KR20100038323A - 고양이 항원의 유전자를 발현하는 라쿤 폭스바이러스 - Google Patents

고양이 항원의 유전자를 발현하는 라쿤 폭스바이러스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 외인성 핵산 분자를 포함하는 새로운 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터에 대한 것으로서, 상기 각 핵산 분자는 적어도 하나의 고양이 단백질을 코딩하고, 상기 핵산 분자 중 2 이상은 헤마글루티닌(ha) 자리 또는 티미딘 키나아제(tk) 자리에 삽입되거나, 또는 핵산 분자 중 하나 이상은 헤마글루티닌 및 티미딘 키나아제 자리에 각각 삽입된다. 면역학적 유효량의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터 및, 임의적으로 적절한 담체 또는 희석제를 포함하는 1가 및 다가의 재조합 고양이 백신이 본원에 기술된다. 본 발명의 백신은 다양한 고양이 병원체에 대하여 고양이에게 광범위한 스펙트럼의 보호를 제공하기 위해 선택적으로 추가의 고양이 항원을 포함한다. 또한, 본 발명은 재조합 백신을 투여함으로써 고양이에 있어서 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

고양이 항원의 유전자를 발현하는 라쿤 폭스바이러스{RACCOON POXVIRUS EXPRESSING GENES OF FELINE ANTIGENS}
본 발명은 고양이 항원의 복수 유전자를 발현하는 새로운 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(recombinant raccoon poxvirus vector) 및 고양이 병원체에 의해 야기된 감염 또는 질병의 예방에 있어서 다가(multivalent) 백신에서의 벡터의 용도에 관한 것이다.
많은 고양이 감염성 질병들이 풍토병이 되면 다수의 고양이가 사는 환경, 특히 동물 병원, 고양이 사육장, 그리고 경우는 덜하지만 동물 보호소에서도 치명적인 상황을 야기하게 된다. 고양이의 건강에 매우 중요한 두 병원체는 고양이 칼리시바이러스(feline calicivirus(FCV))와 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스(feline rhinotracheitis virus(FVR))로 알려져 왔는데, 이는 모든 고양이 호흡기 감염의 거의 90% 이상이 FVR과 FCV가 차지하기 때문이다. 보통, FCV 감염은 상기도(upper respiratory tract)에 영향을 주어 바이러스성 비기관지염(FVR)과 흡사한 증상을 나타내게 되는데, 이따금 관절 통증과 절름발이 증상을 보이기도 한다. 또한, 감염된 고양이는 혀 위와 입 부위에 궤양이 발병되기도 한다. 콧구멍, 경구개 및 혀에서 소포진 및 진무름이 퍼지기도 한다. FCV 질병의 다른 증상들로서는 고열, 탈모, 다리 또는 얼굴 주변에 피부 궤양 및 부종(종기)을 포함한다. 감염 균주의 병독성에 따라, FCV 감염은 치명적이 될 수 있다. 감염 전달의 일차적인 방법은 경구 경로 감염을 통해서이지만, 고양이는 감염된 다른 고양이들의 타액, 배설물 또는 오줌에 존재하는 감염성 바이러스의 흡입에 의해 감염될 수 있다. FCV는 매우 전염성이 강해서; 감염된 고양이는 감염 후에 장시간 동안 그 바이러스를 계속 퍼뜨릴 것이고, 회복된 고양이는 그 감염성 바이러스를 일생동안 보유할 수도 있다. 증상이 없는 고양이조차도 다른 건강한 고양이에게 치명적인 질병을 퍼뜨릴 수 있다. 최근, 북부 캘리포니아와 뉴잉글랜드에서, 동물 보호소의 고양이 집단에 특히 치명적이고 매우 전염성이 강한, 출혈성 칼리시바이러스의 유전적으로 다른 두 균주(각각 FCV-Ari와 FCV-Diva로 명명됨)가 출현하였다는 보고가 있었다(문헌 [N. C. Pedersen et al., "An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus," Veterinary Microbiol. 73: 281-300 (May 2000)]; [E. M. Schorr-Evans et al., An epizootic of highly virulent feline calicivirus disease in a hospital setting in New England," Journal of Feline Medicine and Surgery 5:217- 226 (2003)]).
고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스(FVR)는 헤르페스바이러스 군의 고양이 헤르페스바이러스 1(FHV-1)이다. 집 고양이와 야생 고양이에서 전세계적으로 발견되는 FVR은 감염성이며 급성인 고양이의 상기도 감염을 야기하는데, 이는 비염(코의 염증), 열병, 결막염(눈꺼풀 내막의 염증), 코와 눈 고름 및 재채기 증상을 특징으로 한다. 또한, 상기 바이러스는 생식기에도 영향을 미쳐 임신 기간 중에 합 병증을 유발시킬 수도 있다. 바이러스성 질병은 흔히 비기관지염(또는 고양이 헤르페스바이러스 감염)로서 알려져 있으나, 보통 고양이 인플루엔자 또는 코리자(coryza)로서도 알려져 있다. 고양이의 FVR 호흡기 질환은 매우 전염성이 강해서, 특히 고양이 사육장에서는 심각할 수 있다. 고양이과의 모든 동물이 FVR에 감염되기 쉽지만, 어린 새끼 고양이와 늙은 고양이들은 폐렴으로 인한 폐사를 비롯하여, FVR에 의해 야기된 중증 질환에 더 감염되기 쉽다. 샴 고양이(Siamese)와 버마 고양이(Burmese)와 같은 특정 품종이 다른 것들보다 FVR에 의해 더욱 심각하게 영향을 받는 것으로 밝혀졌다.
FCV 이외에, FVR에 의해 야기된 비기관지염은 코와 눈의 고름과 함께 재채기를 야기하는 바이러스성 및 세균성 감염군인 고양이 상기도 감염 또는 복합 상기도 질환의 일부이다. 고양이는 종종 동시에 2종 이상의 상기도 감염에 걸린다. FCV와 FVR(FHV-1)가 가장 흔한 두 감염증을 일으키지만, 복합 호흡기 질환도 통상 클라미디아증(Chlamydiosis)을 포함한다.
고양이 클라미디아증은 전세계적으로 확산된 병원체인 클라미도필라 펠리스(Chlamydophila felis, 이전에는 고양이 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci)로 알려짐)에 의해 발병된다. 때로는 클라미디아 시타시 고양이 간질성 폐렴 병원체로도 지칭되는 상기 세균성 병원체는, 고양이 결막염 및 폐렴(간질성 폐렴)의 원인이 되는 병원체이다. 결막염이 흔한 주요 임상적 증상이나, 병든 고양이는 경미한 재채기 및 코 고름 증상도 수반할 수도 있다. 때로는, 무기력감과 식욕 감퇴를 초래하는 경미한 열병이 생기지만, 보통 클라미도필라 펠리스에 감염된 고양이들은 초기에는 건강하게 보인다. 그러나, 치료되지 않은 상태로 놓이면, 결막염이 대개 8주 이상 지속되어 고양이는 몇 달 뒤에 죽게 될 것이다. 이후, 감염증은 더 심각한 경우인 폐렴으로 진행된다.
고양이에 있어서, 전염성이며 치명적인 감염증을 유발시키는 또 하나의 심각한 병원체는 고양이 백혈병 바이러스(FeLV)이다. FeLV로 인한 감염증은 흔하고 집 고양이의 치명적 질병의 주요 원인이 되어, 고양이에 있어서 다른 기타 감염성 질병보다 더 많은 폐사율의 요인이 된다. 고양이는 바이러스로 감염된 후 수개월 또는 수년 동안 질병의 증상이 개시되지 않을 수 있다. 일단 FeLV로 지속적으로(영구적으로) 감염되면, 고양이는 빈혈증과 암의 중증 질병을 진행시킬 수 있는 높은 위험에 처해진 것이다. RNA로 이루어지고 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)와 연관이 있는 암컷 레트로바이러스인 FeLV는 고양이 백혈병(암성 질병), 면역결핍증 및 기타 암의 원인이 되는 병원체이다. 대략 80-90%의 감염된 고양이가 FeLV 감염증으로 진단된 후 3년 반 이내에 폐사한다. 통상적으로, FeLV 감염은 바이러스가 면역계의 세포를 공격하는 면역억제를 유도하게 된다. 바이러스는 백혈구 세포를 사멸시키거나 손상을 입혀 고양이가 여러가지 다양한 기타 질병 및 2차 감염에 걸리기 쉽도록 만든다. FeLV 감염은 전염성이 높지는 않아, 바이러스의 유행은 오히려 고양이들이 밀착하여 장시간 접촉하는 것에 의존하는데, 예를 들어, 고양이 집단에서 30%까지 고양이를 감염시킬 수 있는 고양이 사육장, 동물 보호소, 여러 마리의 고양이 가족이 있는 장소 및 고양이 밀집 거주지가 그러한 바이러스가 유행가능한 접촉 공간의 예이다.
따라서, FVR과 FCV는 모든 고양이 호흡기 질병의 대다수를 차지하고; FVR, FCV 및 고양이 클라미디아증은 고양이 복합 상기도 질환으로 알려진 군과 동일한 고양이를 빈번하게 감염시켜며; FeLV로 인한 감염은 종종 치명적이다. 고양이의 이러한 심각한 감염증 또는 치명적인 질병 상태를 예방하기 위한 효과 있는 혼합 백신의 개발은 수의학 분야에서 매우 중요할 것이다.
과거에는, 1가 백신들이 기술되어 왔고 고양이 칼리시바이러스 F9 균주(미국 특허 제3,944,469호), 고양이 클라미디아 시타시(미국 특허 제5,972,350호 및 제5,242,686호), 고양이 백혈병 바이러스(미국 특허 제4,264,587호) 등과 같은 다양한 항원들을 이용하여 고양이 질병을 예방하기 위해 일부 백신들이 제조되었다. FCV-M8과 FCV-255와 같은 다른 칼리시바이러스 균주 및 고양이 비기관지염 바이러스도 이전에 단리되었으며, 백신 용도로도 기술되어 있다(문헌 [E. V. Davis et al., "Studies on the safety and efficacy of an intranasal feline rhinotracheitis-calici virus vaccine," VM-SAC 71:1405-1410 (1976)]; [D. E. Kahn et al., "Induction of immunity to feline caliciviral disease," Infect. Immun. 11:1003-1009 (1975)]; [D. E. Kahn, "Feline viruses: pathogenesis of picornavirus infection in the cat," Am. J. Vet. Research 32:521-531 (1971)]). 미국 특허 제6,231,863호는 FCV-2280 균주 게놈의 뉴클레오타이드 서열과, 고양이 칼리시바이러스 질병을 예방하기 위한 캡시드 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 이용한 백신을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,106,619호는 특히 고양이 칼리시바이러스를 포함하는 비활성화된 바이러스 백신의 제조를 개시하고 있다. 미국 특허 제 6,051,239호는 변형된 보툴리눔 독소와 함께 칼리시바이러스와 같은 항원을 병용하는 경구 백신을 기술하고 있다.
분명히, 다가 백신은 고양이에게는 외상이 덜 가게 하고, 고양이를 취급하는 사람 또는 수의사에게는 보다 용이하게 광범위한 군의 병원체에 대하여 고양이를 접종할 수 있다는 점에서, 예전의 1가 백신에 비해 장점을 제공한다. 따라서, 다가 백신은 클라미도필라 펠리스(이전에 고양이 클라미디아 시타시로 알려짐)와 같은 많은 항원들과 함께, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 칼리시바이러스, 고양이 비기관지염 바이러스, 고양이 후천성 면역결핍 바이러스, 공수병, 고양이 감염성 복막염, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 등(미국 특허 제6,004,563호)을 포함하는 하나 이상의 병원체와의 혼합물을 포함하도록 제조되거나 기술되었다. 리카드(Rickard) 단리된 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 비기관지염 바이러스, 고양이 칼리시바이러스 및 고양이 범백혈병 바이러스의 또 다른 혼합물이 백신으로서 유사하게 기술되었다(미국 특허 제5,374,424호).
공교롭게도, 이전에 사용된 고양이 칼리시바이러스 균주를 포함하는 선행하는 백신들 중 그 어느 것도, 최근에 생겨나고 있는 출혈성 고양이 칼리시바이러스 균주로부터 고양이를 적절히 보호하지 못하고 있다. 최근 출혈성 고양이 칼리시바이러스의 출현에서는, 고양이들이 칼리시바이러스에 대한 백신 접종을 받았음에도, 현저하게 많은 수의 고양이가 폐사되었다. 더욱이, 고양이의 백신 접종은 고양이가 때로는 특정 병원체에 대해 특이적 반응을 나타내어, 접종물에 대해 충분한 면역 반응을 얻기 위해 아주반트의 첨가가 필요한 전형적인 주사 제형에 대해 육종-유발 부작용을 보이는 점에서, 그 특유의 어려움이 있다.
심각한 고양이 감염증 또는 질병에 대해 보다 나은 고양이의 면역성을 부여하기 위해 고양이 백신 조성물을 개선하고자 하는 시도에 있어서, 재조합 기법에 대하여 연구 노력이 집중되었다. 현재까지, 백신으로서 재조합 라쿤 폭스바이러스의 주제에 대해 간행된 정보물은 상당히 많이 존재한다. 그럼에도 불구하고, 아주반트를 포함하는 필요성을 피하면서 고양이의 충분한 면역 반응을 유도하기 위해, 항원성 단백질을 성공적이고 알맞게 발현하는 기능적이며 다가의 재조합 백신을 발굴하여 개발하는 것은 어려운 과제이다.
예컨대, 미국 특허 번호 제6,241,989호 및 이의 연속 출원인 미국 특허 번호 제7,087,234호는 티미딘 키나아제 유전자 또는 헤마글루티닌 유전자 내에 삽입된 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 다가의 재조합 라쿤 폭스바이러스를 다루고 있다. 상기 두 관련 특허에는 고양이 병원체에 의한 차후의 공격에 대해 고양이에게 면역성을 부여하기 위한 백신으로서의 다가의 재조합 라쿤 폭스바이러스의 용도가 개시된다. 또한, 재조합 방법에 의하여 다가의 재조합 라쿤 폭스바이러스를 제조하는 방법도 개시되는데, 여기서 재조합 방법은, 외인성 유전자가 삽입되는 삽입 벡터를 구축하는 단계; 라쿤 폭스바이러스 티미딘 키나아제 유전자 또는 헤마글루티닌 유전자 내에서 재조합할 수 있는 서열에 상기 삽입된 유전자를 측접(flanking)시키는 단계; 외인성 유전자를 포함하는 삽입 벡터와 라쿤 폭스바이러스 모두를 감염되기 쉬운 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 생성된 플라크에서 재조 합형 라쿤 폭스바이러스를 선별하는 단계를 수반한다. 이 특허에서 다가의, 재조합 라쿤 폭스바이러스는 고양이 세포 내에서 이를 감염시키고 복제할 수 있고, 바이러스 복제에 필수적이지 않은 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 유전자 또는 티미딘 키나아제 유전자로 이루어진 영역 내로 삽입된 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는데, 특히 여기서 외인성 유전자는 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 각 외인성 유전자는 고양이 병원체 항원을 코딩한다. 상기 특허는 고양이 백혈병 바이러스(FeLV Env), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV Gag), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV Env), 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV M), 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV N), 고양이 칼리시바이러스(FCV 캡시드 단백질), 고양이 범백혈구감소증 바이러스(FPV VP2) 및 공수병-G와 같은 고양이 병원체 항원을 코딩하는 외인성 유전자들에 대해 기술하고 있다.
미국 특허 번호 제6,294,176호는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 HindIII "U" 게놈 영역, HindIII "M" 게놈 영역 또는 HindIII "N" 게놈 영역 내의 비필수 영역 내에 삽입된 외부 DNA 서열을 포함하는 라쿤 바이러스 바이러스성 게놈로 이루어진 재조합 라쿤 폭스바이러스(RCNV) 백신에 관한 것이다. 상기 라쿤 폭스바이러스 바이러스성 게놈는 이 특허에서 바이러스성 게놈의 라쿤 폭스바이러스 숙주 범위 유전자(host range gene) 내에 결실을 포함하는 것으로 기술된다. 상기 특허는 라쿤 폭스바이러스 게놈 내에 외부 DNA 서열을 삽입하여 재조합 라쿤 폭스바이러스를 제조하기 위한 상동성 벡터를 제공한다.
미국 특허 번호 제6,106,841호는 특히 이종성 항원에 대해 동물에게 면역성 을 부여하기 위한 특유의 전달 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 이종성 항원을 코딩하는 핵산 분자를 갖는 재조합형 라쿤 폭스바이러스를 포함하는 조성물을 결막 경로를 통해 동물에게 투여하는 것을 기술하고 있다. 결막 경로 이외에, 상기 특허는 비강 내 백신 접종 투여 경로도 개시하고 있다. 재조합 라쿤 폭스바이러스에 의해 발현될 수 있으며 상기 특허 방법에 사용될 수 있는 이종성 항원은 칼리시바이러스, 코로나바이러스, 헤르페스바이러스, 면역결핍 바이러스, 감염성 복막염 바이러스, 백혈병 바이러스, 파보바이러스 항원, 공수병 바이러스, 바르토넬 라(Bartonella), 여시니아, 디로필라리아, 톡소플라스마, 벼룩 항원 또는 벼룩 알레르겐, 작은 곤충(midge) 항원 또는 알레르겐, 진드기 항원 또는 알레르겐 및 종양 항원과 같은 것들이 있다. 덧붙여, 재조합 라쿤 폭스바이러스는 사이토카인, 케모카인과 같은 면역조절인자 및 기타 면역조절인자를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수도 있으나, 이러한 구축물이 어떻게 만들어지는가에 대한 구체적인 실시예는 없다. 또한, 여기에서 특허권자들은 그들의 청구 방법의 예시 단계에서 이전의 구축물만을 사용하기 때문에, 이종성 항원을 코딩하는 새로운 재조합 라쿤 폭스바이러스가 어떻게 제조되는가에 대한 개시도 없다. 여기에는 하나 이상의 핵산 분자가 사상충 PLA2 항원을 코딩하는 공지된 RCNV/PLA2 폭스바이러스에 대한 언급만 있고, 그 실시예는 공수병 당단백질 G(gG) 단백질, 즉, RCNV/공수병 gG(RCN/G)를 발현하는 공지된 재조합 라쿤 폭스바이러스의 비강 내 및/또는 결막 투여 만을 설명하고 있다. 특히, 공지된 RCNV/공수병 gG 구축물은 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자 내에 폭스바이러스 P11 프로모터에 작동가능하게 연결된 공수병 당단백질 G 단백질 을 코딩하는 이종성 핵산 분자를 삽입함으로써 제조된다. 이 특허는 임의의 다른 신규한 형태의 재조합 라쿤 폭스바이러스의 제조에 대해서 기술하거나 시사하고 있지는 않다.
미국 특허 번호 제6,010,703호는 고양이에 있어서 FHV-1에 대한 면역성을 부여하여, 고양이 바이러스성 비기관지염(FVR)을 억제하는 방법에서 사용될 수 있는 고양이 헤르페스바이러스(FHV-1)에 대한 재조합 폭스바이러스 백신에 관한 것이다. 이 특허는 고양이 헤르페스바이러스 gD 당단백질 전구체 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 gB 전구체 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하여 이를 발현하는 재조합 라쿤 폭스바이러스를 기술하며 여기서, 유전자는 폭스바이러스-티미딘 키나아제 도너 플라스미드 내로 삽입 또는 클로닝된다. FHV-1 gB 또는 FHV-1 gD만을 발현하는 라쿤 폭스 재조합체는 이들 모두 질병의 임상적 징후에 대한 보호를 유도하는 것으로 설명되어 있다.
단일 고양이 항원, 예컨대 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 또는 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV)의 발현을 위해 추가의 재조합 기법이 유사하게 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,989,562호는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)에 의해 야기된 질병의 예방을 위한 백신에서 유용한 재조합 라쿤 폭스바이러스에 관해 기술한다. 이 특허의 개시 내용에 따르면, 재조합 라쿤 폭스바이러스는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)의 FIV gag 단백질(gag), FIV 외피 단백질(env), FIV env의 아미노산 1-735번으로 이루어진 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 내부 유전자를 가진다. 여기에 기술된 FIV를 발현하는 재조합 라쿤 폭스바이러스를 하나 이상 포함하는 백신은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 약학적으로 허용가능한 아주반트(adjuvant)도 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,989,562호는 FIV에 의해 야기되는 질병을 예방 또는 경감시키는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 기술된 백신을 이러한 질병의 치료가 필요한 고양이에게 투여함으로써 수행된다. 폭스바이러스 내에 FIV gag 또는 env 유전자를 도입하는 것은 바이러스성 티미딘 키나아제 유전자를 붕괴시킴에 의해서만 이루어진다.
이와 유사하게, 미국 특허 번호 제5,820,869호는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)의 외피 단백질을 발현하고, 단독으로 또는 담체 및 아주반트와 병용하여 백신으로 유용한 재조합 라쿤 폭스바이러스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이 특허는 FIV의 외피 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 내부 유전자를 갖는 재조합 라쿤 폭스바이러스를 기술하고 있다.
미국 특허 번호 제5,770,211호는 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV)의 뉴클레오캡시드 및 막관통 단백질을 발현하는 재조합 라쿤 폭스바이러스를 개시하고 있다. 특히, 이 특허에서는 FIPV의 막관통(M/E1) 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 내부 유전자를 갖는 재조합 라쿤 폭스바이러스가 기술되어 있으며, 이를 권리로서 청구하고 있다.
또한, 미국 특허 번호 제5,656,275호는 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV)의 뉴클레오캡시드 및 막관통 단백질을 발현하는 재조합 라쿤 폭스바이러스를 기술하고 있다. 특히 이 특허에서는 FIPV의 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 코딩 하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 내부 유전자를 갖는 재조합 라쿤 폭스바이러스가 기술되어 있으며, 이를 권리로서 청구하고 있다.
미국 특허 제5,505,941호는 병원체의 항원을 코딩하고 발현하는 임의의 공급원 DNA를 조류폭스 게놈의 비필수 영역에 존재하게 하여 변형된 계두 바이러스 또는 카나리폭스 바이러스와 같은 합성된 재조합 조류폭스 바이러스로 포유동물 또는 조류 숙주를 접종시킴으로써, 병원체에 대한 포유동물 또는 조류 숙주의 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 이 특허는 공수병 G 항원, gp51,30 소 백혈병 바이러스의 외피 항원, 고양이 백혈병 바이러스의 FeLV 외피 항원 및 단순 포진 바이러스의 당단백질 D 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 동정하고 있다. 구체적으로, 이 특허는 p70+p15E 다단백질(polyprotein)을 코딩하는 서열을 포함하는 당단백질의 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피(env)를 발현하는 조류폭스바이러스 재조합체의 구축에 대해서 개시하고 있다. 이 유전자는 FeLV env 유전자에 대해 5' 방향으로 병치된 백시니아(vaccinia) H6 프로모터를 갖는 플라스미드 내에 삽입되었는데, 여기서 상기 플라스미드는 백시니아 헤마글루티닌(ha) 유전자를 포함하는 1802 bp Sal I/Hind III 단편을 pUC18 벡터 내에 먼저 삽입시켜 유도하였다.
수의학 백신 업계에서 행해진 이러한 모든 노력에도 불구하고, 당업계에서는 광범위한 고양이 항원에 대해 고양이에게 적절한 보호 면역 반응을 부여하는 안전하고 효과적인 혼합 백신(combination vaccine)을 제공하고자 하는 명확한 필요성이 여전히 계속 제기되고 있다. 동물 보호소, 다수의 고양이가 사는 세대 등에서 우세하게 횡행하는 높은 전염성의 출혈성 고양이 칼리시바이러스 감염증 때문에, 출혈성 FCV 균주 및 흔한 FCV 균주 모두에 의해 야기되는 심각한 감염증 및 질병에 대해 고양이를 보호할 수 있는 광범위한 바이러스성 백신을 제공하고자 하는 당업계의 또 다른 필요성이 제기되고 있다. 또한, 당업계에서는 고양이를 급성 및 만성 바이러스성 또는 세균성 질병으로부터 보호하기 위해 FCV의 전염성의 출혈성 균주 및 기타 고양이 병원체에 대한 특이적인 면역 반응을 유도해낼 수 있는 다가 백신을 만들고자 하는 또 다른 요구가 제기되고 있다. 본 발명의 고양이 다가 백신은 재조합 구축물의 6가지 이상의 서로 다른 재조합 구축물의 분획의 신규한 조합을 통하여 우수한 항체 역가를 훌륭하게 달성하고 광범위한 면역화를 가능하게 함으로써 당업계에서 존재하는 기존의 기술적 문제점들을 해결한다.
상기한 목적들은 본원에 기술된 바와 같은 안전하고 효과적인 재조합 고양이 조합 백신에 의해 달성되는데, 이 백신은 고양이에 있어서 아주반트를 첨가하지 않고도 다수의 고양이 항원들에 대해 보호 면역 반응을 유도한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 문헌 및 간행물은 그 내용 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 개요
본원의 가장 광범위한 측면으로서, 본 발명은 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌(ha) 및/또는 티미딘 키나아제(tk)의 삽입 자리에서 다수의 고양이 바이러스성 항원, 세균성 항원 및 사이토킨 항원을 발현하기 위한 벡터로서 라쿤 폭스바이러스를 이용하는, 1가 또는 다가의 백신으로서 유용한, 안전하고 효과가 있고, 아주반트를 첨가하지 않은 재조합 고양이 백신(feline vaccine)을 제공한다. 상기 신규한 라쿤 폭스바이러스 벡터는 우선적으로 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리에 삽입된 하나 이상의 핵산 분자; 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리에 삽입된 2개 이상의 핵산 분자; 또는 대안적으로는, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리에 삽입된 하나 이상의 핵산 분자와, 동시에 라쿤 폭스바이러스 게놈의 티미딘 키나아제 자리에 삽입된 하나 이상의 핵산 분자를 보유하도록 고안된다. 구체적으로, 상기 구축물은 고양이 칼리시바이러스(FCV) 캡시드 단백질, 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스(FVR) 당단백질 D/B(gD/gB), 고양이 클라미디아 시타시(FCP, 현재 클라미도필라 펠리스로서 흔히 알려짐) 외막 단백질(momp), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) gag-pr65-pro/env-gp70/env-gp85 및 고양이 인터루킨-12(IL-12) P35/P40를 코딩하는 핵산 분자 또는 유전자를 발현하는데, 후자 성분은 고양이에 있어서 상기 조합 백신(comb vaccine)의 면역원성을 향상시키기 위한 면역조절인자로서 포함되는 것이다. 본 발명의 1가 및 다가의 재조합 고양이 백신은 면역 유효량의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터와, 임의적으로는, 적절한 담체 또는 희석제를 포함한다. 유익한 점으로, 상기 조합 백신 제형은 숙주 면역 반응을 향상시키기 위해 아주반트를 필요로 하지 않는데, 이로써 일부 전형적인 주사용 백신에서 빈번히 발생할 수 있는 아주반트 연관 육종 부작용을 피할 수 있게 된다. 본 발명의 백신은 선택적으로 하나 이상의 추가의 고양이 항원을 포함하여, 다양한 고양이 병원체에 대하여 고양이를 광범위하게 보호할 수 있게 된다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 백신을 고양이에게 투여함으로써 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 일 양태에서 2개 이상의 외인성 동종 핵산 분자를 포함하는 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(rRCNV)를 제공하는데, 여기서 상기 각 핵산 분자는 동일한 고양이 병원체 중 2개 이상의 서로 다른 균주로부터 유래한 고양이 단백질을 하나 이상 코딩하며, 여기서 핵산 분자 중 2개 이상은 헤마글루티닌(ha) 자리 또는 티미딘 키나아제(tk) 자리에 삽입되거나, 또는 핵산 분자 중 하나 이상은 헤마글루티닌 및 티미딘 키나아제 자리에 각각 삽입된다. 2개의 외인성 핵산이 동일한 자리에 삽입되는 경우, 이들은 인접할 수 있거나, 또는 이들은 삽입 서열(intervening sequence)에 의해 분리될 수도 있다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 임의의 비필수 부위에 삽입된 고양이 바이러스성/세균성 항원 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 티미딘 키나아제 및 헤마글루티닌 자리 이외의 라쿤 폭스바이러스 게놈의 제3 비필수 부위에 삽입된 고양이 바이러스성/세균성 항원 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 제3 비필수 부위는 세린 프로테아제 억제제 부위이다.
일 구체예에서, 라쿤 폭스바이러스는 살아 있고(live) 복제가능하다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입되는, FCV-2280의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 발현을 위해 백시니아 바이러스 후기 프로모터 P11 또는 초기-후기(early-late) 프로모터에 작동가능하게 연결된 FCV-2280 캡시드 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 프로모터는 발현을 위한 합성 초기-후기 프로모터일 수 있다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된 FCV-DD1의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 발현을 위해 백시니아 바이러스 후기 프로모터에 작동가능하게 연결된 FCV-2280 캡시드 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 발현을 위해 초기-후기 프로모터에 작동가능하게 연결된 FCV-DD1 캡시드 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는데, 여기서 프로모터는 발현을 위한 합성 초기-후기 프로모터일 수 있다.
일 구체예에서, 재조합형 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된 FCV-255의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된, 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스 당단백질 gD를 코딩하는 핵산 분자 및 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스 당단백질 gB를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된, 고양이 백혈병 바이러스 항원 gag-pr65-pro를 코딩하는 핵산 분자 및 고양이 백혈병 바이러스 항원 env-gp85를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 라쿤 폭스바이러스 벡터에서 바이러스성 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 발현을 위한 합성 초기-후기 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 또는 이들 자리 모두에 삽입된, 고양이 백혈병 바이러스 항원 gag-pr65-pro를 코딩하는 핵산 분자, 고양이 백혈병 바이러스 항원 env-gp70을 코딩하는 핵산 분자 및 고양이 백혈병 바이러스 항원 env-gp85를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된, 클라미도필라 펠리스 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된 클라미도필라 펠리스의 외막 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 클라미도필라 펠리스의 외막 단백질 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 발현을 위해 백시니아 바이러스 후기 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 티미딘 키나아제 자리, 바람직하게는 헤마글루티닌 자리에 삽입된, 고양이 인터루킨-12의 P35 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 고양이 인터루킨-12의 P40 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
본 발명의 두 번째 양태에서 본원에 기술된 바와 같은 면역학적 유효량의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터와, 선택적으로, 적절한 담체 또는 희석제를 포함하는 고양이 백신을 제공한다.
일 구체예에서, 라쿤 폭스바이러스는 살아 있고 복제가능하다.
일 구체예에서, 상기 백신은 단일 투여량으로 또는 반복 투여량으로 투여된다.
일 구체예에서, 상기 백신은 아주반트를 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명은 고양이 바이러스성/세균성 항원 및/또는 본 발명의 IL-12와 같은 사이토킨을 발현하는, 2개 이상의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터 구축물의 면역학적 유효량을 포함하는 고양이 혼합 백신을 제공한다. 상기 혼합 백신의 예로서는 이에 제한되지는 않지만, (1) rRCNV-고양이 3(변형된 생(生) FPV, rRCNV-FCV, rRCNV-FVR); (2) rRCNV-고양이 4(rRCNV-고양이 3 + rRCNV-FCP); (3) rRCNV-고양이 4 + rRCNV-FeLV; (4) rRCNV-고양이 IL-12를 포함하며, 이들은 각 혼합 백신에서 면역조절인자로서 제제화될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 백신은 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 고양이 항원의 혼합물을 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 상기 백신은 rRCNV-FCV2280, rRCNV-FCV2280-FCVDD1, rRCNV-FCV2280-FCVDD1-FCV255, rRCNV-FVR gD/gB, rRCNV-FeLV gag-pr65-pro/env-gp85, rRCNV-FeLV gag-pr65-pro/env-gp70/env-gp85, rRCNV-FCP momp 및 rRCNV-고양이 IL-12 P35/P40로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터의 2종 이상의 혼합물을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 백신은 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 고양이 항원의 혼합물을 추가로 포함한다.
본 발명의 세 번째 양태에서 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 상기 백신의 면역 유효량을 고양이에게 투여하는 단계를 포함하여, 고양이에 있어서 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 보호 면역 반응은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 이상인 상기 백신의 면역 유효량을 투여함으로써 유도된다.
일 구체예에서, 보호 면역 반응은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 내지 약 7.5 Log10TCID50/㎖ 범위인 상기 백신의 면역 유효량을 투여함으로써 유도된다.
일 구체예에서, 보호 면역 반응은 체액 또는 항체 매개성 반응이다.
일 구체예에서, 보호 면역 반응은 세포 매개성 또는 T 세포 매개성 면역 반응이다.
본 발명의 네 번째 양태에서 본원에 기술된 바와 같은 플라스미드 구축물 및 핵산 서열 중 하나 이상을 제공한다.
일 구체예에서, 플라스미드는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산은 FCV-2280 또는 FCV-DD1과 같은 특정 균주로부터 유래한다.
다른 구체예에서, 이러한 균주들 중 어느 하나의 균주는 칼리시바이러스의 또 다른 균주에서 유래한 것과 동일하거나 유사한 단백질을 코딩하는 핵산으로 대체될 수 있다. 칼리시바이러스의 다른 균주는 FCV-2280 또는 FCV-DD1 중 어느 하나에 대해 교차 보호할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, FCV-DD1을 코딩하는 핵산은 당업계에 잘 알려진 또 다른 초전염성, 전염성, 출혈성 또는 전염성계 균주로 대체될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,029,682호; WO 2005/072214, 미국 특허 제2006/0057159호, 미국 특허 제6,541,458호; 미국 특허 제6,534,066호 및 미국 특허 제2004/0259225호를 참조한다.
본 발명의 다섯 번째 양태에서는 하기를 포함하는 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(RCNV)를 제공한다:
a) 하나 이상의 외인성 핵산 및 하나 이상의 동종의 외인성 핵산 (여기서, 각 핵산은 2개 이상의 서로 다른 고양이 병원체 균주로부터 유래한 것과 동일한 고양이 단백질을 코딩하며, 상기 하나 이상의 동종 핵산은 ha 자리 또는 tk 자리 중 하나 이상의 자리에 삽입된다); 또는
b) 2개 이상의 외인성 핵산 (여기서, 각 핵산은 동일한 고양이 병원체로부터 유래한 것과는 서로 다른 고양이 단백질을 하나 이상 코딩하며, 상기 외인성 핵산 중 하나의 핵산은 ha 또는 tk 부위 중 하나 이상의 부위에 삽입되거나, 또는 상기 하나 이상의 핵산은 ha 자리에 삽입되며, 하나 이상의 핵산은 tk 자리에 삽입된다).
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(RCNV)는 2개 이상의 동종의, 외인성 핵산 분자를 포함하는데, 여기서 각 핵산 분자는 2개 이상의 서로 다른 고양이 병원체 균주로부터 유래한 것과 동일한 고양이 단백질을 코딩하며, 상기 동종의 외인성 핵산 분자는 ha 자리, tk 자리, 세린 프로테아제 억제제 자리에 삽입되거나, 또는 상기 하나 이상의 동종의 외인성 핵산 분자는 ha, tk, 또는 세린 프로테아제 억제제 자리 각각에 삽입된다.
일 구체예에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터는 2개 이상의 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하는데, 여기서 2개 이상의 외인성 핵산 분자 중 하나 이상은 고양이 칼리시바이러스 단백질, 고양이 비기관지염의 당단백질 gB, 고양이 비기관지염의 당단백질 gD, 고양이 백혈병 바이러스 유래의 gag 단백질, 고양이 백혈병 바이러스 유래의 env 단백질, 클라미도필라 펠리스 단백질 및 고양이 인터루킨-12의 P35 및 P40 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 상이한 고양이 단백질을 코딩한다.
본 발명의 여섯 번째 양태에서 고양이에게 투여하기 위한 상기 기술된 임의의 하나 이상의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 백신은 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 고양이 항원의 혼합물을 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 상기 기술된 백신은 기술된 백신의 면역 유효량을 고양이에게 투여함으로써 고양이에 있어서 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 백신의 면역 유효량은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 이상이다.
일 구체예에서, 상기 백신의 면역 유효량은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 내지 약 7.5 Log10TCID50/㎖ 범위이다.
본 발명의 일곱 번째 양태에서 포유동물에 있어서 고양이 병원체 단독 또는 다른 고양이 항원 또는 단백질과 조합된 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응 유도용 약제의 제조를 위한 본 발명의 임의의 벡터 또는 백신의 용도를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 pFD2000A-FDAH 플라스미드의 핵산 서열이다(서열 번호 1).
도 2는 pFD2001 TK-FDAH 플라스미드의 핵산 서열이다(서열 번호 2).
도 3은 pFD2003SEL-FDAH 플라스미드의 핵산 서열이다(서열 번호 3).
도 4는 pFD2003SEL-GPV-PV-FDAH 플라스미드의 핵산 서열이다(서열 번호 4).
도 5는 FCP momp-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 5).
도 6은 FCV255-Bmut-N-결실-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 6).
도 7은 FCV2280-N-결실-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 7).
도 8은 FCVDD1-N-결실-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 8).
도 9는 고양이 IL-12 p35-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 9).
도 10은 고양이 IL-12 P40-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 10).
도 11은 FeLV 61E Env-gp85-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 11).
도 12는 FeLV 61E gag-pr65-pro-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 12).
도 13은 FeLV 61E P27-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 13).
도 14는 FVR-gB-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 14).
도 15는 FVR-gD-BKXMut-FDAH의 핵산 서열이다(서열 번호 15).
발명의 상세한 설명
본 발명의 방법 및 치료 방법론을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되는 것이 아니라 이러한 방법들과 조건들은 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범주는 첨부되는 특허청구범위에서만 한정될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 특정 구체예들만을 기술하기 위한 목적으로 사용된 것이지, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
본원 명세서와 첨부되는 특허청구범위에서, 단수형("일", "하나의" 및 "상기")은 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 복수형에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예컨대 "방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에 기술된 유형의 단계 및/또는 본 개시 내용을 읽으면서 당업자에 명백해지는 사항 등을 포함한다.
따라서, 본 출원에서는, 당업계에서 통상적인 분자생물학 기법, 미생물학적 기법 및 재조합 DNA 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌에 상세히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Byrd, CM and Hruby, DE, Methods in Molecular Biology, Vol. 269: Vaccinia Virus and Poxvirology, Chapter 3, pages 31-40]; [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (본원에서, "Sambrook et al., 1989")]; [DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; [Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984)]; [Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & SJ. Higgins eds. (1985)]); [Transcription And Translation (B. D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984))]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))]; [B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; [F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)]를 참조한다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에 있어서 사용될 수는 있지만, 하기에는 바람직한 방법과 물질을 기술한다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
정의
본원에 사용된 용어들은 당업자에게 인식되어 공지된 의미를 나타내지만, 편의상 그리고 완전한 의미의 제공을 위해 특정 용어들과 그 의미를 하기에 기재한다.
"약"이라는 용어는 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 보다 더 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
"항원"이라는 용어는 동물에 주사 또는 흡수되는 조성물을 비롯해, 동물에서 항체의 생성 또는 T-세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 면역원성 물질을 가리킨다. 상기 용어는 개개의 거대분자, 또는 항원성 거대분자의 동종 개체군 혹은 이종성 개체군을 지칭하는데 사용될 수 있다. 항원은 특이적 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응의 산물과 반응한다. "항원"이라는 용어는 단백질, 폴리펩타이드, 항원성 단백질 단편, 핵산, 올리고당, 다당류, 유기 또는 무기 화학물질 또는 조성물 등을 비롯한 모이어티(moiety)를 광범위하게 망라한다. 게다가, 항원은 임의의 바이러스, 세균, 기생충, 원생동물 또는 진균류로부터 유도되거나 수득될 수 있고, 하나의 유기체 전체가 될 수도 있다. "항원"이라는 용어는 항원성 에피토프와 관련된 모든 것들을 포함한다. 이와 유사하게, 예컨대 핵산 면역화 용도에서 항원을 발현하는, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또한 본 정의에 포함된다. 또한, 합성 항원, 예를 들어, 폴리에피토프, 측접(flanking) 에피토프 및 기타 재조합 또는 합성 유도된 항원도 포함된다(문헌 [Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781]; [Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249]; [Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75:402-408]; [Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 Jul. 3, 1998]).
"~에 의해 코딩된다" 또는 "코딩하는"이라는 용어는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열과 관련되는데, 여기서 상기 폴리펩타이드 서열은 적어도 3개 내지 5개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산 및 보다 더 바람직하게는 적어도 15개 내지 20개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하며, 폴리펩타이드는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 이용하여 면역학적으로 동정가능한 폴리펩타이드 서열도 포함된다. 따라서, 항원 "폴리펩타이드," "단백질," 또는 "아미노산" 서열은 항원의 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 유사성, 바람직하게는 약 80% 이상의 유사성, 보다 바람직하게는 약 90-95%의 유사성 및 가장 바람직하게는 약 99%의 유사성을 가질 수 있다.
"외인성"라는 용어는 라쿤 폭스바이러스 게놈 바깥에서 생성, 유래, 유도 또는 발생되는 이러한 외부 유전자에 의해 코딩되는 외부 유전자 또는 단백질을 일컫는다.
본 발명의 문맥에서 사용된 "유전자"라는 용어는 유전적 기능이 관련된 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등) 내의 뉴클레오타이드 서열이다. 유전자는 예를 들어 한 유기체의 게놈 내에 특정한 물리적 위치("유전자 자리" 또는 "유전적 자리")를 점유하고 있는 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 포유동물에 있어서 DNA 서열)을 포함하는 유기체의 유전적 단위이다. 유전자는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, tRNA)와 같은 발현된 산물을 코딩할 수 있다. 다르게는, 유전자는 예컨대 단백질 및/또는 핵산의 결합과 같은 특정 이벤트/기능에 대하여 게놈 위치(예를 들어, 파지 결합 부위)를 규정할 수 있는데, 이때 상기 유전자는 발현된 산물을 코딩하지 않는다. 보통, 유전자는 코딩 서열, 예컨대 폴리펩타이드 코딩 서열과, 비코딩 서열, 예컨대 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)을 포함한다. 많은 진핵세포 유전자는 "인트론"(비코딩 서열)이 개재된 "엑손"(코딩 서열)을 가진다. 특정 경우에는, 하나의 유전자는 또 다른 유전자와 서열을 공유할 수도 있다(예를 들어, 중복 유전자).
항원 또는 백신 조성물에 대한 "면역 반응"은 해당 항원 또는 백신 조성물 내에 존재하는 분자에 대한 체액성 및/또는 세포 매개성 면역 반응을 일으키는 개체 내에서 발생한다. 본 발명에 있어서, "체액성 면역 반응"은 항체 매개성 면역 반응으로, 본 발명의 항원/백신에 대해 친화도를 갖는 항체의 발생을 수반하는 것인 반면, "세포 매개성 면역 반응"은 T-림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 반응이다. "세포 매개성 면역 반응"은 주조직적합성 복합체(MHC)의 I군 또는 II군 분자와 관련이 있는 항원성 에피토프의 제시에 의해 유도된다. 이는 항원-특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 또는 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포("CTL")를 활성화시킨다. CTL은 주조직적합성 복합체(MHC)에 의해 코딩되어 세포의 표면에서 발현되는 단백질과 관련하여 제시되는 펩타이드 항원에 대한 특이성을 가진다. CTL은 세포 내 미생물의 세포 내 파괴, 또는 이러한 미생물에 감염된 세포의 분해를 유도하여 촉진시키는데 도움을 준다. 세포성 면역의 또 다른 양태는 헬퍼 T-세포에 의한 항원-특이적 반응을 포함한다. 헬퍼 T-세포는 이들의 표면 상에 MHC 분자와 관련이 있는 펩타이드 항원을 제시하는 세포에 대하여 비특이적 효과기 세포의 기능을 촉진시켜 그 활성에 초점을 맞추는데 도움이 되도록 작용한다. 또한, "세포 매개성 면역 반응"은 사이토카인, 케모카인 및 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유도된 것들을 포함하는 활성화 T-세포 및/또는 다른 백혈구에 의해 생성된 기타 이러한 분자의 생성에도 적용된다. 세포 매개성 면역 반응을 촉진하는 특정 항원 또는 조성물의 능력은 다수의 검정법들, 예컨대 림프증식(림프구 활성화) 검정, CTL 세포독성 세포 검정, 감작된 개체에서의 항원에 대한 특이적인 T-림프구 검정, 또는 항원의 재자극에 반응한 T-세포에 의한 사이토카인 생성하는 정도를 검정하는 측정법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 검정법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199]; [Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376]을 참조한다.
본원에서 호환되어 사용되는 "면역(학적) 유효량" 또는 "유효 면역화량"이라는 용어는 면역 반응, 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응을 유도하기에 충분한 항원 또는 백신의 양(당업자에게 공지된 표준 검정법에 의해 측정됨)을 지칭한다. 본 발명에서, "면역(학적) 유효량" 또는 "유효 면역화량"이라는 용어는 약 4.5 내지 7.5 Log10TCID50/㎖의 최소 보호 투여량(역가)이다. 면역원으로서 항원의 유효성은 증식 검정, 세포용해 검정, 예컨대 특이적 표적 세포를 용해시키는 T 세포의 능력을 측정하는 크롬 방출 검정법에 의하거나, 또는 혈청에서 항원에 특이적인 항체가 순환하는 정도를 재서 B 세포 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 또한, 면역 반응의 보호 수준은 면역화된 숙주를 주사된 항원을 이용하여 그 면역성을 테스트함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응이 요구되는 항원이 바이러스 또는 종양 세포인 경우, 항원의 "면역학적 유효량"에 의해 유도된 보호 수준은 바이러스 또는 종양 세포가 동물을 공격한 후의 생존율 또는 치사율을 관찰함으로써 측정될 수 있다.
본원에서, 라쿤 폭스바이러스 게놈 내의 "비필수 부위"는 바이러스 게놈 내에 바이러스성 감염 또는 복제를 위해 필수적이지 않은 영역을 의미한다. 라쿤 폭스바이러스 게놈에서 비필수 부위의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 티미딘 키나아제(TK) 부위, 헤마글루티닌(HA) 부위 및 세린 프로테아제 억제제 부위를 포함한다. 라쿤 폭스바이러스의 TK 부위는 문헌 [C. Lutze-Wallace, M. Sidhu and A. Kappeler, Virus Genes 10 (1995), pp. 81-84]에 기술되어 있다. 또한, 라쿤 폭스바이러스의 TK 유전자 서열은 PubMed 엑세스 번호 DQ066544와 U08228로 찾을 수 있다. 라쿤 폭스바이러스의 HA 부위는 문헌 [Cavallaro KF and Esposito, JJ, Virology (1992), 190 (1): 434-9]에 기술되어 있다. 또한, 라쿤 폭스바이러스의 HA 유전자 서열은 PubMed 엑세스 번호 AF375116로 찾을 수 있다.
"핵산 분자" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 단백질 합성의 과정을 지시하는, 즉 단백질 물질을 코딩하고 발현하는, 퓨린과 피리미딘 염기의 반복 단위와 같은 장쇄의 반복 뉴클레오타이드를 지칭한다. 청구범위에서 사용된 용어와 같이, 핵산은 고양이 항원을 코딩하는 공지된 외인성 또는 외부 유전자를 일컫는다.
"작동가능하게 연결된"은 구성 성분들의 배열을 지칭하는 것인데, 여기서는 기술된 성분들이 그들의 기능을 수행하도록 배치된다는 의미이다. 따라서, 코딩 서열(예를 들어, 항원 또는 대상을 코딩하는 서열)에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는 조절 단백질과 적당한 효소가 존재하면 코딩 서열의 발현을 유효화할 수 있다. 일부 경우에는, 특정 조절 구성 성분들은 그들의 발현을 지시하도록 작용하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 전사는 되었지만 번역되지 않은 개재 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있는데, 이러한 경우에도 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결"된 것으로 간주될 수 있다. 따라서, RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA 내로 전사시키고, 이후 tRNA 스플라이싱되어 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역되는 경우에, 코딩 서열이 세포 내의 전사 및 번역 조절 서열에 "작동가능하게 연결"된다고 한다.
"보호" 면역 반응은 포유동물을 감염으로부터 보호하는 역할을 하는 체액성 또는 세포 매개된 면역 반응을 유도하는 백신의 능력을 일컫는다. 제공된 보호 작용은 고양이과 포유동물의 대조군인 개체군과 비교하여 통계적으로 유의한 향상이 있다면 절대적일 필요는 없다(즉, 감염이 완전하게 예방되거나 근절될 필요는 없다). 보호는 감염 증상의 중증도 또는 그 발병의 신속도를 완화시키는데 있어서 제한될 수 있다.
본원에서 "재조합"이라는 용어는 단순히 표준 유전공학 방법에 의해 생성된 라쿤 폭스바이러스 구축물을 지칭한다.
"복제가능한"이라는 용어는 적절한 숙주 세포 내에서 복제, 중첩 또는 재생할 수 있는 미생물, 특히 바이러스 예컨대 라쿤 폭스바이러스를 일컫는다.
본원에서, 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 호환되어 사용할 수 있으며, 동물에 있어서 면역 반응을 유도하고/하거나, 동물을 감염에 의한 질병 또는 감염에 의해 가능한 폐사로부터 보호하는 하나 이상의 면역 활성 성분을 포함하는 약학 조성물을 가리키며, 이는 상기 활성 성분의 면역 활성을 향상시키는 하나 이상의 추가 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 백신은 약학 조성물에 통상적인 추가의 성분들을 더 포함할 수 있다.
"벡터"는 숙주 유기체 내에서 복제를 할 수 있는 DNA 분자로서, 여기에 유전자가 삽입되어 재조합 DNA 분자가 구축된다.
일반적인 설명
본 발명에 따르면, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌(ha) 및/또는 티미딘 키나아제(tk) 삽입 자리에서 다수의 고양이 바이러스성 항원, 세균성 항원 및 사이토카인 항원을 발현시키기 위한 벡터로서 라쿤 폭스바이러스를 이용하는, 안전하면서 효과가 있는 유일한 재조합 고양이 조합(혼합(comb) 또는 다가로도 일컬음) 백신이 제공된다. 바람직하게는, 상기 구축물은 고양이 칼리시바이러스(FCV) 캡시드 단백질, 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스(FVR) 당단백질 D/B(gD/gB), 고양이 클라미디아 시타시(FCP, 현재 클라미도필라 펠리스로서 흔히 알려짐) 외막 단백질(momp), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) gag-pr65-pro/env-gp70/env-gp85 및 고양이 인터루킨-12(IL-12) P35/P40를 코딩하는 핵산 분자(유전자)를 발현하는데, 후자 성분은 아주반트를 첨가하지 않으면서 고양이에 있어서 상기 조합 백신의 면역원성을 향상시키기 위한 면역조절인자로서 포함되는 것이다. 이렇게 효능 있는 새로운 혼합 백신은 아주반트가 첨가되지 않아서, 일부 전형적인 주사용 백신 제형에서 빈번히 발생할 수 있는 아주반트 연관성의 육종 문제를 피할 수 있게 해주는 그의 유일한 능력 때문에 보다 안전하다. 유익한 점으로는, rRCNV 벡터로 만들어진 본 발명의 고양이 백신은 또한 백신 제조 공정 중에 종업원의 안전성을 향상시키고, 상업적 제조 공정 중에 사용되는 불활성화 및 정화 절차에서 병원성 바이러스가 살아남을 수 있는 일말의 기회조차도 완전히 제거한다. 다른 항원, 예컨대 고양이 범백혈구감소증 바이러스(FPV, 변형된 살아 있는 백신 균주를 이용함), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV), 바르토넬라 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8, 이의 조합 등은 광범위하게 다양한 고양이 병원체에 대한 광범위한 보호력을 제공하기 위해, 다가의 재조합 백신의 추가적 분획물로서 선택적으로 포함될 수 있다.
라쿤 폭스바이러스(허먼(Herman) 균주)는 1961년에서 1962년 사이에 미국 매릴랜드주 애버딘에서 Y. F. 허먼(Herman)에 의해 임상적 증상이 없는 라쿤의 호흡기로부터 처음 단리되었다(문헌 [Y. F. Herman, "Isolation and characterization of a naturally occurring poxvirus of raccoons," In: Bacteriol. Proc, 64th Annual Meeting of the American Society for Microbiology, p.117 (1964)]). 그 이전에 여러 연구에서도, tk 자리에서 CVS 공수병 G 유전자를 발현하는 RCNV 벡터는 고양이를 비롯한 야생 동물과 가축 동물 모두에 투여하였을 경우에 안전하다고 보고되었다(예를 들어, 문헌 [A. D. Alexander et al., "Survey of wild mammals in a Chesapeake Bay area for selected zoonoses," J. Wildlife Dis. 8: 119-126 (1972)]; [C. Bahloul et al., "DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological cross reactivity against the lyssaviruses," Vaccine 16: 417-425 (1998)]; [S. Chakrabarti et al., "Compact, Synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression," BioTechniques 23: 1094-1097 (1997)]; 및 [J. C. DeMartini et al., "Raccoon poxvirus rabies glycoprotein recombinant vaccine in sheep," Arch. Virol. 133: 211-222 (1993)] 참조). 고양이 항원을 포함하는 다른 RCNV 구축물은 상기 본원에서 언급한 방법과 같이 고양이에게 투여하기 위해 이미 제조되어 당업계에 공지되어 있다.
그러나, 그 이전에 어떤 구축물도, 고양이 항원을 코딩하는 다수의 유전자가 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌(ha) 및/또는 티미딘 키나아제(tk) 삽입 자리에 삽입되어 광범위한 고양이 병원체에 대하여 안전하고도 유효한 활성을 제공하는 것인 본 발명의 유일한 디자인을 제공한 선례가 없다.
p70+p15E 다단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 FeLV env 유전자가 사용된 미국 특허 제5,505,941호의 방법과는 대조적으로, 본 발명의 구축물은 FeLV의 gag-pr65-pro/env-gp70/gp85로 귀결되는 차별적이고 독특한 조합을 사용한다. 본 발명의 새로운 혼합 백신에서 rRCNV-FeLV를 생성하기 위한 벡터와 프로모터는 이전의 카나리 폭스바이러스 벡터 백신을 제조하는데 사용된 벡터 및 프로모터와는 구별된다.
특히, 본 발명의 혼합 백신의 rRCNV-FCV 분획은 2개 이상의 FCV 캡시드 유전자를 발현한다. 상기 구축물은 바람직하게는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리로부터 FCV-2280의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 단일 핵산 분자를 포함하여 발현하도록 제조될 수 있으나, 동일한 헤마글루티닌 자리에 FCV-255의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 동시적으로 삽입하거나 또는 삽입하지 않으면서, FCV-DD1 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하는 것도 바람직하다.
rRCNV-FCV를 구축하는데 있어서 본 발명에서 유용한 고양이 칼리시바이러스(FCV) 캡시드 유전자를 단리시키기 위해, 임의의 고양이 칼리시바이러스(FCV) 균주가 이용될 수 있으나, 바람직하게는 하나 이상의 FCV 캡시드 유전자를 FCV-DD1 균주로부터 수득한다. 이러한 FCV-DD1 균주는 37 C.F.R. §1.808에 의해 규정된 조건 하에 기탁되었으며, 부다페스트 조약에 따라 미국 버지니아주 20110-2209 매나사스 블러바드 유니버시티 10801에 소재하는 미국 미생물 보존센터(ATCC)에 보존되어 있다. 구체적으로, FCV-DD1 샘플은 2004년 9월 9일에 ATCC에 기탁되어 ATCC 특허 기탁 지정번호(Patent Deposit Designation) PTA-6204로 지정되었다. 재조합 백신 분획은 예를 들어, FCV-255(NCBI/GenBank 엑세스 번호 U07130 참조), FCV-2280(NCBI/GenBank 엑세스 번호 X99445 참조), FCV-Diva(문헌 [Pedusen, NC, Vet. Microbiol. 73: 281-300 (May 2000)]; [Schorr-Evans, EM, J Feline Med and Surg 5: 217-226 (2003)] 참조), FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9(NCBI/GenBank 엑세스 번호 Z11536 참조), FCV-F4(NCBI/GenBank 엑세스 번호 D90357 참조), FCV-M8 등과 같은 하나 이상의 추가적인 FCV 단리물의 캡시드 유전자를 선택적으로 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구축물은 FCV-2280, FCV-DD1(미국특허 제7,306,807호 및 ATCC 기탁번호 PTA-6204 참조) 및 FCV-255의 항원성 단백질을 발현한다.
또한, rRCNV-FCV 구축물은 클로닝 목적을 위한 스크리닝 마커로서 FCV 캡시드 항원을 이용하고 LacZ와 같은 외래 마커의 통상적인 사용을 피할 수 있다는 독특한 특징을 찾을 수 있다.
본 발명의 혼합 백신의 rRCNV-FVR gB/gD 분획은 P11 프로모터를 이용하여 두 단백질 유전자인 rRCNV-FVR gD와 rRCNV-FVR gB를 특징적으로 발현시켜 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리에 gD와 gB를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유도하고 조합시킬 수 있다. 상기 구축물은 기존의 플라스미드(pFD2000A FVR gB) 내에 FVR gD(당단백질 D)를 클로닝시켜 제조되고 플라스미드 pFD2000A FVR gB/gD를 생성시킨다. 이로부터, 블루-투-화이트(blue-to-white) 스크리닝 기법을 이용한 COS7 세포, 플라스미드 pFD2000A FVR gB/gD 및 rRCNV-FeLV의 세 방향의 감염/형질감염에 의해 클론 풀(pool)이 생성된다. 클론 스크리닝은 한계 희석법 및 클론 스크리닝을 위한 모체로서 항원 FeLV P27의 신규한 용도에 의해 달성되며, 이로써 스크리닝을 위한 통상적인 외래 마커인 LacZ의 사용을 피할 수 있다.
본 발명의 혼합 백신의 rRCNV-FCP momp 분획은 고양이 클라미디아 시타시(FCP, 클라미도필라 펠리스로도 알려짐) 외막 단백질(momp)을 발현하며, 프로모터 P11을 이용하여 구축된다.
본 발명의 혼합 백신의 rRCNV-FeLV 분획은 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리에 고양이 백혈병 바이러스 항원 gag-pr65-pro 및 env-gp85를 코딩하는 핵산 분자를 발현한다. 대안적으로는, 상기 구축물은 라쿤 폭스바이러스 게놈의 티미딘 키나아제 자리에 고양이 백혈병 바이러스 항원 gag-pr65-pro, env-gp85 및 env-gp70을 코딩하는 유전자를 포함하여 발현하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 혼합 백신의 독특한 rRCNV-고양이 IL-12 분획은, 동일한 바이러스 내에서 두 개의 서로 다른 발현 수준의 프로모터(P35에 대해서는 P11/PSEL, 그리고 P40에 대해서는 P7.5/PSEL)를 이끌어냄으로써 동일한 자리(ha 또는 tk)에서 고양이 IL-12를 발현한다. 바람직하게는, 고양이 인터루킨-12의 P35 및 P40 항원을 코딩하는 핵산 분자는 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리에 삽입된다.
또한, 본 발명의 혼합 백신은 선택적으로 항원과 같은 기타의 병원체를, 단순 혼합물, 현탁액, 에멀션 등과 같은 혼합물로서, 예컨대 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라 박테리아(예를 들어 전형적인 고양이 묘소병), 이의 조합 등과 같은 재조합 구축물과 함께 포함할 수 있다. 특정 고양이 칼리시바이러스 균주의 캡시드 유전자가 상기 생성된 재조합 폭스바이러스 내에 포함되지 않는 경우에는, 예를 들어 FCV-255, FCV-2280, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 등과 같은 추가의 분획으로서 바이러스성 항원을 다가 백신 제형에 별도로 첨가할 수도 있다.
본 발명은 추가적으로 아주반트가 없으면서 효능이 있고 새로운 재조합 백신을 감염과 질병으로부터 보호를 필요로 하는 고양이에게 투여하는 단계를 포함하여, 고양이를 감염과 질병으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 본 발명의 백신은 다양한 고양이 병원체에 의해 야기된 감염 또는 질병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 면역학적 유효량으로 투여된다. 고양이에게 투여된 유효 면역화량은, 백신 분야에서 표준 수치로 요구되는 바와 같이, 고양이가 병원체로부터 감염되는 것을 보호하도록 백신에 대한 충분한 면역 반응이 얻어지는 양을 말한다. 고양이에게 접종하여 만족스런 백신 접종 효과를 유도해내는 면역 유효 투여량 또는 유효 면역화량은 예컨대 표준 용량 적정 연구와 같은 통상적인 시험에 의해 쉽게 결정될 수 있거나 용이하게 적정될 수 있다.
상기 백신은 특히 예방 주사(booster shot)가 필요한 경우에 단회 투여량 또는 반복 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 백신은 건강한 고양이에게 단회 접종으로 투여되어 장기간의 보호를 제공한다.
상기 백신은 본원에 기술된 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터 구축물 중 임의의 하나의 구축물을 면역학적 유효량으로 포함할 수 있다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 혼합 백신은 본원에 기술된 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터 구축물 중 임의의 2종 이상의 구축물을 면역학적 유효량으로 포함할 수 있다.
상기 백신은 적절히 비강, 경피(즉, 전신 흡수를 위한 피부 표면에 또는 표면 상에 적용), 비경구, 경구 등 또는 투여량의 일부는 경구로, 일부는 콧구멍으로 넣는 구비강(oronasal)과 같은 조합 경로로 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 이에 제한되지는 않지만, 근육, 피하, 경피(즉, 주사 또는 그렇지 않으면 피부 아래 임의의 위치), 정맥 등을 포함한다. 근육, 피하 및 구비강 투여 경로가 바람직하다. 바람직하게는, 상기 백신은 건강한 고양이에 피하 투여된다.
폭스바이러스 벡터는 살아 있는 상태로 존재하거나, 예를 들어, BEI(binary ethyleneimine, 2성분 에틸렌이민), 포르말린 등(BEI가 바람직한 비활성임)을 이용하여 비활성화 바이러스성 백신을 제조하기 위한 통상적인 절차에 의하여 비활성화될 수 있지만, 최적의 그리고 강력한 면역 효능을 위해 생 라쿤 폭스바이러스를 사용하는 것이 본 발명의 백신에 있어서는 매우 바람직하다. 생 라쿤 폭스바이러스는 또한 복제가능한데, 이것은 이들이 백신 개발을 위해 적절한 배양물에서 종자(master seed) 바이러스로부터 자신의 복사체를 만들어 내어 번식할 수 있다는 의미이다.
액상으로 투여되는 경우, 본 발명의 백신은 수용액, 시럽, 엘릭시르, 팅크 등의 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 이러한 제형들은 당업계에 공지되어 있으며, 통상 고양이에게 투여하기 위한 적절한 담체 또는 용매 시스템에 항원 및 다른 첨가제들을 용해 혹은 분산시킴으로써 제조된다. 적절한 비독성의, 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 용매로는, 이에 제한되지는 않지만, 물, 식염수, 에틸렌 글리콜, 글리세롤 등을 포함한다. 또한, 상기 백신은 감압 동결 건조(lyophilized) 또는 그렇지 않으면 동결 건조된 후, 사용 직전에 적절한 희석제를 이용하여 무균 재건시키거나 재수화시킬 수 있다. 적절한 희석제로는, 이에 제한되지는 않지만, 식염수, 이글의 최소 필수 배지(Eagle's minimum essential media) 등을 포함한다. 통상적인 첨가제 또는 부형제(co-formulant)로는, 예를 들어, 품질 보증된 염료, 향미제, 감미제 및 하나 이상의 항미생물성 보존제, 예컨대 티메로살(sodium ethylmercurithiosalicylate, 나트륨 에틸머큐리티오살리실레이트), 네오마이신, 폴리믹신 B, 암포테리신 B 등을 들 수 있다. 이러한 용액들은 예를 들어, 부분적으로 가수분해된 젤라틴, 소르비톨 또는 세포 배양 배지의 첨가에 의해 안정화될 수 있으며, 당업계에 공지된 시약, 예컨대 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소칼륨, 인산이수소칼륨, 이의 혼합물 등을 이용하는 통상적인 방법에 의해 완충시킬 수 있다.
또한, 액상 제형은 다른 표준 부형제와 함께 현탁제 또는 유화제를 포함하는 현탁액 및 에멀션을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 액상 제형은 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 콜로이드 밀을 이용하여 제조될 수 있다. 에멀션은 예를 들어, 균질기(homogenizer)를 이용하여 제조될 수 있다.
체액 시스템으로 주입을 위해 고안된 비경구 제형은 고양이 체액 수준에 상응하는 적절한 등장성과 pH 완충이 필요하다. 등장성은 필요에 따라 염화나트륨과 기타 염들로 적절히 조절될 수 있다. 백신 접종시, 바이러스는 탈이온수, 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 생리적으로 허용가능한 담체를 이용하여 해동(동결된 경우) 또는 재건(감압 동결 건조된 경우)될 수 있다. 폴리프로필렌 글리콜과 같은 적절한 용매를 사용하여 제형 내에 성분들의 용해도 및 액상 제제의 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 유전적 구축물을 제조하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표준 방법론에 의해 라쿤 폭스바이러스 벡터에 원하는 임의의 핵산 서열의 삽입을 위한 특정 제한 부위를 이용할 수 있다. 대안적으로는, 본원에 기술된 바와 같은 다수의 유전자를 삽입하는 것이 바람직한 경우 또는 큰 서열이 삽입되는 것이 바람직한 경우에는 동종 재조합 기법을 사용할 수 있다. 이 방법에서는, 다수의 유전자가 삽입될 삽입 부위에 측접하고 있는 플라스미드 서열은, 라쿤 폭스바이러스 게놈 내에 존재하는 서열과 충분한 동일성의 서열을 포함하여 재조합을 매개한다. 상기 측접 서열은 예컨대 헤마글루티닌 자리, 또는 티미딘 키나아제 자리, 또는 세린 프로테아제 억제제 자리와 같이 라쿤 폭스바이러스의 성장 및 증식을 위해 비필수적인 라쿤 폭스바이러스의 영역과 동종이어야 한다. 재조합될 두 외인성 유전자의 발현을 유도하기 위해 하나의 프로모터를 사용할 수 있지만, 하나의 삽입 벡터에 개개의 유전자에 각각 작동가능하게 연결된 두 개의 프로모터를 사용하는 것도 효율적인 발현을 제공할 수 있을 것이다.
하기 실시예들은 본 발명의 특정 양태들을 설명한다. 그러나, 이러한 실시예들은 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 조건 및 범위에 대해 전체적으로 한정하고자 하는 의도가 아님을 이해해야 한다. 통상적인 반응 조건들(예를 들어, 온도, 반응 시간 등)이 주어지는 경우에는, 일반적으로 덜 적절하더라도, 그 구체적인 범위를 초과하는 조건과 그 미만인 조건 모두가 사용될 수 있음을 알아야 한다. 하기 실시예들은 실온(약 23℃ 내지 약 28℃) 및 대기압에서 수행되었다. 본원에 언급된 모든 부와 백분율은 중량을 기초로 하며, 모든 온도는 달리 특정되지 않는 한 섭씨 온도로 표현된다.
하기 뒤따르는 실시예들로부터 본 발명을 한층 더 이해할 수 있을 것이다. 이러한 실시예들은 본 발명의 범위를 한정하지 않으면서 본 발명을 예시하는 것이다.
실시예 1 : 플라스미드 pFD2000A , pFD2001TK 및 pFD2003SEL 의 구축
라쿤 폭스바이러스 게놈의 ha 자리에 외래 유전자를 전달하기 위해 두 플라스미드 pFD2000A와 pFD2003SEL을 구축하였다. 측접하는 ha 서열은 동종 재조합의 정확성과 빈도수를 증가시키기 위해 백시니아 바이러스가 아닌 RCNV 게놈로부터 직접 클로닝/변형시켰다.
이와 유사하게, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 tk 자리에 외래 유전자를 전달하기 위해 플라스미드 pFD20001TK를 구축하였다. 측접하는 tk 서열은 동종 재조합의 정확성과 빈도수를 증가시키기 위해 백시니아 바이러스가 아닌 RCNV 게놈로부터 직접 클로닝/변형시켰다.
실시예 2: rRCNV - FCV 의 1세대 구축물
rRCNV-FCV2280 캡시드(P11)를 구축하고 FCV ELISA와 웨스턴 블롯으로 FCV 캡시드 발현을 확인하였다. 상기 구축 공정과 숙주 동물 내에서 재조합 바이러스성 구축물 평가는 하기 6개의 주요 단계를 포함한다: (1) FCV2280 캡시드 유전자를 플라스미드 벡터 pFD2000A 내로 클로닝시켜 플라스미드 pFD2000A FCV2280 캡시드를 생성하는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 RCNV를 이용한 세 방향의 감염/형질감염으로 클론 풀 rRCNV-FCV2280을 생성하는 단계; (3) 한계 희석법과 FCV ELISA에 의해 순수한 클론을 스크리닝하는 단계; (4) PCR, ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 rRCNV-FCV2280에 분자적 특징을 부여하는 단계; (5) rRCNV-FCV 종자를 수립하는 단계; 및 (6) 고양이 내에서 rRCNV-FCV2280(P11)의 용량 적정 연구를 수행 하는 단계. 면역성 시험(challenge study) 연구 결과, rRCNV-FCV2280으로 백신 접종한 고양이는 7.5 Log10TCID50/mL에서 조차도 FCV255 공격에 대해 현저한 보호력을 보여주지 못한 것으로 나타났다.
또한, rRCNV-FCV2280 캡시드(PSEL)를 상기와 유사한 접근 방법으로 구축하여 FCV ELISA와 웨스턴 블롯으로 FCV 캡시드 발현을 확인하였다.
실시예 3 : rRCNV - FCV 의 2세대 구축물
FCV2280 및 FCV DD1 캡시드 유전자(5'-372 bp 뉴클레오타이드는 결실됨)를 모두 ha 자리에 삽입하는 것을 제외하고는, 실시예 2에서와 같이 rRCNV-FCV의 2세대를 구축하고, FCV ELISA와 웨스턴 블롯으로 FCV 캡시드 발현을 확인하였다. 상기 구축물에서는, 재조합 라쿤 폭스바이러스는 FCV2280 캡시드(P11)와 FCV DD1(PSEL) 모두 ha 자리에서 발현하였다. 종자는 rRCNV-FCV(2280-DD1)로 지정하였다. 고양이에서 용량 적정 연구를 수행하여, 그 결과를 하기와 같이 요약하였다: (1) 7.5 Log10TCID50/㎖로 백신 접종된 10마리의 고양이에서 FCVDD1 역가에 대한 유의한 혈청 중화가 관찰되었던 반면, 모든 대조군(10마리의 고양이)은 혈청 반응에서 음성으로 유지되었고(p<0.05); (2) 대조군과 비교하여 백신 접종한 군(6.5 및 7.5 Log10TCID50/㎖)에서 열병의 유의한 감소가 관찰되었으며(p<0.05); (3) 대조군과 비교하여 백신 접종한 군(7.5 Log10TCID50/㎖)에서 경구 및 피부 궤양(병변)의 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.05). 이러한 결과들은 rRCNV-FCV(2280-DD1)가 백신 후보물 질로 유용하다는 것을 의미한다.
실시예 4: rRCNV - FCV 의 3세대 구축물
본 구축물에서, FCV 캡시드 유전자(2280-DD1-255)는 ha 자리에 삽입된다. rRCNV-FCV의 3세대는 하기 4개의 주요 단계를 통하여 구축되었다: (1) 기존의 플라스미드(2세대 구축을 구축하는 데 사용되었던 것) 내에 FCV255 캡시드를 클로닝하여 플라스미드 pFD2000A FCV 캡시드(2280-DD1-255)를 생성시키는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 RCNV의 세 방향 감염/형질감염에 의해 클론 풀을 생성하는 단계; (3) 한계 희석법과 FCV ELISA로 클론을 스크리닝하는 단계; 및 (4) RCNV 게놈 내에 FCV 캡시드 유전자를 삽입하고 FCV PCR, ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 FCV 캡시드의 발현을 측정하는 단계. 용량 적정 연구는 고양이 내에서 수행된다. 상기 구축물은 상기 2세대 구축물에 비해, 백신의 효능을 증가시키고 그 보호 범위를 광범위하게 넓힐 수 있을 것이다.
실시예 5: rRCNV - FVR 의 1세대 구축물
rRCNV-FVR gD(P11)와 rRCNV-FVR gB(P11)를 실시예 2에 기술된 것과 유사한 접근 방법으로 구축하였다. 본 구축 절차는 하기 5개의 주요 단계를 포함한다: (1) FVR gD/gB 당단백질 유전자를 각각 플라스미드 벡터 pFD2000A 내로 클로닝시켜, 플라스미드 pFD2000A FVR gD 및 pFD2000A FVR gB를 생성시키는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 RCNV를 이용한 세 방향 감염/형질감염으로 클론 풀 rRCNV-FVR gD/gB를 생성하는 단계; (3) 플라크 정제/LacZ 스크리닝에 의해 순수한 클론을 스크리닝하는 단계; (4) PCR, ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 rRCNV-FVR gD(P11)와 rRCNV-FVR gB(P11)에 분자적 특징을 부여하는 단계; 및 (5) rRCNV-FVR 종자를 수립하는 단계.
실시예 6: rRCNV - FVR 의 2세대 구축물
본 구축물에서, FVR gD/gB 유전자는 ha 자리에 삽입된다. rRCNV-FVR의 2세대는 하기 4개의 주요 단계를 통해 구축하였다: (1) 기존의 플라스미드(pFD2000A FVR gB) 내에 FVR gD(당단백질 D)를 클로닝시켜 플라스미드 pFD2000A FVR gB/gD를 생성시키는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 rRCNV-FeLV(블루-투-화이트 스크리닝, 실시예 13 참조)의 세 방향 감염/형질감염에 의해 클론 풀을 생성하는 단계; (3) 한계 희석법과 FeLV P27 ELISA에 의해 클론을 스크리닝 단계; 및 (4) RCNV 게놈 내에 FVR gD/gB를 삽입하고, FVR PCR과 웨스턴 블롯에 의해 FVR gD/gB의 발현을 측정하는 단계. 용량 적정 연구는 고양이 내에서 수행하였다.
실시예 7: rRCNV - FeLV 의 1세대 구축물
rRCNV-FeLV gag-pr65(P11)와 rRCNV-FeLV env-gp70(P11)을 실시예 2에 기술된 것과 유사한 접근 방법으로 구축하였다. 이들 두 구축물의 용량 적정 결과, rRCNV-FeLV env-gp70 구축물은 FeLV 바이러스 혈증(viremia)에 대해 40%(2/5: 7.5 Log10TCID50/㎖로 백신 접종된 고양이 5마리 중 2마리)의 예방 효과가 있는 것으로 나타났으나, rRCNV-FeLV gag-pr65는 FeLV 바이러스 혈증에 대해 보호능력을 나타내지 못하였다(0/5: 백신 접종된 고양이 5마리 중 0마리).
실시예 8: rRCNV - FeLV 의 2세대 구축물
rRCNV-FeLV의 2세대를 구축하였다. 본 구축물에서, 재조합 라쿤 폭스바이러스는 ha 자리에서 FeLV gag-pr65-pro(PSEL)와 FeLV env-gp85(PSEL) 모두를 발현하였다. 상기 구축 절차 및 고양이의 백신 후보물질 평가는 하기 6개의 주요 단계를 포함한다: (1) 플라스미드 벡터 pFD2003SEL 내에 FeLV gag-pr65-pro 및 FeLV env gp85를 클로닝하는 단계; (2) 플라스미드 pFD2003SEL FeLV gag-pr65-pro(PSEL)-env-gp85(PSEL)를 구축하는 단계; (3) COS7 세포, 단계 2에서의 플라스미드 및 rRCNV-FCV를 이용한 세 방향의 감염/형질감염으로 클론 풀 rRCNV-FeLV를 생성하는 단계; (3) 한계 희석법과 FeLV P27 ELISA에 의해 순수한 클론을 스크리닝하는 단계; (4) PCR, ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 rRCNV-FeLV에 분자적 특징을 부여하는 단계; (5) rRCNV-FeLV 종자를 수립하는 단계; 및 (6) 고양이의 용량 적정 연구 단계. 면역 시험 결과를 하기에 요약하였다: 고양이를 각각 7.5, 6.5 및 5.5 Log10TCID50/㎖의 rRCNV-FeLV로 피하 백신 접종했을 때(3주 간격으로 2회 투여량으로 처방), 고양이는 7/10(70%), 6/10(60%) 및 5/10(50%)의 비율로 지속성 FeLV 바이러스 혈증에 대해 보호되었다. 반대로, 백신 접종을 하지 않은 9/10(90%) 비율의 고양들은 지속성 FeLV 바이러스 혈증을 나타내었다. 이전의 1세대 구축물의 실패에 비춰보면, 이러한 예기치 못한 성공적인 결과는 rRCNV-FeLV가 백신 후보물질로서 유용하다는 것을 의미한다.
실시예 9: rRCNV - FeLV 의 3세대 구축물
본 구축물에서, FeLV gag-pr65-pro/env-gp85 유전자는 tk 자리에 삽입된다. rRCNV-FeLV의 3세대는 하기의 4개의 주요 단계를 통해 구축하였다: (1) 플라스미드 pFD2006TK FeLV gag-pr65/env-gp85를 생성하는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 rRCNV-FeLV env-gp70(P11)(실시예 7의 1세대 구축물로부터)의 세 방향 감염/형질감염에 의해 클론 풀을 생성하는 단계; (3) 한계 희석법과 FeLV P27 ELISA에 의한 클론 스크리닝 단계; 및 (4) RCNV 게놈 내에 FeLV gag/env 유전자를 삽입하고, FeLV P27 ELISA 및 FeLV gp70 웨스턴 블롯에 의해 FeLV gag/env의 발현을 측정하는 단계. 용량 적정 연구는 고양이 내에서 수행하였다.
실시예 10: rRCNV - FCP 의 1세대 구축물
실시예 2에 기술된 것과 유사한 접근 방법으로 rRCNV-FCP 외막 단백질(momp, P11)을 구축하였다(ha 자리). 상기 구축 절차는 하기의 5개의 주요 단계를 포함한다: (1) 플라스미드 벡터 pFD2000A 내에 FCP momp 유전자를 클로닝시켜, 플라스미드 pFD2000A FCP momp(P11)를 생성하는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 RCNV를 이용한 세 방향 감염/형질감염으로 클론 풀 rRCNV-FCP를 생성하는 단계; (3) 플라크 정제/LacZ 스크리닝에 의해 순수한 클론을 스크리닝하는 단계; (4) PCR에 의해 rRCNV-FCP momp(P11)에 분자적 특징을 부여하는 단계; 및 (5) rRCNV-FCP momp 종자를 수립하는 단계.
실시예 11 : rRCNV -고양이 IL -12의 1세대 구축물
고양이 IL-12 P35 및 P40 유전자를 RT-PCR과 TOPO 클로닝에 의해 고양이의 림프절 조직으로부터 클로닝하고, 상기 고양이 IL-12 P35 및 P40 유전자를 시퀀싱하였다. rRCNV-고양이 IL-12 P35(P11)와 rRCNV-고양이 IL-12(P11)를 실시예 2에서와 같이 구축하였다. ha 자리에서 고양이 IL-12 P35와 P40의 발현을 P40-특이적 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다.
실시예 12: rRCNV -고양이 IL -12의 2세대 구축물
본 구축물에서는, 고양이 IL-12 P35/P40 유전자는 ha 자리에 삽입된다. rRCNV-FeLV IL-12의 2세대는 하기 4개의 주요 단계를 통해 구축하였다: (1) 플라스미드 pFD2003SEL 고양이 IL-12 P35/P40을 구축하는 단계; (2) COS7 세포, 단계 1에서의 플라스미드 및 rRCNV-FeLV(블루-투-화이트 스크리닝 또는 고양이 IL-12 P40 ELISA)의 세 방향 감염/형질감염에 의해 클론 풀을 생성하는 단계; (3) 한계 희석법과 FeLV P27 ELISA 또는 고양이 IL-12 P40 ELISA에 의해 클론을 스크리닝하는 단계; 및 (4) RCNV 게놈 내에 고양이 IL-12 P35/P40 유전자를 삽입하고, 고양이 IL-12 PCR과 P40 웨스턴 블롯에 의해 고양이 IL-12 P35/P40의 발현을 측정하는 단계. 용량 적정 연구(살아 있는 rRCNV-고양이 IL-12 또는 비활성화된 rRCNV-고양이 IL-12로 제형화된 각각의 고양이 항원)를 고양이에서 수행하여 면역성에 대한 고양이 IL-12 사이토카인의 증강 효과를 평가하였다.
실시예 13: 재조합 RCNV 벡터 시스템을 위한 블루 -투-화이트( Blue - To - White ) 스크리닝 마커
rRCNV-FeLV gag(1세대 구축물)과 rRCNV-FeLV(gag-pr65-pro/env gp85, 2세대 구축물)을 블루-투-화이트(btw) 스크리닝을 위한 모체로 사용하여 임의의 RCNV-벡터 재조합 백신을 구축하였다. 이러한 시스템의 장점은 모균주로서 RCNV 야생형(백색 플라크)보다는 rRCNV-FeLV(FeLV P27 유전자 발현으로 인한 청색 플라크)를 이용하기 때문에, 임의의 관심 대상인 외래 유전자(또는 보호 항원)가 ha/tk 자리에 삽입되어 ha/tk DNA 서열 내의 측접 DNA 단편을 함유하는 FeLV P27을 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의해 대체한다는 점이다. 결과적으로, FeLV P27 항원 ELISA는 96-웰 플레이트 스크리닝 시스템에서 모균주(FeLV P27 발현으로 인한 청색 플라크)와 재조합체(백색 플라크)를 쉽게 구별할 수 있다. 이러한 시스템은 rRCNV-고양이 IL-12 및 rRCNV-FVR를 구축하는데 사용된다.
실시예 14: 재조합 RCNV -벡터 시스템에 스크리닝 마커로서 삽입된 면역원의 발현
본 개념을 rRCNV-FCV의 구축에 적용하였다(상기 실시예 3과 4 참조). 생성된 재조합체 클론을 FCV 캡시드-특이적 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 독특한 특징은 스크리닝을 위해 LacZ와 같은 외래 마커가 필요치 않다는 것이다. 이러한 개념은 오직 면역원-특이적 ELISA가 이용가능한 경우, 예를 들어, rRCNV-FeLV(P27 ELISA), rRCNV-고양이 IL-12(P40 ELISA) 등의 경우, 본 발명의 모든 rRCNV-바이러스성 구축물에 사용될 수 있다.
실시예 15: 바이러스 안정성
야외 환경(field environment)과 실험실 조건에서 미생물의 생존가능성을 시험하였다. 실험실 조건 하에서, rRCNV FIPV-N(고양이 감염성 복막염 바이러스 뉴클 레오캡시드 유전자를 발현하는 재조합 RCNV) 구축물에 대한 시험은, 가장 높은 계대접종(MSV + 5)으로 제조된 상기 바이러스 저장액을 -70℃, 4-8℃ 및 37℃에서 유지시킴으로써 수행하였다. 상기 바이러스 저장액의 샘플을 정해진 간격으로 취하여 다양한 저장 조건들 하에 바이러스의 안정성을 측정하기 위해 적정을 수행하였다. 안정제를 포함하는 바이러스의 감압 동결 케이크와 바이러스의 액상 현탁액 모두가 -70℃와 4-8℃에서 90일간, 그리고 4-8℃에서 33개월 동안 저장하였을 때, 바이러스 역가의 현저한 손실이 없는 것으로 보아 안정한 것으로 밝혀졌다. 액상 바이러스에 있어서는 37℃에서 바이러스 역가의 현저한 감소가 관찰되었다. 37℃에서 28일째에 이 검정법으로는 바이러스가 더 이상 검출되지 않았다. 상기 바이러스는 냉장 보관되었을 경우에 상당히 안정할 것으로 보인다.
실시예 16: rRCNV -고양이 IL -12의 2세대 구축물
간략하면, 바이러스 rRCNV-고양이 IL-12는 무독성의 허먼(Herman) 균주인 RCNV 게놈의 헤마글루티닌(ha) 자리 내에 고양이 IL-12 P35와 P40 유전자를 삽입시킴으로써 구축하였다. 고양이 IL-12 P35와 P40 유전자는 RT-PCR을 이용하여 고양이 림프절로부터 클로닝하였다.
rRCNV-공수병 G2의 구축 공정은 2개의 주요 단계를 통해 이루어졌다. 첫째, 고양이 IL-12의 PCR-증폭된 669-bp P35 및 990-bp P40 유전자를 플라스미드 pFD2003SEL 벡터 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pFD2003SEL-고양이 IL-12 P35-(SEL)-P40을 생성시켰다. P35와 P40 유전자 모두는 각각 프로모터 PSEL의 조절 하에 공동-발현된다. 둘째, COS-7 세포에서 RCNV와 플라스미드 pFD2003SEL-고양이 IL-12(P35-P40)의 세 방향 공동감염/형질감염을 수행하여, ha 자리에서 대립형질 상호교환에 의해 rRCNV-고양이 IL-12를 생성시켰다. 베로(Vero) 세포 내에서 한계 희석법과 P40 ELISA를 4번 연속적으로 순환 수행함으로써 고양이 IL-12-발현된 클론을 스크리닝하였다. 클론 후보물질을 0.05%의 락트알부민 가수분해물(LAH), 30 ㎍/㎖의 겐타마이신 설페이트 및 5% 소태아 혈청이 보충된 최소 필수 배지(MEM)를 이용하여 베로 세포에서 2번 더 추가로 확장시킨 후, 고양이 IL-12 P40 유전자-특이적 PCR과 고양이 IL-12 P40 ELISA에 의해 확인하였다. 6번째 계대접종으로 예비 종자를 제조하였다. 종자는 예비 종자의 1:10,000 희석으로 수립하여 rRCNV-고양이 IL-12로 지정하였으며, 여기서 생 벡터로서 라쿤 폭스바이러스는 ha 자리에서 고양이 IL-12 P35와 P40 단백질을 각각 발현할 수 있다. rRCNV-FPV/FCV/FVR/FCP/FeLV/공수병 및 rRCNV-고양이 IL-12의 서로 다른 투여량을 이용한 용량 적정 연구는 면역성에 대한 고양이 IL-12 사이토카인의 증강 효과를 평가하기 위해 고양이 내에서 수행하였다.
상기에서, 본 발명의 특정 구체예들을 예시할 목적으로 상세한 설명을 제공하였으나, 이는 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 이러한 본 발명의 개시 내용에 비추어, 당업자에게 명백한 다른 모든 변형들, 도출가능한 결과들 및 균등물들은 청구된 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Wyeth <120> Raccoon Poxvirus Expressing Genes of Feline Antigens <130> AM102753 <150> 60/932419 <151> 2007-05-30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6872 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> plasmid <400> 1 ttattggaca ctagataatc atcacatgtt accacaaaat tatataatgt ataaatgcga 60 aattattaaa cgcaaatatc catgggaaaa cgcgcagtat acagacgatt ttttacagta 120 tttggagagt tttataggaa gtatatagag tagaaccaga attttgtaaa aataaatcac 180 atttttatac taatatgaaa caactatcga tagttatatt gctactatcg atagtatata 240 caaccaaacc tcatcctaca cagatatcaa aaaaactagg cgatgatgct actctatcgt 300 gtaatagaaa caatacacat ggatatcttg tcatgagttc ttggtataag aaaccagact 360 ccattattct cttagcagcc aaaaacgatg tcgtatactt tgatgattat acagcggata 420 aagtatcata cgattcaccg tatgatactc tagctacaat tattacaatt aaatcattga 480 catctggaga tgcaggtact tatatatgcg cattctttat aacatcaaca aatgatacgg 540 ataaaataga ttatgaagaa ttcgtcgacg cggccgcctg cagaagcttg gtaccattta 600 tagcatagaa aaaaacaaaa tgaaattcta ctatattttt acatacatat 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1500 cctcgcggtg atggtgctgc gttggagtga cggcagttat ctggaagatc aggatatgtg 1560 gcggatgagc ggcattttcc gtgacgtctc gttgctgcat aaaccgacta cacaaatcag 1620 cgatttccat gttgccactc gctttaatga tgatttcagc cgcgctgtac tggaggctga 1680 agttcagatg tgcggcgagt tgcgtgacta cctacgggta acagtttctt tatggcaggg 1740 tgaaacgcag gtcgccagcg gcaccgcgcc tttcggcggt gaaattatcg atgagcgtgg 1800 tggttatgcc gatcgcgtca cactacgtct caaggtcgaa aacccgaaac tgtggagcgc 1860 cgaaatcccg aatctctatc gtgcggtggt tgaactgcac accgccgacg gcacgctgat 1920 tgaagcagaa gcctgcgatg tcggtttccg cgaggtgcgg attgaaaatg gtctgctgct 1980 gctgaacggc aagccgttgc tgattcgagg cgttaaccgt cacgagcatc atcctctgca 2040 tggtcaggtc atggatgagc agacgatggt gcaggatatc ctgctgatga agcagaacaa 2100 ctttaacgcc gtgcgctgtt cgcattatcc gaaccatccg ctgtggtaca cgctgtgcga 2160 ccgctacggc ctgtatgtgg tggatgaagc caatattgaa acccacggca tggtgccaat 2220 caatcgtctg accgatgatc cgcgctggct accggcgatg agcgaacgcg taacgcgaat 2280 ggtgcagcgc gatcgtaatc acccgagtgt gatcatctgg tcgctgggga atgaatcagg 2340 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attcggcttg cctcaaacat taggagttca 1620 ttgactaaat tatga 1635 <210> 9 <211> 669 <212> DNA <213> Felis catus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(669) <223> Feline IL-12 p35 gene <400> 9 atgtgcccgc cgcgtggcct cctccttgta accatcctgg tcctgttaaa ccacctggac 60 cacctcagtt tggccaggaa cctccccaca cccacaccaa gcccaggaat gttccagtgc 120 ctcaaccact cccaaaccct gctgcgagcc atcagcaaca cgcttcagaa ggctagacaa 180 actctagaat tttactcctg cacttccgaa gagattgatc atgaagatat cacaaaagat 240 aaaaccagca cagtggaggc ctgcttacca ctggaattaa ccatgaatga gagttgcctg 300 gcttccagag agatctctct gataactaat gggagttgcc tggcctccag aaagacctct 360 tttatgacga ccctgtgcct tagcagtatc tatgaggact tgaagatgta ccaggtggag 420 ttcaaggcca tgaatgcaaa gctgttaatg gatcctaaaa ggcagatctt tctggatcaa 480 aacatgctga cagctattga tgagctgtta caggccctga atgtcaacag tgtgactgtg 540 ccacagaact cctccttgga agaaccggat ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata 600 cttcttcatg ctttcagaat tcgtgcagtg accatcaata gaatgatgag ctatctgaat 660 tcttcctaa 669 <210> 10 <211> 990 <212> DNA <213> Felis catus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(990) <223> Feline IL-12 p40 gene <400> 10 atgcatcctc agcagctggt catcgcctgg ttttccctgg ttttgctggc acctcccctc 60 atggccatat gggaactgga gaaaaacgtt tatgttgtag agttggactg gcaccctgat 120 gcccccggag aaatggtggt cctcacctgc aatactcctg aagaagatga catcacctgg 180 acctctgacc agagcagtga ggtcctaggc tctggtaaaa ctctgaccat ccaagtcaaa 240 gaatttgcag atgctggcca gtatacctgt cataaaggag gcgaggttct gagccattcg 300 ttcctcctga tacacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatctt aagggaacag 360 aaagaaccca aaaataagat ctttctaaaa tgtgaggcaa agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacggc aatcagtacc gatttgaaat tcactgtcaa aagcagcaga 480 ggctcctctg acccccaagg ggtgacttgt ggagcagcga cactctcagc agagaaggtc 540 agagtggaca acagggatta taagaagtac acagtggagt gtcaggaggg cagtgcctgc 600 ccggctgccg aggagagcct acccattgaa gtcgtggtgg acgctattca caagctcaag 660 tacgaaaact acaccagcag cttcttcatc agggacatca tcaaaccgga cccacccaag 720 aacctgcaac tgaagccatt aaaaaattct cggcatgtgg aagtgagctg ggaataccct 780 gacacctgga gcaccccaca ttcctacttc tccttaacat ttggcgtaca ggtccagggc 840 aagaacaaca gagaaaagaa agacagactc tccgtggaca agacctcagc caaggtcgtg 900 tgccacaagg atgccaagat ccgcgtgcaa gccagagacc gctactatag ctcatcctgg 960 agcaactggg catccgtgtc ctgcagttag 990 <210> 11 <211> 1929 <212> DNA <213> Feline leukemia virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1929) <223> FeLV env-gp85 gene <400> 11 atggaaagtc caacgcaccc aaaaccctct aaagataaga ctctctcgtg gaacttagtg 60 tttctggtgg ggatcttatt cacaatagac ataggaatgg ccaatcctag tccacaccaa 120 atatataatg taacttgggt aataaccaat gtacaaacta acacccaagc taatgccacc 180 tctatgttag gaaccttaac cgatgtctac cctaccctac atgttgactt atgtgaccta 240 gtgggagaca cctgggaacc tatagtccta agcccaacca atgtaaaaca cggggcacgt 300 tacccttcct caaaatatgg atgtaaaact acagatagaa aaaaacagca acagacatac 360 cccttttacg tctgccccgg acatgccccc tcgctggggc caaagggaac acattgtgga 420 ggggcacaag atgggttttg tgccgcatgg ggatgtgaaa ccaccggaga agcttggtgg 480 aagccctcct cctcatggga ctatatcaca gtaaaaagag ggagtagtca ggacaataac 540 tgtgagggaa aatgcaaccc cctgattttg cagttcaccc agaaggggaa acaagcctct 600 tgggacggac ctaagatgtg gggattgcga ctataccgta caggatatga ccctatcgcc 660 ttattcacgg tatcccggca ggtgtcaacc attacgccgc ctcaggcaat gggaccaaac 720 ctagtcttac ctgatcaaaa acccccatcc cgacaatctc aaacagggtc caaagtggcg 780 acccagaggc cccaaacgaa tgaaagcgcc ccaaggtctg ttgcccccac caccgtgggt 840 cccaaacgga ttgggaccgg agataggtta ataaatttag tacaagggac atacctagcc 900 ttaaatgcca ccgaccccaa caaaactaaa gactgttggc tctgcctggt ttctcgacca 960 ccctattacg aagggattgc aatcttaggt aactacagca accaaacaaa ccctccccca 1020 tcctgcctat ctattccgca acacaagctg accatatctg aagtatcagg gcaaggactg 1080 tgcataggga ctgttcctaa gacccaccag gctttgtgca ataagacgca acagggacat 1140 acaggggcgc actatctagc cgcccccaat ggcacctatt gggcctgtaa cactggactc 1200 accccatgca tttccatggc ggtgctcaat tggacctctg atttttgtgt cttaatcgaa 1260 ttatggccca gagtgactta ccatcaaccc gaatatgtgt acacacattt tgccaaagct 1320 gtcaggttcc gaagagaacc aatatcacta actgttgccc tcatgttggg aggactcact 1380 gtagggggca tagccgcggg ggtcggaaca gggactaaag ccctccttga aacagcccag 1440 ttcagacaac tacaaatggc catgcacaca gacatccagg ccctagaaga gtcaattagt 1500 gccttagaaa agtccctgac ctccctttct gaagtagtct tacaaaacag acggggccta 1560 gatattctat tcctacaaga gggagggctc tgtgccgcat taaaagaaga atgttgcttc 1620 tatgcggatc acaccggact cgtccgagac aatatggcta aattaagaga aagactaaaa 1680 cagcggcaac aactgtttga ctcccaacag ggatggtttg aaggatggtt caacaggtcc 1740 ccctggttta caaccctaat ttcctccatt atgggcccct tactaatcct actcctaatt 1800 ctcctcttcg gcccatgcat ccttaacaga ttagtacaat tcgtaaaaga cagaatatct 1860 gtggtacaag ccttaatttt aacccaacag taccaacaga taaagcaata cgatccggac 1920 cgaccatga 1929 <210> 12 <211> 1881 <212> DNA <213> Feline leukemia virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1881) <223> FeLV gag-pr65-pro gene <400> 12 atgggccaaa ctataactac ccccttaagc ctcacccttg atcactggtc tgaagtccgg 60 gcacgagccc ataatcaagg tgtcgaggtc cggaaaaaga aatggattac cttatgtgag 120 gccgaatggg tgatgatgaa tgtgggctgg ccccgagaag gaactttttc tcttgataac 180 atttcccagg ttgagaaaaa gatcttcgcc ccgggaccgt atggacaccc cgaccaagtt 240 ccgtacatta ccacatggag atccttagcc acagaccccc cttcgtgggt tcgtccgttc 300 ctaccccctc ccaaaactcc cacacccctc cctcaacctc tatcgccgca gccctccgcc 360 cctcttacct cttccctcta ccccgttctc cccaagtcag accctcccaa accgcctgtg 420 ttaccgcctg atccttcttc ccctttaatt gatctcttaa cagaagagcc acctccctat 480 ccggggggtc acgggccacc gccatcaggt cctagaaccc caaccgcttc cccgattgcc 540 agccggctaa gggaacgacg agaaaaccct gctgaagaat ctcaagccct ccccttgagg 600 gaaggcccca acaaccggcc ccagtattgg ccattctcag cttcagacct gtataactgg 660 aagtcgcata accccccttt ctcccaagac cccgtggccc taactaacct aattgagtcc 720 attttagtga cgcatcaacc aacctgggac gactgccagc agctcttgca ggcactcctg 780 acaggcgaag aaaggcaaag ggtccttctt gaggcccgaa agcaggttcc aggcgaggac 840 ggacggccaa cccagctgcc caatgtcatt gacgaagctt tccccttgac ccgtcccaac 900 tgggattttc gtacgccggc aggtagggag cacctacgcc tttatcgcca gttgctgtta 960 gcgggtctcc gcggggctgc aagacgcccc actaatttgg cacaggtaaa 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tgggcccagg 1860 ggtttacccc tacaagtcct t 1881 <210> 13 <211> 744 <212> DNA <213> Feline leukemia virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(744) <223> FeLV p27 gene <400> 13 cccttgaggg aaggccccaa caaccggccc cagtattggc cattctcagc ttcagacctg 60 tataactgga agtcgcataa cccccctttc tcccaagacc ccgtggccct aactaaccta 120 attgagtcca ttttagtgac gcatcaacca acctgggacg actgccagca gctcttgcag 180 gcactcctga caggcgaaga aaggcaaagg gtccttcttg aggcccgaaa gcaggttcca 240 ggcgaggacg gacggccaac ccagctgccc aatgtcattg acgaagcttt ccccttgacc 300 cgtcccaact gggattttgc tacgccggca ggtagggagc acctacgcct ttatcgccag 360 ttgctgttag cgggtctccg cggggctgca agacgcccca ctaatttggc acaggtaaag 420 caagttgtac aagggaaaga ggaaacgcca gcctcattct tagaaagatt aaaagaggct 480 tacagaatgt atactcccta tgaccctgag gacccagggc aggctgctag tgttatcctg 540 tcctttatct accagtctag cccggacata agaaataagt tacaaaggct agaaggccta 600 caggggttca cactgtctga tttgctaaaa gaggcagaaa agatatacaa caaaagggag 660 accccagagg aaagggaaga aagattatgg cagcggcagg aagaaagaga taaaaagcgc 720 cataaggaga tgactaaagt tctg 744 <210> 14 <211> 2847 <212> DNA <213> Feline viral rhinotracheitis virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2847) <223> glycoprotein B <400> 14 atgtccactc gtggcgatct tgggaagcgg cgacgaggga gtcgttggca gggacacagt 60 ggctattttc gacagagatg ttttttccct tctctactcg gtattgcagc gactggctcc 120 agacatggta acggatcgtc gggattaacc agactagcta gatatgtttc atttatctgg 180 atcgtactat tcttagtcgg tccccgtcca gtagagggtc aatctggaag cacatcggaa 240 caaccccggc ggactgtagc tacccctgag gtagggggta caccaccaaa accaactaca 300 gatcccaccg atatgtcgga tatgagggaa gctctccgtg cgtcccaaat agaggctaac 360 ggaccatcga ctttttatat gtgtccacca ccttcaggat ctactgtcgt gcgtttagag 420 ccaccacggg cctgtccaga ttataaacta gggaaaaatt ttaccgaggg tatagctgta 480 atatttaaag aaaatatagc gccatataaa ttcaaggcaa atatatacta taaaaacatt 540 attatgacaa cggtatggtc tgggagttcc tatgccgtta caaccaaccg atatacagac 600 agggttcccg tgaaagttca agagattaca gatctcatag atagacgggg tatgtgcctc 660 tcgaaagctg attacgttcg taacaattat caatttacgg cctttgatcg agacgaggat 720 cccagagaac tgcctctgaa accctccaag ttcaacactc cagagtcccg tggatggcac 780 accaccaatg aaacatacac aaagatcggt gctgctggat ttcaccactc tgggacctct 840 gtaaattgca tcgtagagga agtggatgca agatctgtat atccatatga ctcatttgct 900 atctccactg gtgacgtgat tcacatgtct ccattctttg ggctgaggga tggagcccat 960 gtagaacata ctagttattc ttcagacaga tttcaacaaa tcgagggata ctatccaata 1020 gacttggata cgcgattaca actgggggca ccagtttctc gcaatttttt ggaaactccg 1080 catgtgacag tggcctggaa ctggacccca aagtgtggtc gggtatgtac cttagccaaa 1140 tggagggaaa tagatgaaat gctacgcgat gaatatcagg gctcctatag atttacagtc 1200 aagaccatat ccgctacttt catctccaat acttcacaat ttgaaatcaa tcgtatccgt 1260 ttgggggact gtgccaccaa ggaggcagcc gaagccatag accggattta taagagtaaa 1320 tatagtaaaa ctcatattca gactggaacc ctggagacct acctagcccg tggcggattt 1380 ctaatagctt tccgtcccat gatcagcaac gaactagcaa agttatatat caatgaatta 1440 gcacgttcca atcgcacggt agatctcagt gcactcctca atccatctgg ggaaacagta 1500 caacgaacta gaagatcggt cccatctaat caacatcata ggtcgcggcg cagcacaata 1560 gaggggggta tagaaaccgt gaacaatgca tcactcctca agaccacctc atctgtggaa 1620 ttcgcaatgc tacaatttgc ctatgactac atacaagccc atgtaaatga aatgttgagt 1680 cggatagcca ctgcctggtg tacacttcag aaccgcgaac atgtgctgtg gacagagacc 1740 ctaaaactca atcccggtgg ggtggtctcg atggccctag aacgtcgtgt atccgcgcgc 1800 ctacttggag atgccgtcgc cgtaacacaa tgtgttaaca tttctagcgg acatgtctat 1860 atccaaaatt ctatgcgggt gacgggttca tcaacgacat gttacagccg ccctcttgtt 1920 tccttccgtg ccctcaatga ctccgaatac atagaaggac aactagggga aaacaatgac 1980 cttctcgtgg aacgaaaact aattgagcct tgcactgtca ataataagcg gtattttaag 2040 tttggggcag attatgtata ttttgaggat tatgcgtatg tccgtaaagt cccgctatcg 2100 gagatagaac tgataagtgc gtatgtggat ttaaatctta ctctcctaga ggatcgtgaa 2160 tttctcccac tcgaagttta tacacgagct gagctggaag ataccggcct tttggactac 2220 agcgagattc aacggcgcaa ccaactccac gccttaaaat tttatgatat agacagcata 2280 gtcagagtgg ataataatct tgtcatcatg cgtggtatgg caaatttttt tcagggactc 2340 ggggatgtgg gggctggttt cggcaaggtg gtcttagggg ctgcgagtgc ggtaatctca 2400 acagtatcag gcgtatcatc atttctaaac aacccatttg gagcattggc cgtgggactg 2460 ttaatattag ctggcatcgt cgcagcattc ctggcatatc gctatatatc tagattacgt 2520 gcaaatccaa tgaaagcctt atatcctgtg acgactagga atttgaaaca gacggctaag 2580 agccccgcct caacggctgg tggggatagc gacccgggag tcgatgactt cgatgaggaa 2640 aagctaatgc aggcaaggga gatgataaaa tatatgtccc tcgtatcggc tatggagcaa 2700 caagaacata aggcgatgaa aaagaataag ggcccagcga tcctaacgag tcatctcact 2760 aacatggccc tccgtcgccg tggacctaaa taccaacgcc tcaataatct tgatagcggt 2820 gatgatactg aaacaaatct tgtctaa 2847 <210> 15 <211> 1125 <212> DNA <213> Feline viral rhinotracheitis virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1125) <223> glycoprotein D <400> 15 atgatgacac gtctacattt ttggtggtgt ggaatctttg cggtcctgaa atatctggta 60 tgtacttcaa gccttacgac cacgccaaaa acaactacgg tttatgtgaa gggatttaat 120 atacctccac tacgctacaa ttatactcaa gccagaatcg tgccaaaaat tccccaggcg 180 atggacccga agataacagc tgaagtacgt tatgtaacat caatggattc atgtgggatg 240 gtggcattga tatcagagcc ggatatagac gctactattc gaaccataca actatctcaa 300 aaaaaaacat ataacgcgac tataagttgg tttaaggtaa cccagggttg tgaataccct 360 atgtttctta tggatatgag actttgtgat cctaaacggg aatttggaat atgtgcttta 420 cggtcgcctt catattggtt ggaaccttta acaaagtata tgttcctaac agacgatgaa 480 ctgggtttga ttatgatggc cccggcccaa tttaatcaag gacaatatcg aagagttata 540 accatcgatg gttccatgtt ttatacagat tttatggtac aactatctcc aacgccatgt 600 tggttcgcaa aacccgatag atacgaagag attctacatg aatggtgtcg aaatgttaaa 660 actattggcc ttgatggagc tcgtgattac cactattatt gggttcccta taacccacaa 720 cctcaccata aagccgtact cttatattgg tatcggactc atggccgaga acccccagta 780 agattccaag aggccattcg atatgatcgt cccgccatac cgtctgggag tgaggattcg 840 aaacggtcca acgactcaag aggagaatcg agtggaccca attggataga cattgaaaat 900 tacactccta aaaataatgt gcctattata atatctgacg atgacgttcc tacagcccct 960 cccaagggca tgaataatca gtcagtagtg atacccgcaa tcgtactaag ttgtcttata 1020 atagcactga ttctaggagt gatatattat attttgaggg taaagaggtc tcgatcaact 1080 gcatatcaac aacttcctat aatacataca actcaccatc cttaa 1125

Claims (38)

  1. 2개 이상의 외인성 동종 핵산 분자를 포함하는 재조합 라쿤 폭스바이러스(raccoon poxvirus) 벡터(rRCNV)로서, 상기 각 핵산 분자는 동일한 고양이 병원체(feline pathogen)의 2개 이상의 서로 다른 균주로부터의 단백질을 코딩하고, 상기 핵산 분자 중 2 이상은 헤마글루티닌(ha) 자리 또는 티미딘 키나아제(tk) 자리에 삽입되거나, 또는 핵산 분자 중 하나 이상은 헤마글루티닌 자리와 티미딘 키나아제 자리에 각각 삽입되는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 라쿤 폭스바이러스는 살아 있고(live) 복제가능한 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 외인성 핵산 분자 중 하나 이상은 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질(feline calicivirus capsid protein)을 코딩하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 외인성 핵산 분자 중 하나 이상은 FCV-2280의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  5. 제3항에 있어서, FCV-2280 캡시드 단백질을 코딩하는 상기 핵산 분자는 발현 을 위해 초기-후기(early-late) 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 발현을 위한 합성 초기-후기 프로모터일 수 있는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리에 삽입된 FCV-DD1의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  7. 제6항에 있어서, FCV-2280 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 발현을 위해 백시니아(vaccinia) 바이러스 후기 프로모터에 작동가능하게 연결되고, FCV-DD1 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 발현을 위해 초기-후기 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 발현을 위한 합성 초기-후기 프로모터일 수 있는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리에 삽입된 FCV-255의 고양이 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스(rhinotracheitis virus) 당단백질 gD 또는 고양이 바이러스성 비기관지염 바이러스 당단백질 gB를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 고양이 백혈병 바이러스 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 고양이 백혈병 바이러스 env 단백질 또는 gag 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 바이러스성 항원을 코딩하는 핵산 분자는 발현을 위해 초기-후기 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 프로모터는 발현을 위한 합성 초기-후기 프로모터일 수 있는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 다른 고양이 병원체의 고양이 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 클라미도필라 펠리스( Chlamydophila felis ) 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  15. 제1항에 있어서, 클라미도필라 펠리스의 외막 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 외막 단백질 유전자의 핵산 서열은 발현을 위해 백시니아 바이러스 후기 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 헤마글루티닌 자리 또는 티미딘 키나아제 자리에 삽입되는, 고양이 인터루킨-12의 P35 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 고양이 인터루킨-12의 P40 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 라쿤 폭스바이러스 게놈의 티미딘 키나아제 자리와 헤마글루티닌 자리 이외에 라쿤 폭스바이러스 게놈의 제3 비필수 부위에 삽입되는 고양이 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 것인 재조 합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 라쿤 폭스바이러스 게놈의 제3 비필수 부위는 세린 프로테아제 억제제 부위인 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터의 면역학적 유효량 및 임의적으로 적절한 담체 또는 희석제를 포함하는 고양이 백신(feline vaccine).
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터 중 2종 이상의 면역학적 유효량 및 임의적으로 적절한 담체 또는 희석제를 포함하는 고양이 백신.
  22. 제21항에 있어서, 상기 백신은 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라( Bartonella ) 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 고양이 항원의 혼합물을 더 포함하는 것인 고양이 백신.
  23. 제21항에 있어서, 상기 백신은 rRCNV-FCV2280, rRCNV-FCV2280-FCVDD1, rRCNV-FCV2280-FCVDD1-FCV255, rRCNV-FVR gD, rRCNV-FVR gB, rRCNV-FVR gD+gB, rRCNV-FeLV gag-pr65-pro/env-gp85, rRCNV-FeLV gag-pr65-pro-env-gp85(TK)//env-gp70(HA), rRCNV-FCP momp 및 rRCNV-고양이 IL-12 P35/P40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터 중 2이상의 혼합물을 포함하는 것인 고양이 백신.
  24. 제21항에 있어서, 상기 백신은 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 고양이 항원의 혼합물을 더 포함하는 것인 고양이 백신.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항의 백신의 면역 유효량을 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는 고양이에 있어서 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
  26. 서열 번호 1, 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드.
  27. 제25항에 있어서, 상기 백신의 면역 유효량은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 이상인 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 백신의 면역 유효량은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 내지 약 7.5 Log10TCID50/㎖ 범위인 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 백신은 단회 투여량 또는 반복 투여량으로 투여되는 것인 방법.
  30. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 아주반트(adjuvant)가 첨가되지 않은 것인 고양이 백신.
  31. a) 하나 이상의 외인성 핵산과 하나 이상의 동종의 외인성 핵산; 또는
    b) 2개 이상의 외인성 핵산
    을 포함하는 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(RCNV)로서,
    상기 a)에서 각각의 핵산은 고양이 병원체의 2개 이상의 서로 다른 균주로부터 유래한 것과 동일한 고양이 단백질을 코딩하며, 상기 하나 이상의 동종의 핵산은 ha 자리 또는 tk 자리 중 하나 이상의 자리에 삽입되고,
    상기 b)에서 각 핵산은 동일한 고양이 병원체로부터 유래한 것과는 서로 다 른 하나 이상의 고양이 단백질을 코딩하며, 상기 외인성 핵산 중 하나의 핵산은 ha 또는 tk 부위 중 하나 이상의 부위에 삽입되거나, 또는 적어도 한 핵산은 ha 자리에 삽입되며, 하나 이상의 핵산은 tk 자리에 삽입되는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(RCNV).
  32. 제1항 또는 제31항에 있어서, 2개 이상의 동종의 외인성 핵산 분자를 포함하는 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(RCNV)로서, 상기 각 핵산 분자는 고양이 병원체의 2개 이상의 서로 다른 균주로부터 유래한 것과 동일한 고양이 단백질을 코딩하며, 상기 동종의 외인성 핵산 분자는 ha 자리, tk 자리, 세린 프로테아제 억제제 자리에 삽입되거나, 또는 상기 하나 이상의 동종의 외인성 핵산 분자는 ha, tk, 또는 세린 프로테아제 억제제 자리에 각각 삽입되는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터(RCNV).
  33. 제31항에 있어서, 상기 2개 이상의 외인성 핵산 분자 중 하나 이상의 핵산 분자는 고양이 칼리시바이러스 단백질, 고양이 비기관지염의 당단백질 gB, 고양이 비기관지염의 당단백질 gD, 고양이 백혈병 바이러스로부터의 gag 단백질, 고양이 백혈병 바이러스로부터의 env 단백질, 클라미도필라 펠리스 단백질 및 고양이 인터루킨-12의 P35와 P40 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 상이한 고양이 단백질을 코딩하는 것인 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터.
  34. 제1항, 제13항, 제18항 또는 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 재조합 라쿤 폭스바이러스 벡터의 2종 이상을 면역학적 유효량으로 포함하는 고양이 백신.
  35. 제34항에 있어서, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 바르토넬라 박테리아, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-벨링햄, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 고양이 항원의 혼합물을 더 포함하는 것인 고양이 백신.
  36. 고양이에게 제34항 또는 제35항의 백신을 면역 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여, 고양이에 있어서 고양이 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 백신의 면역 유효량은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 이상인 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 백신의 면역 유효량은 약 4.5 Log10TCID50/㎖ 내지 약 7.5 Log10TCID50/㎖ 범위인 것인 방법.
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