CN101052645A - 细胞周期报道细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于确定活细胞的细胞周期位置的非破坏性和动态方法。本发明提供了可以用于确定细胞周期位置的稳定细胞系，和用于测量测试试剂对细胞周期位置的影响的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于确定活细胞的细胞周期位置的新的非破坏性和动态方法。
发明背景
真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续阶段的细胞周期来进行。两个过渡期，即G1和G2，散布在复制细胞DNA的DNA合成(S)期和每个细胞分裂形成两个子细胞的有丝分裂(M)期之间。
细胞周期或细胞周期控制的破坏可导致细胞异常或疾病状态诸如癌症，这起因于多种遗传改变，其将生长受限的细胞转化成了高度侵入性的细胞，它们对生长的正常控制没有应答。正常细胞到癌细胞的转变可通过DNA复制和DNA修复机制的正确功能的丧失而产生。所有分裂中的细胞都受控于许多控制机制，称为细胞周期关卡，其通过停滞异常细胞或诱导异常细胞的破坏来维持基因组完整。因此对细胞周期进展和控制的研究对于设计抗癌药物来说是有相当重要性的(Flatt，P.M.和Pietenpol，J.A.2000 Drug Metab.Rev.32(3-4)：283-305；Buolamwini，J.K.2000 Current Pharmaceutical Design 6，379-392)。
细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至关重要的，其中：
a)需要直接或间接改变细胞周期进展的物质，例如作为抗癌治疗。
b)检查药物对细胞周期进展的有害影响。
c)怀疑试剂对细胞周期的特定阶段的细胞是活性的或无活性的。
传统上，细胞群的细胞周期状态是通过流式细胞术确定的，其中使用荧光染料染色细胞核的DNA(Barlogie，B.et al，Cancer Res.，1983，43(9)，3982-97)。流式细胞术产生细胞DNA含量的定量信息，因此能够确定处于细胞周期的G1、S和G2+M期的相对细胞数量或细胞比例。然而，该分析是破坏性的非动态方法，并且需要对群体进行连续取样，以便随时间确定细胞周期状态。此外，标准的流式细胞术技术仅仅检验样品中的总细胞群，而不产生单个细胞的数据，这排除了进行分析的样品中可能存在的不同细胞类型的细胞周期状态的研究。因此，流式细胞术适于检验群体内细胞的总体细胞周期分布，但不能用于随时间监测单个细胞的精确细胞周期状态。
因此，研究具有需要或不需要的效果的试剂对细胞周期的影响所需要的是通过非破坏性方法精确确定单个活细胞的细胞周期状态的方法，所述非破坏性方法使得能够随时间重复查询同一细胞。此外，从细胞周期控制成分直接控制的探针确定细胞周期位置，而不是间接通过DNA含量或上文描述的细胞周期位置的其它间接标志物，这将是有利的。
已经描述了许多方法，其利用细胞周期控制机制的某些成分，提供分析或开发细胞增殖状态的程序。
US 6048693描述了筛选影响细胞周期调节蛋白的化合物的方法，其中报道基因的表达与控制元件相关，所述控制元件通过细胞周期蛋白或其它细胞周期控制蛋白起作用。在该方法中，报道基因产物的时间性表达是以细胞周期特异的方式被驱动的，作用于一种或多种细胞周期控制成分的化合物可以增加或降低表达水平。由于测定系系统不含提供报道基因产物的破坏也不破坏来自报道基因的任何信号的元件，该方法不能产生关于测定中任何细胞的细胞周期位置的信息，并且仅仅报道细胞周期控制机制的一般干扰。
WO 03/031612描述了DNA报道基因构建体以及用于确定活哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，其依靠细胞周期阶段特异性表达控制元件和破坏控制元件。一种实施方案采用充分表征的细胞周期控制蛋白即细胞周期蛋白B1的元件控制绿色荧光蛋白(GFP)分子的表达和降解，并且报道细胞通过细胞周期G2和M期的转变。由于该构建体处于细胞周期蛋白B1启动子的控制下，在G1和S期缺乏GFP表达，由此阻止了细胞周期的这些阶段的细胞分析。
已经报道和表征了人解旋酶B同源物(Taneja et al J.Biol.Chem.，(2002)，277，40853-40861)。报道证明在G1期间需要解旋酶活性来促进G1/S转变。
Gu et al(Mol.Biol.Cell.，(2004)，15，3320-3332)已经表明，称为磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)的解旋酶B基因的小C末端区是由Cdk2/细胞周期蛋白E磷酸化的，并且含有NLS和NES序列。Gu et al(Mol.Biol.Cell.，(2004)，15，3320-3332)在用由CMV启动子表达的编码EGFP-βGal-PSLD融合物(在构建体中包括β-半乳糖苷酶(βGal)作为惰性基团以使整个融合蛋白在大小上类似于解旋酶B)的质粒瞬时转染的细胞上进行了研究。处于G1的细胞主要在细胞核中显示EGFP信号，而处于细胞周期其它阶段的细胞主要显示细胞质EGFP信号。这些研究者断定，在细胞周期的G1/S期转变前后，PSLD引导了βGal-EGFP报道分子从细胞核到细胞质的转运。
前述采用细胞周期控制机制的成分的方法都没有提供在整个细胞周期中容易并且准确确定单个细胞或细胞群的细胞周期状态方法。因此，开发了一种方法，并且在此描述为在确定的组合中采用细胞周期调节机制的关键成分，来驱动双非依赖性细胞报道分子，以提供在单个活细胞的细胞周期的所有阶段确定细胞周期状态的新方法。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了稳定的细胞系，其表达：
i)第一多肽构建体，其包含与至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件连接的第一可检测的活细胞报道分子，所述构建体在哺乳动物细胞内的定位表明细胞周期位置；和
ii)第二多肽构建体，其包含与破坏控制元件连接的第二可检测的活细胞报道分子，其中所述第二报道分子可以在哺乳动物细胞中细胞周期的预定位置检测到，
其中所述第一和第二报道分子可以彼此区分，并且稳定的细胞系可以用于确定细胞周期位置。
本发明提供了含有多肽构建体的细胞系，其通过将报道信号与细胞周期成分的时间和空间表达、定位和破坏直接关联，表现出细胞周期阶段特异性激活、易位或破坏。这显著改进了确定细胞周期阶段状态的精确性，并且使得能够连续监测单个细胞中的细胞周期进展。此外，发明人已经发现这些可由细胞周期控制机制分离并提取关键控制元件，这使得能够设计动态受控的细胞周期阶段报道分子，并能够与内源细胞周期控制成分一致地但是独立地进行操作，从而提供了用于监测细胞周期状态的手段，其不影响或干扰细胞周期的自然进展。
合适地，细胞周期阶段依赖性定位控制元件选自由Rag2、Chaf1B、Fen1、PPP1R2、解旋酶B、sgk、CDC6或其中的基序组成的肽组，所述基序诸如解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)。
合适地，破坏控制元件包括细胞周期蛋白B1 D-盒。
合适地，第一和第二活细胞报道分子选自荧光蛋白和酶报道分子。
优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Emerald和J-Red。优选地，所述酶报道分子是halo-tag(Promega)。
优选地，第一报道分子是EGFP，第二报道分子是J-Red，或第一报道分子是J-Red，第二报道分子是EGFP。更优选地，第一报道分子是J-Red，第二报道分子是EGFP。
在本发明的一种优选实施方案中，第一多肽构建体包含与红色荧光蛋白(RFP)偶联的解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)，第二多肽构建体包含与绿色荧光蛋白(GFP)偶联的细胞周期蛋白B1的氨基末端的171个氨基酸，所述氨基酸在细胞周期蛋白B1启动子的控制下表达。
当在哺乳动物细胞中表达时，这些构建体表现出细胞周期特异性表达和GFP构建体的破坏，以及RFP构建体的易位，其中GFP构建体对应于内源性细胞周期蛋白B1的表达和降解，RFP构建体对应于内源性解旋酶B的易位。因此，GFP和RFP荧光强度和定位的测量使得能够鉴定处于细胞周期的G1、S、G2和M期的细胞。因此，随时间分析群体中每个细胞的荧光特征，产生了关于每个细胞的细胞周期状态的动态信息。
在本发明的进一步的方面，提供了分析培养的细胞的细胞周期分布并确定测试试剂对细胞周期分布的影响的方法。术语“测试试剂”应被理解为电磁辐射的形式或者化学实体。优选地，测试试剂是选自药物、核酸、激素、蛋白质和肽的化学实体。测试试剂可以是外源应用到细胞的，或者可以是在进行研究的细胞中所表达的肽或蛋白质。
因此，在本发明的第二方面，提供了确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，所述方法包括：
a)培养上文描述的稳定的细胞系；和
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置。
在本发明的第三方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：
a)培养上文描述的稳定的细胞系；和
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置，其中不存在所述测试试剂和存在所述试剂的条件下测量到的发射的信号之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
在本发明的第四方面，提供了确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：
a)培养上文描述的稳定的细胞系；
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置；和
c)比较存在测试试剂的条件下发射的信号和不存在测试试剂的条件下发射的信号的已知值；
其中存在测试试剂的条件下测量的发射的信号和不存在测试试剂的条件下所述已知值之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
在本发明方法的进一步的方面，提供了通过监测报道细胞周期位置的细胞中的细胞过程，确定细胞过程的细胞周期依赖性的方法。
因此，根据本发明第五方面，提供了确定哺乳动物细胞周期对通过已知反应于测试试剂而改变的过程报道分子监测的细胞过程的影响的方法，所述方法包括：
a)培养上文描述的稳定的细胞系；
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置；和
c)监测由过程报道分子发射的信号，其中过程报道分子与第一和第二报道分子是可区分的；
其中通过步骤b)确定的细胞周期位置和由过程报道分子发射的信号之间的关系表明细胞过程是否是细胞周期依赖性的。
附图简述
SEQ ID NO：1是PSLD-J-RED融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是pCORON1022-JRed-C1-PSLD的核酸序列。
SEQ ID NO：3是pCORON1020-JRed-C1-PSLD的核酸序列。
图1是pCORON1002-EGFP-C1-PSLD的载体图。
图2显示pCORON1022-JRed-C1-PSLD(图2a)和pCORON1020-JRed-C1-PSLD(图2b)的载体图。
图3显示用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)成像系统产生的表达细胞周期蛋白B1-EGFP和PSLD-J Red荧光蛋白的U2OS细胞的图像。发现细胞处于其细胞周期的各个阶段，如字母/数字′S′、′G1′和′G2′所示。由图3a中的蓝色荧光表明了Hoechst染料的存在，并且显示了图3b中G2/M细胞周期蛋白B1绿色荧光蛋白报道分子的表达和图3c中G1/S PSLD红色荧光蛋白报道分子的表达。
发明详述
PSLD-RFP构建体
将全长人DNA解旋酶B(HDHB)cDNA作为BgIII/NotI片段(Taneja et al.，J.Biol.Chem.，(2002)277，40853-40861)插入pEGFP-C1载体(Clontech)的NotI位点。将390 bp PSLD区的PCR扩增和5′NheI和3′SaII限制酶位点在PSLD片段的导入用于亚克隆到载体pCORON1002-EGFP-C1(GE Healthcare)中。得到的6704 bpDNA构建体pCORON1002-EGFP-C1-PSLD(图1)含有遍在蛋白C启动子、细菌氨苄青霉素抗性基因和哺乳动物新霉素抗性基因。用标准PCR和克隆技术(Sambrook，J.et al(1989))进行该载体的进一步修饰，以便用荧光蛋白J-Red(Evrogen)代替EGFP，从而将质粒从新霉素抗性转化为潮霉素抗体(图2a)，并且用CMV IE/启动子代替遍在蛋白C启动子(图2b)。
双构建体稳定细胞系
根据提供者的说明书，培养稳定表达细胞周期蛋白B1-EGFP细胞周期报道分子(如WO03/031612中的描述，并且以AmershamBiosciences UK Limited/GE Healthcare Biosciences的产品代码25-80-10′G2M Cell Cycle Phase Marker′提供)的U2OS细胞系。根据制造商的说明书，采用Fugene(Roche)，用编码PSLD-RFP融合蛋白(SEQID NO：1)的质粒(图2a和2b)转染细胞。将细胞置于潮霉素(125μg/ml)和新霉素(500μg/ml)选择下，选择存活的克隆用于进一步扩增。
表达G1/S和G2/M传感器的稳定细胞系的成像
在标准组织培养条件下使表达细胞周期蛋白B1-EGFP和PSLD-JRed荧光融合蛋白的稳定U2OS细胞系在96孔板上的补加10％血清的McCoys培养基中生长。在2％低聚甲醛中固定细胞，用Hoechst染色，采用具有蓝色(Hoechst)、绿色(细胞周期蛋白B1-EGFP)和红色(PSLD-J Red)荧光的合适的激发和发射滤光器的IN CellAnalyzer 1000(GE Healthcare)成像。
实施例1
表达细胞周期蛋白B1-EGFP和PSLD-J Red的稳定细胞系的图像(图3)显示了细胞周期的不同阶段中细胞之间绿色和红色融合蛋白的差异表达和定位。每个细胞的细胞质和细胞核中绿色和红色荧光融合蛋白的存在与否的确定使得能够根据以下方案确定细胞周期位置：
| G1 | S | G2 | M | ||
| 细胞质 | 绿色 | - | - | + | + |
| 红色 | - | + | + | + | |
| 细胞核 | 绿色 | - | - | - | + |
| 红色 | + | - | - | + | |
涉及制备表达包含与至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件连接的第一可检测活细胞报道分子的多肽构建体的稳定细胞系(该构建体在哺乳动物细胞中的定位表明细胞周期位置)的实验细节描述于申请人的共同未决的美国临时专利申请US60/645,968，该申请的名称是“细胞周期阶段标志物”，在此全文引入其公开内容作为参考。
上述内容是说明本发明，不要理解为对它的限制。尽管已经描述了本发明的一些例证性的实施方案，但是本领域技术人员将很容易理解的是，例证性实施方案中不实质上背离本发明的新的教导和优点的许多修改是可能的。因此，所有的这些修改都被确定为包括在本发明的范围内，如权利要求中所定义的。所以要理解的是，上述内容是说明本发明，不要理解为被限定到所披露的特定实施方案，对所披露实施方案的修改以及其它实施方案都被确定为包括在所附权利要求的范围内。本发明通过下面的权利要求来限定，权利要求的等同方案被包括在其中。
序列表
SEQ ID NO：1
MDEDGSEGGP ALFQSDMTFK IFIDGEVNGQ KFTIVADGSS KFPHGDFNVH AVCETGKLPM 60
SWKPICHLIQ YGEPFFARYP NGISHFAQEC FPEGLSIDRT VRFENDGTMT SHHTYELDGT 120
CVVSRITVNC DGFQPDGPIM RDQLVDILPN ETHMFPHGPN AVRQLAFIGF TTADGGLMMG 180
HFDSKMTFNG SRAIKIPGPH FVTIITKQMR DTSDKRDHVC QREVTYAHSV PRITSAIGSD 240
EDSGLMYKGN GGNASSGAPP ADFPSPRKSS GDSGGPSTPS ASPLPVVTDH AMTNDVTWSE 300
ASSPDERTLT FAERWQLSSP DGVDTDDDLP KSRASKRTCG VNDDESPSKI FMVGESPQVS 360
SRLQNLRLNN LIPRQLFKPT DNQET 385
SEQ ID NO：2
ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60
ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 120
cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 180
gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 240
aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 300
gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 360
cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct 420
ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc 480
caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg 540
cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga 600
ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt 660
cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct 720
gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt 780
tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc 840
gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg 900
cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat 960
cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg 1020
gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg 1080
ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca 1140
atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct 1200
tttttgttag acgaagcttg gtaccgagct cgatatcgcc accatggacg aggatggttc 1260
agagggcggc cccgccctgt tccagagcga catgaccttc aaaatcttca tcgacggcga 1320
ggtgaacggc cagaagttca ccatcgtggc cgacggcagc agcaagttcc cccacggcga 1380
cttcaacgtg cacgccgtgt gcgagaccgg caagctgccc atgagctgga agcccatctg 1440
ccacctgatc cagtacggcg agcccttctt cgcccgctac cccaacggca tcagccactt 1500
cgcccaggag tgcttccccg agggcctgag catcgaccgc accgtgcgct tcgagaacga 1560
cggcaccatg accagccacc acacctacga gctggacggc acctgcgtgg tcagccgcat 1620
caccgtgaac tgcgacggct tccagcccga cggccccatc atgcgcgacc agctggtgga 1680
catcctgccc aacgagaccc acatgttccc ccacggcccc aacgccgtgc gccagctggc 1740
cttcatcggc ttcaccaccg ccgacggcgg cctgatgatg ggccacttcg acagcaagat 1800
gaccttcaac ggcagccgcg ccatcaagat ccccggcccc cacttcgtga ccatcatcac 1860
caagcagatg agggacacca gcgacaagcg cgaccacgtg tgccagcgcg aggtgaccta 1920
cgcccacagc gtgccccgca tcaccagcgc catcggtagc gacgaggatt ccggactcat 1980
gtacaagggc aatggcggca atgctagcag cggcgcacct ccagcagatt ttccgtcccc 2040
acggaagagc tctggagaca gtggaggacc cagcacaccg tcagcatctc cactccctgt 2100
agtcacagac cacgccatga caaatgatgt cacctggagc gaggcctctt cgcctgatga 2160
gaggacactc acctttgctg aaagatggca attatcttca cctgatggag tagatacaga 2220
tgatgattta ccaaaatcgc gagcatccaa aagaacctgt ggtgtgaatg atgatgaaag 2280
tccaagcaaa atttttatgg tgggagaatc tccacaagtg tcttccagac ttcagaattt 2340
gagactgaat aatttaattc ccaggcaact tttcaagccc accgataatc aagaaactta 2400
ggtcgacccg ggcggccgct tcgagcagac atgataagat acattgatga gtttggacaa 2460
accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 2520
ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt 2580
atgtttcagg ttcaggggga gatgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa 2640
tgtggtaaaa tccgataagg atcgatccgg gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 2700
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gacgcgccct gtagcggcgc 2760
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 2820
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 2880
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 2940
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 3000
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 3060
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 3120
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 3180
attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 3240
caccgcatac gcggatctgc gcagcaccat ggcctgaaat aacctctgaa agaggaactt 3300
ggttaggtac cttctgaggc ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg 3360
gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 3420
caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 3480
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 3540
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 3600
aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 3660
gcttttgcaa aaagcttgat tcttctgacg ctagcgatcg cccgggccac catgaaaaag 3720
cctgaactca ccgcgacgtc tgtcgagaag tttctgatcg aaaagttcga cagcgtctcc 3780
gacctgatgc agctctcgga gggcgaagaa tctcgtgctt tcagcttcga tgtaggaggg 3840
cgtggatatg tcctgcgggt aaatagctgc gccgatggtt tctacaaaga tcgttatgtt 3900
tatcggcact ttgcatcggc cgcgctcccg attccggaag tgcttgacat tggggaattc 3960
agcgagagcc tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg gtgtcacgtt gcaagacctg 4020
cctgaaaccg aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg aggccatgga tgcgatcgct 4080
gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa 4140
tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa 4200
actgtgatgg acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt 4260
tgggccgagg actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat 4320
gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg 4380
gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag 4440
cagcagacgc gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc gcggctccgg 4500
gcgtatatgc tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc 4560
gatgatgcag cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact 4620
gtcgggcgta cacaaatcgc ccgcagaagc gcggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa 4680
gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc agcactcgtc cgagggcaaa ggaatagctc 4740
gagtttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgatggc cgcaataaaa 4800
tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gcgataagga 4860
tccgcgtatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 4920
gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 4980
acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 5040
cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 5100
taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 5160
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 5220
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 5280
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 5340
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 5400
acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 5460
ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 5520
gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 5580
atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 5640
acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 5700
tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 5760
ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 5820
aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 5880
aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 5940
ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 6000
atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 6060
aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 6120
accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 6180
tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 6240
tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 6300
tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 6360
cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 6420
caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 6480
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 6540
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 6600
gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 6660
acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 6720
atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 6780
cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 6840
gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 6900
tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tggctcgaca gatct 6945
SEQ ID NO：3
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660
cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 840
gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900
ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960
cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020
aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtatcgcca ccatggacga 1080
ggatggttca gagggcggcc ccgccctgtt ccagagcgac atgaccttca aaatcttcat 1140
cgacggcgag gtgaacggcc agaagttcac catcgtggcc gacggcagca gcaagttccc 1200
ccacggcgac ttcaacgtgc acgccgtgtg cgagaccggc aagctgccca tgagctggaa 1260
gcccatctgc cacctgatcc agtacggcga gcccttcttc gcccgctacc ccaacggcat 1320
cagccacttc gcccaggagt gcttccccga gggcctgagc atcgaccgca ccgtgcgctt 1380
cgagaacgac ggcaccatga ccagccacca cacctacgag ctggacggca cctgcgtggt 1440
cagccgcatc accgtgaact gcgacggctt ccagcccgac ggccccatca tgcgcgacca 1500
gctggtggac atcctgccca acgagaccca catgttcccc cacggcccca acgccgtgcg 1560
ccagctggcc ttcatcggct tcaccaccgc cgacggcggc ctgatgatgg gccacttcga 1620
cagcaagatg accttcaacg gcagccgcgc catcaagatc cccggccccc acttcgtgac 1680
catcatcacc aagcagatga gggacaccag cgacaagcgc gaccacgtgt gccagcgcga 1740
ggtgacctac gcccacagcg tgccccgcat caccagcgcc atcggtagcg acgaggattc 1800
cggactcatg tacaagggca atggcggcaa tgctagcagc ggcgcacctc cagcagattt 1860
tccgtcccca cggaagagct ctggagacag tggaggaccc agcacaccgt cagcatctcc 1920
actccctgta gtcacagacc acgccatgac aaatgatgtc acctggagcg aggcctcttc 1980
gcctgatgag aggacactca cctttgctga aagatggcaa ttatcttcac ctgatggagt 2040
agatacagat gatgatttac caaaatcgcg agcatccaaa agaacctgtg gtgtgaatga 2100
tgatgaaagt ccaagcaaaa tttttatggt gggagaatct ccacaagtgt cttccagact 2160
tcagaatttg agactgaata atttaattcc caggcaactt ttcaagccca ccgataatca 2220
agaaacttag gtcgacccgg gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag 2280
tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat 2340
gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc 2400
attcatttta tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac 2460
ctctacaaat gtggtaaaat ccgataagga tcgatccggg ctggcgtaat agcgaagagg 2520
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg 2580
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 2640
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 2700
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 2760
gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 2820
atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 2880
ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 2940
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 3000
taacaaaata ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 3060
ggtatttcac accgcatacg cggatctgcg cagcaccatg gcctgaaata acctctgaaa 3120
gaggaacttg gttaggtacc ttctgaggcg gaaagaacca gctgtggaat gtgtgtcagt 3180
tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 3240
attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 3300
gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 3360
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 3420
cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 3480
gaggcctagg cttttgcaaa aagcttgatt cttctgacgc tagcgatcgc ccgggccacc 3540
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 3600
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 3660
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 3720
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 3780
ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 3840
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 3900
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 3960
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 4020
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 4080
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 4140
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 4200
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 4260
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 4320
cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 4380
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 4440
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 4500
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 4560
gaatagctcg agtttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgatggcc 4620
gcaataaaat atctttattt tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag 4680
cgataaggat ccgcgtatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 4740
gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg 4800
catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac 4860
cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta 4920
atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 4980
gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 5040
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 5100
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 5160
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 5220
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 5280
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 5340
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 5400
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 5460
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 5520
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 5580
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 5640
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 5700
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 5760
ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 5820
tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 5880
ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 5940
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ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 6060
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 6120
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 6180
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 6240
cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 6300
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 6360
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 6420
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 6480
aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 6540
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 6600
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 6660
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 6720
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat ggctcgacag atct 6774
Claims (11)
1.稳定的细胞系，其表达：
i)第一多肽构建体，其包含与至少一个细胞周期阶段依赖性定位控制元件连接的第一可检测的活细胞报道分子，所述构建体在哺乳动物细胞内的定位表明细胞周期位置；和
ii)第二多肽构建体，其包含与破坏控制元件连接的第二可检测的活细胞报道分子，其中所述第二报道分子可以在哺乳动物细胞中细胞周期的预定位置检测到，
其中所述第一和第二报道分子可以彼此区分，并且稳定的细胞系可以用于确定细胞周期位置。
2.权利要求1的稳定的细胞系，其中细胞周期阶段依赖性定位控制元件选自由Rag2、Chaf1B、Fen1、PPP1 R2、解旋酶B、sgk、CDC6或其中的基序组成的肽组，所述基序如解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)。
3.权利要求1或2的稳定的细胞系，其中破坏控制元件包括细胞周期蛋白B1 D-盒。
4.权利要求1-3的稳定的细胞系，其中第一和第二活细胞报道分子选自荧光蛋白和酶报道分子。
5.权利要求4的稳定的细胞系，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Emerald和J-Red。
6.前述任意一项权利要求的稳定的细胞系，其中所述第一报道分子是EGFP，第二报道分子是J-Red，或第一报道分子是J-Red，第二报道分子是EGFP。
7.前述任意一项权利要求的稳定的细胞系，其中第一多肽构建体包含与红色荧光蛋白(RFP)偶联的解旋酶B的C末端空间控制区的磷酸化依赖性亚细胞定位结构域(PSLD)，第二多肽构建体包含与绿色荧光蛋白(GFP)偶联的细胞周期蛋白B1的氨基末端的171个氨基酸，所述氨基酸在细胞周期蛋白B1启动子的控制下表达。
8.确定哺乳动物细胞的细胞周期位置的方法，所述方法包括：
a)培养权利要求1-7的稳定的细胞系；和
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置。
9.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：
a)培养权利要求1-7的稳定的细胞系；和
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置，其中不存在所述测试试剂和存在所述试剂的条件下测量到的发射的信号之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
10.确定测试试剂对哺乳动物细胞的细胞周期位置的影响的方法，所述方法包括：
a)培养权利要求1-7的稳定的细胞系；
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置；和
c)比较存在测试试剂的条件下发射的信号和不存在测试试剂的条件下发射的信号的已知值；
其中存在测试试剂的条件下测量的发射的信号和不存在测试试剂的条件下所述已知值之间的差异表明测试试剂对细胞的细胞周期位置的影响。
11.确定哺乳动物细胞周期对通过已知反应于测试试剂而改变的过程报道分子监测的细胞过程的影响的方法，所述方法包括：
a)培养权利要求1-7的稳定的细胞系；
b)通过监测第一和第二报道分子发射的信号确定细胞周期位置；和
c)监测由过程报道分子发射的信号，其中过程报道分子与第一和第二报道分子是可区分的；
其中通过步骤b)确定的细胞周期位置和由过程报道分子发射的信号之间的关系表明细胞过程是否是细胞周期依赖性的。
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