CN101052645B - 细胞周期报道细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于确定活细胞的细胞周期位置的非破坏性和动态方法。本发明提供了可以用于确定细胞周期位置的稳定细胞系，和用于测量测试试剂对细胞周期位置的影响的方法。

Description

细胞周期报道细胞系

技术领域

本发明涉及用于确定活细胞的细胞周期位置的新的非破坏性和动态方法。

发明背景

真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续阶段的细胞周期来进行。两个过渡期，即G1和G2，散布在复制细胞DNA的DNA合成(S)期和每个细胞分裂形成两个子细胞的有丝分裂(M)期之间。

细胞周期或细胞周期控制的破坏可导致细胞异常或疾病状态诸如癌症，这起因于多种遗传改变，其将生长受限的细胞转化成了高度侵入性的细胞，它们对生长的正常控制没有应答。正常细胞到癌细胞的转变可通过DNA复制和DNA修复机制的正确功能的丧失而产生。所有分裂中的细胞都受控于许多控制机制，称为细胞周期关卡，其通过停滞异常细胞或诱导异常细胞的破坏来维持基因组完整。因此对细胞周期进展和控制的研究对于设计抗癌药物来说是有相当重要性的(Flatt，P.M.和Pietenpol，J.A.2000 Drug Metab.Rev.32(3-4)：283-305；Buolamwini，J.K.2000 Current Pharmaceutical Design 6，379-392)。

细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至关重要的，其中：

a)需要直接或间接改变细胞周期进展的物质，例如作为抗癌治疗。

b)检查药物对细胞周期进展的有害影响。

c)怀疑试剂对细胞周期的特定阶段的细胞是活性的或无活性的。

传统上，细胞群的细胞周期状态是通过流式细胞术确定的，其中使用荧光染料染色细胞核的DNA(Barlogie，B.et al，Cancer Res.，1983，43(9)，3982-97)。流式细胞术产生细胞DNA含量的定量信息，因此能够确定处于细胞周期的G1、S和G2+M期的相对细胞数量或细胞比例。然而，该分析是破坏性的非动态方法，并且需要对群体进行连续取样，以便随时间确定细胞周期状态。此外，标准的流式细胞术技术仅仅检验样品中的总细胞群，而不产生单个细胞的数据，这排除了进行分析的样品中可能存在的不同细胞类型的细胞周期状态的研究。因此，流式细胞术适于检验群体内细胞的总体细胞周期分布，但不能用于随时间监测单个细胞的精确细胞周期状态。

因此，研究具有需要或不需要的效果的试剂对细胞周期的影响所需要的是通过非破坏性方法精确确定单个活细胞的细胞周期状态的方法，所述非破坏性方法使得能够随时间重复查询同一细胞。此外，从细胞周期控制成分直接控制的探针确定细胞周期位置，而不是间接通过DNA含量或上文描述的细胞周期位置的其它间接标志物，这将是有利的。

已经描述了许多方法，其利用细胞周期控制机制的某些成分，提供分析或开发细胞增殖状态的程序。

US 6048693描述了筛选影响细胞周期调节蛋白的化合物的方法，其中报道基因的表达与控制元件相关，所述控制元件通过细胞周期蛋白或其它细胞周期控制蛋白起作用。在该方法中，报道基因产物的时间性表达是以细胞周期特异的方式被驱动的，作用于一种或多种细胞周期控制成分的化合物可以增加或降低表达水平。由于测定系系统不含提供报道基因产物的破坏也不破坏来自报道基因的任何信号的元件，该方法不能产生关于测定中任何细胞的细胞周期位置的信息，并且仅仅报道细胞周期控制机制的一般干扰。

WO 03/031612描述了DNA报道基因构建体以及用于确定活哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，其依靠细胞周期阶段特异性表达控制元件和破坏控制元件。一种实施方案采用充分表征的细胞周期控制蛋白即细胞周期蛋白B1的元件控制绿色荧光蛋白(GFP)分子的表达和降解，并且报道细胞通过细胞周期G2和M期的转变。由于该构建体处于细胞周期蛋白B1启动子的控制下，在G1和S期缺乏GFP表达，由此阻止了细胞周期的这些阶段的细胞分析。

已经报道和表征了人解旋酶B同源物(Taneja et al J.Biol.Chem.，(2002)，277，40853-40861)。报道证明在G1期间需要解旋酶活性来促进G1/S转变。

Gu et al(Mol.Biol.Cell.，(2004)，15，3320-3332)已经表明，称为磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)的解旋酶B基因的小C末端区是由Cdk2/细胞周期蛋白E磷酸化的，并且含有NLS和NES序列。Gu et al(Mol.Biol.Cell.，(2004)，15，3320-3332)在用由CMV启动子表达的编码EGFP-βGal-PSLD融合物(在构建体中包括β-半乳糖苷酶(βGal)作为惰性基团以使整个融合蛋白在大小上类似于解旋酶B)的质粒瞬时转染的细胞上进行了研究。处于G1的细胞主要在细胞核中显示EGFP信号，而处于细胞周期其它阶段的细胞主要显示细胞质EGFP信号。这些研究者断定，在细胞周期的G1/S期转变前后，PSLD引导了βGal-EGFP报道分子从细胞核到细胞质的转运。

前述采用细胞周期控制机制的成分的方法都没有提供在整个细胞周期中容易并且准确确定单个细胞或细胞群的细胞周期状态方法。因此，开发了一种方法，并且在此描述为在确定的组合中采用细胞周期调节机制的关键成分，来驱动双非依赖性细胞报道分子，以提供在单个活细胞的细胞周期的所有阶段确定细胞周期状态的新方法。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供了稳定的细胞系，其表达：

i)第一多肽构建体，其包含与至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件连接的第一可检测的活细胞报道分子，所述构建体在哺乳动物细胞内的定位表明细胞周期位置；和

ii)第二多肽构建体，其包含与破坏控制元件连接的第二可检测的活细胞报道分子，其中所述第二报道分子可以在哺乳动物细胞中细胞周期的预定位置检测到，

其中所述第一和第二报道分子可以彼此区分，并且稳定的细胞系可以用于确定细胞周期位置。

本发明提供了含有多肽构建体的细胞系，其通过将报道信号与细胞周期成分的时间和空间表达、定位和破坏直接关联，表现出细胞周期阶段特异性激活、易位或破坏。这显著改进了确定细胞周期阶段状态的精确性，并且使得能够连续监测单个细胞中的细胞周期进展。此外，发明人已经发现这些可由细胞周期控制机制分离并提取关键控制元件，这使得能够设计动态受控的细胞周期阶段报道分子，并能够与内源细胞周期控制成分一致地但是独立地进行操作，从而提供了用于监测细胞周期状态的手段，其不影响或干扰细胞周期的自然进展。

合适地，细胞周期阶段依赖性定位控制元件选自由Rag2、Chaf1B、Fen1、PPP1R2、解旋酶B、sgk、CDC6或其中的基序组成的肽组，所述基序诸如解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)。

合适地，破坏控制元件包括细胞周期蛋白B1D-盒。

合适地，第一和第二活细胞报道分子选自荧光蛋白和酶报道分子。

优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Emerald和J-Red。优选地，所述酶报道分子是halo-tag(Promega)。

优选地，第一报道分子是EGFP，第二报道分子是J-Red，或第一报道分子是J-Red，第二报道分子是EGFP。更优选地，第一报道分子是J-Red，第二报道分子是EGFP。

在本发明的一种优选实施方案中，第一多肽构建体包含与红色荧光蛋白(RFP)偶联的解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)，第二多肽构建体包含与绿色荧光蛋白(GFP)偶联的细胞周期蛋白B1的氨基末端的171个氨基酸，所述氨基酸在细胞周期蛋白B1启动子的控制下表达。

当在哺乳动物细胞中表达时，这些构建体表现出细胞周期特异性表达和GFP构建体的破坏，以及RFP构建体的易位，其中GFP构建体对应于内源性细胞周期蛋白B1的表达和降解，RFP构建体对应于内源性解旋酶B的易位。因此，GFP和RFP荧光强度和定位的测量使得能够鉴定处于细胞周期的G1、S、G2和M期的细胞。因此，随时间分析群体中每个细胞的荧光特征，产生了关于每个细胞的细胞周期状态的动态信息。

在本发明的进一步的方面，提供了分析培养的细胞的细胞周期分布并确定测试试剂对细胞周期分布的影响的方法。术语“测试试剂”应被理解为电磁辐射的形式或者化学实体。优选地，测试试剂是选自药物、核酸、激素、蛋白质和肽的化学实体。测试试剂可以是外源应用到细胞的，或者可以是在进行研究的细胞中所表达的肽或蛋白质。

因此，在本发明的第二方面，提供了确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，所述方法包括：

a)培养上文描述的稳定的细胞系；和

b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置。

在本发明的第三方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：

a)培养上文描述的稳定的细胞系；和

b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置，其中不存在所述测试试剂和存在所述试剂的条件下测量到的发射的信号之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。

在本发明的第四方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：

a)培养上文描述的稳定的细胞系；

b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置；和

c)比较存在测试试剂的条件下发射的信号和不存在测试试剂的条件下发射的信号的已知值；

其中存在测试试剂的条件下测量的发射的信号和不存在测试试剂的条件下所述已知值之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。

在本发明方法的进一步的方面，提供了通过监测报道细胞周期位置的细胞中的细胞过程，确定细胞过程的细胞周期依赖性的方法。

因此，根据本发明第五方面，提供了确定哺乳动物细胞周期对通过已知反应于测试试剂而改变的过程报道分子监测的细胞过程的影响的方法，所述方法包括：

a)培养上文描述的稳定的细胞系；

b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置；和

c)监测由过程报道分子发射的信号，其中过程报道分子与第一和第二报道分子是可区分的；

其中通过步骤b)确定的细胞周期位置和由过程报道分子发射的信号之间的关系表明细胞过程是否是细胞周期依赖性的。

附图简述

SEQ ID NO：1是PSLD-J-RED融合蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是pCORON1022-JRed-C1-PSLD的核酸序列。

SEQ ID NO：3是pCORON1020-JRed-C1-PSLD的核酸序列。

图1是pCORON1002-EGFP-C1-PSLD的载体图。

图2显示pCORON1022-JRed-C1-PSLD(图2a)和pCORON1020-JRed-C1-PSLD(图2b)的载体图。

图3显示用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)成像系统产生的表达细胞周期蛋白B1-EGFP和PSLD-J Red荧光蛋白的U2OS细胞的图像。发现细胞处于其细胞周期的各个阶段，如字母/数字′S′、′G1′和′G2′所示。由图3a中的蓝色荧光表明了Hoechst染料的存在，并且显示了图3b中G2/M细胞周期蛋白B1绿色荧光蛋白报道分子的表达和图3c中G1/S PSLD红色荧光蛋白报道分子的表达。

发明详述

PSLD-RFP构建体

将全长人DNA解旋酶B(HDHB)cDNA作为BgIII/NotI片段(Taneja et al.，J.Biol.Chem.，(2002)277，40853-40861)插入pEGFP-C1载体(Clontech)的NotI位点。将390bp PSLD区的PCR扩增和5′NheI和3′SaII限制酶位点在PSLD片段的导入用于亚克隆到载体pCORON1002-EGFP-C1(GE Healthcare)中。得到的6704bpDNA构建体pCORON1002-EGFP-C1-PSLD(图1)含有遍在蛋白C启动子、细菌氨苄青霉素抗性基因和哺乳动物新霉素抗性基因。用标准PCR和克隆技术(Sambrook，J.et al(1989))进行该载体的进一步修饰，以便用荧光蛋白J-Red(Evrogen)代替EGFP，从而将质粒从新霉素抗性转化为潮霉素抗体(图2a)，并且用CMV IE/启动子代替遍在蛋白C启动子(图2b)。

双构建体稳定细胞系

根据提供者的说明书，培养稳定表达细胞周期蛋白B1-EGFP细胞周期报道分子(如WO03/031612中的描述，并且以AmershamBiosciences UK Limited/GE Healthcare Biosciences的产品代码25-80-10′G2M Cell Cycle Phase Marker′提供)的U2OS细胞系。根据制造商的说明书，采用Fugene(Roche)，用编码PSLD-RFP融合蛋白(SEQID NO：1)的质粒(图2a和2b)转染细胞。将细胞置于潮霉素(125μg/ml)和新霉素(500μg/ml)选择下，选择存活的克隆用于进一步扩增。

表达G1/S和G2/M传感器的稳定细胞系的成像

在标准组织培养条件下使表达细胞周期蛋白B1-EGFP和PSLD-JRed荧光融合蛋白的稳定U2OS细胞系在96孔板上的补加10％血清的McCoys培养基中生长。在2％低聚甲醛中固定细胞，用Hoechst染色，采用具有蓝色(Hoechst)、绿色(细胞周期蛋白B1-EGFP)和红色(PSLD-J Red)荧光的合适的激发和发射滤光器的IN CellAnalyzer 1000(GE Healthcare)成像。

实施例1

表达细胞周期蛋白B1-EGFP和PSLD-J Red的稳定细胞系的图像(图3)显示了细胞周期的不同阶段中细胞之间绿色和红色融合蛋白的差异表达和定位。每个细胞的细胞质和细胞核中绿色和红色荧光融合蛋白的存在与否的确定使得能够根据以下方案确定细胞周期位置：

涉及制备表达包含与至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件连接的第一可检测活细胞报道分子的多肽构建体的稳定细胞系(该构建体在哺乳动物细胞中的定位表明细胞周期位置)的实验细节描述于申请人的共同未决的美国临时专利申请US60/645,968，该申请的名称是“细胞周期阶段标志物”，在此全文引入其公开内容作为参考。

上述内容是说明本发明，不要理解为对它的限制。尽管已经描述了本发明的一些例证性的实施方案，但是本领域技术人员将很容易理解的是，例证性实施方案中不实质上背离本发明的新的教导和优点的许多修改是可能的。因此，所有的这些修改都被确定为包括在本发明的范围内，如权利要求中所定义的。所以要理解的是，上述内容是说明本发明，不要理解为被限定到所披露的特定实施方案，对所披露实施方案的修改以及其它实施方案都被确定为包括在所附权利要求的范围内。本发明通过下面的权利要求来限定，权利要求的等同方案被包括在其中。

序列表

SEQ ID NO：1

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SRLQNLRLNN LIPRQLFKPT DNQET                                          385

SEQ ID NO：2

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atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata    5640

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt    5700

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag    5760

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca    5820

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg    5880

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg    5940

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag    6000

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg    6060

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag    6120

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga    6180

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt    6240

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc    6300

tgcacgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc    6360

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac    6420

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac    6480

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt    6540

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct    6600

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat    6660

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt    6720

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg    6780

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt    6840

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt    6900

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tggctcgaca gatct                    6945

SEQ ID NO：3

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta      60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc     120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg     180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc     240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat     300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc     360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga     420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg     480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac     540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt     600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg     660

cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata     720

agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac     780

agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt     840

gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa     900

ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact     960

cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac    1020

aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtatcgcca ccatggacga    1080

ggatggttca gagggcggcc ccgccctgtt ccagagcgac atgaccttca aaatcttcat    1140

cgacggcgag gtgaacggcc agaagttcac catcgtggcc gacggcagca gcaagttccc    1200

ccacggcgac ttcaacgtgc acgccgtgtg cgagaccggc aagctgccca tgagctggaa    1260

gcccatctgc cacctgatcc agtacggcga gcccttcttc gcccgctacc ccaacggcat    1320

cagccacttc gcccaggagt gcttccccga gggcctgagc atcgaccgca ccgtgcgctt    1380

cgagaacgac ggcaccatga ccagccacca cacctacgag ctggacggca cctgcgtggt    1440

cagccgcatc accgtgaact gcgacggctt ccagcccgac ggccccatca tgcgcgacca    1500

gctggtggac atcctgccca acgagaccca catgttcccc cacggcccca acgccgtgcg    1560

ccagctggcc ttcatcggct tcaccaccgc cgacggcggc ctgatgatgg gccacttcga    1620

cagcaagatg accttcaacg gcagccgcgc catcaagatc cccggccccc acttcgtgac    1680

catcatcacc aagcagatga gggacaccag cgacaagcgc gaccacgtgt gccagcgcga    1740

ggtgacctac gcccacagcg tgccccgcat caccagcgcc atcggtagcg acgaggattc    1800

cggactcatg tacaagggca atggcggcaa tgctagcagc ggcgcacctc cagcagattt    1860

tccgtcccca cggaagagct ctggagacag tggaggaccc agcacaccgt cagcatctcc    1920

actccctgta gtcacagacc acgccatgac aaatgatgtc acctggagcg aggcctcttc    1980

gcctgatgag aggacactca cctttgctga aagatggcaa ttatcttcac ctgatggagt    2040

agatacagat gatgatttac caaaatcgcg agcatccaaa agaacctgtg gtgtgaatga    2100

tgatgaaagt ccaagcaaaa tttttatggt gggagaatct ccacaagtgt cttccagact    2160

tcagaatttg agactgaata atttaattcc caggcaactt ttcaagccca ccgataatca    2220

agaaacttag gtcgacccgg gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag    2280

tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat    2340

gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc    2400

attcatttta tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac    2460

ctctacaaat gtggtaaaat ccgataagga tcgatccggg ctggcgtaat agcgaagagg    2520

cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg    2580

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc    2640

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg    2700

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg    2760

gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg    2820

atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt    2880

ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt    2940

gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt    3000

taacaaaata ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc    3060

ggtatttcac accgcatacg cggatctgcg cagcaccatg gcctgaaata acctctgaaa    3120

gaggaacttg gttaggtacc ttctgaggcg gaaagaacca gctgtggaat gtgtgtcagt    3180

tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca    3240

attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa    3300

gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc    3360

taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg    3420

cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg    3480

gaggcctagg cttttgcaaa aagcttgatt cttctgacgc tagcgatcgc ccgggccacc    3540

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac    3600

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat    3660

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat    3720

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt    3780

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg    3840

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat    3900

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga    3960

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat    4020

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag    4080

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc    4140

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg    4200

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct    4260

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg    4320

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac    4380

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga    4440

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc    4500

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag    4560

gaatagctcg agtttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgatggcc    4620

gcaataaaat atctttattt tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag    4680

cgataaggat ccgcgtatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa    4740

gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg    4800

catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac    4860

cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta    4920

atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg    4980

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat    5040

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc    5100

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa    5160

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac    5220

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga    5280

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag    5340

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca    5400

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca    5460

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa    5520

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc    5580

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa    5640

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag    5700

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct    5760

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac    5820

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa    5880

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt    5940

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat    6000

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg    6060

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc    6120

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg    6180

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag    6240

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact    6300

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg    6360

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc    6420

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg    6480

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg    6540

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag    6600

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc    6660

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct    6720

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat ggctcgacag atct          6774

Claims (8)

1.稳定的细胞系，其表达：

i)第一多肽构建体，其包含与解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域即PSLD连接的第一荧光蛋白，所述构建体在哺乳动物细胞内的定位表明细胞周期位置；和

ii)第二多肽构建体，其包含与细胞周期蛋白B1 D-盒连接的第二荧光蛋白，其中所述第二荧光蛋白能在哺乳动物细胞中细胞周期的预定位置检测到，

其中所述第一和第二荧光蛋白能彼此区分，并且稳定的细胞系能够用于确定细胞周期位置。

2.权利要求1的稳定的细胞系，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Emerald和J-Red。

3.权利要求1或2的稳定的细胞系，其中所述第一荧光蛋白是EGFP，第二荧光蛋白是J-Red，或第一荧光蛋白是J-Red，第二荧光蛋白是EGFP。

4.权利要求1或2的稳定的细胞系，其中第一多肽构建体的荧光蛋白是红色荧光蛋白即RFP，第二多肽构建体包含与绿色荧光蛋白即GFP偶联的细胞周期蛋白B1的氨基末端的171个氨基酸，所述氨基酸在细胞周期蛋白B1启动子的控制下表达。

5.确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，所述方法包括：

a)培养权利要求1-4中任一项的稳定的细胞系；和

b)通过监测第一和第二荧光蛋白发射的信号确定细胞周期位置。

6.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：

a)培养权利要求1-4中任一项的稳定的细胞系；和

b)通过监测第一和第二荧光蛋白发射的信号确定细胞周期位置，其中不存在所述测试试剂和存在所述试剂的条件下测量到的发射的信号之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。

7.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：

a)培养权利要求1-4中任一项的稳定的细胞系；

b)通过监测第一和第二荧光蛋白发射的信号确定细胞周期位置；和

c)比较存在测试试剂的条件下发射的信号和不存在测试试剂的条件下发射的信号的已知值；

其中存在测试试剂的条件下测量的发射的信号和不存在测试试剂的条件下所述已知值之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。

8.确定哺乳动物细胞周期对通过已知反应于测试试剂而改变的过程报道分子监测的细胞过程的影响的方法，所述方法包括：

a)培养权利要求1-4中任一项的稳定的细胞系；

b)通过监测第一和第二荧光蛋白发射的信号确定细胞周期位置；和

c)监测由过程报道分子发射的信号，其中过程报道分子与第一和第二荧光蛋白是可区分的；

其中通过步骤b)确定的细胞周期位置和由过程报道分子发射的信号之间的关系表明细胞过程是否是细胞周期依赖性的。

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