CN101849013A - 猫抗原的浣熊痘病毒表达基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含两种或更多种外源性核酸分子的新重组浣熊痘病毒载体，每种核酸分子编码至少一种猫蛋白，其中将所述核酸分子中的至少两种插入血凝素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座中，或将所述核酸分子中的至少一种插入血凝素和胸苷激酶基因座的每一者中。本文阐述单价和多价重组猫疫苗，其包含免疫有效量的重组浣熊痘病毒载体和任选地适宜载剂或稀释剂。本发明疫苗任选地包括额外猫抗原以向猫类提供针对多种猫病原体的广谱保护。本发明另外涉及通过投与重组疫苗在猫中诱导针对猫病原体的保护性免疫应答的方法。

Description

猫抗原的浣熊痘病毒表达基因
技术领域
本发明涉及表达多个猫抗原基因的新重组浣熊痘病毒载体，以及所述载体在预防猫病原体引发的感染或疾病的多价疫苗中的用途。
背景技术
多种猫传染病具有地方性并且在有多只猫的环境中会造成灾难性情况，尤其在动物医院、育猫室和(程度较低)动物收容所中。两种对猫的健康具有重要影响的病原体始终是猫杯状病毒(FCV)和猫病毒性鼻气管炎病毒(FVR)，这是因为FVR和FCV几乎占所有猫呼吸道感染的90％。通常，FCV感染通过影响上呼吸道以及间或导致关节疼痛和跛足来表现与病毒性鼻气管炎(FVR)类似的体征。另外，受感染猫会在舌上和口腔内区域出现溃疡。鼻道、硬腭和舌经常出现水泡和糜烂。FCV疾病的其它症状包括高烧、脱毛、四肢或脸周围皮肤溃疡和水肿(肿胀)。根据感染株系的毒力，FCV感染可能会致死。主要传播方法是通过经口感染途径，但猫可因吸入存于受感染猫的唾液、粪便或尿液中的感染性病毒而被感染。FCV具有高传染性；受感染猫在感染后可在长时间内继续散布病毒，并且痊愈的猫可能会成为感染性病毒的终生载体。无症状猫可能甚至会向其它健康猫传播致死疾病。南加州和新英格兰已报道了最近两种遗传上不同的高毒性、出血性杯状病毒株系的爆发，其尤其对动物收容所中的猫种群具有致死性，分别将其命名为FCV-Ari和FCV-Diva(N.C.彼得逊(N.C.Pedersen)等人，“猫中由新颖高毒性猫杯状病毒株系引发的已分离出血样发烧动物流行病(An isolatedepizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain offeline calicivirus)”，兽医微生物学(Veterinary Microbiol.)73：281-300(May 2000)；E.M.肖尔-伊文恩(E.M.Schorr-Evans)等人，“在新英格兰医院环境中高毒性猫杯状病毒疾病的动物流行病(An epizootic of highly virulent feline calicivirus disease in a hospital settingin New England)”，猫医学和外科学杂志(Journal of Feline Medicine and Surgery)5：217-226(2003))。
猫病毒性鼻气管炎病毒(FVR)是疱疹病毒科(Herpesviridae)的猫疱疹病毒1(FHV-1)。FVR在世界范围内存于家猫和野猫中，其引发猫的感染性急性上呼吸道感染，其特征在于鼻炎(鼻子炎症)、发烧、结膜炎(眼睑衬膜炎症)、流鼻涕和眼黏分泌物以及打喷嚏。病毒也影响生殖道并且可在妊娠期间引发并发症。病毒性疾病通常称作鼻气管炎(或猫疱疹病毒感染)，但一般也称作猫流感或猫鼻炎。猫的FVR呼吸道疾病具有高传染性并且可能很严重，尤其是在育猫室中。所有猫科(Felidae)动物都对FVR敏感，同时幼猫和老猫对FVR引发的严重疾病更敏感，包括肺炎导致的死亡。人们已发现诸如暹罗猫(Siamese)和缅甸猫(Burmese)等某些品种受FVR影响比其它品种更严重。
除FCV外，FVR引发的鼻气管炎是猫上呼吸道感染或疾病综合症的一部分，其是一类病毒性和细菌性感染，可引发打喷嚏以及流鼻涕和眼黏分泌物。猫经常同时罹患两种或更多种上呼吸道感染。尽管FCV和FVR(FHV-1)引发两种最常见的感染，但呼吸道疾病综合症通常也包括衣原体病。
猫衣原体病是由在世界范围内传播的病原体猫披衣菌(Chlamydophila felis)(通常称作猫鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci))所引发。有时称作鹦鹉热衣原体猫肺炎因子的细菌病原体是猫结膜炎以及肺炎(pneumonia)(肺炎(pneumonitis))的致病因子。即使主要临床症状通常为结膜炎，病猫也可发生轻微地打喷嚏和流鼻涕。有时，感染猫披衣菌的猫会出现轻微发烧，从而导致嗜睡和食欲下降，但通常其在初期表现正常。然而，若将其置之不理，结膜炎一般会持续八周或更久，并且猫会在几个月内散布生物体。然后感染会发展成更严重的肺炎情况。
在猫中引发传染性致死感染的另一种严重病原体是猫白血病病毒(FeLV)。感染FeLV是家猫致死性疾病常见并且主要的病因，其对猫死亡的责任大于其它任何传染病。在感染所述病毒后，猫可能在数月或甚至数年内都不开始表现疾病体征。一旦猫持续地(持久地)受到FeLV感染，则其发生严重贫血和癌症疾病的危险相当高。由RNA构成并且与猫免疫缺陷病毒(FIV)相关的雌性反转录病毒FeLV是猫白血病(癌性疾病)、免疫缺陷和其它癌症的致病因子。约80-90％的病猫在经诊断患有FeLV感染后的三年半内死亡。通常，FeLV感染导致免疫抑制，其中病毒侵袭免疫系统细胞。通过杀灭或损坏白细胞，所述病毒使猫对众多种其它疾病和继发感染敏感。FeLV感染不具有高传染性，相反，病毒的传播依赖于猫(例如育猫室、动物收容所、多猫家庭和猫群密集城市的猫)的长时间密切接触，其中病毒感染可感染最多30％的猫。
因此，FVR和FCV占所有猫呼吸道疾病的绝大多数；FVR、FCV和猫衣原体病通常作为称为猫上呼吸道疾病综合症的群组感染同一只猫；并且FeLV感染经常是致死的。可在猫中防止这些严重感染或致死性疾病状态的有效组合疫苗的研发对兽医学领域具有重大意义。
过去，人们已阐述单价疫苗并且使用诸如以下等多种抗原制造了数种单价疫苗来防止猫疾病：猫杯状病毒F9株系(美国专利第3,944,469号)、猫鹦鹉热衣原体(美国专利第5,972,350号和第5,242,686号)、猫白血病病毒(美国专利第4,264,587号)和诸如此类。先前也已分离出诸如FCV-M8和FCV-255以及猫鼻气管炎病毒等其它杯状病毒株系并且阐述其可用于疫苗应用(E.V.戴维斯(E.V.Davis)等人，“对鼻内猫鼻气管炎-杯状病毒疫苗的安全性和有效性的研究(Studies on the safety and efficacy of anintranasal feline rhinotracheitis-calici virus vaccine)”，VM-SA C 71：1405-1410(1976)；D.E.卡恩(D.E.Kahn)等人，“针对猫杯状病毒性疾病的免疫的诱导(Induction of immunity tofeline caliciviral disease)”，感染免疫学(Infect.Immun.)11：1003-1009(1975)；D.E.卡恩，“猫病毒：猫中微小核糖核酸病毒感染的发病机制(Feline viruses：pathogenesis ofpicornavirus infection in the cat)”，美国兽医学研究杂志(Am.J.Vet.Research)32：521-531(1971))。美国专利第6,231,863号阐述FCV-2280株系基因组的核苷酸序列和防止猫杯状病毒疾病的使用衣壳基因核苷酸序列的疫苗。美国专利第5,106,619号揭示尤其包括猫杯状病毒的灭活病毒疫苗的制备。美国专利第6,051,239号揭示使用经修饰肉毒菌毒素以及诸如杯状病毒等抗原的口服疫苗。
当然，多价疫苗相对于先前单价疫苗的优势在于能对猫实施接种以抵抗众多类病原体，其对猫的创伤性较低并且猫处理者或兽医更易操作。因此人们已制备或阐述含有多种抗原(例如猫披衣菌(通常称作猫鹦鹉热衣原体))以及一或多种病原体(包含猫白血病病毒、猫泛白细胞减少病毒、猫杯状病毒、猫鼻气管炎病毒、猫获得性免疫缺陷病毒、狂犬病、猫感染性腹膜炎、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和诸如此类)的多价疫苗(美国专利第6,004,563号)。类似地已揭示理查德(Rickard)分离猫白血病病毒、猫鼻气管炎病毒、猫杯状病毒与猫泛白血病病毒的混合物可作为疫苗(美国专利第5,374,424号)。
不幸的是，含有猫杯状病毒已使用株系的先前疫苗皆不足以防止猫感染出血性猫杯状病毒株系。在最近出血性猫杯状病毒的爆发中，尽管事实上许多猫已接受了针对杯状病毒的疫苗接种，但仍有大量猫死亡。此外，猫的疫苗接种本身存在独特的困难：猫有时对某些病原体有特质性反应并且对典型可注射调配物存在肉瘤诱导副作用，因此需要添加佐剂以对接种体产生足够免疫应答。
为改良猫疫苗组合物以使猫获得针对严重猫感染或疾病的免疫，人们已开始努力研究重组技术。至今已公开大量关于以重组浣熊痘病毒作为疫苗的主题的资讯。然而，发现并研发可成功并充分地表达抗原蛋白以在猫中获得足够免疫应答同时不需要引入佐剂的实用性多价重组疫苗是一个很复杂的任务。
例如，美国专利第6,241,989号和其接续美国专利第7,087,234号涉及多价重组浣熊痘病毒，其含有一种以上插入胸苷激酶基因或血凝素基因中的外源基因。在所述两个相关专利中揭示多价重组浣熊痘病毒作为疫苗来赋予猫抵抗随后猫病原体攻击的免疫性的用途。也揭示通过重组方法制造多价重组浣熊痘病毒的方法，所述重组方法涉及构建插入有外源基因的插入载体；和将可重组至浣熊痘病毒胸苷激酶基因或血凝素基因中的序列置于插入基因的侧翼；将含有外源基因的插入载体与浣熊痘病毒二者引入敏感宿主细胞中；以及自所得噬斑中选择重组浣熊痘病毒。所述专利的多价重组浣熊痘病毒可在猫细胞中感染并复制，并且含有一个以上插入由浣熊痘病毒基因组的血凝素基因或胸苷激酶基因组成的非病毒复制必需区域中的外源基因，并且应注意，其中外源基因可操作连接至表达启动子上；并且每一外源基因皆编码猫病原体抗原。所述专利阐述编码诸如以下等猫病原体抗原的外源基因：猫白血病病毒(FeLV Env)、猫免疫缺陷病毒(FIV Gag)、猫免疫缺陷病毒(FIV Env)、猫感染性脑膜炎病毒(FIPV M)、猫感染性脑膜炎病毒(FIPV N)、猫杯状病毒(FCV衣壳蛋白)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV VP2)和狂犬病-G。
美国专利第6,294,176号涉及由含有外来DNA序列的浣熊痘病毒基因组组成的重组浣熊痘病毒(RCNV)疫苗，所述外来DNA序列插入浣熊痘病毒基因组HindIII“U”基因组区域、HindIII“M”基因组区域或HindIII“N”基因组区域内的非必需区域中。在所述专利中阐述浣熊痘病毒基因组在病毒基因组的浣熊痘病毒宿主范围基因中含有缺失。所述专利通过将外来DNA序列插入浣熊痘病毒基因组中来提供产生重组浣熊痘病毒的同源载体。
美国专利第6,106,841号具体来说涉及使动物针对异源抗原免疫之特征性递送方法。所述方法阐述通过结膜途径向动物投与包含重组浣熊痘病毒的组合物，所述痘病毒具有编码异源抗原的核酸分子。除结膜途径外，所述专利也揭示鼻内疫苗接种投与途径。可由重组浣熊痘病毒来表达并用于所述专利方法中的异源抗原列示如下：杯状病毒、冠状病毒、疱疹病毒、免疫缺陷病毒、感染性腹膜炎病毒、白血病病毒、细小病毒抗原、狂犬病病毒、巴尔通体属(Bartonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、恶丝虫属(Dirofilaria)、弓形虫属(Toxoplasma)、跳蚤抗原或跳蚤过敏原、蠓抗原或过敏原、螨抗原或过敏原和肿瘤抗原。另外，重组浣熊痘病毒可包含编码诸如细胞因子、趋化因子和其它免疫调节剂等免疫调节剂的核酸分子；然而，关于如何生成此一构建体没有具体实例。此外，由于专利所有人在其所主张方法的范例中仅使用先前构建体，因此尚未揭示如何制造任何编码异源抗原的新重组浣熊痘病毒。其中一次提及已知RCNV/PLA2痘病毒，其中至少一种核酸分子编码恶丝虫PLA2抗原；并且工作实例仅阐述鼻内和/或结膜投与表达狂犬病糖蛋白G(gG)蛋白(即RCNV/狂犬病gG(RCN/G))的已知重组浣熊痘病毒。应注意，已知RCNV/狂犬病gG构建体是通过在病毒胸苷激酶基因内插入编码狂犬病糖蛋白G蛋白并且可操作连接至痘病毒p11启动子上的异源核酸分子来制备。所述专利未阐述或建议制造重组浣熊痘病毒的任何其它新颖形式。
美国专利第6,010,703号涉及针对猫疱疹病毒(FHV-1)的重组痘病毒疫苗，其向猫提供针对FHV-1的免疫并且可用于在猫中抑制猫病毒性鼻气管炎(FVR)的方法中。所述专利阐述重组浣熊痘病毒含有或表达编码猫疱疹病毒gD糖蛋白前体多肽的基因或编码gB前体肽的基因，其中将所述基因插入或克隆至痘病毒-胸苷激酶供体质粒中。其中阐述仅表达FHV-1gB或FHV-1gD的浣熊痘重组二者皆可诱导抵抗疾病临床体征的保护。
人们已以类似方式使用其它重组技术来表达单一猫抗原，例如猫免疫缺陷病毒(FIV)或猫感染性腹膜炎病毒(FIPV)。例如，美国专利第5,989,562号涉及可用于预防猫免疫缺陷病毒(FIV)所引发疾病的疫苗的重组浣熊痘病毒。根据专利的揭示内容，重组浣熊痘病毒中至少一种内部基因包含编码猫免疫缺陷病毒(FIV)FIV gag蛋白(gag)、FIV包膜蛋白(env)、由FIV env的氨基酸1-735组成的多肽、或其免疫原性片段的DNA序列。包含一或多种其中所述FIV表达重组浣熊痘病毒的疫苗也可包含医药上可接受的载剂或稀释剂和医药上可接受的佐剂。美国专利第5,989,562号也提供防止或减轻由FIV引发的疾病的方法，其是通过向需要此治疗的猫投与上述疫苗来实施。将FIV gag或env基因纳入痘病毒DNA中仅伴随有对病毒胸苷激酶基因的破坏。
类似地，美国专利第5,820,869号涉及重组浣熊痘病毒，其表达猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白并且可单独地或与载剂和佐剂组合用作疫苗。更具体来说，所述专利阐述重组浣熊痘病毒中至少一种内部基因包含编码FIV包膜蛋白或其免疫原性片段的DNA序列。
美国专利第5,770,211号揭示重组浣熊痘病毒，其表达猫感染性腹膜炎病毒(FIPV)的核衣壳和跨膜蛋白。所述专利中具体来说阐述和主张至少一种内部基因包含编码FIPV跨膜(M/E1)蛋白的DNA序列的重组浣熊痘病毒。
美国专利第5,656,275号也揭示重组浣熊痘病毒，其表达猫感染性腹膜炎病毒(FIPV)的核衣壳和跨膜蛋白。所述专利中具体来说阐述和主张至少一种内部基因包含编码FIPV核衣壳(N)蛋白的DNA序列的重组浣熊痘病毒。
美国专利第5,505,941涉及在哺乳动物或鸟类宿主中通过以下方式诱导针对病原体的免疫应答的方法：用通过在鸟痘基因组非必需区域中引入编码并表达病原体抗原的任一来源DNA修饰的合成重组鸟痘病毒(例如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒)接种所述哺乳动物或鸟类宿主。所述专利鉴别选自由以下组成的群组的抗原：狂犬病G抗原、牛白血病病毒的gp51，30包膜抗原、猫白血病病毒的FeLV包膜抗原和单纯疱疹病毒的糖蛋白D抗原。具体来说，所述专利展示表达猫白血病病毒(FeLV)糖蛋白包膜(env)的鸟痘病毒重组的构建，其中FeLV env基因含有编码p70+p15E聚蛋白的序列。将此基因插入具有5′与FeLV env基因并置的牛痘H6启动子的质粒中，其中所述质粒是通过首先将含有牛痘血凝素(ha)基因的1802 bp Sal I/Hind III片段插入pUC18载体中而获得。
尽管兽医疫苗领域已实施了所有这些努力，但业内明确公认仍需要提供安全有效的组合疫苗以赋予猫针对多种猫抗原的足够保护性免疫应答。由于在动物收容所、多猫家庭和类似场所流行高毒性、出血性猫杯状病毒感染，所以业内公认还需要提供广谱病毒疫苗以针对由出血性和一般FCV株系引发的严重感染和疾病来保护猫。业内公认还需要制造能激发针对FCV的毒性、出血性株系和其它猫病原体的特异性免疫应答的多价疫苗以防止猫罹患急慢性病毒或细菌性疾病。本发明猫多价疫苗通过以独特方式获得极佳抗体效价和通过至少六种不同重组构建体部分的新颖组合使得可达成广谱免疫来解决业内存在的技术性难题。
上述目标是通过提供本文所述安全有效重组猫组合(comb)(组合(combination))疫苗来达成，其中所述疫苗在猫中不添加佐剂即可激发针对多种猫抗原的保护性免疫应答。
本说明书中所引用的所有专利和出版物都是全文以引用方式并入本文中。
发明内容
本发明在其最广泛方面中提供安全有效并且不含佐剂的重组猫疫苗，其可用作单价或多价疫苗，并且使用浣熊痘病毒作为载体于浣熊痘病毒基因组的血凝素(ha)和/或胸苷激酶(tk)插入基因座处表达多种猫病毒、细菌和细胞因子抗原。新颖浣熊痘病毒载体优先设计为具有至少一种插入浣熊痘病毒基因组血凝素基因座或胸苷激酶基因座的核酸分子；至少两个插入浣熊痘病毒基因组血凝素基因座或胸苷激酶基因座的核酸分子，或另一选择为至少一种插入血凝素基因座的核酸分子以及并行地至少一种插入浣熊痘病毒基因组胸苷激酶基因座的核酸分子。具体来说，所述构建体表达编码猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白、猫病毒性鼻气管炎病毒(FVR)糖蛋白D/B(gD/gB)、猫鹦鹉热衣原体(FCP，现在一般称作猫披衣菌)外膜蛋白(momp)、猫白血病病毒(FeLV)gag-pr65-pro/env-gp70/env-gp85和猫白介素-12(IL-12)P35/P40的核酸分子或基因，后一组份猫白介素-12(IL-12)P35/P40是作为免疫调节剂而引入以增强组合疫苗在猫中的免疫原性。本发明单价和多价重组猫疫苗包含免疫有效量的重组浣熊痘病毒载体和任选地适宜载剂或稀释剂。有利地，组合疫苗调配物不需要佐剂来增强宿主免疫应答，由此可避免某些传统可注射疫苗偶然出现的佐剂相关肉瘤副作用。本发明疫苗任选地包括一或多种额外猫抗原以向猫提供针对多种猫病原体的广谱保护。本发明另外涉及通过投与重组疫苗在猫中诱导针对猫病原体的保护性免疫应答的方法。
因此，第一方面提供包含两种或更多种外源性同源核酸分子的重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，每种核酸分子编码至少一种来自同一猫病原体的两种或更多种不同株系的猫蛋白，其中将至少两种核酸分子插入血凝素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座中，或将至少一种核酸分子插入血凝素和胸苷激酶基因座的每一者中。当将两种外源性核酸插入同一基因座时，其可邻接或其可由间插序列来分隔。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫病毒/细菌性抗原或蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的任一非必需位点中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫病毒/细菌性抗原或蛋白的核酸分子，除将其插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶和血凝素基因座中外，也将其插入浣熊痘病毒基因组的第三非必需位点中。
在一实施例中，浣熊痘病毒基因组的第三非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。
在一实施例中，浣熊痘病毒是活病毒并且可复制。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体包含编码猫杯状病毒衣壳蛋白的核酸分子。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体包含编码猫杯状病毒FCV-2280衣壳蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的血凝素或胸苷激酶基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体包含FCV-2280衣壳基因的核苷酸序列，其可操作连接至表达用牛痘病毒晚期启动子P11或早-晚期启动子上，所述启动子可为表达用合成早-晚期启动子。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫杯状病毒FCV-DD1衣壳蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含FCV-2280衣壳基因的核苷酸序列，其可操作连接至表达用牛痘病毒晚期启动子上，并且FCV-DD1衣壳基因的核苷酸序列可操作连接至表达用早-晚期启动子上，所述启动子可为表达用合成早-晚期启动子。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫杯状病毒FCV-255衣壳蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫病毒性鼻气管炎病毒糖蛋白gD的核酸分子和编码猫病毒性鼻气管炎病毒糖蛋白gB的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫白血病病毒抗原gag-pr65-pro的核酸分子和编码猫白血病病毒抗原env-gp85的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，浣熊痘病毒载体中编码病毒抗原的核苷酸序列可操作连接至表达用合成早-晚期启动子上。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫白血病病毒抗原gag-pr65-pro的核酸分子、编码猫白血病病毒抗原env-gp70的核酸分子和编码猫白血病病毒抗原env-gp85的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座或胸苷激酶基因座中或同时插入两个基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫披衣菌蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座或血凝素基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫披衣菌外膜蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座或血凝素基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
在一实施例中，猫披衣菌外膜蛋白基因的核苷酸序列可操作连接至表达用牛痘病毒晚期启动子上。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含编码猫白介素-12的P35蛋白的核酸分子和编码猫白介素-12的P40蛋白的核酸分子，将其插入浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座中或浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中，但优选地插入血凝素基因座中。
本发明第二方面提供猫疫苗，其包含免疫有效量的本文所述重组浣熊痘病毒载体和任选地适宜载剂或稀释剂。
在一实施例中，浣熊痘病毒是活病毒并且可复制。
在一实施例中，以单次剂量或重复剂量投与疫苗。
在一实施例中，疫苗不含佐剂。
在一实施例中，本发明提供猫组合疫苗，其包含免疫有效量的两种或更多种本发明重组浣熊痘病毒载体化构建体，其表达猫病毒/细菌性抗原和/或诸如IL-12等细胞因子。组合疫苗的实例包括(但不限于)：(1)rRCNV-猫3(经修饰活FPV、rRCNV-FCV、rRCNV-FVR)；(2)rRCNV-猫4(rRCNV-猫3+rRCNV-FCP)；(3)rRCNV-猫4+rRCNV-FeLV；(4)rRCNV-猫IL-12，可将其作为免疫调节剂调配于每种组合疫苗中。
在一实施例中，疫苗另外包含一或多种选自由以下组成的群组的额外猫抗原的混合物：猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉(Bellingham)、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8和其组合。
在一实施例中，疫苗包含两种或更多种选自由以下组成的群组的重组浣熊痘病毒载体的混合物：rRCNV-FCV2280、rRCNV-FCV2280-FCVDD1、rRCNV-FCV2280-FCVDD1-FCV255、rRCNV-FVR gD/gB、rRCNV-FeLV gag-pr65-pro/env-gp85、rRCNV-FeLV gag-pr65-pro/env-gp70/env-gp85、rRCNV-FCP momp和rRCNV-猫IL-12P35/P40。
在一实施例中，疫苗另外包含一或多种选自由以下组成的群组的额外猫抗原的混合物：猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8和其组合。
本发明第三方面提供在猫中诱导针对猫病原体的保护性免疫应答的方法，其包含向猫投与有效免疫量的至少一种本文所述疫苗。
在一实施例中，通过投与至少约4.5Log10TCID50/ml的有效免疫量的疫苗来诱导保护性免疫应答。
在一实施例中，通过投与介于约4.5Log10TCID50/ml至约7.5Log10TCID50/ml范围内的有效免疫量的疫苗来诱导保护性免疫应答。
在一实施例中，保护性免疫应答是体液或抗体介导应答。
在一实施例中，保护性免疫应答是细胞介导或T细胞介导免疫应答。
本发明第四方面提供一或多种本文所述核酸序列和质粒构建体。
在一实施例中，质粒包含SEQ ID NO：1、2、3或4核苷酸序列中的任一者。
在某些本发明实施例中，编码猫杯状病毒衣壳蛋白的核酸来自诸如FCV-2280或FCV-DD1等特定株系。
在其它实施例中，这些株系中的任一者可经来自另一杯状病毒株系的编码相同或类似蛋白的核酸替代。其它杯状病毒株系会或不会针对FCV-2280或FCV-DD1进行交叉保护。例如，编码FCV-DD1的核酸可由另一超毒性、毒性、出血性或毒性全身性株系来替代，如业内所熟知。例如，参见美国专利第7,029,682号；WO 2005/072214、US 2006/0057159、U.S.6,541,458；U.S.6,534,066和U.S.2004/0259225。
本发明第五方面提供重组浣熊痘病毒载体(RCNV)，其包含：
a)至少一种外源性核酸和至少一种同源外源性核酸，其各自编码来自两种或更多种不同猫病原体株系的相同猫蛋白，其中将所述至少一种同源性核酸插入ha基因座或tk基因座的至少一者中；或
b)至少两种外源性核酸，每种核酸编码至少一种来自相同猫病原体的不同猫蛋白；其中将一种外源性核酸插入ha或tk位点的至少一者中，或其中将至少一种核酸插入ha基因座中并且将至少一种核酸插入tk基因座中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体(RCNV)包含至少两种同源外源性核酸分子，每种核酸分子编码来自两种或更多种不同猫病原体株系的相同猫蛋白，其中将所述同源外源性核酸分子插入ha基因座、tk基因座、丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座中，或其中将至少一种同源外源性核酸分子插入ha、tk或丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座中的每一者中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体另外包含至少两种外源性核酸分子，其中所述至少两种外源性核酸分子中的至少一者编码一种选自由以下组成的群组的不同猫蛋白：猫杯状病毒蛋白、猫鼻气管炎的糖蛋白gB、猫鼻气管炎的糖蛋白gD、猫白血病病毒的gag蛋白、猫白血病病毒的env蛋白、猫披衣菌蛋白、以及猫白介素-12的P35和P40蛋白。
本发明第六方面提供疫苗或免疫原性组合物，其包含上述用于投与猫的任何一或多种重组浣熊痘病毒载体。疫苗可另外包含一或多种选自由以下组成的群组的额外猫抗原的混合物：猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8和其组合。
在一实施例中，可通过向猫投与有效免疫量的所述疫苗使用上述疫苗在猫中诱导针对猫病原体的保护性免疫应答。
在一实施例中，疫苗的有效免疫量为至少约4.5Log10TCID50/ml。
在一实施例中，疫苗的有效免疫量介于约4.5Log10TCID50/ml至约7.5Log10TCID50/ml范围内。
本发明第七方面提供任一本发明载体或疫苗的用途，其用于制备在哺乳动物中单独或与其它猫抗原或蛋白质组合诱导针对猫病原体的保护性免疫应答的药物。
附图说明
图1是pFD2000A-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO：1)
图2是pFD2001TK-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO：2)
图3是pFD2003SEL-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO：3)
图4是pFD2003SEL-GPV-PV-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO：4)
图5是FCP momp-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：5)
图6是FCV255-Bmut-N缺失-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：6)
图7是FCV2280-N-缺失-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：7)
图8是FCVDD1-N缺失-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：8)
图9是猫IL-12p35-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：9)
图10是猫IL-12P40-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：10)
图11是FeLV 61E Env-gp85-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：11)
图12是FeLV 61E gag-pr65-pro-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：12)
图13是FeLV 61E P27-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：13)
图14是FVR-gB-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：14)
图15是FVR-gD-BKXMut-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO：15)
具体实施方式
在阐述本发明方法和治疗方法学之前，应了解本发明并不限于所述特定方法和实验条件，并且所述方法和条件可以改变。也应了解，本文所用术语仅用于阐述特定实施例的目的，而非意欲限制本发明的范围，因为本发明的范围仅受限于随附权利要求书。
除非上下文明确指明其它含义，否则本说明书和随附权利要求书中所用的单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数含义。因此，例如，在提及“所述方法”时包括一或多种方法和/或本文所述类型的步骤，和/或在阅读本揭示内容后所属领域技术人员可了解者等等。
因此，在本申请案中，可使用所属领域技术人员熟知的习用分子生物学、微生物学和重组DNA技术。文献中对所述技术进行了充分阐释。例如，参见伯德，CM(Byrd，CM)和赫鲁比，DE(Hruby，DE)，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，第269卷：牛痘病毒和痘病毒学(Vaccinia Virus and Poxvirology)，第3章，第31-40页；萨姆布鲁克(Sambrook)，弗里茨赫(Fritsch)和玛尼蒂斯(Maniatis)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(1989)，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(本文中“萨姆布鲁克等人，1989”)；DNA克隆：实践方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，第I和II卷(D.N.格洛弗(D.N.Glover)编辑，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.给特(M.J.Gait)编辑，1984)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和S.J.希金斯(S.J.Higgins)编辑，(1985))；转录和转译(Transcription And Translation)(B.D.黑姆斯和S.J.希金斯编辑，(1984))；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.弗莱士尼(R.I.Freshney)编辑，(1986))；固定细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社，(1986))；B.波保(B.Perbal)，分子克隆实践手册(A Practical Guide To MolecularCloning)(1984)；F.M.奥斯贝(F.M.Ausubel)等人(编辑)，分子生物学当前方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，约翰威利父子(John Wiley & Sons)公司(1994)。
尽管本发明的实践或测试可使用任何与本文所述方法和材料类似或等效者，但下文阐述优选方法和材料。本文所提及的所有出版物都是全文以引用方式并入本文中。
定义
本文所用术语具有所属领域技术人员所公认和习知的含义，然而，为方便和完整起见，下文阐述特定术语和其含义。
术语“约”意指在20％内，更优选地在10％内并且更优选地在5％内。
术语“抗原”是指可在动物中刺激抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或免疫原性物质，包括注射或吸收至动物中的组合物。所述术语可用于指单个大分子或指抗原性大分子的均质或异质群。抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应。术语“抗原”广义上涵盖包括蛋白质、多肽、抗原性蛋白片段、核酸、寡糖、多糖、有机或无机化学品或组合物和类似物在内的部分。此外，抗原可得自或获自任何病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌，并且可为完整生物体。术语“抗原”包括所有相关抗原性表位。类似地，所述定义也包括表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸(例如在核酸免疫应用中)。同样包括合成抗原，例如多表位、侧翼表位和其它重组或合成产生抗原(伯格曼(Bergmann)等人(1993)，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)23：2777 2781；伯格曼等人(1996)，免疫学杂志(J.Immunol.)157：3242 3249；苏赫贝尔，A.(Suhrbier，A.)(1997)，免疫学与细胞生物学(Immunol.and Cell Biol.)75：402408；加德纳(Gardner)等人(1998)，第12届世界AIDS会议，日内瓦，瑞士，1998年6月28日至7月3日)。
“由...编码”或“编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列含有具有至少3个至5个氨基酸、更优选地至少8个至10个氨基酸、并且甚至更优选地至少15个至20个氨基酸的氨基酸序列、由核酸序列编码的多肽。也涵盖可视为与所述序列编码的多肽在免疫学上一致的多肽序列。因此，抗原“多肽”、“蛋白质”或“氨基酸”序列可与抗原的多肽或氨基酸序列具有至少70％相似性，优选地至少约80％相似性，更优选地约90-95％相似性并且最优选地约99％相似性。
术语“外源性”是指外来基因或由所述外来基因编码的蛋白质，其是在浣熊痘病毒基因组外产生、起源、衍生或出现。
在本发明上下文中所用的“基因”是核酸分子(染色体、质粒等)中具有相关遗传功能的核苷酸序列。基因是(例如)生物体的遗传单位，其包含在生物体基因组内占据特定物理位置(“基因基因座”或“遗传基因座”)的多核苷酸序列(例如，哺乳动物的DNA序列)。基因可编码所表达产物，例如多肽或多核苷酸(例如，tRNA)。或者，基因可界定特定事件/功能的基因组位置，例如蛋白质和/或核酸的结合(例如，噬菌体附着位点)，其中所述基因不编码所表达产物。通常，基因包括诸如多肽编码序列等编码序列和诸如启动子序列、聚腺苷酸化序列、转录调节序列(例如，增强子序列)等非编码序列。许多真核基因具有穿插“内含子”(非编码序列)的“外显子”(编码序列)。在某些情形下，一种基因可与其它基因共享序列(例如，重叠基因)。
针对抗原或疫苗组合物的“免疫应答”是在个体中针对存于目标抗原或疫苗组合物中的分子形成体液和/或细胞介导免疫应答。出于本发明目的，“体液免疫应答”是抗体介导免疫应答，并且涉及对本发明抗原/疫苗具有亲和性的抗体的生成，而“细胞介导免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其它白细胞介导免疫应答。“细胞介导免疫应答”是通过递呈与主要组织相容性复合物(MHC)的I型或II型分子相关联的抗原性表位来激发。此免疫应答激活抗原特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)。CTL对与主要组织相容性复合物(MHC)所编码且在细胞表面上表达的蛋白质一起递呈的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏或受所述微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性反应。辅助T细胞用于帮助刺激所述功能，并使抵抗在表面上表现肽抗原以及MHC分子的细胞的非特异性效应细胞的活性集中。“细胞介导免疫应答”也是指细胞因子、趋化因子和活化T细胞和/或其它白细胞所产生的其它分子(包括得自CD4+和CD8+T细胞者)的产生。可通过多种分析来测定特定抗原或组合物刺激细胞介导免疫应答的能力，例如淋巴组织增生(淋巴细胞激活)分析、CTL细胞毒性细胞分析、对敏化个体中抗原特异性T淋巴细胞的分析、或测量T细胞响应抗原再刺激而产生的细胞因子。所述分析为业内所熟知。例如，参见埃里克森(Erickson)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)(1993)151：4189-4199；都(Doe)等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)(1994)24：2369-2376。
在本文中可互换使用的“免疫有效量”或“有效免疫量”是指如通过所属领域技术人员已知的标准分析所测量，足以激发免疫应答(细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)应答)的抗原或疫苗的量。在本发明中，“免疫有效量”或“有效免疫量”是约4.5-7.5Log10TCID50/mL的最小保护剂量(效价)。抗原作为免疫原的有效性可通过以下方法来测量：增殖分析、细胞溶解分析(例如铬释放分析以测量T细胞溶解其特异性靶细胞的能力)或测量B细胞活性水平(通过测量血清中抗原特异性循环抗体的水平)。此外，免疫应答的保护水平可通过攻击具有已注射抗原的经免疫宿主来测量。例如，若期望免疫应答所针对的抗原是病毒或肿瘤细胞，则通过在用病毒或肿瘤细胞攻击动物后检测存活率百分比或死亡率百分比来测量“免疫有效量”抗原所诱导的保护水平。
本文所定义浣熊痘病毒基因组中的“非必需位点”意指病毒基因组中病毒感染或复制的非必需区域。浣熊痘病毒基因组中非必需位点的实例包括(但不限于)胸苷激酶(TK)位点、血凝素(HA)位点和丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。浣熊痘病毒的TK位点阐述于C.卢策-华莱士(C.Lutze-Wallace)、M.西杜(M.Sidhu)和A.卡普乐(A.Kappeler)，病毒基因(Virus Genes)10(1995)，第81-84页中。浣熊痘病毒的TK基因序列也可参见PubMed登录号DQ066544和U08228。浣熊痘病毒的HA位点阐述于卡瓦拉罗KF(Cavallaro KF)和埃斯波西托，JJ(Esposito，JJ)，病毒学(Virology)(1992)，190(1)：434-9中。浣熊痘病毒的HA基因序列也可参见PubMed登录号AF375116。
术语“核酸分子”或“核酸序列”具有其普通含义，其是指长链重复核苷酸，例如引导蛋白质合成进程(也就是说其编码并表达蛋白质物质)的嘌呤和嘧啶碱基重复单元。在权利要求书中使用所述术语时，核酸是指编码猫抗原的已知外源或外来基因。
“可操作连接”是指元件的排列，其中如此阐述的组件的构造使其可实施其常用功能。因此，当存在调节蛋白和适宜酶时，可操作连接于编码序列(例如，编码目标抗原的序列)的给定启动子能够实现编码序列的表达。在某些情形下，某些控制元件不需要与编码序列邻接，只要所述控制元件的功能能引导其表达即可。例如，启动子序列与编码序列之间可存在经转录但未经转译的间插序列，并且启动子序列仍可视为“可操作连接”至编码序列上。因此，在细胞中，当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA，并且其随后经转运RNA剪接并转译成所述编码序列编码的蛋白质时，编码序列“可操作连接”于转录和转译控制序列。
“保护性”免疫应答是指疫苗激发免疫应答(体液或细胞介导免疫应答)的能力，其用于保护哺乳动物不受感染。若与对照猫哺乳动物种群相比存在统计学上显著的改良，则所提供保护不一定是绝对的，即不一定完全防止或消灭感染。保护可限于减轻感染症状发作的严重性或迅速性。
本文所用术语“重组”仅是指通过标准遗传工程方法所产生的浣熊痘病毒构建体。
术语“可复制的”是指微生物、具体来说诸如浣熊痘病毒等病毒能够在适宜宿主细胞中复制、加倍或繁殖。
术语“疫苗”或“疫苗组合物”在本文中可互换使用，并且是指包含至少一种可在动物中诱导免疫应答和/或保护动物免于因感染引发疾病或可能死亡的免疫活性组份的医药组合物，并且可包括或不包括一或多种能够增强活性组份免疫活性的额外组份。疫苗可另外包含其它典型医药组合物组份。
“载体”是能在宿主生物体中复制的DNA分子，并且将基因插入其中以构建重组DNA分子。
一般说明
本发明提供独特的安全有效重组猫组合(称作组合(comb、combination)或多价)疫苗，其使用浣熊痘病毒作为载体于浣熊痘病毒基因组的血凝素(ha)和/或胸苷激酶(tk)插入基因座处表达多种猫病毒、细菌和细胞因子抗原。合意地，构建体表达编码猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白、猫病毒性鼻气管炎病毒(FVR)糖蛋白D/B(gD/gB)、猫鹦鹉热衣原体(FCP，现在一般称作猫披衣菌)外膜蛋白(momp)、猫白血病病毒(FeLV)gag-pr65-pro/env-gp70/gp85、和猫白介素-12(IL-12)P35/P40的核酸分子(基因)，后一组份猫白介素-12(IL-12)P35/P40是作为免疫调节剂而引入以不添加佐剂的情况下增强组合疫苗在猫中的免疫原性。此有效新组合疫苗不含佐剂，并且因其可避免在猫中注射某些疫苗调配物时偶然出现的佐剂相关肉瘤问题而更安全。有利地，本发明rRCNV载体化猫疫苗也改良了在疫苗生产期间雇员的安全性，并且完全消除了病原性病毒在工业生产期间逃脱所用灭活和净化程序的任何可能性。可任选地包括其它抗原(例如猫泛白细胞减少病毒(FPV，使用经修饰活疫苗株系)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒(FIPV)、巴尔通体属细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8、其组合和诸如此类)作为多价重组疫苗的额外部分以在猫中提供针对众多种猫病原体性因子的广谱保护。
浣熊痘病毒(赫尔曼(Herman)株系)首先由Y.F.赫尔曼于1961-1962年在Aberdeen，Maryland自无临床症状的浣熊呼吸道中分离出来(Y.F.赫尔曼，“天然存在浣熊痘病毒的分离和特征分析(Isolation and characterization of a naturally occurring poxvirus of raccoons)”，细菌学方法(Bacteriol.Proc.)，第64届美国微生物学学会年会(64thAnnual Meeting of the American Society for Microbiology)，第117页(1964))。多个早期研究报导，当投与野生动物和家畜(包括猫)二者时在tk基因座表达CVS狂犬病G基因的RCNV载体是安全的(例如，参见A.D.亚历山大(A.D.Alexander)等人，“针对选定动物传染病对切萨匹克湾区域的野生哺乳动物进行的调查(Survey of wildmammals in a Chesapeake Bay area for selected zoonoses)”，野生生物探索杂志(J.WildlifeDis.)8：119-126(1972)；C.巴卢(C.Bahloul)等人，“研究针对狂犬病病毒属的免疫交叉反应性放大的DNA基免疫(DNA-based immunization for exploring the enlargement ofimmunological cross reactivity against the lyssaviruses)”，疫苗(Vaccine)16：417-425(1998)；S.查克巴罗蒂(S.Chakrabarti)等人，“用于蛋白质表达的致密合成痘苗病毒早/晚期启动子(Compact，Synthetic，vaccinia virus early/late promoter for proteinexpression)”，生物技术(BioTechniques)23：1094-1097(1997)；和J.C.德玛蒂尼(J.C.DeMartini)等人，“绵羊中的浣熊痘病毒狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗(Raccoon poxvirusrabies virus glycoprotein recombinant vaccine in sheep)”，病毒学文献(Arch.Virol.)133：211-222(1993))。如上文所述以及所属领域技术人员已知，先前已制造含有猫抗原的其它RCNV构建体以供投与猫。
然而，先前构建体都不能提供本发明的独特设计，其中将编码猫抗原的多个基因插入浣熊痘病毒基因组的血凝素(ha)和/或胸苷激酶(tk)插入基因座中以提供针对众多种猫病原体的安全有效活性。
与美国专利第5,505,941号的方法(其中使用含有编码p70+p15E聚蛋白的序列的FeLV env基因)相反，本发明构建体采用不同的描述为FeLV的gag-pr65-pro/env-gp70/gp85的独特蛋白质组合。在本发明新组合疫苗中生成rRCNV-FeLV的载体和启动子也不同于用于制造先前金丝雀痘病毒载体疫苗的载体和启动子。
具体来说，本发明组合疫苗的rRCNV-FCV片段表达两种或更多种FCV衣壳基因。尽管所制得构建体可合意地在浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座包括并表达编码猫杯状病毒FCV-2280衣壳蛋白的单一核酸分子，但优选地将编码FCV-DD1衣壳蛋白的基因也插入相同血凝素基因座中并且并行插入或不插入编码猫杯状病毒FCV-255衣壳蛋白的基因。
为将可用于本发明中的猫杯状病毒(FCV)衣壳基因分离至构建体rRCNV-FCV中，可采用任何猫杯状病毒(FCV)株系，但优选地自FCV-DD1株系获得至少一种FCV衣壳基因。此FCV-DD1株系已存放在37C.F.R.§1.808授权的条件下并且依照布达佩斯条约(Budapest Treaty)维持在美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)(10801大学街(University Boulevard)，马纳萨斯，弗吉尼亚20110-2209，美国)中。具体来说，在2004年9月9日将FCV-DD1样品存放在ATCC并且指定ATCC专利存放标号为PTA-6204。重组疫苗部分可任选地含有一或多种其它FCV分离物的衣壳基因，例如FCV-255(参见NCBI/基因库(GenBank)登录号U07130)、FCV-2280(参见NCBI/基因库登录号X99445)、FCV-Diva(参见派度森，NC(Pedusen，NC)，兽医微生物学73：281-300(2000年5月)；肖尔-伊文恩，EM，猫医学和外科学杂志5：217-226(2003))、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9(参见NCBI/基因库登录号Z11536)、FCV-F4(参见NCBI/基因库登录号D90357)、FCV-M8等。特别优选的构建体表达FCV-2280、FCV-DD1(参见美国专利第7,306,807号和ATCC存放号PTA-6204)和FCV-255的抗原性蛋白。
也发现rRCNV-FCV构建体的独特特征在于可利用FCV衣壳抗原作为用于克隆目的的筛选标记，并且可避免使用诸如LacZ等习用外来标记。
本发明组合疫苗的rRCNV-FVR gB/gD部分能特征性地表达两种蛋白基因rRCNV-FVR gD和rRCNV-FVR gB，其使用P11启动子将编码gD和gB的核苷酸序列驱动并合并至浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座中。所述构建体是通过将FVR gD(糖蛋白D)克隆至现存质粒(pFD2000A FVR gB)中来制造以生成质粒pFD2000A FVRgB/gD。由此，使用蓝-白筛选技术通过COS7细胞、质粒pFD2000A FVR gB/gD和rRCNV-FeLV以三种途径实施感染/转染来产生池克隆。克隆筛选是通过有限稀释和使用新颖抗原FeLV P27作为克隆筛选的亲代来达成，其避免使用传统外来筛选标记LacZ。
本发明组合疫苗的rRCNV-FCP momp部分表达猫鹦鹉热衣原体(FCP，也称作猫披衣菌)外膜蛋白(momp)并且是使用启动子P11来构建。
本发明组合疫苗的rRCNV-FeLV部分在浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座表达编码猫白血病病毒抗原gag-pr65-pro和env-gp85的核酸分子。或者，所制得构建体可在浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座含有并表达编码猫白血病病毒抗原gag-pr65-pro、env-gp85和env-gp70的基因。
本发明组合疫苗的独特rRCNV-猫IL-12部分通过在相同病毒中驱动启动子(针对P35的P11/PSEL，和针对P40的P7.5/PSEL)的两种不同表达水平在相同基因座(ha或tk)表达猫IL-12。优选地，将编码猫白介素-12的P35和P40抗原的核酸分子插入浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座中。
同样，本发明组合疫苗可在呈简单混合物、悬浮液、乳液和类似形式的与重组构建体组成的掺混物中任选地含有其它病原体作为抗原，例如猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属细菌(例如典型猫抓病)、其组合以及诸如此类。若所生成重组痘病毒内不包括特定猫杯状病毒株系的衣壳基因，那么可将病毒性抗原作为额外部分单独添加至多价疫苗调配物中，例如FCV-255、FCV-2280、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8等。
本发明另外提供针对感染和疾病保护猫的新方法，其包含向需要保护的猫投与无佐剂有效新重组疫苗。在本发明方法中，将免疫有效量的本发明疫苗投与猫以诱导针对多种猫病原体所引发的感染或疾病的保护性免疫应答。如疫苗领域标准价值所要求的，给予猫的有效免疫量是可获得针对疫苗的足够免疫应答从而保护猫免受病原体感染的量。给动物接种并激发良好疫苗接种效果的免疫有效剂量或有效免疫量可通过常规测试(例如标准剂量滴定研究)容易地测定或便捷地滴定。
疫苗可以单次剂量或以重复剂量(尤其在需要加强注射时)来投与。合意地，以单次接种向健康猫投与疫苗以提供长期保护。
疫苗可含有免疫有效量的本文所述任何一种重组浣熊痘病毒载体构建体。在另一特定实施例中，组合疫苗可含有免疫有效量的本文所述任何两种或更多种重组浣熊痘病毒载体化构建体。
疫苗可方便地以鼻内、经皮(即施加在皮肤表面上或施加在皮肤表面以供全身吸收)、非经肠、经口等方式来投与，或以诸如经口鼻等组合方式来投与，其中一部分剂量经口给予并且另一部分经鼻孔给予。非经肠投与途径包括(但不限于)肌内、皮下、皮内(即注射或以其它方式置于皮肤下)、静脉内和诸如此类。肌内、皮下和口鼻投与途径是优选途径。优选地，将疫苗经皮下投与健康猫。
痘病毒载体可为活载体或通过制备灭活病毒疫苗的习用程序使用(例如)BEI(二元次乙亚胺)、福尔马林(formalin)和类似物(BEI是优选灭活剂)加以灭活，但人们非常期望本发明疫苗可使用活浣熊痘病毒以获得最佳有效免疫效力。活浣熊痘病毒也可复制，意指其可在适宜培养物中繁殖来制造其自身的拷贝以供自种源病毒研发疫苗。
在以液体形式投与时，可以水溶液、糖浆剂、酏剂、酊剂及诸如此类等习用形式来制备本发明疫苗。所述调配物为业内已知，并且通常是通过将抗原和其它添加剂溶于或分散于适合投与猫的载剂或溶剂系统中来制备。生理上可接受的适宜无毒性载剂或溶剂包括(但不限于)水、盐水、乙二醇、甘油等。也可将疫苗冻干或以其它方式冷冻干燥，然后在即将使用前用适宜稀释剂以无菌方式重建或重水合。适宜稀释剂包括(但不限于)盐水、伊格氏(Eagle′s)最低必需培养基和诸如此类。典型添加剂或辅调配剂为(例如)合格染料、矫味剂、甜味剂和一或多种抗微生物防腐剂，例如硫柳汞(thimerosal)(乙基汞硫代水杨酸钠)、新霉素(neomycin)、多粘菌素(polymyxin)B、两性霉素(amphotericin)B和诸如此类。所述溶液可通过例如添加部分水解的明胶、山梨醇或细胞培养基来稳定，并且可通过习用方法使用业内已知试剂来缓冲，例如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、其混合物和诸如此类。
液体调配物也可包括悬浮液和乳液，其含有悬浮剂或乳化剂以及其它标准辅调配剂。这些类型的液体调配物可通过习用方法来制备。例如，可使用胶体磨来制备悬浮液。例如，可使用匀浆器来制备乳液。
经设计用于注射至体液系统中的非经肠调配物需要适宜等渗性和缓冲至猫体液相应水平的pH。可根据需要用氯化钠和其它盐来适当地调节等渗性。在疫苗接种时，用诸如去离子水、盐水、磷酸缓冲盐水或类似物等生理上可接受的载剂对病毒实施解冻(若已冷冻)或重建(若已冻干)。可使用诸如丙二醇等适宜溶剂来提高调配物中各成份的溶解度和液体制剂的稳定性。
所属领域技术人员所习知的任一方法均可用于制备本发明基因构建体。例如，可利用特定限制位点使用标准方法将任何期望核酸序列插入浣熊痘病毒载体中。或者，如本文所述，当期望插入较大序列时或当期望插入多个基因时，可利用同源重组技术。在此方法中，欲向其中插入多个基因的插入位点侧翼的质粒序列含有与存于浣熊痘病毒基因组中的序列具有充分同源性的序列以介导重组。侧翼序列必须与浣熊痘病毒中浣熊痘病毒生长和繁殖的非必需区域(例如血凝素基因座、或胸苷激酶基因座、或丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座)同源。尽管可使用一个启动子来驱动两种欲重组外源基因的表达，但在插入载体中使用两个启动子(各启动子可操作连接于单个基因上)也可提供有效表达。
实例
以下实例展示本发明的某些方面。然而，应了解这些实例仅用于阐释而不欲完全界定本发明的条件和范围。应了解，当给出典型反应条件(例如温度、反应时间等)时，也可使用高于和低于指定范围的条件，但一般不甚方便。各实例是在室温(约23℃至约28℃)和大气压力下实施。除非另有说明，否则本文所提及的所有份数和百分比都以重量计，并且所有温度都以摄氏度表示。
根据下文的实例可达成对本发明的进一步理解。这些工作实例意欲阐释本发明而非限制其范围。
实例1：质粒pFD2000A、pFD2001TK和pFD2003SEL的构建
如下所述来构建两种质粒pFD2000A和pFD2003SEL以将外来基因递送至浣熊痘病毒基因组的ha基因座中。自RCNV基因组而非牛痘病毒直接克隆/修饰侧翼ha序列以提高同源重组的准确度和频率。
类似地，构建质粒pFD20001TK以将外来基因递送至浣熊痘病毒基因组的tk基因座中。自RCNV基因组而非牛痘病毒直接克隆/修饰侧翼tk序列以提高同源重组的准确度和频率。
实例2：第一代rRCNV-FCV构建体
构建rRCNV-FCV2280衣壳(P11)并且通过FCV ELISA和蛋白质印迹法(Westernblot)来验证FCV衣壳表达。宿主动物中的构建程序和重组病毒构建体评估包括以下6个关键步骤：(1)将FCV2280衣壳基因克隆至质粒载体pFD2000A中以生成质粒pFD2000A FCV2280衣壳；(2)使用COS7细胞、步骤1中的质粒和RCNV以三种途径实施感染/转染来生成池克隆rRCNV-FCV2280；(3)通过有限稀释和FCV ELISA实施纯克隆筛选；(4)通过PCR、ELISA和蛋白质印迹法对rRCNV-FCV2280实施分子特征分析；(5)建立rRCNV-FCV种源；和(6)在猫中实施rRCNV-FCV2280(P11)的剂量滴定研究。攻击研究结果表明，经rRCNV-FCV2280以甚至7.5Log10TCID50/mL实施疫苗接种的猫未显示针对FCV255攻击的显著保护。
此外，以与上文类似的方法来构建rRCNV-FCV2280衣壳(PSEL)并且通过FCVELISA和蛋白质印迹法来验证FCV衣壳表达。
实例3：第二代rRCNV-FCV构建体
第二代rRCNV-FCV是如实例2所述来构建，但将FCV2280与FCV DD1衣壳基因(5′-372bp核苷酸缺失)二者插入ha基因座中，并且通过FCV ELISA和蛋白质印迹法来验证FCV衣壳表达。在此构建体中，重组浣熊痘病毒在ha基因座表达FCV2280衣壳(P11)和FCV DD1(PSEL)二者。将种源命名为rRCNV-FCV(2280-DD1)。在猫中实施剂量滴定研究，并且结果归纳如下：(1)在10只以7.5Log10TCID50/mL实施疫苗接种的猫中观察到显著血清中和达成FCVDD1效价，而所有对照(10只猫)仍保持血清阴性(p＜0.05)；(2)在疫苗接种组(6.5和7.5Log10TCID50/mL)中观察到与对照相比发烧显著减轻(p＜0.05)；(3)在疫苗接种组(7.5Log10TCID50/mL)中观察到与对照相比口部和外部溃疡(伤口)显著减轻(p＜0.05)。这些结果表明，rRCNV-FCV(2280-DD1)可用作疫苗候选物。
实例4：第三代rRCNV-FCV构建体
在此构建体中，将FCV衣壳基因(2280-DD1-255)插入ha基因座中。第三代rRCNV-FCV是通过以下四个关键步骤来构建：(1)将FCV255衣壳克隆至现存质粒(用于构建第二代构建体)中以生成质粒pFD2000A FCV衣壳(2280-DD1-255)；(2)通过以三种途径实施感染/转染来产生池克隆：COS7细胞、步骤1中的质粒和RCNV；(3)通过有限稀释和FCV ELISA实施克隆筛选；和(4)通过FCV PCR、ELISA和蛋白质印迹法来确定RCNV基因组中FCV衣壳基因的插入和FCV衣壳的表达。剂量滴定研究是在猫中实施。与第二代构建体相比，此构建体可提高效力并拓宽保护范围。
实例5：第一代rRCNV-FVR构建体
rRCNV-FVR gD(P11)和rRCNV-FVR gB(P11)是以与实例2中所述类似的方法来构建。构建程序包括以下五个关键步骤：(1)将FVR gD/gB糖蛋白基因分别克隆至质粒载体pFD2000A中以生成质粒pFD2000A FVR gD和pFD2000A FVR gB；(2)使用COS7细胞、步骤1中的质粒和RCNV以三种途径实施感染/转染来生成池克隆rRCNV-FVR gD/gB；(3)通过噬斑纯化/LacZ筛选来实施纯克隆筛选；(4)通过PCR、ELISA和蛋白质印迹法对rRCNV-FVR gD(P11)和rRCNV-FVR gB(P11)实施分子特征分析；(5)建立rRCNV-FVR种源。
实例6：第二代rRCNV-FVR构建体
第二代rRCNV-FVR是通过以下四个关键步骤来构建：(1)将FVRgD(糖蛋白D)克隆至现存质粒(pFD2000A FVR gB)中以生成质粒pFD2000A FVR gB/gD；(2)通过以三种途径实施感染/转染来产生池克隆：COS7细胞、步骤1中的质粒和rRCNV-FeLV(蓝-白筛选，参见实例13)；(3)通过有限稀释和FeLV P27ELISA来实施克隆筛选；在此构建体中，将FVR gD/gB基因插入ha基因座中；和(4)通过FVR PCR和蛋白质印迹法来确定RCNV基因组中FVR gD/gB基因的插入和FVR gD/gB的表达。剂量滴定研究是在猫中实施。
实例7：第一代rRCNV-FeLV构建体
rRCNV-FeLV gag-pr65(P11)和rRCNV-FeLV env-gp70(P11)是以与实例2中所述类似的方法来构建。这两种构建体的剂量滴定研究表明，rRCNV-FeLV env-gp70构建体显示针对FeLV病毒血症的40％保护(2/5以7.5Log10TCID50/mL实施疫苗接种的猫)，然而，rRCNV-FeLV gag-pr65未显示针对FeLV病毒血症的保护(0/5疫苗接种猫)。
实例8：第二代rRCNV-FeLV构建体
构建第二代rRCNV-FeLV。在此构建体中，重组浣熊痘病毒在ha基因座中表达FeLV gag-pr65-pro(PSEL)与FeLV env-gp85(PSEL)二者。在猫中的构建程序和疫苗候选物评估包括以下六个关键步骤：(1)将FeLV gag-pr65-pro和FeLV env gp85克隆至质粒载体pFD2003SEL中；(2)构建质粒pFD2003SEL FeLV gag-pr65-pro(PSEL)-env-gp85(PSEL)；(3)使用COS7细胞、步骤2中的质粒和rRCNV-FCV以三种途径实施感染/转染来生成池克隆rRCNV-FeLV；(3)通过有限稀释和FeLV P27 ELISA来实施纯克隆筛选；(4)通过PCR、ELISA和蛋白质印迹法对rRCNV-FeLV实施分子特征分析；(5)建立rRCNV-FeLV种源；和(6)在猫中实施剂量滴定研究。攻击结果归纳如下：当经皮下分别用7.5、6.5和5.5Log10TCID50/mL rRCNV-FeLV以两次剂量方案(间隔3周)对猫实施疫苗接种时，7/10(70％)、6/10(60％)、和5/10(50％)的猫受到针对持续性FeLV病毒血症的保护。相反，9/10(90％)未经疫苗接种的猫表现持续性FeLV病毒血症。鉴于先前第一代构建体的失败，这些意料之外的成功结果表明rRCNV-FeLV可用作疫苗候选物。
实例9：第三代rRCNV-FeLV构建体
在此构建体中，将FeLV gag-pr65-pro/env-gp85基因插入tk基因座中。第三代rRCNV-FeLV是通过以下四个关键步骤来构建：(1)生成质粒pFD2006TK FeLVgag-pr65/env-gp85；(2)通过以三种途径实施感染/转染来产生池克隆：COS7细胞、步骤1中的质粒和rRCNV-FeLV env-gp70(P11)(来自第一代构建体，实例7)；(3)通过有限稀释和FeLV P27 ELISA来实施克隆筛选；和(4)通过FeLV P27ELISA和FeLVgp70蛋白质印迹法来确定RCNV基因组中FeLV gag/env基因的插入和FeLV gag/env的表达。剂量滴定研究是在猫中实施。
实例10：第一代rRCNV-FCP构建体
rRCNV-FCP外膜蛋白(momp，P11)是以与实例2中所述类似的方法来构建(ha基因座)。构建程序包括以下五个关键步骤：(1)将FCP momp基因克隆至质粒载体pFD2000A中以生成质粒pFD2000A FCPmomp(P11)；(2)使用COS7细胞、步骤1中的质粒和RCNV以三种途径实施感染/转染来生成池克隆rRCNV-FCP；(3)通过噬斑纯化/LacZ筛选来实施纯克隆筛选；(4)通过PCR对rRCNV-FCP momp(P11)实施分子特征分析；和(5)建立rRCNV-FCP momp种源。
实例11：第一代rRCNV-猫IL-12构建体
通过RT-PCR和TOPO克隆自猫的淋巴结组织克隆猫IL-12 P35和P40基因，并且对猫IL-12 P35和P40基因实施测序。rRCNV-猫IL-12 P35(P11)和rRCNV-猫IL-12(P11)是根据实例2来构建。猫IL-12P35和P40在ha基因座中的表达是通过P40特异性蛋白质印迹法来确定。
实例12：第二代rRCNV-猫IL-12构建体
在此构建体中，将猫IL-12P35/P40基因插入ha基因座中。第二代rRCNV-FeLVIL-12是通过以下四个关键步骤来构建：(1)构建质粒pFD2003SEL猫IL-12P35/P40；(2)通过以三种途径实施感染/转染来产生池克隆：COS7细胞、步骤1中的质粒和rRCNV-FeLV(蓝-白筛选或猫IL-12P40ELISA)；(3)通过有限稀释和FeLV P27ELISA或猫IL-12P40ELISA来实施克隆筛选；和(4)通过猫11-12PCR和P40蛋白质印迹法来确定RCNV基因组中猫IL-12P35/P40基因的插入和猫IL-12P35/P40的表达。在猫中实施剂量滴定研究(与活的或灭活的rRCNV-猫IL-12一起调配的各种猫抗原)以评估猫IL-12细胞因子对免疫的增强效应。
实例13：重组RCNV载体系统的蓝-白筛选标记
使用rRCNV-FeLV gag(第一代构建体)和rRCNV-FeLV(gag-pr65-pro//env gp85，第二代构建体)作为蓝-白(btw)筛选的亲代来构建任何RCNV载体化重组疫苗。此系统的优势在于其利用rRCNV-FeLV(因FeLV P27基因表达所致的蓝色噬斑)而非RCNV野生型(白色噬斑)作为亲代株系，并且通过等位基因交换将任一外来目标基因(或保护性抗原)插入ha/tk基因座中来替代在ha/tk DNA序列侧翼含有DNA片段的FeLV P27。因此，FeLV P27抗原ELISA可在96孔板筛选系统中容易地区分重组(白色噬斑)与亲代株系(因FeL P27表达所致的兰色噬斑)。使用此系统来构建rRCNV-猫IL-12和rRCNV-FVR。
实例14：重组RCNV载体系统中作为筛选标记的插入免疫原的表达
此概念应用于rRCNV-FCV的构建(参见上文实例3和4)。通过FCV衣壳特异性ELISA来筛选所得重组克隆。其独特特征在于筛选不需要诸如LacZ等外来标记。此概念可用于本发明所有rRCNV病毒构建体，除非可使用免疫原特异性ELISA，例如rRCNV-FeLV(P27ELISA)、rRCNV-猫IL-12(P40ELISA)等。
实例15：病毒稳定性
在田间环境和实验室条件中测试微生物的存活能力。在实验室条件下，通过将以最高传代数(MSV+5)制备的病毒原液保持在-70℃、4-8℃和37℃下来测试构建体rRCNV FIPV-N(表达猫感染性腹膜炎病毒核衣壳基因的重组RCNV)。以特定间隔移出病毒原液样品，并且实施滴定以确定此病毒在各种储存条件下的稳定性。当在-70℃和4-8℃下储存90天时，以及在4-8℃下储存33个月时，发现含有稳定剂的病毒冻干饼和病毒液体悬浮液二者是稳定的，表现为病毒效价无显著损失。在37℃下于第14天观察到液体病毒的病毒效价显著降低。在37℃下截至第28天即不可再检测到病毒。当冷藏储存时此病毒似乎相当稳定。
实例16第二代rRCNV-猫IL-12构建体
简单来说，通过将猫IL-12P35和P40基因插入RCNV基因组的血凝集(ha)基因座中来构建病毒rRCNV-猫IL-12，其为无毒性赫尔曼株系。使用RT-PCR自猫淋巴结来克隆猫IL-12P35和P40基因。
rRCNV-Rabies G2的构建方法是通过两个主要步骤来实施。首先，将PCR扩增的猫IL-12的669-bp P35和990-bp P40基因亚克隆至质粒pFD2003SEL载体中以生成质粒pFD2003SEL-猫IL-12P35-(SEL)-P40。P35与P40基因二者分别在启动子PSEL控制下共表达。随后，在COS-7细胞中以三种途径对RCNV和质粒pFD2003SEL-猫IL-12(P35-P40)实施共感染/转染以通过等位基因交换在ha基因座生成rRCNV-猫IL-12。在Vero细胞中通过连续四轮有限稀释和P40ELISA来筛选表达猫IL-12的克隆。在Vero细胞中使用补充有0.05％乳清蛋白水解产物(LAH)、30μg/mL硫酸庆大霉素和5％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)将候选克隆进一步再扩增两次，并且随后通过猫IL-12P40基因特异性PCR和猫IL-12P40ELISA来验证。使用第六次传代株系来制备前种源。种源是通过1∶10,000稀释前种源来建立，并且命名为rRCNV-猫IL-12，其中作为活载体的浣熊痘病毒能在ha基因座中分别表达猫IL-12P35和P40蛋白。在猫中使用rRCNV-FPV/FCV/FVR/FCP/FeLV/狂犬病和不同剂量的rRCNV-猫IL-12实施剂量滴定研究以评估猫IL-12细胞因子对免疫的增强效应。
在上文中已出于阐释而非限制性目的提供本发明特定实施例的详细阐述。应理解，所属领域技术人员根据此揭示内容可了解，所有其它修改、细节和等效内容均意欲包括在本发明所主张的范围内。
序列表
<110>惠氏有限责任公司
 
<120>猫抗原的浣熊痘病毒表达基因
 
<130>AM102753
 
<150>60/932419
<151>2007-05-30
 
<160>15
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>6872
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>质粒
 
<400>1
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<211>5508
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cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag tggcgtctgg    4620
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gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac cgccagtcag    4740
gctttctttc acagatgtgg attggcgata aaaaacaact gctgacgccg ctgcgcgatc    4800
agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc cgcattgacc    4860
ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta ccaggccgaa gcagcgttgt    4920
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aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc agccgctaca    5340
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ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg agcccgtcag    5460
tatcggcgga attccagctg agcgccgttc gctaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa    5520
aataaggatc ctcgatacca acaacggtag aaagtgttac aatatctact acaaaatata    5580
caactagtga ctttatagag atatttggca ttgtttcact aattttatta ttggccgtgg    5640
cgattttctg tattatatat tatttctgta gtggacggtc tcgtaaacaa gaaacaaata    5700
tattatagat tttaactcag ataaatgtct ggaataatta aatctatcgt tttgagcgga    5760
ccatctggtt ccggcaagac agctatagtc aggagactct tacaagatta tggaaatata    5820
tttggatttg tggtatccca taccactaga tttcctcgtc ctatggaacg agaaggtgtc    5880
gtctaccatt acgttaacag agaggccatt tggaagggaa tagccgctgg aaacttgcta    5940
gaacatacag agtttttggg aaatatttat gggacttcta aaacatccat gaacacagct    6000
gctattaata atcgtatatg tgttatggat ttaaacattg acggagttag gagtcttaaa    6060
aacacatact tgatgcctta ctctgtttat ataagaccta catctcttaa aatggtagaa    6120
actgcatgcc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat    6180
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cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat    6420
ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt    6480
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct    6540
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc    6600
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa    6660
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg    6720
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt    6780
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg    6840
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac    6900
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc    6960
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa    7020
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc    7080
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt    7140
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga    7200
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa    7260
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa    7320
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa    7380
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt    7440
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt    7500
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg    7560
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt    7620
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca    7680
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac    7740
tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac    7800
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct    7860
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg    7920
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca    7980
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt    8040
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tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc    8160
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc    8220
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa    8280
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag    8340
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagag ctc                                 8373
 
<210>5
<211>1179
<212>DNA
<213>猫披衣菌
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1179)
<223>主要外膜蛋白的MOMP基因
 
<400>5
atgaaaaaac tcttaaaatc ggcattatta tttgccgctg cgggttccgc tctctcctta    60
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cgtgcaggat tctacggaga ttatgttttc gatcgtatat taaaagttga tgttaataaa    240
accatcagcg gaatggctgc ggctccaaca gcagcttctg gaactgcaag caacaccact    300
gtcgctgccg acagatcaaa ttttgcctac ggcaaacatc ttcaagatgc cgaatggtgc    360
accaatgctg cttacttagc attaaatatt tgggatcgtt ttgatgtttt ctgcacgcta    420
ggagcgtcta atggttactt caaagcaagt tctgatgcat ttaaccttgt cggattgatt    480
ggtcttgcag gaactgattt cgccaatcag cgtccaaacg ttgaaatttc tcaaggcatt    540
gtagagctat acacagatac cgcattttct tggagcgttg gtgctcgcgg agctttgtgg    600
gaatgtggtt gtgcaacttt gggagctgaa ttccaatatg ctcaatccaa tcctaaaatt    660
gaaatgctca atgtaacctc tagcccagca caattcatga tacacaagcc tagaggatac    720
aaagggactg cagcaaactt ccccttacct gtagcagctg gcacagcaac tgcaacagat    780
actaaatcag ctactgttaa gtaccatgaa tggcaagtag gattggctct ttcatacaga    840
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actatccgca ttgctcaacc taaattggcc tcagcaatcc taaacttaac aacctggaac    960
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caaatcgttt ctatgcaaat caacaagatg aagtctagaa aagcttgtgg tattgctgtt   1080
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gaaagagctg ctcacattaa tgctcaattc agattctaa                          1179
 
<210>6
<211>1635
<212>DNA
<213>猫杯状病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1635)
<223>株系255具有372个碱基对的N末端缺失和BamHI位点突变的衣壳蛋白
 
<400>6
gctgatgatg ggtctatcac gtcacctgag cagggaacca tggttggtgg tgtgattgca     60
gagcctagtg cccaaatgtc aactgcagct gatatggcca caggaaagag tgtcgactct    120
gaatgggagg cattcttctc attccatacc agtgtcaatt ggagtacatc tgaagcacaa    180
ggcaagattc ttttcaagca atctttagga ccactactta acccatacct tgagcaccta    240
gcaaaactct atgttgcttg gtcgggatct gttgatgtta gattttctat ttctggatct    300
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acatccctcg taatcatggt gtacaatgat cttatcaatc cgtatgctag tgattctaat    540
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tcctcttccc tctggattgg caatcggcac tggaccgata taactgactt tgtaattcgg    720
ccatttgtat tccaagccaa ccgtcacttc gactttaatc aggagacggc tggttggagc    780
acgccaagat tccgaccaat cacaataaca attagtgaga aggatggctc caaattggga    840
attggggttg caatggactc tatcgttcct ggaataccgg atggatggcc agatactacc    900
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attactacag ccaaagatta tgattcggcc actgtaattc aaaacaatac caacttcaaa   1020
ggtatgtata tccgtggatc tttacagaga gcctggggtg ataagaaaat atcaaacacc   1080
gcatttatta ctactgcaac caggagtgac aacacaatta caccatccaa tgtgatagac   1140
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gacagggtcg tgcgcatcag tgtactgcca gaaactgggg ctcgcggtgg caaccatccc    1320
atcttttaca agaactctat taaactaggt tatgtgatta gatctataga tgtgttcaac    1380
tctcaaatcc tgcacacatc tcgacaacta tccctcaata actatcttct cccacctgat    1440
tctttcgctg tgtaccgaat aactgattct aatggttcat ggtttgacat aggaattgat    1500
agtgatggct tctcttttgt cggtgcctcc aacgttggta aattggagtt tcctcttact    1560
gcctcctaca tgggaattca attggcaaag attcggcttg cctcaaacat taggagttca    1620
ttgactaaat tatga                                                     1635
 
<210>7
<211>1635
<212>DNA
<213>猫杯状病毒
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1635)
<223>株系2280具有372个碱基对的N末端缺失的衣壳蛋白
 
<400>7
gctgatgatg gttctatcac ggcccctgag caaggaacgg ttgttggtgg ggtcattgcc     60
gagcctagtg cacaaatgtc aacagctgct gatatggcca cagggaaaag cgttgactct    120
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ggaaagattt tattcaaaca atctttggga cccctcctaa acccatacct tgaacatctt    240
gctaagctgt atgttgcttg gtctggatct attgatgtta ggttctctat ctctggttct    300
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ccctttgtct tccaagcaaa ccgacacttt gattttaatc aggaaactgc tgggtggagc     780
acgccgagat tccggccaat aactgttaca gttagtgaaa gtggtgggtc aaagcttggg     840
ataggtgttg caactgacta cattgttccc ggtattccag atggctggcc agacacaaca     900
attcctgaaa agcttacccc tgcaggtaat tatgcaatta caaccagcaa taacagtgac     960
attgctacgg ctactgaata cgaccatgct gatgaaatca aaaacaacac aaactttaaa    1020
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gcttttatca ccacagcagt caaggaaggt aacagcatca caccgtctaa cacaattgac    1140
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atcttctaca aaaatacaat taaattgggc tatgtgatta ggtctattga tgtgtttaac    1380
tcccagatcc tccacacgtc cagacaacta tccctaaatc actacctgct tccacctgat    1440
tcctttgctg tctatagaat aattgattct aatggttcat ggtttgacat tggtattgat    1500
agtgatggtt tctcttttgt tggtgtttct agtttaccca cactggaatt tcctctctct    1560
gcctcctaca tgggaattca attggcaaaa atcaggcttg cctcaaatat taggagtagt    1620
atgacaaaattatga                                                      1635
<210>8
<211>1635
<212>DNA
<213>猫杯状病毒
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1635)
<223>株系DD1具有N末端缺失的衣壳基因
 
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gctgatgatg gctcaatcac aactcctgag caaggtacaa tggtcggcgg tgtaattgct     60
gaacccagtt ctcaaatgtc agctgctgct gatatggcta ctgggaaaag tgtggactcg    120
gaatgggaag ccttcttctc atttcacact agtgtcaact ggagcacttc tgagacacaa    180
ggaaagattc tctttaaaca atctttagga ccactgctta acccctacct ttcacatctt    240
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acttcccttg caatcatggt ttataatgat ctcattaacc cttatgctaa tgattcaaat    540
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tcatcttcat actggactgg aaatcggcat tggaccgaca tcaccgggtt tgtaattcga    720
ccttttgtgt tccaagccaa cagacacttt gatttcaatc aggaaactgc cggctggagt    780
tcaccgagat ttcgcccaat ttcaatcaat atcagtgttg aaaaagccgc aaaacttgga    840
actggagttg ctactgatta cattgtccct ggcataccag atggttggcc tgacaccaca    900
atccctgaga agctgacacc tgctggcgat tacgccatcg tagatggatc aggcaatgac    960
atcacaacta aggataaata tgaaagtgct gatgtgatca agaataacac caatttcagg   1020
ggcatgtaca tttgtggctc acttcaaaga gcatggggtg ataagaaaat ctcaaacact    1080
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aacctgcaac tgaagccatt aaaaaattct cggcatgtgg aagtgagctg ggaataccct    780
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<213>猫白血病病毒
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1929)
<223>FeLV env-gp85基因
 
<400>11
atggaaagtc caacgcaccc aaaaccctct aaagataaga ctctctcgtg gaacttagtg     60
tttctggtgg ggatcttatt cacaatagac ataggaatgg ccaatcctag tccacaccaa    120
atatataatg taacttgggt aataaccaat gtacaaacta acacccaagc taatgccacc    180
tctatgttag gaaccttaac cgatgtctac cctaccctac atgttgactt atgtgaccta    240
gtgggagaca cctgggaacc tatagtccta agcccaacca atgtaaaaca cggggcacgt    300
tacccttcct caaaatatgg atgtaaaact acagatagaa aaaaacagca acagacatac    360
cccttttacg tctgccccgg acatgccccc tcgctggggc caaagggaac acattgtgga    420
ggggcacaag atgggttttg tgccgcatgg ggatgtgaaa ccaccggaga agcttggtgg    480
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tgtgagggaa aatgcaaccc cctgattttg cagttcaccc agaaggggaa acaagcctct     600
tgggacggac ctaagatgtg gggattgcga ctataccgta caggatatga ccctatcgcc     660
ttattcacgg tatcccggca ggtgtcaacc attacgccgc ctcaggcaat gggaccaaac     720
ctagtcttac ctgatcaaaa acccccatcc cgacaatctc aaacagggtc caaagtggcg     780
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ccctattacg aagggattgc aatcttaggt aactacagca accaaacaaa ccctccccca    1020
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tgcataggga ctgttcctaa gacccaccag gctttgtgca ataagacgca acagggacat    1140
acaggggcgc actatctagc cgcccccaat ggcacctatt gggcctgtaa cactggactc    1200
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gatattctat tcctacaaga gggagggctc tgtgccgcat taaaagaaga atgttgcttc    1620
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ctcctcttcg gcccatgcat ccttaacaga ttagtacaat tcgtaaaaga cagaatatct    1860
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cgaccatga                                                            1929
 
<210>12
<211>1881
<212>DNA
<213>猫白血病病毒
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1881)
<223>FeLV gag-pr65-pro基因
 
<400>12
atgggccaaa ctataactac ccccttaagc ctcacccttg atcactggtc tgaagtccgg     60
gcacgagccc ataatcaagg tgtcgaggtc cggaaaaaga aatggattac cttatgtgag    120
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atttcccagg ttgagaaaaa gatcttcgcc ccgggaccgt atggacaccc cgaccaagtt    240
ccgtacatta ccacatggag atccttagcc acagaccccc cttcgtgggt tcgtccgttc    300
ctaccccctc ccaaaactcc cacacccctc cctcaacctc tatcgccgca gccctccgcc    360
cctcttacct cttccctcta ccccgttctc cccaagtcag accctcccaa accgcctgtg    420
ttaccgcctg atccttcttc ccctttaatt gatctcttaa cagaagagcc acctccctat    480
ccggggggtc acgggccacc gccatcaggt cctagaaccc caaccgcttc cccgattgcc    540
agccggctaa gggaacgacg agaaaaccct gctgaagaat ctcaagccct ccccttgagg    600
gaaggcccca acaaccggcc ccagtattgg ccattctcag cttcagacct gtataactgg    660
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acaggcgaag aaaggcaaag ggtccttctt gaggcccgaa agcaggttcc aggcgaggac     840
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caagggaaag aggaaacgcc agcctcattc ttagaaagat taaaagaggc ttacagaatg    1080
tatactccct atgaccctga ggacccaggg caggctgcta gtgttatcct gtcctttatc    1140
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accttaaaaa taggggggca accggtgact ttcctggtgg acacgggagc ccagcactca    1620
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actaaactta aggcccaaat ccattttacc ggagaagggg ctaatgttgt tgggcccagg    1860
ggtttacccc tacaagtcct t                                              1881
 
<210>13
<211>744
<212>DNA
<213>猫白血病病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(744)
<223>FeLV p27基因
 
<400>13
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tataactgga agtcgcataa cccccctttc tcccaagacc ccgtggccct aactaaccta    120
attgagtcca ttttagtgac gcatcaacca acctgggacg actgccagca gctcttgcag    180
gcactcctga caggcgaaga aaggcaaagg gtccttcttg aggcccgaaa gcaggttcca    240
ggcgaggacg gacggccaac ccagctgccc aatgtcattg acgaagcttt ccccttgacc    300
cgtcccaact gggattttgc tacgccggca ggtagggagc acctacgcct ttatcgccag    360
ttgctgttag cgggtctccg cggggctgca agacgcccca ctaatttggc acaggtaaag    420
caagttgtac aagggaaaga ggaaacgcca gcctcattct tagaaagatt aaaagaggct    480
tacagaatgt atactcccta tgaccctgag gacccagggc aggctgctag tgttatcctg    540
tcctttatct accagtctag cccggacata agaaataagt tacaaaggct agaaggccta    600
caggggttca cactgtctga tttgctaaaa gaggcagaaa agatatacaa caaaagggag    660
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cataaggaga tgactaaagt tctg                                           744
 
<210>14
<211>2847
<212>DNA
<213>猫病毒性鼻气管炎病毒
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2847)
<223>糖蛋白B
 
<400>14
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ggctattttc gacagagatg ttttttccct tctctactcg gtattgcagc gactggctcc    120
agacatggta acggatcgtc gggattaacc agactagcta gatatgtttc atttatctgg    180
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caaccccggc ggactgtagc tacccctgag gtagggggta caccaccaaa accaactaca    300
gatcccaccg atatgtcgga tatgagggaa gctctccgtg cgtcccaaat agaggctaac    360
ggaccatcga ctttttatat gtgtccacca ccttcaggat ctactgtcgt gcgtttagag    420
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gacttggata cgcgattaca actgggggca ccagtttctc gcaatttttt ggaaactccg   1080
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<400>15
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Claims (38)

1.一种重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，其包含两种或更多种外源性同源核酸分子，所述核酸分子各自编码同一猫病原体的两种或更多种不同株系的蛋白质，其中将所述核酸分子中的至少两种插入血凝素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座中，或将所述核酸分子中的至少一种插入所述血凝素和胸苷激酶基因座中的每一者中。
2.如权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述浣熊痘病毒是活病毒并且可复制。
3.如权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述外源性核酸分子中的至少一种编码猫杯状病毒衣壳蛋白。
4.如权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述外源性核酸分子中的至少一种编码猫杯状病毒FCV-2280衣壳蛋白。
5.如权利要求3所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述编码所述FCV-2280衣壳蛋白的核酸分子可操作连接至表达用早-晚期启动子上，所述启动子可为表达用合成早-晚期启动子。
6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含编码所述猫杯状病毒FCV-DD1衣壳蛋白的核酸分子，将所述核酸分子插入所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中。
7.如权利要求6所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述编码所述FCV-2280衣壳蛋白的核酸分子可操作连接至表达用牛痘病毒晚期启动子上，并且所述编码所述FCV-DD1衣壳蛋白的核酸分子可操作连接至表达用早-晚期启动子上，所述启动子可为表达用合成早-晚期启动子。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含编码所述猫杯状病毒FCV-255衣壳蛋白的核酸分子，将所述核酸分子插入所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中。
9.如权利要求1-7中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含至少一种编码猫病毒性鼻气管炎病毒糖蛋白gD或猫病毒性鼻气管炎病毒糖蛋白gB的外源性核酸分子。
10.如权利要求1-8中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含至少一种编码猫白血病病毒蛋白的外源性核酸分子。
11.如权利要求10所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含至少一种编码猫白血病病毒env蛋白或gag蛋白中至少一种的外源性核酸分子。
12.如权利要求10所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述编码所述病毒性抗原的核酸分子可操作连接至表达用早-晚期启动子上，所述启动子可为表达用合成早-晚期启动子。
13.如权利要求1-10中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含至少一种编码不同猫病原体的猫蛋白的异源核酸分子。
14.如权利要求1-13中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含至少一种编码猫披衣菌(Chlamydophila felis)蛋白的外源性核酸分子。
15.如权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含至少一种编码猫披衣菌外膜蛋白的外源性核酸分子。
16.如权利要求15所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述外膜蛋白基因的核酸序列可操作连接至表达用牛痘病毒晚期启动子上。
17.如权利要求1-16中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含编码猫白介素-12P35蛋白的核酸分子和编码猫白介素-12P40蛋白的核酸分子，将所述核酸分子插入所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中。
18.如权利要求1-17中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其另外包含编码猫蛋白的核酸分子，除将所述核酸分子插入所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶和血凝素基因座中外，也将其插入所述浣熊痘病毒基因组的第三非必需位点中。
19.如权利要求18所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述浣熊痘病毒基因组的第三非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。
20.一种猫疫苗，其包含免疫有效量的如权利要求1-19中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体和任选地适宜载剂或稀释剂。
21.一种猫疫苗，其包含免疫有效量的两种或更多种如权利要求1-19中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体和任选地适宜载剂或稀释剂。
22.如权利要求21所述的猫疫苗，其中所述疫苗另外包含一或多种选自由以下组成的群组的额外猫抗原的混合物：猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属(Bartonella)细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉(Bellingham)、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8和其组合。
23.如权利要求21所述的猫疫苗，其中所述疫苗包含两种或更多种选自由以下组成的群组的重组浣熊痘病毒载体的混合物：rRCNV-FCV2280、rRCNV-FCV2280-FCVDD1、rRCNV-FCV2280-FCVDD1-FCV255、rRCNV-FVR gD、rRCNV-FVR gB、rRCNV-FVR gD+gB、rRCNV-FeLV gag-pr65-pro/env-gp85、rRCNV-FeLV gag-pr65-pro-env-gp85(TK)//env-gp70(HA)、rRCNV-FCP momp和rRCNV-猫IL-12P35/P40。
24.如权利要求21所述的猫疫苗，其中所述疫苗另外包含一或多种选自由以下组成的群组的额外猫抗原的混合物：猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8和其组合。
25.一种在猫中诱导针对猫病原体的保护性免疫应答的方法，其包含向所述猫投与有效免疫量的如权利要求20-24中任一权利要求所述的疫苗。
26.一种质粒，其包含SEQ ID NO：1、2、3或4中任一者的核苷酸序列。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述疫苗的有效免疫量为至少约4.5Log10TCID50/ml。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述疫苗的有效免疫量介于约4.5Log10TCID50/ml至约7.5Log10TCID50/ml范围内。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述疫苗是以单次剂量或以重复剂量投与。
30.如权利要求20-24中任一权利要求所述的疫苗，其中所述疫苗不含佐剂。
31.一种重组浣熊痘病毒载体(RCNV)，其包含：
a)至少一种外源性核酸和至少一种同源外源性核酸，其各自编码来自两种或更多种不同猫病原体株系的相同猫蛋白，其中将所述至少一种同源核酸插入所述ha基因座或所述tk基因座的至少一者中；或
b)至少两种外源性核酸，每种核酸编码至少一种来自相同猫病原体的不同猫蛋白；其中将所述外源性核酸中的一种插入所述ha或所述tk位点的至少一者中，或者其中将至少一种核酸插入所述ha基因座中并且将至少一种核酸插入所述tk基因座中。
32.如权利要求1或31中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体(RCNV)，其包含至少两种同源外源性核酸分子，每种核酸分子编码来自两种或更多种不同猫病原体株系的相同猫蛋白，其中将所述同源外源性核酸分子插入所述ha基因座、所述tk基因座、所述丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座中，或其中将至少一种同源外源性核酸分子插入所述ha、tk或丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座的每一者中。
33.如权利要求31所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述至少两种外源性核酸分子中的至少一种编码一种选自由以下组成的群组的不同猫蛋白：猫杯状病毒蛋白、猫鼻气管炎的糖蛋白gB、猫鼻气管炎的糖蛋白gD、猫白血病病毒的gag蛋白、猫白血病病毒的env蛋白、猫披衣菌蛋白、和猫白介素-12的P35和P40蛋白。
34.一种猫疫苗，其包含免疫有效量的两种或更多种如权利要求1、13、18、31、32和33中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体。
35.如权利要求34所述的猫疫苗，其另外包含一或多种选自由以下组成的群组的额外猫抗原的混合物：猫泛白细胞减少病毒、猫免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、巴尔通体属细菌、FCV-Diva、FCV-Kaos、FCV-贝宁汉、FCV-F9、FCV-F4、FCV-M8和其组合。
36.一种在猫中诱导针对猫病原体的保护性免疫应答的方法，其包含向所述猫投与有效免疫量的如权利要求34或35中任一权利要求所述的疫苗。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述疫苗的有效免疫量为至少约4.5Log10TCID50/ml。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述疫苗的有效免疫量介于约4.5Log10TCID50/ml至约7.5Log10TCID50/ml范围内。
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