CN102965311A - 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种枯草芽孢杆菌其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PG-8，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册的编号是CGMCC NO.6324，保藏日期是2012年7月10日。本发明还公开了上述枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。利用该菌株在仅含有L-谷氨酸的培养基中培养，在优化条件下能积累γ-D-聚谷氨酸30~60g/L。该菌株能利用多种碳源和氮源，培养条件粗放，操作方便简单，γ-D-聚谷氨酸产量高，生产成本低，能广泛应用于植物保水，食品添加等领域。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种高产γ-D-聚谷氨酸（γ-D-PGA）的微生物菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其应用。 

背景技术

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid,简称γ-PGA）是由多种杆菌（如炭疽芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等）产生的一种胞外聚合物。γ-PGA是谷氨酸单体以γ-羧基与氨基相缩合的一种均聚氨基酸，主链为nylon-4结构（1）。γ-PGA具有极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性，在注重环保、强调可持续发展的今天，γ-PGA及其衍生物有十分广阔的应用前景。可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域。 

至今发现的聚γ-PGA产生菌主要集中在芽孢杆菌属（Bacillus sp.），包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌（B.lichemiformis）和短小芽孢杆菌（B.pumilus）等。至今发现的在枯草芽孢杆菌中发酵生产的γ-PGA都为γ-D,L-PGA。而高聚物的单体构型往往会影响产品的性能和应用。L-异构体含量高的γ-PGA可以更好的应用在化妆品领域及降解材料；D-异构体含量高的γ-PGA则更适用于农业保水剂及食品添加剂等方面。在γ-PGA工业化生产方面，美国ADM公司、日本明治制果、味之素和台湾味丹企业等已对γ-PGA进行了商业化试生产。我国内地在该领域的研究相对起步较晚，与其它国家与机构相比还是存在一定的差距。关于γ-PGA工业化生产方面，尤其是在应用方面的研究都较少。 

目前未见高光学纯度天然γ-PGA的产业化生产。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株能够产高光学纯度的γ-D-PGA的枯草芽孢杆菌。 

本发明还要解决的技术问题，是提供上述枯草芽孢杆菌的应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

发明人实验室选育的微生物菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PG-8，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。登记入册的编号是CGMCC NO.6324，保藏日期是：2012年7月10日。以此菌作为生产菌株。 

CGMCC NO.6324菌株具有下述性质： 

1、菌落形态学特征： 

在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.7~1.0×1.5~2.7μm大小的杆菌，37℃培养2~3天形成芽孢，芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中32℃培养12h菌体可以大量生长。菌落呈白色，边缘有褶皱，不透明，不闪光。 

2、生理与生化特性： 

（1）培养温度：28~37℃，最适温度为32℃； 

（2）在pH 6.0~7.5范围内生长； 

（3）革兰氏染色：阳性； 

（4）甲基红实验：阴性； 

（5）硝酸盐还原：阳性； 

（6）吲哚生产：阴性； 

（7）H₂S生产：阴性； 

（8）耐NaCl浓度：7%浓度以上可以生长。 

3、16S rDNA序列分析： 

测得16S rDNA大部分序列1443bp，如SEQ ID No：1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与枯草芽孢杆菌达到99.9%同源。所以认定本发明使用的是枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PG-8。 

4、营养特征： 

枯草芽孢杆菌的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量为：碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~25g/L， 其余为水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的一种或多种；氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl和NH₄NO₃中的一种或多种；培养基中还包括钾盐、钠盐、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐等常用的无机盐类。 

上述枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。 

具体的方法是：将菌株CGMCC NO.6324接种于含有谷氨酸或谷氨酸盐、碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可得到γ-D-聚谷氨酸。 

其中，所述的发酵培养基包含如下组分：谷氨酸或谷氨酸盐1~90g/L，碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~25g/L，其余为水，pH 6.0~7.5。 

其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl和NH₄NO₃中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。其中，所述的合适生长的条件是：初始pH为6.0~7.5、培养温度为28~37℃、培养时间为24~72小时。 

其中，发酵结束后，除去菌体的发酵液可提取γ-D-PGA。 

其中，制备得到的γ-聚谷氨酸中，D-异构体含量为100%。 

具体地说： 

本发明提供的制备γ-D-PGA的方法，是将菌株CGMCC No.6324的接种到斜面1~2天后（斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基），在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养24~72小时，可以生成30~60g/Lγ-D-PGA，通常发酵条件还包括：培养基为：葡萄糖或糖蜜10~90g/L，L-谷氨酸10~90g/L，(NH₄)₂SO₄1~5g/L，K₂HPO₄1~20g/L。发酵温度28~37℃，较佳的为30~37℃；培养基的初始pH范围为6.0~7.5，较佳的为6.8~7.2；好氧培养。 

有益效果：本发明具有如下优势： 

（1）本发明筛选到一株γ-PGA生产菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产γ-D-PGA，操作方便简单，培养条件十分粗放。 

（2）该菌株可以合成高光学纯度的γ-D-PGA，即D-异构体含量100%。 

（3）可以使用纤维素水解糖液（替代葡萄糖或蔗糖）、豆饼粉（替代酵母膏或蛋白 胨）和味精废水（替代谷氨酸）作为γ-PGA发酵培养基的碳源、氮源和合成前体，使发酵原料成本大幅下降。 

附图说明

图1为水解液薄层层析，其中，1,4谷氨酸标样；2,3γ-PGA水解液。 

图2为L-/D-型谷氨酸混合单体标准品液相色谱图。 

图3为水解液液相色谱图。 

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 

实施例1：7.5L罐分批发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。 

种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，利用NaOH溶液调pH 6.8。 

发酵培养基：葡萄糖40g/L，味精40g/L，酵母膏5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，K₂HPO₄·3H₂O2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 6.8。 

将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养15h，将种子液按5%（v/v）的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：30℃，400r/min，通气量1.2L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或氨水控制发酵液pH值在6.5-7.5之间。发酵48h，γ-D-PGA浓度达到40.2g/L。 

取发酵液用浓盐酸调pH 2.8-3.5，9000rpm离心30min去除菌体，取上清加入2-5倍体积的乙醇，将沉淀用水复溶，透析去除小分子物质，滤液冷冻干燥得到γ-PGA粗品。用该粗品配制1g/L溶液，1.5mL溶液加入1.5mL浓盐酸，装入安瓿瓶中密封，110℃水解24-36h，取出后用6M NaOH调pH6.5-7.0，得到谷氨酸水解液。将水解液进行薄层层析分析，薄层：纤维素、硅胶GF254，铺板(自制)；展开剂：正丁醇:冰醋酸:吡啶:水=4:1:1:2(V/V)；显色剂：0.2%的茚三酮正丁醇溶液。结果如图1所示，水解液在硅胶板上只有一个斑点，且与谷氨酸标液一致，表明γ-PGA被完全水解成谷氨酸单体，无残留高聚物。 

采用蒸发光散射检测器测定γ-PGA水解液中总谷氨酸浓度，条件如下：流动相：2%乙腈，0.2%三氟乙酸，0.06%七氟丁酸；流速：0.5mL/min；蒸发室温度：117℃；氮气流速：3.2L/min。γ-PGA水解液中L-谷氨酸浓度采用SBA-40C型生物传感器检测，该仪器利用L-谷氨酸酶膜专一检测L-型谷氨酸单体。检测结果未在SBA中检测到L-型谷氨酸单体，故证实该产物为100%γ-D-PGA。 

实施例2：7.5L罐分阶段控制转速发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。 

种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，利用NaOH溶液调pH 7.0。 

发酵培养基：酸处理糖蜜20g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨2g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，味精废水80g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 7.0。 

将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、32℃、220r/min的摇床条件下培养16h，将种子液按5%（v/v）的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，通气量1.2L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。转速控制条件：0~12h，600r/min；12~48h，400r/min，在此条件下，γ-D-PGA浓度达到48.5g/L。 

γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。 

采用色谱柱Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)检测水解液中D-型、L-型谷氨酸单体。流动相A：0.05mol/L醋酸钠溶液，流动相B：甲醇:乙腈(V:V)=45:55；梯度洗脱程序：0-25min，4.5%-5.5%B，25-40min,5.5%-15.5%B；流速：1.0mL/min；柱温：20℃；荧光检测波长：λ_Ex=340nm，λ_Em=445nm；进样量：10μL。用L-型谷氨酸单体及D-型谷氨酸单体配制成混合标液进样，结果如图2所示，L-型及D-型单体可以很好地分开；再将水解液进样，结果如图3所示，表明水解液中不存在L-型单体。 

实施例3：7.5L罐补料分批发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。 

种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，利用NaOH溶液调pH 6.8。 

发酵培养基：糖蜜90g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，味精废水90g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 6.8。 

将枯草芽孢杆菌B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)在种子培养基、32℃、200r/min的摇床条件下培养16h，将种子液按4%（v/v）的种子量接种于预装有4.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：32℃，400r/min，通气量1.4L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在10g/L时，打开补料装置，将含糖浓度为500g/L的糖蜜补入发酵液中，控制发酵液中糖浓度保持在10~15g/L左右，进行补料发酵。发酵72h，γ-D-PGA浓度达到58.5g/L。 

γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。 

水解液中L-型、D-型单体检测同实施例1中所述。实施例4：1吨发酵罐发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。 

一级种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨2.5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，NaCl 1g/L，谷氨酸钠1g/L，pH7.0。 

二级种子培养基：糖蜜20g/L，葡萄糖2g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，pH7.0。 

发酵培养基：葡萄糖90g/L，蛋白胨3g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 10g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，谷氨酸40g/L，pH7.0。 

一级种子制备：将B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)接种于若干500mL三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量100mL，30℃，200r/min培养16小时。 

二级种子制备：按3%(v/v)接种量将一级种子接种在300L发酵罐中进行扩大培养。通风量为9m³/h，搅拌转速为120r/min，32℃下培养8小时。 

1吨发酵罐生产：按接种量为2%(v/v)将二级种子接种到1吨发酵罐中，通风量200m³/h，搅拌转速为100r/min，32℃下培养。发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在15g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中总糖浓度保持在10~15g/L，发酵72h，γ-D-PGA浓度达53.6g/L。 

γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。 

水解液中L-型、D-型单体检测同实施例2中所述。 

实施例5：10吨发酵罐发酵B.subtilis PG-8生产γ-D-PGA。 

一级种子培养基：糖蜜20g/L，葡萄糖5g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨2.5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，NaCl 1g/L，谷氨酸钠1g/L，pH6.8。 

二级种子培养基：糖蜜20g/L，葡萄糖5g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，pH6.8。 

发酵培养基：糖蜜60g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，K₂HPO₄·3H₂O10g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，味精废水30g/L，谷氨酸10g/L，pH6.8。 

一级种子制备：将B.subtilis PG-8(CGMCC NO:6324)接种于若干500mL三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量100mL，37℃，200r/min培养14小时。 

二级种子制备：按4%(v/v)接种量将一级种子接种在300L发酵罐中进行扩大培养。通风量为9m³/h，搅拌转速为120r/min，32℃下培养8小时。 

10吨发酵罐生产：按接种量为2%(v/v)将二级种子接种到10吨发酵罐中，通风量240m³/h，搅拌转速为60r/min，32℃下培养。发酵过程中开启pH自动控制装置，利用HCl或NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在15g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的糖蜜及葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中总糖浓度保持在10~15g/L，发酵72h，γ-D-PGA浓度达46.1g/L。 

γ-PGA粗品及水解液制备同实施例1中所述。 

水解液中L-型、D-型单体检测同实施例2中所述。 

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PG-8，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册的编号是CGMCC NO.6324，保藏日期是2012年7月10日。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将菌株CGMCC NO.6324接种于含有谷氨酸或谷氨酸盐、碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可得到γ-D-聚谷氨酸。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下组分：谷氨酸或谷氨酸盐1~90g/L、碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~25g/L，其余为水，pH 6.0~7.5。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl和NH₄NO₃中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的合适生长的条件是：初始pH为6.0~7.5、培养温度为28~37℃、培养时间为24~72小时。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的应用，其特征在于，制备得到的γ-聚谷氨酸中，D-异构体含量为100%。

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