Leu Ala Asp

260 265 270

Ile Val Arg Lys Arg Pro Asp Leu Ile Ile Leu Thr Asp Asp Leu Tyr

275 280 285

Gly Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Ser Leu Phe Ala Ile Cys Pro Asn

290 295 300

Asn Thr Ile Leu Val Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Phe Gly Ala Thr Gly

305 310 315 320

Trp Arg Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ile Asp Gln

325 330 335

Lys Ile Ala Ala Leu Ser Asp Gln Glu Lys Gln Glu Leu Glu Glu Arg

340 345 350

Tyr Ser Ser Leu Thr Thr Glu Pro Glu Lys Ile Lys Phe Ile Asp Arg

355 360 365

Leu Val Ala Asp Ser Arg Asn Val Ala Leu Asn His Thr Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Thr Pro Gln Gln Val Gln Met Val Leu Phe Ala Leu Phe Asn Met

385 390 395 400

Met Asp Ser Arg Gln Ala Tyr Lys Lys Ala Val Lys Ser Val Val Arg

405 410 415

Glu Arg Asp Ala Ala Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Val Glu Val Pro Glu

420 425 430

Asp Leu Asn Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Leu Val Asp Leu Glu Arg Thr

435 440 445

Ala Arg Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Phe Ala Asn Trp Val Met Val Asn

450 455 460

Lys Asn Pro Thr Glu Leu Leu Phe Arg Val Ala Asp Glu Thr Gly Val

465 470 475 480

Val Leu Leu Pro Gly Ser Gly Phe Gly Val Ser His Pro Ser Ala Arg

485 490 495

Ala Ser Leu Ala Asn Leu Asn Ala Tyr Gln Tyr Ala Ala Ile Gly Asp

500 505 510

Ser Leu Arg Arg Phe Ala Glu Asp Ala Tyr Gln Glu Tyr Leu Gly Thr

515 520 525

Lys Lys Asp Glu Ser

530

<210> 5

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggaactta aaaataaaaa atggactgat gaagagtttc ataaacaaag agaagaggta 60

ctacaacaat ggccaactgg taaagaagta gatttacaag aggctgttga ttatttaaag 120

aaaataccag cagaaaagaa ttttgctgaa aaattagttt tagctaagaa aaaaggaata 180

actatggctc aaccaagagc tggagttgct ctattagatg aacatataga attattaaga 240

tatttacaag atgaaggtgg agcagacttt ttaccttcaa caattgatgc ttatacaaga 300

caaaatagat atgacgaatg tgaaaatggt ataaaagaaa gtgaaaaagc aggaagatca 360

ttattaaatg gtttcccagg agttaattat ggtgttaagg gatgtagaaa agttttagaa 420

gcagttaact taccactaca agcaagacac ggtacaccag actcaagatt attagcagaa 480

ataattcacg caggtggatg gacttcaaat gaaggaggag gtatctccta caatgttcca 540

tatgcaaaga atgttacaat agaaaaaagc ttattagatt ggcaatattg tgatagactt 600

gttggtttct atgaagaaca aggtgttcat ataaacagag aaccatttgg tccattgaca 660

ggaacacttg taccaccatc aatgtcaaat gcagttggaa ttacagaagc attacttgca 720

gcagaacaag gtgttaagaa cataacagtt ggatacggtg aatgtggaaa catgatccaa 780

gatatagctg cattaagatg tctagaagaa caaacaaatg aatatttaaa agcttatgga 840

tataatgatg tatttgtaac tacagtattc caccaatgga tgggaggatt cccacaagat 900

gaatcaaagg catttggtgt tatagttaca gctactacta tagcagcttt agcaggagct 960

acaaaagtta tagttaagac tcctcatgaa gcaattggta taccaacaaa agaagcaaat 1020

gctgcaggaa taaaagctac taagatggct ttaaatatgt tagaaggaca aagaatgcca 1080

atgtccaaag aattagaaac tgaaatggct gtaatcaagg ctgaaactaa atgtatcctt 1140

gacaaaatgt ttgaattagg aaagggagat ttagctatag gtacagttaa agcatttgaa 1200

acaggagtta tggatattcc atttggacca agtaaatata atgcaggtaa gatgatgcca 1260

gtaagggata atcttggatg cgttagatac ttagaatttg gaaatgttcc atttactgaa 1320

gaaataaaga attacaacag agaaagatta caagaaagag ccaaatttga aggtagagat 1380

gttagcttcc aaatggttat agatgacata tttgcagttg gaaaaggaag attaattgga 1440

agaccagaag gacaaggaca aggacaagga caaggacaag gagagaaaaa gactattgtt 1500

cttggagtta ttggttcaga ctgtcatgca gttggtaaca aaatattaga ccactcattt 1560

acaaatgcag gcttcaatgt tgttaacata ggagttttat catcacagga agattttata 1620

aatgcagcta tagaaactaa agcagacctt atatgtgttt cttcattata tggacaggga 1680

gaaattgact gtaaaggatt aagagaaaag tgtgatgaag caggacttaa aggaataaaa 1740

ttatttgttg gcggaaacat tgttgttggt aaacaaaact ggccagatgt tgaacagaga 1800

tttaaagcaa tgggatttga tagagtatat ccaccaggaa catctccaga aacaacaata 1860

gctgatatga aagaagtttt aggagtagaa taa 1893

<210> 6

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggggaatg tagattattc taaatattca aaacttagcc cattcgagtt agccgatagc 60

ctgattgctt tggcacagag taagcgggac cgcttaatgc tcaatgctgg acgaggaaac 120

cctaattttc tggctaccct gccacgtagg gctttttttc aattaggttt attttctgcc 180

acagaatcag aattttcatt ttcttacatg ccagaaggct taggtgggtt cccccgtcct 240

gtcggtttgc aatcacgttt tgataatttt ctcatgcaga accgggataa acctggagtt 300

ttatttctgg gaaaagcagt gtcttatgtg agagaccaat tgggtttaga tccagatatg 360

tttctgcttg aaatggtcga agggattcta ggatgtaact accctgtacc tgatcgcatg 420

ctccgtgtca gtgaaacaat tattaaagag tatctgttac aggaaatggg cgtaaaaagt 480

atgcccaagg aaggcttgga cctgtttgcg gttgaaggcg gaaccgcagc catggcttat 540

atatttaact ccttaaaaga aaacaagatt attaatactg acgaccgaat tgcaatcggc 600

agaccgattt ttacgccgta tctggaaatt cccaaactga atgactatca gcttgaagaa 660

atttttattg aagctgatcc caatctgggc tggcaatatc ctgagtctga attaagaaag 720

ttagaagacc cttcaatcaa ggcattcttt ttagtcaatc cgagcaaccc gccttctgtc 780

aaaataagtg atgaaggatt gctaatactg gcagatattg taagaaaacg tcctgacctg 840

attattttga cagatgatat ctatggaact tttgcagatg actttaagtc actttttgca 900

atttgcccaa ataatactat tttagtttat tcattctcaa agtactttgg ggctacaggc 960

tggagacttg gcattattgc gctgtcgaat aacaatatca ttgatcagaa gattgcagcg 1020

ctttcagatc aggaaaagca ggaacttgaa gaacgttatt catcattaac tactgaacca 1080

gaaaaaatca agtttattga ccgtttggta gcagatagcc gtaatgttgc actgaatcac 1140

accgcaggtc tgtcaacacc gcagcaggta cagatggttc tttttgccct gtttaatatg 1200

atggattctc gtcaggctta taaaaaagct gtcaagtctg tagtccggga acgcgatgct 1260

gcactttata gacagcttgg tgttgaagtc cctgaagatc ttaacgctgt tgactattac 1320

accttggtag atctggaaag aacagcccgc atattatatg gtgacgattt tgccaactgg 1380

gtcatggtca ataaaaaccc gacagaatta ttatttcggg tagcagatga aaccggtgtc 1440

gttctgttgc caggttctgg ctttggggta tcccatccat cggcacgtgc ttcattagcc 1500

aatctgaatg cttaccaata tgctgcaatc ggtgattctc tacgacgctt tgccgaagat 1560

gcctatcagg aatatctggg aactaaaaaa gatgagtcc 1599

<210> 7

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggggaatg tagattattc taaatattca aaacttagcc cattcgagtt agccgatagc 60

ctgattgctt tggcacagag taagcgggac cgcttaatgc tcaatgctgg acgaggaaac 120

cctaattttc tggctaccct gccacgtagg gctttttttc aattaggttt attttctgcc 180

acagaatcag aattttcatt ttcttacatg ccagaaggct taggtgggtt cccccgtcct 240

gtcggtttgc aatcacgttt tgataatttt ctcatgcaga accgggataa acctggagtt 300

ttatttctgg gaaaagcagt gtcttatgtg agagaccaat tgggtttaga tccagatatg 360

tttctgcttg aaatggtcga agggattcta ggatgtaact accctgtacc tgatcgcatg 420

ctccgtgtca gtgaaacaat tattaaagag tatctgttac aggaaatggg cgtaaaaagt 480

atgcccaagg aaggcttgga cctgtttgcg gttgaaggcg gaaccgcagc catggcttat 540

atatttaact ccttaaaaga aaacaagatt attaatactg acgaccgaat tgcaatcggc 600

agaccgattt ttacgccgta tctggaaatt cccaaactga atgactatca gcttgaagaa 660

atttttattg aagctgatcc caatctgggc tggcaatatc ctgagtctga attaagaaag 720

ttagaagacc cttcaatcaa ggcattcttt ttagtcaatc cgagcaaccc gccttctgtc 780

aaaataagtg atgaaggatt gctaatactg gcagatattg taagaaaacg tcctgacctg 840

attattttga cagatgatct ctatggaact tttgcagatg actttaagtc actttttgca 900

atttgcccaa ataatactat tttagtttat tcattctcaa agtactttgg ggctacaggc 960

tggagacttg gcattattgc gctgtcgaat aacaatatca ttgatcagaa gattgcagcg 1020

ctttcagatc aggaaaagca ggaacttgaa gaacgttatt catcattaac tactgaacca 1080

gaaaaaatca agtttattga ccgtttggta gcagatagcc gtaatgttgc actgaatcac 1140

accgcaggtc tgtcaacacc gcagcaggta cagatggttc tttttgccct gtttaatatg 1200

atggattctc gtcaggctta taaaaaagct gtcaagtctg tagtccggga acgcgatgct 1260

gcactttata gacagcttgg tgttgaagtc cctgaagatc ttaacgctgt tgactattac 1320

accttggtag atctggaaag aacagcccgc atattatatg gtgacgattt tgccaactgg 1380

gtcatggtca ataaaaaccc gacagaatta ttatttcggg tagcagatga aaccggtgtc 1440

gttctgttgc caggttctgg ctttggggta tcccatccat cggcacgtgc ttcattagcc 1500

aatctgaatg cttaccaata tgctgcaatc ggtgattctc tacgacgctt tgccgaagat 1560

gcctatcagg aatatctggg aactaaaaaa gatgagtcc 1599

<210> 8

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggggaatg tagattattc taaatattca aaacttagcc cattcgagtt atccgatagc 60

ctgattgctt tggcacagag taagcgggac cgcttaatgc tcaatgctgg acgaggaaac 120

cctaattttc tggctaccct gccacgtagg gctttttttc aattaggttt attttctgcc 180

acagaatcag aattttcatt ttcttacatg ccagaaggct taggtgggtt cccccgtcct 240

gtcggtttgc aatcacgttt tgataatttt ctcatgcaga accgggataa acctggagtt 300

ttatttctgg gaaaagcagt gtcttatgtg agagaccaat tgggtttaga tccagatatg 360

tttctgcttg aaatggtcga agggattcta ggatgtaact accctgtacc tgatcgcatg 420

ctccgtgtca gtgaaacaat tattaaagag tatctgttac aggaaatggg cgtaaaaagt 480

atgcccaagg aaggcttgga cctgtttgcg gttgaaggcg gaaccgcagc catggcttat 540

atatttaact ccttaaaaga aaacaagatt attaatactg acgaccgaat tgcaatcggc 600

agaccgattt ttacgccgta tctggaaatt cccaaactga atgactatca gcttgaagaa 660

atttttattg aagctgatcc caatctgggc tggcaatatc ctgagtctga attaagaaag 720

ttagaagacc cttcaatcaa ggcattcttt ttagtcaatc cgagcaaccc gccttctgtc 780

aaaataagtg atgaaggatt gctaatactg gcagatattg taagaaaacg tcctgacctg 840

attattttga cagatgatat ctatggaact tttgcagatg actttaagtc actttttgca 900

atttgcccaa ataatactat tttagtttat tcattctcaa agtactttgg ggctacaggc 960

tggagacttg gcattattgc gctgtcgaat aacaatatca ttgatcagaa gattgcagcg 1020

ctttcagatc aggaaaagca ggaacttgaa gaacgttatt catcattaac tactgaacca 1080

gaaaaaatca agtttattga ccgtttggta gcagatagcc gtaatgttgc actgaatcac 1140

accgcaggtc tgtcaacacc gcagcaggta cagatggttc tttttgccct gtttaatatg 1200

atggattctc gtcaggctta taaaaaagct gtcaagtctg tagtccggga acgcgatgct 1260

gcactttata gacagcttgg tgttgaagtc cctgaagatc ttaacgctgt tgactattac 1320

accttggtag atctggaaag aacagcccgc atattatatg gtgacgattt tgccaactgg 1380

gtcatggtca ataaaaaccc gacagaatta ttatttcggg tagcagatga aaccggtgtc 1440

gttctgttgc caggttctgg ctttggggta tcccatccat cggcacgtgc ttcattagcc 1500

aatctgaatg cttaccaata tgctgcaatc ggtgattctc tacgacgctt tgccgaagat 1560

gcctatcagg aatatctggg aactaaaaaa gatgagtcc 1599

<210> 9

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggggaatg tagattattc taaatattca aaacttagcc cattcgagtt atccgatagc 60

ctgattgctt tggcacagag taagcgggac cgcttaatgc tcaatgctgg acgaggaaac 120

cctaattttc tggctaccct gccacgtagg gctttttttc aattaggttt attttctgcc 180

acagaatcag aattttcatt ttcttacatg ccagaaggct taggtgggtt cccccgtcct 240

gtcggtttgc aatcacgttt tgataatttt ctcatgcaga accgggataa acctggagtt 300

ttatttctgg gaaaagcagt gtcttatgtg agagaccaat tgggtttaga tccagatatg 360

tttctgcttg aaatggtcga agggattcta ggatgtaact accctgtacc tgatcgcatg 420

ctccgtgtca gtgaaacaat tattaaagag tatctgttac aggaaatggg cgtaaaaagt 480

atgcccaagg aaggcttgga cctgtttgcg gttgaaggcg gaaccgcagc catggcttat 540

atatttaact ccttaaaaga aaacaagatt attaatactg acgaccgaat tgcaatcggc 600

agaccgattt ttacgccgta tctggaaatt cccaaactga atgactatca gcttgaagaa 660

atttttattg aagctgatcc caatctgggc tggcaatatc ctgagtctga attaagaaag 720

ttagaagacc cttcaatcaa ggcattcttt ttagtcaatc cgagcaaccc gccttctgtc 780

aaaataagtg atgaaggatt gctaatactg gcagatattg taagaaaacg tcctgacctg 840

attattttga cagatgatct ctatggaact tttgcagatg actttaagtc actttttgca 900

atttgcccaa ataatactat tttagtttat tcattctcaa agtactttgg ggctacaggc 960

tggagacttg gcattattgc gctgtcgaat aacaatatca ttgatcagaa gattgcagcg 1020

ctttcagatc aggaaaagca ggaacttgaa gaacgttatt catcattaac tactgaacca 1080

gaaaaaatca agtttattga ccgtttggta gcagatagcc gtaatgttgc actgaatcac 1140

accgcaggtc tgtcaacacc gcagcaggta cagatggttc tttttgccct gtttaatatg 1200

atggattctc gtcaggctta taaaaaagct gtcaagtctg tagtccggga acgcgatgct 1260

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accttggtag atctggaaag aacagcccgc atattatatg gtgacgattt tgccaactgg 1380

gtcatggtca ataaaaaccc gacagaatta ttatttcggg tagcagatga aaccggtgtc 1440

gttctgttgc caggttctgg ctttggggta tcccatccat cggcacgtgc ttcattagcc 1500

aatctgaatg cttaccaata tgctgcaatc ggtgattctc tacgacgctt tgccgaagat 1560

gcctatcagg aatatctggg aactaaaaaa gatgagtcc 1599

Claims

1.一种生物合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，以L-谷氨酸为底物，以双酶串联体系催化L-谷氨酸生成L-2-氨基丁酸；所述双酶是L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶；所述双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度为10-30mmol/L；L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶按照4-6:1的质量比添加到双酶串联体系中，其中，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为0.5-5mg/mL。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双酶串联体系中，底物L-谷氨酸的浓度是10-20mmol/L，L-谷氨酸变位酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶按照4-6:1的质量比添加到双酶串联体系中。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的用量为2-3mg/mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双酶串联体系中还含有0.5-1.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5-1mmol/L的磷酸吡哆醛、0.01-0.02mmol/L的腺苷钴胺素、1-1.5mmol/Lα-酮戊二酸以及18-22mM pH 6.5-7.5的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化反应的温度为35-39℃，反应10-30h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述L-谷氨酸变位酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-谷氨酸变位酶的制备方法是：将核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示的编码L-谷氨酸变位酶的基因连接到质粒pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-GlmES，将该重组质粒装入大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-GlmES，以重组大肠杆菌BL21/pET-28a-GlmES发酵生产得到L-谷氨酸变位酶。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶的制备方法是：将核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因连接到质粒pET-28a，获得重组质粒，将该重组质粒转入大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌，以重组大肠杆菌发酵生产得到L-天冬氨酸-β-脱羧酶。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，L-谷氨酸变位酶、L-天冬氨酸-β-脱羧酶的制备方法还包括：收集培养得到的菌体，进行破碎，分离纯化目的酶蛋白，获得电泳纯的酶。