JP2002320480A - 遺伝子治療用組換ｂ型肝炎ウイルスプラスミドベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、遺伝子治療用組換Ｂ型肝炎ウイル
スベクターに関するものであり、より詳しくは、肝細胞
にのみ特異的に感染して異種遺伝子を伝達及び発現する
ことができる遺伝子組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターに関
するものである。Ｂ型肝炎ウイルスは肝細胞にのみ選択
的に感染するため、本発明で提供する組換ウイルスは肝
細胞にのみ選択的に感染し治療用遺伝子を伝達する特性
があるため、in vivo治療が可能な利点がある。 【解決手段】 ＨＢＶゲノム複製に必須の新規２種類の
シス−エレメントである、配列番号１のアルファ−エレ
メント(nt．2818-3052)、及び配列番号２ベータ(β)−
エレメント(nt．1607-1804)配列を含むプロトタイプの
Ｂ型肝炎ウイルスプラスミドベクター、これを用いる組
換ＨＢＶ粒子を作ることができる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子治療用組換
Ｂ型肝炎ウイルスベクターに関し、より詳しくは、肝細
胞にのみを特異的に標的としin vivo又はex vivo遺伝子
治療に用いることができる組換Ｂ型肝炎ウイルスベクタ
ーに関するものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】一般
に遺伝子治療は、細胞内の遺伝子発現の異状による幾多
の疾患を根本的に治すことができるので、次世代治療法
として認識されている(Anderson，1992)。遺伝子治療法
は未だ商業化されていないが、ゲノムプロジェクトの完
成でその重要性がさらに浮き彫りにされ幾多のバイオテ
ク会社と大学病院で関心を持って研究開発が進められて
いる(Mulligan，1993)。現在遺伝子治療は大きくレトロ
ウイルス、又はアデノウイルス等のウイルスを利用した
ウイルスベクターや、リポソーム又はnaked ＤＮＡ等を
利用した非ウイルス性ベクターに分類することができる
(Friedmann，1999)。異種遺伝子を治療用目的に利用す
る場合に、重要な目標は、目的とする細胞に特異的に標
的とすることと治療効果の持続性である。しかし、細胞
特異性の欠乏と非効率的な遺伝子伝達は遺伝子治療の主
要な改善点として持ち上がってきた。それだけでなく、
症状が緩和するか完治するまで治療用の遺伝子産物の効
果が持続し得るようにすることも重要な問題であり、大
部分のベクターが細胞で消滅及び分解され持続性の不足
も問題となり、その効果をさらに低下させる問題点があ
った(Crystal，1995)。

【０００３】現在、主に用いられている遺伝子伝達シス
テムは遺伝子の効率的な伝達のため、ウイルスから由来
したベクター等を主に用いる。特に、レトロウイルス、
アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス(adeno-assoc
iated viruses；ＡＡＶ)等が主に用いられる(Friedman
n，1999)。これらは病原性がなく、ウイルス増殖による
危険を防ぐため複製能(replication defective)がない
ように考案されたウイルスベクターである。しかし、こ
れらウイルス由来のベクターは対象細胞に効率的に遺伝
子を伝達し発現するには理想的でない欠点がある。先
ず、レトロウイルスは対象細胞のゲノムに統合(integra
tion)され持続的に発現する利点があるが、低いタイタ
ー(titer)と、ただ分裂する細胞(dividing cells)のゲ
ノムにのみ統合する制限性によりin vivo治療には使用
が困難である。その反面、アデノウイルスは非常に高い
タイター(titer)と効率的な遺伝子伝達能力、そして、
分裂しない細胞(nondividing cells)にも遺伝子を伝達
する利点がある。しかし、発現が持続的でなく、宿主に
免疫反応を誘発する問題点がある。さらに、治療効果を
誘導するために必ず伴う反復的な投与は甚だしい免疫反
応を誘発する副作用がある(Yang et al.，1995)。

【０００４】このような問題点のため、レトロウイルス
とアデノウイルスベクターは臨床的に用いられるには幾
多の改善が必要である。さらに、現在臨床研究で最も多
く用いられるレトロウイルスとアデノウイルスベクター
は細胞特異性がないので治療対象組織だけでなく、その
他の組織にも感染するためin vivoの治療には副作用が
伴う問題がある。

【０００５】前記ウイルスベクターには組織特異性、肝
細胞特異性等がないため、肝疾患にはin vivoプロトコ
ールは副作用等に制限され主にex vivoプロトコールが
用いられる。ex vivoプロトコールによる肝標的治療は
外科的な摘出手術が必須なので、組換ウイルスベクター
を処理して作った修飾肝細胞(治療能力を有する肝細胞)
を患者の肝、脾臓に形質導入することがが不可避にな
る。しかし、このような摘出された肝細胞を実験室内で
培養するには幾多の困難と複雑さ、そして莫大の費用を
必要とすることになる。

【０００６】好ましくは、肝標的遺伝子治療ベクターは
肝細胞にのみ特異的に伝達されなければならない。ＨＢ
Ｖのように肝向性(hepatotropic)ウイルスから由来した
遺伝子治療ベクターは、血管内注射又は野生型ウイルス
が利用する肝細胞の受容体を利用して患者内に注入する
ことができる。ＨＢＶから由来した肝標的治療用ベクタ
ーの開発にはＨＢＶゲノム複製に必須のシス−エレメン
トに対する情報が先行しなければならず、シス−エレメ
ントに対する完全な解明がなければベクターへの利用は
非常に制限される。

【０００７】ＨＢＶはヘパドナウイルス科(hapadnaviri
dae)に属し、宿主特異性と組織特異性を有する小さいＤ
ＮＡウイルスである(Ganem，D.，1996)。ヘパドナウイ
ルスは人間(ＨＢＶ)、北米産マーモット(woodchuch；Ｗ
ＨＶ)、北米産斑りす(ＧＳＨＶ)のような哺乳動物と、
北京鴨(ＤＨＢＶ)、灰色のサギ(ＨＨＢＶ)のような鳥類
からも発見されている(Ganem，1996)。

【０００８】遺伝子治療用組換Ｂ型肝炎ウイルスベクタ
ーの開発において困難であった問題点は、ウイルスのゲ
ノム複製に必須のシス−エレメントに対する正確な情報
を知ることができなかった点である。よって、ＨＢＶゲ
ノム全体に亘るシス−エレメントに関する情報が、遺伝
子治療用の組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターの開発におい
て必ず先行しなければならない部分である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、前記の問題点
を解決し前記の必要性により考案されたものであり、本
発明の目的は遺伝子治療用の組換Ｂ型肝炎ウイルスベク
ターを提供することである。

【００１０】発明の構成前記の目的を達成するため、本
発明はＨＢＶゲノム複製に必須の新しい２種類のシス−
エレメントである配列番号１に記載されたアルファ−エ
レメント(nt．2818-3052)、及び配列番号２に記載され
たベータ(β)−エレメント(nt．1607-1804)配列を含む
プロトタイプ(prototype)のＢ型肝炎ウイルスプラスミ
ドベクターを提供する。

【００１１】本発明のベクターは、５'位置から３'位置
の方向にサイトメガロウイルスの初期プロモーター(imm
ediate early promoter)、ＤＲ１エレメント、エプシロ
ンエレメント(epsilon，nt．1849-1909)、アルファ−エ
レメント(nt．2818-3052)、ＤＲ２エレメント、ベータ
−エレメント(nt．1607-1804)、ＤＲ１エレメントを含
む配列番号３に記載されたプロトタイプのＢ型肝炎ウイ
ルスプラスミドベクターであるのが好ましい。

【００１２】配列番号３で、サイトメガロウイルスの初
期プロモーター(immediate early promoter)は塩基配列
7408から7999であり、ＤＲ１エレメントは７から１７、
エプシロンエレメント(epsilon，nt．1849-1909)は３０
から９０、アルファ−エレメント(nt．2818-3052)は998
から1233であり、ＤＲ２エレメントは2955から2965であ
り、ベータエレメント(nt．1607-1804)は2970から3167
であり、ＤＲ１エレメントは3189から3199であり、９１
から997までと1233から2954までにそれぞれ約0.9kbと約
1.7kbの外来遺伝子が挿入され得る部位が存在する。

【００１３】即ち、本発明のＢ型肝炎ウイルスプラスミ
ドベクターは、前記エプシロン(nt．1849-1909)と前記
アルファ−エレメント(nt．2818-3052)の間と、前記ア
ルファ−エレメント(nt．2818-3052)と前記ＤＲ２(nt．
1592-1602)の間に外来遺伝子の挿入部位が存在する(図
８参照)。

【００１４】尚、本発明のＢ型肝炎ウイルスプラスミド
ベクターにおいて、前記ベクターはＨＢＶ遺伝子中内部
ウイルスプロモーターを用い、内部ウイルスプロモータ
ーの中でコアプロモーターとプリＳ２／Ｓプロモーター
をそれぞれ選択して用いるのが好ましい。

【００１５】さらに、本発明のＢ型肝炎ウイルスプラス
ミドベクターは野生型3.2Ｋ bp ＨＢＶゲノムの大きさ
を増加させず、エプシロンエレメントとアルファエレメ
ントの間に0.90Ｋ bpまでの塩基配列を挿入することが
でき、アルファエレメントとＤＲ２エレメントの間に1.
7Ｋ bpまで挿入できるベクターである。

【００１６】さらに、本発明のベクターにおいて、前記
ベクターは複製に必須のコアタンパク質、またはポリメ
ラーゼ遺伝子が欠けた複製不能(replication-defectiv
e)のベクターである。

【００１７】本発明のベクターは、少なくとも一つの異
種遺伝子(heterologous gene)を発現することができる
異種塩基配列を含むベクターである。

【００１８】尚、本発明はＢ型肝炎ウイルスのキャプシ
ド化に必須の“エプシロン”エレメントが欠け複製する
ことができないが、Ｂ型肝炎ウイルスのタンパク質を現
わして組換ＨＢＶベクターにウイルス遺伝子複製に必要
なタンパク質(trans-actingfactors)を発現するヘルパ
ープラスミド(helper plasmid)を提供する。

【００１９】さらに、本発明は前記の組換ＨＢＶベクタ
ーと前記のヘルパープラスミドを肝細胞株に共にトラン
スフェクションし、組換ＨＢＶ粒子を作ることができる
方法を提供する。

【００２０】前記の組換ＨＢＶベクターはウイルス遺伝
子複製に必須のシス−エレメントを含み、少なくとも一
つの遺伝子治療用異種遺伝子を発現することができ、さ
らに、ウイルス遺伝子複製に必要なウイルス遺伝子中少
なくとも一種類を発現することができず、前記のヘルパ
ープラスミド(またはパッケージングプラスミド)は、ウ
イルス遺伝子複製に必要なタンパク質(trans-acting fa
ctors)中少なくとも一種類を発現することのできない組
換ＨＢＶベクターにこの欠乏したタンパク質を提供し、
組換ＨＢＶベクターを補って(complementation)感染性
のあるウイルスを生産できなければならず、前記肝細胞
株は複製に必要なタンパク質(trans-acting factors)が
提供されると組換ＨＢＶベクターが複製できる肝細胞株
である。

【００２１】本発明で肝細胞は人間の肝細胞、鳥類の肝
細胞、げっ歯類の肝細胞の集団から選択された肝細胞で
あるのが好ましい。

【００２２】さらに、本発明は前記の組換ＨＢＶ粒子を
血管内又は肝組織内投与方法で標的細胞に感染させる方
法を提供する。

【００２３】標的細胞に感染させる方法において、前述
した挿入できる外部遺伝子は多様な遺伝子に対するアン
チセンス遺伝子とリボザイムを含み、特にＢ型肝炎ウイ
ルスとＣ型肝炎ウイルスのアンチセンス遺伝子とリボザ
イムを作る遺伝子を含む。さらに、多様な癌抑制遺伝
子、成長因子、ホルモン、サイトカイン、細胞膜受容
体、血液凝固因子をコードする異種遺伝子を含む。

【００２４】尚、組換ＨＢＶ粒子を標的細胞に感染させ
る方法で次を含む。ＨＢＶに慢性感染した患者の肝組織
内に、直接組換ＨＢＶベクターＤＮＡの投与方法を含
み、前記で言及した挿入できる外部遺伝子は、多様な遺
伝子に対するアンチセンス遺伝子とリボザイムを含み、
特に、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスのアンチセ
ンス遺伝子及びリボザイムを作る遺伝子を含む。さら
に、多様な癌抑制遺伝子、成長因子、ホルモン、サイト
カイン、細胞膜受容体、血液凝固因子をコードする異種
遺伝子を含む。

【００２５】本発明の理解を助けるため、次の用語を下
記のように定義する。“エレメント”はＤＮＡ、または
ＲＮＡの塩基配列で特定の機能を有する塩基配列を言
う。“シス−エレメント(cis-acting element)”は同一
ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子内で調節機能を有して作用す
る塩基配列を言う。“キャプシド化(encapsidation)”
は“パッケージング(packaging)”と同じ意味で用いら
れており、コア粒子内にウイルス遺伝子(ＤＮＡまたは
ＲＮＡ)が入る過程を言う。“異種遺伝子(heterologous
sequence or gene)”はＨＢＶ遺伝子でない遺伝子を言
い、“外部遺伝子(foreign gene)”と同じ意味で用いら
れた。“ベクター”はＤＮＡ切片を含んで他の細胞に運
搬する機能のある核酸塩基配列を言い、プロトタイプの
ベクターは異種遺伝子を挿入でき一般に用いることがで
きるベクターを言う。

【００２６】本発明でＨＢＶの塩基配列は２種類に示さ
れている。先ず、明細書の本文では特に指摘しない場合
は全てGalibertの方法に従いＨＢＶ塩基配列を示した(G
alibert et al.，1979)。この場合nt．----で示した。
一方、添付の塩基配列表はプリゲノミックＲＮＡの開始
部位であるnt．1820を１にし、それぞれプラスミドの塩
基配列を示した。

【００２７】

【発明の実施態様】以下、本発明を詳しく説明する。 Ｉ．Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ) Ｂ型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus，ＨＢＶ)はヘパ
ドナウイルスに属し、急性肝炎だけでなく慢性肝炎を起
す臨床的に非常に重要なウイルスである。マーモット肝
炎ウイルス(ＷＨＶ)、斑りす肝炎ウイルス(ＧＳＨＶ)、
北京鴨肝炎ウイルス(ＤＨＢＶ)等がヘパドナウイルス科
に属する(Genem，1996)。ＨＢＶはＤＮＡウイルスであ
るがプリゲノミックＲＮＡを鋳型にし、ＨＢＶ ＤＮＡ
重合酵素が有する逆転写活性(reverse transcriptase a
ctivity)を介してＤＮＡ遺伝子に複製する非常に特異な
ゲノム複製を有するウイルスである。ＨＢＶは約3.2 k
bpのプラス−ＤＮＡ鎖に間隙が存在する円形のＤＮＡ遺
伝子を有しており、コア(Ｃ)、ポリメラーゼ(Ｐ)、表面
抗原(Ｓ)、そしてＸタンパク質の四つのウイルスタンパ
ク質を有する。

【００２８】II．ヘパドナウイルス(hepadnavirus)の感
染周期 ヘパドナウイルスの感染周期は図２に示されている(Gen
em，1996)。ヘパドナウイルスは受容体(receptor-media
ted endocytosis)を介して肝細胞に侵入することが知ら
れている。肝細胞に入った後、隙間(gap)が存在するＨ
ＢＶゲノムは、転写の鋳型になる共有結合性閉環状ＤＮ
Ａ(covalently closed circular ＤＮＡ：ＣＣＣ ＤＮ
Ａ)に切り替えられる。四つのウイルスの転写体が合成
されたあと細胞質に移動する。3.5Kbpのプリゲノミック
ＲＮＡはコアとポリメラーゼのｍＲＮＡとして作用する
だけでなく、ウイルス遺伝子複製の鋳型としても作用す
る。

【００２９】III．逆転写(reverse transcriptase)過程 ＨＢＶはレトロウイルスとは別の逆転写過程を有する(N
assal et al.，1996)。ＨＢＶはウイルス複製のため、
コアタンパク質とプリゲノミックＲＮＡを認識するポリ
メラーゼが同時にコア粒子にキャプシド化した後、この
コア粒子内でポリメラーゼによる遺伝子複製が発生す
る。ポリメラーゼタンパク質とプリゲノミックＲＮＡの
結合が遺伝子複製に必須のコア粒子形成に重要である。
プリゲノミックＲＮＡの５'位置の末端部位に存在する
“エプシロン”と言われる約８５塩基対の特異な２次構
造の塩基配列が、キャプシド化段階でシス−エレメント
に作用する(Junker-Niepmann et al.，1990；Hirsch et
al.，1991)。このエプシロンはステム−ループ構造(st
em-loop structure)を成し、ヘパドナウイルスに属する
全てのウイルスに非常に高く保存されている。

【００３０】ＨＢＶポリメラーゼの逆転写過程はＨＢＶ
の独特なゲノム構造ほど非常に複雑である(図３；Nassa
l et al.，1996)。野生型の完全な二重−鎖ＤＮＡゲノ
ムを形成するためには下記のような鋳型スイッチング過
程(template switching)が必要である(図３)。第一、コ
ア粒子内にキャプシド化したプリゲノミックＲＮＡを鋳
型にし、ＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼが逆転写過程でマ
イナス−鎖ＤＮＡを合成する。このマイナス−鎖ＤＮＡ
合成のプライマーと、ポリメラーゼに同時にＨＢＶのＤ
ＮＡポリメラーゼが利用される(Wang et al.，1992)。
即ち、タンパク質−プライミング(protein-priming)に
よりマイナス−鎖ＤＮＡ合成が開始される。

【００３１】このプライミング過程で５'に存在するエ
プシロン(ε)がＨＢＶマイナス−鎖ＤＮＡ合成の開始部
位に作用する(Wang et al.，1996；Pollack et al.，19
94)。次いで、このマイナス−鎖ＤＮＡはエプシロンと
ＤＲ１(direct repeat)の間の４塩基対の相同性を利用
して５'から３'ＤＲ１に移動する(Nassal et al.，199
6)。この過程をマイナス−鎖移動(minus-strand transl
ocation)と言う。マイナス−鎖ＤＮＡが合成されると、
ＨＢＶポリメラーゼが有するRnase Ｈ活性によりプリゲ
ノミックＲＮＡは５'−末端側の１８ヌクレオチドＲＮ
Ａのみを除いて分解される(Loeb et al.，1991)。

【００３２】次に、５'−末端キャップＲＮＡが３'ＤＲ
２に伝達された後、ＲＮＡプライマーに作用してプラス
−鎖ＤＮＡを合成する。次いで、ＤＲ２部位に鋳型スイ
ッチングを行なってプラス−鎖ＤＮＡ合成を始め、プラ
ス−鎖ＤＮＡはＤＲ２に転位(translocation)される円
形化段階を経て円形のゲノムを合成する(Loeb et al.，
1997)。このプラス−鎖ＤＮＡの合成が完了する前に、
ＨＢＶ ＤＮＡはウイルス表面抗原粒子に取り囲まれ細
胞の外に出る。結局、ＨＢＶは円形の隙間が存在する二
重鎖ゲノムを有することになる。

【００３３】IV．ＨＢＶゲノム複製に必須のシス−エレ
メント 前記で記述されているように、ＨＢＶは３回の鋳型スイ
ッチングを介して線形のプリゲノミックＲＮＡを円形の
二重鎖ＤＮＡに複製する。過去２０年間、分子生物学的
な技法でウイルスＤＮＡ複製に重要な役割を果たすエレ
メントが明らかにされた(Nassal et al.，1996)。文献
に報告されたシス−エレメントを並べてみれば、キャプ
シド化信号に利用される５'位置エプシロンエレメント
が知られており(Junker-Niepmann et al.，1990；Hirsc
h et al.，1991)、ウイルス複製段階中にプライマー移
動(translocation)過程で利用されるＤＲ１とＤＲ２(Na
ssal et al.，1996；Condreay et al.，1992)、円形化
(circularization)段階で利用されるｒ(repeat)が作用
する(Loeb et al.，1997)。そして、転写後RNAプロセッ
シングエレメント(posttranscriptional RNA processin
g element：ＰＲＥ)等がある(Huang et al.，1995；Yen
et al.，1998)。このようなシス−エレメントは大部分
ＨＢＶプリゲノムの両側に存在する(図１と図８)。

【００３４】一方、ヘパドナウイルス中のＤＨＢＶ(Duc
k hepatitis B virus)の場合、３Ｅ、Ｍ、５Ｅと名付け
られた三つのエレメントが遺伝子複製に必要であること
が報告されており、プラス−鎖ＤＮＡの合成時に鋳型ス
イッチングに必要である(Havert et al.，1997)。ＤＨ
ＢＶとは別に、ＨＢＶは未だ複製に必要なシス−エレメ
ントが解明されていない。このような理由で、ＨＢＶゲ
ノムは遺伝子治療用ベクターに利用されていない。遺伝
子治療ベクターは、複製に必要なシス−エレメントを必
ず含んでいなければならない。本発明ではＨＢＶ遺伝子
複製に必要なシス−エレメントを解明した後、この情報
に基づく組換ＨＢＶベクターを設計した。

【００３５】Ｖ．プロトタイプのＨＢＶベクターの設計 ＨＢＶゲノム複製に必要な全てのシス−エレメントを解
明し複製に必須のウイルスタンパク質(trans-acting fa
ctors)が提供されれば、複製能(replication competen
t)の存在する異種遺伝子を有する遺伝子治療用ベクター
に開発することができる。簡単に言えば、ＨＢＶベクタ
ーはウイルスタンパク質を発現しないにも拘らず、ウイ
ルスゲノム複製に必要な全てのシス−エレメントをコー
ドしている。それにも拘らず、ヘルパープラスミドやパ
ッケージング細胞株を介してウイルスタンパク質(例え
ば、コアタンパク質、ポリメラーゼタンパク質、表面タ
ンパク質)が提供されれば、組換ＨＢＶベクターは複製
され得る(図４)。異種遺伝子の挿入部位の選定、挿入さ
れた異種遺伝子の大きさ、異種遺伝子の発現のために利
用されるプロモーター等が遺伝子治療用ベクター開発の
成功のポイントになり得る。

【００３６】先ず、本発明では２つのシス−エレメント
を解明した。１つはアルファエレメントで、他の１つは
ベータエレメントである(図８)。本発明の方法を具体化
するため、本発明では２つの挿入可能部位を選定した
(図８)。一つは５'エプシロンとアルファエレメントの
間で、もう一つはアルファエレメントとＤＲ２エレメン
トの間である。この二つの挿入部位はウイルス複製にお
いて欠損可能部位(dispensable region)である。しか
し、挿入部位の選定を現在のものに限定はせず、プロト
タイプＨＢＶベクターの５'エプシロンとアルファ−エ
レメントの間に異種遺伝子の挿入も可能である(図８)。
挿入できる異種遺伝子の大きさは野生型のゲノム大きさ
を固定させるようにしたとき、それぞれ0.90K bpと1.7K
bpまで可能である(図８)。

【００３７】最近、野生型より約0.2K bp程度大きい大
きさのプリゲノミックＲＮＡまで、マイナス−鎖ＤＮＡ
合成が可能であることが報告された(Ho et al.，200
0)。従って、本発明では前記の２個所の挿入位置に、そ
れぞれ1.1K bp、1.9K bpまでの大きさの切片を挿入して
も複製する可能性はなくならない。幸いに、挿入部位よ
り上側に存在する２つの内在するウイルスプロモーター
(即ち、コアプロモーターとプリ−Ｓ２／Ｓプロモータ
ー)を利用して異種遺伝子が転写されるよう設計した。
さらに進んで、本発明の組換ＨＢＶベクターはバイシス
トロニック(bicistronic)発現ベクターに考案されてい
るため、２つの挿入部位に挿入された異種遺伝子が同時
に発現可能である。

【００３８】ヘパドナウイルスの肝向性(liver tropis
m)は、肝疾患の遺伝子治療においてＨＢＶを利用しよう
とする最も重要な特性である。本発明で提供する肝標的
ＨＢＶベクターは肝炎、肝硬変、肝癌等の肝疾患だけで
なく、家族性高コレステロール血症、血液凝固因子VII
I、IVが欠けて発生する血友病等の肝細胞に遺伝子発現
が欠けて発生する代謝性遺伝病治療にも活用することが
できる。さらに、肝標的ＨＢＶベクターは慢性肝炎患者
の治療にも非常に有用である。Ｂ型肝炎ウイルスに既に
感染した慢性感染者はウイルスの複製に必要なコアタン
パク質とポリメラーゼが肝細胞内に常に現われている。
従って、本発明で提供するＨＢＶベクターに治療用遺伝
子が挿入された組換ＤＮＡを、慢性感染者の肝細胞に直
接又は血液循環を介して注入すれば、組換ウイルスがＨ
ＢＶ慢性感染者の肝細胞では複製が持続的に可能であ
る。これは慢性感染治療に非常に効率的である。

【００３９】本発明では、ＨＢＶの複製に必須のＢ型肝
炎ウイルスゲノムのシス−エレメント(α−element、β
−element)に対する情報を提供しており、アルファエレ
メント、ベータエレメントのヌクレオチド配列を提供し
ている。

【００４０】本発明では組換ＨＢＶゲノムを利用してい
るが、本発明がＨＢＶに限定されるのではない。ヘパド
ナウイルスに属するマーモット肝炎ウイルス(ＷＨＶ)、
斑リス肝炎ウイルス(ＧＳＨＶ)、北京鴨肝炎ウイルス
(ＤＨＢＶ)等も互いのゲノムも類似するので、本発明が
他のヘパドナウイルスの遺伝子治療用ベクター開発にも
利用することができる。

【００４１】本発明を具体化するため、ウイルス遺伝子
複製に必須のシス−エレメントを完全に解明した後、こ
れらシス−エレメントを保存したプロトタイプのＨＢＶ
ベクターを設計した。しかし、本発明で提示する２つの
新しいシス−エレメント(アルファエレメント、ベータ
エレメント)の位置を限定する必要はない。最大のパッ
ケージングサイズ(maximal packaging size)以内では、
野生型プリゲノミックＲＮＡの大きさである3.5kbより
大きいサイズのプリゲノミックＲＮＡ挿入も可能であ
り、新しいシス−エレメントはベクターの機能に影響を
及ぼさない範囲内で、ベクター内のシス−エレメントの
相対的な位置変更も可能である。

【００４２】本発明で提供する組換ＨＢＶゲノムのキャ
プシド化(encapsidation)のため、次のような過程が先
行しなければならない。第一、組換ＨＢＶベクターは少
なくとも一つ以上の異種遺伝子を発現する。第二、ヘル
パープラスミドはウイルスのキャプシド化とゲノム複製
に必須のコアタンパク質、ポリメラーゼ、及び表面抗原
をトランス(in trans)で提供する。即ち、ヘルパープラ
スミドと組換ＨＢＶベクターは肝細胞内で互いに相互補
完現象(complementation)でキャプシド化され、ウイル
ス粒子を形成することができる。本発明が利用できる肝
細胞群株は次のようなHepG２細胞、Huh７細胞、Chang肝
細胞等の人間肝細胞株とげっ歯類肝細胞株を含む一連の
肝細胞株がある。

【００４３】ＨＢＶの遺伝子に異種遺伝子を挿入または
置換し、組換ＨＢＶの可能性を探索した研究が幾つかの
文献に報告されている(Chiang et al.，1992；Chaisomc
hitet al.，1997；Protzer et al.，1999)。本発明は米
国特許第5,981,274号とは幾つかの点で区別される(Tyrr
ell et al.，US Patent 5,981,274，1999；Chaisomchit
et al.，1997)。前記特許は異種遺伝子をＨＢＶポリメ
ラーゼのスペーサ(spacer or tether)ドメインに挿入さ
せた。

【００４４】何よりも、米国特許第5,981,274号で用い
た外部遺伝子挿入部位は本発明で解明したアルファ−エ
レメント部位に該当する。即ち、このアルファ部位はＨ
ＢＶ遺伝子複製に必須なので、この部位に外部遺伝子の
挿入は複製を阻害する。遺伝子を発現するためには小さ
なサイズ(270または374bp)の切片を挿入しており、挿入
後ベクターの複製が約５０倍減少したのでベクターとい
うのは困難である。このような理由で、前記の米国特許
第5,981,274号は遺伝子治療用ベクターでに分類され得
ない。

【００４５】一方、台湾のDr．Changの研究室で約0.7Kb
の発光遺伝子(luciferase)をＨＢＶ遺伝子の２箇所に置
換し、組換ＨＢＶ粒子を生産することが報告されている
(Chiang et al.，1992)。さらに、最近ＤＨＢＶとＨＢ
Ｖを組換ベクターに用いた最初の成功事例が報告された
(Protzer et al.，1999)。この報告ではウイルス遺伝子
複製に必須のシス−エレメントに対する情報なしに緑色
蛍光タンパク質(ＧＦＰ)またはインターフェロン遺伝子
を、ＨＢＶまたはＤＨＢＶ遺伝子の何箇所に挿入した結
果、そのうち表面抗原ＯＲＦ(i．e.，Ｓ ＯＲＦ)に異種
遺伝子を置換したときウイルスが生産されることを観察
した。

【００４６】本発明で提供するＨＢＶベクターは前記報
告と幾つかの面で区別される利点を有する。先ず、本発
明はシス−エレメントを完全に解明して設計したプロト
タイプのＨＢＶベクターを提供する。即ち、表面抗原Ｏ
ＲＦを含む２箇所の挿入部位を提供するだけでなく、挿
入する遺伝子の最大の大きさの限界をそれぞれ0.79kbま
たは1.7kbであることを具体的に提供する。即ち、一般
に異種遺伝子を挿入して用いることができる本格的な意
味の組換遺伝子ベクターである。

【００４７】本発明で提供するＨＢＶベクターを構築す
るために用いられたトランスフェクション技術は、文献
とこの分野の専門家等が多く用いる実験材料と実験方法
を利用した。

【００４８】本発明で提供するＨＢＶベクターを作るた
めに用いる接合(ligation)技術と制限(restriction)技
術は、文献(Sambrook et al.，in Molecular Cloning：
A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator
y，3rd Ed.，N．Y．2001)に記述されている方法を用い
た。

【００４９】本発明では次のような略語を用いた：ＤＲ
１(direct repeat 1)、ＤＲ２(direct repeat 2)、ε(e
psilon)、ＧＦＰ(green flourescence protein)、Ｍ(mo
lar)、ｍＭ(millomolar)、ｍｌ(milliliters)、μｇ(mi
crograms)、ｍｇ(milligrams)、K bp(kilo base pair
s)、ＰＣＲ(polymerase chain reaction)、ＰＥＧ(poly
ethylene glycol)。

【００５０】以下、本発明を実施例によりより詳しく説
明する。但し、次の実施例はただ本発明を例示するため
のものだけであり、次の実施例が本発明を限定するもの
ではない。

【００５１】

【実施例】実施例１ 野生型ＨＢＶ発現ベクター(Ｒ015；ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／
３０)の製造 ＨＢＶ遺伝子治療ベクターを設計するためには、ＨＢＶ
の遺伝子複製に必須の塩基配列部位(シス−エレメント)
の完全な解明が先行しなければならない。このような複
製に必要な塩基配列部位を解明するため細胞にトランス
フェクションしたとき、ＨＢＶ遺伝子複製能(replicati
on competent)を有するベクターを製造した。即ち、野
生型ＨＢＶを生成するＨＢＶプリゲノミックＲＮＡ発現
ベクターを製造した。異種プロモーターによりＨＢＶプ
リゲノミック(pregenomic)ＲＮＡと同じ構造及び塩基配
列のｍＲＮＡが転写されると、ＨＢＶのゲノム複製と同
じ過程を介してウイルス粒子を作ることができるという
ことは公知の事実である(Nassal，et al.，1990)。よっ
て、ＨＢＶを発現するプラスミドを製造するため優先的
に考慮しなければならない事柄は、直ちに転写されるｍ
ＲＮＡがＨＢＶプリゲノミックＲＮＡと同じように作る
ことである。以後、転写されたｍＲＮＡから複製に必要
なウイルスのタンパク質が作られ、ウイルス遺伝子の複
製及びウイルス粒子が生産される。

【００５２】特に、エプシロン(ε)というキャプシド化
(encapsidation)信号は、ウイルスの複製の第一段階で
キャプシド化に必須の重要な因子である(Junker-Niepma
nn et al.，1990；Hirsch et al.，1991)。このエプシ
ロン信号はプリゲノミックＲＮＡの５'−末端から約３
０ヌクレオチド(nucleotide)離れている(Jeong et a
l.，2000)。

【００５３】本発明で用いた塩基配列番号は、Galibert
等(Galibert，et al.，1979)の方法に従いＨＢＶ aywサ
ブタイプ(subtype)の塩基配列を、ＨＢＶ内の制限酵素E
coRI位置を１番にして3182番まで表記したものである。
表示された塩基配列番号はＨＢＶのものであり、若し他
のものの塩基配列番号を用いるときは別に示しておい
た。プリゲノミックＲＮＡの５'位置末端部位は1820配
列番号に示しており、転写開始位置を意味する。Ｒ015
プラスミドの塩基配列は配列番号３に示されている。

【００５４】１−１．Ｒ402プラスミド(ｐＣＭＶ−ＨＢ
Ｖ／164)の製造 ＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶ ayw subtypeの遺伝子を有する
ｐＳＶ２Ａ−Neo(ＨＢＶ)２プラスミドを利用した(Shih
et al.，1989)。先ず、ＨＢＶのプリゲノミックＲＮＡ
の５'−末端と３'−末端が同じ塩基配列及び構造(termi
nal redundancy)を有するので、線状(linear)のプラス
ミド転写でこれを保つためプロモーターの下流(downstr
eam)にゲノム大きさより大きいゲノムを挿入した(Gane
m，1996)。よって、ＣＭＶプロモーターから宿主細胞の
ＲＮＡポリメラーゼ(polymerase)IIにより転写が発生す
るpcＤＮＡ１／Amp(Invitrogen,ＵＳＡ)のクローニング
サイトにあるEcoR VとXba Iの制限酵素認識部位の間
に、ＨＢＶ全体遺伝子より172ヌクレオチドがさらに重
なる長さのＨＢＶ aywサブタイプ(subtype)遺伝子(Gali
bert et al.，1979)をFsp IとXba Iに切断して挿入した
(図５ａ参照)。

【００５５】これにより作られたＲ402プラスミド(ｐＣ
ＭＶ−ＨＢＶ／164)は、野生型ＨＢＶとは別に５'−末
端からエプシロン信号が164ヌクレオチド離れているｍ
ＲＮＡに転写される。これは野生型に比べエプシロンの
位置が５'−末端から134ヌクレオチドさらに遠く離れて
いるものである(Jeong et al.，2000)。

【００５６】このような結果は、pcＤＮＡ１／Ampの転
写が始まる地点が挿入部位より上流(upstream)に位置す
るためである。

【００５７】１−２．野生型ＨＢＶプリゲノミックＲＮ
Ａを発現するＲ015プラスミド(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３
０)製造 野生型ＨＢＶプリゲノミックＲＮＡのような塩基配列及
び構造を有するｍＲＮＡを転写するように作るため、実
施例１−１で作ったプラスミドの５'−末端塩基を除去
した。図５ａでのように、Ｒ402プラスミド(ｐＣＭＶ−
ＨＢＶ／164)をSac IとBspE Iに切断し、同じ制限酵素
認識部位を両端に保有したＨＢＶ遺伝子切片をＰＣＲに
よって増幅した(Jeong et al.，2000)。このとき、人為
的な制限酵素認識部位を挿入し、Ｒ402プラスミドの転
写開始部位にＨＢＶプリゲノミックＲＮＡ開始部位が正
しく一致するようプライマー(ＨＢＶ1820)を製造した。
用いたプライマー塩基配列は次の通りである。

【００５８】

【００５９】これらプライマーとＲ402プラスミドを鋳
型にして作られたＰＣＲ産物を、再びSac I(nt 2894 of
pcＤＮＡ１／amp)とBspE I(nt．2331)に切断してプラ
スミドＲ402に挿入した。

【００６０】１−３．ヘルパープラスミドＲ063(ｐＣＭ
Ｖ−ＣＰＳ)プラスミドの製造 pcＤＮＡ３(Invitrogen，Ｕ.Ｓ.Ａ)のEcoR I、Xho I認
識部位にＲ015プラスミドを鋳型にして作ったＰＣＲ生
成物(nt．1903-to-2454)を挿入した。詳しく説明すれ
ば、正方向プライマー(forward primer)の５'位置末端
部位にEcoR I認識部位を作り、逆方向プライマー(rever
se primer)の５'位置末端部位にXho I認識部位を作った
ＰＣＲ生成物の0.5K bpのEcoR I、Xho I切片を、pcＤＮ
Ａ３プラスミドのEcoR I、Xho I認識部位に挿入してＲ0
62プラスミドを作った。その次に、Ｒ015プラスミドのB
spE I(nt．2331)、Apa Iの間の約2.6K bpの切片をＲ062
プラスミドのBspE I、Apa I切片と置換してＲ063プラス
ミドを作った。Ｒ063プラスミドはコア、ポリメラー
ゼ、表面抗原を発現するヘルパープラスミドに用いられ
た。

【００６１】Forward primer：５'−ＣＡＴＧＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＣＴ−３'(下線：EcoR
I部位) Reverse primer：５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＣ
ＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡ−３'(下線：Xho I
部位)

【００６２】実施例２ Ｒ015プラスミド(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３０)で転写され
るプリゲノミックＲＮＡの複製能 ２−１．肝癌細胞株の細胞増殖とトランスフェクション 肝癌細胞株のHuh７細胞を１０％ＦＢＳ(fetal bovine s
erum)と、１０mg／mlgentamicinを投入したＤＭＥＭ(Gi
bco-ＢＲＬ)培地に３日ごとに分株して細胞を育てた。
トランスフェクションする一日前にHuh７細胞を７５％
で６０mmプレートに培養させて細胞を用意する。先ず、
燐酸緩衝溶液(phosphate buffered saline)で細胞を２
回洗浄し新しい培養液に取り替えた後、前記プラスミド
１０μｇを0.25M CaCl_２が含まれた250mlの水に混合し
てから、同量の２Ｘ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液［280mM NaC
l、５０mM ＨＥＰＥＳ acid、1.5mM Na_２HPO_４(pH 7.
1)］に揺り動かしながら一滴ずつ滴下して混合物を作
る。以後、この混合物を常温で３０分間反応させて白色
の沈澱物が生じるようにした後、プレートに均等に散布
する。トランスフェクション１６時間後新しい培養液
［ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１０mg／ml gentamycin］
に取り替え、３日後ウイルスコア粒子を抽出した。

【００６３】２−２．コア粒子からＨＢＶ ＤＮＡ抽出
及びサーザンブロットを介したＨＢＶreplication-inte
rmediate ＤＮＡの調査 トランスフェクション３日後、ＰＥＧ沈澱法で細胞内の
コア粒子を抽出してＨＢＶのＤＮＡを用意した(Stapran
s et al.，1991)。詳しく説明すれば、先ず燐酸緩衝溶
液(phosphate buffered saline)で細胞を２回洗浄し、
細胞溶液緩衝溶液［１０mM Tris(pH7.5)、１mM ＥＤＴ
Ａ、５０mM NaCl、８％ sucrose、0.25％Nonidet Ｐ−
４０］で細胞をプレートから外す。残留するトランスフ
ェクションしたプラスミドを除去するため、６mM MgCl
_２とDnase I(５０μｇ／ml)処理を３７℃ ３０分間行な
った後、４Ｘ ＰＮＥ［２６％ ＰＥＧ、1.4M NaCl、４
０mMＥＤＴＡ］でコア粒子を沈澱させ、遠心分離を行な
ってコア粒子のみ分離した。得られたコア粒子タンパク
質を分解するため、プロナーゼ(pronase、Sigma、ＵＳ
Ａ)で３７℃で２時間反応させた。以後、フェノールと
クロロホルム(１：１)でタンパク質を除去しエタノール
でコア粒子を沈澱させた後、ＴＥ「１０mM Tris(pH 8.
0)、１mM ＥＤＴＡ」でＤＮＡを抽出した。

【００６４】抽出したウイルスＤＮＡを1.25％アガロー
スゲルを介して電気泳動し、文献(Current Protocols i
n Molecular Biology，Ausubel，F．et al.，eds.，Wil
ey and Sons，New York，1995)に記載のサーザンブロッ
ト方法で分析した。

【００６５】実施例３ Ｒ015プラスミド(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３０)の欠損変異
体の製造 一般的な遺伝子組換技術を利用して次のような欠損変異
体を製造した。３−１．Ｒ060(ｐＣＭＶ−ayw Δ1910-1
992)プラスミドの製造ＨＢＶ遺伝子(Galibert，et a
l.，1979)のSac I、EcoR Iの間の切片をpBluescript Ｓ
Ｋ(＋)プラスミド(Stratagene、ＵＳＡ)のSac I、EcoR
Iの位置に移した後、ＰＣＲでnt．1910-1992を削除した
Ｒ059プラスミド(ｐＢＳ＋Δ1910-1992)を製造した。Ｒ
059プラスミドのSac I、EcoR Iの間の切片をＲ015プラ
スミドのSac I、EcoR Iの位置に移してＲ060プラスミド
を製造した。

【００６６】３−２．Ｒ048(ｐＣＭＶ−ayw Δ1884-245
9)プラスミドの製造 ＨＢＶ遺伝子(Galibert，et al.，1979)のSac I、EcoR
I(nt．3182)の間の切片をｐＣＨ110(Pharmacia)のSac
I、EcoR Iの位置に移してＲ046プラスミドを作った後、
151bpのXba I切片(1992-2143)を削除したＲ047プラスミ
ドを製造した。Ｒ047プラスミドのSac I、EcoR Iの間の
切片をＲ015プラスミドのSac I、EcoR Iの位置に移して
Ｒ048プラスミドを製造した。

【００６７】３−３．Ｒ056(ｐＣＭＶ−ayw Δ2143-245
9)プラスミドの製造 Ｒ015プラスミドのSac I、EcoR Iの間の切片をpBluescr
ipt II ＳＫ(＋)(Stratagene、ＵＳＡ)のSac I、EcoR I
の位置に移してＲ049プラスミドを作った。Ｒ049プラス
ミドのSty I(nt．1884)−Sty I(nt．2459)切片を逆方向
プライマー(reverse primer)の５'位置末端部位にSty I
認識部位を作ったＰＣＲ生成物であるSty I(nt．1884)
−Xba I(nt．2143)切片に置換させてＲ051プラスミドを
製造した。Ｒ051プラスミドのSac I、EcoR Iの間の切片
をＲ015プラスミドのSac I、EcoRIの位置に移してＲ056
プラスミドを製造した。

【００６８】Forward primer：５'−ＣＣＣＧＡＧＣＴ
ＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴ
ＣＴＧＣＣ−３'(下線：Sac I部位) Reverse primer：５'−ＣＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＴ
ＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＴ−３'(下線：Sty I部位)

【００６９】３−４．Ｒ021(ｐＣＭＶ−ayw Δ2459-281
7)プラスミドの製造 Ｒ015プラスミドのSac I、Xho I(nt．129)の間の切片を
pBlueBacHis２プラスミド(Invitrogen、ＵＳＡ)のSac
I、Xho Iの位置に移してＲ407プラスミドを製造した。
Ｒ407プラスミドのSty I(nt．2459)、BstE II(nt．281
7)の間を切断してクレノー切片で満たし(filling-in)、
ライゲーションしてnt．2459-2817を削除したＲ018プラ
スミドを製造した。Ｒ018プラスミドからBspE I、EcoR
Iの間の切片をＲ015のBspE I、EcoR Iの位置に移してＲ
021プラスミドを製造した。

【００７０】３−５．Ｒ022(ｐＣＭＶ−ayw Δ2662-318
2／0)プラスミドの製造 Ｒ015プラスミドをBstE II(nt．2662)とEcoR I(nt．318
2)に切断してクレノー切片で満たした後、ライゲーショ
ンしてnt．2662-3182を削除したＲ022プラスミドを製造
した。

【００７１】３−６．Ｒ045(ｐＣＭＶ−ayw Δ2839-318
2／0)プラスミドの製造 先ず、Ｒ015プラスミドをBstE II(nt．2817)とSph I(n
t．1239)に切断した後、pＧＥＭ−４Ｚ(Promega、ＵＳ
Ａ)に移してＲ701プラスミドを製造した。Ｒ701プラス
ミドのBgl II(nt．2839)とEcoR I(nt．3182)切片を削除
しクレノー切片で満たした後、ライゲーションしてnt．
2839-3182を削除したＲ043プラスミドを製造してから、
Ｒ043プラスミドをBstX Iで切断した切片をＲ015プラス
ミドのBstXI(nt．2817-620)の間の切片に置換してＲ045
プラスミドを製造した。

【００７２】３−７．Ｒ044(ｐＣＭＶ−ayw Δ3052-318
2／0)プラスミドの製造 Ｒ701プラスミドのBsu36 I(nt．3052)とEcoR I(nt．318
2)の間の切片を消去しクレノー切片で満たした後、ライ
ゲーションしてnt．3052-3182を削除したＲ042プラスミ
ドを製造してから、Ｒ042プラスミドをBstX Iで切断し
た切片をＲ015プラスミドのBstX I(nt．2817-620)の間
の切片に置換してＲ044プラスミドを製造した。

【００７３】３−８．Ｒ023(ｐＣＭＶ−ayw Δ3182／0-
129)プラスミドの製造 Ｒ015プラスミドをEcoR I(nt．3182)とXho I(nt．129)
に切断しクレノー切片で満たした後、ライゲーションし
てnt．3182／0-129を削除したＲ023プラスミドを製造し
た。

【００７４】３−９．Ｒ040(ｐＣＭＶ−ayw Δ129-490)
プラスミドの製造 Ｒ018プラスミドのEcoR I(nt．3182)、Sph I(nt．1239)
の間の切片をpＧＥＭ−４Ｚ(Promega、ＵＳＡ)プラスミ
ドに挿入してＲ037プラスミドを製造した。Ｒ037プラス
ミドをXho I(nt．129)、BamH I(nt．490)に切断した後
クレノー切片で満たし、ライゲーションしてnt．129-49
0を削除したＲ038プラスミドを製造した。Ｒ038プラス
ミドのEcoR I、Sph Iの間の877bp大きさの切片を、Ｒ01
5プラスミドのEcoR I、Sph Iの位置に移してＲ040プラ
スミドを作った。

【００７５】３−１０．Ｒ041(ｐＣＭＶ−ayw Δ490-82
7)プラスミドの製造 Ｒ037プラスミドをBamH I(nt．490)とAcc I(nt．827)に
切断した後クレノー切片で満たし、ライゲーションして
nt．490-827を削除したＲ039プラスミドを製造した。Ｒ
039プラスミドのEcoR I、Sph Iの間の897bp大きさの切
片を、Ｒ015プラスミドのEcoR I、Sph Iの位置に移して
Ｒ041プラスミドを製造した。

【００７６】３−１１．Ｒ025(ｐＣＭＶ−ayw Δ827-12
38)プラスミドの製造 Ｒ015プラスミドのEcoR I(nt．3182)とApa Iの間の切片
をpBluescript II ＳＫ(＋)(Stratagene、ＵＳＡ)に移
してＲ050プラスミドを製造した。Ｒ050プラスミドのAc
c I(nt．827)とSph I(nt．1238)の間の切片を除去して
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライゲーションし
てnt．827-1238を削除したＲ008プラスミドを製造し
た。Ｒ008プラスミドのEcoR I、Apa I切片をＲ015プラ
スミドのEcoRI、Apa Iの位置に移してＲ025プラスミド
を製造した。

【００７７】３−１２．Ｒ026(ｐＣＭＶ−ayw Δ1238-1
374)プラスミドの製造 Ｒ050プラスミドをSph I(nt．1238)、Nco I(nt．1374)
に切断した後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライ
ゲーションしてnt．1238-1374を削除したＲ009プラスミ
ドを製造した。次いで、Ｒ009プラスミドのEcoR IとApa
Iの間の1866bp大きさの切片をＲ015プラスミドのEcoR
I、Apa Iの位置に置換してＲ026プラスミドを製造し
た。

【００７８】３−１３．Ｒ027(ｐＣＭＶ−ayw Δ1374-1
419)プラスミドの製造 Ｒ050プラスミドをNco I(nt．1374)、Aat II(nt．1419)
に切断した後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライ
ゲーションしてnt．1374-1419を削除したＲ012プラスミ
ドを製造した。次いで、Ｒ012プラスミドのEcoR I(nt．
3182)、Apa Iの間の1957bp大きさの切片をＲ015プラス
ミドのEcoR I、Apa Iの位置に移してＲ027プラスミドを
製造した。

【００７９】３−１４．Ｒ028(ｐＣＭＶ−ayw Δ1419-1
804)プラスミドの製造 Ｒ050プラスミドをAat II(nt．1419)、Fsp I(nt．1804)
に切断した後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライ
ゲーションしてnt．1419-1804を削除したＲ013プラスミ
ドを作った。Ｒ013プラスミドのEcoR I(nt．3182)、Apa
Iの間の1617bp大きさの切片をＲ015プラスミドのEcoR
I、Apa Iの位置に移してＲ028プラスミドを製造した。

【００８０】３−１５．Ｒ053(ｐＣＭＶ−ayw Δ1419-1
804)プラスミドの製造 Ｒ050プラスミドのAat II(nt．1419)とApa Iの間の切片
を、正方向プライマー(forward primer)の５'位置末端
部位にAat II認識部位を製造したＰＣＲ生成物であるAa
t II(nt．1592)-Apa I切片に置換してＲ052プラスミド
を製造した。次いで、Ｒ052プラスミドのEcoR I、Apa I
の間の切片をＲ015プラスミドのEcoR I、Apa Iの位置に
移してＲ053プラスミドを製造した。

【００８１】３−１６．Ｒ035(ｐＣＭＶ−ayw Δ1607-1
804)プラスミドの製造 Ｒ050プラスミドをEcoR I(nt．3182)-Bsa I(nt．1607)
の間のブラント(blunt)切片を製造した後、Ｒ015プラス
ミドをEcoR I(nt．3182)-Fsp I(nt．1804)の間の切片と
置換してＲ035プラスミドを製造した。

【００８２】３−１７．Ｒ029(ｐＣＭＶ−ayw Δ1804-1
884)プラスミドの製造 Ｒ050プラスミドのFsp I(nt．1804)-Sty I(nt．1884)の
間の切片を消去しクレノー切片で満たした後、ライゲー
ションしてnt．1804-1884を削除したＲ010プラスミドを
製造した。次いで、Ｒ010プラスミドのEcoR I(nt．318
2)、Apa Iの間の1922bp大きさの切片をＲ015プラスミド
のEcoR I、Apa Iの位置に移してＲ029プラスミドを製造
した。

【００８３】実施例４ ＨＢＶゲノム複製に必須のシス−エレメントの分析 ４−１．コア粒子からＨＢＶ ＤＮＡ抽出及びサーザン
ブロット トランスフェクション、ＤＮＡ抽出とサーザンブロット
を実施例２−２と同じように行なった。ＨＢＶ遺伝子複
製に必要なウイルスのタンパク質を提供するため、コア
タンパク質とポリメラーゼを提供することができるヘル
パープラスミド(Ｒ063、ｐＣＭＶ−ＣＰＳ)を同時にト
ランスフェクションした。図７で１７種の欠損変異体等
のサーザンブロットの結果を示している。ＨＢＶ遺伝子
ゲノム複製で説明したように、コア粒子に存在するＨＢ
Ｖ遺伝子複製の中間体はＳＳ(一本鎖ＤＮＡ)、ＤＬ(二
本鎖ＤＮＡ)、ＲＣ(relaxed circular ＤＮＡ、リラッ
クスド環形)の形で存在する。この中でＲＣ(リラックス
ド環形)形のＤＮＡがウイルス粒子(virion particle)に
存在するＨＢＶゲノム複製の最終産物であるため、ＲＣ
形ＤＮＡの存在有無で各欠損変異体に欠けた塩基配列が
複製に必要なシス−エレメントであるか否かを判断する
ことができる。

【００８４】４-２．シス−エレメント分析 ＨＢＶ複製に必要なシス−エレメントを解明するため制
限酵素の位置を利用して幾つかの欠損変異体を製造し
た。これら欠損変異体はそれぞれ約0.1-0.4K bpの切片
を欠いており、全部合わせるとＨＢＶ全体ゲノムを含
む。

【００８５】表１はＢ形肝炎ウイルスの遺伝子中シス−
エレメントを解明するため製作した、欠損変異体の欠損
位置に伴う複製可否を要約した表である。

【表１】

【００８６】サーザンブロットの結果を分析してみる
と、Ｒ022プラスミド(ｐＣＭＶ−aywΔ2662-3182／0)を
トランスフェクションした場合、ＲＣ ＤＮＡは検出さ
れずＳＳ ＤＮＡのみ検出された(図７、表１)。この部
位をさらに詳しく解明するためＲ022プラスミドをＲ045
プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ2839-3182／0)と、Ｒ044
プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ3052-3182／0)に区分した
後サーザンブロットを行なった。その結果、Ｒ044プラ
スミドはＳＳ ＤＮＡ、ＤＬ ＤＮＡだけでなくＲＣ Ｄ
ＮＡが検出されたため、Ｒ044の欠損部位は複製に不要
であることが分かった(図７、表１)。その反面、Ｒ045
プラスミドは少量のＳＳ ＤＮＡのみ検出されたため、
Ｒ045プラスミドの欠損部位(nt．2839-3182／0)が複製
に必要な部位を含んでいることが分かった(図７、表
１)。

【００８７】一方、Ｒ021プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ
2459-2817)はＳＳ ＤＮＡ、ＤＬ ＤＮＡだけでなくＲＣ
ＤＮＡが検出されたため、Ｒ021の欠損部位は複製に不
要である(図７、表１)。前記四種類の欠損変異体の結果
から(nt．2818-3052)が新しいシス−エレメントである
ことが分かった。本発明でこの部位をアルファ−エレメ
ント(α)と名付けた。

【００８８】Ｒ028プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ1419-1
804)はＤＲ２(nt．1592-1602)が欠けている変異体であ
る。Ｒ028プラスミドのサーザンブロットの結果をみれ
ば、ＲＣ(relaxed circular)ＤＮＡが現われず、一本鎖
ＤＮＡのみ感知された(図７、表１)。この結果でＤＨＢ
Ｖでマイナス−鎖ＤＮＡ合成にＤＲ２が重要な役割を果
たすとの報告と一致する(Loeb et al.，1996；Condreay
et al.，1992)。これを確認するためＤＲ２部分前まで
のみ削除したＲ053プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ1419-1
592)を製造してサーザンブロットを行なった結果、ＲＣ
ＤＮＡを確認した(図７、表１)。よって、Ｒ028プラス
ミドは新しいシス−エレメントを含むものではなく、Ｄ
Ｒ２エレメント(nt．1592-1602)が欠けているためＲＣ
(relaxed circular)ＤＮＡが現れないことが分かった。

【００８９】一方、Ｒ035プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ
1607-1804)はＤＲ１とＤＲ２の間が欠けた変異体であ
り、ＤＮＡ合成が全く生じなかった(図７、表１)。マイ
ナス−鎖ＤＮＡ合成の開始部位(initiation位置)である
ＤＲ１が存在するが、複製が生じないためＤＲ１とＤＲ
２の間の塩基配列は複製に必要であることが分かった。
即ち、この部分はマイナス−鎖ＤＮＡ合成に必要であ
る。この部分は新しいシス−エレメントであるため、ベ
ータ−エレメント(β)と名付けた。

【００９０】Ｒ029プラスミド(ｐＣＭＶ−ayw Δ1804-1
884)はＤＲ１(nt．1826-1836)が欠けた変異体であり、
マイナス−鎖ＤＮＡ合成が全く感知されなかった(図
７、表１)。これは文献の報告と一致した結果を見せて
いる(Condreay et al.，1992)。

【００９１】結論的に、本発明ではＨＢＶ遺伝子複製に
必要な二つの新しいシス−エレメント等を解明した。こ
のようなサーザンブロットの結果により、ＨＢＶゲノム
複製で重要なシス−エレメントに対する総合的な理解で
プロトタイプのＨＢＶベクターを設計することができ
た。

【００９２】一方、ＨＢＶ遺伝子の一部はＨＢＶ遺伝子
複製に不要な欠損可能部位(despensable region)である
ことが明らかになった。欠損してもＲＣ(relaxed circu
lar)ＤＮＡを形成することができるものに現われた欠損
変異体らはＲ060(ｐＣＭＶ−ayw Δ1910-1992)、Ｒ048
(ｐＣＭＶ−ayw Δ1992-2143)、Ｒ056(ｐＣＭＶ−aywΔ
2143-2459)、Ｒ021(ｐＣＭＶ−ayw Δ2459-2817)、Ｒ04
4(ｐＣＭＶ−ayw Δ3052-3182／0)、Ｒ023(ｐＣＭＶ−a
yw Δ3182／0-129)、Ｒ040(ｐＣＭＶ−ayw Δ129-49
0)、Ｒ041(ｐＣＭＶ−ayw Δ490-827)、Ｒ025(ｐＣＭＶ
−ayw Δ827-1238)、Ｒ026(ｐＣＭＶ−ayw Δ1238-137
4)、Ｒ027(ｐＣＭＶ−ayw Δ1374-1419)、Ｒ053(ｐＣＭ
Ｖ−ayw Δ1419-1592)を含む。

【００９３】実施例５ プロトタイプＨＢＶ遺伝子治療ベクター設計 本発明ではＨＢＶ遺伝子複製に必要な新しいシス−エレ
メント等を全て解明した。文献上ではＨＢＶゲノム複製
段階に重要なエレメントが幾種類既に明らかになってい
る。このエレメント等はキャプシド化の信号に用いられ
る５'位置のエプシロン(Junker-Niepmann et al.，199
0；Hirsch et al.，1991)、ＤＲ１とＤＲ２エレメント
(Condreay et al.，1992；Seeger et al.，1991；Nassa
l et al.，1996)、円形化(circularization)に作用する
ｒ(repeat)エレメント(Loeb et al.，1997)、post-tran
scriptional RNA processingに必要なＰＲＥ エレメン
ト(Huang et al.，1995；Yen et al.，1998)等がある。
この他に、本発明では全体ＨＢＶゲノムのマッピング(m
apping)を介して二種類の新しいシス−エレメントを解
明した。

【００９４】ＨＢＶ遺伝子複製に必須のシス−エレメン
ト等を解明することにより、プロトタイプのＨＢＶ遺伝
子治療ベクターを設計することができる礎石を設けた
(図８参考)。ＨＢＶ遺伝子治療ベクター開発において最
も考慮すべき点は異種遺伝子の挿入位置と異種遺伝子の
大きさである。本発明ではプロトタイプのＨＢＶ遺伝子
治療ベクターを開発するため、二つの異種遺伝子の挿入
可能部位を選定した。先ず、５'位置エプシロン(ε)と
アルファ(α)−エレメント(nt．1909-2817)の間にＨＢ
Ｖ遺伝子を異種遺伝子の置換が可能である。この挿入部
位に少なくとも0.9K bp大きさの異種遺伝子ＤＮＡ切片
の挿入が可能である。さらに、この挿入部位の上流(ups
tream)に位置し、コアプロモーター(core promoter)を
挿入された異種遺伝子発現に活用することになる。第二
に、アルファ(α)−エレメントとＤＲ２エレメントの間
を異種遺伝子に置換することができる。ここでは、1.7K
bp大きさのＤＮＡ切片を異種遺伝子に置換することが
できる。最初の挿入部位と類似するよう、第二の挿入部
位の上流にプリ(pre)−Ｓ２／Ｓプロモーター(promote
r)が位置している。よって、この部位に挿入した異種遺
伝子はプリ(pre)−Ｓ２／Ｓプロモーターを利用して発
現することができる。

【００９５】実施例６ 異種遺伝子が挿入されたＨＢＶ vectorの製造 実施例５で設計されたＨＢＶベクターの欠損可能部位に
外部遺伝子を挿入してその複製を調査するため、異種遺
伝子の緑色蛍光タンパク質(green fluorescentprotei
n：ＧＦＰ)遺伝子を挿入させたＲ711プラスミドを(ｐＣ
ＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ)製造した(図９参考)。

【００９６】６−１．挿入部位とプロモーター 次のような事柄を考慮し挿入部位を決定した。第一、Ｈ
ＢＶゲノム複製に必須の全てのシス−エレメントは存在
しなければならない。第二、最大のパッケージングされ
得る大きさ(packaging limit)を超過しない範囲で発現
能力を有する内在ウイルスプロモーターが必要である。

【００９７】６−２．緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝
子のＨＢＶベクターへの挿入 外部遺伝子が挿入された組換ＨＢＶベクターを製造する
ため、約0.7K bpの緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)遺伝子
をＨＢＶベクターに挿入した。先に、緑色蛍光タンパク
質(ＧＦＰ)遺伝子をＰＣＲ生成物に作った後、このとき
ＧＦＰ ＰＣＲ産物の両端にはプライマーを介して作ら
れた制限酵素認識部位が生成されるように製作した。先
ず、Ｒ709プラスミド(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ΔＰ_Ｓ２ＧＦ
Ｐ)は、Ｒ015プラスミドのBsu３６ I(nt．3052)−EcoR
I(nt．3182)の間の切片を、両端にBsu３６ I−EcoR I制
限酵素認識部位を有する0.7K bp大きさのＧＦＰ遺伝子
を発現するＰＣＲ生成物に置換して作った。具体的に、
プライマーＧＦＰ BsuF IIの５'末端からクローニング
のためのBsu３６ Iの制限酵素認識部位を、そして、プ
ライマーＧＦＰ EcoR IIの５'末端にEcoR Iの制限酵素
認識部位を挿入してＰＣＲに利用した。

【００９８】具体的な塩基配列は次の通りである。

【００９９】一連のクローニング過程の中でプリ(pre)
−Ｓ２／Ｓプロモーターの一部が欠ける。欠けたpre−
Ｓ２／Ｓプロモーター部位を復旧させるため、Bsu３６
I(nt．3052)−Bsu３６ I(nt．3166)の間の切片をＲ709
プラスミドに挿入し、Ｒ710プラスミド(ｐＣＭＶ−pre
ＨＢＶ／ＧＦＰ)を製造した。ついで、Ｒ711プラスミド
(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ)(配列番号４)を製造するた
め、Ｒ710プラスミドのEcoR I(nt．3182)−Sph I(nt．1
238)の間の切片を削除した。結局、1.3K bp大きさのＨ
ＢＶ遺伝子の一部が0.7K bpのＧＦＰ遺伝子に置換され
る。よって、ベクターは全体ゲノム大きさが1.3K bp程
度が削除され、ＧＦＰ遺伝子の0.7K bpが添加されてＨ
ＢＶゲノム大きさより0.6K bpが小さくなるよう製造し
た。

【０１００】実施例７ 組換ＨＢＶ遺伝子ベクターの複製確認 組換ＨＢＶベクターの複製能力を確認することにより、
遺伝子治療ベクターとしての有用性を確認した。Ｒ711
プラスミドとｐＣＭＶ−ＣＰＳ(ヘルパー)をHuh７細胞
にトランスフェクションした。実施例２−２のようにコ
アＤＮＡを抽出し、ＨＢＶプローブ(probe)を利用した
サーザンブロットを行なった(図１１ａ)。対照群でＨＢ
Ｖを生産する肝癌細胞株のHepG2.2.15細胞へのコア粒子
から抽出したＤＮＡを比較分析した(Sells et al．，19
88)。図１１ａに示されるように、陽性対照群のHepG2.
2.15細胞とＲ015プラスミドがトランスフェクションさ
れた細胞でＲＣ(relaxed circular)ＤＮＡ、ＤＬ(doubl
e-stranded linear)ＤＮＡ、ＳＳ(single-stranded)Ｄ
ＮＡ等が検出された。その上に、Ｒ711プラスミドをト
ランスフェクションさせたときの場合にも、ＲＣ ＤＮ
Ａが検出されることを確認することができた。さらに、
ＲＣ ＤＮＡの量が野生型ＨＢＶクローンのＲ015プラス
ミドをトランスフェクションした場合と類似するとのこ
とも確認することができた。

【０１０１】さらに、図１１ｂでＧＦＰプローブを利用
したサーザンブロットの結果からＲ711プラスミドベク
ターの複製能力を再確認することができた。結論的に、
本発明が提供するプロトタイプのＨＢＶベクターは異種
遺伝子を挿入しても複製能(replication competent)に
損傷がないため、有用な遺伝子治療ベクターとしての可
能性が立証された。

【０１０２】プラスミドＲ711(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦ
Ｐ)は、ＨＢＶゲノムの大きさが野生型に比べ0.6K bp小
さい。ＨＢＶゲノムの大きさがマイナス−鎖の移動(tra
nslocation)に影響を及ぼす可能性があるため(ＨＯ et
al.，2000)、これを補うため野生型のゲノム大きさと同
じＲ712(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ3.2)プラスミド(配
列番号５)を製造した。Ｒ712プラスミドはＲ710プラス
ミドのEcoR I(nt．3182)−Apa I切片を削除し、ＰＣＲ
を利用して正方向プライマー(forward primer)の５'位
置末端部位にEcoR I認識部位を作ったＰＣＲ生成物のEc
oR I(nt．732)−Apa I切片に置換してＲ712プラスミド
を製造した。プライマーの具体的な塩基配列は次の通り
である。

【０１０３】

【０１０４】Ｒ712プラスミドは、削除されたＨＢＶサ
イズ程度の異種遺伝子が入っているため全体のサイズが
野生型と同じである。Ｒ712プラスミドをトランスフェ
クションさせたときの場合、Ｒ711と同様にサーザンブ
ロットの結果からＲＣ ＤＮＡを確認することができ
た。

【０１０５】

【発明の効果】前記の構成の本発明によれば、本発明で
提供する組換ウイルスは肝細胞にのみ選択的に感染し、
治療用遺伝子を伝達する特性があるためin vivo治療とe
x vivo治療が可能な利点があり、このような新しい遺伝
子治療用組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターは肝組織にＤＮ
Ａを直接挿入、循環等の方法で注入(administration)さ
せると、肝に異種遺伝子を伝達して発現させるのに直接
利用が可能である。

【０１０６】他の引用文献 Anderson, W. F, Human gene therapy. Science 256:8
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ntity of the terminal redundancies on the minus-st
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gene expression in hepadnaviruses. Semin. Virol.
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【０１０７】 配列表 i) SEQUENCE CHARACTORISTICS: (A) length: 235 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) iii) HYPOTHETICAL: NO iv) ANTI-SENSE: NO v) FRAGMENT TYPE: vi) ORIGINAL SOURCE: HBV- ayw(2818-3052) vii) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO.1: α-element sequence gtcaccatat tcttgggaac aagatctaca gcatggggca gaatctttcc accagcaatc 60 ctctgggatt ctttcccgac caccagttgg atccagcctt cagagcaaac accgcaaatc 120 cagattggga cttcaatccc aacaaggaca cctggccaga cgccaacaag gtaggagctg 180 gagcattcgg gctgggtttc accccaccgc acggaggcct tttggggtgg agccc 235 i) SEQUENCE CHARACTORISTICS: (A) length: 197 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) iii) HYPOTHETICAL: NO iv) ANTI-SENSE: NO v) FRAGMENT TYPE: vi) ORIGINAL SOURCE: HBV- ayw(1608-1804) vii) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO.2: β-element sequence gcatggagac caccgtgaac gcccaccaaa tattgcccaa ggtcttacat aagaggactc 60 ttggactctc agcaatgtca acgaccgacc ttgaggcata cttcaaagac tgtttgttta 120 aagactggga ggagttgggg gaggagatta ggttaaaggt ctttgtacta ggaggctgta 180 ggcataaatt ggtctgc 197 i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) length: 8007 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) iii) HYPOTHETICAL: NO iv) ANTI-SENSE: NO v) FRAGMENT TYPE: vi) ORIGINAL SOURCE: vii) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO.3: pCMV-HBV/30 Full Sequences 8007 bp ms-DNA circular From HBV-ayw #1 ; #1820 of HBV-ayw (accession number J02203) transcription start site of HBV pregenomic RNA #1 - 3360 ; HBV-ayw (178 bp overlapping the HBV genome-length) 5'- epsilon secondary structure ; bases 30 - 90 3'- epsilon secondary structure ; bases 3212 - 3272 5'- DR1 ; bases 7 - 17 3'- DR1 ; bases 3189 - 3199 3'- DR2 ; bases 2955 - 2965 Poly A signal ; bases 3281-3286 Core ORF ; bases 84 - 632 (exclude stop codon) Polymerase ORF ; bases 490 - 2985 (exclude stop codon) S1 ORF ; bases 1031 - 2197 (exclude stop codon) S2 ORF ; bases 1355 - 2197 (exclude stop codon) S ORF ; bases 1520 - 2197 (exclude stop codon) X ORF ; bases 2739 - 3200 (exclude stop codon) From pcDNA1/Amp <<<<<<<< Col E1 origin ; bases 5103-5689 (1-587 of pcDNA1/Amp) M13 origin ; bases 5690-6282 Ampicillin gene ; bases 6462-7405 CMV promoter ; bases 7406-7999 SP6 primer sequence ; bases 3372-3390 Splice and polyA ; bases 3391-4089 >>>>>>>> aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc tactgttcaa gcctccaagc 60 tgtgccttgg gtggctttgg ggcatggaca tcgaccctta taaagaattt ggagctactg 120 tggagttact ctcgtttttg ccttctgact tctttccttc agtacgagat cttctagata 180 ccgcctcagc tctgtatcgg gaagccttag agtctcctga gcattgttca cctcaccata 240 ctgcactcag gcaagcaatt ctttgctggg gggaactaat gactctagct acctgggtgg 300 gtgttaattt ggaagatcca gcgtctagag acctagtagt cagttatgtc aacactaata 360 tgggcctaaa gttcaggcaa ctcttgtggt ttcacatttc ttgtctcact tttggaagag 420 aaacagttat agagtatttg gtgtctttcg gagtgtggat tcgcactcct ccagcttata 480 gaccaccaaa tgcccctatc ctatcaacac ttccggagac tactgttgtt agacgacgag 540 gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa tcgccgcgtc 600 gcagaagatc tcaatctcgg gaatctcaat gttagtattc cttggactca taaggtgggg 660 aactttactg ggctttattc ttctactgta cctgtcttta atcctcattg gaaaacacca 720 tcttttccta atatacattt acaccaagac attatcaaaa aatgtgaaca gtttgtaggc 780 ccactcacag ttaatgagaa aagaagattg caattgatta tgcctgccag gttttatcca 840 aaggttacca aatatttacc attggataag ggtattaaac cttattatcc agaacatcta 900 gttaatcatt acttccaaac tagacactat ttacacactc tatggaaggc gggtatatta 960 tataagagag aaacaacaca tagcgcctca ttttgtgggt caccatattc ttgggaacaa 1020 gatctacagc atggggcaga atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca 1080 ccagttggat ccagccttca gagcaaacac cgcaaatcca gattgggact tcaatcccaa 1140 caaggacacc tggccagacg ccaacaaggt aggagctgga gcattcgggc tgggtttcac 1200 cccaccgcac ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tacaaacttt 1260 gccagcaaat ccgcctcctg cctccaccaa tcgccagtca ggaaggcagc ctaccccgct 1320 gtctccacct ttgagaaaca ctcatcctca ggccatgcag tggaattcca caaccttcca 1380 ccaaactctg caagatccca gagtgagagg cctgtatttc cctgctggtg gctccagttc 1440 aggaacagta aaccctgttc tgactactgc ctctccctta tcgtcaatct tctcgaggat 1500 tggggaccct gcgctgaaca tggagaacat cacatcagga ttcctaggac cccttctcgt 1560 gttacaggcg gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca ataccgcaga gtctagactc 1620 gtggtggact tctctcaatt ttctaggggg aactaccgtg tgtcttggcc aaaattcgca 1680 gtccccaacc tccaatcact caccaacctc ttgtcctcca acttgtcctg gttatcgctg 1740 gatgtgtctg cggcgtttta tcatcttcct cttcatcctg ctgctatgcc tcatcttctt 1800 gttggttctt ctggactatc aaggtatgtt gcccgtttgt cctctaattc caggatcctc 1860 aacaaccagc acgggaccat gccggacctg catgactact gctcaaggaa cctctatgta 1920 tccctcctgt tgctgtacca aaccttcgga cggaaattgc acctgtattc ccatcccatc 1980 atcctgggct ttcggaaaat tcctatggga gtgggcctca gcccgtttct cctggctcag 2040 tttactagtg ccatttgttc agtggttcgt agggctttcc cccactgttt ggctttcagt 2100 tatatggatg atgtggtatt gggggccaag tctgtacagc atcttgagtc cctttttacc 2160 gctgttacca attttctttt gtctttgggt atacatttaa accctaacaa aacaaagaga 2220 tggggttact ctctaaattt tatgggttat gtcattggat gttatgggtc cttgccacaa 2280 gaacacatca tacaaaaaat caaagaatgt tttagaaaac ttcctattaa caggcctatt 2340 gattggaaag tatgtcaacg aattgtgggt cttttgggtt ttgctgcccc ttttacacaa 2400 tgtggttatc ctgcgttgat gcctttgtat gcatgtattc aatctaagca ggctttcact 2460 ttctcgccaa cttacaaggc ctttctgtgt aaacaatacc tgaaccttta ccccgttgcc 2520 cggcaacggc caggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcttg 2580 gtcatgggcc atcagcgcat gcgtggaacc ttttcggctc ctctgccgat ccatactgcg 2640 gaactcctag ccgcttgttt tgctcgcagc aggtctggag caaacattat cgggactgat 2700 aactctgttg tcctatcccg caaatataca tcgtttccat ggctgctagg ctgtgctgcc 2760 aactggatcc tgcgcgggac gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa tcctgcggac 2820 gacccttctc ggggtcgctt gggactctct cgtccccttc tccgtctgcc gttccgaccg 2880 accacggggc gcacctctct ttacgcggac tccccgtctg tgccttctca tctgccggac 2940 cgtgtgcact tcgcttcacc tctgcacgtc gcatggagac caccgtgaac gcccaccaaa 3000 tattgcccaa ggtcttacat aagaggactc ttggactctc agcaatgtca acgaccgacc 3060 ttgaggcata cttcaaagac tgtttgttta aagactggga ggagttgggg gaggagatta 3120 ggttaaaggt ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat 3180 gcaacttttt cacctctgcc taatcatctc ttgttcatgt cctactgttc aagcctccaa 3240 gctgtgcctt gggtggcttt ggggcatgga catcgaccct tataaagaat ttggagctac 3300 tgtggagtta ctctcgtttt tgccttctga cttctttcct tcagtacgag atcttctaga 3360 gggccctatt ctatagtgtc acctaaatgc tagaggatct ttgtgaagga accttacttc 3420 tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa ggtaaatata 3480 aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt 3540 ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga ggaaaacctg 3600 ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc tcaacattct 3660 actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc agaattgcta 3720 agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc tatttacacc 3780 acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattt gatgtatagt 3840 gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa 3900 aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa 3960 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 4020 taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 4080 tcatgtctgg atcatcccgc catggtatca acgccatatt tctatttaca gtagggacct 4140 cttcgttgtg taggtaccgc tgtattccta gggaaatagt agaggcacct tgaactgtct 4200 gcatcagcca tatagccccc gctgttcgac ttacaaacac aggcacagta ctgacaaacc 4260 catacacctc ctctgaaata cccatagttg ctagggctgt ctccgaactc attacaccct 4320 ccaaagtcag agctgtaatt tcgccatcaa gggcagcgag ggcttctcca gataaaatag 4380 cttctgccga gagtcccgta agggtagaca cttcagctaa tccctcgatg aggtctacta 4440 gaatagtcag tgcggctccc attttgaaaa ttcacttact tgatcagctt cagaagatgg 4500 cggagggcct ccaacacagt aattttcctc ccgactctta aaatagaaaa tgtcaagtca 4560 gttaagcagg aagtggacta actgacgcag ctggccgtgc gacatcctct tttaattagt 4620 tgctaggcaa cgccctccag agggcgtgtg gttttgcaag aggaagcaaa agcctctcca 4680 cccaggccta gaatgtttcc acccaatcat tactatgaca acagctgttt tttttagtat 4740 taagcagagg ccggggaccc ctgggccggc ccgcttactc tggagaaaaa gaagagaggc 4800 attgtagagg cttccagagg caacttgtca aaacaggact gcttctattt ctgtcacact 4860 gtctggccct gtcacaaggt ccagcacctc cataccccct ttaataagca gtttgggaac 4920 gggtgcgggt cttactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc 4980 gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 5040 gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctaat 5100 tcggcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 5160 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 5220 caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 5280 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 5340 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 5400 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 5460 acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 5520 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 5580 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 5640 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcaagc tagcttctag 5700 ctagaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 5760 tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagccc 5820 gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 5880 tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gccgcccact acgtgaacca 5940 tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa 6000 gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 6060 aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 6120 accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg ttgctttgac 6180 gagaccgtat aacgtgcttt cctcgttgga atcagagcgg gagctaaaca ggaggccgat 6240 taaagggatt ttagacagga acggtacgcc agctggatta ccaaagggcc tcgtgatacg 6300 cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 6360 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 6420 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 6480 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 6540 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 6600 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 6660 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 6720 tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 6780 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 6840 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 6900 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 6960 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 7020 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 7080 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 7140 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 7200 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 7260 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 7320 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 7380 aaaacttcat ttttaatttc tctagcgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 7440 taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 7500 acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 7560 acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggactat 7620 ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 7680 attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 7740 gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 7800 ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 7860 caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 7920 tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 7980 tatataagca gagctctctg gctaact 8007 i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) length: 8717 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) iii) HYPOTHETICAL: NO iv) ANTI-SENSE: NO v) FRAGMENT TYPE: vi) ORIGINAL SOURCE: vii) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO.4: R711; pCMV-HBV/GFP Full Sequences 8717 bp ms-DNA circular From HBV-ayw subtype # 1 ; #1820 of HBV-ayw (accession number J02203) transcription start site of HBV pregenomic RNA # 1 - 1355, 2071 - 4065 ; HBV-ayw -. 178 bp overlapping the HBV genome-length -. HBV bases 1353 - 1362 in R015(pCMV-HBV/30) were deleted # 1353 - 2071 ; ORF for GFP(Green Fluorescent Protein) Sequences # From HBV gene 5'- epsilon secondary structure ; bases 30 - 90 3'- epsilon secondary structure ; bases 3922 - 3982 5'- DR1 ; bases 7 - 17 3'- DR1 ; bases 3899 - 3909 3'- DR2 ; bases 3665 - 3675 Poly A signal ; bases 3991 - 3996 Core ORF ; bases 84 - 632 (exclude stop codon) Polymerase ORF ; is broken S1 ORF ; is broken S2 ORF ; is broken S ORF ; is broken X ORF ; bases 3449 - 3910 (exclude stop codon) From pcDNA1/Amp <<<<<<<< bases 4066 - 8717 Col E1 origin ; bases 5813 - 6399 (1-587 of pcDNA1/Amp) M13 origin ; bases 6400 - 6992 Ampicillin gene ; bases 7172 - 8115 CMV promoter ; bases 8116 - 8709 SP6 primer sequence ; bases 4082 - 4100 Splice and polyA ; bases 4101 - 4799 >>>>>>>> <400> aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc tactgttcaa gcctccaagc 60 tgtgccttgg gtggctttgg ggcatggaca tcgaccctta taaagaattt ggagctactg 120 tggagttact ctcgtttttg ccttctgact tctttccttc agtacgagat cttctagata 180 ccgcctcagc tctgtatcgg gaagccttag agtctcctga gcattgttca cctcaccata 240 ctgcactcag gcaagcaatt ctttgctggg gggaactaat gactctagct acctgggtgg 300 gtgttaattt ggaagatcca gcgtctagag acctagtagt cagttatgtc aacactaata 360 tgggcctaaa gttcaggcaa ctcttgtggt ttcacatttc ttgtctcact tttggaagag 420 aaacagttat agagtatttg gtgtctttcg gagtgtggat tcgcactcct ccagcttata 480 gaccaccaaa tgcccctatc ctatcaacac ttccggagac tactgttgtt agacgacgag 540 gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa tcgccgcgtc 600 gcagaagatc tcaatctcgg gaatctcaat gttagtattc cttggactca taaggtgggg 660 aactttactg ggctttattc ttctactgta cctgtcttta atcctcattg gaaaacacca 720 tcttttccta atatacattt acaccaagac attatcaaaa aatgtgaaca gtttgtaggc 780 ccactcacag ttaatgagaa aagaagattg caattgatta tgcctgccag gttttatcca 840 aaggttacca aatatttacc attggataag ggtattaaac cttattatcc agaacatcta 900 gttaatcatt acttccaaac tagacactat ttacacactc tatggaaggc gggtatatta 960 tataagagag aaacaacaca tagcgcctca ttttgtgggt caccatattc ttgggaacaa 1020 gatctacagc atggggcaga atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca 1080 ccagttggat ccagccttca gagcaaacac cgcaaatcca gattgggact tcaatcccaa 1140 caaggacacc tggccagacg ccaacaaggt aggagctgga gcattcgggc tgggtttcac 1200 cccaccgcac ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tacaaacttt 1260 gccagcaaat ccgcctcctg cctccaccaa tcgccagtca ggaaggcagc ctaccccgct 1320 gtctccacct ttgagaaaca ctcatcctca ggagatgagt aaaggagaag aacttttcac 1380 tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt 1440 cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac 1500 tactggaaaa ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttctctt atggtgttca 1560 atgcttttca agatacccag atcatatgaa acagcatgac tttttcaaga gtgccatgcc 1620 cgaaggttat gtacaggaaa gaactatatt tttcaaagat gacgggaact acaagacacg 1680 tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct tgttaataga atcgagttaa aaggtattga 1740 ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca caaattggaa tacaactata actcacacaa 1800 tgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gttaacttca aaattagaca 1860 caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg 1920 cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc acacaatctg ccctttcgaa 1980 agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgtaacag ctgctgggat 2040 tacacatggc atggatgaac tatacaaata aggaattcca caaccttcca ccaaactctg 2100 caagatccca gagtgagagg cctgtatttc cctgctggtg gctccagttc aggaacagta 2160 aaccctgttc tgactactgc ctctccctta tcgtcaatct tctcgaggat tggggaccct 2220 gcgctgaaca tggagaacat cacatcagga ttcctaggac cccttctcgt gttacaggcg 2280 gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca ataccgcaga gtctagactc gtggtggact 2340 tctctcaatt ttctaggggg aactaccgtg tgtcttggcc aaaattcgca gtccccaacc 2400 tccaatcact caccaacctc ttgtcctcca acttgtcctg gttatcgctg gatgtgtctg 2460 cggcgtttta tcatcttcct cttcatcctg ctgctatgcc tcatcttctt gttggttctt 2520 ctggactatc aaggtatgtt gcccgtttgt cctctaattc caggatcctc aacaaccagc 2580 acgggaccat gccggacctg catgactact gctcaaggaa cctctatgta tccctcctgt 2640 tgctgtacca aaccttcgga cggaaattgc acctgtattc ccatcccatc atcctgggct 2700 ttcggaaaat tcctatggga gtgggcctca gcccgtttct cctggctcag tttactagtg 2760 ccatttgttc agtggttcgt agggctttcc cccactgttt ggctttcagt tatatggatg 2820 atgtggtatt gggggccaag tctgtacagc atcttgagtc cctttttacc gctgttacca 2880 attttctttt gtctttgggt atacatttaa accctaacaa aacaaagaga tggggttact 2940 ctctaaattt tatgggttat gtcattggat gttatgggtc cttgccacaa gaacacatca 3000 tacaaaaaat caaagaatgt tttagaaaac ttcctattaa caggcctatt gattggaaag 3060 tatgtcaacg aattgtgggt cttttgggtt ttgctgcccc ttttacacaa tgtggttatc 3120 ctgcgttgat gcctttgtat gcatgtattc aatctaagca ggctttcact ttctcgccaa 3180 cttacaaggc ctttctgtgt aaacaatacc tgaaccttta ccccgttgcc cggcaacggc 3240 caggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcttg gtcatgggcc 3300 atcagcgcat gcgtggaacc ttttcggctc ctctgccgat ccatactgcg gaactcctag 3360 ccgcttgttt tgctcgcagc aggtctggag caaacattat cgggactgat aactctgttg 3420 tcctatcccg caaatataca tcgtttccat ggctgctagg ctgtgctgcc aactggatcc 3480 tgcgcgggac gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa tcctgcggac gacccttctc 3540 ggggtcgctt gggactctct cgtccccttc tccgtctgcc gttccgaccg accacggggc 3600 gcacctctct ttacgcggac tccccgtctg tgccttctca tctgccggac cgtgtgcact 3660 tcgcttcacc tctgcacgtc gcatggagac caccgtgaac gcccaccaaa tattgcccaa 3720 ggtcttacat aagaggactc ttggactctc agcaatgtca acgaccgacc ttgaggcata 3780 cttcaaagac tgtttgttta aagactggga ggagttgggg gaggagatta ggttaaaggt 3840 ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt 3900 cacctctgcc taatcatctc ttgttcatgt cctactgttc aagcctccaa gctgtgcctt 3960 gggtggcttt ggggcatgga catcgaccct tataaagaat ttggagctac tgtggagtta 4020 ctctcgtttt tgccttctga cttctttcct tcagtacgag atcttctaga gggccctatt 4080 ctatagtgtc acctaaatgc tagaggatct ttgtgaagga accttacttc tgtggtgtga 4140 cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa ggtaaatata aaatttttaa 4200 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt ccaacctatg 4260 gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga ggaaaacctg ttttgctcag 4320 aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc tcaacattct actcctccaa 4380 aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc agaattgcta agttttttga 4440 gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc tatttacacc acaaaggaaa 4500 aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattt gatgtatagt gccttgacta 4560 gagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca 4620 cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt 4680 gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 4740 ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg 4800 atcatcccgc catggtatca acgccatatt tctatttaca gtagggacct cttcgttgtg 4860 taggtaccgc tgtattccta gggaaatagt agaggcacct tgaactgtct gcatcagcca 4920 tatagccccc gctgttcgac ttacaaacac aggcacagta ctgacaaacc catacacctc 4980 ctctgaaata cccatagttg ctagggctgt ctccgaactc attacaccct ccaaagtcag 5040 agctgtaatt tcgccatcaa gggcagcgag ggcttctcca gataaaatag cttctgccga 5100 gagtcccgta agggtagaca cttcagctaa tccctcgatg aggtctacta gaatagtcag 5160 tgcggctccc attttgaaaa ttcacttact tgatcagctt cagaagatgg cggagggcct 5220 ccaacacagt aattttcctc ccgactctta aaatagaaaa tgtcaagtca gttaagcagg 5280 aagtggacta actgacgcag ctggccgtgc gacatcctct tttaattagt tgctaggcaa 5340 cgccctccag agggcgtgtg gttttgcaag aggaagcaaa agcctctcca cccaggccta 5400 gaatgtttcc acccaatcat tactatgaca acagctgttt tttttagtat taagcagagg 5460 ccggggaccc ctgggccggc ccgcttactc tggagaaaaa gaagagaggc attgtagagg 5520 cttccagagg caacttgtca aaacaggact gcttctattt ctgtcacact gtctggccct 5580 gtcacaaggt ccagcacctc cataccccct ttaataagca gtttgggaac gggtgcgggt 5640 cttactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 5700 tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 5760 aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctaat tcggcgtaat 5820 ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 5880 gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 5940 ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 6000 cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 6060 cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 6120 ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 6180 tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 6240 cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 6300 ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 6360 aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcaagc tagcttctag ctagaaattg 6420 taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta 6480 accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagccc gagatagggt 6540 tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca 6600 aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gccgcccact acgtgaacca tcacccaaat 6660 caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc 6720 gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga 6780 aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac 6840 ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg ttgctttgac gagaccgtat 6900 aacgtgcttt cctcgttgga atcagagcgg gagctaaaca ggaggccgat taaagggatt 6960 ttagacagga acggtacgcc agctggatta ccaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 7020 taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 7080 gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 7140 agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 7200 catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 7260 ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 7320 atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 7380 ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc 7440 gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 7500 ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 7560 ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 7620 gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 7680 ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg 7740 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 7800 ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 7860 gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 7920 gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 7980 caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 8040 cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 8100 ttttaatttc tctagcgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 8160 cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 8220 gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 8280 ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa 8340 ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 8400 atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 8460 cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 8520 acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 8580 acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 8640 actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 8700gagctc tctg gctaact 8717 i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) length: 7991 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) iii) HYPOTHETICAL: NO iv) ANTI-SENSE: NO v) FRAGMENT TYPE: vi) ORIGINAL SOURCE: vii) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO.5: R712; pCMV-HBV/GFP3.2 Full Sequences 7991 bp ms-DNA circular From HBV-ayw # 1 ; #1820 of HBV-ayw (accession number J02203) transcription start site of HBV pregenomic RNA # 1 - 1355, 2071 - 3339 ; HBV-ayw -. 178 bp overlapping the HBV genome-length -. HBV bases 1353 - 1362, 2079-2805 in pCMV-HBV30 were deleted # 1353 - 2071 ; Green Fluorescent Protein Sequences # From HBV gene 5'- epsilon secondary structure ; bases 30 - 90 3'- epsilon secondary structure ; bases 3196 - 3256 5'- DR1 ; bases 7 - 17 3'- DR1 ; bases 3173 - 3183 3'- DR2 ; bases 2939 - 2949 Poly A signal ; bases 3265 - 3270 Core ORF ; bases 84 - 632 (exclude stop codon) Polymerase ORF ; is broken S1 ORF ; is broken S2 ORF ; is broken S ORF ; is broken X ORF ; bases 2723 - 3184 (exclude stop codon) From pcDNA1/Amp <<<<<<<< bases 3340 - 7991 Col E1 origin ; bases 5087- 5673 (1-587 of pcDNA1/Amp) M13 origin ; bases 5674 - 6266 Ampicillin gene ; bases 6446 - 7389 CMV promoter ; bases 7390 - 7983 SP6 primer sequence ; bases 3356 - 3374 Splice and polyA ; bases 3375 - 7043 >>>>>>>> <400> aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc tactgttcaa gcctccaagc 60 tgtgccttgg gtggctttgg ggcatggaca tcgaccctta taaagaattt ggagctactg 120 tggagttact ctcgtttttg ccttctgact tctttccttc agtacgagat cttctagata 180 ccgcctcagc tctgtatcgg gaagccttag agtctcctga gcattgttca cctcaccata 240 ctgcactcag gcaagcaatt ctttgctggg gggaactaat gactctagct acctgggtgg 300 gtgttaattt ggaagatcca gcgtctagag acctagtagt cagttatgtc aacactaata 360 tgggcctaaa gttcaggcaa ctcttgtggt ttcacatttc ttgtctcact tttggaagag 420 aaacagttat agagtatttg gtgtctttcg gagtgtggat tcgcactcct ccagcttata 480 gaccaccaaa tgcccctatc ctatcaacac ttccggagac tactgttgtt agacgacgag 540 gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa tcgccgcgtc 600 gcagaagatc tcaatctcgg gaatctcaat gttagtattc cttggactca taaggtgggg 660 aactttactg ggctttattc ttctactgta cctgtcttta atcctcattg gaaaacacca 720 tcttttccta atatacattt acaccaagac attatcaaaa aatgtgaaca gtttgtaggc 780 ccactcacag ttaatgagaa aagaagattg caattgatta tgcctgccag gttttatcca 840 aaggttacca aatatttacc attggataag ggtattaaac cttattatcc agaacatcta 900 gttaatcatt acttccaaac tagacactat ttacacactc tatggaaggc gggtatatta 960 tataagagag aaacaacaca tagcgcctca ttttgtgggt caccatattc ttgggaacaa 1020 gatctacagc atggggcaga atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca 1080 ccagttggat ccagccttca gagcaaacac cgcaaatcca gattgggact tcaatcccaa 1140 caaggacacc tggccagacg ccaacaaggt aggagctgga gcattcgggc tgggtttcac 1200 cccaccgcac ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tacaaacttt 1260 gccagcaaat ccgcctcctg cctccaccaa tcgccagtca ggaaggcagc ctaccccgct 1320 gtctccacct ttgagaaaca ctcatcctca ggagatgagt aaaggagaag aacttttcac 1380 tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt 1440 cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac 1500 tactggaaaa ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttctctt atggtgttca 1560 atgcttttca agatacccag atcatatgaa acagcatgac tttttcaaga gtgccatgcc 1620 cgaaggttat gtacaggaaa gaactatatt tttcaaagat gacgggaact acaagacacg 1680 tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct tgttaataga atcgagttaa aaggtattga 1740 ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca caaattggaa tacaactata actcacacaa 1800 tgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gttaacttca aaattagaca 1860 caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg 1920 cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc acacaatctg ccctttcgaa 1980 agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgtaacag ctgctgggat 2040 tacacatggc atggatgaac tatacaaata aggaattctt cagttatatg gatgatgtgg 2100 tattgggggc caagtctgta cagcatcttg agtccctttt taccgctgtt accaattttc 2160 ttttgtcttt gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa gagatggggt tactctctaa 2220 attttatggg ttatgtcatt ggatgttatg ggtccttgcc acaagaacac atcatacaaa 2280 aaatcaaaga atgttttaga aaacttccta ttaacaggcc tattgattgg aaagtatgtc 2340 aacgaattgt gggtcttttg ggttttgctg ccccttttac acaatgtggt tatcctgcgt 2400 tgatgccttt gtatgcatgt attcaatcta agcaggcttt cactttctcg ccaacttaca 2460 aggcctttct gtgtaaacaa tacctgaacc tttaccccgt tgcccggcaa cggccaggtc 2520 tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cttggtcatg ggccatcagc 2580 gcatgcgtgg aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt 2640 gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac tgataactct gttgtcctat 2700 cccgcaaata tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg 2760 ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc ggacgaccct tctcggggtc 2820 gcttgggact ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg accgaccacg gggcgcacct 2880 ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt 2940 cacctctgca cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caaatattgc ccaaggtctt 3000 acataagagg actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa 3060 agactgtttg tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggttaa aggtctttgt 3120 actaggaggc tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca ccatgcaact ttttcacctc 3180 tgcctaatca tctcttgttc atgtcctact gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg 3240 ctttggggca tggacatcga cccttataaa gaatttggag ctactgtgga gttactctcg 3300 tttttgcctt ctgacttctt tccttcagta cgagatcttc tagagggccc tattctatag 3360 tgtcacctaa atgctagagg atctttgtga aggaacctta cttctgtggt gtgacataat 3420 tggacaaact acctacagag atttaaagct ctaaggtaaa tataaaattt ttaagtgtat 3480 aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt gtgtatttta gattccaacc tatggaactg 3540 atgaatggga gcagtggtgg aatgccttta atgaggaaaa cctgttttgc tcagaagaaa 3600 tgccatctag tgatgatgag gctactgctg actctcaaca ttctactcct ccaaaaaaga 3660 agagaaaggt agaagacccc aaggactttc cttcagaatt gctaagtttt ttgagtcatg 3720 ctgtgtttag taatagaact cttgcttgct ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg 3780 cactgctata caagaaaatt atggaaaaat atttgatgta tagtgccttg actagagatc 3840 ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc 3900 cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct 3960 tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 4020 ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcatc 4080 ccgccatggt atcaacgcca tatttctatt tacagtaggg acctcttcgt tgtgtaggta 4140 ccgctgtatt cctagggaaa tagtagaggc accttgaact gtctgcatca gccatatagc 4200 ccccgctgtt cgacttacaa acacaggcac agtactgaca aacccataca cctcctctga 4260 aatacccata gttgctaggg ctgtctccga actcattaca ccctccaaag tcagagctgt 4320 aatttcgcca tcaagggcag cgagggcttc tccagataaa atagcttctg ccgagagtcc 4380 cgtaagggta gacacttcag ctaatccctc gatgaggtct actagaatag tcagtgcggc 4440 tcccattttg aaaattcact tacttgatca gcttcagaag atggcggagg gcctccaaca 4500 cagtaatttt cctcccgact cttaaaatag aaaatgtcaa gtcagttaag caggaagtgg 4560 actaactgac gcagctggcc gtgcgacatc ctcttttaat tagttgctag gcaacgccct 4620 ccagagggcg tgtggttttg caagaggaag caaaagcctc tccacccagg cctagaatgt 4680 ttccacccaa tcattactat gacaacagct gtttttttta gtattaagca gaggccgggg 4740 acccctgggc cggcccgctt actctggaga aaaagaagag aggcattgta gaggcttcca 4800 gaggcaactt gtcaaaacag gactgcttct atttctgtca cactgtctgg ccctgtcaca 4860 aggtccagca cctccatacc ccctttaata agcagtttgg gaacgggtgc gggtcttact 4920 ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 4980 atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 5040 tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc taattcggcg taatctgctg 5100 cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 5160 aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 5220 agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 5280 tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 5340 ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 5400 cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagca 5460 ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 5520 ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 5580 tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 5640 gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc aagctagctt ctagctagaa attgtaaacg 5700 ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat 5760 aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gcccgagata gggttgagtg 5820 ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc 5880 gaaaaaccgt ctatcagggc gatggccgcc cactacgtga accatcaccc aaatcaagtt 5940 ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta 6000 gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag 6060 cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg 6120 cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgagacc gtataacgtg 6180 ctttcctcgt tggaatcaga gcgggagcta aacaggaggc cgattaaagg gattttagac 6240 aggaacggta cgccagctgg attaccaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt 6300 aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 6360 ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 6420 taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 6480 cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 6540 acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 6600 ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 6660 atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa 6720 gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 6780 acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 6840 atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 6900 accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 6960 ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc aatggcaaca 7020 acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 7080 gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 7140 tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 7200 ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 7260 actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 7320 taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 7380 tttctctagc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 7440 cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 7500 ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 7560 taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc 7620 acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 7680 gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 7740 agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 7800 atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 7860 atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 7920 ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 7980 tctggctaac t 7991

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１：Ｂ型肝炎ウイルスのプリゲノミックＲ
ＮＡを図式化した図であり、次のcis-elementが示され
ている：ＤＲ１(direct repeat １)、ＤＲ２(direct re
peat ２)、epsilon(encapsidation signal)、ｒ(repea
t)element、ＰＲＥ(posttranscriptional RNA processi
ng element)。さらに、四つのＯＲＦを矢印状ボックス
図で示している：Ｃ(core)ＯＲＦ、Ｐ(polymerase)ＯＲ
Ｆ、Ｓ(surface antigen)、and Ｘ ＯＲＦ。

【図２】 図２：Ｂ型肝炎ウイルスの肝炎周期を示す。

【図３】 図３：ウイルスのポリメラーゼがプリゲノミ
ックＲＮＡを鋳型にし、逆転写過程を介してＢ型肝炎ウ
イルスの遺伝子複製過程が図式化されている。

【図４】 図４：異種遺伝子(ＧＦＰ)が挿入されたＨＢ
Ｖ組換ベクターの細胞内での作用を要約した図で、ＨＢ
Ｖ組換ウイルスの複製に必要なウイルスタンパク質が提
供されるpackaging cell lineにトランスフェクション
させ、細胞内核でＣＣＣ(covalently closed circular)
形態のＤＮＡに復旧され、野生形と同じく異種遺伝子を
有するＨＢＶ組換ベクターでの異種遺伝子発現過程を図
式化した図である。packaging cell lineはヘルパープ
ラスミドに代置することができる。

【図５】 図５ａ：Ｒ015プラスミド(Ｂ型肝炎ウイルス
のプリゲノミックＲＮＡを発現するプラスミド)を製造
するための図式である。

【図６】 図５ｂ：Ｒ015プラスミド(Ｂ型肝炎ウイルス
のプリゲノミックＲＮＡを発現するプラスミド)を表
す。

【図７】 図６：Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子中シス−エ
レメントを解明するため製作した欠損変異体の欠損位置
を要約した図であり、欠損部位を太い線で表示。左下の
挿入された図はＤＲ２、ＤＲ１部位の拡大図である。

【図８】 図７：Ｂ型肝炎ウイルス欠損変異体の複製の
可否をＨＢＶプローブ(probe)にサーザンブロットした
結果であり、ここでＲＣ(relaxed circularＤＮＡ)、Ｄ
Ｌ(double-stranded linear ＤＮＡ)、ＳＳ(single-str
anded ＤＮＡ)は、それぞれＨＢＶ遺伝子複製の中間
体。

【図９】 図８：プロトタイプのＨＢＶ組換ベクターの
地図で、Ｂ型肝炎ウイルスの複製に必要な新しいシス−
エレメント(アルファとベータ)と、異種遺伝子の挿入可
能部位と挿入可能遺伝子の大きさを図式化したものであ
る。

【図１０】 図９：異種遺伝子(ＧＦＰ；green floures
cence protein)が挿入されたＨＢＶ組換ベクター(Ｒ711
プラスミド)を製造するための過程を示す図式図であ
る。

【図１１】 図１０：シス−エレメントを含む異種遺伝
子で緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ；green flourescence
protein)が挿入されたＨＢＶ組換ベクター(Ｒ711プラス
ミドとＲ712プラスミド)の図式図。Ｒ711プラスミド
は、野生型より約0.6K bp小さい遺伝子を有する組換Ｈ
ＢＶを生産することになり、Ｒ712プラスミドは、野生
型と同じ大きさの遺伝子を有する組換ＨＢＶを生産する
ことになる。

【図１２】 図１１ａ：異種遺伝子に緑色蛍光タンパク
質(ＧＦＰ)が挿入されたＨＢＶ組換ベクターＲ711(ｐＣ
ＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ)の複製の可否をＨＢＶプローブ
で確認したサーザンブロットの結果であり、ここでＲＣ
(relaxed circular ＤＮＡ)、ＤＬ(double-stranded li
near ＤＮＡ)、ＳＳ(single-strandedＤＮＡ)は、それ
ぞれＨＢＶ遺伝子複製の中間体である。

【図１３】 図１１ｂ：緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)が
挿入されたＨＢＶ組換ベクターＲ711(ｐＣＭＶ−ＨＢＶ
／ＧＦＰ)の複製の可否をＧＦＰプローブで確認したサ
ーザンブロットの結果であり、ここでＲＣ(relaxed cir
cular ＤＮＡ)、ＤＬ(double-stranded linear ＤＮ
Ａ)、ＳＳ(single-stranded ＤＮＡ)は、それぞれＨＢ
Ｖ遺伝子複製の中間体である。

フロントページの続き (72)発明者 李 濟漢 大韓民国京幾道高陽市一山区 カンソン・ マウル108−1404 (72)発明者 ▲ちょ▼ 雨永 大韓民国ソウル市江南区三成洞123−13 (72)発明者 尹 桂順 大韓民国京幾道城南市盆唐区九美洞 ロッ テ祥京アパートメント405−402 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA17 4B065 AA96X AB01 BA02 CA23 CA44 4C084 AA07 AA13 CA53 MA02 MA66 NA14 ZB331 4C087 AA01 AA02 AA03 BB64 BB65 CA12 MA66 NA14 ZB33

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＢＶゲノム複製に必須の新規２種類の
   シス−エレメントである、配列番号１のアルファ−エレ
   メント(nt．2818-3052)、及び配列番号２のベータ(β)
   −エレメント(nt．1607-1804)配列を含む、プロトタイ
   プのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
2. 【請求項２】 前記のベクターが、５'位置から３'位置
   方向に、サイトメガロウイルスの初期プロモーター(imm
   ediate early promoter)、ＤＲ１エレメント、エプシロ
   ンエレメント(epsilon，nt．1849-1909)、請求項１に記
   載のアルファ−エレメント(nt．2818-3052)、ＤＲ２エ
   レメント、請求項１に記載のベータ−エレメント(nt．1
   607-1804)、ＤＲ１エレメントを含む、配列番号３の請
   求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミ
   ドベクター。
3. 【請求項３】 前記エプシロン(nt．1849-1909)と前記
   アルファ−エレメント(nt．2818-3052)の間に外来遺伝
   子の挿入部位を有する、請求項２記載のプロトタイプの
   Ｂ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
4. 【請求項４】 前記アルファ−エレメント(nt．2818-30
   52)と前記ＤＲ２(nt．1592-1602)の間に外来遺伝子の挿
   入部位を有する、請求項２記載のプロトタイプのＢ型肝
   炎ウイルスプラスミドベクター。
5. 【請求項５】 前記ベクターが、さらにＨＢＶ遺伝子中
   内在性ウイルスプロモーターを用いる、請求項２記載の
   プロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
6. 【請求項６】 前記ベクターが、ＨＢＶ遺伝子中内在性
   ウイルスプロモーターの中のコアプロモーターとプリＳ
   ２／Ｓプロモーターをそれぞれ選択して用いる、請求項
   ２記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベ
   クター。
7. 【請求項７】 前記ベクターが、野生型3.2Ｋ bp ＨＢ
   Ｖゲノムの大きさを超えることなく、エプシロンエレメ
   ントとアルファエレメントの間に0.90Ｋ bpまでの塩基
   配列を挿入できる、請求項２記載のプロトタイプのＢ型
   肝炎ウイルスプラスミドベクター。
8. 【請求項８】 前記ベクターが、野生型3.2Ｋ bp ＨＢ
   Ｖゲノムの大きさを超えることなく、アルファエレメン
   トとＤＲ２エレメントの間に1.7Ｋ bpまでの塩基配列を
   挿入できる、請求項２記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウ
   イルスプラスミドベクター。
9. 【請求項９】 前記ベクターが、複製に必須のコアタン
   パク質、またはポリメラーゼ遺伝子が欠け複製不能(rep
   lication-defective)である、請求項２記載のプロトタ
   イプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
10. 【請求項１０】 前記ベクターが、少なくとも一つの異
    種遺伝子(heterologous gene)を発現することができる
    異種塩基配列を含む、請求項２記載のプロトタイプのＢ
    型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
11. 【請求項１１】 Ｂ型肝炎ウイルスのキャプシド化に必
    須の“エプシロン”エレメントが欠け複製することがで
    きないが、Ｂ型肝炎ウイルスのタンパク質を発現し、組
    換ＨＢＶベクターにウイルス遺伝子複製に必要なタンパ
    ク質(trans-acting factors)を発現するヘルパープラス
    ミド(helper plasmid)。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の組換ＨＢＶベクタ
    ーと、請求項１１に記載のヘルパープラスミドを肝細胞
    株に共にトランスフェクションして組換ＨＢＶ粒子を作
    ることができる方法であって：前記で請求項１０に記載
    の組換ＨＢＶベクターが、ウイルス遺伝子複製に必須の
    シス−エレメントを含み、少なくとも一つの遺伝子治療
    用異種遺伝子を発現することができ、さらに、ウイルス
    遺伝子複製に必要なウイルス遺伝子中少なくとも一種を
    発現することができず、請求項１１に記載のヘルパープ
    ラスミド(helper plasmid or packaging plasmid)が、
    ウイルス遺伝子複製に必要なタンパク質(trans-acting
    factors)中少なくとも一種を発現することができない組
    換ＨＢＶベクターにこの欠乏したタンパク質を提供し、
    組換ＨＢＶベクターを補って(complementation)感染性
    のあるウイルスを生産できなければならず、前記肝細胞
    株は、複製に必要なタンパク質(trans-acting factors)
    が提供されると組換ＨＢＶベクターが複製できる肝細胞
    株であることを特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 前記肝細胞が人間の肝細胞、鳥類の肝
    細胞、げっ歯類の肝細胞からなる群から選択される、請
    求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記組換ＨＢＶ粒子を血管内、又は肝
    組織内投与方法で標的細胞に感染させる、請求項１２記
    載の方法。
15. 【請求項１５】 前記標的細胞の集団が人間の肝細胞を
    含む、請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記で言及した挿入できる外部遺伝子
    が、多様な遺伝子に対するアンチセンス遺伝子とリボザ
    イムを含み、特にＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルス
    のアンチセンス遺伝子とリボザイムを作る遺伝子を含
    み、さらに、多様な癌抑制遺伝子、成長因子、ホルモ
    ン、サイトカイン、細胞膜受容体(cellular receptor
    s)、血液凝固因子をコードする異種遺伝子を含む、請求
    項１４記載の方法。
17. 【請求項１７】 ＨＢＶに慢性感染した患者の肝組織内
    に、直接前記組換ＨＢＶベクターＤＮＡを投与すること
    を含む、組換ＨＢＶ粒子を標的細胞に感染させる方法。
18. 【請求項１８】 標的細胞の集団が、人間の肝細胞を含
    む、請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 前記で言及した挿入できる外部遺伝子
    が、多様な遺伝子に対するアンチセンス遺伝子とリボザ
    イムを含み、特にＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルス
    のアンチセンス遺伝子とリボザイムを作る遺伝子を含
    み、さらに、多様な癌抑制遺伝子、成長因子、ホルモ
    ン、サイトカイン、細胞膜受容体(cellular receptor
    s)、血液凝固因子をコードする異種遺伝子を含む、請求
    項１７記載の方法。