BR112020020919A2 - Receptor de antígeno quimérico específico para receptor de interleucina-23 - Google Patents

Abstract

"receptor de antígeno quimérico específico para receptor de interleucina-23". a presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (car) específico para um receptor de il-23 e a um ácido nucleico que codifica o mesmo. a presente invenção se refere adicionalmente a uma célula t que expressa o referido car, e ao uso da mesma para o tratamento de um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatória(o).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “RECEPTOR

DE ANTÍGENO QUIMÉRICO ESPECÍFICO PARA RECEPTOR DE INTERLEUCINA-23”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao campo da imunoterapia. Em particular, a presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para o receptor da interleucina-23, às células T que expressam o referido CAR e ao uso do mesmo para o tratamento de um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A interleucina-23 (IL-23), um membro da família das citocinas IL-12, é composta por duas subunidades, p19 e p40. O receptor para IL-23 (IL-23R) consiste em uma subunidade de IL-23Ra em complexo com uma subunidade IL- 12Rb1, que é uma subunidade comum para o receptor de IL-12 e interage com a tirosina quinase 2 (Tyk2). O IL-23R está associado constitutivamente com Janus Quinase 2 (JAK2) e associa-se com STAT3 e STAT4 após sua ativação por IL-23.

[003] O IL-23R é expressado principalmente em células imunológicas, em particular, células T (por exemplo, células T Th17 e gd), macrófagos, células dendríticas e células NK (Duvallet et al., 2011). Demonstrou-se recentemente que os neutrófilos não ativados expressam uma quantidade basal de IL-23R e que a expressão de IL-23R é aumentada após a ativação celular (Chen et al., 2016).

[004] A ativação de IL-23R por IL-23 induz a fosforilação de IL-23R, bem como o recrutamento de STAT3 e STAT4 formando homodímeros que, uma vez fosforilados, translocam para o núcleo e consequentemente induzem a expressão do fator de transcrição RORgt. RORgt, por sua vez, ativa a transcrição de citocinas pró-inflamatórias a jusante, tal como IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-6 e IFN-g, que estão envolvidas na ativação da resposta imunológica (Razawy et al., 2018, Sivanesan et al., 2016 e Duvallet et al., 2011). Em particular, a via de sinalização de IL-23/IL-23R foi descrita como crítica para promover a proliferação e a diferenciação de células imunológicas secretoras de IL-17, em particular células CD4+ Th17 e células T gd.

[005] Na técnica, a expressão de IL23R foi descrita como uma característica comum de células inflamatórias patogênicas envolvidas no aparecimento e na manutenção de doenças autoimunes e inflamação crônica. A expressão de IL23R na superfície é induzida pela exposição a IL23 e depende dos níveis de inflamação. Em células humanas, enquanto a expressão de IL23R em nível de RNA é bem documentada, pouco foi mostrado a respeito da presença da proteína na superfície celular e, portanto, quanto à sua disponibilidade para um agente direcionador.

[006] A inibição da via de sinalização de IL-23/IL-23R foi investigada como uma possível abordagem terapêutica para doenças ou distúrbios autoimunes e inflamatória(o)s. Em particular, o ustecinumab, um anticorpo direcionado à subunidade IL-12p40, foi testado com resultados bem sucedidos em pacientes não responsivos com doença de Crohn e em pacientes com psoríase (Fegan et al., 2016, Mease et al., 2015). O ustecinumab foi aprovado como tratamento para psoríase nos Estados Unidos. No entanto, um relato de caso revelou que a artrite psoriática havia piorado em 4 pacientes após o tratamento com ustecinumab (Simon et al., 2016).

[007] Além disso, para um tratamento de longo prazo de doenças ou distúrbios autoimunes e/ou inflamatória(o)s, é necessária a indução de tolerância, que pode não ser obtida quando se tem como alvo a citocina.

[008] Consequentemente, ainda existe a necessidade de um método para inibir a via de sinalização de IL-23/IL-23R, tratando assim doenças ou distúrbios autoimunes e/ou inflamatória(o)s, que não apresentem as desvantagens do método da técnica anterior.

[009] Nesse documento é fornecido um receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionado para IL-23R e uma população de células Treg que expressa o referido CAR de IL- 23R. A referida população de células Treg pode, em particular, ser usada para tratar doenças ou distúrbios relacionada(o)s com células que expressam IL-23R, em particular doenças ou distúrbios autoimunes e/ou inflamatória(o)s.

SUMÁRIO

[0010] A presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para pelo menos um receptor de IL-23 (IL-23R), em que o referido CAR compreende: (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga à referida IL-23R, (ii) opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, (iii) um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e, (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

[0011] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular compreende um fragmento scFv direcionado contra a referida IL-23R.

[0012] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular compreende um fragmento scFv direcionado contra a referida IL-23R, em que o referido scFv compreende - um domínio variável da cadeia pesada (VH) tendo a sequência de SEQ ID NO: 37 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 37 - um domínio variável da cadeia leve (VL) tendo uma sequência selecionada do grupo que compreende ou consistindo em SEQ ID NOs: 38, 46 e 56 e sequências com pelo menos cerca de 70% de identidade com a referida SEQ ID NO: 38, 46 ou 56, e - opcionalmente, um ligante entre o VH e o VL.

[0013] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular compreende um fragmento scFv direcionado contra a referida IL-23R, em que o scFv tem uma sequência SEQ ID NO: 55 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 55.

[0014] Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é uma região de dobradiça de CD8 de humano, de preferência, tendo a sequência de SEQ ID NO: 13 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 13.

[0015] Em uma modalidade, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar derivado do CD8a humano, de preferência, tendo a sequência de SEQ ID NO: 21 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 21.

[0016] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador de 4-1BB de humano, de preferência, tendo a sequência de SEQ ID NO: 29 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 29 e uma célula T primária sinalizando CD3 zeta de humano, de preferência, tendo a sequência de SEQ ID NO: 26 ou uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 26.

[0017] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende: (i) um scFv anti-IL-23R, de preferência, compreendendo um VH tendo a sequência de SEQ ID NO: 37 e um VL tendo a sequência de SEQ ID NO: 38, ligado por um ligante (G4S)3 (SEQ ID NO: 3), (ii) um domínio de dobradiça derivado de CD8a, de preferência SEQ ID NO: 13, (iii) um domínio transmembranar de CD8a humano, de preferência SEQ ID NO: 21, (iv) um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização de 4-1BB de humano, de preferência SEQ ID NO: 29 e um domínio zeta CD3 humano, de preferência SEQ ID NO: 26, e (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

[0018] A presente invenção se refere adicionalmente a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR, como descrito acima.

[0019] A presente invenção também se refere a um vetor que compreende a sequência de ácidos nucleicos como descrita acima.

[0020] A presente invenção se refere adicionalmente a uma população de células T, manipulada para expressar na superfície celular um CAR específico para pelo menos um receptor de IL-23, em que o referido CAR compreende: (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga ao referido IL-23R, (ii) opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, (iii) um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e, (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

[0021] Em uma modalidade, a referida população de células T é uma população de células T reguladoras.

[0022] Em uma modalidade, a referida população de células T é uma população de células Treg selecionada do grupo que compreende ou consiste em células Tr1, Treg CD4+CD25+Foxp3+, células Th3 secretoras de TGF-b, células NKT reguladoras, células T reguladoras gd, células T reguladoras CD8+ e células T reguladoras duplamente negativas.

[0023] A presente invenção se refere adicionalmente a uma composição que compreende pelo menos uma população de células T manipulada para expressar na superfície celular um CAR específico para pelo menos um receptor de IL-23, em que o referido CAR compreende: (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga ao referido IL-23R, (ii) opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, (iii) um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e, (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

[0024] Em uma modalidade, a referida composição é uma composição farmacêutica e compreende adicionalmente pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0025] A presente invenção se refere adicionalmente a um método ex vivo para obter uma população de células T projetada para expressar na superfície celular um CAR específico para pelo menos um receptor de IL-23, em que o referido CAR compreende: (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga ao referido pelo menos um IL-23R, (ii) opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, (iii) um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e, (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou sequência líder, em que o referido método compreende a modificação genética, de preferência, a transdução, de pelo menos uma célula T com um ácido nucleico que codifica um CAR de IL-23R e, opcionalmente, uma etapa de expansão das células transduzidas.

[0026] A presente invenção se refere adicionalmente a um método para tratar um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células que expressam IL-23R, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo pelo menos uma população de células T manipulada para expressar na superfície celular um CAR específico para pelo menos um receptor de IL-23, em que o referido CAR compreende: (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga ao referido pelo menos um IL-23R, (ii) opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, (iii) um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e, (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

[0027] A presente invenção se refere adicionalmente a uma população de células T como descrita nesse documento ou a uma composição como descrita nesse documento para o tratamento, ou para uso no tratamento, de um IL-23R que expressa doença ou distúrbio mediada(o) por células.

[0028] Em uma modalidade, o referido IL-23R que expressa doença ou distúrbio mediada(o) por células é um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a).

[0029] Em uma modalidade, o referido IL-23R que expressa doença ou distúrbio mediada(o) por células é selecionada do grupo que compreende ou consiste em doenças inflamatórias do intestino (tais como, por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica, espondilite anquilosante, diabetes tipo 1, distúrbios autoimunes da tireoide, esclerose múltipla, miastenia gravis, psoríase, artrite psoriática ou uveíte. Em uma modalidade, o referido IL-23R que expressa a doença mediada por células é um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a), de preferência a doença de Crohn.

DEFINIÇÕES

[0030] Na presente invenção, os seguintes termos têm os seguintes significados: - Os termos “um” e “uma” se referem a um(a) ou mais de um(a) (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[0031] - O termo “cerca de” quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, significa abranger variações de ±20% ou em alguns casos ±10%, ou em alguns casos ±5%, ou em alguns casos ±1%, ou em alguns casos ±0,1% do valor especificado, tais variações são apropriadas para executar os métodos divulgados.

[0032] - O termo “ativação”, como usado nesse documento, se refere ao estado de uma célula T (por exemplo, uma célula T reguladora) que foi suficientemente estimulada para induzir uma resposta celular detectável. A ativação também pode estar associada a função(ões) efetora(s) detectável(eis), tal como produção de citocina ou atividade supressora. O termo células T reguladoras “ativadas” se refere a, entre outras coisas, células T reguladoras que são capazes de suprimir uma resposta imunológica.

[0033] - O termo “anticorpo”, como usado nesse documento, se refere a uma proteína ou sequência polipeptídica derivada de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de cadeia simples ou múltipla, ou imunoglobulinas intactas e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. O termo “anticorpo” também inclui anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

Os anticorpos podem ser multímeros de moléculas de imunoglobulina, tais como tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. A unidade básica de anticorpo de quatro cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, chamados capa ([capa]) e lambda ([lambda]), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes (CL).

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas alfa ([alfa]), delta ([delta]), épsilon ([épsilon]), gama ([gama]) e mi ([mi]), respectivamente. As classes [gama] e [alfa] são adicionalmente divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores na sequência e na função CH, por exemplo, os humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas uma à outra por uma ou mais de ligações dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem no terminal N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias [alfa] e [gama] e quatro domínios CH para os isotipos [mi] e [épsilon]. Cada cadeia L tem no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Pensa-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O pareamento de um VH e um VL juntos forma um único sítio de ligação de antígeno. Um anticorpo IgM consiste em cinco das unidades básicas de heterotetrâmero juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J e, portanto, contém dez sítios de ligação de antígeno, enquanto anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes compreendendo 2-5 das 4 unidades de cadeia junto com a cadeia J. No caso de IgGs, as 4 unidades de cadeia é de geralmente cerca de 150.000 Daltons. Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71, e Capítulo 6.

[0034] - O termo “anticorpo monoclonal”, como usado nesse documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendidos na população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, um anticorpo monoclonal pode ser preparado pela metodologia de hibridoma primeiro descrita por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feito usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, animais ou vegetais eucarióticas (ver, por exemplo, Patente US N° 4.816.567). Um “anticorpo monoclonal” também pode ser isolado de bibliotecas de anticorpos de fago usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol.

Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo. Os anticorpos monoclonais incluem nesse documento anticorpos “quiméricos”.

[0035] - O termo “fragmento de anticorpo” se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo intacto, de preferência, a região de ligação de antígeno ou região variável do anticorpo intacto, que retém a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição espacial) um epítopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmentos Fv, fragmentos de anticorpo scFv, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único, tal como sdAb (ou VL ou VH), domínios VHH de camelídeos, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos, tal como um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça, e uma CDR isolada ou outros fragmentos de ligação de epítopo de um anticorpo. Um fragmento de ligação de antígeno também pode ser incorporado em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, nanocorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, um v-NAR e um bis-scFv (ver, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126 -1136, 2005). Os fragmentos de ligação de antígeno também podem ser enxertados em andaimes baseadas em polipeptídeos, tal como uma fibronectina do tipo III (ver Patente U.S. N°

6.703.199, que descreve minicorpos de polipeptídeo de fibronectina). A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab”, e um fragmento “Fc” residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com o domínio da região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1).

Cada fragmento Fab é monovalente no que se refere à ligação de antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação de antígeno. O tratamento de um anticorpo com pepsina produz um único fragmento F(ab’)2 grande que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto tendo atividade de ligação de antígeno divalente e ainda é capaz de reticular o antígeno. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab por terem alguns resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH é a designação nesse documento para Fab’ no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab’ que possuem cisteínas de dobradiça entre os mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[0036] - O fragmento “Fc” de um anticorpo compreende as porções carboxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, essa região também é a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

[0037] - “Fv” é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento e ligação de antígeno. Esse fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável da cadeia pesada e um da cadeia leve em associação estreita não covalente. A partir do dobramento desses dois domínios emanam seis enovelamentos hipervariáveis (três enovelamentos de cada uma da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação de antígeno e conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.

[0038] - O termo “scFv” se refere a uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis das cadeia leve e pesada são contíguamente ligadas, por exemplo, por meio de um ligante sintético, por exemplo, um ligante polipeptídico curto e flexível, e capaz de ser expressado como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual é derivado. A menos que especificado, como usado nesse documento, um scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, em relação às extremidades N- terminal e C-terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL-ligante-VH ou pode compreender VH-ligante-VL.

[0039] - Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende um sítio de ligação de antígeno, bem como um CL e pelo menos os domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequência de aminoácidos dos mesmos. Um polinucleotídeo de “sequência nativa” é aquele que tem a mesma sequência de nucleotídeos que um polinucleotídeo derivado da natureza. Um polipeptídeo de “sequência nativa” é aquele que tem a mesma sequência de aminoácidos que um polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) derivado da natureza (por exemplo, de qualquer espécie).

Esses polinucleotídeos e polipeptídeos de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos.

[0040] O termo “cadeia pesada do anticorpo” se refere ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural e que normalmente determina a classe à qual o anticorpo pertence.

[0041] - O termo “cadeia leve de anticorpo” se refere ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural. As cadeias leves capa (K) e lambda (λ) se referem aos dois principais isotipos da cadeia leve do anticorpo.

[0042] - O termo “antígeno” ou “Ag” se refere a uma molécula que provoca uma resposta imunológica. Essa resposta imunológica pode envolver a produção de anticorpos e/ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambas. O técnico habilitado entenderá que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente toda(o)s a(o)s proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno.

Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Um técnico habilitado na técnica entenderá que qualquer DNA, que compreende uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos parcial que codifica uma proteína que provoca uma resposta imunológica, portanto, codifica um “antígeno” como esse termo é usado nesse documento. Além disso, um técnico habilitado entenderá que um antígeno não precisa necessariamente ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeos de comprimento total de um gene. É prontamente evidente que a presente invenção inclui o, mas não está limitada ao, uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são arranjadas em várias combinações para codificar polipeptídeos que provocam a resposta imunológica desejada. Além disso, uma pessoa habilitada na técnica entenderá que um antígeno não precisa necessariamente ser codificado por um “gene”. É facilmente evidente que um antígeno pode ser sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica, ou pode ser macromolécula além de um polipeptídeo. Essa amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a, uma amostra de tecido, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.

[0043] - O termo “adnectina”, também conhecido como monocorpo, é bem conhecido na técnica e se refere a proteínas projetadas para se ligarem com alta afinidade e especificidade a antígenos. Eles pertencem à classe de moléculas chamadas coletivamente de “miméticos de anticorpos”.

[0044] - O termo “alfabeto”, como usado nesse documento, que também pode ser referido como Alfabetos de Penetração Celular, se refere a um tipo de mimético de anticorpo que consiste em pequenas proteínas de 10 kda manipuladas para se ligarem a uma variedade de antígenos. Os alfabetos são capazes de alcançar e se ligar a alvos de proteína intracelular.

[0045] - O termo “affibody” é bem conhecido na técnica e se refere a proteínas de afinidade com base em um domínio de proteína de resíduo de 58 aminoácidos, derivado de um do domínio de ligação de IgG da proteína estafilocócica A.

[0046] - O termo “afilina” é bem conhecido na técnica e se refere a proteínas artificiais manipuladas para se ligarem seletivamente a antígenos. Eles se assemelham aos anticorpos em sua afinidade e especificidade aos antígenos, mas não na estrutura, o que os torna um tipo de mimético de anticorpos.

[0047] - O termo “anticalina” é bem conhecido na técnica e se refere a uma tecnologia de mimético de anticorpo, em que a especificidade de ligação é derivada de lipocalinas.

As anticalinas também podem ser formatadas como proteínas de duplo direcionamento, chamadas Duocalinas.

[0048] - O termo “andaime com base em proteína de repetição de tatu”, como usado nesse documento, se refere a um tipo de miméticos de anticorpos que correspondem a andaimes artificiais de ligação de peptídeos com base em proteínas de repetição de tatu. As proteínas de repetição de tatu são caracterizadas por um domínio de tatu, composto por repetições de tatu em tandem de aproximadamente 42 aminoácidos, que medeiam interações com peptídeos ou proteínas.

[0049] - O termo “atrímero” é bem conhecido na técnica e se refere a moléculas de ligação para proteínas alvo que trimerizam como um pré-requisito para sua atividade biológica. Eles são relativamente grandes em comparação com outras estruturas miméticas de anticorpos.

[0050] - O termo “avímero” é bem conhecido na técnica e se refere a uma tecnologia de mimético de anticorpo

[0051] - O termo “DARPins” (proteínas de repetição de anquirina manipuladas) é bem conhecido na técnica e se refere a uma tecnologia de DRP (proteína de repetição manipulada) mimética de anticorpo desenvolvida para explorar as capacidades de ligação de polipeptídeos que não são de anticorpos.

[0052] - O termo “diacorpo” se refere a pequenos fragmentos de anticorpo preparados pela construção de fragmentos scFv com ligantes curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL, de modo que o pareamento intercadeia, mas não intracadeia dos domínios V seja alcançado, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento tendo dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos scFv “cruzados” nos quais os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os diacorpos são descritos mais detalhadamente, por exemplo, em EP 0404097; WO 93/11161; e Holliger et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993).

[0053] - O termo “evasinas” é bem conhecido na técnica e se refere a uma classe de proteínas de ligação de quimiocinas.

[0054] - O termo “fynomer” é bem conhecido na técnica e se refere a proteínas que pertencem à classe de miméticos de anticorpos. Eles são moléculas de ligação atraentes devido à sua alta estabilidade térmica e imunogenicidade reduzida.

[0055] - O termo “knottin” (que também pode ser referido como nó de cistina inibidor), como usado nesse documento, se refere a um mimético de anticorpo compreendendo um motivo estrutural de proteína contendo três pontes dissulfeto.

[0056] - O termo “peptídeo de domínio kunitz” se refere a um tipo de mimético de anticorpo e é baseado nos domínios ativos de proteínas que inibem a função de proteases.

[0057] - O termo “nanocorpo” é bem conhecido na técnica e se refere a uma proteína terapêutica derivada de anticorpo que contém as propriedades estruturais e funcionais únicas de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. Esses anticorpos da cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3).

[0058] - O termo “unicorpo” é bem conhecido na técnica e se refere a um fragmento de anticorpo sem a região de dobradiça de anticorpos IgG4. A eliminação da região de dobradiça resulta em uma molécula que tem essencialmente metade do tamanho dos anticorpos IgG4 tradicionais e tem uma região de ligação univalente em vez da região bivalente de ligação dos anticorpos IgG4.

[0059] - O termo “versacorpos” é bem conhecido na técnica e se refere a outra tecnologia de mimético de anticorpo. São pequenas proteínas de 3-5 kda com >15% de cisteínas, que formam um andaime de alta densidade de dissulfeto, substituindo o núcleo hidrofóbico que as proteínas típicas possuem.

[0060] - O termo “célula apresentadora de antígeno” ou “APC” se refere a uma célula do sistema imunológico, tal como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica e semelhantes) que exibe um antígeno estranho complexado com os principais complexos de histocompatibilidade (MHC) em sua superfície. As células T podem reconhecer esses complexos usando seus receptores de células T (TCRs). APCs processam antígenos e os apresentam às células T.

[0061] - O termo “alogênico” se refere a qualquer material derivado de um indivíduo diferente da mesma espécie que o indivíduo a quem o material é introduzido. Dois ou mais indivíduos são considerados alogênicos um ao outro quando os genes em um ou mais de locais não são idênticos.

Em alguns aspectos, o material alogênico de indivíduos da mesma espécie pode ser suficientemente diferente geneticamente para interagir antigenicamente.

[0062] - O termo “autólogo” se refere a qualquer material derivado do mesmo indivíduo a quem será posteriormente reintroduzido.

[0063] - O termo “receptor quimérico ou receptor de antígeno quimérico ou CR ou CAR” se refere a um polipeptídeo ou a um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando em uma célula imune, fornece à célula especificidade para um ligando alvo e com geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos é contíguo entre si. Em algumas modalidades, o receptor quimérico é uma proteína de fusão quimérica que compreende o conjunto de polipeptídeos. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos inclui um comutador de dimerização que, mediante a presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos uns aos outros, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação de ligando a um domínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende uma sequência líder opcional no terminal amino (N-ter) da proteína de fusão do receptor quimérico. Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende adicionalmente uma sequência líder no terminal N do domínio de ligação do ligando extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação do ligante durante o processamento celular e a localização do receptor quimérico na membrana celular.

[0064] O termo “modificações de sequência conservadora” se refere a modificações de aminoácidos que não afetam significativamente ou alteram a função biológica da proteína que contém a sequência de aminoácidos.

Essas modificações conservadoras incluem substituições, adições e eliminações de aminoácidos.

As modificações podem ser introduzidas em uma proteína por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediada por

PCR.

As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares, de modo que um habilitado na técnica da química de peptídeos esperaria que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo fossem substancialmente inalteradas.

As substituições de aminoácidos são geralmente, portanto,

baseadas na similaridade relativa dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e semelhantes.

Substituições exemplificativas que levam em consideração várias das características anteriores são bem conhecidas dos habilitados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

As substituições de aminoácidos podem adicionalmente ser feitas com base na similaridade na polaridade, carga, solubilidade,

hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos.

Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e os aminoácidos com grupos de cabeça polar sem carga tendo valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

Outros grupos de aminoácidos que podem representar alterações conservadoras incluem: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr, trp, his. Outras famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica.

Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais de resíduos de aminoácidos dentro de um receptor quimérico da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o receptor quimérico alterado pode ser testado usando os ensaios funcionais descritos nesse documento.

[0065] - O termo promotor “constitutivo” se refere a uma sequência de nucleotídeos que, quando operacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto gênico, faz com que o produto gênico seja produzido em uma célula sob a maioria ou todas as condições fisiológicas da célula.

[0066] - O termo uma “molécula coestimuladora” se refere a um parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente a um ligando coestimulador, mediando assim uma resposta coestimuladora pela célula T, tal como, mas não se limitando a, proliferação. As moléculas coestimuladoras são moléculas da superfície celular que não os receptores de antígenos ou seus ligandos que contribuem para uma resposta imunológica eficiente. Um domínio de sinalização coestimulador pode ser a porção intracelular de uma molécula coestimuladora. Uma molécula coestimuladora pode ser representada nas seguintes famílias de proteínas: proteínas receptoras de TNF, proteínas semelhantes a imunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de ativação linfocítica sinalizadoras (proteínas SLAM) e receptores de células NK ativadores.

[0067] - O termo “derivado de”, como usado nesse documento, indica uma relação entre uma primeira e uma segunda molécula. Geralmente se refere à similaridade estrutural entre a primeira molécula e uma segunda molécula e não conota ou inclui um processo ou limitação de fonte em uma primeira molécula que é derivada de uma segunda molécula.

Por exemplo, no caso de um domínio de sinalização intracelular que é derivado de uma molécula CD3 zeta, o domínio de sinalização intracelular retém estrutura CD3 zeta suficiente de modo que tenha a função necessária, ou seja, a capacidade de gerar um sinal sob as condições apropriadas.

Não conota ou inclui uma limitação a um determinado processo de produção do domínio de sinalização intracelular, por exemplo, não significa que, para fornecer o domínio de sinalização intracelular, deve-se começar com uma sequência zeta de CD3 e excluir a sequência indesejada ou impor mutações, para chegar ao domínio de sinalização intracelular.

[0068] - O termo “codificação” se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como moldes para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo um sequência de nucleotídeos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes das mesmas. Assim, um gene, cDNA ou

RNA, codifica uma proteína se a transcrição e a tradução do mRNA correspondente a esse gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é usualmente fornecida em listagens de sequências, quanto a fita não codificadora, usada como molde para a transcrição de um gene ou cDNA, pode ser referida como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.

A menos que especificado de outra forma, uma “sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos” inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. A expressão “sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA” também pode incluir íntrons na medida em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode, em alguma versão, conter um ou mais íntron(s).

[0069] - O termo “endógeno” se refere a qualquer material de ou produzido dentro de um(a) organismo, célula, tecido ou sistema.

[0070] - O termo “manipulado” ou “modificado” se refere a uma célula que foi transfectada, transformada ou transduzida.

[0071] - O termo “exógeno” se refere a qualquer material introduzido ou produzido fora de um(a) organismo, célula, tecido ou sistema.

[0072] - O termo “expressão” se refere à transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos específica conduzida por um promotor.

[0073] - O termo “vetor de expressão” se refere a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende sequências de controle de expressão operativamente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressada. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[0074] - O termo “homologia” ou “identidade” se refere à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de polipeptídeo. Quando uma posição de subunidade em ambas as duas moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então elas são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero de dez subunidades de comprimento) das posições em duas sequências são homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90%

das posições (por exemplo, 9 de 10) são correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas.

Assim, o termo “homólogo” ou “idêntico”, quando usado em uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos ou de duas ou mais moléculas de ácido nucleico, se refere ao grau de relação de sequência entre polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico, como determinado pelo número de correspondências entre sequências de dois ou mais resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos. “Identidade” mede a porcentagem de correspondências idênticas entre as menores de duas ou mais sequências com alinhamentos de lacunas (se houver) endereçadas por um modelo matemático específico ou programa de computador (isto é, “algoritmos”). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos.

Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Computational Molecular

Biology, Lesk, A.

M., ed., Oxford University Press, Nova

Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects,

Smith, D.

W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993;

Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.

M.,

e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.

e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos de determinação da identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. MoI. Biol.

215, 403-410 (1990)). O programa BLASTX está disponível publicamente no National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., Supra). O conhecido algoritmo Smith Waterman também pode ser usado para determinar a identidade.

[0075] - Os termos formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de murinos) se referem a imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de ligação de antígeno de anticorpos)

que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana.

Na maior parte, os anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpos dos mesmos são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor ou fragmento de anticorpo) em que os resíduos de uma região determinante complementar (CDR)

do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo,

rato ou coelho tendo a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas.

Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes.

Além disso, um anticorpo/fragmento de anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou nas sequências estruturais.

Essas modificações podem adicionalmente refinar e otimizar o desempenho do anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Em geral,

o anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado do mesmo compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínio(s) variável(eis), em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas as, ou uma significativa porção das, regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana.

O anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr.

Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

[0076] - Como usado nesse documento, “RNA transcrito in vitro” se refere a RNA, de preferência mRNA, que foi sintetizado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitro é gerado a partir de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro compreende um molde que é usado para gerar o RNA transcrito in vitro.

[0077] - O termo promotor “indutível” se refere a uma sequência de nucleotídeos que, quando operacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto gênico, faz com que o produto gênico seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.

[0078] - Como usado nesse documento, uma “capa 5’” (também denominada uma capa de RNA, uma capa de RNA 7- metilguanosina ou uma capa de RNA m7G) é um nucleotídeo guanina modificado que foi adicionado à “frente” ou na extremidade 5’ de um RNA mensageiro eucariótico logo após o início da transcrição. A capa 5’ consiste assim em um grupo terminal que está ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito.

Sua presença é crítica para o reconhecimento pelo ribossomo e a proteção contra RNases. A adição da capa é acoplada à transcrição e ocorre co-transcricionalmente, de modo que cada um influencia o outro. Logo após o início da transcrição, a extremidade 5’ do mRNA sendo sintetizado é ligada por um complexo sintetizador de capa associado à RNA polimerase. Esse complexo enzimático catalisa as reações químicas que são necessárias para o capeamento do mRNA. A síntese ocorre como uma reação bioquímica de várias etapas.

A porção de capeamento pode ser modificada para modular a funcionalidade do mRNA, tal como sua estabilidade ou eficiência de tradução.

[0079] - No contexto da presente invenção, são usadas as seguintes abreviações para as bases de ácido nucleico de ocorrência comum. “A” se refere a adenina, “C” se refere a citosina, “G” se refere a guanina, “T” se refere a timina e “U” se refere a uracila.

[0080] - O termo “material de instrução” inclui uma publicação, uma gravação, um diagrama ou qualquer outro meio de expressão que pode ser usado para comunicar a utilidade das composições e métodos da invenção. O material de instrução do kit da invenção pode, por exemplo, ser afixado a um recipiente que contém a célula da invenção ou ser enviado junto com um recipiente que contém a célula da invenção. Alternativamente, o material de instrução pode ser enviado separadamente do recipiente com a intenção de que a célula de material de instrução seja usada cooperativamente pelo receptor.

[0081] - O termo “domínio de sinalização intracelular”, como usado nesse documento, se refere a uma porção intracelular de uma molécula. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imune da célula contendo o receptor quimérico. Exemplos de função efetora imune em uma célula T do receptor quimérico podem incluir atividade citolítica, atividade supressora, atividade reguladora e atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas.

[0082] - O termo “isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é “isolado”, mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes em seu estado natural é “isolado”. Um ácido nucleico ou peptídeo isolado pode existir em forma substancialmente purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospedeira. Tipicamente, uma preparação de ácido nucleico ou peptídeo isolado contém o ácido nucleico ou peptídeo pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 85% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, mais de 95% puro, maior do que cerca de 96% puro, maior do que cerca de 97% puro, maior do que cerca de

98% puro ou maior do que cerca de 99% puro. Um “ácido nucleico isolado” é um ácido nucleico que é substancialmente separado de outras sequências de DNA do genoma, bem como proteínas ou complexos, tais como ribossomos e polimerases, que acompanham naturalmente uma sequência nativa. O termo abrange uma sequência de ácidos nucleicos que foi removida de seu ambiente de ocorrência natural e inclui isolados de DNA recombinante ou clonado e análogos sintetizados quimicamente ou análogos sintetizados biologicamente por sistemas heterólogos. Um “polipeptídeo isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural.

[0083] - O termo “lentivírus” se refere a um gênero da família Retroviridae. Os lentivírus são únicos entre os retrovírus por serem capazes de infectar células que não se dividem; eles podem dispensar uma quantidade significativa de informação genética no DNA da célula hospedeira, portanto, são um dos métodos mais eficientes de um vetor de dispensação de genes. HIV, SIV e FIV são exemplos de lentivírus.

[0084] - O termo “vetor lentiviral” se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo especialmente um vetor lentiviral auto-inativador como fornecido em Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus que podem ser usados na clínica incluem a, mas não estão limitados à,

tecnologia de dispensação de genes LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetores LENTIMAX™ da Lentigen e semelhantes. Tipos não clínicos de vetores lentivirais também estão disponíveis e seriam conhecidos por um habilitado na técnica.

[0085] - O termo “ligando” se refere a um membro de um par ligando/receptor e se liga ao outro membro do par.

[0086] - O termo “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo” se refere a um polímero de nucleotídeos covalentemente ligados por ligações fosfodiéster, tais como, ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA), na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácidos nucleicos particular também engloba implicitamente variantes modificadas de forma conservadora (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições degeneradas de códons podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais de códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxinossina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol.

Chem. 260: 2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Célula.

Probes 8: 91-98 (1994)).

[0087] - O termo “operativamente ligado” ou “controle transcricional” se refere à ligação funcional entre uma sequência reguladora e uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, resultando na expressão dessa última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. As sequências de DNA operacionalmente ligadas podem ser contíguas entre si e, por exemplo, quando necessárias para unir duas regiões de codificação de proteínas, estão na mesma fase de leitura.

[0088] - Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” são usados indistintamente e se referem a um composto compreendido de resíduos de aminoácidos covalentemente ligados por ligações peptídicas. Um(a) proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender uma sequência de proteínas ou peptídeos. Os polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas. Como usado nesse documento, o termo se refere a ambas as cadeias curtas, que também são comumente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e a cadeias mais longas, que geralmente são referidas na técnica como proteínas, das quais são muitos tipos. “Polipeptídeos” incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação dos mesmos.

[0089] - O termo “excipiente farmaceuticamente aceitável” ou “carreador farmaceuticamente aceitável” se refere a um excipiente que não produz uma reação adversa, alérgica ou outra reação desagradável quando administrado a um animal, de preferência um humano. Inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e similares. Para administração humana, as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, como exigido pelos órgãos reguladores, tais como, por exemplo, o Escritório da FDA ou EMA.

[0090] - O termo “poli(A)” se refere a uma série de adenosinas monofosfato anexada a mRNA. Em uma modalidade de uma construção para expressão transiente, o poliA está entre 50 e 5000 adenosinas monofosfato, de preferência, maior ou igual a 64, mais de preferência maior ou igual a 100, mais de preferência maior ou igual a 300 ou 400 adenosinas monofosfato. As sequências de poli(A) podem ser modificadas quimicamente ou enzimaticamente para modular a funcionalidade de mRNA, tal como localização, estabilidade ou eficiência da tradução.

[0091] - O termo “poliadenilação” se refere à ligação covalente de uma fração poliadenilila, ou sua variante modificada, a uma molécula de RNA mensageiro. Em organismos eucarióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) são poliadeniladas na extremidade 3’. A cauda poli(A) 3’ é uma longa sequência de nucleotídeos adenina (frequentemente várias centenas) adicionados ao pré-mRNA por meio da ação de uma enzima, poliadenilato polimerase. Em eucariotos superiores, a cauda poli(A) é adicionada aos transcritos que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadenilação. A cauda poli(A) e a proteína ligada a ela auxiliam na proteção do mRNA da degradação por exonucleases.

A poliadenilação também é importante para a terminação da transcrição, exportação do mRNA do núcleo e tradução. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição do DNA em RNA, mas também pode ocorrer posteriormente no citoplasma. Após o término da transcrição, a cadeia de mRNA é clivada pela ação de um complexo de endonuclease associado à RNA polimerase. O sítio de clivagem é usualmente caracterizado pela presença da sequência de bases AAUAAA próximo ao sítio de clivagem. Após o mRNA ter sido clivado, os resíduos de adenosina são adicionados à extremidade 3’ livre no sítio de clivagem.

[0092] - O termo “promotor” se refere a uma sequência de DNA reconhecida pelo mecanismo sintético da célula, ou mecanismo sintético introduzido, necessário para iniciar a transcrição específica de uma sequência de polinucleotídeos.

[0093] - O termo “sequência promotora/reguladora” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que é necessária para a expressão de um produto gênico operacionalmente ligado à sequência promotora/reguladora. Em alguns casos, essa sequência pode ser a sequência promotora de núcleo e, em outros casos, essa sequência também pode incluir uma sequência intensificadora e outros elementos reguladores que são necessários para a expressão do produto gênico. A sequência promotora/reguladora pode, por exemplo, ser uma que expressa o produto gênico de uma maneira específica do tecido.

[0094] - O termo “proteína ou peptídeo recombinante” se refere a um(a) proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo) que é gerado(a) usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um(a) proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo) expressado(a) por um bacteriófago ou sistema de expressão de levedura. O termo também deve ser interpretado como significando um(a) proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo) que foi gerado(a) pela síntese de uma molécula de DNA que codifica a(o) proteína ou peptídeo (por exemplo, o anticorpo) e cuja molécula de DNA expressa um(a) proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo), ou uma sequência de aminoácidos especificando a(o) proteína ou peptídeo (por exemplo, o anticorpo), em que o DNA ou a sequência de aminoácidos foi obtido(a) usando DNA recombinante ou tecnologia de sequência de aminoácidos que está disponível e é bem conhecido(a) na técnica.

[0095] - O termo “domínio de sinalização” se refere à porção funcional de uma proteína que atua transmitindo informações dentro da célula para regular a atividade celular por meio de vias de sinalização definidas, gerando segundos mensageiros ou funcionando como efetores, respondendo a tais mensageiros.

[0096] - O termo “via de transdução de sinal” se refere à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula.

[0097] - O termo “se liga especificamente” se refere a um anticorpo, ou um ligando, que reconhece e se liga a um parceiro de ligação presente em uma amostra, mas cujo anticorpo ou ligando não reconhece ou se liga a substancialmente outras moléculas na amostra.

[0098] - O termo “estimulação” se refere a uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimuladora (por exemplo, um complexo TCR/CD3 ou receptor quimérico) com seu ligando cognato, mediando assim um evento de transdução de sinal, tal como, mas não limitado a, sinal transdução via complexo TCR/CD3 ou transdução de sinal via domínios de sinalização do receptor quimérico. A estimulação pode mediar a expressão alterada de certas moléculas.

[0099] - O termo “molécula estimuladora” se refere a uma molécula expressada por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK, célula B) que fornece a(s) sequência(s) de sinalização citoplasmática que regulam a ativação da célula imune de forma estimulante para pelo menos algum aspecto da via de sinalização de células imunológicas. Em um aspecto, o sinal é um sinal primário que é iniciado, por exemplo, pela ligação de um complexo TCR/CD3 com uma molécula

MHC carregada com peptídeo, e que leva à mediação de uma resposta de células T, incluindo, mas não se limitando a, proliferação, ativação, diferenciação e semelhantes. Uma sequência de sinalização citoplasmática primária (também referida como um “domínio de sinalização primário”) que atua de uma maneira estimuladora pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação com base em imunorreceptor tirosina ou ITAM.

[00100] - O termo “indivíduo” se destina a incluir organismos vivos nos quais uma resposta imunológica pode ser induzida (por exemplo, mamíferos, humanos). Em uma modalidade, um indivíduo pode ser um “paciente”, isto é, um animal de sangue quente, mais de preferência um humano, que está aguardando o recebimento de, ou está recebendo, cuidados médicos ou foi/é/será o objeto de um procedimento médico, ou é monitorado para o desenvolvimento da doença ou condição de alvo, tal como, por exemplo, uma condição inflamatória ou autoimune. Em uma modalidade, o indivíduo é um adulto (por exemplo, um indivíduo com mais de 18 anos). Em outra modalidade, o indivíduo é uma criança (por exemplo, um indivíduo com menos de 18 anos). Em uma modalidade, o indivíduo é um homem. Em outra modalidade, o indivíduo é uma mulher. Em uma modalidade, o indivíduo é afetado, de preferência é diagnosticado, com um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a), tal como, por exemplo, uma doença autoimune mediada por autoanticorpos. Em uma modalidade, o indivíduo está em risco de desenvolver um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a), tal como, por exemplo, uma doença autoimune mediada por autoanticorpos. Exemplos de fatores de risco incluem, mas não estão limitados à, predisposição genética ou histórico familiar de um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a).

[00101] - O termo “célula substancialmente purificada” se refere a uma célula que é essencialmente livre de outros tipos de células. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos de células com os quais está normalmente associada no seu estado de ocorrência natural. Em uma modalidade, uma célula substancialmente purificada se refere a uma célula que está pelo menos cerca de 75% livre, 80% livre ou 85% livre e, de preferência, cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % livre, de outros tipos de células com os quais está normalmente associado em seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas se refere a uma população homogênea de células. Em uma modalidade, uma população de células substancialmente purificadas se refere a uma população de células pelo menos cerca de 75% homogênea, 80% homogênea ou 85% homogênea, e de preferência cerca de 90%,

95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% homogênea. Em outros casos, esse termo se refere simplesmente a células que foram separadas das células com as quais estão naturalmente associadas em seu estado natural. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em outros aspectos, as células não são cultivadas in vitro.

[00102] - Os termos “quantidade terapeuticamente eficaz” se referem a uma quantidade de células que expressam um CAR, como descrito nesse documento, eficaz para ter como alvo um determinado resultado biológico. Assim, os termos “quantidade terapeuticamente eficaz” significam um(a) nível ou quantidade de agente que se destina, sem causar efeitos colaterais negativos ou adversos significativos, ao alvo, (1) retardar ou prevenir o início da doença ou condição alvo; (2) desacelerar ou interromper a(o) progressão, agravamento ou deterioração de um ou mais de sintomas da doença ou condição alvo; (3) provocar melhorias nos sintomas da doença ou condição alvo; (4) reduzir a gravidade ou incidência da doença ou condição alvo; ou (5) curar a doença ou condição alvo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada antes do início da doença ou condição alvo, para uma ação profilática ou preventiva. Alternativamente, ou adicionalmente, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada após o início da doença ou condição alvo, para uma ação terapêutica.

[00103] - O termo “transfectado” ou “transformado” ou “transduzido” se refere a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula “transfectada” ou “transformada” ou “transduzida” é aquela que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula principal e sua progênie.

[00104] - O termo “vetor de transferência” se refere a uma composição de matéria que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usada para dispensar o ácido nucleico isolado ao interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo “vetor de transferência” inclui um plasmídeo de replicação autônoma ou um vírus. O termo também deve ser interpretado para incluir adicionalmente compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para as células, tais como, por exemplo, um composto de polilisina, lipossoma e semelhantes. Exemplos de vetores de transferência viral incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores retrovirais, vetores lentivirais e semelhantes.

[00105] - Como usado nesse documento, “transitório”

se refere à expressão de um transgene não integrado por um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo de expressão é menor do que o período de tempo para a expressão do gene se integrado no genoma ou contido em um replicon plasmídeo estável na célula hospedeira.

[00106] - Como usado nesse documento, os termos “tratar”, “tratamento” e “tratando” se referem à redução ou melhoria da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença ou condição de alvo, por exemplo, uma condição autoimune ou a melhoria de um ou mais de sintomas (de preferência, um ou mais de sintomas discerníveis) de uma doença ou condição de alvo, por exemplo, uma condição autoimune, em que a referida melhoria resulta da administração de uma ou mais de terapias (por exemplo, um ou mais de agentes terapêuticos, tal como uma célula Treg da invenção). Em modalidades específicas, os termos “tratar”, “tratamento” e “tratando” se referem à melhoria de pelo menos um parâmetro físico mensurável de uma doença ou condição de alvo, por exemplo, um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a). Em outras modalidades, os termos “tratar”, “tratamento” e “tratando” se referem à inibição da progressão de uma doença ou condição de alvo, por exemplo, um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a), fisicamente por, por exemplo, estabilização de um sintoma discernível, fisiologicamente por, por exemplo, estabilização de um parâmetro físico, ou ambos. Em outras modalidades, os termos “tratar”, “tratamento” e “tratando” se referem à redução ou melhoria da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença ou condição de alvo, por exemplo, um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a), ou a melhora de um ou mais de sintomas de uma doença ou condição de alvo, por exemplo, um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a).

“Tratar” ou “tratamento” se refere a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas; em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) a doença ou condição de alvo.

Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm a doença, bem como aqueles propensos a ter a doença ou aqueles nos quais a condição deve ser evitada. Um indivíduo é “tratado” com sucesso para uma doença ou condição se, após receber uma quantidade terapêutica de uma população de células compreendendo um receptor quimérico de acordo com a presente invenção, o indivíduo mostra melhora observável e/ou mensurável em um ou mais dos seguintes: redução do número de células patogênicas; redução na porcentagem do total de células que são patogênicas; alívio até certo ponto de um ou mais dos sintomas associados à condição específica; morbidade e mortalidade reduzidas e/ou melhoria nas questões de qualidade de vida. Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e a melhora da condição são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico.

[00107] - O termo “célula Treg” se refere a uma célula capaz de suprimir, inibir ou prevenir respostas inflamatórias excessivas ou indesejadas, tais como, por exemplo, autoimunidade ou reações alérgicas. Em uma modalidade, a população de células Treg da invenção é capaz de atividade supressora. Em uma modalidade, a referida atividade supressora é independente de contato. Em outra modalidade, a referida atividade supressora é dependente do contato. Em uma modalidade, a população de células Treg da invenção apresenta uma ação supressora nas células T efetoras, de preferência, a referida ação supressora é dependente da expressão e/ou ativação de TCR.

[00108] - O termo polinucleotídeo “variante”, como usado nesse documento, é um polinucleotídeo que tipicamente difere de um polinucleotídeo especificamente divulgado nesse documento em uma ou mais de substituições, eliminações, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ocorrer naturalmente ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, modificando uma ou mais das sequências de polinucleotídeos da invenção e avaliando uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo codificado como descrito nesse documento e/ou usando qualquer uma de uma série de tecnologias bem conhecidas na técnica.

Consequentemente, o termo “variante de polipeptídeo”, como usado nesse documento, é um polipeptídeo que tipicamente difere de um polipeptídeo especificamente divulgado nesse documento em uma ou mais de substituições, eliminações, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ser de ocorrência natural ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, modificando uma ou mais das sequências de polipeptídeos acima e avaliando uma ou mais de atividades biológicas do polipeptídeo como descrito nesse documento e/ou usando qualquer uma de uma série de tecnologias bem conhecidas na técnica. As modificações podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção e ainda obter uma molécula funcional que codifica uma variante ou um polipeptídeo derivado com características desejáveis. Quando se deseja alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo para criar um equivalente, ou mesmo uma variante ou porção melhorada de um polipeptídeo da invenção, um habilitada na técnica irá tipicamente alterar um ou mais dos códons da sequência de DNA de codificação.

Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável de sua capacidade de se ligar a outros polipeptídeos (por exemplo, antígenos) ou células. Uma vez que é a capacidade de ligação e a natureza de uma proteína que define a atividade biológica funcional dessa proteína, certas substituições de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteína e, claro, em sua sequência de codificação de DNA subjacente e, no entanto, obter uma proteína com propriedades similares. É assim contemplado que várias mudanças podem ser feitas nas sequências de peptídeos da presente invenção, ou sequências de DNA correspondentes que codificam os referidos peptídeos sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica.

Em muitos casos, uma variante de polipeptídeo conterá uma ou mais de substituições conservadoras. Uma variante também pode, ou alternativamente, conter alterações não conservadoras. Em uma modalidade preferida, os polipeptídeos variantes diferem de uma sequência nativa por substituição, eliminação ou adição de cinco aminoácidos ou menos. As variantes também podem (ou alternativamente) ser modificadas, por exemplo, pela eliminação ou adição de aminoácidos que têm influência mínima na imunogenicidade, na estrutura secundária e na natureza hidropática do polipeptídeo.

[00109] - O termo “zeta” ou alternativamente “cadeia zeta”, “CD3-zeta” ou “TCR-zeta” é definido como a proteína fornecida como N° de Acesso do Banco de Gene BAG36664.1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, chipanzé e semelhantes e um “domínio estimulador de zeta” ou, alternativamente, um “domínio estimulador de CD3-zeta” ou um "Domínio estimulador de TCR-zeta” é definido como os resíduos de aminoácidos do domínio citoplasmático da cadeia zeta, ou derivados funcionais dos mesmos, que são suficientes para transmitir funcionalmente um sinal inicial necessário para a ativação de células T. Em uma modalidade, o domínio citoplasmático de zeta compreende os resíduos 52 a 164 do N° de Acesso do Banco de Gene BAG36664.1 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, chimpanzé e semelhantes, que são ortólogos funcionais dos mesmos.

[00110] DESCRIÇÃO DETALHADA

[00111] Um primeiro objeto da presente invenção é um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para pelo menos um receptor de IL-23 (IL-23R), em que o referido CAR compreende (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga ao referido IL-23R (que pode ser referido como um domínio de ligação de IL-23R extracelular), (ii) opcionalmente um domínio de dobradiça extracelular, (iii) opcionalmente um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e (v) opcionalmente uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

[00112] Em uma modalidade, o CAR compreende um ou mais polipeptídeo(s).

[00113] Em uma modalidade, o CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a um IL-23R expressado na superfície celular.

[00114] Em outra modalidade, o CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a um IL-23R solúvel (isto é, não ligado à membrana).

[00115] Em uma modalidade, o CAR da invenção reconhece e se liga a um IL-23R humano. IL-23R humano é uma proteína codificada por um mRNA de 2,8 kb de comprimento compreendendo 11 éxons (número de acesso no Banco do Gene: NM_144701).

[00116] Em uma modalidade, o CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a uma variante de IL-23R, de preferência uma variante de um IL-23R humano.

[00117] Em uma modalidade, um peptídeo variante de IL-23R se refere a um peptídeo de IL-23R modificado em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos são eliminados, adicionados ou substituídos em comparação com o peptídeo original.

[00118] Variantes de splicing do IL-23R humano foram previamente identificadas (Kan et al, 2008). Em particular, foram descritas 24 isoformas diferentes de IL-23R: isoforma_v1 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990313), isoforma_v2 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990314), isoforma_v3 (codificado por um mRNA com o Banco do Gene número de acesso AM990315), isoforma_v4 (codificado por um mRNA tendo o número de acesso Banco do Gene AM990316),

isoforma_v5 (codificado por um mRNA tendo o número de acesso

Banco do Gene AM990317), isoforma_v6 (codificado por um mRNA tendo o número de acesso Banco do Gene AM990318), isoforma_v7

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990319), isoforma_v8 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990320), isoforma_v9

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990321), isoforma_v10 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990322), isoforma_v11

(codificado por um mRNA com o número de acesso no Banco do

Gene AM990323), isoforma_v12 (codificado por um mRNA com o número de acesso no Banco do Gene AM990324), isoforma_v13

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990325), isoforma_v14 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990326), isoforma_v15

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990327), isoforma_v16 (codificado por um mRNA com o

Número de acesso do Banco do Gene AM990328), isoforma_v17

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990329), isoforma_v18 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990330), isoforma_v19

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990331), isoforma_v20 codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990332), isoforma_v21

(codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do

Gene AM990333), isoforma_v22 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990334), isoforma_v23 (codificado por um mRNA com o acesso do Banco do Gene número AM990335) e isoforma_v24 (codificado por um mRNA com o número de acesso do Banco do Gene AM990336).

[00119] Portanto, em uma modalidade, o CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a uma variante de splicing do IL-23R humano selecionado do grupo que compreende isoforma_v1, isoforma_v2, isoforma_v3, isoforma_v4, isoforma_v5, isoforma_v6, isoforma_v7, isoforma_v8, isoforma_v9, isoforma_v10, isoforma_v11, isoforma_v12, isoforma_v13, isoforma_v14, isoforma_v15, isoforma_v16, isoforma_v17, isoforma_v18, isoforma_v19, isoforma_v20, isoforma_v21, isoforma_v22, isoforma_v23 e isoforma_v24.

[00120] Além disso, polimorfismos de nucleotídeo únicos na subunidade alfa do IL-23R humano foram descritos anteriormente (Kan et al., 2008 e et al. 2016).

[00121] Em uma modalidade, o CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a uma variante de IL-23R compreendendo um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP) na subunidade alfa, em que o referido SNP é selecionado do grupo que compreende R381Q, G149R, V362I e combinações dos mesmos.

[00122] Em uma modalidade, o CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a um IL-23R de murino.

[00123] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular de IL-23R é um anticorpo direcionado a um IL- 23R ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00124] A porção do CAR da invenção que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode existir em uma variedade de formas em que o domínio de ligação de antígeno é expressado como parte de uma cadeia polipeptídica contígua incluindo, por exemplo, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento de anticorpo de domínio único (sdAb), um anticorpo humanizado ou anticorpo biespecífico (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., 1988, Proc.

Natl. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).

[00125] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um anticorpo inteiro, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo dimérico de cadeia única, um Fv, um scFv, um Fab, um F(ab)’2, um anticorpo desfucosilado, um anticorpo biespecífico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um unicorpo, um anticorpo de domínio, um nanocorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dos mesmos.

[00126] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular de IL-23R é um mimético de anticorpo. Exemplos de miméticos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, um affibody, um alfabeto, uma estrutura baseada em proteína de repetição de tatu, um knottin, um peptídeo de domínio kunitz, uma afilina, uma afitina, uma adnectina, um atrímero, uma evasina, um DARPin, um anticalin, um avímero, um fynomer, um versabody ou um duocalina.

[00127] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular do CAR da invenção compreende ou consiste em um fragmento de anticorpo, tal como, por exemplo, um scFv.

[00128] Os limites precisos da sequência de aminoácidos de um dado CDR podem ser determinados usando qualquer um de uma série de esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest” 5a Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração “Kabat”), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273.927-948 (esquema de numeração “Chothia”), ou uma combinação dos mesmos.

[00129] Em uma modalidade, o anticorpo compreendido no CAR da invenção é uma molécula de anticorpo multiespecífico, por exemplo, compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífico. Um anticorpo biespecífico tem especificidade para não mais do que dois antígenos. Uma molécula de anticorpo biespecífico é caracterizada por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo.

[00130] Em uma modalidade, o CAR compreende ou consiste em um scFv compreendendo uma cadeia pesada VH tendo uma sequência SEQ ID NO: 37, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a SEQ ID NO: 37.

[00131] Em uma modalidade, o CAR compreende ou consiste em um scFv que compreende um VL da cadeia leve selecionado do grupo que compreende SEQ ID NO: 38, 46 e 56 ou sequências com pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade com a referida SEQ ID NO: 38, 46 e 56, de preferência compreende uma cadeia leve VL tendo a sequência SEQ ID NO: 38 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 38.

[00132] Em uma modalidade, o scFv compreende um VH de cadeia pesada tendo uma SEQ ID NO: 37 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 37) e um VL da cadeia leve selecionado do grupo que compreende SEQ ID NO: 38, 46, 56 e sequências com pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade com a referida SEQ ID NO: 38, 46 e 56, de preferência um VL tendo uma SEQ ID NO: 38 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 38).

[00133] Em uma modalidade, o scFv compreende um VH da cadeia pesada tendo uma SEQ ID NO: 37 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 37) e um VL da cadeia leve tendo uma SEQ ID NO: 38 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 38).

[00134] Em uma modalidade, o scFv compreende um VH da cadeia pesada tendo uma SEQ ID NO: 37 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 37) e um VL da cadeia leve tendo uma SEQ ID NO: 46 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 46).

[00135] Em uma modalidade, o scFv compreende um VH de cadeia pesada tendo uma SEQ ID NO: 37 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 37) e um VL de cadeia leve tendo uma SEQ ID NO: 56 (ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 56).

[00136] Em uma modalidade, o scFv compreende um ligante que liga as cadeias VH e VL.

[00137] Em uma modalidade, o ligante é um oligo- ou polipeptídeo curto, de preferência tendo um comprimento que varia de 2 a 10 aminoácidos.

[00138] Por exemplo, um dupleto de glicina-serina fornece um domínio de dobradiça particularmente adequado (ligante GS). Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é um ligante Gly/Ser. Exemplos de ligantes Gly/Ser incluem, mas não estão limitados a, ligantes GS, ligantes G2S, ligantes G3S, ligantes G4S.

[00139] Um exemplo não limitativo de ligante G2S é GGS.

[00140] Os ligantes G3S compreendem a sequência de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n também referida como (GGGS)n ou (SEQ ID NO: 1) n, onde n é um número inteiro positivo igual ou maior que 1 (tal como, por exemplo, n = l, n = 2, n = 3. n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 ou n = 10).

Exemplos de ligantes G3S incluem, mas não estão limitados a, GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 6).

[00141] Exemplos de ligantes G4S incluem, mas não estão limitados a, (Gly4 Ser) correspondendo a GGGGS (SEQ ID NO: 5); (Gly4 Ser)2 correspondendo a GGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 4); (Gly4Ser)3 correspondendo a GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 3); e (Gly4 Ser)4 correspondendo a GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 2).

[00142] Em uma modalidade, o ligante é um ligante (G4S)3 (SEQ ID NO: 3).

[00143] Em uma modalidade, o scFv compreende ou consiste em uma sequência SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 57 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85 %, 90%, 95% ou mais de identidade com a referida SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 57. Em uma modalidade, o scFv compreende ou consiste em uma sequência SEQ ID NO: 55 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, de preferência pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade com a referida SEQ ID NO: 55.

[00144] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R extracelular e pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular. Portanto, de acordo com essa modalidade, o CAR da invenção é capaz de se ligar a IL-23R e a pelo menos um outro antígeno.

[00145] Em uma modalidade, o CAR da invenção é capaz de se ligar a um IL-23R e a um antígeno ou ligando distinto.

Em outra modalidade, o CAR da invenção é capaz de se ligar a um primeiro epítopo em um IL-23R e um epítopo distinto no mesmo IL-23R. Em outra modalidade, o CAR da invenção é capaz de se ligar a um IL-23R e a um IL-23R distinto (como, por exemplo, uma variante de IL-23R).

[00146] Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular é um anticorpo direcionado a um antígeno específico ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00147] Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular compreende ou consiste em um fragmento de anticorpo, tal como, por exemplo, um scFv.

[00148] Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00149] O termo “antígeno alimentar da dieta humana comum” se refere a um peptídeo imunogênico, que vem de artigos alimentícios comuns para humanos, tais como antígenos alimentares da seguinte lista não limitativa: antígenos bovinos, tal como lipocalina, S100 de ligação de Ca, alfa-lactalbumina, lactoglobulinas, tais como, beta- lactoglobulina, albumina de soro bovino, caseínas. Os antígenos alimentares também podem ser antígenos do salmão do atlântico, tais como, parvalbumina; antígenos de frango, tais como, ovomucóide, ovalbumina, Ag22, conalbumina, lisozima ou albumina de soro de frango; antígenos de amendoim; antígenos de camarão, tal como tropomiosina; antígenos de trigo, tais como aglutinina ou gliadina; antígenos de aipo, tal como profilina de aipo; antígenos de cenoura, tal como profilina de cenoura; antígenos de maçã, tal como taumatina, proteína de transferência de lipídeos de maçã ou profilina de maçã; antígenos de pera, tal como profilina de pera ou isoflavona redutase; antígenos de abacate, tal como endocitinase; antígenos de damasco, tal como proteína de transferência de lipídeos de damasco; antígenos de pêssego, tal como proteína de transferência de lipídeos de pêssego ou profilina de pêssego; antígenos de soja, tais como, HPS, profilina de soja ou prot PR-I0 (SAM22); fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00150] Em outra modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a um autoantígeno, tal como, por exemplo, um antígeno associado à esclerose múltipla, um antígeno associado à articulação, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP de humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD.

[00151] Em uma modalidade, o termo “antígeno associado à esclerose múltipla” se refere à proteína básica de mielina (MBP). glicoproteína associada à mielina (MAG), glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP), oligoproteína de oligodendrócito de mielina (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada à mielina (MOBP), proteína específica de oligodendrócitos (OSP/Claudina l), proteínas de choque térmico, proteínas específicas de oligodendrócitos (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22 (PMP22), nucleotídeo 3’-fosfodiesterase 2’3’-cíclico (CNPase), fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00152] Em uma modalidade, o termo “antígeno associado à articulação” se refere a peptídeos de filagrina cíclicos e lineares substituídos por citrulina, peptídeos de colágeno tipo II, peptídeos de glicoproteína de cartilagem humana 39 (HCgp39), HSP, peptídeos A2 de ribonucleoproteína nuclear heterogênea (hnRNP), hnRNP B1 , hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 e HSP90, BiP, queratina, vimentina, fibrinogênio, peptídeos de colágeno tipo I, III, IV e V,

anexina V, glicose 6 fosfato isomerase (GPI), acetil- calpastatina, piruvato desidrogenase (PDH), aldolase, topoisomerase I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, antígenos de fosfolipídios, incluindo cardiolipina aniônica e fosfatidilserina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina com carga neutra, metaloproteinase matriz, fibrilina, agrecano, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

Outros exemplos de antígenos associados às articulações incluem, mas não estão limitados a, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado.

[00153] Em uma modalidade, o termo “antígeno associado ao olho” se refere ao colágeno tipo II, arrestina retinal, S-arrestina, proteínas de ligação de retinóide interfotorreceptor (IRBP1), B1 beta-cristalino, proteínas retinais, proteínas coróides e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos. Outros exemplos de antígenos associados ao olho incluem, mas não estão limitados a, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado.

[00154] Em uma modalidade, o termo “antígeno de HSP humano” se refere a HSP60, HSP70, HSP90 humano, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00155] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno associado a uma condição inflamatória do sistema nervoso, de preferência um antígeno associado à esclerose múltipla.

Exemplos de antígenos associados à condição do sistema nervoso inflamatório, de preferência de antígenos associados à esclerose múltipla incluem, mas não estão limitados a, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína associada a mielina (MAG), proteína de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP), oligoproteína de oligodendrócito de mielina (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada à mielina (MOBP), proteína específica de oligodendrócito (OSP/Claudina 1), proteínas de choque térmico, proteínas específicas de oligodendrócito (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22 (PMP22), nucleotídeo 3’-fosfodiesterase 2’3’- cíclico (CNPase), fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00156] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno associado à pele. Exemplos de antígenos associados à pele incluem, mas não estão limitados a, antígenos de queratinócitos, um antígeno presente na derme ou epiderme, um antígeno de melanócitos (tal como, por exemplo, melanina ou tirosinase), desmogleína (por exemplo, desmogleína 1 ou 3, que também pode ser referido como Dsg1/3), BP180, BP230, plectina, integrinas (por exemplo, integrina a4b6), colágenos (por exemplo, colágeno tipo VII), lamininas (por exemplo, laminina 332 ou laminina g1), plaquinas (por exemplo, envoplaquina, periplaquina ou desmoplaquinas),

queratinas (por exemplo, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 e KRT31), proteínas associadas ao filamento de queratina, filagrina, corneodesmosina e elastina.

[00157] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD. Exemplos de tais antígenos incluem as, mas não estão limitados às, MHCs específicas para o tecido transplantado ou para o hospedeiro, b2-microglobulina, antígenos do sistema ABO, antígenos do sistema rhesus (em particular antígenos do C, c, E et e sistema D) e isohemaglutininas. Outros exemplos de antígenos que podem estar envolvidos na rejeição do enxerto ou GVHD incluem, mas não estão limitados a, HLA-DR (em particular durante os primeiros seis meses após o enxerto), HLA-B (em particular durante os primeiros dois anos após o enxerto), HLA-A, antígenos de histocompatibilidade menores (miHA, por exemplo, HLA-E, HLA-F e HLA-G), HLAs correspondentes a MHC classe I (A, B e C), HLAs correspondentes a MHC classe II (DP, DM , DOA, DOB, DQ e DR) e HLAs correspondentes a MHC classe III (por exemplo, componentes do sistema de complemento).

[00158] Em uma modalidade, o antígeno é uma proteína de superfície da célula HLA-A2. Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular compreende um anticorpo direcionado para HLA-A2 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00159] O termo “HLA-A2”, como usado nesse documento,

se refere a proteínas de antígeno leucocitário humano (HLA), incluindo proteínas de superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*02 no locus HLA-A do complexo de genes HLA. As proteínas de HLA abrangidas pelo termo “HLA- A2” incluem proteínas de HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*02 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA- A*02 incluem “HLA-A2”, “HLA-A02” e “HLA-A*2”. Diferentes sistemas de nomenclatura foram desenvolvidos para identificar proteínas de HLA codificadas por esta família de alelos, incluindo o sistema de nomenclatura HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê da OMS para Fatores do Sistema de HLA.

O termo “HLA-A2” se refere a proteínas de HLA codificadas por alelos com designações de acordo com este sistema de nomenclatura que começam com “HLA-A*02”, incluindo, mas não se limitando a, designações que começam com “HLA-A*02: 01” , “HLA-A*02:02”, “HLA-A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA- A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA- A*02:09”, “HLA-A*02:10” e “HLA-A*02:11”. As designações de alelos podem estar em itálico. As designações de alelos que começam com “HLA-A*02:” seguidas de 2 ou 3 dígitos adicionais podem constituir a designação completa ou uma porção inicial da designação. O termo “HLA-A2” também se refere a proteínas de HLA identificadas com designações que começam com “HLA- A*02” de acordo com este sistema de nomenclatura, incluindo,

mas não se limitando às, designações “HLA-A*02:01”, “HL- A*02: 02”, “HLA-A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-A*02:10” e “HLA-A*02:11”.

[00160] Outros exemplos de autoantígenos incluem, sem limitação, canais de água de aquaporina (tais como, por exemplo, canal de água de aquaporina-4 (AQP4)), Hu, Ma2, proteína mediadora de resposta colapsina 5 (CRMP5) e anfifisina, canal de potássio controlado por voltagem (VGKC), receptor de N-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido a- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropriônico (AMPAR), tireoide peroxidase, tireoglobulina, receptor anti-N-metil- D-aspartato (subunidade NR1), antígenos do grupo sanguíneo Rh, antígeno I, desmogleína 1 ou 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, receptores pós-sinápticos nicotínicos de acetilcolina, receptores de tireotropina, integrantes de plaquetas, GpIIb:IIIa, Colágeno (tal como, por exemplo, cadeia de colágeno alfa-3 (IV)), fator reumatoide, calpastatina, proteínas citrulinadas, proteína básica de mielina (MBP), peptídeos de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), alfa-beta-cristalina, DNA, histona, ribossomos, RNP, transglutaminase de tecido (TG2), fator intrínseco, antígeno de 65 kda, fosfatidilserina, fosfoproteínas ribossomais, anticorpo citoplasmático anti-neutrófilos, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, anti-SSB, anticorpos antinucleares (ANA),

Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), Jo-1, anticorpos antimitocondriais, gp210, p62, sp100, anticorpos antifosfolipídeos, SnRNP U1 de 70 kd, gangliosídeo GQ1b, GM1, asialo GM1, GD1b, anticorpos anti-músculo liso (ASMA), anticorpos microssomais anti-fígado-rim-1 (ALKM-1), anticorpo anticitosol hepático-1 (ALC-1), anticorpos antiendomisiais IgA, proteínas de grânulos de neutrófilos, antígeno de parede celular estreptocócica, fator intrínseco de células parietais gástricas, insulina (IAA), descarboxilase de ácido glutâmico (GAA ou GAD) e proteína tirosina fosfatase (tal como, por exemplo, IA2 ou ICA512), PLA2R1 e THSD7A1.

[00161] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno de câncer.

[00162] Como usado nesse documento, o termo “antígeno de câncer” se refere a antígenos que são expressados diferencialmente por células cancerígenas e podem, portanto, ser explorados a fim de ter como alvo as células cancerígenas. Os antígenos de câncer são antígenos que podem estimular potencialmente respostas imunológicas aparentemente específicas do tumor. Alguns desses antígenos são codificados, embora não necessariamente expressados, por células normais. Esses antígenos podem ser caracterizados como aqueles que são normalmente silenciosos (isto é, não expressados) em células normais, aqueles que são expressados apenas em certos estágios de diferenciação e aqueles que são expressados temporalmente, tal como antígenos embrionários e fetais. Outros antígenos de câncer são codificados por genes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene ras ativado), genes supressores (por exemplo, p53 mutante), e proteínas de fusão resultantes de eliminações internas ou translocações cromossômicas. Ainda outros antígenos de câncer podem ser codificados por genes virais, como aqueles transportados em vírus de tumor de RNA e DNA.

Muitos antígenos tumorais foram definidos em termos de múltiplos tumores sólidos: MAGE 1, 2 e 3, definido por imunidade; MART-l/Melano-A, gpl00, antígeno carcinoembrionário (CEA), HER2, mucinas (isto é, MUC-1), antígeno específico da próstata (PSA) e fosfatase ácida prostática (PAP). Além disso, as proteínas virais, tais como algumas codificadas pela hepatite B (HBV), Epstein-Barr (EBV) e papiloma humano (HPV), mostraram ser importantes no desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, linfoma e câncer cervical, respectivamente.

[00163] Outros antígenos de câncer incluem, mas não estão limitados a, 707-AP (alanina prolina707), AFP (alfa(a)-fetoproteína), ART-4 (antígeno de adenocarcinoma reconhecido por células T4), BAGE (antígeno B; b-catenina/m, b-catenina/mutado), BCMA (antígeno de maturação de células B), Bcr-abl (região de agrupamento do ponto de interrupção-

Abelson), CAIX (anidrase carbônica IX), CD19 (agrupamento de diferenciação 19), CD20 (agrupamento de diferenciação 20),

CD22 (agrupamento de diferenciação 22), CD30 (agrupamento de diferenciação 30), CD33 (agrupamento de diferenciação 33),

CD44v7/8 (agrupamento de diferenciação 44, éxons 7/8), CAMEL

(antígeno reconhecido por CTL no melanoma) , CAP-1 (peptídeo de antígeno carcinoembrionário-1), CASP-8 (caspase-8),

CDC27m (ciclo de divisão celular 27 mutado), CDK4/m (mutação de quinase 4 dependente de ciclina), CEA (antígeno carcinoembrionário), CT (câncer/testículo (antígeno)), Cyp-

B (ciclofilina B), DAM (antígeno de diferenciação de melanoma), EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), EGFRvlll (receptor do fator de crescimento epidérmico, variante III), EGP-2 (glicoproteína epitelial2),

EGP-40 (glicoproteína epitelial 40), Erbb2, 3, 4 (homólogo-

2, 3, 4 de oncogene viral de leucemia eritroblástica), ELF2M

(fator de alongamento 2 mutado), ETV6-AML1 (gene variante

Ets 6/gene da leucemia mieloide aguda 1 ETS), FBP (proteína de ligação ao folato), fAchR (receptor fetal de acetilcolina), G250 (glicoproteína 250), GAGE (antígeno G),

GD2 (disialogangliosídeo 2), GD3 (disialogangliosídeo 3),

GnT-V (N-acetilglucosaminiltransferase V), Gp100

(glicoproteína de 100 kd), HAGE (antígeno de helicose), HER-

2/neu (receptor epidérmico humano-2/neurológico; também conhecido como EGFR2), HLA-A (antígeno leucocitário humano-

A) HPV (vírus do papiloma humano), HSP70-2M (proteína de choque térmico 70-2 mutada), HST-2 (tumor de anel de sinete humano-2), hTERT ou hTRT (transcriptase reversa da telomerase humana), iCE (carboxil esterase intestinal), IL-

13R-a2 (subunidade alfa-2 do receptor de lnterleucina-13),

KIAA0205, KDR (receptor do domínio de inserção da quinase),

cadeia leve k, LAGE (antígeno L), LDLR/FUT (receptor de lipídios de baixa densidade/GDP-L-fucose: b-D-galactosidase

2-a-Lfucosiltransferase), LeY (anticorpo de Lewis-Y), L1 CAM

(molécula de adesão de células L1), MAGE (antígeno de melanoma), MAGE-A1 (antígeno associado a melanoma 1),

mesotelina, células infectadas por CMV de murino, MART-

1/Melan-A (antígeno de melanoma reconhecido por células T-

I/antígeno A de melanoma), MC1 R (receptor 1 de melanocortina), miosina/m (miosina mutada), MUC1 (mucina 1),

MUM-1, -2, -3 (melanoma ubíquo mutado 1, 2, 3), NA88-A (clone de cDNA NA do paciente M88), NKG2D (grupo exterminador natural 2, membro D) ligandos, NY-BR-1 (antígeno de diferenciação de mama de Nova Iorque 1), NY-ESO-1 (carcinoma de células escamosas de esôfago de Nova Iorque), antígeno oncofetal (h5T4), P15 (proteína 15), p190 menor bcr-abl

(proteína bcr-abl de 190 KD), Pml/RARa (leucemia promielocítica/receptor de ácido retinóico a), PRAME

(antígeno de melanoma de preferência expressado), PSA

(antígeno específico da próstata), PSCA (antígeno de células-tronco da próstata), PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), RAGE (antígeno renal), RU1 ou RU2 (renal ubíquo 1 ou 2), SAGE (antígeno de sarcoma), SART-1 ou SART-3 (tumor de rejeição de antígeno escamoso 1 ou 3), SSX1, -2, -3, 4 (sarcoma sinovial X1, -2, -3, -4), TAA (antígeno associado ao tumor), TAG-72 (glicoproteína 72 associada a tumor), TEL/AML1 (translocação de leucemia da família Ets/leucemia mieloide aguda 1), TPI/m (triosefosfato isomerase mutado), TRP-1 (proteína relacionada à tirosinase 1 ou gp75), TRP-2 (proteína relacionada à tirosinase 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/íntron 2), VEGF-R2 (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2), ou WT1 (gene do tumor de Wilms).

[00164] Outros exemplos de autoantígenos incluem, sem limitação, canais de água de aquaporina (tais como, por exemplo, canal de água aquaporina-4 (AQP4)), Hu, Ma2, proteína mediadora de resposta de colapsina 5 (CRMP5) e anfifisina, canal de potássio controlado por voltagem (VGKC), receptor de N-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido a- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropriônico (AMPAR), peroxidase tireoidiana, tireoglobulina, anti-receptor N- metil-D-aspartato (subunidade NR1), antígenos do grupo sanguíneo Rh, antígeno I, desmogleína 1 ou 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, receptores pós-sinápticos nicotínicos de acetilcolina, receptores de tireotropina, integrana de plaquetas, GpIIb:IIIa, Colágeno (tal como, por exemplo, cadeia de colágeno alfa-3 (IV)), fator reumatoide, calpastatina, proteínas citrulinadas, proteína básica de mielina (MBP), peptídeos glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), alfa-beta-cristalina, DNA, histona, ribossomos, RNP, transglutaminase de tecido (TG2), fator intrínseco, antígeno de 65 kda, fosfatidilserina, fosfoproteínas ribossomais, anticorpo citoplasmático antineutrófilos, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, anti-SSB, anticorpos antinucleares (ANA), anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), Jo-1, anticorpos antimitocondriais, gp210, p62, sp100, anticorpos antifosfolipídeos, SnRNP U1 de 70 kd, gangliosídeo GQ1b, GM1, asialo GM1, GD1b, anticorpos anti-músculo liso (ASMA), anticorpos microssoma-1 anti- fígado-rim (ALKM-1), anticorpo anticitosol hepático-1 (ALC- 1), anticorpos antiendomisiais IgA, proteínas de grânulos de neutrófilos, antígeno de parede celular estreptocócica, fator intrínseco de células parietais gástricas, insulina (IAA), descarboxilase de ácido glutâmico (GAA ou GAD) e proteína tirosina fosfatase (tal como, por exemplo, IA2 ou ICA512), PLA2R1 e THSD7A1.

[00165] Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a um antígeno associado a células infectadas.

[00166] Como usado nesse documento, o termo “células infectadas” se refere a células contaminadas com algo que afeta sua(seu) qualidade, caráter ou condição desfavoravelmente.

[00167] Em uma modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por vírus. Em outra modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por bactérias.

Em outra modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por fungos. Em outra modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por parasitas.

[00168] Em outra modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a um alérgeno inalado, um alérgeno ingerido ou um alérgeno de contato.

[00169] Exemplos de alérgenos inalados incluem, mas não estão limitados a, alérgenos de Astigmativo (por exemplo, Acarus siro (ácaro de armazenamento, Aca s 13), Blomia tropicalis (ácaro, Blo t), Dermatophagoides farinae (ácaro do pó doméstico americano, Der f), Dermatophagoides microceras (ácaro do pó doméstico, Der m), Dermatophagoides pteronyssinus (ácaro do pó doméstico europeu, Der p), Euroglyphus maynei (ácaro do pó doméstico, Eur m), Glycyphagus domesticus (ácaro de armazenamento, Gly d 2), Lepidoglyphus destructor (ácaro de armazenamento , Lep d), Tyrophagus putrescentiae (ácaro de armazenamento, Tyr p));

Blattaria (por exemplo, Blattella germanica (barata alemã,

Bla g), Periplaneta americana (barata americana, Per a));

Coleoptera (por exemplo, Harmonia axyridis (joaninha asiática, Har a)), Diptera (por exemplo, Aedes aegypti

(mosquito da febre amarela, Aed a), Chironomus kiiensis

(Midge, Chi k), Chironomus thummi (Mosquito, Chi t),

Forcipomyia taiwana (muruim, For t), Glossina morsitans

(mosca tsé-tsé da Savana, Glo m), Hemidiptera: Triatoma protracta (barbeiro da Califórnia, Tria p)), Hymenoptera

(por exemplo, Apis cerana (abelha oriental, Api c), Apis dorsata (abelha gigante, Api d), Apis mellifera (abelha melífera, Api m), Bombus pennsylvanicus (abelha amarela, Bom p), Bombus terrestris (abelha amarela, Bom t),

Dolichovespula arenaria (vespa amarela, Dol a),

Dolichovespula maculata (vespa de face branca, Dol m),

Myrmecia pilosula (formiga saltadora australiana, Myr p),

Polistes annularis (Vespa, Pol a), Polistes dominulus (vespa guarda-chuva mediterrâneo, Pol d), Polistes exclamans

(Vespa, Pol e), Polistes fuscatus (Vespa, Pol f), Polistes gallicus (Vespa, Pol g), Polistes metricus (Vespa, Pol m),

Polybia paulista (Vespa, Pol p), Polybia scutellaris (Vespa,

Pol s), Solenopsis geminata (formiga de fogo tropical, Sol g), Solenopsis invicta (formiga de fogo vermelha importada,

Sol i), Solenopsis richteri (formiga de fogo preta, Sol r),

Solenopsis saevissima (formiga de fogo brasileira, Sol s),

Vespa crabro (vespa europeia, Vesp c), Vespa mandarinia

(Vespa mandarina, Vesp m), Vespula fiavopilosa (Vespa jaqueta amarela, Vesp f), Vespula germanica (Vespa germânica, Vesp g), Vespula maculifrons (Vespa jaqueta amarela oriental, Vesp m), Vespula pensylvanica (Vespa

Jaqueta amarela ocidental, Vesp p), Vespula squamosa (Vespa

Jaqueta amarela do Sul, Vesp s), Vespula vidua (Vespa, Vespa

Jaqueta amarela de viúva Vesp vi), Vespula vulgaris (Vespa comum, Vesp v)), Ixodida (por exemplo, Argas reflexus

(carrapato de pombo, Arg r)), Lepidoptera (por exemplo,

Bombyx niori (bicho da seda, Bomb n), Plodia interpunctella

(traça indiana da farinha, Plo i), Thaumetopoea pityocampa

(lagarta do pinheiro, Tha p)), Thysanura (por exemplo,

Lepisma saccharina (peixinho de prata, Lep s)), Siphonaptera

(por exemplo, Ctenocephalides felis (pulga de gato, Cte f)),

Carnivora (por exemplo, Canis familiaris (cão, Can f), Felis domesticus (gato, Fel d)); Lagomorpha (por exemplo,

Oryctolagus cuniculus (coelho europeu, Ory c),

Perissodactlyla: Equus caballus (cavalo doméstico, Equ c)),

Pleuronectiformes (por exemplo, Lepidorhombus whiffiagonis

(Megrim, linguado arreiro, Galo, Lep w)), Rodentia (por exemplo, Cavia porcellus) (porquinho da índia, Cav p), Mus musculus (camundongo, Mus m), Rattus norvegius (rato, Rat n)); Coniferales: Chamaecyparis obtusa (cipreste japonês,

Cha o), Cupressus arizonica (cipreste do arizona, Cup a),

Cryptomeria japonica (Sugi, Cry j), Cupressus sempervirens

(cipreste comum, Cup s), Juniperus ashei (zimbro, Jun a),

Juniperus oxycedrus (zimbro bravo, Jun o), Juniperus sabinoides (cedro da montanha, Jun s), Juniperus virginiana

(cedro vermelho, Jun v)); Gentianales (por exemplo,

Catharanthus roseus (vinca de madagástar, Cat r)); Poales

(por exemplo, Anthoxanthum odoratum (erva santa, Anto 1),

Cynodon dactylon (grama Bermudas, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d

12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24), Dactylis glomerata (erva dos combros, Dae g 1, Dae g 2, Dae g 3, Dae g 4, Dae g 5), Festuca pratensis (festuca do prado, Fes p

4)), Holcus lanatus (erva lanar, Hol l 1, Hol l 5), Hordeum vulgare (Cevada, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21), Lolium perenne (azevém, Lol p 1,

Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11), Oryza sativa

(arroz, Ory s 1, Ory s 12), Paspalum notarum (capim Bahia,

Pas n 1), Phalaris aquatica (alpista da água, Pha a 1, Pha a 5), Phleum pratense (timótio, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4,

Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13),

Poa pratensis (erva de febra, Poa p 1, Poa p 5), Secale cereale (Centeio, Sec c 1, Sec c 20), Sorghum halepense

(sorgo de alepo, Sor h 1), Triticum aestivum (trigo duro,

Tri a 12, Tri a 14, Tri a 185, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26,

Tri a 2 7, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30), Zea mays (Milho,

Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25), Fagales: Alnus glutinosa (Amieiro, Aln g 1, Aln g 4), Betula verrucosa (Vidoeiro branco, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 5, Bet v 6, Bet v 7), Carpinus betuhxs (raio europeu, Car b 1)); Lamiales (por exemplo, Fraxinus excelsior (freixos, Fra e l), alfeneiro (Privet, Lig v), Syringa vulgaris (Lilás, Syr v)); Malpighiales (por exemplo, Hevea brasiliensis (seringueira (látex), Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13)); Proteales (por exemplo, Platanus acerifolia (plátano, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3), Platanus orientalis (plátano oriental, Pla ou 1, Pla ou 2, Pla ou 3)).

[00170] Exemplos de alérgenos ingeridos incluem, mas não estão limitados a, alérgenos de Fungo Ascomycota, tal como, por exemplo, Dothideales (por exemplo, Mancha Alternaria (fungo da podridão Alternaria, Alt a), Cladosporium cladosporioides (Cla c), Cladosporium herbarum (Cla h), Curvularia lunata (Cur l), - Eurotiales: Aspergillus flavus (Asp fl), Aspergillus fumigatus (Asp f), Aspergillus niger (Asp n), Aspergillus oryzae (Asp o), Penicillium brevicompactum (Pen b), Penicillium chrysogenum Pen ch), Penicillium citrinum (Pen c), Penicillium oxalicum (Pen o)), Hypocreales (por exemplo, Fusarium culmorum (Fus c)); Onygenales (por exemplo, Trichophyton rubrum (Tri r), Trichophyton tonsurans (Tri t), Saccharomycetales: Candida albicans (levedura, Cand a), Candida boidinii (levedura, Cand b)); Tuberculariales (por exemplo, Epicoccum purpurascens (Epi p)), alérgenos de Fungo Basidiomycota, tal como, por exemplo, Hymenomycetes (por exemplo, Coprinus comatus (coprino barbudo, Cop c), Psilocybe cubensis (cogumelo enteógeno, Psi c), Urediniomycetes (por exemplo, Rhodotorula mucilaginosa (Levedura, Rho m)); Ustilaginomycetes (por exemplo, Malassezia furfur (Agente infec. Pityriasis versicolor, Mala f), Malassezia sympodialis (Mala s)); antibióticos (tais como, por exemplo, Penicilinas, Cefalosporinas, Aminosporinas, Quinolonas, macrolídeos, tetraciclina, sulfamidas); fármacos (tais como, por exemplo, ácido acetilsalicílico, vacinas, morfinas e derivados); vitaminas, tais como, por exemplo, vitamina K1; e alérgenos alimentares (tais como, por exemplo, alérgeno do leite, ovo, amendoim, nozes (nozes, caju, etc.), peixes, mariscos, soja, trigo e cenoura, maçã, pera, abacate, damasco, pêssego).

[00171] Exemplos de alérgenos de contato incluem, mas não estão limitados a, metais pesados (tais como, por exemplo, níquel, cromo, ouro), látex, haptenos, tais como, por exemplo, halotano, hidralazina.

[00172] Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a um antígeno selecionado do grupo que compreende ovalbumina, MOG, fragmentos de colágeno tipo II, variantes e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a um antígeno selecionado do grupo que compreende vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, variantes e misturas dos mesmos.

[00173] Em uma modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a ovalbumina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00174] Em outra modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a MOG, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00175] Em outra modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar ao colágeno tipo II, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00176] Em outra modalidade, o referido pelo menos um outro domínio de ligação de antígeno extracelular (de preferência scFv) é capaz de se ligar a vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00177] Em uma modalidade, o domínio de ligação de IL-23R extracelular está conectado a um domínio transmembranar por um domínio de dobradiça.

[00178] Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é um ligante oligo- ou polipeptídico curto, de preferência tendo um comprimento que varia de 2 a 10 aminoácidos, como descrito acima.

[00179] Outro exemplo de domínio de dobradiça que pode ser usado na presente invenção é descrito em WO2012/138475, incorporado nesse documento por referência.

[00180] Em uma modalidade, o domínio de dobradiça compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que compreende a sequência de aminoácidos AGSSSSGGSTTGGSTT (SEQ ID NO: 7), a sequência de aminoácidos GTTAASGSSGGSSSGA (SEQ ID NO: 8), a sequência de aminoácidos SSATATAGTGSSTGST (SEQ ID NO: 9), e a sequência de aminoácidos TSGSTGTAASSTSTST (SEQ ID NO: 10).

[00181] Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de nucleotídeos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 11).

[00182] Em outra modalidade, o domínio de dobradiça é uma dobradiça KIR2DS2 correspondente a KIRRDSS (SEQ ID NO: 12).

[00183] Em uma modalidade, o domínio de dobradiça compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de uma dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 13) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% identidade com a SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é uma dobradiça CD8 codificada pela sequência de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 14 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98 % ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 14.

[00184] Em outra modalidade, o domínio de dobradiça compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de uma dobradiça de IgG4 (SEQ ID NO: 15), ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 15.

Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é uma dobradiça de IgG4 codificada pela sequência de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 16 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 16.

[00185] Em outra modalidade, o domínio de dobradiça compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de uma dobradiça de IgD (SEQ ID NO: 17) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% identidade com a SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é uma dobradiça de IgD codificada pela sequência de ácidos nucleicos SEQ ID NO:

18 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 18.

[00186] Em outra modalidade, a região de dobradiça compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de uma dobradiça CD28 (SEQ ID NO: 19) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% identidade com a SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é uma dobradiça CD28 codificada pelo ácido nucleico SEQ ID NO: 20 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 20.

[00187] Exemplos de domínios transmembranares que podem ser usados no receptor quimérico da invenção incluem, mas não estão limitados a, domínios transmembranares de uma cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de células T, ou de CD28, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7Ra, ITGA1, VLA1 , CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29,

ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB- A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, e/ou NKG2C.

[00188] Em uma modalidade, o domínio transmembranar compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de um domínio transmembranar CD8 (SEQ ID NO: 21), ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:

21. Em outra modalidade, o domínio transmembranar compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma, duas ou três modificação(ões), mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 21.

[00189] Em outra modalidade, o domínio transmembranar é codificado pela sequência de nucleotídeos de um domínio transmembranar CD8 (SEQ ID NO: 22) ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade cm a SEQ ID NO: 22.

[00190] Em outra modalidade, o domínio transmembranar compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de um domínio transmembranar CD28 (SEQ ID NO: 23) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:

23. Em uma modalidade, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD28 codificado pela sequência de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24.

[00191] Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode ser recombinante, caso em que compreenderá aminoácidos predominantemente hidrofóbicos, tal como valina ou leucina.

[00192] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender toda a porção intracelular, ou todo o domínio de sinalização intracelular nativo, da molécula da qual é derivado, ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo.

[00193] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização primário de células T (ou uma sequência derivada do mesmo) e, opcionalmente, um ou mais de domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T (ou sequência(s) derivada(s) da mesma).

[00194] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção consiste em um domínio de sinalização primário.

[00195] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um ou mais de domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T.

Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular consiste em um ou mais de domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T.

[00196] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende pelo menos um domínio coestimulatório e um domínio de sinalização primário.

[00197] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende pelo menos dois domínios coestimuladores e um domínio de sinalização primário.

[00198] Em uma modalidade da invenção, o domínio de sinalização primário de células T compreende um domínio de sinalização de uma proteína selecionada no grupo de CD3 zeta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, FcR gama comum (FCER1G), FcR beta (Fc épsilon Rib), CD79a, CD79b, Fc gama RIIa, DAP10 e DAP 12 e sequências derivadas dos mesmos.

[00199] Em uma modalidade, o domínio de sinalização primário de células T compreende ou consiste em um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta.

[00200] Em uma modalidade, o domínio de sinalização primário de células T compreende ou consiste na sequência de aminoácidos do domínio CD3-zeta de SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62.

[00201] Em outra modalidade, o domínio de sinalização primário CD3 zeta compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma, duas ou três modificação(ões), mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62.

[00202] Assim, em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio de sinalização primário de células T compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos do domínio CD3-zeta de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de nucleotídeos com em pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28.

[00203] Os domínios de sinalização primários de células T que atuam de uma maneira estimuladora podem compreender motivos de sinalização conhecidos como motivos de ativação à base de imunorreceptor tirosina (ITAMS).

[00204] Exemplos de ITAM contendo domínios de sinalização intracelular primários de células T que são de uso particular na invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de (ou derivados de) CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama RIIa, FcR beta (Fc épsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD66b, CD79a, CD79b, DAP10 e DAP12.

[00205] Em uma modalidade, o domínio de sinalização primário de células T compreende um domínio de ITAM modificado, por exemplo, um domínio de ITAM mutado que alterou (por exemplo, aumentou ou diminuiu) a atividade em comparação com o domínio de ITAM nativo. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM modificado, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM otimizado e/ou truncado. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um, dois, três, quatro ou mais motivos ITAM.

[00206] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende um domínio de sinalização primário de células T (tal como, por exemplo, um domínio de sinalização CD3-zeta), combinado com um ou mais de domínios de sinalização coestimuladores.

[00207] Exemplos de domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T incluem os, mas não estão limitados aos, domínios de sinalização de proteínas selecionadas no grupo de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), uma molécula de MHC de classe I, BTLA, um receptor do ligando Toll, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligando que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, ARHR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2ra, IL6Ra, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), IL-21R, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a/CD18, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, CTLA-4 (CD152), CD95, TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), TGFbR1/2/3, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, cadeia gama comum, um ligando que se liga especificamente a CD83, NKp44, NKp30, NKp46 ou NKG2D e qualquer combinação dos mesmos.

[00208] Em uma modalidade da invenção, o receptor quimérico compreende pelo menos um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T selecionada do grupo que compreende 4-1BB, ICOS, CD27, OX40, CD28, CTLA4 e PD-1.

[00209] Em uma modalidade, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de 4-1BB (SEQ ID NO: 29) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97% , 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 29. Em outra modalidade, o domínio de sinalização coestimuladora de células T compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificação(ões), mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[00210] Em uma modalidade, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD27 (SEQ ID NO: 30) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98 % ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 30. Em outra modalidade, o domínio de sinalização coestimuladora de células T compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificação(ões), mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[00211] Em uma modalidade, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD28 (SEQ ID NO: 31) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, o domínio de sinalização coestimuladora de células T compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificação(ões), mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[00212] Em uma modalidade da invenção, o receptor quimérico compreende uma combinação de pelo menos dois domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T, de preferência selecionada de um domínio intracelular de CD28, um domínio intracelular de CD27 e um domínio intracelular de 4-1BB.

[00213] Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de 4-1BB (SEQ ID NO: 29) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% identidade com a SEQ ID NO: 29 e a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD27 (SEQ ID NO: 30) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 30.

[00214] Em outra modalidade, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de 4-1BB (SEQ ID NO: 29) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% identidade com a SEQ ID NO: 29 e a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD28 (SEQ ID NO: 31) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 31.

[00215] Em ainda outra modalidade, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD27 (SEQ ID NO: 30) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade cm a SEQ ID NO: 30 e a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD28 (SEQ ID NO: 31) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 31.

[00216] Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de 4-1BB (SEQ ID NO: 29) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% identidade com a SEQ ID NO: 29 e a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD27 (SEQ ID NO: 30) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 30 e a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD28 (SEQ ID NO:

31) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 31.

[00217] Assim, em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio de sinalização coestimuladora de células T compreende a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular de 4-1BB (SEQ ID NO: 32) ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 32, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular de CD27 (SEQ ID NO: 33) ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 33 e/ou a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular de CD28 (SEQ ID NO: 34), ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 34.

[00218] Na modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende: - a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de 4-1BB de SEQ ID NO: 29 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 29, e/ou a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD27 de SEQ ID NO: 30 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 30, e/ou a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular de CD28 de SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 31; e - a sequência de aminoácidos de um domínio intracelular CD3-zeta de SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade cm a SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62; em que as sequências compreendidas no domínio intracelular são expressadas na mesma fase e como uma única cadeia polipeptídica.

[00219] Assim, em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende: - a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular de 4-1BB de SEQ ID NO: 32 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 32, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular de CD27 de SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 33, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular de CD28 de SEQ ID NO: 34 ou uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 34; e - a sequência de ácidos nucleicos de um domínio intracelular CD3-zeta de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28, ou uma sequência com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28.

[00220] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende pelo menos dois domínios diferentes (por exemplo, um domínio de sinalização primário e pelo menos um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T) que podem ser ligados um ao outro de forma aleatória ou em uma ordem especificada.

[00221] Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, entre 2 e 10 aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) de comprimento pode formar a ligação entre domínios de sinalização distintos. Em uma modalidade, um dupleto de glicina-serina (GS) é usado como um ligante adequado. Em uma modalidade, um único aminoácido, por exemplo, uma alanina (A), uma glicina (G), é usado como um ligante adequado.

Outros exemplos de ligante são descritos nesse documento.

[00222] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios de sinalização coestimuladores.

[00223] Em outra modalidade, os dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, domínios de sinalização coestimuladores, são separados por uma molécula de ligante, por exemplo, uma molécula de ligante como descrito acima.

[00224] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular do receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização primário de CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62) e o domínio de sinalização coestimulador de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31).

[00225] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização primário de CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62) e o domínio de sinalização coestimulador de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29).

[00226] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização de CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62) e o domínio de sinalização de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30).

[00227] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende adicionalmente uma sequência líder localizada no terminal N a partir do domínio de ligação extracelular específico de IL-23R. Um exemplo não limitante de sequência líder é uma sequência líder de CD8 que pode compreender ou consiste na sequência SEQ ID NO: 39.

[00228] Em uma modalidade, o CAR compreende adicionalmente uma etiqueta, tal como, por exemplo, uma etiqueta para controle de qualidade, enriquecimento, rastreamento in vivo e semelhantes. A referida etiqueta pode ser localizada no terminal N, terminal C e/ou internamente.

Exemplos de etiquetas que podem ser usadas no CAR da invenção são bem conhecidos pelos habilitados na técnica. Por exemplo, mas sem limitação, uma etiqueta usada na invenção pode ser uma etiqueta selecionada do grupo que compreende ou consiste em etiqueta de hemaglutinina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poli-histidina, etiqueta de Myc, etiqueta de Strep, etiqueta de S, etiqueta de HAT, etiqueta de Flag 3x, etiqueta de peptídeo de ligação de calmodulina, etiqueta de SBP, etiqueta de domínio de ligação de quitina, etiqueta de GST, etiqueta de proteína de ligação de maltose, etiqueta de proteína fluorescente, etiqueta de T7, etiqueta de V5 e etiqueta de Xpress. Outros exemplos de etiqueta incluem, sem limitação, NWSHPQFEK (SEQ ID NO: 59) ou SAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 60).

[00229] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende adicionalmente sequências P2A (SEQ ID NO: 44) e GFP (SEQ ID NO: 45).

[00230] De acordo com uma primeira modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R extracelular, opcionalmente um domínio de dobradiça extracelular, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular.

[00231] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00232] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00233] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00234] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00235] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00236] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00237] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00238] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00239] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00240] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00241] De acordo com uma segunda modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R, opcionalmente um domínio de dobradiça extracelular, um domínio transmembranar, um único domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T e um domínio de sinalização primário de células T.

[00242] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO:

29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00243] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00244] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00245] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00246] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência

SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00247] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00248] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00249] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00250] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00251] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00252] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00253] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00254] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00255] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00256] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00257] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO:

29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00258] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00259] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00260] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00261] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00262] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00263] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00264] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência

SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00265] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00266] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00267] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00268] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00269] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00270] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00271] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00272] De acordo com uma terceira modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R, opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, um domínio transmembranar, dois domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T e um domínio de sinalização primário de células T.

[00273] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00274] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00275] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO:

31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00276] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00277] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00278] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00279] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00280] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00281] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00282] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00283] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00284] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 13); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00285] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00286] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00287] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00288] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO:

29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00289] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00290] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgG4 (de preferência SEQ ID NO: 15); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00291] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD, de preferência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17; um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00292] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00293] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00294] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID

NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00295] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00296] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de IgD (de preferência SEQ ID NO: 17); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00297] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00298] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00299] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD8 (de preferência SEQ ID NO: 21); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00300] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00301] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de 4-1BB (de preferência SEQ ID NO: 29); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00302] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R; um domínio de dobradiça de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 19); um domínio transmembranar de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 23); um domínio intracelular de CD27 (de preferência SEQ ID NO: 30); um domínio intracelular de CD28 (de preferência SEQ ID NO: 31); e um domínio de sinalização primário CD3-zeta (de preferência SEQ ID NO: 25, 26, 61 ou 62).

[00303] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende (i) um domínio de ligação de IL-23R, (ii) uma região de dobradiça de CD28 de humano, (iii) um domínio transmembranar de CD28 de humano, (iv) um domínio intracelular de CD28 de humano e (v) um domínio intracelular da cadeia CD3z humana.

[00304] Em uma modalidade, a parte do CAR que compreende uma região de dobradiça de CD28 de humano, um domínio transmembranar de CD28 de humano, um domínio intracelular de CD28 de humano e um domínio intracelular da cadeia de CD3z de humano corresponde à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou 63 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 35 ou

63.

[00305] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação de IL-23R, ligado a uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou 63 ou uma sequência ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 35 ou 63.

[00306] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende (i) um domínio de ligação de IL-23R, (ii) uma região de dobradiça de CD8 de humano, (iii) um domínio transmembranar de CD8 de humano, (iv) um domínio intracelular de humano 4-1BB e (v) um domínio intracelular de CD3z de humano. Em uma modalidade, a parte do CAR que compreende uma região de dobradiça de CD8 de humano, um domínio transmembranar de CD8 de humano, um domínio intracelular de 4-1BB de humano e um domínio intracelular de CD3z de humano compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 49, 50, 70 ou 71, ou qualquer sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49, 50, 70 ou

71.

[00307] Em outra modalidade, o CAR da invenção compreende (i) um domínio de ligação de IL-23R, (ii) uma região de dobradiça de CD8 de humano, (iii) um domínio transmembranar de CD8 de humano, (iv) um domínio intracelular de CD28 de humano e (v) um domínio intracelular de CD3z de humano. Em uma modalidade, a parte do CAR que compreende uma região de dobradiça de CD8 de humano, um domínio transmembranar de CD8 de humano, um domínio intracelular de CD28 de humano e um domínio intracelular de CD3z de humano compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 51 ou 72, ou qualquer sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 51 ou 72.

[00308] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência SEQ ID NO: 55, 36 ou 57, de preferência SEQ ID NO: 55), uma região de dobradiça de CD8, um domínio transmembranar de CD8 de humano, um domínio intracelular de 4-1BB de humano e um domínio intracelular de CD3z de humano. Em uma modalidade, o referido CAR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 41, 43, 65 ou 67 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 41, 43, 65 ou 67.

[00309] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende uma sequência líder de CD8, um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência SEQ ID NO: 55, 36 ou 57, de preferência SEQ ID NO: 55), uma região de dobradiça de CD8, um domínio transmembranar de CD8 de humano, um domínio intracelular de 4-1BB de humano e um domínio intracelular de CD3z de humano. Em uma modalidade, o referido CAR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 40, 42, 64 ou 66 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 40, 42, 64 ou 66.

[00310] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência SEQ ID NO: 55, 36 ou 57, de preferência SEQ ID NO: 55), uma região de dobradiça de CD8, um domínio transmembranar de CD8 de humano, um domínio intracelular de CD28 de humano e um domínio intracelular de CD3z de humano. Em uma modalidade, o referido CAR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 48, 53, 69 ou 74 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 48, 53, 69 ou 74.

[00311] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende uma sequência líder de CD8, um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência

SEQ ID NO: 55, 36 ou 57, de preferência SEQ ID NO: 55), uma região de dobradiça de CD8, um domínio transmembranar de CD8 de humano, um domínio intracelular de CD28 de humano e um domínio intracelular de CD3z de humano. Em uma modalidade, o referido CAR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 47, 52, 68 ou 73 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 47, 52, 68 ou 73.

[00312] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende uma sequência líder de CD8 tendo a SEQ ID NO: 39, um scFv anti-IL-23R humano, compreendendo um VH tendo a sequência SEQ ID NO: 37 e um VL tendo SEQ ID NO: 38, ligado por um ligante (G4S)3 (SEQ ID NO: 3), um domínio de dobradiça derivado de CD8a tendo a sequência de SEQ ID NO: 13, um domínio transmembranar CD8a humano tendo a SEQ ID NO: 21, e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização de 4-1BB de humano tendo SEQ ID NO: 29 e um domínio zeta CD3 humano tendo SEQ ID NO: 26.

[00313] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R humano, compreendendo um VH tendo a sequência SEQ ID NO: 37 e um VL tendo SEQ ID NO: 38, ligado por um ligante (G4S)3 (SEQ ID NO: 3), um domínio de dobradiça derivado de CD8a tendo a sequência de SEQ ID NO: 13, um domínio transmembranar de CD8a humano tendo a SEQ ID NO: 21, e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização de 4-1BB de humano tendo SEQ ID NO: 29 e um domínio CD3 zeta de humano tendo SEQ ID NO: 26.

[00314] Em uma modalidade, o CAR da invenção tem uma sequência SEQ ID NO: 54 ou uma sequência com pelo menos cerca de 95, de preferência cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 54.

[00315] A presente invenção se refere adicionalmente a uma célula T, de preferência uma célula T isolada, manipulada para expressar na superfície da célula um CAR como descrito acima.

[00316] A presente invenção também se refere a uma população de células T isolada e/ou substancialmente purificada compreendendo células manipuladas para expressar na superfície celular um CAR como descrito acima.

[00317] Em uma modalidade, as células T da invenção são supressoras para células que expressam em sua superfície o IL-23R reconhecido pelo CAR.

[00318] Em uma modalidade, as células T da invenção são citotóxicas para células que expressam em sua superfície a IL-23R reconhecido pelo CAR.

[00319] Em uma modalidade, a população de células T da invenção compreende ou consiste em células T reguladoras (Treg), células T CD8+, células T CD4+ e células T NK.

[00320] Em uma modalidade, as células T da invenção são células Treg.

[00321] Em uma modalidade, a célula T é uma célula imune reguladora, tal como, por exemplo, qualquer célula imune reguladora adequada para uso em terapia celular.

[00322] Em uma modalidade, todas as células Treg da população da invenção expressam um receptor quimérico (CAR) como definido nesse documento e podem, assim, ser definidas como monoespecíficas de CAR (isto é, todas as células Treg reconhecem o mesmo antígeno (IL-23R) com o CAR que eles expressam). Em uma modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR (isto é, todas as células Treg reconhecem o mesmo antígeno com seu TCR). Em outra modalidade, a população de células Treg é poliespecífica de TCR (isto é, as células Treg podem reconhecer diferentes antígenos com seu TCR).

[00323] Em uma modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR reconhece um antígeno, um fragmento de um antígeno, uma variante de um antígeno ou uma mistura dos mesmos.

[00324] Em uma modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico de um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00325] Em outra modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico de um autoantígeno, tal como, por exemplo, um antígeno associado à esclerose múltipla, um antígeno associado à articulação, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP de humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD. Exemplos de autoantígenos, em particular de antígenos associados à esclerose múltipla, antígenos associados às articulações, antígenos associados ao olho, antígenos HSP humanos, antígenos associados à pele e antígenos envolvidos na rejeição do enxerto ou GVHD são dados nesse documento.

[00326] Em outra modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico de um alérgeno inalado, um alérgeno ingerido ou um alérgeno de contato.

[00327] Em uma modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico de um antígeno selecionado do grupo que compreende ovalbumina, MOG, fragmentos de colágeno tipo II, variantes e misturas dos mesmos.

[00328] Em uma modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico de ovalbumina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00329] Em outra modalidade, a população de células Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico de MOG, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00330] Em outra modalidade, a população de células

Treg é monoespecífica de TCR e o TCR é específico do colágeno tipo II, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00331] Em uma modalidade, as células Treg que expressam o CAR da invenção são supressoras contra as células que expressam IL-23R reconhecidas pelo CAR.

[00332] Em uma modalidade, o CAR da invenção, quando expressado por uma célula Treg, confere à célula Treg a capacidade de se ligar a células que expressam IL-23R em sua superfície celular e ser ativada pelo IL-23R, diferentemente do antígeno que as células Treg são ou teriam sido específicas da ou ativada pela mesma.

[00333] A população de células Treg da invenção pode, assim, ser definida como uma população de células Treg redirecionada. Como usado nesse documento, o termo “redirecionado” se refere a uma célula Treg carregando um receptor quimérico, como descrito nesse documento, que confere à célula Treg a capacidade de se ligar e ser ativada por um ligante que é diferente daquele que a célula Treg é ou teria sido específico do ou seria ativado pelo mesmo.

[00334] Em uma modalidade, as células Treg da invenção não são citotóxicas. Em outra modalidade, as células Treg da invenção são citotóxicas.

[00335] Exemplos de células que expressam IL-23R incluem, mas não estão limitados a, Th17, células T ab, neutrófilos, células T gama delta, NK, NKT, células dendríticas e macrófagos.

[00336] Em uma modalidade, as células Treg da invenção podem ser selecionadas do grupo que compreende Treg CD4+CD25+Foxp3+, células Tr1, células Th3 secretoras de TGF- b, células T NK reguladoras, células T reguladoras gd, células T CD8+ reguladoras e células T reguladoras duplamente negativas.

[00337] Em uma modalidade, a célula reguladora é uma célula T reguladora CD4+ (Treg). Em uma modalidade, a Treg é uma Treg derivada do timo ou uma Treg adaptativa ou induzida.

Em uma modalidade, a Treg é uma célula T reguladora CD4+FOXP3+ ou uma célula T reguladora CD4+FOXP3- (célula Tr1), de preferência uma célula T reguladora CD4+FOXP3+.

[00338] Em uma modalidade, a célula reguladora é uma célula T reguladora CD8+ (Treg). Em uma modalidade, a célula T reguladora CD8+ é selecionada do grupo que consiste em uma célula T reguladora CD8+CD28−, uma célula T reguladora CD8+CD103+, uma célula T reguladora CD8+FOXP3+, uma célula T reguladora CD8+CD122+, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a célula reguladora é uma célula T reguladora INFg+IL10+IL34+ CD8+CD45RClow.

[00339] Em uma modalidade, as células Treg da invenção são células de mamíferos, de preferência células Treg de humano.

[00340] Em uma modalidade, o Treg é derivado de células-tronco, tais como, por exemplo, células-tronco induzidas, incluindo, sem limitação, células-tronco pluripotentes induzidas (iPS ou iPSC).

[00341] Como usado nesse documento, o termo “células- tronco pluripotentes induzidas”, “iPS” ou “iPSC” se refere a células-tronco pluripotentes artificiais, derivadas de células não pluripotentes, em particular de células somáticas adultas, por desdiferenciação ou reprogramação. Em particular, iPSC pode ser obtido pela introdução de um conjunto específico de genes associados à pluripotência em uma célula, tal como, por exemplo, os fatores de transcrição Oct4 (Pou5f1), Sox2, cMyc e Klf4. Além de sua morfologia, propriedades de autorrenovação e pluripotência similares às das células-tronco embrionárias, as iPSCs também exibem reprogramação epigenética com um perfil geral de metilação de histonas e expressão gênica muito próxima ao das células- tronco embrionárias. IPSCs, em particular, expressam marcadores de pluripotência, tais como, por exemplo, proteínas Nanog, Sox2, Oct4 e Ssea3/4.

[00342] Em uma modalidade, a célula reguladora tem o seguinte fenótipo: CD4+CD25+, tal como, por exemplo, CD4+CD25+CD127-, tal como, por exemplo, CD4+CD25+CD127- CD45RA+. De preferência, a célula imune reguladora tem o seguinte fenótipo: FOXP3+CD4+CD25+, tal como, por exemplo, FOXP3+CD4+CD25+CD127-, tal como, por exemplo,

FOXP3+CD4+CD25+CD127-CD45RA+.

[00343] Em uma modalidade, a célula reguladora apresenta pelo menos um dos seguintes fenótipos: CD4+CD25+, FOXP3+, CD127lo/-, CTLA-4+, CD39+, Helios+, CD62L+/hi, VLA4+, LFA1+, CD49bint, ITGb7int, PSGL-1+, ICOS+, GITR+, PD-1int, Perflo/-, CCR7+. Em uma modalidade, a célula imunorreguladora não expressa Granzima A e/ou Granzima B.

[00344] Em uma modalidade, a determinação do nível de expressão de moléculas é conduzida por citometria de fluxo, imunofluorescência ou análise de imagem, por exemplo, análise de alto conteúdo. De preferência, a determinação do nível de expressão das moléculas é conduzida por citometria de fluxo. Em uma modalidade, antes de realizar a análise de citometria de fluxo, as células são fixadas e permeabilizadas, permitindo assim a detecção de proteínas intracelulares.

[00345] Em uma modalidade, a determinação do nível de expressão de uma molécula em uma população de células compreende a determinação da porcentagem de células da população de células que expressam a molécula (isto é, células “+” para a molécula). De preferência, a referida percentagem de células que expressam a molécula é medida por FACS.

[00346] Os termos “expressando (ou +)” e “não expressando (ou -)” são bem conhecidos na técnica e se referem ao nível de expressão do marcador de célula de interesse, em que o nível de expressão do marcador de célula correspondente a “+” é alto ou intermediário, também referido como “+/-”, e o nível de expressão do marcador de célula correspondente a “-” é nulo.

[00347] O termo “baixo” ou “lo” ou “lo/-” é bem conhecido na técnica e se refere ao nível de expressão do marcador de célula de interesse, em que o nível de expressão do marcador de célula é baixo em comparação com a expressão nível desse marcador de célula na população de células sendo analisadas como um todo. Mais particularmente, o termo “lo” se refere a uma população distinta de células que expressam o marcador de célula em um nível inferior do que uma ou mais de outras populações distintas de células.

[00348] O termo “alto” ou “hi” ou “brilhante” é bem conhecido na técnica e se refere ao nível de expressão do marcador de célula de interesse, em que o nível de expressão do marcador de célula é alto em comparação com o nível de expressão desse marcador de célula na população de células sendo analisadas como um todo.

[00349] Geralmente, as células nos 2, 3, 4 ou 5% a mais da intensidade de coloração são designadas “hi”, com aquelas caindo na metade superior da população categorizada como sendo “+”. Essas células que caem abaixo de 50% da intensidade de fluorescência são designadas como células

“lo” e abaixo de 5% como células “-”.

[00350] O nível de expressão do marcador de célula de interesse é determinado comparando a intensidade de fluorescência mediana (MFI) das células da população de células coradas com anticorpo rotulado fluorescentemente específico para esse marcador com a intensidade de fluorescência (FI) das células da mesma célula população corada com anticorpo rotulado fluorescentemente com uma especificidade irrelevante, mas com o mesmo isotipo, a mesma sonda fluorescente e originada da mesma espécie (referida como isotipo de controle). As células da população coradas com anticorpo rotulado fluorescentemente específico para esse marcador e que mostram MFI equivalente ou um MFI inferior do que as células coradas com os isotipos de controle não estão expressando esse marcador e, então, são designadas (-) ou negativas. As células da população coradas com anticorpo rotulado fluorescentemente específico para esse marcador e que mostram um valor de MFI superior às células coradas com os isotipos de controle estão expressando esse marcador e então são designadas (+) ou positivas.

[00351] Em uma modalidade, as células da população de células Treg da invenção expressam em sua superfície celular um CAR da invenção, e outro receptor (referido nesse documento como “segundo receptor”), que se liga a outro ligando que não o IL-23R reconhecido pelo CAR da invenção.

De acordo com a invenção, esse outro receptor compreende um domínio de ligação de ligando extracelular, opcionalmente uma dobradiça, opcionalmente um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, como descrito anteriormente.

[00352] Em uma modalidade, o segundo receptor é endógeno (tal como, por exemplo, o TCR endógeno). Em outra modalidade, o segundo receptor é exógeno e sua expressão é induzida nas células da população de células Treg da invenção por transformação ou transdução de um ácido nucleico que codifica as mesmas. O referido receptor exógeno pode ser um TCR exógeno ou um CAR. Portanto, em uma modalidade, as células Treg da invenção expressam dois CARs, em que o primeiro reconhece um IL-23R e o segundo reconhece um ligando distinto. Em outra modalidade, as células Treg da invenção expressam dois CARs, em que o primeiro reconhece um primeiro epítopo em um IL-23R e o segundo reconhece um epítopo distinto no mesmo IL-23R. Em outra modalidade, as células Treg da invenção expressam dois CARs, em que o primeiro reconhece um IL-23R e o segundo reconhece um IL-23R distinto (tal como, por exemplo, uma variante de IL-23R).

[00353] Em uma modalidade, pelo menos um dos CAR da invenção e o segundo receptor (de preferência o segundo CAR) é indutível, isto é, sua expressão na superfície celular pode ser induzida.

[00354] Em uma modalidade, a expressão de um dos CAR da invenção e do segundo receptor (de preferência o segundo CAR) é induzida pela ativação do outro receptor. Em uma primeira modalidade, a expressão do CAR da invenção é induzida pela ativação do segundo receptor. Em uma segunda modalidade, a expressão do segundo receptor é induzida pela ativação do CAR da invenção. CARs induzíveis foram previamente descritos na técnica, como, por exemplo, por Roybal et al (Cell, 2006).

[00355] Em uma modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico de um antígeno, um fragmento de um antígeno, uma variante de um antígeno ou uma mistura dos mesmos.

[00356] Em uma modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico de um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00357] O termo “antígeno alimentar da dieta humana comum” se refere a um peptídeo imunogênico, que vem de artigos alimentícios comuns para humanos, tais como antígenos alimentares da seguinte lista não limitativa: antígenos bovinos, tal como lipocalina, S100 de ligação de Ca, alfa-lactalbumina, lactoglobulinas, tais como, beta- lactoglobulina, albumina de soro bovino, caseínas. Os antígenos alimentares também podem ser antígenos do salmão do atlântico, tal como parvalbumina; antígenos de frango,

tais como ovomucóide, ovalbumina, Ag22, conalbumina, lisozima ou albumina de soro de frango; antígenos de amendoim; antígenos de camarão, tal como tropomiosina; antígenos de trigo, tal como aglutinina ou gliadina; antígenos de aipo, tal como profilina de aipo; antígenos de cenoura, tal como profilina de cenoura; antígenos de maçã, tal como taumatina, proteína de transferência de lipídeos de maçã ou profilina de maçã; antígenos de pera, tal como profilina de pera ou isoflavona redutase; antígenos de abacate, tal como endocitinase; antígenos de damasco, tal como proteína de transferência de lipídeos de damasco; antígenos de pêssego, tal como proteína de transferência de lipídeos de pêssego ou profilina de pêssego; antígenos de soja, tal como HPS, profilina de soja ou (SAM22) PR-I0 prot; fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00358] Em outra modalidade, o segundo receptor, de preferência, o segundo CAR, é específico de um autoantígeno, tal como, por exemplo, um antígeno associado à esclerose múltipla, um antígeno associado à articulação, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD.

[00359] Exemplos de antígenos associados à esclerose múltipla incluem, mas não estão limitados a, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína associada à mielina (MAG),

glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP), oligoproteína de oligodendrócito de mielina (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada à mielina (MOBP), proteína específica de oligodendrócito proteína de choque térmico de oligodendrócitos (OSP/Claudina l), proteínas de choque térmico, proteínas específicas de oligodendrócitos (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22 (PMP22), nucleotídeo 3'- fosfodiesterase 2’3’-cíclico (CNPase), fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00360] Exemplos de antígenos associados à articulação incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de filagrina cíclicos e lineares substituídos por citrulina, peptídeos de colágeno tipo II, peptídeos de glicoproteína de cartilagem humana 39 (HCgp39), HSP, ribonucleoproteína nuclear heterogênea (hnRNP), peptídeos A2, hnRNP B1 , hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 e HSP90, BiP, queratina, vimentina, fibrinogênio, peptídeos de colágeno tipo I, III, IV e V, anexina V, glicose 6 fosfato isomerase (GPI), acetil- calpastatina, piruvato desidrogenase (PDH), aldolase, topoisomerase I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, antígenos de fosfolipídios, incluindo cardiolipina aniônica e fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina de carga neutra e fosfatidilcolina, metaloproteinase matriz, fibrilina, agracana, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

Outros exemplos de antígenos associados às articulações incluem, mas não estão limitados a, vimentina citrulinada, colágeno citrulinado tipo II, fibrinogênio citrulinado.

[00361] Exemplos de antígenos associados ao olho incluem, mas não estão limitados a, colágeno tipo II, arrestina retinal, S-arrestina, proteínas de ligação de retinóide interfotorreceptor (IRBP1), beta-cristalina B1, proteínas retinais, proteínas coróides e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00362] Exemplos de antígenos de HSP humanos incluem, mas não estão limitados a, HSP60, HSP70, HSP90 humano, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00363] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno associado a uma condição inflamatória do sistema nervoso, de preferência um antígeno associado à esclerose múltipla.

Exemplos de antígenos associados à condição do sistema nervoso inflamatório, de preferência de antígenos associados à esclerose múltipla incluem, mas não estão limitados a, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína associada a mielina (MAG), proteína de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP), oligoproteína de oligodendrócito de mielina (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada à mielina (MOBP), proteína específica de oligodendrócito (OSP/Claudinl 1), proteínas de choque térmico, proteínas específicas de oligodendrócito

(OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22 (PMP22), nucleotídeo 3'-fosfodiesterase 2’3’- cíclico (CNPase), fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00364] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno associado à pele. Exemplos de antígenos associados à pele incluem, mas não estão limitados a, antígenos de queratinócitos, um antígeno presente na derme ou epiderme, um antígeno de melanócitos (tal como, por exemplo, melanina ou tirosinase), desmogleína (por exemplo, desmogleína 1 ou 3, que também pode ser referido como Dsg1/3), BP180, BP230, plectina, integrinas (por exemplo, integrina a4b6), colágenos (por exemplo, colágeno tipo VII), lamininas (por exemplo, laminina 332 ou laminina g1), plaquinas (por exemplo, envoplaquina, periplaquina ou desmoplaquinas), queratinas (por exemplo, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 e KRT31), proteínas associadas a filamento de queratina, filagrina, corneodesmosina e elastina.

[00365] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD. Exemplos de tais antígenos incluem a, mas não estão limitados à, MHC específica para o tecido transplantado ou para o hospedeiro, b2-microglobulina, antígenos do sistema ABO, antígenos do sistema rhesus (em particular antígenos do sistema C, c, E et e D) e isohemaglutininas. Outros exemplos de antígenos que podem estar envolvidos na rejeição do enxerto ou GVHD incluem, mas não estão limitados a, HLA-DR (em particular durante os primeiros seis meses após o enxerto), HLA-B (em particular durante os primeiros dois anos após o enxerto), HLA-A, antígenos de histocompatibilidade menores (miHA, por exemplo, HLA-E, HLA-F e HLA-G), HLAs correspondentes a MHC classe I (A, B e C), HLAs correspondentes à MHC classe II (DP, DM , DOA, DOB, DQ e DR) e HLAs correspondentes à MHC classe III (por exemplo, componentes do sistema de complemento).

[00366] Em uma modalidade, o antígeno é uma proteína de superfície da célula HLA-A2. Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular compreende um anticorpo direcionado para HLA-A2 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00367] O termo “HLA-A2”, como usado nesse documento, se refere a proteínas de antígeno leucocitário humano (HLA), incluindo proteínas de superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*02 no locus HLA-A do complexo de gene de HLA. As proteínas de HLA abrangidas pelo termo “HLA- A2” incluem proteínas de HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*02 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA- A*02 incluem “HLA-A2”, “HLA-A02 e “HLA-A*2”. Diferentes sistemas de nomenclatura foram desenvolvidos para identificar proteínas de HLA codificadas por essa família de alelos, incluindo o sistema de nomenclatura de HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê da OMS para Fatores do Sistema de HLA. O termo “HLA-A2” se refere a proteínas de HLA codificadas por alelos tendo designações de acordo com esse sistema de nomenclatura que começa com “HLA-A*02”, incluindo, mas não se limitando a, designações que começam com “HLA-A*02:01”, “HLA-A*02:02”, “HLA-A*02:03”, “HLA- A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA- A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-A*02:10”, e “HLA-A*02:11”. As designações de alelos podem estar em itálico. As designações de alelos que começam com “HLA-A*02:” seguidas de 2 ou 3 dígitos adicionais podem constituir a designação completa ou uma porção inicial da designação. O termo “HLA-A2” também se refere a proteínas de HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*02” de acordo com esse sistema de nomenclatura, incluindo, mas não se limitando às designações “HLA-A*02:01”, “HLA-A*02:02”, “HLA-A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-A*02:10” e “HLA-A*02:11”.

[00368] Outros exemplos de autoantígenos incluem, sem limitação, canais de água de aquaporina (tal como, por exemplo, canal de água aquaporina-4 (AQP4)), Hu, Ma2, proteína mediadora de resposta de colapsina 5 (CRMP5) e anfifisina, canal de potássio controlado por voltagem (VGKC), receptor de N-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido a-

amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropriônico (AMPAR),

peroxidase tireoidiana, tireoglobulina, receptor de anti-N-

metil-D-aspartato (subunidade NR1), antígenos do grupo sanguíneo Rh, antígeno I, desmogleína 1 ou 3 (Dsg1/3), BP180,

BP230, receptores pós-sinápticos nicotínicos de acetilcolina, receptores de tireotropina, integrantes de plaquetas, GpIIb:IIIa, colágeno (tal como, por exemplo,

cadeia de colágeno alfa-3 (IV)), fator reumatoide,

calpastatina, proteínas citrulinadas, proteína básica de mielina (MBP), peptídeos de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), alfa-beta-cristalina,

DNA, histona, ribossomos, RNP, transglutaminase de tecido

(TG2), fator intrínseco, antígeno de 65 kda,

fosfatidilserina, fosfoproteínas ribossomais, anticorpo citoplasmático anti-neutrófilos, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA,

anti-SSB, anticorpos antinucleares (ANA), anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), Jo-1, anticorpos antimitocondriais, gp210, p62, sp100, anticorpos antifosfolipídeos, SnRNP U1 de 70 kd, gangliosídeo GQ1b,

GM1, asialo GM1, GD1b, anticorpos anti-músculo liso (ASMA),

anticorpos microssoma-1 anti-fígado-rim (ALKM-1), anticorpo anticitosol hepático-1 (ALC-1), anticorpos antiendomisiais

IgA, proteínas de grânulos de neutrófilos, antígeno de parede celular estreptocócica, fator intrínseco de células parietais gástricas, insulina (IAA), descarboxilase do ácido glutâmico (GAA ou GAD) e proteína tirosina fosfatase (tal como, por exemplo, IA2 ou ICA512), PLA2R1 e THSD7A1.

[00369] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno de câncer.

[00370] Como usado nesse documento, o termo “antígeno de câncer” se refere a antígenos que são expressados diferencialmente por células cancerígenas e podem, portanto, ser explorados a fim de ter como alvo as células cancerígenas. Os antígenos de câncer são antígenos que podem estimular potencialmente respostas imunológicas aparentemente específicas do tumor. Alguns desses antígenos são codificados, embora não necessariamente expressados, por células normais. Esses antígenos podem ser caracterizados como aqueles que são normalmente silenciosos (isto é, não expressados) em células normais, aqueles que são expressados apenas em certos estágios de diferenciação e aqueles que são expressados temporalmente, tais como antígenos embrionários e fetais. Outros antígenos de câncer são codificados por genes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene ras ativado), genes supressores (por exemplo, p53 mutante) e proteínas de fusão resultantes de eliminações internas ou translocações cromossômicas. Ainda outros antígenos de câncer podem ser codificados por genes virais, tais como aqueles transportados em RNA e DNA de vírus de tumor. Muitos antígenos tumorais foram definidos em termos de múltiplos tumores sólidos: MAGE 1, 2 e 3, definido por imunidade; MART-l/Melan-A, gp100, antígeno carcinoembrionário (CEA), HER2, mucinas (isto é, MUC-1), antígeno específico da próstata (PSA) e fosfatase ácida prostática (PAP). Além disso, as proteínas virais, tais como algumas codificadas pela hepatite B (HBV), Epstein-Barr (EBV) e papiloma humano (HPV), mostraram ser importantes no desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, linfoma e câncer cervical, respectivamente.

[00371] Outros antígenos de câncer incluem, mas não estão limitados a, 707-AP (alanina prolina707), AFP (alfa(a)-fetoproteína), ART-4 (antígeno de adenocarcinoma reconhecido por células T4), BAGE (antígeno B; b-catenina/m, b-catenina/mutado), BCMA (antígeno de maturação de células B), Bcr-abl (região de agrupamento do ponto de interrupção- Abelson), CAIX (anidrase carbônica IX), CD19 (agrupamento de diferenciação 19), CD20 (agrupamento de diferenciação 20), CD22 (agrupamento de diferenciação 22), CD30 (agrupamento de diferenciação 30), CD33 (agrupamento de diferenciação 33), CD44v7/8 (agrupamento de diferenciação 44, éxons 7/8), CAMEL (antígeno reconhecido por CTL no melanoma) , CAP-1 (peptídeo de antígeno carcinoembrionário-1), CASP-8 (caspase-8), CDC27m (ciclo de divisão celular 27 mutado), CDK4/m (mutação de quinase 4 dependente de ciclina), CEA (antígeno carcinoembrionário), CT (câncer/testículo (antígeno)), Cyp-

B (ciclofilina B), DAM (antígeno de diferenciação de melanoma), EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), EGFRvlll (receptor do fator de crescimento epidérmico, variante III), EGP-2 (glicoproteína epitelial

2), EGP-40 (glicoproteína epitelial 40), Erbb2, 3, 4

(oncogene viral de leucemia eritroblástica homólogo-2, -3,

4), ELF2M (fator de alongamento 2 mutado), ETV6-AML1 (gene variante Ets 6/gene da leucemia mieloide aguda 1 ETS), FBP

(proteína de ligação ao folato), fAchR (receptor fetal de acetilcolina), G250 (glicoproteína 250), GAGE (antígeno G),

GD2 (disialogangliosídeo 2), GD3 (disialogangliosídeo 3),

GnT-V (N-acetilglucosaminiltransferase V), Gp100

(glicoproteína de 100 kd), HAGE (antígeno de helicose), HER-

2/neu (receptor epidérmico humano 2/neurológico; também conhecido como EGFR2), HLA-A (antígeno leucocitário humano-

A) HPV (vírus do papiloma humano), HSP70-2M (proteína de choque térmico 70 -2 mutada), HST-2 (tumor de anel de sinete de humano - 2), hTERT ou hTRT (transcriptase reversa da telomerase de humano), iCE (carboxil esterase intestinal),

IL-13R-a2 (subunidade alfa-2 do receptor de lnterleucina-

13), KIAA0205, KDR (receptor do domínio de inserção da quinase), cadeia leve k, LAGE (antígeno L), LDLR/FUT

(receptor de lipídios de baixa densidade/GDP-L-fucose: bD-

galactosidase 2-a-Lfucosiltransferase), LeY (anticorpo de

Lewis-Y), L1 CAM (molécula de adesão de células L1), MAGE

(antígeno de melanoma), MAGE-A1 (antígeno associado a melanoma 1), mesotelina, células infectadas por CMV de murino, MART-1/Melan-A (antígeno de melanoma reconhecido por células T-I/antígeno de melanoma A), MC1 R (receptor de melanocortina 1), miosina/m (miosina mutada), MUC1 (mucina

1), MUM-1, -2, -3 (melanoma ubíquo mutado 1, 2, 3), NA88-A

(clone de cDNA NA do paciente M88), ligandos NKG2D (grupo exterminador natural 2, membro D), NY-BR-1 (antígeno de diferenciação de mama 1 de Nova Iorque), NY-ESO-1 (carcinoma de células escamosas de esôfago de Nova York), antígeno oncofetal (h5T4), P15 (proteína 15), p190 menor bcr-abl

(proteína bcr-abl de 190KD), Pml/RARa (leucemia promielocítica/receptor de ácido retinóico a), PRAME

(antígeno expressado de preferência de melanoma), PSA

(antígeno específico da próstata), PSCA (antígeno de células-tronco da próstata), PSMA (antígeno de membrana específica da próstata), RAGE (antígeno renal), RU1 ou RU2

(renal ubíquo 1 ou 2), SAGE (antígeno de sarcoma), SART-1 ou

SART-3 (tumor de rejeição de antígeno escamoso 1 ou 3), SSX1,

-2, -3, 4 (sarcoma sinovial X1, -2, -3, -4), TAA (antígeno associado a tumor), TAG-72 (glicoproteína associada a tumor

72), TEL/AML1 (translocação de leucemia da família

Ets/leucemia mieloide aguda 1), TPI/m (triosefosfato isomerase mutado) , TRP-1 (proteína relacionada à tirosinase

1 ou gp75), TRP-2 (proteína relacionada à tirosinase 2),

TRP-2/INT2 (TRP-2/íntron 2), VEGF-R2 (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2), ou WT1 (gene do tumor de Wilms).

[00372] Em uma modalidade, o antígeno está associado a células infectadas.

[00373] Como usado nesse documento, o termo “células infectadas” se refere a células contaminadas com algo que afeta sua qualidade, seu caráter ou sua condição desfavoravelmente.

[00374] Em uma modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por vírus. Em outra modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por bactérias.

Em outra modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por fungos. Em outra modalidade, o antígeno está associado a células infectadas por parasitas.

[00375] Em outra modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico de um alérgeno inalado, um alérgeno ingerido ou um alérgeno de contato.

[00376] Em uma modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico de um antígeno selecionado do grupo que compreende ovalbumina, MOG, fragmentos de colágeno tipo II, variantes e misturas dos mesmos.

[00377] Em uma modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico de ovalbumina,

fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00378] Em outra modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico de MOG, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00379] Em outra modalidade, o segundo receptor, de preferência o segundo CAR, é específico do colágeno tipo II, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00380] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um primeiro domínio de sinalização intracelular e o segundo receptor compreende um segundo domínio de sinalização intracelular distinto. Em uma primeira modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de sinalização primário de células T (tal como, por exemplo, CD3 zeta), e o segundo receptor compreende um domínio de sinalização coestimulador (tal como, por exemplo, de 4-1BB, CD28 ou uma combinação de domínio de sinalização coestimulador de 4-1BB e CD28). Em uma segunda modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de sinalização coestimulador (tal como, por exemplo, de 4-1BB, CD28 ou uma combinação de domínio de sinalização coestimulador de 4-1BB e CD28), e o segundo receptor compreende um domínio de sinalização primário da célula T (como, por exemplo, CD3 zeta).

[00381] Consequentemente, de acordo com essas modalidades, a ativação completa da população de células

Treg da invenção requer a ligação do CAR da invenção ao IL- 23R e a ligação do segundo receptor ao ligando ao qual é direcionado.

[00382] Em uma modalidade, o ligando reconhecido pelo segundo receptor é expressado ou está presente no tecido ou órgão doente, ou no sítio da resposta autoimune.

Consequentemente, a atividade supressora para células que expressam IL-23R será induzida apenas no tecido ou órgão doente ou no sítio da resposta autoimune, quando o referido ligando estiver presente e reconhecido pelo segundo receptor nas células da população de células Treg.

[00383] Em uma modalidade, o receptor quimérico da invenção compreende adicionalmente um domínio de ligação de ligando extracelular que reconhece um ligando distinto do IL-23R reconhecido pelo receptor quimérico. Em uma modalidade, o referido domínio de ligação de ligando é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00384] Em uma modalidade, o receptor quimérico da invenção compreende um domínio de ligação de ligante extracelular que compreende um domínio de ligação de IL-23R e outro domínio de ligação de ligante que reconhece um ligando distinto do referido IL-23R. Em uma modalidade, o referido domínio de ligação de ligando é um anticorpo bifuncional que reconhece o IL-23R e o ligando distinto.

[00385] Em uma modalidade, a população de células Treg é obtida por diferenciação in vitro de células T naïve.

[00386] A presente invenção também se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR como descrito acima, em que a referida sequência de ácidos nucleicos compreende (i) uma sequência de ácidos nucleicos de um domínio de ligação extracelular de IL-23R, (ii) opcionalmente uma sequência de ácidos nucleicos de um domínio de dobradiça extracelular, (iii) opcionalmente, uma sequência de ácidos nucleicos de um domínio transmembranar, (iv) uma ou mais de sequência(s) de ácido nucleico de n domínio de sinalização intracelular e (v) opcionalmente uma sequência de ácidos nucleicos de uma Etiqueta e/ou uma sequência líder.

[00387] Outro objeto da invenção é um vetor que compreende a sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR como descrito acima.

[00388] Exemplos de vetores que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus animal e um cosmídeo.

[00389] A tecnologia de vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al.

(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque) e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores, incluem, mas não estão limitados a, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes e lentivírus.

[00390] Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios de endonuclease de restrição convenientes e um ou mais de marcadores selecionáveis, (por exemplo, WO01/96584; WO01/29058; e US 6.326.193 incorporados nesse documento por referência).

[00391] Vários sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para transferência de genes para células de mamíferos. Por exemplo, os retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de dispensação de genes. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e acondicionado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e dispensado às células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Vários sistemas retrovirais são conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades, vetores de adenovírus são usados.

Vários vetores de adenovírus são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, vetores de lentivírus são usados.

[00392] Elementos transcricionalmente ativos adicionais, por exemplo, promotores e intensificadores, podem regular a frequência de iniciação da transcrição.

Tipicamente, em relação à promoção de núcleo, esses estão localizados na região 30-110 bp a montante do sítio de início, embora um número de promotores tenha recentemente demonstrado conter elementos funcionais a jusante do sítio de partida também, e os elementos potencializadores estão geralmente localizados a 500-2000bp a montante do sítio de partida. O espaçamento entre os elementos do promotor frequentemente é flexível, de modo que a função do promotor seja preservada quando os elementos são invertidos ou movidos uns em relação aos outros. No promotor da timidina quinase (tk), o espaçamento entre os elementos do promotor pode ser aumentado para 50 bp antes que a atividade comece a diminuir.

Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição.

[00393] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência do promotor do citomegalovírus inicial imediato (CMV). Essa sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de conduzir a níveis altos de expressão de qualquer sequência de polinucleotídeos ligada operacionalmente à mesma. Outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de crescimento de alongamento - la (EF- la). Outro exemplo de um promotor adequado é o promotor da fosfoglicerato quinase (PGK). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também podem ser usadas, incluindo o, mas não se limitando ao, promotor inicial do vírus símio

40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência de humano (HIV), promotor MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor precoce imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos, tais como, mas não se limitando a, o promotor da actina, o promotor da miosina, o promotor da hemoglobina e o promotor da creatina quinase. Além disso, a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção.

O uso de um promotor induzível proporciona um comutador molecular capaz de ligar a expressão da sequência de polinucleotídeos à qual está operacionalmente ligado quando tal expressão é desejada, ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores indutíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticóide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina. Além disso, os promotores bidirecionais que permitem a expressão eficaz e coordenada de dois ou mais de genes também podem ter interesse na presente invenção. Exemplos de promotores bidirecionais incluem, mas não estão limitados aos, promotores descritos por Luigi Naldini em US2006200869, incorporado nesse documento por referência, divulgando um promotor bidirecional compreendendo i) uma primeira sequência promotora mínima derivada de citomegalovírus (CMV) ou genomas de vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV) e ii) uma sequência promotora totalmente eficaz derivada de um gene animal.

[00394] De modo a avaliar a expressão de um polipeptídeo de CAR ou porções do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula T também pode conter um gene marcador selecionável, tal como CD34 ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e a seleção de células expressoras da população de células que buscou ser transfectada ou infectada por meio de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção. Os marcadores selecionáveis e os genes repórteres podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir a expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes resistentes a antibióticos, tais como neo e semelhantes.

[00395] Em algumas modalidades da invenção, a tecnologia do gene suicida pode ser usada. Diferentes tecnologias de genes suicidas são descritas na técnica, dependendo de seu mecanismo de ação (Jones et al. Frontiers in Pharmacology, 2014 (5): 254). Exemplos de terapia com pró-fármaco enzimático direcionado por genes (GDEPT) convertendo um fármaco não tóxico em um fármaco tóxico incluem timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-TK) e citosina desaminase (CD). Outros exemplos são proteínas quiméricas compostas por um domínio de ligação de fármaco ligado a componentes apoptóticos, tal como, por exemplo, os sistemas indutíveis Fas (iFas) ou Caspase 9 (iCasp9). Outros exemplos incluem sistemas mediados por anticorpos terapêuticos, tal como a indução da superexpressão de c-myc na superfície da célula manipulada para induzir sua eliminação por administração de um anticorpo anti-c-myc. O uso de EGFR é descrito como um sistema similar em comparação com o sistema c-myc. Em uma modalidade, a tecnologia do gene suicida usada é a tecnologia descrita em WO2013153391 ou WO2016120216 (incorporada nesse documento por referência).

WO2013153391 descreve um polipeptídeo que compreende uma porção marcadora (tal como, por exemplo, um epítopo mínimo de CD34) e uma porção suicida, em que a porção suicida compreende um epítopo mínimo com base em um epítopo do CD20, de modo que as células que expressam o referido polipeptídeo podem ser seletivamente mortas usando um anticorpo lítico, tal como, por exemplo, Rituximab. Mais particularmente, o referido peptídeo pode ter a fórmula St-R1-S1-Q-S2-R2, em que St é uma sequência de pedúnculo que, quando o polipeptídeo é expressado na superfície de uma célula alvo,

faz com que os epítopos R e Q sejam projetados da superfície da célula; R1 e R2 são um epítopo de ligação de Rituximab; S1 e S2 são sequências espaçadoras opcionais, que podem ser iguais ou diferentes; e Q é um epítopo de ligação de QBEND-

10. Um exemplo desse peptídeo é a SEQ ID NO: 76:

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP

APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSL VITLYCNHRNRRRVCKCPRPW. WO2016120216 descreve um CAR compreendendo um domínio de ligação extracelular (scFv) modificado para permitir a classificação celular e a depleção celular, em que a referida modificação consiste na inserção de um ou mais de epítopos selecionados dentro do scFv, os referidos epítopos tendo uma especificidade para serem reconhecidos por um ou mais de anticorpo(s) específicos(s).

Em particular, o referido epítopo selecionado pode ser um epítopo de CD20, de modo que as células que expressam o referido CAR possam ser seletivamente mortas usando um anticorpo lítico, tal como, por exemplo, Rituximab.

[00396] Genes repórteres são usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente ou é expressado pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é testada em um momento adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras. Genes repórteres adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina secretadada ou o gene da proteína fluorescente verde (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Os sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, a construção com a região flanqueadora 5’ mínima mostrando o nível mais alto de expressão do gene repórter é identificada como o promotor. Essas regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar os agentes quanto à capacidade de modular a transcrição conduzida pelo promotor.

[00397] Os métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bactéria, levedura ou inseto por qualquer método na técnica.

Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[00398] Os métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e semelhantes. Os métodos para a produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica.

Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque). Um método preferido para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira é a transfecção com fosfato de cálcio.

[00399] Os métodos biológicos para a introdução de um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Os vetores virais e, especialmente, os vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserir genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus de herpes simplex I, adenovírus e vírus adenoassociados e semelhantes. Ver, por exemplo, US 5.350.674 e 5.585.362.

[00400] Os meios químicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como, complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microgrânulos, grânulos e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal de exemplo para uso como veículo de dispensação in vitro e in vivo é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).

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[00402] No caso em que um sistema de dispensação não viral é utilizado, um veículo de dispensação de exemplo é um lipossoma. O uso de formulações lipídicas é contemplado para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode estar associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídio pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossoma, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossoma, ligado a um lipossoma por meio de uma molécula de ligação que está associada ao lipossoma e ao oligonucleotídeo, aprisionado em um lipossoma, complexado com um lipossoma, dispersado em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela, ou então associado a um lipídeo.

As composições associadas a lipídios, lipídios/DNA ou lipídios/vetores de expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura “colapsada”. Eles também podem ser simplesmente intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma.

Os lipídeos são substâncias graxas que podem ocorrer naturalmente ou lipídeos sintéticos. Por exemplo, os lipídios incluem as gotículas graxas de ocorrência natural no citoplasma, bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos.

[00403] Os lipídios adequados para uso podem ser obtidos de fontes comerciais. Por exemplo, a dimiristilfosfatidilcolina (“DMPC”) pode ser obtida na Sigma, St. Louis, MO; dicetil fosfato (“DCP”) pode ser obtido em K & K Laboratories (Plainview, NY); o colesterol (“Choi”) pode ser obtido na Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol (“DMPG”) e outros lipídios podem ser obtidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). As soluções de carga de lipídios em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20 °C.

O clorofórmio é usado como o único solvente, uma vez que é mais facilmente evaporado do que o metanol. “Lipossoma” é um termo genérico que engloba uma variedade de veículos lipídicos unilamelares e multilamelares formados pela geração de bicamadas ou agregados de lipídios fechados. Os lipossomas podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bicamada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Os lipossomas multilamelares têm múltiplas camadas de lipídios separadas por meio aquoso.

Eles se formam espontaneamente quando os fosfolipídios são colocados em suspensão em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). No entanto, composições que possuem estruturas em solução diferentes da estrutura vesicular normal também são abrangidas. Por exemplo, os lipídios podem assumir uma estrutura micelar ou simplesmente existir como agregados não uniformes de moléculas de lipídios. Também são contemplados os complexos lipofectamina-ácido nucleico.

[00404] Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de “biologia molecular” bem conhecidos pelos habilitados na técnica, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; ensaios “bioquímicos”, tal como detectar a presença ou a ausência de um determinado peptídeo, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por ensaios descritos nesse documento para identificar os agentes que se enquadram no escopo da invenção.

[00405] Em uma modalidade, as células T da invenção são modificadas através da introdução de RNA. Em uma modalidade, um CAR de RNA transcrito in vitro pode ser introduzido em uma célula como uma forma de transfecção transitória. O RNA é produzido por transcrição in vitro usando um modelo gerado por reação em cadeia da polimerase (PCR). O DNA de interesse de qualquer fonte pode ser convertido diretamente por PCR em um molde para a síntese de mRNA in vitro usando iniciadores apropriados e RNA polimerase. A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA genômico, DNA de plasmídeo, DNA de fago, cDNA, sequência de DNA sintético ou qualquer outra fonte apropriada de DNA. O molde desejado para a transcrição in vitro é o CAR da presente invenção.

[00406] Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR contém uma fase de leitura aberta. O DNA pode ser de uma sequência de DNA de ocorrência natural do genoma de um organismo. Em uma modalidade, o DNA é um gene de interesse de comprimento total ou uma porção de um gene. O gene pode incluir algumas ou todas as regiões 5’ e/ou 3’ não traduzidas (UTRs). O gene pode incluir éxons e íntrons. Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR é um gene humano. Em outra modalidade, o DNA a ser usado para PCR é um gene humano incluindo as UTRs 5’ e 3’. O DNA pode, alternativamente, ser uma sequência de DNA artificial que normalmente não é expressada em um organismo de ocorrência natural. Uma sequência de DNA artificial de exemplo é aquela que contém porções de genes que são ligadas entre si para formar uma fase de leitura aberta que codifica uma proteína de fusão.

As porções de DNA que são ligadas entre si podem ser de um único organismo ou de mais de um organismo.

[00407] A PCR é usada para gerar um molde para a transcrição in vitro de mRNA que é usado para transfecção.

Os métodos para realizar PCR são bem conhecidos na técnica.

Os iniciadores para uso em PCR são concebidos para terem regiões que são substancialmente complementares às regiões do DNA a serem usadas como um molde para a PCR.

“Substancialmente complementar”, como usado nesse documento, se refere a sequências de nucleotídeos em que a maioria ou todas as bases na sequência de iniciadores são complementares, ou uma ou mais bases são não complementares ou incompatíveis. Sequências substancialmente complementares são capazes de anelar ou hibridizar com o alvo de DNA pretendido sob condições de anelamento usadas para PCR. Os iniciadores podem ser concebidos para serem substancialmente complementares a qualquer porção do molde de DNA. Por exemplo, os iniciadores podem ser concebidos para amplificar a porção de um gene que é normalmente transcrito nas células (a fase de leitura aberta), incluindo UTRs 5’ e 3’. Os iniciadores também podem ser concebidos para amplificar uma porção de um gene que codifica um domínio de interesse particular. Em uma modalidade, os iniciadores são projetados para amplificar a região de codificação de um cDNA humano, incluindo todas ou porções das UTRs 5’ e 3’. Os iniciadores úteis para PCR são gerados por métodos sintéticos que são bem conhecidos na técnica.

[00408] “Iniciadores diretos” são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos nucleotídeos no molde de DNA que estão a montante da sequência de DNA que deve ser amplificada. “A montante” é usado nesse documento para se referir a uma localização 5’, para a sequência de DNA a ser amplificada em relação à fita de codificação. “Iniciadores reversos” são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a um molde de DNA de fita dupla que está a jusante da sequência de DNA que deve ser amplificada. “A jusante” é usado nesse documento para se referir a uma localização 3’ para a sequência de DNA a ser amplificada em relação à fita de codificação.

[00409] Qualquer DNA polimerase útil para PCR pode ser usada nos métodos divulgados nesse documento. Os reagentes e a polimerase estão disponíveis comercialmente em várias fontes.

[00410] Estruturas químicas com a capacidade de promover estabilidade e/ou eficiência de tradução também podem ser usadas. O RNA, de preferência, tem UTRs 5’ e 3’.

Em uma modalidade, a UTR 5’ está entre zero e 3000 nucleotídeos de comprimento. O comprimento das sequências UTR 5’ e 3’ a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterado por diferentes métodos, incluindo, mas não se limitando a, conceber iniciadores para PCR que se anelam a diferentes regiões das UTRs. Usando essa abordagem, um habilitado comum na técnica pode modificar os comprimentos UTR 5’ e 3’ necessários para ter como alvo a eficácia de tradução ideal após a transfecção do RNA transcrito. As UTRs 5’ e 3’ podem ser as UTRs 5’ e 3’ endógenas de ocorrência natural para o gene de interesse. Alternativamente, as sequências de UTR que não são endógenas ao gene de interesse podem ser adicionadas incorporando as sequências de UTR nos iniciadores direto e reverso ou por quaisquer outras modificações do molde. O uso de sequências de UTR que não são endógenas ao gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficácia de tradução do RNA.

Por exemplo, sabe-se que elementos ricos em AU em sequências de UTR 3’ podem diminuir a estabilidade do mRNA. Portanto, as UTRs 3’ podem ser selecionadas ou concebidas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base nas propriedades das UTRs que são bem conhecidas na técnica.

[00411] Em uma modalidade, a UTR 5’ pode conter a sequência Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando uma UTR 5’ que não é endógena ao gene de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito acima, uma sequência de consenso Kozak pode ser redesenhada adicionando a sequência de UTR 5’. As sequências Kozak podem aumentar a eficácia da tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parece ser necessária para todos os RNAs para permitir uma tradução eficaz. O requisito de sequências Kozak para muitos mRNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades, a UTR 5’ pode ser derivada de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável nas células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeos podem ser usados na UTR 3’ ou 5’ para impedir a degradação da exonuclease do mRNA.

[00412] Para permitir a síntese de RNA a partir de um molde de DNA sem a necessidade de clonagem de genes, um promotor de transcrição deve ser afixado ao molde de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Quando uma sequência que funciona como um promotor para uma RNA polimerase é adicionada à extremidade 5’ do iniciador direto, o promotor da RNA polimerase torna-se incorporado no produto de PCR a montante da fase de leitura aberta que deve ser transcrito.

Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor da polimerase T7, como descrito em outro lugar nesse documento.

Outros promotores úteis incluem, mas não estão limitados a, promotores da polimerase de RNA T3 e SP6. As sequências de nucleotídeos de consenso para os promotores T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica.

[00413] Em uma modalidade, o mRNA tem uma capa na extremidade 5’ e uma cauda poli(A) 3’ que determinam a ligação ao ribossomo, o início da tradução e a estabilidade do mRNA na célula. Em um molde de DNA circular, por exemplo, DNA de plasmídeo, a RNA polimerase produz um produto concatemérico longo que não é adequado para expressão em células eucarióticas. A transcrição do DNA de plasmídeo linearizado na extremidade da UTR 3’ resulta em mRNA de tamanho normal que não é eficaz na transfecção eucariótica, mesmo se for poliadenilado após a transcrição.

[00414] Em um molde de DNA linear, o fago T7 RNA polimerase pode estender a extremidade 3’ do transcrito além da última base do molde (Schenborn e Mierendorf, Nuc Acids Res., 13: 6223-36 (1985); Nacheva e Berzal-Herranz, Eur. J.

Biochem., 270: 1485-65 (2003).

[00415] O método convencional de integração de trechos poliA/T em um molde de DNA é a clonagem molecular.

No entanto, a sequência poliA/T integrada no DNA do plasmídeo pode causar instabilidade do plasmídeo, razão pela qual os moldes de DNA do plasmídeo obtidos de células bacterianas são frequentemente altamente contaminados com eliminações e outras aberrações. Isso torna os procedimentos de clonagem não apenas trabalhosos e demorados, mas frequentemente não confiáveis. É por isso que um método que permite a construção de moldes de DNA com trecho poliA/T 3’ sem clonagem é altamente desejável.

[00416] O segmento poliA/T do molde de DNA transcricional pode ser produzido durante a PCR usando um iniciador reverso contendo uma cauda polyT, tal como a cauda 100T (o tamanho pode ser 50-5000 T), ou após PCR por qualquer outro método, incluindo, mas não se limitando a, ligação de DNA ou recombinação in vitro. Caudas poli(A) também fornecem estabilidade a RNAs e reduzem sua degradação. Geralmente, o comprimento de uma cauda poli(A) se correlaciona positivamente com a estabilidade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda poli(A) está entre 100 e 5000 adenosinas.

[00417] As caudas poli(A) de RNAs podem ser ainda estendidas após a transcrição in vitro com o uso de uma poli(A) polimerase, como polimerase poliA de E. coli (E- PAP). Em uma modalidade, aumentar o comprimento de uma cauda poli(A) de 100 nucleotídeos para entre 300 e 400 nucleotídeos resulta em um aumento de cerca de duas vezes na eficiência de tradução do RNA. Adicionalmente, a afixação de diferentes grupos químicos à extremidade 3’ pode aumentar a estabilidade do mRNA. Tal anexo pode conter nucleotídeos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda poli(A) usando poli(A) polimerase. Os análogos de ATP podem aumentar ainda mais a estabilidade do RNA.

[00418] As capas 5’ em RNAs também fornecem estabilidade às moléculas de RNA. Em uma modalidade preferida, os RNAs produzidos pelos métodos divulgados nesse documento incluem uma capa 5’. A capa 5’ é fornecida usando técnicas conhecidas na técnica e descritas nesse documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29: 436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7: 1468- 95 (2001); Elango, et ai, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330: 958-966 (2005)).

[00419] Os RNAs produzidos pelos métodos divulgados nesse documento também podem conter uma sequência do sítio de entrada do ribossomo interno (IRES). A sequência do IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossômica ou concebida artificialmente que inicia a ligação do ribossomo independente da capa ao mRNA e facilita a iniciação da tradução. Quaisquer solutos adequados para eletroporação celular, que podem conter fatores que facilitam a permeabilidade e a viabilidade celular, tais como, açúcares, peptídeos, lipídios, proteínas, antioxidantes e tensoativos podem ser incluídos.

[00420] O RNA pode ser introduzido em células alvo usando qualquer um de uma série de métodos diferentes, por exemplo, métodos disponíveis comercialmente que incluem, mas não estão limitados a, eletroporação (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colônia, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) ou o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colorado), Multiporator (Eppendort,

Hamburgo Alemanha), transfecção mediada por lipossoma catiônico usando lipofecção, encapsulação de polímero, transfecção mediada por peptídeo ou sistemas de biolística de dispensação de partículas, tais como “pistolas de genes” (ver, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8): 861-70 (2001).

[00421] Em uma modalidade, as sequências de CAR são dispersadas nas células usando um vetor retroviral ou lentiviral. Os vetores retrovirais e lentivirais que expressam CAR podem ser dispensados em diferentes tipos de células eucarióticas, bem como em tecidos e organismos inteiros usando células transduzidas como transportadores ou dispensação local ou sistêmica livre de células de vetores encapsulados, ligados ou nus. O método usado pode ser para qualquer finalidade em que a expressão estável seja necessária ou suficiente.

[00422] Em outra modalidade, as sequências de CAR são dispensadas às células usando mRNA transcrito in vitro. O CAR de mRNA transcrito in vitro pode ser dispensado em diferentes tipos de células eucarióticas, bem como em tecidos e organismos inteiros usando células transfectadas como transportadores ou dispensação local ou sistêmica livre de células de mRNA encapsulado, ligado ou nu. O método usado pode ser para qualquer finalidade em que a expressão transitória seja necessária ou suficiente.

[00423] Em outra modalidade, o CAR desejado pode ser expressado nas células por meio de transposons.

[00424] Antes da expansão e modificação genética das células Treg da invenção, uma fonte de células T é obtida de um indivíduo. As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de nódulos linfáticos, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um sítio de infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em certas modalidades da presente invenção, qualquer número de linhas de células T disponíveis na técnica pode ser usado. Em certas modalidades da presente invenção, as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas pelo técnico habilitado na técnica, tal como separação FicollÔ. Em uma modalidade, as células do sangue circulante de uma pessoa são obtidas por aférese. O produto de aférese normalmente contém linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas.

Em uma modalidade, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por leucaferese.

[00425] Em uma modalidade, as células coletadas por leucaferese podem ser lavadas para remover a fração do plasma e para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em uma modalidade da invenção, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem carece de cálcio e pode carecer de magnésio ou pode carecer de muitos, senão todos, os cátions divalentes. Após a lavagem, as células podem ser recolocadas em suspensão em uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como, por exemplo, PBS sem Ca+2, sem Mg+2, PlasmaLyte A, ou outra solução salina com ou sem tampão.

Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de leucaferese podem ser removidos e as células diretamente recolocadas em suspensão no meio de cultura.

[00426] Em outra modalidade, as células T são isoladas de linfócitos do sangue periférico por lise dos glóbulos vermelhos e esgotamento dos monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL™ ou por elutriação centrífuga de contrafluxo. Uma subpopulação específica de células T pode ser adicionalmente isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, em uma modalidade, as células T são isoladas por incubação com grânulos conjugados com anti-CD3/anti-CD28 (isto é, 3x28), tal como T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450, por um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células T desejadas.

Em uma modalidade, o período de tempo é de cerca de 30 minutos. Em uma outra modalidade, o período de tempo varia de 30 minutos a 36 horas ou mais e todos os valores inteiros entre os mesmos. Em uma outra modalidade, o período de tempo é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Em ainda outra modalidade preferida, o período de tempo é de 10 a 24 horas.

Em uma modalidade preferida, o período de incubação é de 24 horas. Tempos de incubação mais longos podem ser usados para isolar células T em qualquer situação em que existam poucas células T em comparação com outros tipos de células. Assim, simplesmente encurtando ou alongando o tempo em que as células T podem se ligar aos grânulos CD3/CD28 e/ou aumentando ou diminuindo a razão de grânulos para células T (como descrito mais adiante nesse documento), as subpopulações de células T podem ser, de preferência, selecionadas a favor ou contra no início da cultura ou em outros momentos durante o processo. Adicionalmente, aumentando ou diminuindo a razão de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 nos grânulos ou em outra superfície, as subpopulações de células T podem ser, de preferência, selecionadas a favor ou contra no início da cultura ou em outros momentos desejados. O técnico habilitado reconheceria que múltiplas rodadas de seleção também podem ser usadas no contexto dessa invenção.

[00427] Em outra modalidade, pode ser desejável realizar o procedimento de seleção e usar as células “não selecionadas” no processo de ativação e expansão. As células

“não selecionadas” também podem ser submetidas a outras rodadas de seleção. O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser realizado com uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície únicos para as células selecionadas negativamente. Um método é a classificação e/ou seleção de células por meio de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais direcionados a marcadores de superfície celular presentes nas células selecionadas negativamente. Por exemplo, para enriquecer células CD4 + por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais tipicamente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em certas modalidades, as células T reguladoras são esgotadas por grânulos conjugados com anti-CD25 ou outro método de seleção similar.

[00428] Para o isolamento de uma população desejada de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e de superfície (por exemplo, partículas tais como grânulos) pode ser variada. Em certas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual grânulos e células são misturados (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e grânulos. Por exemplo, em uma modalidade, uma concentração de 2 bilhões de células/ml é usada. Em uma modalidade, uma concentração de 1 bilhão de células/ml é usada. Em uma outra modalidade, mais de 100 milhões de células/ml são usadas. Em uma outra modalidade, uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/ml é usada. Em ainda outra modalidade, uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml é usada. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml.

O uso de altas concentrações pode resultar em maior rendimento celular, ativação celular e expansão celular.

Além disso, o uso de altas concentrações de células permite a captura mais eficaz de células que podem expressar fracamente antígenos alvo de interesse, tais como células T CD28-negativas, ou de amostras onde há muitas células tumorais presentes (isto é, sangue leucêmico, tecido tumoral, etc.). Essas populações de células podem ter valor terapêutico e seria desejável obter.

[00429] As células T para estimulação também podem ser congeladas após uma etapa de lavagem. Desejando não ser limitado pela teoria, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente fornece um produto mais uniforme, removendo granulócitos e, em certa medida, monócitos na população de células. Após a etapa de lavagem que remove o plasma e as plaquetas, as células podem ser suspensas em uma solução de congelamento. Embora muitas soluções e parâmetros de congelamento sejam conhecidos na técnica e sejam úteis nesse contexto, um método envolve o uso de PBS contendo DMSO 20% e albumina de soro humano 8%, ou meio de cultura contendo Dextrano 40 10% e Dextrose 5%, Albumina de soro humano 20% e DMSO 7,5%, ou Plasmalyte-A 31,25%, Dextrose 5%, NaCl 0,45%, Dextrano 40 10% e Dextrose 5%, albumina de soro humano 20% e DMSO 7,5% ou outro meio de congelamento de células adequado contendo, por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, as células são então congeladas a - 80 °C a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.

Outros métodos de congelamento controlado podem ser usados, bem como o congelamento não controlado imediatamente a -20 °C ou em nitrogênio líquido.

[00430] Em certas modalidades, as células criopreservadas são descongeladas e lavadas como descrito nesse documento e deixadas em repouso por uma hora em temperatura ambiente antes da ativação.

[00431] Também contemplada no contexto da invenção é a coleta de amostras de sangue ou produto de leucaferese de um indivíduo em um período de tempo antes de quando as células expandidas, como descrito nesse documento, podem ser necessárias. Como tal, a fonte das células a serem expandidas pode ser coletada em qualquer ponto de tempo necessário, e as células desejadas, tais como células T, isoladas e congeladas para uso posterior em terapia de células T para qualquer número de doenças ou condições que se beneficiariam de Terapia com células T, tais como aquelas descritas nesse documento. Em uma modalidade, uma amostra de sangue ou uma leucaferese é retirada de um indivíduo geralmente saudável.

Em certas modalidades, uma amostra de sangue ou uma leucaferese é retirada de um indivíduo geralmente saudável que está em risco de desenvolver uma doença, mas que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em certas modalidades, as células T podem ser expandidas, congeladas e usadas posteriormente.

[00432] Quer antes ou depois da modificação genética das células Treg para expressar um CAR desejável, as células T podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, em US 6.352.694; 6.534.055;

6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681;

7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843;

5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e US20060121005, incorporados nesse documento por referência.

[00433] Geralmente, as células Treg da invenção são expandidas por contato com uma superfície tendo afixadas às mesmas um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligando que estimula uma molécula coestimuladora na superfície das células das células Treg. Em particular,

as células Treg podem ser estimuladas como descrito nesse documento, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície, ou por contato com uma proteína quinase C ativador (por exemplo, briostatina) em conjunto com um ionóforo de cálcio. Para a coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T, um ligando que se liga à molécula acessória é usado. Por exemplo, uma população de células T pode ser contactada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T.

Para estimular a proliferação de células T CD4+, um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28 podem ser usados. Exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem, sem estar limitado a,

9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, França). Outros métodos de expansão comumente conhecidos na técnica podem ser usados (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

[00434] Em certas modalidades, o sinal estimulatório primário e o sinal coestimulador para as células Treg da invenção podem ser fornecidos por diferentes protocolos. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem ser acoplados à mesma superfície (isto é, em formação “cis”) ou a superfícies separadas (isto é, em formação “trans”). Alternativamente, um agente pode ser acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em uma modalidade, o agente que fornece o sinal coestimulador está ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em certas modalidades, ambos os agentes podem estar em solução. Em outra modalidade, os agentes podem estar na forma solúvel e, em seguida, reticulados a uma superfície, tal como uma célula que expressa receptores Fc ou um anticorpo ou outro agente de ligação que se ligará aos agentes. A este respeito, ver, por exemplo, US20040101519 e 20060034810, incorporados nesse documento por referência, para células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e na expansão de células T na presente invenção.

[00435] Em uma modalidade, os dois agentes são imobilizados em grânulos, seja no mesmo grânulo, isto é, “cis” ou para separar grânulos, isto é, “trans”. A título de exemplo, o agente que fornece o sinal de ativação primário é um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e o agente que fornece o sinal coestimulador é um anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo; e ambos os agentes são coimobilizados no mesmo grânulo em quantidades moleculares equivalentes.

Em uma modalidade, uma razão de 1:1 de cada anticorpo ligado aos grânulos para expansão de células T CD4+ e crescimento de células T é usada.

Em certos aspectos da presente invenção, uma razão de anticorpos anti CD3:CD28 ligados aos grânulos é usada de modo que um aumento na expansão de células T seja observado em comparação com a expansão observada usando uma razão de 1:1. Em uma modalidade particular, um aumento de cerca de 1 a cerca de 3 vezes é observado em comparação com a expansão observada usando uma razão de 1:1. Em uma modalidade, a razão de anticorpo

CD3:CD28 ligado aos grânulos varia de 100:1 a 1:100 e todos os valores inteiros entre os mesmos.

Em um aspecto da presente invenção, mais anticorpo anti-CD28 é ligado às partículas do que o anticorpo anti-CD3, isto é, a razão de

CD3:CD28 é menor que um.

Em certas modalidades da invenção,

a razão do anticorpo anti-CD28 para o anticorpo anti-CD3 ligado aos grânulos é maior do que 2:1. Em uma modalidade particular, uma razão de 1:100 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a grânulos é usada.

Em outra modalidade, uma razão de

1:75 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a grânulos é usada.

Em uma outra modalidade, uma razão de 1:50 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a grânulos é usada.

Em outra modalidade,

uma razão de 1:30 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a grânulos é usada.

Em uma modalidade preferida, é usada uma razão de

1:10 de CD3:CD28 de anticorpo ligado a grânulos.

Em outra modalidade, uma razão de 1:3 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às grânulos é usada. Em ainda outra modalidade, uma razão de 3:1 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às grânulos é usada.

[00436] Razões de partículas para células de 1:500 a 500:1 e quaisquer valores inteiros entre podem ser usados para estimular células T ou outras células alvo. Como aqueles habilitados comuns na técnica podem prontamente apreciar, a razão de partículas para células pode depender do tamanho de partícula em relação à célula alvo. Por exemplo, grânulos pequenos podem ligar apenas algumas células, enquanto grânulos maiores podem ligar muitas. Em certas modalidades, a razão de células para partículas varia de 1:100 a 100:1 e quaisquer valores inteiros entre e em outras modalidades a razão compreende 1:9 a 9:1 e quaisquer valores inteiros entre os mesmos, também podem ser usados para estimular as células T. A razão de partículas acopladas a anti-CD3- e anti-CD28 para células T que resulta na estimulação de células T pode variar como observado acima, no entanto, certos valores preferidos incluem 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10 1 e 15:1 com uma razão preferida sendo pelo menos 1:1 de partículas por célula T. Em uma modalidade, uma razão de partículas para células de 1:1 ou menos é usada. Em uma modalidade particular, uma razão preferida partícula:célula é de 1:5. Em outras modalidades,

a razão de partículas para células pode ser variada, dependendo do dia de estimulação. Por exemplo, em uma modalidade, a proporção de partículas para células é de 1:1 a 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células todos os dias ou em dias alternados daí em diante por até 10 dias, nas razões finais de 1:1 a 1:10 (com base na contagem de células no dia da adição). Em uma modalidade particular, a razão de partículas para células é de 1:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:5 nos terceiro e quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, as partículas são adicionadas diariamente ou em dias alternados para uma razão final de 1:1 no primeiro dia e 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, a razão de partículas para células é de 2:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:10 no terceiro e no quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, as partículas são adicionadas diariamente ou em dias alternados para uma razão final de 1:1 no primeiro dia e 1:10 no terceiro e no quinto dias de estimulação. Um habilitado na técnica apreciará que uma variedade de outras razões podem ser adequadas para uso na presente invenção. Em particular, as razões irão variar dependendo do tamanho da partícula e do tamanho e do tipo de célula.

[00437] Em outras modalidades da presente invenção, as células Treg são combinadas com grânulos revestidos com agente, os grânulos e as células são subsequentemente separados e, em seguida, as células são cultivadas. Em uma modalidade alternativa, antes da cultura, os grânulos e as células revestido(a)s com agente não são separado(a)s, mas são cultivado(a)s junto(a)s. Em uma outra modalidade, os grânulos e as células são primeiro concentrados pela aplicação de uma força, tal como uma força magnética, resultando em aumento da ligação de marcadores de superfície celular, induzindo assim a estimulação celular.

[00438] A título de exemplo, as proteínas da superfície celular podem ser ligadas permitindo que grânulos paramagnéticos aos quais o anti-CD3 e o anti-CD28 estão ligados (3x28 grânulos) entrem em contato com as células Treg da invenção. Em uma modalidade, as células (por exemplo, células T 104 a 109) e grânulos (por exemplo, grânulos paramagnéticos T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450 em uma razão de 1:1) são combinados em um tampão, de preferência PBS (sem cátions divalentes, tais como cálcio e magnésio). Novamente, aqueles habilitados comuns na técnica podem facilmente apreciar que qualquer concentração de células pode ser usada.

Por exemplo, a célula alvo pode ser muito rara na amostra e compreender apenas 0,01% da amostra ou toda a amostra (isto é, 100%) pode compreender a célula alvo de interesse.

Consequentemente, qualquer número de célula está dentro do contexto da presente invenção. Em certas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual as partículas e células são misturadas (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e partículas. Por exemplo, em uma modalidade, uma concentração de cerca de 2 bilhões de células/ml é usada. Em outra modalidade, são usados mais de 100 milhões de células/ml. Em uma outra modalidade, uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/ml é usada. Em ainda outra modalidade, uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml é usada. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml. O uso de altas concentrações pode resultar em maior rendimento celular, ativação celular e expansão celular. Além disso, o uso de altas concentrações de células permite a captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente os antígenos alvo de interesse, tais como células T CD28- negativas. Essas populações de células podem ter valor terapêutico e seria desejável obter em certas modalidades.

[00439] Em uma modalidade da presente invenção, a mistura pode ser cultivada por várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor inteiro de hora em hora entre as mesmas. Em outra modalidade, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. Em uma modalidade da invenção, os grânulos e as células T são cultivados juntos por cerca de

8 dias.

Em outra modalidade, os grânulos e as células T são cultivados juntos por 2-3 dias.

Vários ciclos de estimulação também podem ser desejados de modo que o tempo de cultura de células T possa ser de 60 dias ou mais.

As condições apropriadas para a cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, meio essencial mínimo ou meio RPMI

1640 ou, X-vivo 15, (Lonza)) que pode conter fatores necessários para a proliferação e a viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal bovino ou humano),

interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF,

IL-10, IL-12, IL-15, TGFb e TNF-a ou qualquer outro aditivo para o crescimento de células conhecidos do técnico habilitado.

Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não estão limitados a, tensoativo, plasmanato e agentes redutores, tais como N-acetil-cisteína e 2-

mercaptoetanol.

O meio pode incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM,

MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, Optimizer, com adição de aminoácidos, piruvato de sódio e vitaminas, sem soro ou suplementado com uma quantidade apropriada de soro

(ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e a expansão das células T.

Antibióticos, por exemplo,

penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que serão infundidas em um indivíduo.

As células alvo são mantidas sob as condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37 °C) e atmosfera (por exemplo, ar mais CO2 a 5%).

[00440] As células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem apresentar características diferentes. Por exemplo, sangue típico ou produtos de células mononucleares de sangue periférico aférrico têm uma população de células T auxiliares (Th, CD4+) que é maior do que a população de células T citotóxicas ou supressoras (Tc, CD8+). A expansão ex vivo de células T estimulando os receptores CD3 e CD28 produz uma população de células T que antes de cerca de dias 8-9 consiste predominantemente em células Th, enquanto após cerca de 8-9 dias, a população de células T compreende uma população cada vez maior de células Tc. Consequentemente, dependendo da finalidade do tratamento, infundir um indivíduo com uma população de células T compreendendo predominantemente células Th pode ser vantajoso. De forma similar, se um subconjunto específico de antígeno de células Tc tiver sido isolado, pode ser benéfico expandir esse subconjunto a um grau maior. Além disso, além dos marcadores CD4 e CD8, outros marcadores fenotípicos variam significativamente, mas em grande parte, reproduzivelmente durante o curso do processo de expansão celular. Assim, essa reprodutibilidade permite a capacidade de adaptar um produto de células T ativadas para finalidades específicas.

[00441] Em uma modalidade da invenção, as células T podem ser cultivadas na presença de rapamicina a fim de obter células T reguladoras, como descrito por exemplo em WO2007110785 incorporado nesse documento por referência.

Outro método para gerar células T reguladoras é descrito em US2016024470 incorporado nesse documento por referência, onde as células T são cultivadas com um ativador de receptor de células T (TCR)/CD3, tal como, por exemplo, anticorpos TCR/CD3, um ativador coestimulador de TCR, tais como, por exemplo, de anticorpos CD28, CD137 (4-1 BB), GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40, CD40 ou CD137 e rapamicina.

[00442] Em uma modalidade da invenção, as células T geneticamente modificadas pela expressão do CAR também podem ter sido geneticamente modificadas pela expressão de pelo menos um fator intracelular, tal como ROR-C, Foxp3, Foxo1, T-bet ou Gata 3, c-Maf, AhR. Em uma modalidade, a célula imune geneticamente modificada da invenção expressa Foxp3.

Em uma modalidade, a célula imune geneticamente modificada da invenção expressa Foxo1.

[00443] Em uma modalidade, a célula Treg geneticamente modificada da invenção pode ser uma célula Treg alogênica. Por exemplo, a célula Treg alogênica pode ser uma célula T sem expressão de um antígeno leucocitário humano funcional (HLA), por exemplo, HLA classe I e/ou HLA classe II e/ou uma célula T sem expressão de um HLA endógeno.

[00444] Em uma modalidade, as células Treg como descritas nesse documento podem ser projetadas de modo que não expressem um HLA funcional em sua superfície. Por exemplo, uma célula Treg como descrita nesse documento pode ser concebida nesse documento de modo que a expressão da superfície da célula de HLA, por exemplo, HLA classe 1 (em particular um HLA-A, HLA-B ou HLA-C) e/ou moléculas de HLA classe II ou HLA não clássica são reguladas negativamente.

[00445] Em outra modalidade, a célula Treg pode não ter um TCR funcional e um HLA funcional, tal como HLA classe I (em particular um HLA-A, HLA-B ou HLA-C) e/ou HLA classe II.

[00446] Em outra modalidade, uma célula Treg descrita nesse documento pode ser projetada de modo que não expresse um HLA endógeno em sua superfície.

[00447] As células Treg modificadas que carecem de expressão de um TCR e/ou HLA funcional podem ser obtidas por qualquer meio adequado, incluindo uma inativação ou um silenciamento de uma ou mais de subunidades de TCR ou HLA.

Por exemplo, a célula Treg pode incluir um silenciamento de TCR e/ou HLA usando siRNA, shRNA, ativador de transcrição de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR) como efetor nuclease (TALEN), endonuclease de dedo de zinco (ZFN), meganuclease (mn, também conhecido como endonuclease de homing), ou megaTAL (combinando um efetor TAL com um domínio de clivagem mn).

[00448] Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica um CAR, como descrito nesse documento, é inserido em um locus específico no genoma de uma Treg, tal como, por exemplo, no locus de um gene a ser eliminado. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica um CAR, como descrito nesse documento, é inserido dentro de um locus de HLA, resultando assim na inibição da expressão de HLA.

[00449] Em uma modalidade, a expressão de TCR e/ou expressão de HLA pode ser inibida usando siRNA ou shRNA que tem como alvo um ácido nucleico que codifica um TCR e/ou HLA em uma célula T. A expressão de siRNA e shRNAs em células T pode ser alcançada usando qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, tal como um sistema de expressão lentiviral. ShRNAs de exemplo que regulam negativamente a expressão de componentes do TCR são descritos, por exemplo, em US2012/0321667. SiRNA e shRNA de exemplo que regulam negativamente a expressão de genes HLA classe I e/ou HLA classe II são descritos, por exemplo, em US2007/0036773.

[00450] “CRISPR” ou “CRISPR para TCR e/ou HLA” ou “CRISPR para inibir TCR e/ou HLA”, como usado nesse documento, se refere a um conjunto de repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas ou um sistema compreendendo esse conjunto de repetições.

“Cas”, como usado nesse documento, se refere a uma proteína associada a CRISPR. Um sistema “CRISPR/Cas” se refere a um sistema derivado de CRISPR e Cas que pode ser usado para silenciar ou mutar um gene de TCR e/ou HLA.

[00451] Os sistemas de CRISPR/Cas de ocorrência natural são encontrados em aproximadamente 40% dos genomas de eubactérias sequenciados e 90% das arquéias sequenciadas.

Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Esse sistema é um tipo de sistema imunológico procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos, tais como plasmídeos e fagos, e fornece uma forma de imunidade adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845. O sistema de CRISPR/Cas foi modificado para uso na edição de genes (silenciamento, intensificação ou alteração de genes específicos) em eucariotos, tais como camundongos ou primatas. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Isso é conseguido introduzindo na célula eucariótica um plasmídeo contendo um CRISPR especificamente concebido e um ou mais de Cas apropriados. A sequência de CRISPR, às vezes chamada de locus de CRISPR, compreende repetições e espaçadores alternada(o)s. Em um CRISPR de ocorrência natural, os espaçadores usualmente compreendem sequências estranhas à bactéria, tal como um plasmídeo ou sequência de fago; no sistema de CRISPR/Cas TCR e/ou HLA, os espaçadores são derivados da sequência do gene de TCR ou HLA. O RNA do locus de CRISPR é expressado constitutivamente e processado pelas proteínas Cas em pequenos RNAs. Esses compreendem um espaçador flanqueado por uma sequência de repetição. Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos no nível de RNA ou DNA. Horvath et al.

(2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1:7. Os espaçadores servem, portanto, como moldes para moléculas de RNA, analogamente a siRNAs. Pennisi (2013) Science 341: 833-836. O sistema de CRISPR/Cas pode, assim, ser usado para editar um gene de TCR e/ou HLA (adicionando ou excluindo um par de bases), ou introduzindo uma parada prematura que, assim, diminui a expressão de um TCR e/ou HLA. O sistema CRISPR/Cas pode ser alternativamente usado como RNA de interferência, desligando o gene de HLA de forma reversível. Em uma célula de mamífero, por exemplo, o RNA pode guiar a proteína Cas para um promotor de TCR e/ou HLA, bloqueando estericamente as RNA polimerases.

[00452] Sistemas de CRISPR/Cas artificiais podem ser gerados que inibem TCR e/ou HLA, usando tecnologia conhecida na técnica, por exemplo, aquela descrita em US20140068797 e Cong (2013)

[00453] Science 339: 819-823. Outros sistemas de CRISPR/Cas artificiais que são conhecidos na técnica também podem ser gerados que inibem TCR e/ou HLA, por exemplo, o descrito em Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32: 6 569-576, US8.871.445; 8.865.406; 8.795.965; 8.771.945; e 8.697.359.

[00454] “TALEN” ou “TALEN para TCR e/ou HLA” ou “TALEN para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. TALENs são produzidas artificialmente pela fusão de um domínio de ligação de DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA. Efetores semelhantes a ativadores de transcrição (TALEs) podem ser manipulados para se ligarem a qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma porção do gene de TCR e/ou HLA. Combinando um TALE manipulado com um domínio de clivagem de DNA, uma enzima de restrição pode ser produzida que é específica para qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma sequência de TCR e/ou HLA. Esses podem então ser introduzidos em uma célula, onde podem ser usados para edição do genoma. Boch (2011) Nature Biotech.

29: 135-6; e Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.

[00455] TALEs são proteínas secretadas pela bactéria Xanthomonas. O domínio de ligação de DNA contém uma sequência repetida de 33-34 aminoácidos altamente conservada, com exceção do 12º e 13º aminoácidos. Essas duas posições são altamente variáveis, mostrando uma forte correlação com o reconhecimento de nucleotídeos específicos. Eles podem,

portanto, ser manipulados para se ligarem a uma sequência de DNA desejada. Para produzir uma TALEN, uma proteína TALE é fundida a uma nuclease (N), que é uma endonuclease Fokl de tipo selvagem ou mutada. Várias mutações em Fokl foram feitas para seu uso em TALENs; esses, por exemplo, melhoram a especificidade ou atividade da clivagem. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech.

29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; e Guo et al. (2010)/. Mol. Biol.

200: 96. O domínio Fokl funciona como um dímero, exigindo duas construções com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados.

Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação de DNA TALE e o domínio de clivagem Fokl quanto o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais parecem ser parâmetros importantes para ter como alvo altos níveis de atividade. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8. Uma TALEN de HLA pode ser usado dentro de uma célula para produzir uma quebra de fita dupla (DSB).

Uma mutação pode ser introduzida no sítio da quebra se os mecanismos de reparo reparar indevidamente a quebra por meio de junção de extremidade não homóloga. Por exemplo, o reparo impróprio pode introduzir uma mutação por mudança de matriz de leitura. Alternativamente, DNA estranho pode ser introduzido na célula junto com a TALEN; dependendo das sequências do DNA estranho e da sequência cromossômica, esse processo pode ser usado para corrigir um defeito no gene de TCR e/ou HLA ou introduzir tal defeito em um TCR wt e/ou gene de HLA, diminuindo assim a expressão de HLA. TALENs específicas para sequências em TCR e/ou HLA podem ser construídos usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo vários esquemas usando componentes modulares.

Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: el9509.

[00456] “ZFN” ou “Nuclease de dedo de zinco” ou “ZFN para TCR e/ou HLA” ou “ZFN para inibir TCR e/ou HLA” se referem a uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. Como uma TALEN, uma ZFN compreende um domínio de nuclease Fokl (ou derivado do mesmo) fundido a um domínio de ligação de DNA. No caso de uma ZFN, o domínio de ligação de DNA compreende um ou mais dedos de zinco. Carroll et al.

(2011) Genetics Society of America 188: 773-782; e Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160. Um dedo de zinco é um pequeno motivo estrutural de proteína estabilizado por um ou mais íons de zinco. Um dedo de zinco pode compreender, por exemplo, Cys2His2 (SEQ ID NO: 75) e pode reconhecer uma sequência de aproximadamente 3 pb. Vários dedos de zinco de especificidade conhecida podem ser combinados para produzir polipeptídeos de múltiplos dedos que reconhecem sequências de cerca de 6, 9, 12, 15 ou 18 pb.

Várias técnicas de seleção e montagem modular estão disponíveis para gerar dedos de zinco (e combinações dos mesmos) que reconhecem sequências específicas, incluindo apresentação de fago, sistemas de um híbrido de levedura, sistemas de um híbrido e dois híbridos de bactérias e células de mamíferos.

[00457] Como uma TALEN, uma ZFN deve dimerizar para clivar o DNA. Assim, um par de ZFNs é necessário para ter como alvo sítios de DNA não palindrômicos. As duas ZFNs individuais devem se ligar a fitas opostas do DNA com suas nucleases devidamente espaçadas. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95: 10570-5. Também como uma TALEN, uma ZFN pode criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação por mudança de matriz de leitura se for reparada incorretamente, levando a uma diminuição na expressão e na quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula.

ZFNs também podem ser usados com recombinação homóloga para sofrer mutação no gene de TCR e/ou HLA. ZFNs específicos para sequências em TCR e/ou HLA podem ser construídos usando qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-

7; Quo et al. (2010) /. Mol. Biol. 400: 96; US2011/0158957; e US2012/0060230.

[00458] “Meganuclease” ou “meganuclease para TCR e/ou HLA” ou “meganuclease para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma endonuclease monomérica com grandes (>14 pares de bases) sítios de reconhecimento, que podem ser usados para editar o gene de TCR e/ou HLA. Meganucleases (mn) são proteínas monoméricas com atividade de nuclease inata que são derivadas de endonucleases de homing bacterianas e manipuladas para um único sítio de destino. As endonucleases de homing são enzimas de clivagem de DNA que podem gerar quebras de fita dupla em loci individuais em seus genomas hospedeiros e, assim, conduzir eventos de conversão de genes específicos do sítio. (Stoddard, Structure. 12 de janeiro de 2011; 19(1):7- 15). Apesar de seu pequeno tamanho, as endonucleases de homing reconhecem longas sequências de DNA (tipicamente 20 a 30 pares de bases). As endonucleases de homing são extremamente difundidas e são encontradas em micróbios, bem como em fagos e vírus. As enzimas LAGLIDADG e His-Cys box (que são as mais específicas de sequência dessas enzimas) dependem de folhas b antiparalelas que se encaixam nas ranhuras principais de seus sítios de DNA alvo (Flick et al., 1998; Jurica et al., 1998). Lá eles estabelecem uma coleção de contatos específicos e não específicos de sequência que são distribuídos de forma não uniforme em vários pares de base consecutivos (Chevalier et al., 2003; Scalley-Kim et al., 2007).

[00459] A família de endonuclease de homing LAGLIDADG (LHE) é a fonte primária das enzimas manipuladas usadas para aplicações de direcionamento de genes. A família de LHE é codificada principalmente em archaea e no nos genomas de cloroplasto e mitocondriais de algas e fungos (Chevalier et al., 2005; Dalgaard et al., 1997; Sethuraman et al., 2009).

As meganucleases que possuem um único motivo LAGLIDADG conservado (SEQ ID NO: 58) por cadeia de proteína formam proteínas homodiméricas que clivam sequências alvo de DNA palindrômicas e quase palindrômicas, enquanto aquelas que contêm dois desses motivos por cadeia de proteína formam monômeros pseudo-simétricos maiores que podem ter como alvo sequências de DNA completamente assimétricas.

[00460] As meganucleases podem ser manipuladas para ter como alvo TCR e/ou HLA e, assim, criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação por mudança de matriz de leitura se reparada de maneira inadequada, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula.

[00461] “MegaTAL” ou “megaTAL para TCR e/ou HLA” ou “megaTAL para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma nuclease artificial, que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. MegaTALs são nucleases monoméricas híbridas obtidas através da fusão de domínios efetores TAL mínimos (semelhantes a ativador de transcrição) ao terminal N de meganucleases derivadas da família de endonucleases de homing LAGLIDADG (Nucleic Acids Res. Fev de 2014;42(4):2591- 601 ; Takeuchi et al, Methods Mol Biol. 2015; 1239:105-32.

Doi: 10.1007/978-1-4939-1862-1_6). MegaTALs, portanto, consistem em uma cabeça de clivagem de meganuclease específica de sítio com afinidade e especificidade adicionais fornecidas por um domínio de ligação de DNA efetor de TAL.

[00462] MegaTALs podem ser manipulados para ter como alvo TCR e/ou HLA e, assim, criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação por mudança de matriz de leitura se reparada de maneira inadequada, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula.

[00463] Embora não desejando ser limitado por qualquer teoria particular, em algumas modalidades, uma célula T terapêutica tem persistência de curto prazo em um paciente, devido a telômeros encurtados na célula T; consequentemente, a transfecção com um gene da telomerase pode alongar os telômeros da célula T e melhorar a persistência da célula T no paciente. Ver Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117: 1466-1476 (2007). Assim, em uma modalidade, a célula Treg geneticamente modificada, expressa ectopicamente uma subunidade da telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica da telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. Em alguns aspectos, essa divulgação fornece um método de produção de uma célula que expressa CR, compreendendo o contato de uma célula com um ácido nucleico que codifica uma subunidade da telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica da telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. A célula pode ser contactada com o ácido nucleico antes, simultaneamente ou depois de ser contatada com uma construção que codifica um CR.

[00464] A presente invenção se refere adicionalmente a um método para obter uma célula Treg da invenção, em que o referido método compreende a transdução de pelo menos uma célula Treg com um ácido nucleico que codifica um CAR como descrito acima e, opcionalmente, a expansão das células transduzidas.

[00465] Em uma modalidade, o método é um método ex vivo.

[00466] Em uma modalidade, o método para obter células Treg da invenção compreende: - uma etapa de isolamento de células Treg de uma população de PBMC (por exemplo, recuperada por leucaferese) - uma etapa de modificação genética em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR, conforme descrito acima, é introduzida ou transferida dentro das células Treg, - opcionalmente, uma etapa de expansão, - opcionalmente, uma etapa de lavagem e, - opcionalmente, uma etapa de congelamento.

[00467] Em uma modalidade, a(s) etapa(s) de modificação genética corresponde(m) a uma etapa de ruptura de gene, uma etapa de correção de gene ou uma etapa de adição de gene, de preferência uma etapa de adição de gene. Em uma modalidade, a(s) etapa(s) de modificação genética é(são) realizada(s) por um método selecionado do grupo que compreende, mas não se limita a, transfecção, transdução ou edição de gene.

[00468] Exemplos de métodos de edição de genes que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, métodos baseados em nucleases manipuladas, métodos baseados em vírus adenoassociado recombinante (ou AAV), métodos baseados em transposons (por exemplo, a sistema de transposon da Bela Adormecida), métodos baseados em recombinação homóloga, direcionamento condicional usando recombinases específicas do sítio (por exemplo, sistemas Cre-LoxP e Flp-FRT), e Manipulação Genômica Automotizada Multiplexada (MAGE).

[00469] Exemplos não limitativos de nucleases manipuladas incluem, mas não estão limitados a, nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição (TALEN) de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), endonuclease de dedo de zinco (ZFN), meganuclease (mn, também conhecida como endonuclease de homing), ou megaTAL (combinando um efetor TAL com um domínio de clivagem mn).

[00470] Em uma modalidade, o método para obter células Treg da invenção compreende: - uma etapa de isolamento de células Treg de uma população de PBMC (por exemplo, recuperada por leucaferese) - uma etapa de transdução ou transfecção com um vetor compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR como descrito acima, - opcionalmente, uma etapa de expansão, - opcionalmente, uma etapa de lavagem e, - opcionalmente, uma etapa de congelamento.

[00471] Outro objeto da invenção é uma composição compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos uma população de células Treg da invenção.

[00472] Em uma modalidade, a referida composição compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma população de células Treg projetada para expressar na superfície celular um CAR específico para pelo menos um IL-23R como descrito acima, em que o referido CAR compreende (i) um domínio de ligação extracelular específico para IL- 23R como descrito acima, (ii) opcionalmente um domínio de dobradiça extracelular como descrito acima, (iii) opcionalmente um domínio transmembranar como descrito acima, (iv) um domínio de sinalização intracelular como descrito acima, e, (v) opcionalmente uma etiqueta e/ou uma sequência líder como descrito acima.

[00473] Em uma modalidade, a referida composição foi congelada e descongelada.

[00474] Outro objeto da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos uma população de células Treg como descrito acima e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00475] Outro objeto da invenção é um medicamento compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos uma população de células Treg como descrito acima.

[00476] Em uma modalidade, a composição farmacêutica ou o medicamento compreende pelo menos uma população de células Treg isolada e/ou substancialmente purificada da invenção.

[00477] Em uma modalidade, a composição farmacêutica ou o medicamento compreende uma combinação de populações de células Treg como descrito acima (isto é, pelo menos duas populações de células Treg distintas da invenção).

[00478] Em uma modalidade, a composição, composição farmacêutica ou o medicamento da invenção compreende adicionalmente pelo menos uma outra população de células Treg, em que as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de um antígeno, um fragmento de um antígeno, uma variante de um antígeno ou uma mistura dos mesmos.

[00479] Em uma modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00480] Em outra modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de um autoantígeno, tal como, por exemplo, um antígeno associado à esclerose múltipla, um antígeno associado à articulação, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP de humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD.

[00481] Em outra modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de um alérgeno inalado, um alérgeno ingerido ou um alérgeno de contato.

[00482] Em uma modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de um antígeno selecionado do grupo que compreende ovalbumina, MOG, fragmentos de colágeno tipo II, variantes e misturas dos mesmos.

[00483] Em uma modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de ovalbumina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00484] Em outra modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de MOG, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00485] Em outra modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico do colágeno tipo II, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00486] Em outra modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR específico de vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado ou fibrinogênio citrulinado, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00487] Em outra modalidade, as células da referida outra população de células imunológicas expressam na superfície celular um CAR específico de HLA-A2, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00488] Em uma modalidade, as células da referida outra população de células Treg expressam na superfície celular um CAR em que o domínio de ligação extracelular do referido CAR é uma proteína ou fragmentos ou variantes dos mesmos, como, por exemplo, um autoantígeno ou fragmentos ou variantes dos mesmos.

[00489] Como usado nesse documento, o termo “consistindo essencialmente em”, com referência a uma composição farmacêutica ou medicamento, significa que pelo menos uma população de células Treg da invenção é o único agente terapêutico ou agente com atividade biológica dentro da referida composição farmacêutica ou medicamento.

[00490] Tais composições e medicamentos podem compreender tampões, tais como, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos, tais como, glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tal como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tal como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes.

[00491] A administração das composições pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As composições descritas nesse documento podem ser administradas a um paciente por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.) ou intraperitoneal. Em um aspecto, as composições de células T da presente invenção são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea.

[00492] Em uma modalidade, as populações de células Treg da presente invenção são administradas por injeção i.v..

[00493] As composições da presente invenção estão em uma modalidade formulada para administração intravenosa.

[00494] Em outra modalidade, as populações de células Treg da presente invenção podem ser injetadas diretamente no sítio da doença ou do distúrbio autoimune e/ou inflamatório.

[00495] A presente invenção se refere adicionalmente a uma célula Treg que expressa um CAR da presente invenção, a uma população de tais células, a uma composição, a uma composição farmacêutica ou a um medicamento como descrito nesse documento, para uso no tratamento de um(a) doença ou distúrbio mediada(o) por célula que expressa IL-23R.

[00496] Outro objeto da invenção é, portanto, um método para tratar, em um indivíduo em necessidade do mesmo, um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células que expressam IL-23R, em que o referido método compreende a administração ao indivíduo de pelo menos uma célula Treg ou população de células Treg como descrito acima.

[00497] Em uma modalidade, o método é um método de terapia celular.

[00498] Em uma modalidade, o indivíduo é administrado (ou deve ser administrado) com células autólogas. Em outras palavras, em uma modalidade, a terapia celular é autóloga.

[00499] Em uma modalidade, a terapia celular é heteróloga.

[00500] Em outra modalidade, o indivíduo é administrado (ou deve ser administrado) com células alogênicas. Em outras palavras, em uma modalidade, a terapia celular é alogênica.

[00501] Outro objeto da presente invenção é um método para tratar, em um indivíduo em necessidade do mesmo, um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células que expressam IL-23R, em que o referido método compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um CAR como descrito nesse documento ou ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento ou vetor compreendendo um CAR conforme descrito nesse documento. Em uma modalidade, o método da invenção é um método de terapia gênica.

[00502] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio mediada(o) por células que expressam IL-23R é um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células pró-inflamatórias, um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por Th17 ou um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por T gd.

[00503] Em uma modalidade, a doença mediada por células que expressam IL-23R é um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou um(a) doença ou distúrbio inflamatório(a).

[00504] Exemplos de doenças ou distúrbios mediados por células que expressam IL-23R incluem, mas não estão limitados a, doença de Crohn, colite ulcerativa (UC),

penfigóide bolhoso, lúpus (incluindo lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite lúpica (LN), lúpus discoide, lúpus eritematoso profundo, lúpus eritematoso pérneo, lúpus eritematoso tumidus, lúpus eritematoso sistêmico grave,

lúpus cutâneo agudo, lúpus cutâneo crônico), esclerose múltipla, artrite (tais como, por exemplo, artrite reumatoide juvenil, artrite reativa (síndrome de Reiter),

artrite idiopática juvenil, espondilite anquilosante e artrite psoriática), neuromielite óptica (NMO), encefalite límbica autoimune (LE), doença de Hashimoto, encefalite de receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR), anemia hemolítica autoimune, pênfigo vulgar, miastenia grave, doença de

Graves, púrpura trombocitopênica idiopática, síndrome de

Goodpasture, doença celíaca, anemia perniciosa, vitiligo,

esclerodermia, psoríase, síndrome de Sjogren, granulomatose de Wegener, polimiosite, dermatomiosite, cirrose biliar primária, síndrome antifosfolipídica, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome de Miller Fisher, síndrome de Guillain-

Barré, neuropatia axonal motora aguda, hepatite autoimune,

dermatite herpetiforme, doença de Churg-Strauss, poliangiite microscópica, nefropatia por IgA causada por ANCA e outras doenças associadas a ANCA, febre reumática aguda, anemia perniciosa, diabetes tipo 1 (T1D), nefropatia membranosa,

polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, púrpura trombocitopênica trombótica, hiperviscosidade em gamopatias monoclonais, síndrome urêmica hemolítica (atípica, devido a anticorpos a fator H), doença de Wilson, fulminante, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, aloimunização de hemácias na gravidez, envenenamento por cogumelo, encefalomielite disseminada aguda, síndrome hemolítico-urêmica (atípica, devido a mutações do fator de complemento), anemia hemolítica autoimune (doença da aglutinina fria com risco de vida), nefropatia associada a mieloma, púrpura pós-transfusão, anemia hemolítica autoimune (anemia hemolítica autoimune quente), pancreatite hipertrigliceridêmica, tempestade tireoidiana, síndrome da pessoa rígida, síndrome hemolítico- urêmica (associada à diarréia típica), trombocitopenia imune, transplante de órgão sólido incompatível com ABO (TOS), crioglobulinemia, trombocitopenia induzida por heparina, tempestade tireoidiana, polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, glomeruloesclerose segmentar focal e insuficiência hepática fulminante.

[00505] Em uma modalidade, a referida doença ou distúrbio mediada(o) por células que expressam IL-23R é selecionado de doença inflamatória intestinal (tal como, por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica, espondilite anquilosante, diabetes tipo 1, distúrbios autoimunes da tireoide, esclerose múltipla, miastenia grave, psoríase, artrite psoriática ou uveíte.

[00506] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio mediada(o) por células que expressam IL-23R é a doença de Crohn.

[00507] Os termos “distúrbio inflamatório” ou “doença inflamatória” são usados indistintamente e como usados nesse documento se referem a qualquer anormalidade associada à inflamação.

[00508] Em uma modalidade, a condição inflamatória compreende doenças inflamatórias ou distúrbios ligados a um câncer.

[00509] Em uma modalidade, a condição inflamatória compreende doenças inflamatórias ou distúrbios ligados a uma doença autoimune.

[00510] Exemplos de doenças ou distúrbios inflamatórios incluem, mas não estão limitados a, artrite, artrite reumatoide, espondilite anquilosante, osteoartrite, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite gotosa, gota, poliartrite crônica, periatrite umeroscapular, artrite cervical, artrite lombossacral, artrite enteropática e espondilite anquilosante, asma, dermatite, psoríase, esclerodermia, polimiosite, dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, cirrose biliar primária, fibrose, fibrose cística, fibrose pulmonar,

cirrose, fibrose endomiocárdica, fibrose mediastinal,

mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose nefrogênica,

queloides, esclerodermia, artrofibrose, rejeição pós-

transplante tardia e crônica de órgão sólido, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica,

pênfigo, Pênfigo vulgar, Pênfigo herpetiforme, Pênfigo vegetante, Pênfigo por IgA, Pênfigo eritematoso, Penfigoide bolhoso, Penfigoide gestacional, Dermatose da membrana mucosa, Penfigoide nodular, Dermatose bolhosa por IgA linear, Líquen plano bolhoso, Epidermólise bolhosa aquisita,

diabetes autoimune, retinopatia diabética, nefropatia diabética, vasculopatia diabética, inflamação ocular,

uveíte, rinite, lesão de isquemia-reperfusão, restenose pós-

angioplastia, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC),

glomerulonefrite, doença de Graves, alergias gastrointestinais, conjuntivite, aterosclerose, doença arterial coronariana, angina, doença microvascular,

encefalomielite disseminada aguda, púrpura trombocitopênica idiopática, esclerose múltipla, esclerose sistêmica,

síndrome antifosfolipídica, Síndrome de Sjoegren, anemia hemolítica autoimune, colite, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória intestinal (DII), embolia,

embolia pulmonar, embolia arterial, embolia venosa,

inflamação alérgica, doença cardiovascular, doenças relacionadas a enxerto, doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), distúrbios associados à rejeição de transplante de enxerto, rejeição crônica e aloenxertos ou xenoenxertos de tecido ou células, doenças autoimunes, degeneração após trauma, acidente vascular cerebral, rejeição de transplante, condições alérgicas e hipersensibilidade, por exemplo, rinite alérgica, eczema alérgico e semelhantes, doenças de pele, distúrbios inflamatórios da derme, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00511] Exemplos de doenças de pele incluem, mas não estão limitados a, acne; ceratose actínica; dermatite atópica; dermatite de contato; úlceras de decúbito (escaras); eczema; eritroderma; hemangioma, tais como, por exemplo, hemangioma da infância; cicatriz hipertrófica; líquen plano; distúrbios liquenóides; linfangiogênese; psoríase; granulomas piogênicos; molusco contagioso; neurofibromatose; rosácea; epidermólise bolhosa distrófica recessiva; cicatrizes (quelóides); esclerodermia; ceratose seborreica; cânceres da pele, tais como, angiossarcoma, carcinoma de células basais, hemangioendotelioma, sarcoma de Karposi, melanoma maligno, melanoma, carcinoma de células escamosas; úlceras de pele; danos na pele após enxertos de pele, tal como autotransplante e alotransplante; Síndromes de Steven-Johnson e necrólise epidérmica tóxica; Síndrome de Sturge-Weber; esclerose tuberosa; úlceras venosas; verruga vulgaris; verrugas, tais como, por exemplo, verrugas virais; feridas; e semelhantes.

[00512] Exemplos de distúrbios inflamatórios dérmicos incluem, mas não estão limitados a, psoríase, psoríase em gotas, psoríase inversa, psoríase pustulosa, eritroderma, psoríase, dermatose neutrofílica febril aguda, eczema, eczema asteatótico, eczema disidrótico, eczema palmoplantar vesicular, acne comum, dermatite atópica, dermatite de contato, dermatite de contato alérgica, dermatomiosite, dermatite esfoliativa, eczema das mãos, pomfolix, rosácea, rosácea causada por sarcoidose, rosácea causada por esclerodermia, rosácea causada por síndrome de Sweet, rosácea causada por lúpus eritematoso sistêmico, rosácea causada por urticária, rosácea causada por dor associada a zóster, doença de Sweet, hidradenite neutrofílica, pustulose estéril, erupções por fármacos, dermatite seborreica, pitiríase rósea, doença cutânea de kikuchi, pápulas urticariformes pruriginosas e placas de gravidez, síndrome de Stevens-Johnson e necrólise epidérmica tóxica, reações de tatuagem, síndrome de Wells (celulite eosinofílica), artrite reativa (síndrome Reiter), síndrome da dermatose-artrite associada a intestino, dermatose neutrofílica reumatoide, hidradenite écrina neutrofílica, dermatose neutrofílica das mãos dorsais, balanite circunscrita plasmocelular, balanopostite, doença de Behçet, eritema anular centrífugo,

eritema discrômico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, dermatite das mãos, líquen nítido, líquen plano, líquen escleroso e atrófico, líquen simplex crônico, líquen espinhoso, dermatite mumular, pioderma gangrenoso, sarcoidose, dermatose pustulosa subcórnea, urticária e dermatose acantolítica transitória.

[00513] Em outra modalidade, o CAR da presente invenção pode ser usado para tratar em um submetido em necessidade um(a) doença ou distúrbio autoimune, em que o referido método compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um CAR como descrito nesse documento ou ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento ou vetor compreendendo um CAR conforme descrito nesse documento.

[00514] Exemplos de doenças autoimunes incluem, mas não estão limitados a, lúpus (por exemplo, lúpus eritematoso, nefrite lúpica), tireoidite de Hashimoto, mixedema primário, doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, diabetes (por exemplo, diabetes melito dependente de insulina, diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II), síndrome de Goodpasture, miastenia gravis, pênfigo, doença de Crohn, oftalmia simpática, uveíte autoimune, esclerose múltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulcerativa, Síndrome de Sjogren, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatoide), polimiosite, esclerodermia, psoríase e doença mista do tecido conjuntivo.

[00515] Em outra modalidade, o CAR da presente invenção pode ser usado para tratar em um indivíduo em necessidade um(a) doença ou distúrbio alérgico, em que o referido método compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um CAR como descrito nesse documento ou ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento ou vetor compreendendo um CAR como descrito nesse documento.

[00516] Exemplos de doenças alérgicas incluem, mas não estão limitados a, doenças alérgicas contra um alérgeno inalado, um alérgeno ingerido ou um alérgeno de contato.

Outros exemplos de doenças alérgicas incluem, mas não estão limitados a, asma alérgica, doenças pulmonares de hipersensibilidade, alergia alimentar, dermatite atópica, rinite alérgica, rinoconjuntivite alérgica, urticária crônica, distúrbios de hipersensibilidade de tipo retardado e anafilaxia sistemática.

[00517] Em outra modalidade, o CAR da presente invenção pode ser usado para tratar em um indivíduo em necessidade do mesmo um câncer, em que o referido método compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um CAR como descrito nesse documento ou ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento ou vetor compreendendo um CAR tal como descrito nesse documento.

[00518] Como usado nesse documento, um “câncer” pode ser qualquer câncer que esteja associado a um antígeno de superfície ou marcador de câncer.

[00519] Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma adenóide cístico, adrenocortical, carcinoma, cânceres relacionados à AIDS, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitomas, tumor teratóide/rabdóide atípico, sistema nervoso central, leucemia de células B, linfoma ou outras malignidades de células B, carcinoma de células basais, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, câncer ósseo, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, glioma do tronco cerebral, tumores cerebrais, câncer de mama, tumores brônquicos, linfoma de Burkitt, tumores carcinoides, cânceres do sistema nervoso central, câncer cervical, cordoma, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielóide crônica (CML), distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, câncer colorretal, craniofaringioma, linfoma cutâneo de células T, tumores embrionários, sistema nervoso central, câncer endometrial, ependimoblastoma, ependimoma, câncer de esôfago, estesioneuroblastoma, tumor de células germinais extracranianas da família de sarcoma de ewing, tumor de células germinativas extragonadais, câncer de duto biliar extra-hepático, câncer de olho, histiocitoma fibroso ósseo,

maligno e osteossarcoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinoide gastrointestinal,

tumores estromais gastrointestinais (GIST), sarcoma de tecidos moles, tumor de célula germinal, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células pilosas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de coração, câncer hepatocelular

(fígado), histiocitose, linfoma de Hodgkin, câncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumores de células das ilhotas (pâncreas endócrino), sarcoma de kaposi, câncer de rim, histiocitose de células de Langerhans, câncer de laringe, leucemia, câncer de lábio e cavidade oral, câncer de fígado (primário), carcinoma lobular in situ (LCIS),

câncer de pulmão, linfoma, macroglobulinemia, câncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de osso e osteossarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma,

carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer metastático do pescoço escamoso com carcinoma oculto do trato mediano primário envolvendo o gene NUT, câncer de boca,

síndromes de neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo/neoplasia de células plasmáticas, micose fungóide,

síndromes mielodisplásicas, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena,

leucemia mielógena crônica (LMC), mieloma, distúrbios mieloproliferativos múltiplos, cavidade nasal e câncer de seios paranasais, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma,

linfoma não-hodgkin, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer oral, câncer de cavidade oral, câncer orofaríngeo, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno de osso, câncer de ovário, câncer pancreático, papilomatose,

paraganglioma, seio paranasal e câncer do seio paranasal e de cavidade nasal, câncer de paratireoide, câncer de pênis,

câncer de faringe, feocromocitoma, tumores do parênquima pineal de diferenciação intermediária, pinhooblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor pituitário, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar, gravidez e câncer de mama, linfoma do sistema nervoso central (SNC) primário,

câncer de próstata, câncer retal, câncer de células renais

(rim), pelve renal e ureter, câncer de células transicionais,

retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma, síndrome de Sézary, câncer de células pequenas de pulmão, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas, câncer de pescoço escamoso, câncer de estômago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, linfoma de células t, câncer cutâneo, testicular, câncer de garganta,

timoma e carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer de células transicionais da pelve renal e ureter, tumor trofoblástico, câncer de ureter e pelve renal, câncer uretral, câncer uterino, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, Tumor de Wilms.

[00520] Em alguns aspectos, o câncer é uma malignidade de células B. Exemplos de malignidades de células B incluem, mas não estão limitados a, Linfomas Não-Hodgkin (NHL), Linfoma Difuso de Grandes Células B (DLBCL), Linfoma Linfocítico Pequeno (SLL/CLL), Linfoma de Células do Manto (MCL), Linfoma Folicular (FL), Linfoma da zona marginal (MZL), Linfoma Extranodal (linfoma MALT), Nodal (Linfoma monocitóide de células B), Esplênico, difuso de células grandes, leucemia/linfoma linfocítico crônico de células B, linfoma de Burkitt e linfoma linfoblástico.

[00521] Em uma modalidade, o indivíduo (por exemplo, humano) recebe uma administração inicial da população de células Treg da invenção, e uma ou mais administrações subsequentes, em que uma ou mais administrações subsequentes são administradas em menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13 , 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior.

[00522] Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células Treg é administrada ou deve ser administrada ao indivíduo.

[00523] Em uma modalidade, a quantidade de células Treg de pelo menos uma população de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo é de pelo menos 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 células.

[00524] Em uma modalidade, a quantidade de células Treg de pelo menos uma população de células Treg da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 102 a cerca de 109, de cerca de 103 a cerca de 108, de cerca de 104 a cerca de 107 ou de cerca de 105 a cerca de 106 células.

[00525] Em outra modalidade, a quantidade de células Treg de pelo menos uma população de células Treg da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 106 a cerca de 109, de cerca de 106 a 107, de cerca de 106 a 108, de cerca de 107 a 109, de cerca de 107 a 108, de cerca de 108 a 109. Em outra modalidade, a quantidade de células Treg de pelo menos uma população de células Treg da invenção administrada ao indivíduo é de cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108 ou é de cerca de 109.

[00526] Em uma modalidade, a quantidade de células Treg de pelo menos uma população de células Treg da invenção administrada ao indivíduo é de pelo menos 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 células/kg de corpo.

[00527] Em uma modalidade, a quantidade de células Treg de pelo menos uma população de células Treg da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 104 a 109 células/kg de peso corporal ou 105 a 108 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas.

[00528] Em uma modalidade, o indivíduo recebe mais de uma administração de pelo menos uma população de células Treg da invenção por semana, por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações de pelo menos uma população de células Treg da invenção são administradas por semana ao indivíduo.

[00529] Em uma modalidade, a pelo menos uma população de células Treg é administrada ao indivíduo em necessidade das mesmas em combinação com um agente ativo. De acordo com uma modalidade, a pelo menos uma população de células Treg é administrada antes da, ao mesmo tempo da, ou após a, administração de um agente ativo.

[00530] Outro objeto da presente invenção é um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento de um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células que expressam IL-23R.

[00531] O artigo de manufatura pode compreender um recipiente e um rótulo ou bula no recipiente ou associado ao mesmo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tal como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a(o) doença ou distúrbio mediada(o) por células que expressam IL-23R, tal como um(a) doença ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a), e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).

Pelo menos um agente ativo na composição é uma população de células Treg da invenção.

[00532] O rótulo ou bula pode indicar que a composição é usada para tratar um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células que expressam IL-23R.

[00533] O artigo de fabricação, rótulo ou bula pode compreender adicionalmente material de instrução para a administração da população de células Treg da invenção ao paciente. Adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como, por exemplo, água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode adicionalmente incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[00534] Outro objeto da invenção é um kit compreendendo pelo menos uma população de células Treg da invenção. Por “kit” entende-se qualquer fabricação (por exemplo, uma embalagem ou um recipiente) compreendendo pelo menos uma população de células Treg da invenção. O kit pode ser promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para realizar os métodos da presente invenção. Além disso, qualquer um ou todos os reagentes do kit pode(m) ser fornecido(s) dentro de recipientes que os protegem do ambiente externo, tal como em recipientes selados.

[00535] Os kits também podem conter uma bula que descreve o kit e os métodos de uso. Também são fornecidos kits que são úteis para várias finalidades (por exemplo, para o tratamento de um(a) doença ou distúrbio mediada(o)(a) por células que expressam IL-23R). Podem ser fornecidos kits que contêm a população de células Treg da invenção. Tal como acontece com o artigo de fabricação, o kit pode compreender um recipiente e um(a) rótulo ou bula no, ou associado ao, recipiente. O recipiente contém uma composição que compreende pelo menos uma população de células Treg da invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contêm, por exemplo, diluentes e tampões. O(a) rótulo ou bula pode fornecer uma descrição da composição, bem como instruções para o uso pretendido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00536] A Figura 1 representa uma vista esquemática de uma construção de receptor de antígeno quimérico anti-IL- 23R (CAR) da invenção (tal como, por exemplo, o CAR tendo uma sequência SEQ ID NO: 54). O CAR anti-IL23R compreende uma sequência líder de CD8 humana (CD8), um scFv direcionado contra o IL23R humano (aIL23R), uma dobradiça CD8 (ligante CD8), um domínio transmembranar derivado do alfa CD8 de humano (CD8 TM), uma ativação domínio de 4-1BB de humano (4- IBB) e CD3 zeta (CD3Z). A construção CAR está em quadro com uma sequência de codificação P2A-GFP.

[00537] A Figura 2 é uma combinação de gráficos de pontos de citometria de fluxo mostrando a eficácia de transdução de Treg e a expressão de membrana do CAR. Os resultados obtidos com dois clones de Treg são mostrados (resultados representativos). A eficácia da transdução foi avaliada pela expressão de GFP em citometria de fluxo. A expressão da membrana do CAR foi avaliada por coloração de proteína-L em citometria de fluxo. Os resultados obtidos com dois clones Treg (clone 1: A-B; clone 2: C-D) são mostrados (resultados representativos). (A, C) Treg transduzida por GFP (SIMULADA), (B, D): Treg transduzida com CAR de IL-23R da invenção.

[00538] A Figura 3 é um histograma que mostra a ativação de Treg mediada por CAR de IL-23R. A ativação de células Treg foi avaliada pela expressão de CD69 por citometria de fluxo 24h após a ativação de Treg não transduzida (SIMULADA) ou Treg transduzida por CAR de IL-23R (CAR de IL-23R) com IL-23R humano recombinante revestido (rhuIL-23R) (5 µg/ml) ou com grânulos revestidos com CD3/CD28 (em uma razão de 1:1 DE grânulo para célula). Os resultados foram expressados como média de 2 doadores diferentes ± SEM.

[00539] A Figura 4 é uma vista esquemática de uma construção de receptor de antígeno quimérico de IL-23R anti- murino (CAR) da invenção. O CAR anti-IL23R compreende uma sequência líder de CD8 humana (CD8), um scFv de reação cruzada direcionado contra o IL23R DE humano/murino (aIL23R), um domínio de dobradiça e transmembranaR derivado do CD28 murino (ligante mCD28 & mCD28 TM), um domínio DE ativação de CD28 DE murino (mCD28) e CD3 zeta DE murino (mCD3Z).

[00540] A Figura 5 é uma combinação de gráficos de pontos de citometria de fluxo mostrando a eficácia de transdução de Treg DE murino. A eficácia da transdução foi avaliada por coloração de NGFR em citometria de fluxo.

[00541] A Figura 6 é um histograma que mostra a ativação de Treg de murino mediada por CAR de IL-23R (mTreg).

A ativação das células mTreg foi avaliada pela expressão de CD69 por citometria de fluxo 24 horas após a ativação de mTreg não transduzida (Poli Treg) ou mTreg transduzida por CAR de IL-23R (mTreg de CAR de IL-23R) com grânulos revestidos de CD3/CD28 ou IL-23R de murino recombinante revestido com placa (1 µg/ml revestido com placa de mIL23R) ou grânulos revestidos com IL-23R de humano ou murino.

[00542] A Figura 7 é um gráfico que mostra que mTregs de CARs de IL-23R exibem atividade supressiva mediada por

CAR eficaz in vitro. Supressão dependente de contato mediada por Treg (A) não tranduzida ou Treg de CAR de IL-23R (B) estimulada através de seu CAR com grânulos revestidos com mIL-23R (razões 1:1 ou 2:1), com grânulos revestidos com CD3/CD28 ou não estimulados (NS) foi avaliada medindo a proliferação de células T convencionais (Tconv) em citometria de fluxo.

[00543] A Figura 8 é uma combinação de gráficos que mostram (A) uma vista esquemática do projeto experimental in vivo e (B) a pontuação PASI do modelo de inflamação da pele induzida por imiquimod de diferentes grupos de camundongos: não tratado (solução salina), tratado i.p. com anti-IL-23, tratado i.v. com poli-mTreg (8x106) ou mTreg de CAR de IL- 23R (8x106).

EXEMPLOS

[00544] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos.

Exemplo 1: Treg de humano de CAR anti-IL23R Material e métodos Células e reagentes

[00545] Células HEK293T (LentiX, Ozyme, França) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com Soro Fetal Bovino (FBS) a 10%.

Isolamento de Treg FoxP3

[00546] Células Treg CD4+CD25+CD127low foram recém isoladas de buffy coats usando o kit de Isolamento de Célula T Regulador CD4+CD127lowCD25+ Humano EasySep™ da StemCell.

Após o isolamento, a pureza foi avaliada por coloração com FoxP3. As células Treg isoladas foram plaqueadas a 5 × 105 células por poço em uma placa de 24 poços (Costar) em meio X-VIVO 15 (Lonza) e ativadas com microgrânulos revestidas com anti-CD3/anti-CD28 (Invitrogen, Carlsbad, CA) em uma razão de grânulo para célula de 1:1. As células Tregs receberam rapamicina (100 ng/ml) ao mesmo tempo que a ativação. Nos dias 2, 5, 7 e 9 foi adicionado IL-2 (1000 unidades/ml, Miltenyi).

Construção de CAR

[00547] O construção de CAR anti-IL23R compreende uma sequência líder de CD8 de humano (aa1-22) (por exemplo, tendo a sequência SEQ ID NO: 39), um scFv direcionado contra o IL23R humano (por exemplo, tendo a sequência SEQ ID NO: 55), uma dobradiça de CD8 (por exemplo, tendo a sequência SEQ ID NO: 13) e o domínio transmembranar derivado do CD8 de humano alfa (aa138-206) (por exemplo, tendo a sequência SEQ ID NO: 21), um domínio de ativação de 4-1BB de humano (aa214-255) (por exemplo, tendo a sequência SEQ ID NO: 29) e CD3 zeta (aa52-164) (por exemplo, tendo a sequência SEQ ID NO: 26).

A construção de CAR está em fase com uma sequência de codificação P2A-GFP.

Vetor e titulação

[00548] As construções de CAR foram produzidas usando um sistema lentiviral de 4 plasmídeos clássico.

Resumidamente, as células HEK293T foram transfectadas com um vetor de transferência lentiviral de terceira geração (pTX266), o plasmídeo que expressa HIV-1 gagpol (pMDLgpRRE), o plasmídeo que expressa HIV-1 rev (pRSV.Rev) e o plasmídeo que expressa VSV-G, a glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular (pMD2.G). Um dia após a transfecção, os sobrenadantes virais foram colhidos, concentrados por centrifugação, aliquotados e congelados a -80 °C para armazenamento a longo prazo. Os títulos infecciosos, expressados como o número de unidades de transdução por mililitro (TU/ml), foram obtidos após a transdução de células T Jurkat com uma diluição em série de sobrenadantes virais e a eficácia de transdução avaliada após 3 dias pelo monitoramento da expressão de proteína fluorescente verde (GFP) usando citometria de fluxo.

Transdução lentiviral

[00549] As Tregs foram transduzidas 2 dias após sua ativação com um receptor quimérico composto pela sequência líder do CD8 seguido por um anti-IL-23R scFv. Esse domínio extracelular está ligado à sequência de sinalização através da dobradiça e da região transmembranar do CD8 de humano. A sequência de sinalização é composta pelo domínio intracelular de 4-1BB seguido pela cadeia CD3z humana intracelular. Resumidamente, a transdução foi realizada carregando 0,5x107 unidades de transdução (TU) por ml para cada poço. Após 6 horas a 37 °C, as partículas virais foram removidas por lavagem. As placas foram então incubadas a 37 °C com 5% de CO2. A eficácia de transdução (avaliada pela expressão de GFP) e o nível de receptores quiméricos na superfície da célula (avaliada por coloração de proteína L) foram verificados 5 dias após a transdução.

Coloração com Proteína-L

[00550] A quantificação da expressão de CAR de superfície celular foi realizada por meio da rotulação do CAR com proteína L conjugada com APC e analisada por citometria de fluxo. Resumidamente, após a lavagem, as células foram recolocadas em suspensão em 0,2 ml do tampão de lavagem gelado (PBS 4% BSA) e incubadas com 5 µg de proteína L a 4 °C por 20 minutos. As células foram lavadas com 0,2 ml do tampão de lavagem gelado três vezes e, em seguida, incubadas (no escuro) com 1 µl de estreptavidina conjugada com APC em 0,2 ml do tampão de lavagem. A coloração de imunofluorescência foi analisada em um MACQUANT (Miltenyi) usando o software MacsQuantify (Miltenyi).

Resultados

[00551] As células Treg humanas foram classificadas usando um kit de células-tronco com base no perfil de CD4+CD127lowCD25+ e pré-estimuladas com grânulos revestidos com anti-CD3/anti-CD28, bem como IL-2 por 2 dias antes da transdução viral. As Treg foram transduzidas com um receptor de antígeno quimérico (CAR de IL-23R) composto por um fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anti-IL-23R e está ligado a uma sequência de sinalização através da dobradiça e da região transmembranar do CD8 de humano, à parte intracelular de um 4-1BB de humano, que por sua vez foi fundida a uma cadeia CD3z de humano intracelular (ver Figura 1).

[00552] O sobrenadante viral foi adicionado a 5x105 Tregs estimulados em 250 µl de meio Xvivo. As células foram cultivadas durante 7 dias com adição de IL-2 a cada 2 dias.

A eficiência de transdução avaliada pela expressão de GFP em células FoxP3 positivas mostra cerca de 80% de GFP+ e todas expressaram o CAR na superfície celular (Figura 2).

[00553] Em seguida, foi examinada a capacidade das Tregs transduzidas de serem ativadas por meio do CAR de IL- 23R. Tregs foram estimuladas com IL-23R de humano recombinante revestido com placa ou IL-23R revestido com grânulos. 24h após a estimulação, o estado de ativação foi analisado por meio da expressão de CD69 em citometria de fluxo.

[00554] A regulação positiva de CD69 na presença de IL-23R humano recombinante revestido com placa ou grânulos demonstra que as Tregs transduzidas de CAR de IL-23R podem ser ativadas através do acionamento de CAR (Figura 3).

Exemplo 2: Treg de murino de CAR anti-IL23R Material e métodos Isolamento de Treg FoxP3

[00555] Células Treg de murino CD4+CD25+ foram recém isoladas de baço de camundongos C57Bl6 usando o Kit de Isolamento de Células T Reguladoras da Life Technologies.

Após o isolamento, a pureza foi avaliada por coloração com FoxP3. Células Treg isoladas foram plaqueadas em 5 × 105 células por poço em uma placa de 24 poços em RPMI 10% SVF e ativadas com microgrânulos revestidas com anti-CD3/anti-CD28 (Invitrogen) em uma razão de 2:1 de grânulo para célula. As células Tregs receberam rapamicina (50 ng/ml) ao mesmo tempo que a ativação e no dia 4. Finalmente, no dia 0, 2, 4, foi adicionada IL-2 (1000 unidades/ml).

Construção de CAR

[00556] A construção de CAR de anti-IL23R de murino utilizado nesse experimento (por exemplo, tendo a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 77 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 78) compreende uma sequência líder de CD8 humana (CD8), um scFv de reação cruzada direcionado contra o IL23R de humano/murino (aIL23R), domínios de dobradiça e transmembranar derivados do CD28 de murino (ligante mCD28 & mCD28 TM), um domínio de ativação de CD28 de murino (mCD28) e CD3 zeta de murino (mCD3Z).

[00557] Vetor e titulação

[00558] As construções CAR foram produzidas usando um sistema lentiviral de 4 plasmídeos clássico. Resumidamente, as células HEK293T foram transfectadas com um vetor de transferência lentiviral de terceira geração, o plasmídeo que expressa HIV-1 gagpol (pMDLgpRRE), o plasmídeo que expressa HIV-1 rev (pRSV.Rev) e o plasmídeo que expressa Eco-MLV, a glicoproteína de envelope do vírus da leucemia de murino ecotrópica (pCMV-Eco). Um dia após a transfecção, os sobrenadantes virais foram colhidos, concentrados por centrifugação, divididos em alíquotas e congelados em -80 °C para armazenamento de longo prazo. Os títulos infecciosos, expressados como o número de unidades de transdução por mililitro (TU/ml), foram obtidos após a transdução de células T Jurkat com uma diluição em série de sobrenadantes virais e a eficiência de transdução avaliada após 3 dias pelo monitoramento da expressão de proteína fluorescente verde (GFP) usando citometria de fluxo.

Transdução lentiviral

[00559] As Tregs foram transduzidas 2 dias após sua ativação com um receptor quimérico composto pela sequência líder do CD8 seguido por um scFv anti-IL-23R. Esse domínio extracelular está ligado à sequência de sinalização através da dobradiça e da região transmembranar do CD8 de humano. A sequência de sinalização é composta pelo domínio intracelular de 4-1BB seguido pela cadeia CD3z de humano intracelular. Resumidamente, a transdução foi realizada carregando 0,5x107 TU/ml em cada poço. Após 6 horas a 37 °C, as partículas virais foram removidas por lavagem. As placas foram então incubadas a 37 °C com CO2 a 5%. A eficácia de transdução (avaliada pela expressão de GFP) e o nível de receptores quiméricos na superfície da célula (avaliada por coloração de proteína L) foram verificados 5 dias após a transdução.

Ensaio de ativação de Tregs CAR

[00560] O ensaio de ativação foi realizado no dia 7 da cultura. Resumidamente, 0,05 x 106 Treg foram semeadas em placa de fundo de 96 U sozinha ou na presença de grânulos revestidos com anti CD28/antiCD3 (em uma razão de 2 para 1 de Treg para grânulos), ou na presença de IL-23R de murino revestido com placa (1 µg/ml) ou na presença de escalonamento de dose de grânulos revestidos de IL-23R humano e murino em um volume final de 200 µl. Após 24h a 37 °C, CO2 a 5%, as células foram coradas para CD4 e CD69 e então analisadas por citometria de fluxo.

Ensaio de supressão de proliferação de células T

[00561] O ensaio de supressão foi realizado no dia 7 da cultura. Os esplenócitos de camundongos OTII (Tg para TCR específico de OVA) foram cocultivados por 4 dias na presença de ovalbumina (100 µg/ml), Tregs não transduzidas (Poli Treg)

ou Tregs de mCAR de IL-23R com ou sem grânulos revestidos com IL-23R de murino ou grânulos anti-CD3/CD28. No dia 4, as células foram colhidas, e a proliferação de CD4 dos esplenócitos foi avaliada por citometria de fluxo através da determinação da diluição do corante 450. A porcentagem de inibição da proliferação de Tconv foi calculada da seguinte forma: % de proliferação de Tconv na pesença de Treg de CAR x 100 100 − % de proliferação de Tconv na ausência de Treg de CAR Inflamação da pele semelhante à psoríase induzida por imiquimod

[00562] Camundongos (C57BL/6) com 8 a 10 semanas de idade receberam uma dose tópica diária de 62,5 mg de creme IMQ disponível comercialmente (5%) (Aldara; 3M Pharmaceuticals) nas costas depiladas por 7 dias consecutivos, camundongos de controle foram tratados de forma similar com um creme de veículo de controle (creme de vaselina Lanette; Fagron). No dia 2, Anti-IL-23 (100 ug) foi injetado intra peritonealmente e 8x106 Treg por camundongo (Poli ou CAR de aIL-23R) foram injetadas por via intravenosa.

Todos os camundongos foram sacrificados no Dia 7. Para avaliar a gravidade da inflamação da pele das costas, um sistema de pontuação objetivo foi desenvolvido com base na área clínica de psoríase e índice de gravidade (PASI).

Vermelhidão, descamação e espessamento foram pontuados independentemente em uma escala de 0 a 4: 0, nenhum; 1, leve; 2, moderado; 3, marcado; 4, muito marcado. O nível de vermelhidão foi avaliado usando uma tabela de pontuação com manchas vermelhas. A pontuação cumulativa (vermelhidão mais descamação mais espessamento) serviu como uma medida da gravidade da inflamação (escala de 0-12). Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética animal de acordo com a legislação francesa sobre experimentos com animais.

Resultados

[00563] Após o isolamento, células Treg de murino (mTreg) foram pré-estimuladas com grânulos revestidos com antiCD3/anti-CD28, bem como IL-2 por 2 dias antes da transdução viral. mTreg foram transduzidas com um receptor de antígeno quimérico (IL-23R-mCAR) composto por um fragmento variável de cadeia única (scFv) do anti-IL-23R hu/ms de reatividade cruzada e está ligado a uma sequência de sinalização através da dobradiça e da região transmembranar do CD8 de murino à parte intracelular de um CD28 de murino que por sua vez foi fundido com uma cadeia CD3z de murino intracelular (Figura 4).

[00564] O sobrenadante viral foi adicionado a 5x105 Tregs estimulados em 250 µl de meio Xvivo. As células foram cultivadas durante 7 dias com adição de IL-2 a cada 2 dias.

A eficiência de transdução, bem como a expressão de CAR na superfície da célula, foi avaliada por coloração de NGFR e mostrou cerca de 70% das células transduzidas expressando CAR na superfície da célula. (Figura 5).

[00565] Em seguida, a capacidade das mTregs transduzidas de serem ativadas por meio do CAR de IL-23R foi examinada. As mTregs foram estimuladas com IL-23R de murino recombinante revestido com placa ou de humano revestido com grânulos, bem como IL-23R de murino. 24h após a estimulação, o estado de ativação foi analisado por meio da expressão de CD69 em citometria de fluxo. A regulação positiva de CD69 na presença de IL-23R de humano/murino recombinante revestido com placa ou grânulos demonstra que as mTregs transduzidas com CAR de IL-23R podem ser ativadas através do acionamento de CAR (Figura 6).

[00566] Finalmente, a característica importante é que as células Treg FOXP3+ transduzidas com CAR de IL-23R mantêm sua função dependente de contato supressiva (Figura 7A e B) através do acionamento do CAR.

[00567] Finalmente, como mostrado na Figura 8 A e B, Treg de CAR de IL-23R foi testada quanto à sua atividade in vivo no modelo de inflamação da pele induzida por imiquimod, um modelo descrito para ser conduzido pelo eixo IL-23/IL- 23R. Um anticorpo anti-IL-23 (quadrados brancos) confirmou que o bloqueio de IL-23 induz uma redução da pontuação clínica. Curiosamente, mTreg de CAR de IL-23R (círculos brancos) também são capazes de induzir uma redução, dois dias após sua infusão i.v., de pontuação clínica, enquanto

Treg policlonal (triângulo branco) não tem efeito no curso clínico.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para pelo menos um receptor de IL-23 (IL-23R), o referido CAR caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um domínio de ligação extracelular, em que o referido domínio de ligação se liga à referida IL-23R, (ii) opcionalmente, um domínio de dobradiça extracelular, (iii) um domínio transmembranar, (iv) um domínio de sinalização intracelular, e, (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

2. CAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação extracelular compreende um fragmento scFv direcionado contra a referida IL-23R.

3. CAR, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação extracelular compreende um fragmento scFv direcionado contra a referida IL-23R, em que o referido scFv compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) tendo a sequência da SEQ ID NO: 37 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 37, um domínio variável da cadeia leve (VL) tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 38, 46 e 56 e sequências tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 38, 46 ou 56, e opcionalmente, um ligante entre o VH e o VL, de preferência em que o referido scFv tem a sequência SEQ ID NO: 55 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 55.

4. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de dobradiça é uma região de dobradiça de CD8 humano, de preferência tendo a sequência de SEQ ID NO: 13 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 13.

5. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembranar é um domínio transmembranar derivado do CD8a humano, de preferência, tendo a sequência de SEQ ID NO: 21 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 21.

6. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador de 4-1BB humano, de preferência tendo a sequência de SEQ ID NO: 29, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 29 e um CD3 zeta humano de sinalização de célula T primária, de preferência, tendo a sequência de SEQ ID NO: 26 ou uma sequência tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 26.

7. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um scFv anti-IL-23R, de preferência, compreendendo um VH tendo a sequência da SEQ ID NO: 37 e um VL tendo a sequência da SEQ ID NO: 38, ligado por um ligante (G4S)3 (SEQ ID NO: 3), (ii) um domínio de dobradiça derivado de CD8a, de preferência SEQ ID NO: 13, (iii) um domínio transmembranar de CD8a humano, de preferência SEQ ID NO: 21, (iv) um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização 4-1BB humano, de preferência, SEQ ID NO: 29, e um domínio de CD3 zeta humano, de preferência SEQ ID NO: 26, e (v) opcionalmente, uma etiqueta e/ou uma sequência líder.

8. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que que codifica um CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 8.

10. População de células T, caracterizada pelo fato de ser manipulada para expressar na superfície celular um CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

11. População de células T, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida população de células T é uma população de células T reguladoras, de preferência, em que a referida população de células T reguladoras é selecionada do grupo que consiste em células CD4+CD25+Foxp3+ Treg, Tr1, células Th3 secretoras de TGF-β, células NKT reguladoras, células T gd reguladoras, células T CD8+ reguladoras, e células T reguladoras duplamente negativas.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma população de células T manipulada para expressar na superfície celular um CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida composição é, de preferência, uma composição farmacêutica compreendendo adicionalmente pelo menos um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

13. Método ex vivo para obter uma população de células T manipulada para expressar na superfície celular um CAR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido método ex vivo compreende a modificação genética, de preferência a transdução, de pelo menos uma célula T com um ácido nucleico que codifica um IL-23R-CAR e, opcionalmente, uma etapa de expansão das células transduzidas.

14. População de células AT, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, ou uma composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de um(a) doença ou distúrbio mediada(o) por células que expressam IL-23R em um indivíduo em necessidade da mesma, em que a referida IL-23R que expressa doença ou distúrbio mediada(o) por células é, de preferência, um(a) doença e/ou distúrbio autoimune e/ou inflamatória(o).

15. População ou composição de células T para uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a(o) referida(o) doença e/ou distúrbio autoimune e/ou inflamatório(a) é selecionada(o) do grupo que consiste em doenças inflamatórias do intestino (tais como, por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica, espondilite anquilosante, diabetes Tipo 1, distúrbios autoimunes da tireoide, esclerose múltipla, Miastenia Gravis, psoríase, artrite psoriática e uveíte e, de preferência, a(o) doença e/ou distúrbio inflamatória(o) é doença de Crohn.