CN103923936A - 一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产l-鸟氨酸 - Google Patents

一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产l-鸟氨酸 Download PDF

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刘立明
宋伟
王鸿江
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Abstract

本发明阐述了一种产精氨酸酶工程菌的构建方法及应用该菌转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段从嗜热菌Bacillus caldovelox(DSM411)中克隆获得精氨酸酶基因，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，通过卡那霉素抗性平板筛选获得表达载体高拷贝重组的含精氨酸酶工程菌pET28a-ARG。该酶在大肠杆菌内诱导表达后，仍表现出很高的活力。发酵得到的菌体无需破碎，即可直接用于转化，在60℃条件下，工程菌具有较高的透性，更有利于底物的吸收和产物的释放，反应速度得到极大的提高，转化周期仅需2-4h，鸟氨酸产量可达120.1g/L，转化率为98.9％。

Description

一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产L-鸟氨酸
技术领域
本发明涉及一种产精氨酸酶工程菌的构建方法及如何应用该菌生产L-鸟氨酸，属于生物工程领域。
背景技术
一、L-鸟氨酸的医疗价值及其生理功能
L-鸟氨酸是生物体内普遍存在的氨基酸之一，鸟氨酸是一种非蛋白氨基酸，是合成脯氨酸、精氨酸等蛋白质氨基酸的前体物质。在动物体内鸟氨酸主要参与尿素循环(见图1)。
L-鸟氨酸是细胞内重要代谢化合物，对体内集聚的氨具有解毒作用。L-鸟氨酸可刺激脑垂体分泌生长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢。此外，L-鸟氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促进细胞增殖，在提高免疫功能和抗癌功能上有一定作用；以鸟氨酸为原料制备的依氟鸟氨酸，能抑制多胺合成，延缓肿瘤细胞生长，是颇具前景的新型抗癌药物。L-鸟氨酸除了在医药上通常作为试剂与注射液，还被用于配制解毒、强身、保肝的营养剂和生产消除疲劳的发泡饮料。L-鸟氨酸因其多功能的医药保健作用而引起世人的关注，市场前景看好。
二、L-鸟氨酸的生产方法
L-鸟氨酸的生产方法主要有：化学合成法、发酵法以及酶法。国内外生产鸟氨酸主要还是以发酵法为主，鸟氨酸的发酵生产也以日本为主，生产厂家主要有味之素、田道制药和协和发酵3家。
(1)化学合成法是以丙烯醛、氰化氢、氨气等为原料，经过多步化合和分解作用得到鸟氨酸；但是生产过程中涉及到有毒试剂，且产物为DL型混合物，故化学法并未得到普及。
(2)发酵法是利用微生物发酵生产L-鸟氨酸，常用于鸟氨酸发酵的菌株主要有谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌和柠檬酸节杆菌等，鸟氨酸产量最高可达53g/L。发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但产量不高，同时由于发酵液中的成分复杂，后续分离较为困难，且平均发酵周期长达50h以上。
(3)酶法是利用精氨酸酶将底物L-精氨酸转化为L-鸟氨酸和尿素(见图2)。张鹏等利用粪肠球菌作为酶源生产L-鸟氨酸，在48h的转化周期内，鸟氨酸产量可达112g/L(CN1908177A)。
发明内容
本发明的目的是提供一种产精氨酸酶工程菌的构建方法及如何应用该菌转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸。
本发明的技术方案：
通过分子生物学手段从微生物中克隆获得精氨酸酶基因；构建含精氨酸酶基因的表达载体。将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，通过卡那霉素抗性平板筛选获得表达载体高拷贝重组的含精氨酸酶工程菌。通过表达和分泌获得的精氨酸酶转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸。
具体实施步骤：
1、一种产精氨酸酶基因工程菌的构建
(1)通过分子生物学手段用引物1：5′-CATGCCATGGCAATGAAGCCAATTTCAATTAT-3′和引物2：5′-CCCAAGCTTTTACATGAGTTTTTCACC-3′将来自于Bacillus caldovelox(DSM411)的精氨酸酶基因(GenBank登录号：U48226.1)进行PCR扩增：体系中加入LA taq酶，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.2min，30个循环，最后72℃延伸10min；
(2)用限制性内切酶Nco I和HindIII将目的基因和表达载体pET28a37℃酶切2h；
(3)用T4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pET20b和pET28a16℃连接10h；
(4)将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h；
(5)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，获得表达载体高拷贝的精氨酸酶基因工程菌。
2、通过表达和分泌获得精氨酸酶转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸
(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养12h；
(2)接一环斜面种子到LB培养基内，培养6h；
(3)将种子液接入LB发酵培养基内，培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，6h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次；
(4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为160g/L，转化温度为50-70℃，转化时间2-4h，摇床转速150rpm。
3、转化产物验证及L-鸟氨酸产量检测
取转化液10000rpm离心2min，收集上清液，并以L-鸟氨酸盐酸盐作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与2，4-二硝基氟苯衍生，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用液质联用法验证产物是否为L-鸟氨酸，用高效液相色谱法测定L-鸟氨酸的含量。
标准品和转化产物液质联用图谱见图3
高效液相色谱条件：
色谱柱：C18ODS HYPERSIL；
流动相：磷酸盐缓冲液(PH7.0)-乙腈-水(体积比为70：20：10)，用0.22μm滤膜过滤；
柱温：35℃；
检测波长：360nm；
进样量：10μl；
流速：1ml/min。
标准曲线在200-800mg/L之间呈现良好的线性关系(见图4)，回归方程：y＝0.5319x-103.5203，R2＝0.9990。鸟氨酸标样和转化液高效液相色谱图见图5。
本发明的优点：
1、本发明是国内外第一次使用来源于嗜热菌内的精氨酸酶转化L-将氨酸生产L-鸟氨酸，该酶在大肠杆菌内表达后，仍表现出很高的活力，可以满足工业化规模生产的需求。
2、发酵得到的菌体无需破碎，即可直接用于转化，在酶的最适温度60℃下，工程菌具有较高的透性，更有利于底物的吸收和产物的释放，反应速度得到极大的提高，在转化过程的前30min生产强度可达180g/L/h，仅需2-4h的转化周期即可达到转化终点。
3、目前转化法使用的精氨酸酶主要提取自高等动物的肝脏，手续复杂，成本昂贵。用微生物来源的精氨酸酶，代替动物来源的酶，降低了生产成本。
附图说明
图1尿素循环示意图
图2酶法转化L-精氨酸生产鸟氨酸示意图
图3标准品和转化产物液质联用图谱，A标准品，B转化产物
图4L-鸟氨酸标准品曲线
图5L-鸟氨酸标准品和转化产物高效液相色谱图，A标准品，B转化产物
具体实施方式
以下是含精氨酸酶基因表达框架工程菌的构建和应用该工程菌转化生产L-鸟氨酸的实施例。
实施例1
含精氨酸酶基因工程菌的构建
(1)通过分子生物学手段用引物1：5′-CATGCCATGGCAATGAAGCCAATTTCAATTAT-3′和引物2：5′-CCCAAGCTTTTACATGAGTTTTTCACC-3′将来自于Bacilluscaldovelox(DSM411)的精氨酸酶基因(GenBank登录号：U48226.1)进行PCR扩增：体系中加入LAtaq酶，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.2min，30个循环，最后72℃延伸10min；
(2)用限制性内切酶Nco I和HindIII将目的基因和表达载体pET28a37℃酶切2h；
(3)用T4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pET20b和pET28a16℃连接10h；
(4)将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h；
(5)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，获得表达载体高拷贝的精氨酸酶基因工程菌。
实施例2
通过表达和分泌获得精氨酸酶转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸
(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养12h；
(2)接一环斜面种子到LB培养基内，培养6h；
(3)将种子液接入LB发酵培养基内，培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，6h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次；
(4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为160g/L，转化温度为50-70℃，转化时间2-4h，摇床转速150rpm；
(5)取适量转化液进行检测分析
实施例3
取转化液10000rpm离心2min，收集上清液，并以L-鸟氨酸盐酸盐作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与2，4-二硝基氟苯衍生，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用液质联用法验证产物是否为L-鸟氨酸，用高效液相色谱法测定L-鸟氨酸的含量。
由液质联用法测得发酵产物与标准样品相对分子质量相同(见图3)，可证明转化产物即为L-鸟氨酸。
用高效液相色谱法测定转化液中L-鸟氨酸的含量，可知4h后，L-鸟氨酸的产量达到120.1g/L，转化率为98.9％。

Claims (4)

1.一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产L-鸟氨酸，其特征为：
通过分子生物学手段从微生物中克隆获得精氨酸酶基因，构建含精氨酸酶基因的表达载体，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，通过卡那霉素抗性平板筛选获得表达载体高拷贝重组的含精氨酸酶工程菌，并通过表达和分泌获得的精氨酸酶转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸。
2.根据权利要求1所述一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产L-鸟氨酸，其转化步骤为：
(1)将构建的基因工程菌接入斜面培养基培养；
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液；
(3)将种子液接入发酵培养基，培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，6h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次；
(4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为160g/L，转化温度为50-70℃，转化时间2-4h，摇床转速150rpm，鸟氨酸可达120.1g/L，转化率为98.9％；
(5)产物验证及鸟氨酸产量检测。
3.根据权利要求2所述，转化液缓冲体系为Tris-HCl(pH9.0，Mn2+浓度为10μmol/L)。
4.根据权利要求2所述，其转化过程前30min生产强度可达180g/L/h。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105062941A (zh) * 2015-08-25 2015-11-18 江南大学 一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
CN105087628A (zh) * 2015-08-25 2015-11-25 江南大学 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
CN105112437A (zh) * 2015-08-25 2015-12-02 江南大学 一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产l-鸟氨酸的方法
CN105713888A (zh) * 2016-02-22 2016-06-29 湖北大学 一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法
CN106434611A (zh) * 2016-10-14 2017-02-22 江南大学 一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法
CN108893438A (zh) * 2018-06-25 2018-11-27 江南大学 一种提高钝齿棒杆菌合成l-鸟氨酸产量的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVERETTE STONE,ET AL: "Strategies for optimizing the serum persistence of engineered human arginase I for cancer therapy", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *
JIN-JU YU，ET AL: "Expression, Purification, and Biochemical Properties of Arginase from Bacillus subtilis 168", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 *
MARIA C. BEWLEY,ET AL: "The cloning, expression and crystallisation of a thermostable arginase", 《FEBS》 *
张鹏等: "酶法生产鸟氨酸菌株的筛选与培养", 《北京化工大学学报(自然科学版)》 *
陈雪岚等: "产L-精氨酸基因工程菌的研究", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105062941A (zh) * 2015-08-25 2015-11-18 江南大学 一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
CN105087628A (zh) * 2015-08-25 2015-11-25 江南大学 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
CN105112437A (zh) * 2015-08-25 2015-12-02 江南大学 一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产l-鸟氨酸的方法
WO2017031838A1 (zh) * 2015-08-25 2017-03-02 江南大学 一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
CN105062941B (zh) * 2015-08-25 2019-03-05 江南大学 一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法
CN105713888A (zh) * 2016-02-22 2016-06-29 湖北大学 一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法
CN106434611A (zh) * 2016-10-14 2017-02-22 江南大学 一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法
CN108893438A (zh) * 2018-06-25 2018-11-27 江南大学 一种提高钝齿棒杆菌合成l-鸟氨酸产量的方法

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