KR20190038919A - 항-nkg2d 항체로 크론병을 치료하는 방법 - Google Patents

항-nkg2d 항체로 크론병을 치료하는 방법 Download PDF

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캐리 브로드메르켈
마크 커렌
린다 그린바움
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 NKG2D에 결합하는 항체로 크론병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-NGK2D 항체의 투여를 위한 투여 요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-NKG2D 항체로 치료하기 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-NKG2D 항체로 크론병을 치료하는 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2017년 8월 17일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JBI5096WOPCT_SL.txt이며, 크기가 5,922 바이트이다.
기술분야
본 발명은 NKG2D에 결합하는 항체로 크론병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 항-NGK2D 항체의 투여를 위한 투여 요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-NKG2D 항체로 치료하기 위한 환자를 선택하는 방법에 관한 것이다.
크론병(CD)은 비제어된 면역 반응을 특징으로 하는 만성 과민성 장질환이다 (문헌[Baumgart DC, Sandborn WJ. Lancet 2012;380:1590―605; Mayer L. J Gastroenterol 2010;45:9―16]). CD를 위한 치료법은 면역 억제제 또는 생물학적 치료제를 이용한 염증 작용의 차단에 의한 면역계의 억제에 기초한다. 주로 항-종양 괴사 인자(TNF) 단클론성 항체의 개발 및 광범위한 사용으로 인해, 지난 10 년에 걸쳐 상당한 진전이 있었다. 초기 효능에도 불구하고, 장기적인 이익은 항-TNF 항체로 치료된 CD에 걸린 환자의 절반 미만에서 관찰된다. (문헌[Allez M, Vermeire S, Mozziconacci N, et al. antibodies. Aliment Pharmacol Ther 2010;31:92―101]). 면역 세포의 트래피킹(trafficking)을 표적화하는 단클론성 항체를 포함하는, 새로운 표적을 갖는 생물제제가 개발되어 왔으나, 신규한 작용 기전을 갖는 치료법이 여전히 필요하다.
CD에서의 장의 염증성 병변의 지속은 면역 세포와 비-면역 세포 사이의 활성 크로스토크(crosstalk)에 의해 매개되고, T 세포는 이러한 병원성 작용에서 핵심 플레이어이다(문헌[Allez M, Mayer L. Regulatory T cells: Peace keepers in the gut. Inflamm Bowel Dis 2004;10:666-76]). 염증 점막은, 염증성 사이토카인을 생성하고, 세포독성 특성을 나타내고, 점막 손상에 기여하는 활성화된 T 림프구로 심하게 침윤된다 (문헌[Croitoru K, Zhou P. T-cell-induced mucosal damage in the intestine. Curr Opin Gastroenterol 2004;20:581―6.; Neurath MF, Finotto S, Fuss I, et al. Trends Immunol 2001;22:21―6]). 이들 면역 세포의 축적은 혈류로부터의 능동적 동원, 지속적인 세포 순환 및 아폽토시스를 겪는 세포의 감수성 감소에 의존한다. T 세포 활성화는 T 세포 수용체에 의한 특이적 항원의 인식 및 수반되는 공동자극 신호의 전달에 의존한다. 흥미롭게도, 점막 T 세포는 이러한 공동자극 신호를 제공하는 내재성 수용체를 발현할 수 있다. 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)는 특정 조건 하에서 자연 살해(NK) 세포, 일부 NK T 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, 감마-델타 T 세포 및 CD4+ T 세포의 표면 상에 존재하는 활성화 수용체이다. (문헌[Champsaur M, Lanier LL. Immunol Rev 2010;235:267―85]; 문헌[Jamieson AM, Diefenbach A, McMahon CW, et al. Immunity 2002;17:19―29]).
인간 NKG2D에 결합하는 리간드는 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 관련 분자 A와 B 및 UL-16 결합성 단백질이며, 이들 모두는 세포 스트레스에 의해 발현이 증가한다. (문헌[Groh V, Bahram S, Bauer S, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:12445―50]). 다수의 이들 NKG2D 리간드가 상피 세포 상에서 발현되고, IBD의 염증 점막에서 상향 조절된다 (문헌[Allez M, Tieng V, Nakazawa A, et al. Gastroenterology 2007;132:2346-58]; 문헌[La Scaleia R, Stoppacciaro A, Oliva S, et al. Inflamm Bowel Dis 2012;18:1910-22]; 문헌[Tieng V,
Figure pct00001
du Merle L, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:2977-82]). 따라서, 장 상피는 NKG2D 경로를 통한 직접적인 상호작용을 통해 다양한 T 세포 반응을 조절할 수 있다 (문헌[Allez M, Mayer L. Inflamm Bowel Dis 2004;10:666-76]; 문헌[h V, Bahram S, Bauer S, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:12445―50]). CD4+ T 세포 상에서의 NKG2D의 증가된 발현이 CD에서 관찰된다 (문헌[Allez M, Tieng V, Nakazawa A, et al. Gastroenterology 2007;132:2346-58]). CD4+NKG2D+ T 세포는 특이적 세포독성 활성을 나타내고, NKG2D 리간드를 발현하는 표적 세포를 생체외에서 사멸시킬 수 있고, 또한 염증성 사이토카인 (예를 들어, TNFα, 인터페론 (IFN) γ 및 인터류킨-17(IL-17))의 중요한 공급원이다 (문헌[Allez M, Tieng V, Nakazawa A, et al. Gastroenterology 2007;132:2346-58]; 문헌[Pariente B, Mocan I, Camus M, et al. Gastroenterology 2011;141:217―26, 226.e1―2]). 이들 사이토카인의 생성은 T 세포 수용체 및 NKG2D 수용체의 공동자극에 의해 생체외에서 크게 향상된다 (문헌[Allez M, Tieng V, Nakazawa A, et al. Gastroenterology 2007;132:2346-58]; 문헌[Pariente B, Mocan I, Camus M, et al. Gastroenterology 2011;141:217―26, 226.e1―2]). 흥미롭게도, CD에 걸린 환자의 염증 점막에 발견되는 대부분의 T 세포 올리고클로날(oligoclonal) 확장은 NKG2D를 발현하는 CD4+ T 세포에 상응한다 (문헌[Camus M, Esses S, Pariente B, et al. Immunol 2014;7:325-34]). 장 염증에서의 CD4+NKG2D+ T 세포의 관련은 전달유도 대장염(transferinduced colitis)의 뮤린 모델에서 추가로 입증되었다(문헌[Kjellev S, Haase C, Lundsgaard D, et al. Eur J Immunol 2007;37:1397-406]; 문헌[Ito Y, Kanai T, Totsuka T, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294:G199―207]). 특이적 NKG2D-차단 항체의 투여는 CD4+ T 세포 상에서의 NKG2D 발현을 감소시켰고 대장염의 발병을 약화시켰다. NKG2D는, 셀리악병에서 보여진 바와 같이 (문헌[
Figure pct00002
Mention JJ, Monteiro RC, et al. Immunity 2004;21:367―77]; 문헌[Meresse B, Chen Z, Ciszewski C, et al. Immunity 2004;21:357―66]), CD8+ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 다른 T 세포 서브세트의 기능, 특히 세포독성을 또한 조절할 수 있다. 이들 데이터는 CD의 이펙터 T 세포의 과활성화에서 NKG2D 경로의 잠재적 역할을 뒷받침한다.
따라서, 항-NKG2D 항체를 이용한 크론병에 걸린 대상체의 치료를 위한 효과적인 투여 요법뿐만 아니라 항-NKG2D 항체가 임상 효능을 나타낼 환자를 선택하는 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다. 본 발명은 그러한 방법을 제공한다.
본 출원은 크론병을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 서열 번호 3, 4 및 5에 각각 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과, 서열 번호 6, 7, 및 8에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는, 안전하고 유효한 양의 항-NKG2D 항체를 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-NKG2D 항체는 적어도 1 회의 투여 사이클로 투여되며, 그 적어도 1 회 투여 사이클 각각에 대하여, 항-NKG2D 항체는 다음과 같이 투여된다: (a) 400 mg 항-NKG2D 항체의 1 회 용량 및 (b) 200 mg 항-NKG2D 항체의 적어도 1 회 용량.
일부 실시 형태에서 항-NKG2D 항체는 정맥내 또는 피하 투여를 위해 제형화된다.
일부 실시 형태에서, 항-NKG2D 처리는 최대 6 회의 사이클로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 항-NKG2D 항체의 200 mg 용량이 11 회 투여된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서 NKG2D 항체의 주기적인 투여는 초기 용량의 투여 후 22 주 동안 2 주마다 1 회이다.
일부 실시 형태에서, 항-NKG2D 항체의 양은 대상체에서 크론병의 증상을 감소시키거나, 임상 반응을 유도하거나, 임상 관해를 유도 또는 유지하거나, 질병 진행을 저해하거나, 또는 대상체에서 질병 합병증을 억제하는 데 효과적이다.
일부 실시 형태에서, 항-NKG2D 항체의 양은 대상체의 크론병 활성 지수(Crohn's Disease Activity Index) 점수를 감소시키거나, 대상체의 C 반응성 단백질(C-Reactive Protein) 수준을 낮추거나, 대상체의 대변 칼프로테인(calprotein) 수준을 낮추거나, 또는 대상체에서 개방성 배출 누공(open draining fistula) 개수를 감소시키는 데 효과적이다.
다른 실시 형태에서 대상체는 항-NKG2D 항체의 투여 전에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) rs2255336 및 rs2239705에 대해 양성으로 시험되었다.
바람직한 실시 형태에서, 항-NKG2D 항체는 서열 번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 크론병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
(a) 상기 인간 환자로부터 생물학적 샘플을 얻고 그 생물학적 샘플에 대해 유전자형 검정을 수행함으로써, 상기 인간 환자가 NKG2D 수용체 유전자 또는 MICB 유전자에 SNP를 갖는지 여부를 결정하는 단계;
(b) 상기 환자가 SNP를 가진 경우 항-NKG2D 수용체 항체를 투여하는 단계를 포함하며,
항-NKG2D 항체는 서열 번호 3, 4 및 5에 각각 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과, 서열 번호 6, 7, 및 8에 각각 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
도 1: 항-NKG2D 임상 연구의 개략도.
도 2: 항-NKG2D 임상 연구의 파트 I 의 개략적 개요. (*) 는 1차 종점(primary endpoint)에 대한 시점을 나타내고, (**) 는 최종 효능 및 안전성 방문을 나타내었으며, (†) 위약 무반응자는 12 주째 400 mg 및 14 주째 내지 22 주째 200 mg의 높은 용량을 투여받는다.
도 3: 항-NKG2D 임상 연구의 파트 II 의 개략적 개요. (*) 는 1차 종점에 대한 시점을 나타내고, (**) 는 최종 효능 및 안전성 방문을 나타내었으며, (†) 위약 무반응자는 12 주째의 150 mg, 14 주째, 16 주째, 및 20 주째의 75 mg의 중간 용량을 투여받고, (‡) Bio-IR (불내성/불응성)은 1:1:1:1:1 비로 무작위 배정될 것이다.
도 4: MICB-rs2239705 및 NKG2D-rs2255336 SNP에 대한 유전자형에 기초한 항-NKG2D 치료된 환자에서의 CDAI 점수의 변화를 나타내는 그래프.
정의:
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "hNKG2D", 및 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 경우, "NKG2-D", "CD314", "D1252489E", "KLRK1", "살해 세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 K의 멤버 1", 및 "KLRK1"로도 알려진 용어 "NKG2D"는 인간 살해 세포 활성화 수용체 유전자, 이의 mRNA (예를 들어, NCBI RefSeq NM―007360), 및 이의 유전자 생성물 (서열 번호 9로 나타낸 NCBI RefSeq NP―031386), 또는 이의 자연 발생적 변이체를 지칭한다. NK 및 T 세포에서, hNKG2D 수용체의 리간드 결합 형태는 동종이량체이다 (문헌[Li et al, Nat Immunol 2001; 2:443-451]). hNKG2D 수용체는 전형적으로 DAP10과의 복합체로 표면에 제시되고 (문헌[Wu et al, J Exp Med 2000; 192:1059 et seq.]; NCBI 수탁번호 AAG29425, AAD50293), 더 고차의 복합체를 또한 형성하는 것으로 제안되었다. 본 명세서에서 hNKG2D에 기인하는 임의의 활성, 예를 들어, 세포 활성화, 항체 인식 등은 또한 DAP10, 및/또는 다른 성분들과의 복합체 또는 더 고차의 복합체 형태의 hNKG2D에 기인할 수 있다.
인간 NKG2D (서열 번호 9)
Figure pct00003
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 전장 단클론성 항체, 다클론성 항체, 및 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 경우, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이의 항원 결합성 단편, 항체 변이체, 및 다중특이성 분자를 포함한다. 일반적으로, 전장 항체는 다이설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H) 쇄와 2개의 경(L) 쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합성 부분이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VH로 약기됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VL로 약기됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합성 도메인을 포함한다. 항체 분자 구조의 일반적인 원리 및 항체의 생산과 관련된 다양한 기술이, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에 제공된다.
항체의 "항원 결합성 단편"은, 전형적으로 적어도 VH 영역의 하나 이상의 부분을 포함하는, 항원에 검출 가능하게 결합할 수 있는 전장 항체의 부분을 포함하는 분자이다. 항원 결합성 단편은 항체의 1개, 2개, 3개, 또는 그 초과의 항원 결합성 부분을 포함하는 다가 분자, 및 VL 및 VH 영역, 또는 이들의 선택된 부분이 합성 링커에 의해 또는 재조합 방법에 의해 연결되어 기능적 항원 결합성 분자를 형성하는 단일 사슬 작제물을 포함한다. 항체의 일부 항원 결합성 단편은 더 큰 항체 분자의 실제 단편화 (예를 들어, 효소적 절단)에 의해 얻어질 수 있지만, 대부분은 전형적으로 재조합 기술에 의해 생성된다.
용어 "항체 유도체" 및 "면역접합체"는 전장 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자를 나타내기 위해 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 항체를 제2 분자에 연결하기 위하여, 예를 들어, 알킬화, 페길화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된다. 예시적인 변형은 페길화 (예를 들어, 시스테인-페길화), 바이오티닐화, 방사성 표지화, 및 제2 작용제 (예를 들면, 세포독성제)와의 접합을 포함한다.
"다중특이성 분자"는, 적어도 하나의 다른 기능성 분자 (예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질, 예를 들어 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)와 회합되거나 이에 연결됨으로써 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 분자를 형성하는, 항체, 또는 이의 항원 결합성 단편을 포함한다. 예시적인 다중특이성 분자는 이중 특이적 항체 및 가용성 수용체 단편 또는 리간드에 연결된 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 (즉, 동일하거나 본질적으로 동일한) 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 이 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 "유래"된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상으로 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
"인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 대부분, 인간화 항체는, 수령자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력(capacity)을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린 (수령자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수령자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 또한 선택적으로 포함할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 예를 들어 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)], WO 92/02190호, 미국 특허 출원 제20060073137호, 및 미국 특허 제6,750,325호, 제6,632,927호, 제6,639,055호, 제6,548,640호, 제6,407,213호, 제6,180,370호, 제6,054,297호, 제5,929,212호, 제5,895,205호, 제5,886,152호, 제5,877,293호, 제5,869,619호, 제5,821,337호, 제5,821,123호, 제5,770,196호, 제5,777,085호, 제5,766,886호, 제5,714,350호, 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,530,101호, 제5,585,089호, 및 제5,225,539호를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917])를 포함한다. 전형적으로, 이 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 상기 문헌[Kabat et al.]에 기재된 방법에 의해 수행된다. 본 명세서에서 "카밧(Kabat) 위치", "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 및 "카밧에 따른"이라는 어구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이러한 넘버링 시스템을 지칭한다. 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 그러한 것 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입물 (카밧에 따른 잔기 52a)을 그리고 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은, 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
"프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 CDR 이외의 VH 또는 VL 잔기이다.
"에피토프" 또는 "결합성 부위"는 항원 결합성 펩티드 (예를 들어, 항체)가 특이적으로 결합하는 항원 상의 구역 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우세 성분으로도 일컬어짐), 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (다시 말하면, 이러한 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 "용매 배제된 표면" 및/또는 풋프린트(footprint) 내에 있음)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 에피토프는, 달리 언급되지 않는 경우 (예를 들어, 일부 문맥에서 본 발명은 특정 아미노산 잔기에 직접 결합하는 항체에 관한 것임), 항-hNKG2D 항체, 또는 본 발명에 따른 hNKG2D 특이적 작용제에 특이적으로 결합하는 hNKG2D의 임의의 특정 영역 중에 둘 모두의 유형의 아미노산 결합성 부위를 포함한다. NKG2D는 다수의 상이한 에피토프를 포함할 수 있으며, 이들 에피토프는 제한없이 (1) 선형 펩티드 항원 결정기, (2) 성숙 NKG2D 입체형태로 서로 가까이 위치하는 하나 이상의 비-인접 아미노산으로 이루어진 입체구조형 항원 결정기; 및 (3) 탄수화물 기와 같은 NKG2D에 공유 결합된 분자 구조의 전부 또는 일부로 이루어진 번역후 항원 결정기를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 경우, 입체구조형 항원 결정기는 항원 결합성 펩티드의 원자로부터 약 4Å 거리 내에 NKG2D 아미노산 잔기를 포함한다.
관심 대상의 항체 (예를 들어, MS 또는 21F2)와 "본질적으로 동일한 에피토프 또는 결정기에 결합하는" 이라는 어구는 어떤 항체가 상기 관심 대상의 항체가 특이적으로 결합하는 NKG2D 분자에 대해 상기 관심 대상의 항체와 "경쟁하는" 것을 의미한다.
"파라토프"는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합성 부분의 구역 또는 영역이다. 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 명확히 모순되지 않는 경우, 파라토프는, 에피토프 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기로서, 이들 중 몇몇은 전형적으로 CDR 내에 있는 아미노산 잔기, 및 특이적으로 결합된 항원에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같은, 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기 (다시 말하면, 이 아미노산 잔기는 특이적으로 결합된 항원의 "용매 배제된 표면" 및/또는 "풋프린트" 내에 있음)를 포함할 수 있다.
NKG2D 분자가 천연 NKG2D-리간드 (예를 들어, MICA)로의 NKG2D 분자의 결합을 "차단"하는 항-NKG2D 항체의 능력은, 가용성 또는 세포 표면 회합된 NKG2D 및 리간드 분자를 사용하는 검정에서, 항체가 리간드로의 NKG2D 분자의 결합을 용량 의존적 방식으로 검출 가능하게 감소시킬 수 있음을 의미하며, 이 NKG2D 분자는 항체의 부재 하에 리간드에 검출 가능하게 결합한다. 항-NKG2D 항체가 MICA 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 예시적인 검정이 실시예 3에 제공된다. 동일한 검정이 다른 NKG2D 리간드의 항체 매개된 차단을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
폴리펩티드의 "변이체"는 기준 폴리펩티드, 전형적으로 천연 또는 "모(parent)" 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드 변이체는 천연 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을, 그리고/또는 하나 또는 둘 모두의 말단에서 첨가를 가질 수 있다.
2개의 아미노산 서열과 관련하여 용어 "실질적으로 동일한"은, 예를 들어 디폴트 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 서열들이 적어도 약 50% 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 전형적으로, 실질적으로 동일한 서열은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 나타낼 것이다.
2개의 실질적으로 동일한 아미노산 서열에서의 "상응하는" 아미노산 위치는 본 명세서에서 언급되는 임의의 단백질 분석 소프트웨어에 의해 정렬된 것이다.
핵산 서열 (또는 요소)은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 다른 핵산 서열 (또는 요소)에 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(secretory leader)를 위한 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우 그 폴리펩타이드에 대한 (즉, 이의 발현을 코딩하는) DNA에 작동 가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는, 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 경우 그 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합성 부위는, 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열들이 인접해 있고, 분비 리더의 경우에는 인접해 있고 판독 상태로 있음을 의미한다. 그러나, 일부 요소, 예를 들어 인핸서는 작동 가능하게 연결되도록 코딩 서열과 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 전형적으로 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용될 수 있다.
"단리된" 분자는, 그것이 속하는 분자의 부류와 관련하여 발견되는 조성에서 주된 종인 분자이다 (즉, 이 분자는 조성에서 분자 유형의 적어도 약 50%를 구성하고, 전형적으로 조성에서 분자의 종, 예를 들어 펩티드의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과를 구성할 것임). 일반적으로, 항체 분자의 조성은 조성에서 모든 존재하는 펩티드 종과 관련하여 또는 적어도 제안된 용도와 관련하여 실질적으로 활성인 펩티드 종에 관하여 항체 분자에 대해 98%, 98%, 또는 99%의 균일성을 나타낼 것이다.
용어 "치료하는", 및 "치료" 등은 일반적으로 원하는 약리학적, 생리학적 또는 치료적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 이 효과는 질병, 이의 증상 또는 상태를 예방 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나, 질병, 질병에 기인하는 상태, 증상 또는 유해 효과의 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질병의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하지 못하게 하는 것; (b) 질병을 저해하는 것, 즉, 그의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉, 질병 및/또는 그의 증상 또는 상태의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다. 본 발명은 병리학적 염증과 관련된 질병을 앓는 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 장기간에 걸친 병리학적 염증에 기인하고/하거나 장기간에 걸친 생물학적 시스템에 존재하는 부적절한 염증에 대한 생리적 반응에 의해 야기된 유해 효과를 예방, 저해, 또는 완화하는 데 관여한다.
일 태양에서, 본 발명은 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은, 예를 들어, 대상체에 대해 대체로 건강에 좋은 효과를 가질 수 있는데, 예를 들어 대상체의 예상 수명을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 방법은, 예를 들어 질병, 장애, 질환, 또는 병 ("질환")을 치료, 예방, 치유, 완화, 또는 개선 ("치료") 할 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 질환은 대상체에서 NKG2D의 활성을 (부분적으로 또는 완전히) 감소시킴으로써 치료 가능하다. 치료는 치료적 투여 (즉, 질병 또는 질환의 징후 및 증상이 명백할 때의 투여)뿐만 아니라 예방적 또는 유지 치료법 (즉, 질병 또는 질환이 무활동 상태(quiescent)일 때의 투여) 둘 모두뿐만 아니라, 관해를 유도하고/하거나 관해를 유지하도록 처리하는 것을 포함한다. 따라서, 질병 또는 질환의 중증도가 (부분적으로, 유의하게 또는 완전히) 감소될 수 있거나, 징후 및 증상이 예방 또는 지연될 수 있다 (발병 지연, 관해 연장, 또는 무활동).
본 발명에 따라 치료될 질환은 NKG2D가 근본적인 질병 또는 장애와 관련되거나 이에 기여하는 데 역할을 하거나 그렇지 않으면 음성 증상에 기여하는 질환이다. 그러한 질환은 크론병을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일 뉴클레오티드 다형성" 또는 "SNP"는 일련의 DNA에서 단일 뉴클레오티드 염기에 발생하는 일반적인 변경이다. 예를 들어, SNP는 DNA의 1,000 개 염기마다 1 회 발생할 수 있다. SNP는 질병 작용에 관여할 수 있지만, 대부분은 질병과 관련되지 않을 수 있다. 그러한 SNP의 발생에 기초한 유전자 맵이 주어지면, 개체들은 이들 개개의 유전체에서의 SNP의 특정 패턴에 따라 유전적 카테고리로 그룹화될 수 있다. 그러한 방식으로, 치료 요법은 유전적으로 유사한 개체들의 그룹에 맞추어질 수 있으며, 이때 그러한 유전적으로 유사한 개체들 사이에서 공통적일 수 있는 형질을 고려한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하플로타입(haplotype)"은 함께 유전되는 경향이 있는 유전자 군, DNA의 변이 또는 SNP의 세트를 지칭한다. 이는 또한 동일한 염색체 상에서 발견되는 대립유전자의 조합 또는 SNP의 세트를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "안전하고 유효한 양의 항-NKG2D 항체"는 대상체에 투여될 때 허용되지 않는 약물 관련 유해 사건을 야기하지 않으면서 크론병 또는 이와 관련된 증상을 치료하는 데 효과적인 항-NKG2D 항체의 양을 의미한다.
투여 요법과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "효능"은 특정 치료 요법의 유효성을 지칭한다. 효능은 본 발명의 작용제에 반응한 질병 경과의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 일 실시 형태에서, 항원 결합성 단백질 (예를 들어, 항-NKG2D 항체)은 치료되고 있는 장애의 중증도를 반영하는 적어도 하나의 지표의 개선, 바람직하게는 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 양으로 그리고 시간 동안 대상체에 투여된다. 대상체의 병, 질병 또는 질환의 정도를 반영하는 다양한 지표가 치료의 양 및 시간이 충분한지 여부를 결정하기 위해 평가될 수 있다. 그러한 지표는, 예를 들어 당해 장애의 질병 중증도, 증상, 또는 징후의 임상적으로 인식된 지표를 포함한다. 개선의 정도는 일반적으로 의사에 의해 결정되며, 이때 의사는 징후, 증상, 생검, 또는 다른 시험 결과에 기초하여 이러한 결정을 할 수 있고, 대상체에게 적용되는 질문지, 예를 들어 주어진 질병에 대해 개발된 삶의 질 질문지를 또한 이용할 수 있다.
NKG2D 특이적 항체는 대상체의 질환의 개선을 달성하기 위해 투여될 수 있다. 개선은 질병 활성 지수의 감소에 의해, 임상 증상의 개선에 의해 또는 질병 활성의 임의의 다른 척도에 의해 나타날 수 있다. 하나의 그러한 질병 지수는 크론병 활동성 지수(Crohn's Disease Activity Index, CDAI) 이다. 이 지수는 8개의 인자들로 이루어지며, 각각은 가중 인자로 조정된 후에 합산된다. CDAI 의 구성 요소 및 가중 인자는 다음과 같다:
Figure pct00004
항-NKG2D 항체
본 발명의 항체는 특정 기능적 및/또는 구조적 특징 또는 특성에 의해 특성화된다. 항-hNKG2D 항체의 기능적 활성을 평가하기 위한 검정은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,879,985호에 상세히 기재되어 있고, 예를 들어, 아미노산 서열과 같은 구조적 특성은 또한 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,879,985호에 기재되어 있다.
기능적 특성
본 발명의 항체는 hNKG2D에 결합한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 높은 친화도로, 예를 들어, 10-7 M 이하의 KD, 10-8 M 이하의 KD, 1 nM 이하의 KD, 0.3 nM 이하의 KD, 0.2 nM 이하의 KD, 0.1 nM 이하, 0.05 nM 이하, 또는 0.01 nM 이하로 hNKG2D에 결합한다. 특정 실시 형태에서, 항체는 0.1 nM 이하의 친화도로 hNKG2D에 결합한다.
일 태양에서, 본 발명은 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis), NCBI 수탁 번호 AJ426429) 및 레서스 원숭이 (마카카 뮬라타(Macaca mulatta), NCBI 수탁 번호 AJ554302)와 같은 원숭이의 하나 이상의 NKG2D 오르토로그에, 및/또는 hNKG2D 동종이량체, 올바르게 폴딩된 단량체 전장 hNKG2D, hNKG2D의 세포외 부분을 포함하는 hNKG2D 단편, 변성된 hNKG2D, 또는 앞서 언급한 NKG2D 형태들의 임의의 조합에 또한 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제7,987,985호의 실시예 5에 나타난 바와 같이, 특정 사이노몰거스 세포 유형으로의 인간 항체 21F2 및 MS의 결합은, 상응하는 EC50 (즉, 반수 최대 유효 농도) 값에 따르면, 동일한 인간 세포 유형으로의 그들의 결합의 각각 약 65% 및 약 75% 초과였다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 hNKG2D에 결합하는 것과 유사한 친화도 또는 효능으로 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D에 결합한다. 예를 들어, 항체는, NKG2D 발현 인간 NK 또는 T 세포의 상응하는 집단에 대한 상응하는 EC50의 약 50% 이상, 약 65% 이상, 또는 약 75% 이상의 EC50으로 NKG2D 발현 사이노몰거스 또는 레서스 NK 또는 T 세포에 결합할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 hNKG2D에 대한 친화도의 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 65% 이상, 또는 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상의 친화도로 사이노몰거스 또는 레서스 NKG2D에 결합할 수 있다. 그러한 항체는 인간에 사용하기 전에 가장 적합한 동물 모델(들)에서 독성 시험이 가능하다는 이점을 가진다.
하나의 특정 태양에서, 본 발명의 항체는 또한 ON72와 같은 알려진 뮤린 항-hNKG2D 항체가 결합하지 않는 NKG2D의 형태와 결합한다. 구체적으로, 미국 특허 제7,987,985호의 실시예 3에 기재된 바와 같이, ON72와의 사전 인큐베이션은 후속적으로 첨가된 인간 16F16 항체의 약 82%만을 hNKG2D로의 결합으로부터 차단한 반면, 16F16과의 사전 인큐베이션은 후속적으로 첨가된 ON72의 약 95%를 hNKG2D로의 결합으로부터 차단하였다.
더욱이, 본 발명의 항체는 NK 또는 T 세포의 hNKG2D 매개된 활성화를 감소시키거나 저해할 수 있으며, 즉, hNKG2D 수용체를 길항할 수 있다. 이는, 예를 들어 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려져 있는 하나 이상의 세포독성 검정에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 항체는, 임의의 항-hNKG2D 항체의 부재 하 또는 비-특이적 대조 항체의 존재 하에서의 표적 세포 사멸과 비교하여, NKG2D 리간드 발현 표적 세포의 NK 또는 T 세포 매개된 사멸을 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 저해하는 경우, NK 또는 T 세포의 hNKG2D 매개된 활성화를 저해한다.
hNKG2D 길항제인 본 발명의 항체는 효능제 활성이 없거나 낮을 수 있다. 바람직하게는, 그러한 항체는 인간 항체이거나 인간화된다. 효능제 활성은 본 명세서에 기재된 검정, 또는 당업계에 알려져 있는 검정 중 하나에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 하나의 유형의 검정은 고정된 항-NKG2D 항체의 존재 또는 부재 하에 낮은 수준의 CD3로 자극된 말초 혈액 림프구(PBMC)의 증식을 측정하는 공동자극 검정이다 (미국 특허 제7,987,985호의 실시예 10 참조). 그러한 검정에서, 본 발명의 항체의 존재 하에서의 증식은 항체의 부재 하에서보다 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하이거나 그보다 유의하게 높지 않다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 존재 하에서의 증식은 항체의 부재 하에서보다 유의하게 높지 않다. 추가의 또는 대안적인 실시 형태에서, 효능제 검정에서 본 발명의 항체의 hNKG2D 효능제 활성은 대조군 값보다 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하이거나, 그보다 유의하게 높지 않다. 대조군은 바람직하게는, 예를 들어, 항체의 부재 하, 세포 또는 다른 시약의 부재 하, 및/또는 무관한 항체의 존재 하에서와 같은 음성 대조군이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 효능제 활성은 대조군 값보다 유의하게 높지 않다.
다른 태양에서, 본 발명은 NK 또는 T 세포의 세포 표면 NKG2D로 결합하기 위한 것보다 리간드 유도된 세포독성을 차단하기 위해 더 낮은, 바람직하게는 실질적으로 낮은 EC50 농도를 갖는 항체를 제공한다. 예를 들어, ON72의 경우, BaF/3 세포 상에 발현된 세포 표면 NKG2D로 결합하기 위한 EC50 농도 (0.062 ㎍/ml)가 리간드 (ULBP3) 발현 표적 세포의 NK 세포 매개된 사멸을 차단하기 위한 EC50 농도 (0.065 ㎍/ml)와 유사한 반면, 세포 표면 NKG2D로 결합하기 위한 것 (21F2: 0.033 ㎍/ml; MS: 0.032 g/ml)보다 세포독성을 차단하기 위해 (21F2: 0.021 ㎍/ml; MS: 0.012 ㎍/ml) 21F2는 더 낮은, 그리고 MS는 실질적으로 더 낮은 EC50을 가졌다 (미국 특허 제7,987,985호의 실시예 6 및 실시예 9 참조). 또한, MS는 21F2 및 16F16 (포화 농도 이상에 상응하는 농도를 가졌음, 미국 특허 제7,987,985호의 도 3)보다 낮은 농도 (세포 관련된 NKG2D 수용체의 약 80% 포화에만 상응하는 농도, 미국 특허 제7,987,985호의 도 3)에서 세포독성의 최대 차단을 달성하였다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 NK 또는 T 세포의 세포 표면 NKG2D로 결합하기 위한 것보다 리간드 유도된 세포독성을 차단하기 위해 더 낮은 EC50 농도를 가지는 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체를 제공한다. 세포주 또는 다른 적합한 제제의 NK 또는 T 세포의 세포독성을 차단하기 위한 EC50은, 예를 들어 동일한 세포주 또는 제제의 세포 표면 NKG2D로 결합하기 위한 EC50의 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 50% 이하, 또는 약 40% 이하일 수 있다. 시험을 위한 예시적인 세포주는 NK-92 및 NKL 세포를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 이용 가능한 hNKG2D 수용체를 포화시키는 데 필요한 농도보다 낮은 농도에서 NK 세포 세포독성의 최대 차단을 달성하는 항체를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 항체는 또한 hNKG2D에 결합함에 있어서 MS와 경쟁한다. 다른 특정 실시 형태에서, 그러한 항체는 MS와 본질적으로 동일한 hNKG2D 에피토프에 결합한다.
항체는, 예를 들어 하나 이상의 내인성 hNKG2D 리간드의 hNKG2D 결합을 간섭함으로써 NKG2D 매개된 활성화를 감소시키거나 저해할 수 있다. 예를 들어, 항체는, 예를 들어, MICA; 또는 MICA 및 MICB; 또는 MICA 및 ULBP3; 또는 MICA, MICB, 및 ULBP3; 또는 MICA, MICB, 및 모든 ULBP1, ULBP2, ULBP3, 및 ULBP4; 또는 MICA, MICB, 및 하나 이상의 RAET1 패밀리 구성원의 hNKG2D 결합을 감소시키거나 저해함으로써, MICA; MICB; ULBP1; ULBP2; ULBP4; 및/또는 RAET1 패밀리 구성원의 hNKG2D 결합을 감소시키거나 저해할 수 있다. 내인성 NKG2D 리간드의 hNKG2D 결합을 저해하는 항체의 능력은 본 명세서에 기재된 결합 또는 경쟁 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 리간드 결합의 적어도 30%, 또는 리간드 결합의 적어도 50%, 또는 리간드 결합의 적어도 70%, 또는 리간드 결합의 적어도 80%, 또는 리간드 결합의 적어도 90%를 저해할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 1 ㎍의 MICA-mFc의 hNKG2D 결합을 저해하기 위한 본 발명의 항체에 대한 IC50은 1 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.05 nM 이하, 또는 0.02 nM 이하, 0.01 nM 이하, 0.005 이하, 또는 0.002 이하이다. 다른 실시 형태에서, 1 ㎍의 MICA-mFc 결합의 완전한 차단은 5 nM 이하, 1 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.5 nM 이하, 또는 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.05 nM 이하, 또는 약 0.02 nM 이하의 항체 농도에서 달성된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 리간드 hNKG2D 결합, 예를 들어 hNKG2D로의 MICA 결합을 감소시키거나 저해하는데 있어서 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810 중 임의의 것만큼 효율적이거나 이보다 더 효율적인 항체, 특히 인간 항체를 제공한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-hNKG2D 항체는 결합 시에 (즉, 결합 후에) 세포 표면 hNKG2D의 양을 감소시킬 수 있다. 항체의 결합 시에 세포 표면 관련된 hNKG2D의 감소는 유리한 특징일 수 있는데, 이는 리간드 결합 및 후속 활성화에 이용 가능한 hNKG2D 수용체의 수를 감소시키기 때문이다. 이론에 제한됨이 없이, 이러한 감소는 NKG2D 하향 조절, 내재화, 또는 다른 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 미국 특허 제7,987,985호에 기재된 바와 같이, 인간 항체와 같은 인간 Fc-영역을 갖는 항-hNKG2D 항체는 세포 표면 hNKG2D의 양을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 항-hNKG2D 항체 16F16, MS, 및 21F2 모두는 혈청의 부재 하에 하룻밤 인큐베이션 후 약 75% 이상으로 세포 표면 hNKG2D의 양을 감소시켰으며, MS가 가장 효과적이었는데, 낮은 농도에서 75% 내지 90%의 하향조절을 달성하였다 (미국 특허 제7,987,985호의 도 15 내지 17 참조). 또한, 혈청의 존재 하에서, hNKG2D 발현 BaF/3 세포에 대한 포화 농도 미만에 상응하는 MS 농도가 최대 하향조절을 달성하였다 (미국 특허 제7,987,985호의 도 16B). 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 포화 농도 미만에서 hNKG2D의 최대 하향 조절을 달성할 수 있는 hNKG2D에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 형태에서, 그러한 항체는 또한 hNKG2D에 결합함에 있어서 MS와 경쟁한다. 다른 실시 형태에서, 그러한 항체는 또한 MS와 본질적으로 동일한 hNKG2D 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항체는 항-hNKG2D 항체의 부재 하 또는 비-특이적 대조 항체의 존재 하에서의 세포 표면 hNKG2D와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 또는 적어도 90%만큼 세포 표면 hNKG2D를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 항체는 NKG2D 수용체 신호전달의 활성화를 전혀 야기하지 않거나 최소로 야기하면서, 즉, 효능제 활성이 전혀 없거나 최소로 하면서 세포 표면 NKG2D의 감소를 달성한다. 세포 표면 hNKG2D 및 항-hNKG2D 항체의 효능제 활성을 평가하기 위한 예시적인 검정이 본 명세서에 기재되어 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810으로부터 선택되는 대조 항체보다 더 높은 정도의 하향 조절이 가능한 항체, 특히 인간 항체를 제공한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항-hNKG2D 항체는 포화 농도보다 낮은 농도에서 세포 또는 세포주에 의해 발현되는 세포 표면 NKG2D의 최대 하향 조절을 달성할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 16F16, 16F31, MS, 및/또는 21F2, 더욱 바람직하게는 MS 및/또는 21F2와 동일한 hNKG2D 상의 에피토프와 경쟁하고/하거나 그에 결합하는 항체를 제공한다. 그러한 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표준 hNKG2D 결합 검정에서 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 교차 경쟁하는 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. hNKG2D로의16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 결합을 저해하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 hNKG2D로의 결합에 대해 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 경쟁할 수 있고, 따라서 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 동일한 hNKG2D 상의 에피토프에 결합할 수 있음을 입증한다. 바람직한 실시 형태에서, 16F16, 16F31, MS 또는 21F2와 동일한 hNKG2D 상의 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단클론성 항체이다. 그러한 인간 단클론성 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 항체는 마우스 단클론성 항체 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810 중 임의의 것과는 상이한 에피토프에 결합하고, 나열된 마우스 단클론성 항체들 중 어느 하나보다 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 더 많이 교차 경쟁한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택되는 5개 이상의 잔기를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D (서열 번호 9)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택되는 8개, 10개, 12개 이상의 잔기를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D (서열 번호 9)의 잔기 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 잔기 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로 본질적으로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택되는 하나 이상의 잔기로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 잔기 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로 이루어진다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D (서열 번호 9)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205, 및 Asn 207로부터 선택되는 수소 결합에 관여하는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205, 및 Asn 207로부터 선택되는 수소 결합에 관여하는 5개 이상의 잔기를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205, 및 Asn 207을 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체는 하기 특성 중 적어도 하나, 더욱 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개 이상을 나타낸다: (a) 선택적으로 세포로 결합하기 위한 EC50보다 낮은 리간드 유도된 세포독성을 감소시키기 위한 EC50을 가지면서, NKG2D 발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D 매개된 활성화를 방지하는 특성; (b) NKG2D에 결합하는 데 있어서 적어도 하나의 NKG2D 리간드와 경쟁하는, 바람직하게는 적어도 MICA 및 ULBP3와 경쟁하는 특성; (c) NKG2D 발현 NK 또는 T 세포의 표면 상의 NKG2D의 양을, 바람직하게는 적어도 75% 감소시키는 특성; (d) 바람직하게는 hNKG2D에 결합하는 친화도의 50% 이상의 친화도로, 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D에 결합하는 특성; (e) NKG2D의 하나 초과의 형태 또는 입체 형태에 결합하는 특성; (f) NKG2D에 1 nM 이하, 바람직하게는 0.1 nM 이하의 Kd로 결합하는 특성; (g) hNKG2D에 결합함에 있어서 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 중 하나 이상과 경쟁하는 특성, (h) hNKG2D에 결합함에 있어서 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810 중 임의의 것보다 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 더 많이 경쟁하는 특성; (i) 세포 표면 hNKG2D로의16F16, MS, 또는 21F2 결합의 90% 초과를 차단하는 특성; (j) 유의하지 않은 효능제 활성을 갖는 특성, (k) 16F16, 16F31, MS 및/또는 21F2 중 임의의 것과 본질적으로 동일한 에피토프, 바람직하게는 MS 및/또는 21F2와 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 특성. 전술된 기능적 특징, 및/또는 실시예에 기술된 바와 같은 기능적 특징의 임의의 조합이 본 발명의 항체에 의해 나타날 수 있다.
구조적 특성
본 발명의 바람직한 항체는, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,879,985호에 기재된 바와 같이 생산되고, 단리되고, 그리고 구조적으로 그리고 기능적으로 특성화되는 인간 단클론성 항체 16F16, 16F31, MS, 및 21F2 이다.
항원 결합성 단편
본 발명의 항-hNKG2D 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합성 단편으로서 제조될 수 있다. 항원 결합성 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (전형적으로 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인), 단쇄 Fv (scFv; 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 1988; 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883] 참조), dsFv, Fd (전형적으로 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb (전형적으로 VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 단일 VH 및 단일 VL 쇄를 포함하는 1가 분자; 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 및 카파 바디 (예를 들어, 문헌[Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57] 참조); 캐멀(camel) IgG; IgNAR; 이들뿐만 아니라, 단리된 CDR 또는 항원 결합성 잔기 또는 폴리펩티드가 함께 회합되거나 연결되어 기능성 항체 단편을 형성할 수 있는, 하나 이상의 단리된 CDR 또는 기능적 파라토프를 포함한다. 다양한 유형의 항체 단편이, 예를 들어 문헌[Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136]; WO2005040219호, 및 미국 특허 출원 공개 제20050238646호 및 제20020161201호에 기재되거나 검토되어 있다.
항체 단편은 통상적인 재조합 또는 단백질 공학 기술을 사용하여 얻어질 수 있고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 항원 결합 기능 또는 다른 기능에 대해 스크리닝될 수 있다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 전장 항체의 단백분해성 분해를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌[Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117(1992)]; 및 문헌[Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌[Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167(1992)]). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 선택된 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. WO 1993/16185호; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있다.
다중특이성 분자
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 항-hNKG2D 항체, 또는 이의 항원 단편을 포함하는 다중특이성 분자를 특징으로 한다. 그러한 다중특이성 분자는 hNKG2D에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성과 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 분자를 포함한다.
이중특이성 분자의 한 가지 유형은 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있고, 전장 이중특이성 항체의 전통적인 생산은 보통 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현에 기초하며, 이 2개의 사슬은 상이한 특이성을 가진다 (문헌[Millstein et al., Nature, 305:537-539(1983)]). 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이성 항체) 또는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 항원 결합성 단편으로서 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이성 항체에서, 적어도 하나의 결합 에피토프는 hNKG2D 단백질 상에 있다. 항-NKG2D 결합성 모이어티는 전염증성 백혈구 상의 분자, 예를 들어 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD4, 또는 CD8)에 결합하는 제2 모이어티와 조합됨으로써, 전염증성 hNKG2D 발현 세포에 대한 세포 방어 기전에 집중할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 이중특이성 항체는, 예를 들어, NKG2D를 발현하는 전염증성 세포로 세포독성제를 유도하거나, 그 전염증성 세포에 대해 ADCC/CDC 공격을 유도하는 데 사용될 수 있다. 세포독성제는, 예를 들어, 사포린, 항-인터페론-알파 작용제, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트, 또는 방사성 동위원소일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 제2 모이어티는 암, 바이러스 감염 등과 같은 이펙터 림프구에 의해 정상적으로 조절되는 질병 상태와 연관된 세포 상에 제시되거나 그에 의해 발현되는 세포 관련된 표적에 결합한다. 따라서, 예를 들어, 전형적인 표적은 세포 스트레스 관련 분자, 예를 들어 MIC 분자 (예를 들어, MIC-A 또는 MIC-B) 또는 ULBP (예를 들어, Rae-1, H-60, ULBP2, ULBP3, HCMV UL18, 또는 Rae-1β) 또는 바이러스 헤마글루티닌와 같은 병원체 관련 분자일 수 있다.
다른 다중특이성 분자는 하나 이상의 다른 비-항체 단백질로의 hNKG2D 결합성 항체 모이어티의 융합으로부터 생성되는 것들을 포함한다. 그러한 다중특이성 단백질 및 이들을 작제하는 방법이 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Dreier et al. (Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998))]; 미국 특허 제6,046,310호; 미국 특허 공개 제20030103984호; 유럽 특허 출원 제1 413 316호; 미국 특허 공개 제20040038339호; 문헌[von Strandmann et al., Blood(2006; 107:1955-1962)], 및 WO 2004056873호를 참조한다. 본 발명에 따르면, 비-항체 단백질은, 예를 들어, 앞선 섹션 I에 기재된 "제2 모이어티"의 임의의 항원에 대한 적합한 리간드; 예를 들어,T 세포 또는 Fc 수용체에 대한 리간드, 또는 세포 스트레스 분자, 예를 들어 MIC-A, MIC-B, ULBP, 또는 병원체 관련 분자, 예를 들어 바이러스 헤마글루티닌일 수 있다.
2개 초과의 수가를 갖는 다중특이성 분자가 또한 고려된다. 예를 들어, 3 특이성 항체가 제조될 수 있다. 문헌[Tutt et al., J. Immunol, 147: 60 (1991)].
본 발명의 다중특이성 분자는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 구성 성분 결합 특이성을 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 다중특이성 분자의 각각의 결합 특이성은 개별적으로 생성되고, 이어서 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 작용제 또는 가교 결합제가 공유결합적 접합을 위해 사용될 수 있다. 가교 결합제의 예는 단백질 A, 카르보다이이미드, N-석신이미딜-5-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-다이티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌다이말레이미드 (oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (설포-SMCC) (예를 들어, 문헌[Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; 문헌[Liu, M A et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조)를 포함한다. 다른 방법은 문헌[Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; 문헌[Brennan et al. (1985) Science 229:81-83], 및 문헌[Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 접합 작용제는 SATA 및 설포-SMCC 이며, 이들 둘 모두는 Pierce Chemical Co. (미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 2개의 중쇄의 C 말단 힌지 영역의 설프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의 설프하이드릴 잔기, 바람직하게는 1개를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 둘 모두의 결합 특이성은 동일한 벡터에서 인코딩되고 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이성 분자가 mAb×mAb, mAb×Fab, Fab×F(ab')2 또는 리간드×Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이성 분자는 하나의 단쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단쇄 이중특이성 분자일 수 있다. 이중특이성 분자는 적어도 2개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이성 분자를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 미국 특허 제5,482,858호; 미국 특허 출원 공개 제20030078385호, 문헌[Kontermann et al., (2005) Acta Pharmacological Sinica 26 (1):1-9]; 문헌[Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148 (5):1547-1553]; 문헌[Hollinger et al., (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448]; 및 문헌[Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368]에 기재되거나 검토되어 있다.
항체 변이체
본 발명의 항체는 변형된 항체 또는 항체 "변이체"를 조작하기 위한 출발 물질로서 본 명세서에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 또한 제조될 수 있으며, 이 변형된 항체는 모 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 모두의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시켜, 예를 들어 그 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로, 항체의 항원 결합성 부분으로부터, 항원 결합성 단편, 항체 유도체, 면역접합체, 및 다중특이성 분자와 같은 다른 작제물이 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
항체 변이체 또는 유도체는 전형적으로 "모" 항체와 비교하여 적어도 하나의 변경된 특성을 가지지만, 이 항체 변이체 또는 유도체는 본 명세서에 기재된 항-hNKG2D 항체의 기능적 특성 중 하나, 이의 일부 또는 대부분을 보유할 수 있으며, 이러한 기능적 특성은 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다: (a) 선택적으로 세포로 결합하기 위한 EC50보다 낮은 리간드 유도된 세포독성을 감소시키기 위한 EC50을 가지면서, NKG2D 발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D 매개된 활성화를 방지하는 특성; (b) NKG2D에 결합하는 데 있어서 적어도 하나의 NKG2D 리간드와 경쟁하는, 바람직하게는 적어도 MICA 및 ULBP3와 경쟁하는 특성; (c) NKG2D 발현 NK 또는 T 세포의 표면 상의 NKG2D의 양을, 바람직하게는 적어도 75% 감소시키는 특성; (d) 바람직하게는 실질적으로 유사한 효능 또는 친화도를 가지면서, 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D에 결합하는 특성; (e) NKG2D의 하나 초과의 형태 또는 입체 형태에 결합하는 특성; (f) NKG2D에 1 nM 이하, 바람직하게는 0.1 nM 이하의 Kd로 결합하는 특성; (g) 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 중 하나 이상과 경쟁하는 특성, (h) hNKG2D에 결합함에 있어서 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810 중 임의의 것보다 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 더 많이 경쟁하는 특성; (i) 세포 표면 hNKG2D로의16F16, MS, 또는 21F2 결합의 90% 초과를 차단하는 특성; (j) hNKG2D에 대하여 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810 중 임의의 것보다 적은 효능제 활성을 가지는 특성. 전술된 기능적 특징, 및/또는 실시예에 기술된 바와 같은 기능적 특징의 임의의 조합이 본 발명의 항체에 의해 나타날 수 있다.
항체 변이체 및 유도체의 기능적 특성은 당업계에서 이용 가능하고/하거나 본 명세서에 기재된 표준 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, hNKG2D에 결합하는 항체의 능력은 실시예에 제시된 것 (예를 들어, 바이어코어(Biacore), 유세포 분석법, 또는 ELISA)과 같은 표준 결합 검정을 이용하여 결정될 수 있다.
핵산
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려져 있는 다른 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 된" 것이다. 문헌[F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York] 참조. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA 일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 하기 단락은 DNA 서열 또는 이의 용도에 관한 것이지만, 동일한 방법 또는 원리가 대체로 mRNA 서열에 적용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 유전자도입(transgenic) 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻어질 수 있다. (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 이용하여) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체의 경우, 항체를 인코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,879,985호에 개시되어 있다.
단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)
본 발명의 일 태양에서, 대상체의 NKG2D 수용체 및/또는 NKG2D 리간드에 대한 유전자에서의 유전적 다형성을 평가하였다. 일 실시 형태에서, NKG2D 리간드는 MICB 이다. MICB-rs2239705 SNP는 NKG2D 수용체에 대한 알려진 리간드인 MICB 단백질의 발현 수준과 관련된 MICB 유전자의 변이체이다 (다음으로부터 입수 가능함: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ 및 MICB [NKG2D 리간드] SNP rs2239705 (단일 뉴클레오티드 다형성의 데이터베이스(Database of Single Nucleotide Polymorphisms, dbSNP). 메릴랜드주 베데스다: 미국 국립 의학 도서관 내 미국 국립 생물공학 정보 센터. dbSNP 수탁:{2239705}, (dbSNP Build ID: {150})). rs2255336 SNP는 NKG2D 단백질의 발현 수준과 관련된 NKG2D 수용체 유전자의 변이체이다 (다음으로부터 입수 가능함: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ 및 단일 뉴클레오티드 다형성의 데이터베이스(dbSNP). 메릴랜드주 베데스다: 미국 국립 의학 도서관 내 미국 국립 생물공학 정보 센터. dbSNP 수탁:{2255336}, (dbSNP Build ID: {150})). 크론병에 대한 NKG2D 항체 임상 시험으로부터의 효능 데이터의 사후 분석은 rs2255336 SNP를 갖는 대상체의 하위 그룹에서 NKG2D 항체의 더 큰 효능을 입증하였다.
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항체 생산
본 발명의 단클론성 항체(mAb)는 통상적인 단클론성 항체 방법을 비롯한 다양한 기술, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 하이브리드화 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 하이브리드화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로, 단클론성 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환이 이용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 하나의 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하기 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차와 마찬가지로 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 또한 확립된 기술을 이용하여 뮤린 단클론성 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 DNA는 관심 대상의 뮤린 하이브리도마로부터 얻어질 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린(non-murine) (예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위하여, 뮤린 가변 영역은 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다 (예를 들어, 캐빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호 참조). 인간화 항체를 생성하기 위하여, 뮤린 CDR 영역은 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호 및 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 단클론성 항체이다. hNKG2D에 대해 유도된 이러한 인간 단클론성 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 부분을 지닌 유전자도입 또는 염색체도입(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 유전자도입 및 염색체도입 마우스는 각각 본 명세서에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본 명세서에서 "인간 Ig 마우스"로 총칭된다. HuMAb 마우스 (Medarex, Inc.)는, 내인성 u 및 K 쇄 유전자좌를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (p 및 y) 및 K 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(minilocus)를 함유한다 (예를 들어, 문헌[Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 도입유전자(transgene)는 클래스 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐서 고친화도 인간 IgGK 단클론성을 생성한다 (상기 문헌[Lonberg, N. et al. (1994)]; 문헌[Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; 문헌[Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93], 및 문헌[Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조 및 용도, 및 그러한 마우스가 지닌 유전체 변형은 문헌[Taylor, L. et al.(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; 문헌[Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656]; 문헌[Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724]; 문헌[Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123]; 문헌[Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830]; 문헌[Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920]; 문헌[Taylor, L. et al. (1994) International immunology 6: 579-591]; 및 문헌[Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있으며, 이들 모두의 전체 내용은 본 명세서에 구체적으로 참고로 포함된다. 추가로, 모두 론버그(Lonberg)와 캐이(Kay)의 것인 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5770429호; 수라니(Surani) 등의 미국 특허 제5,545,807호; 모두 론버그와 캐이의 것인 국제특허 공개 WO 92/03918호, WO 93/12227호, WO 94/25585호, WO 97/13852호, WO 98/24884호 및 WO 99/45962호; 및 코르만(Korman) 등의 국제특허 공개 WO 01/14424호를 참조한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 인간 항체는 인간 중쇄 도입유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체(transchromosome)를 지닌 마우스와 같은 도입유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 지닌 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 본 명세서에서 "KM 마우스"로 지칭되는 그러한 마우스는 이시다(Ishida) 등의 국제특허 공개 WO 02/43478호에 상세히 기재되어 있다. 또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 유전자도입 동물 시스템이 당업계에서 이용 가능하고, 본 발명의 항-hNKG2D 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (Abgenix, Inc.)로 지칭되는 대안적인 유전자도입 시스템이 사용될 수 있고; 이러한 마우스는, 예를 들어 쿠첼라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호에 기재되어 있다. 더욱이, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 염색체도입 동물 시스템이 당업계에서 이용 가능하고, 본 발명의 항-hNKG2D 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스염색체와 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 모두를 지닌 마우스가 사용될 수 있고; 그러한 마우스는 문헌[Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 지닌 소가 당업계에 기재되어 있고 (문헌[Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 항-hNKG2D 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 모노클로널 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; 다우어(Dower) 등의 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호를 참조한다. 본 발명의 인간 단클론성 항체는, 인간 면역 세포가 재구성되어 면역화 시에 인간 항체 반응이 생성될 수 있는 SCID 마우스를 사용하여 또한 제조될 수 있다. 그러한 마우스는, 예를 들어 윌슨(Wilson) 등의 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호에 기재되어 있다.
인간 Ig 마우스가 본 발명의 인간 항체를 생성시키기 위해 사용될 때, 그러한 마우스는 문헌[Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859]; 문헌[Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 845-851]; 및 국제특허 공개 WO 98/24884호 및 WO 01/14424호에 기재된 바와 같은 hNKG2D 항원 및/또는 hNKG2D를 발현하는 세포의 정제된 또는 농축된 제제로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입 시에 6 내지 16 주령이다. 예를 들어, hNKG2D 항원의 정제된 또는 농축된 제제 (5 내지 50 ㎍)는 인간 Ig 마우스를 복강내로 면역화하는 데 사용될 수 있다. hNKG2D 항원의 정제된 또는 농축된 제제를 사용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우, 마우스는 hNKG2D를 발현하는 세포, 예를 들어 인간 NK 또는 T 세포주로, 또는 DAP10과 함께 또는 DAP10 없이 재조합 hNKG2D를 발현하는 포유동물 세포로 또한 면역화되어 면역 반응을 촉진시킬 수 있다.
hNKG2D에 대한 완전 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 상세한 절차는 하기 실시예 1에 기술되어 있다. 투여된 항원 (예를 들어, hNKG2D 폴리펩티드 또는 hNKG2D를 발현하는 세포)의 형태 및 양뿐만 아니라 투여 스케줄 및 예를 들어, 완전 프로인트 애주번트 또는 불완전 프로인트 애주번트와 같은 애주번트의 가능한 사용은 전형적으로 당업계의 확립된 방법에 따라 각 항원-마우스 시스템에 대해 최적화된다.
면역 반응은 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있으며, 이때 혈장 샘플은 안와후방 채혈에 의해 얻어지고, 혈장 또는 혈청은 ELISA (후술하는 바와 같음)에 의해 스크리닝될 수 있고, 항-hNKG2D 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 갖는 마우스가 융합에 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장 제거 3 일 전에 항원으로 정맥내로 추가접종될 수 있다. 각 면역화를 위한 2 회 내지 3 회의 융합이 수행될 필요가 있을 수 있음이 예상된다.
본 발명의 인간 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 비장세포 및/또는 림프절 세포가 단리되고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합될 수 있다. 생성된 하이브리도마는 항원 특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 갖는 P3X63-Ag8.653 비분비성(nonsecreting) 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)의 수의 1/6에 융합될 수 있다. 대안적으로, 세포는 전기융합에 의해 융합될 수 있다. 세포를 평면 바닥 미세역가 플레이트에 대략 2 × 105 로 플레이팅한 후, 20% 태아 클론 혈청(Clone Serum), 18% "653" 컨디셔닝된 배지, 5% 오리겐(origen) (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml의 페니실린, 50 mg/ml의 스트렙토마이신, 50 mg/ml의 젠타마이신 및 1 × HAT (Sigma; HAT는 융합 후 24 시간째에 첨가됨)를 함유하는 선택적 배지에서 2 주 인큐베이션한다. 대략 2 주 후, 세포는 HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양될 수 있다. 이어서, 인간 단클론성 IgM 및 IgG 항체에 대하여 개별 웰이 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지는 보통 10 내지 14 일 후에 관찰될 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마가 리플레이팅되고, 다시 스크리닝될 수 있고, 여전히 인간 IgG에 대하여 양성인 경우, 단클론성 항체는 제한 희석에 의해 적어도 2 회 서브클로닝될 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론이 시험관내에서 배양되어 특성화를 위해 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성할 수 있다. 인간 단클론성 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마가 단클론성 항체 정제를 위해 2 리터 스피너-플라스크(spinner-flask)에서 성장될 수 있다. 상청액은, 단백질 A-세파로스 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Pharmacia)를 이용한 친화도 크로마토그래피 전에 여과되고 농축될 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 검사될 수 있다. 완충 용액이 PBS로 교환될 수 있고, 분광법에 의해 농도가 결정될 수 있다. 단클론성 항체는 분취되어 -80°로 저장될 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 당업계에 잘 알려져 있는 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 (예를 들어, 문헌[Morrison, S. (1985) Science 229:1202]) 숙주 세포 트랜스펙토마(transfectoma)에서 또한 생성될 수 있다.
예를 들어, 항체를 발현하기 위하여, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 대상의 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻어질 수 있고, 이 DNA가 발현 벡터 내로 삽입됨으로써 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동 가능하게 연결되어 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공할 수 있다.
발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 양립 가능하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 더욱 전형적으로, 둘 모두의 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트(blunt) 단부 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 원하는 아이소타입의 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터 내로 이들을 삽입하여, VH 세그먼트는 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동 가능하게 연결되고, VL 세그먼트는 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동 가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 아이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 벡터 내로 클로닝되어 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임내(in-frame) 연결될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌[Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))]에 기재되어 있다.
조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마(polyoma)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스성 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 p-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, 조절 요소는, SV40 초기 프로모터로부터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복체를 함유하는 SRa 프로모터 시스템과 같은 (문헌[Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472) 다양한 공급원으로부터의 서열로 구성된다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선택 가능한 마커 유전자와 같은 추가의 서열을 지닐 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 모두 악셀(Axel) 등의 것인 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 가능한 마커 유전자는, 벡터가 도입된 숙주 세포에, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 가능한 마커 유전자는 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위한) 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자 및 (G418 선택을 위한) neo 유전자를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 바람직한데, 이는 그러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다. 항체 유전자의 원핵세포 발현은 높은 수율의 활성 항체의 생산에 효과적이지 않은 것으로 보고되었다 (문헌[Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13]).
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO 세포) (예를 들어, 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위하여, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462호, WO 89/01036호 및 유럽 특허 제338,841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서의 항체의 발현 또는, 더욱 바람직하게는, 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
항체 특성화
생산 또는 정제 후, 또는 스크리닝 또는 선택 절차의 일부로서, 본 발명의 항-hNKG2D 항체의 기능적 특징이 조사될 수 있다. 관심 대상의 기능적 특성은, 예를 들어 hNKG2D에 대한 항체 결합 특이성, hNKG2D-리간드와의 항체 경쟁, (예를 들어, 16F16, 16F31, MS, 및 21F2와 같은) 기준 항체와의 항체 경쟁, 항체가 결합하는 에피토프, 항체-항원 상호작용의 친화도, 및 항체의 길항적/효능적 특성을 포함한다.
다음은 항체 특성화를 위한 예시적인 검정의 간략한 설명이다. 일부는 후속 섹션에 추가로 기술되고/되거나 실시예에 기술되어 있다.
(1) hNKG2D에 대한 항체 특이성은 단클론성 항체 (또는, 동물 스크리닝 절차의 일부로서, 혈청 함유 다클론성 항체)가 NKG2D 발현 세포에 결합하지만 NKG2D 음성 세포에 결합하지 않음을 확인함으로써 평가될 수 있다. NKG2D를 갖거나 갖지 않는 세포주는 항체와 함께 인큐베이션된 후, 직접 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션되고, 예를 들어 유세포 분석법에 의해 가시화된다.
(2) 리간드 결합의 차단은, NKG2D를 발현하는 세포를 항체 또는 하이브리도마 상청액과 함께 또는 항체 또는 하이브리도마 상청액 없이 인큐베이션한 후, 리간드-mFc 단백질 및 리간드에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션함으로써 평가될 수 있고, 리간드 결합 및 이의 차단 수준은 유세포 분석법에 의해 결정될 수 있다. 차단은 사전 인큐베이션 부재 시와 비교하여 사전 인큐베이션 존재 시의 리간드 결합 % 로서 계산될 수 있으며, 이때 사전 인큐베이션 시에 더 낮은 결합이 관찰된다.
(3) 하나 이상의 기준 항-NKG2D 항체에 의해 사용되는 결합 부위에 대한 경쟁은, 사전 인큐베이션이 본 발명의 항체 또는 기준 항체 (예를 들어, ON72 또는 149810)와 함께 수행된 후 후속적으로 첨가된 항체와의 배양 및 이의 검출이 수행될 수 있다는 점을 제외하고는 유사한 방식으로 평가될 수 있다.
(4) 항체의 온-레이트(on-rate) 및 오프-레이트(off-rate)를 포함하는 친화도 파라미터가 바이어코어 기계 상에서 결정될 수 있다. 예를 들어, hNKG2D-Fc 단백질이 칩 상에 고정되고, 항체가 칩 위를 통과하고, 온-레이트 및 오프-레이트가 결정되고, KD가 계산될 수 있다.
(5) 항체에 의한 NKG2D 내재화의 유도는 항체와 함께 또는 항체 없이 hNKG2D 발현 세포를 하룻밤 인큐베이션한 후, 항체를 재첨가하고 유세포 측정기에서 NKG2D 수준 (즉, 결합된 항체의 수준)을 검출함으로써 측정될 수 있다.
(6) hNKG2D-리간드 매개된 사멸을 차단하는 항체의 능력은 예를 들어, NKG2D 리간드인 MICA, MICB, 또는 ULBP1-4를 발현하는 51Cr 로딩된 표적 세포를 사멸시키는 NK 세포주 NK92 또는 이펙터 세포로서의 NKL을 사용하여 평가될 수 있다.
(7) (인간에서와 같은) CD4+ T 세포가 아닌 원숭이 NK 및 CD8+ T 세포와 인간 항-NKG2D 항체의 교차 반응성은, 원숭이 및 인간 PBMC를 PBMC 중의 상이한 세포 유형의 마커와 더불어 hNKG2D 항체 및 2차 항체와 함께 인큐베이션 후 유세포 분석법에 의해 그리고 다양한 서브세트의 NKG2D 염색을 분석함으로써 입증될 수 있다.
(8) 항체 결합 시의 NKG2D의 활성화는, (예를 들어, TCR, CD28 및 IL-2 또는 IL-15를 통한) 사전 자극과 함께 또는 사전 자극 없이, T 세포 수용체, CD28 및 또는 NKG2D를 통한 자극 시의 PBMC 집단에서의 CD8+ 세포의 세포 증식의 유도로서 측정될 수 있다.
결합 검정
본 발명은 hNKG2D에 결합하는 항체, 및 이의 항원 결합성 단편 및 면역접합체를 제공한다. 매우 다양한 검정 중 임의의 것을 이용하여 hNKG2D에 대한 항체의 결합을 평가할 수 있다. 특히, ELISA, 방사면역검정, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 바이어코어, 및 다른 경쟁 검정에 기초한 프로토콜이 사용하기에 적합하며, 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 경쟁 검정을 포함하는 몇몇 결합 검정이 미국 특허 제7,879,985호의 실시예에 기술되어 있다.
예를 들어, 단순 결합 검정이 사용될 수 있으며, 이때 시험 항체는 표적 단백질 또는 에피토프 (예를 들어, NKG2D 또는 이의 부분)의 존재 하에 인큐베이션되고, 결합되지 않은 항체가 씻겨져 나가고, 결합된 항체의 존재는, 예를 들어, 방사성 표지, 물리적 방법, 예를 들어 질량 분석법, 또는 예를 들어, 세포형광측정 분석 (예를 들어, FACScan)을 이용하여 검출되는 직접적 또는 간접적 형광 표지를 사용하여 평가된다. 그러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 비-특이적 대조 항체로 관찰되는 양보다 많은 임의의 결합량은 항체가 표적에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸다.
그러한 검정에서, 표적 세포 또는 인간 NKG2D에 결합하는 시험 항체의 능력은, 동일한 표적에 결합하는 (음성) 대조 단백질, 예를 들어 구조적으로 무관한 항원에 대해 생성된 항체, 또는 비-Ig 펩티드 또는 단백질의 능력과 비교될 수 있다. 임의의 적합한 검정을 이용하여 대조 단백질에 비하여 25%, 50%, 100%, 200%, 1,000%, 또는 더 높은 증가된 친화도로 표적 세포 또는 NKG2D에 결합하는 항체 또는 단편은, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 이와 "특이적으로 상호작용"한다고 하고, 후술되는 치료 방법에 사용하기에 바람직하다. NKG2D에 대한 (양성) 대조 항체, 예를 들어 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 결합에 영향을 미치는 시험 항체의 능력이 또한 평가될 수 있다.
일 태양에서, 본 발명은 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 생물학적 특징 및/또는 실질적인 VH 및/또는 VL 서열 동일성을 공유하는 항-hNKG2D 항체를 제공한다. 하나의 예시적인 생물학적 특징은 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 에피토프, 즉, 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 항체가 결합하는 hNKG2D의 세포외 도메인 내의 각각의 영역으로의 결합이다. 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위하여, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 일상적인 교차 차단 검정이 수행될 수 있다.
예시적인 교차 차단 또는 경쟁 검정에서, 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 (대조) 항체 및 시험 항체가 혼합되고 (또는 사전 흡착되고), NKG2D를 함유하는 샘플에 적용된다. 특정 실시 형태에서, NKG2D 함유 샘플에 적용하기 전에, 대조 항체가 다양한 양의 시험 항체와 일정 기간 동안 사전 혼합 (예를 들어, 1:10 또는 1:100) 될 것이다. 다른 실시 형태에서, 대조군 및 다양한 양의 시험 항체는 항원/표적 샘플에 대한 노출 동안 간단히 혼합될 수 있다. (예를 들어, 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 분리 또는 세척 기술을 이용함으로써) 결합된 항체와 유리 항체를 구별할 수 있고, (예를 들어, 종 특이적 또는 아이소타입 특이적 2차 항체를 사용함으로써, 대조 항체를 검출가능한 표지로 특이적으로 표지화함으로써, 또는 상이한 화합물을 구별하기 위해 질량 분석법과 같은 물리적 방법을 사용함으로써) 대조 항체와 시험 항체를 구별할 수 있는 한, 시험 항체가 항원으로의 대조 항체의 결합을 감소시키는지를 결정할 수 있으며, 이는 시험 항체가 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프를 인식함을 나타낸다. 이 검정에서, 완전히 무관한 항체의 존재 하에 (표지된) 대조 항체의 결합은 높은 대조군 값이다. 낮은 대조군 값은 표지된 (양성) 대조 항체를 표지되지 않은 대조 항체와 함께 인큐베이션함으로써 얻어지며, 이 경우 경쟁이 발생하여 표지된 항체의 결합을 감소시킬 것이다.
시험 검정에서, 시험 항체의 존재 하에서의 표지된 항체 반응성의 유의한 감소는 동일한 에피토프를 인식하는 시험 항체, 즉, 표지된 대조 항체와 "교차 반응하는" 것을 나타낸다. 약 1:10 내지 약 1:100의 대조군:시험 항체 또는 화합물의 임의의 비에서 항원/표적으로의 표지된 대조군의 결합을 적어도 50% 또는 더욱 바람직하게는 70%만큼 감소시키는 임의의 시험 항체 또는 화합물은 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정기에 결합하는 항체 또는 화합물로 간주된다. 바람직하게는, 그러한 시험 항체 또는 화합물은 항원/표적으로의 대조군의 결합을 적어도 90% 감소시킬 것이다. 그럼에도 불구하고, 임의의 측정가능한 정도로 대조 항체 또는 화합물의 결합을 감소시키는 임의의 화합물 또는 항체가 본 발명에 사용될 수 있다.
일 실시 형태에서, 경쟁은 유세포 분석 시험에 의해 평가될 수 있다. hNKG2D를 지닌 세포는 먼저 수용체에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 대조 항체 (예를 들어, hNKG2D를 발현하는 T 또는 NK 세포 또는 hNKG2D를 재조합적으로 발현하는 BaF/3 세포, 및 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 항체)와 함께 인큐베이션되고, 이어서, 예를 들어 형광색소 또는 바이오틴으로 표지될 수 있는 시험 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 시험 항체는, 포화량의 대조 항체와의 사전 인큐베이션에 의해 얻어진 결합이 대조군과의 사전 인큐베이션 없이 항체에 의해 얻어진 결합 (형광의 평균)의 80%, 바람직하게는 50%, 40% 또는 그 미만인 경우 대조군과 경쟁한다고 한다. 대안적으로, 시험 항체는, 포화량의 시험할 항체와 함께 사전 인큐베이션된 세포 상에서 (형광색소 또는 비오틴에 의해) 표지된 대조군에 의해 얻어진 결합이 항체와의 사전 인큐베이션 없이 얻어진 결합의 80%, 바람직하게는 50%, 40%, 또는 그 미만인 경우, 대조군과 경쟁한다고 한다. 예시적인 항체 경쟁 검정에 대해서는 실시예 5를 참조한다.
단순히 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2를 적합한 형태의 hNKG2D 리간드로 교환함으로써 시험 (인간화) 항체가 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, 또는 RAET1 패밀리의 구성원과 같은 인간 NKG2D에 대한 천연 리간드의 결합에 영향을 미치는지를 평가하기 위해 유사한 교차 차단 검정이 또한 사용될 수 있다. 실시예에 기재된 하나의 적합한 형태는 리간드 (예를 들어, MICA)와 항체의 Fc-부분의 융합 단백질이다. 리간드가 Fc 영역에 접합되면, 예를 들어 뮤린 Fc 영역을 검출하기 위한 염소-항-마우스 항체를 사용한, Fc 영역이 유래되는 동물 종에 특이적인 항체에 의한 융합 단백질의 검출을 허용한다.
일 실시 형태에서, hNKG2D 발현 세포, 예를 들어, 류마티스 관절염 환자로부터의 CD4+CD28― 세포 (또는 다른 자가면역 또는 염증성 장애로부터의 등가의 세포)가, 예를 들어, Fc 융합 단백질의 형태의 MICA, MICB, 또는 ULBP 단백질과 같은 NKG2D 리간드, 또는 이들 리간드 중 임의의 것을 발현하는 세포와 함께 인큐베이션되고, 세포의 활성을 차단하는 항-NKG2D 항체 또는 다른 분자의 능력이 평가되는 세포 검정이 이용된다. 대안적인 검정에서, NKG2D 수용체에 대한 활성의 기준선 수준이 리간드의 부재 하에 얻어지고, 기준선 활성 수준의 감소를 일으키는 항체 또는 화합물의 능력이 검출된다. 일 유형의 실시 형태에서, 수용체의 활성화를 차단하거나 그렇지 않으면 이를 하향 조절할 수 있는 화합물을 확인하기 위해 고처리량 스크리닝 접근법이 사용된다. 예시적인 리간드 경쟁 검정에 대해서는 실시예 3을 참조한다.
바람직하게는, NKG2D 에피토프를 인식하는 단클론성 항체는 류마티스 관절염 환자와 같은 환자에서 상당한 백분율의 CD4+ T 세포, 특히 CD4+CD28- T 세포에 존재하는 에피토프와 반응할 것이지만, 다른 세포, 즉, NKG2D를 발현하지 않는 면역 또는 비-면역 세포와 유의하게 반응하지 않을 것이다. 따라서, 일단 항체가 NK 또는 T 세포 상에서 hNKG2D를 특이적으로 인식하면, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 또는 염증성 장애에 걸린 환자로부터 취해진 T 세포에 결합하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다. 본 발명이 NKG2D 활성이 수용체를 발현하는 세포 유형 (예를 들어, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포 등)과 무관하게 장애의 병리와 연관되는 임의의 장애의 치료에 사용될 수 있고, 어느 세포 유형이 특정 장애와 관련이 있든지 간에 항체가 수용체에 결합하는 그의 능력에 대하여 시험될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 특정 장애가 NKG2D 발현 NK 세포의 과잉 활성 또는 증식과 관련이 있는 것으로 관찰되는 경우, 항체는 동일한 수용체를 발현하는 NK 세포를 사용하여 개발 및 시험될 수 있다.
일 실시 형태에서, 항체는, NKG2D 발현 세포, 예를 들어 류마티스 관절염에 걸린 환자로부터 취해진 CD4+CD28- T 세포에 결합하는 그의 능력을 시험하기 위해 면역검정에서 검증된다. 예를 들어, 말초 혈액 림프구(PBL)가 복수의 환자로부터 취해지고, CD4+, 바람직하게는 CD4+CD28- 세포는, 예를 들어 관련 항체를 사용한 유세포 분석법에 의해 PBL로부터 농축된다. 이어서, 세포에 결합하는 주어진 항체의 능력이 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 방법을 이용하여 평가된다. NKG2D를 발현하는 것으로 알려진 세포, 예를 들어, 유의한 백분율의 환자 (예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과)로부터의, RA 환자 등으로부터의 NK 세포, CD8 T 세포, CD4 T 세포의 상당한 비율 (예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 초과)과 결합하는 것으로 밝혀진 항체는, 환자의 세포에서 NKG2D 수용체의 발현을 결정하기 위한 진단 목적을 위한 것 또는 본 명세서에 기술된 치료 방법에 사용하기 위한 것, 예를 들어 인간에 적합한 차단 또는 대안적으로 세포독성 항체로서 사용하기 위한 것 둘 모두를 위해 본 발명에 사용하기에 적합한 것으로 간주될 수 있다. 세포로의 항체의 결합을 평가하기 위하여, 항체는 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적으로 표지될 때, 제2의 표지된 항체가 전형적으로 첨가된다. 이어서, 세포로의 항체의 결합은, 예를 들어, 세포형광측정 분석 (예를 들어, FACS)을 이용하여 검출될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 예를 들어 NKG2D 발현 세포를 사멸시키는 것이 요구되지 않는 경우, 본 발명의 항체는 바람직하게는 Fc 수용체로의 실질적인 특이적 결합을 나타내지 않는다. 그러한 항체는 Fc 수용체에 결합하지 않는 것으로 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 그러한 예는 IgG4 불변 영역이다. 대안적으로, Fab 또는 F(ab')2 단편과 같은 불변 영역을 포함하지 않는 항체 단편이 Fc 수용체 결합을 피하기 위해 사용될 수 있다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 바이어코어 검정에서 Fc 수용체 단백질로의 항체의 결합을 시험하는 것을 포함하는 당업계에 알려져 있는 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, Fc 수용체로의 결합을 최소화하거나 제거하도록 Fc 부분이 변형된 임의의 다른 항체 유형이 사용될 수 있다 (예를 들어, 개시 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 WO03101485호 참조). Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 검정, 예를 들어, 세포 기반 검정이 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 WO03101485호에 기술되어 있다.
기능 검정
NKG2D 활성을 반영하는 임의의 적합한 생리학적 변화가 시험 화합물 또는 항체의 유용성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 효과, 예를 들어 유전자 발현, 사이토카인 생성, 신호전달 분자 인산화, 세포 성장, 세포 증식, pH, 세포내 2차 메신저, 예를 들어, Ca2+, IP3, cGMP, 또는 cAMP, 또는 세포독성 활성 또는 다른 T 세포를 활성화시키는 능력과 같은 활성의 변화를, 예를 들어 세포 기반 검정에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 수용체의 활성은 NKG2D 반응성 유전자, 예를 들어 CD25, IFN-감마, 또는 TNF-알파의 발현을 검출함으로써 평가될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Groh et al. (2003) PNAS 100: 9452-9457]; 문헌[Andre et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34: 1-11] 참조). 대안적으로, NKG2D 활성은, T 세포에 의한 TNF-알파 또는 IFN-감마의 방출을 저해하는 화합물 또는 시험 항체의 능력을 평가하기 위해 CD4+CD28-NKG2D+ 세포를 리간드 또는 활성화 항-NKG2D 항체뿐만 아니라 항-CD3 항체의 존재 하에 인큐베이션함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, CD4+CD28-NKG2D+ T 세포는 리간드, 예를 들어 MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3 등, 또는 리간드 생성 세포, 예를 들어, 자가 MIC+ RA 활막세포의 존재 하에서 인큐베이션될 수 있고, 사이토카인 (예를 들어, IFN-감마 또는 TNF-알파) 생성을 저해하는 시험 항체 또는 화합물의 능력, 또는 T 세포 증식이 평가될 수 있다.
시험관내 검정은 RA와 같은 자가면역 또는 염증성 장애에 걸린 환자로부터 취해진 세포, 예를 들어 RA에 걸린 환자로부터 취해진 NKG2D를 발현하는 CD4+CD28- 세포 (또는 이로부터 유래된 세포주)를 선택적으로 사용할 수 있지만, 일반적으로 임의의 NKG2D 발현 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-RA 면역 세포주, 예를 들어 T 세포주는 NKG2D 인코딩 도입유전자로 형질감염될 수 있고, 수용체의 발현이 검출 가능한 방식으로 세포의 활성을 변경시키는 한, 예를 들어, 이러한 세포를 NKG2D 리간드에 의해 활성화될 수 있게 하는 한, 본 검정에서 사용될 수 있다. 세포주는, 예를 들어, RA 환자로부터의 CD4+CD28- NKG2D+ 세포, 예를 들어 활막 조직으로부터 단리된 PBL 또는 T 세포를 사용하여 확립될 수 있다. 그러한 세포는 NKG2D의 지속적인 발현을 보장하기 위해 IL-15의 존재 하에서 배양될 수 있다 (예를 들어, 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Groh et al. (2003) PNAS 100: 9452-9457] 참조).
항-hNKG2D 항체가 그의 리간드 중 하나 이상과의 NKG2D 상호작용을 감소시키거나 차단하거나, 또는 hNKG2D 리간드 상호작용을 차단하는 것으로 알려진 항체와 경쟁하는 경우, NK 또는 T 세포의 NKG2D 매개된 활성화를 감소시키는 데 유용할 수 있다. 이는 전형적인 세포독성 검정에 의해 평가될 수 있다. 실시예 6은 표적 세포의 예시적인 세포독성 검정인 NKG2D 리간드 매개된 사멸을 설명한다. 이때, MICA 형질감염된 BaF/3의 NK 세포 매개된 사멸을 감소시키거나 저해하는 항-hNKG2D 항체의 능력은 51Cr의 표적 세포 방출을 측정함으로써 평가된다.
다른 태양에서, 본 발명의 항체가 실질적인 효능제 활성이 없음을 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 다음을 포함하는 몇몇 검정이 이러한 목적을 위해 이용될 수 있다.
하나의 검정은, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 함께 가용성 또는 플레이트 결합된 항체를 사용한 활성화 후, 건강한 지원자 또는 IBD 환자로부터의 PBMC의 증식 및 사이토카인 생성을 평가할 수 있다. 이러한 방법에서, PBMC는 건강한 대상체 또는 염증성 장질환(IBD) 환자로부터 통상적인 방법에 의해 정제된다. 세포는 CFSE (Molecular probes의 제품, 카탈로그 번호 C34554)로 염색된다. (2% FCS를 지닌 0.5 ml PBS 중의) 107개의 세포에 1 μl의 CFSE (0.5 mM)가 첨가되고, 세포가 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션된다. 이어서, 2 ml FCS가 첨가되고, 혼합물이 실온에서 1 분 동안 정치된다. 이어서 세포가 RPMI-1640 배지 (12 ml)를 사용하여 원심분리에 의해 3 회 세척된다. 세척 후, 세포가 2% FCS를 지닌 1 ml 배지 (예를 들어, RPMI-1640) 중에 재현탁된다.
96 웰 플레이트가 실온에서 2 시간 동안 30 μl의 항-마우스 Fc (Jackson―Immuno Research 115-006-008)로 코팅되고, 이어서 PBS로 세척된다. 항체 (항-CD3 Biosceince 카탈로그 번호 14-0037-82, 항-CD28 카탈로그 번호 348046 Becton Dickison)가 하기 계획에 따라 첨가되고, 웰에서 정치된다:
세포 단독
CD3 0.1 또는 0.3 ng/ml
CD3 0.1 또는 0.3 ng/ml + CD28 0.2 ㎍/ml
CD3 0.1 또는 0.3 ng/ml + CD28 0.2 ㎍/ml + 항-NKG2D 0.2 ㎍/ml
CD3 0.1 또는 0.3 ng/ml + 항-NKG2D 0.2 ㎍/ml
다음으로, 100.000개의 CFSE 표지된 PBMC가 첨가되고, 3 일 동안 정치된다. 이어서, 상청액이 사이토카인의 분석을 위해 수집되고, PBMC가 증식에 대한 항-CD56, 항-CD4, 항-CD8, 및 CFSE 표지화를 이용하여 림프구의 유형에 대하여 유세포 분석법에 의해 분석된다.
다른 검정에서, NKG2D 리간드를 결여한 표적 세포를 향한 CD8+ T 세포의 세포독성 잠재성에 대한 효과가 시험된다. 결합이 세포의 세포독성 잠재력을 증가시키는 경우, 효능제 활성이 존재한다. 간략하게 말하면, 건강한 대상체로부터 IL-2 가 자극된 PBMC가 MICA를 발현하는 p815 세포와 함께, 또는 형질감염되지 않은 p815 세포 및 항-CD3 항체 (이는 p815 세포 상의 Fc 수용체에 결합함으로써 재유도된 사멸을 가져올 것임) 및 CD8 세포독성 T 세포와 함께 인큐베이션된다. 이어서, p815 세포에 결합하지 않는 항-NKG2D 항체 (예를 들어, 인간 IgG4 아이소타입의 항체)가 MICA-NKG2D 유도된 결합을 차단하는지 여부 및/또는 항체가 CD3-p815 재유도된 결합을 증가시키는지가 분석된다. 이러한 방식으로, p815 세포를 항-CD3 항체 및 추가의 항-NKG2D 항체와 함께 인큐베이션함으로써 CD8+ 세포의 활성이 향상되지 않는다는 것이 나타날 수 있지만, 동일한 항-NKG2D 항체는 이 항체가 동일한 PBMC 집단에서 p815 유도된 사멸에 대한 NK-MICA 상호작용을 차단함을 입증함으로써 작용성인 것으로 나타날 수 있다.
다른 검정에서, NKG2D 신호전달 경로 및 분자가 하나 이상의 항-NKG2D 항체의 첨가에 의해 활성화되는지 여부가 탐색될 수 있다. (예를 들어, NKL 세포 또는 NK-92 세포와 같은) NK 세포주, 또는 말초 혈액으로부터 단리된 인간 NK 또는 CD8+ T 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, NKL 세포는, 예를 들어, Fc-MICA 또는 조사된 MICA 발현 세포를 대조군으로 하여, 용액 상태의 또는 플레이트 결합된 인간 항-NKG2D 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 적합한 기간 (예를 들어, 5 분, 10 분, 30 분) 동안 인큐베이션된 후, 세포가 얼음 상의 프로테아제 및 포스파타제 저해제의 존재 하에서 용해되고, 표준 웨스턴 블롯팅 기술에 의해 NKG2D (예를 들어, Pi3K, Akt, 및 vav)의 자극의 하류에 있는 것으로 알려진 하나 이상의 인산화된 신호전달 분자의 수준에 대해 분석된다.
동물 기반 검정에서, 동물 내의 세포에서의 NKG2D 활성화의 임의의 생리학적 또는 병리학적 결과가 항체 또는 시험 화합물 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, CD4+CD28-NKG2D+ 세포는 MICA 생성 활막세포와 같은 리간드 생성 세포의 공동투여의 존재 또는 부재 하에 동물 모델의 관절 내로 도입될 수 있고, 염증 또는 조직 손상이 평가된다. 이어서, 시험 화합물 또는 항체가 도입될 수 있고, 염증 또는 조직 손상을 저해하거나, 둔화시키거나, 역전시키거나, 또는 임의의 방식으로 염증 또는 조직 손상에 영향을 미치는 그의 능력이 검출된다.
류마티스 관절염(RA) 활막 체외이식편을 사용한 실험이 전염증성 사이토카인의 자발적 방출에 대해 NKG2D를 차단하는 효과를 연구하기 위해 또한 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Brennan et al., Lancet 1989; 2 (8657); 244-247] 참조). 그러한 검정에서, 인간 또는 인간화 항-hNKG2D 항체가 RA 활막 배양물 상에서 시험되고, NKG2D의 리간드 결합 및 기능을 차단하는 데 유용한 것으로 나타난 농도에서, 예를 들어, 뮤린 항-hNKG2D 항체와 비교된다. RA 활막 세포는 항-NKG2D 항체 또는 아이소타입 대조 항체의 부재 또는 존재 하에 48 시간 동안 배양된다. 알려진 항염증 약물이 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 항-NKG2D 항체의 효과는 초기에 6개의 RA 활막 상에서 최대 30 ㎍/ml의 농도에서 시험된다. 세포의 생존력은, 첨가된 시약이 임의의 세포독성을 갖는지를 결정하기 위해 생존 세포를 염색하는 검정 (예를 들어, MTT 검정)으로 분석된다. 이어서, 배양 상청액 중의, 예를 들어, TNF-α, IL-1β 및 IL-6과 같은 사이토카인의 수준을 검출하기 위해 ELISA가 사용된다.
대안적으로, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 건선 또는 궤양성 대장염의 실험 모델에서 시험될 수 있다. 건선에 걸린 피부 샘플이 환자 자신의 PBMC와 함께 SCID 마우스 상에 이식될 수 있고, 시험 화합물의 도입 효과 및 염증 또는 조직 손상을 저해하거나, 둔화시키거나, 역전시키거나, 또는 임의의 방식으로 염증 또는 조직 손상에 영향을 미치는 그의 능력이 검출될 수 있다. 키옐레브(Kjellev) 등의 문헌[Eur J Immunol 2008; 37:1397-1406] 및 이토(Ito) 등의 문헌[Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 294:G199-G207]은 항-뮤린 NKG2D 항체를 사용한 궤양성 대장염의 치료를 평가하기 위한 실험 모델을 기술한다.
약제학적 제형
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-hNKG2D 항체를 하나 이상의 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형을 제공한다.
따라서, 본 발명의 하나의 예시적인 태양은 1 mg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 존재하는 그러한 항체를 포함하는 약제학적 제형이며, 상기 제형은 2.0 내지 10.0의 pH를 가진다. 제형은 완충제 시스템, 방부제(들), 긴장성 작용제(들), 킬레이팅제(들), 안정제, 및/또는 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 약제학적 제형은 수성 제형, 즉 물을 포함하는 제형이다. 그러한 제형은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가의 실시 형태에서, 약제학적 제형은 수용액이다. 용어 "수성 제형"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 제형으로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
다른 실시 형태에서, 약제학적 제형은 냉동 건조 제형이며, 이 경우 의사 또는 환자는 투여 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 약제학적 제형은 임의의 사전 용해 없이 사용할 준비가 된 건조 제형 (예를 들어, 냉동 건조되거나 분무 건조됨)이다.
추가의 태양에서, 약제학적 제형은 그러한 항체의 수용액, 및 완충제를 포함하며, 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 제형은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 가진다.
다른 실시 형태에서, 제형의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0, 및 약 5.5 내지 약 7.5로 이루어진 목록으로부터 선택되는 범위이다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트르산염, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨, 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트라이신, 말산, 석시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충제를 포함한다. 이들 특정 완충제 각각은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 또한 또는 대안적으로 약제학적으로 허용가능한 방부제를 포함한다. 방부제는, 예를 들어 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-하이드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미두레아, 클로로헥시딘, 데하이드로초산나트륨, 클로로크레졸, 에틸 p-하이드록시벤조에이트, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로르페네신 (3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 방부제는, 예를 들어 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 5 mg/ml 내지 10 mg/ml, 또는 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 방부제 각각은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다. 약제학적 조성물에서의 방부제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 또한 또는 대안적으로 등장화제를 포함한다. 등장화제는, 예를 들어 염 (예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산 (예를 들어, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 라이신, 아이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨 (예를 들어, 글리세롤 (글리세린), 1,2-프로판디올 (프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜 (예를 들어, PEG400), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na를 포함하는, 단당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸과 같은 임의의 당이 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 당 첨가제는 수크로스이다. 당 알코올은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되고, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 일 실시 형태에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 제제에 가용성이고 본 발명의 방법을 이용하여 달성되는 안정화 효과에 악영향을 주지 않는 한, 사용되는 양에 대한 고정된 한계는 없다. 당 또는 당 알코올 농도는, 예를 들어 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml 일 수 있다. 등장화제는, 예를 들어 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 8 mg/ml 내지 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 등장화제 각각은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다. 약제학적 조성물에서의 등장화제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 또한 또는 대안적으로 킬레이팅제를 포함한다. 킬레이팅제는, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산의 염, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 킬레이팅제는, 예를 들어 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml, 또는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 킬레이팅제 각각은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다. 약제학적 조성물에서의 킬레이팅제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.
본 발명의 추가의 실시 형태에서, 제형은 또한 또는 대안적으로 안정제를 포함한다. 약제학적 조성물에서의 안정제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 조성물은, 치료적 활성 성분이 액체 약제학적 제형에서 저장 동안 응집체 형성을 나타낼 가능성이 있는 폴리펩티드를 포함하는 안정화된 액체 약제학적 조성물일 수 있다. "응집체 형성"이란, 가용성으로 남아 있을 수 있는 올리고머, 또는 용액으로부터 침전되는 큰 가시적인 응집체의 형성을 가져오는 폴리펩티드 분자들 사이의 물리적 상호작용을 의미한다. "저장 동안"이란 일단 제조된 액체 약제학적 조성물 또는 제형이 대상체에게 즉시 투여되지 않음을 의미한다. 오히려, 제조 후, 그 액체 약제학적 조성물 또는 제형은, 액체 형태로, 냉동된 상태로, 또는 액체 형태로의 추후 재구성을 위한 건조 형태 또는 대상체로의 투여에 적합한 다른 형태로 저장을 위해 포장된다. "건조 형태"란 액체 약제학적 조성물 또는 제형이 냉동 건조 (즉, 동결건조; 예를 들어, 문헌[Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59] 참조), 분무 건조 (문헌[Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676]; 문헌[Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206]; 및 문헌[Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20] 참조), 또는 공기 건조 (문헌[Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470]; 및 문헌[Roser (1991) Biopharm. 4:47-53])에 의해 건조됨을 의미한다. 액체 약제학적 조성물의 저장 동안 폴리펩티드에 의한 응집체 형성은 그 폴리펩티드의 생물학적 활성에 악영향을 줄 수 있어서, 약제학적 조성물의 치료 효능의 손실을 초래한다. 더욱이, 응집체 형성은, 폴리펩티드 함유 약제학적 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여될 때 튜빙, 막, 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 문제를 야기할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 대안적으로 또는 추가로 조성물의 저장 동안 폴리펩티드에 의한 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 포함할 수 있다. "아미노산 염기"란 아미노산 또는 아미노산들의 조합을 의미하며, 이 경우 임의의 주어진 아미노산은 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로 존재한다. 아미노산들의 조합이 사용되는 경우, 아미노산 모두가 그들의 유리 염기 형태로 존재할 수 있거나, 모두가 그들의 염 형태로 존재할 수 있거나, 또는 일부는 그들의 유리 염기 형태로 존재할 수 있지만 다른 아미노산들은 그들의 염 형태로 존재한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 조성물을 제조하는 데 사용하기 위한 아미노산은 하전된 측쇄, 예를 들어 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 및 글루탐산을 지닌 것이다. 특정 아미노산 (예를 들어, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 라이신, 아이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 이들의 혼합물)의 임의의 입체이성질체 L, D, 또는 이들의 혼합물, 또는 이들 입체이성질체의 조합이, 그 특정 아미노산이 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로 존재하는 한, 본 발명의 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, L-입체이성질체가 사용된다. 본 발명의 조성물은 또한 이들 아미노산의 유사체를 사용하여 제형화될 수 있다. "아미노산 유사체"란 본 발명의 액체 약제학적 조성물의 저장 동안 폴리펩티드에 의한 응집 형성을 감소시키는 원하는 효과를 가져오는 자연 발생적 아미노산의 유도체를 의미한다. 적절한 아르기닌 유사체는 예를 들어, 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함하고, 적절한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고, 적절한 시스테인 유사체는 S-메틸-L 시스테인을 포함한다. 다른 아미노산과 같이, 아미노산 유사체는 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로 조성물 내로 혼입된다. 본 발명의 추가의 실시 형태에서, 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 방지하거나 지연시키기에 충분한 농도로 사용된다.
본 발명의 추가의 실시 형태에서, 메티오닌 설폭사이드로의 메티오닌 잔기의 산화를 저해하기 위해 메티오닌 (또는 다른 황산 아미노산 또는 아미노산 유사체)이 첨가될 수 있는데, 이때 치료제로서 작용하는 폴리펩티드는 그러한 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 이와 관련하여, 용어 "저해"는 시간 경과에 따른 메티오닌 산화된 종의 최소 축적을 의미하도록 의도된다. 메티오닌 산화가 저해되면 적절한 분자 형태의 폴리펩타이드를 더 많이 보유하게 된다. 메티오닌의 임의의 입체이성질체 (L 또는 D) 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 첨가되는 양은, 메티오닌 설폭사이드의 양이 규제 기관에 대해 허용 가능해 지도록 메티오닌 잔기의 산화를 저해하기에 충분한 양이어야 한다. 전형적으로, 이는 조성물이 약 10% 내지 약 30% 이하의 메티오닌 설폭사이드를 함유함을 의미한다. 일반적으로, 이는 첨가되는 메티오닌 대 메티오닌 잔기의 비가 약 1:1 내지 약 1:1,000, 예를 들어 10:1 내지 약 100:1 범위가 되도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 추가적으로 또는 대안적으로 고분자량 중합체 또는 저분자량 화합물의 군으로부터 선택되는 안정제를 포함한다. 본 발명의 추가의 실시 형태에서, 안정제는 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 3350), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시/하이드록시셀룰로오스 또는 그의 유도체 (예를 들어, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 사이클로덱스트린, 황 함유 물질, 예를 들어 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올, 및 다양한 염 (예를 들어, 염화나트륨)으로부터 선택된다. 이들 특정 안정제 각각은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
약제학적 조성물은 또한 또는 대안적으로 추가의 안정화제를 포함할 수 있으며, 이러한 추가의 안정화제는 그 약제학적 조성물 내의 치료적 활성 폴리펩티드의 안정성을 추가로 향상시킨다. 본 발명에 대해 특히 관심 대상의 안정제는 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 및 냉동-해동 또는 기계적 전단과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 추가적으로 또는 대안적으로 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는, 예를 들어 세정제, 에톡실화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세라이드, 아세틸화 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 중합체 (예를 들어, 폴록사머, 예를 들어 플루로닉(Pluronic®) F68, 폴록사머 188 및 407, 트리톤 X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체, 예를 들어 알킬화 및 알콕실화 유도체 (트윈(tween), 예를 들어 트윈-20, 트윈-40, 트윈-80 및 Brij-35), 모노글리세라이드 또는 이의 에톡실화 유도체, 다이글리세라이드 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알코올, 글리세롤, 렉틴 및 인지질 (예를 들어, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 다이포스파티딜 글리세롤 및 스핑고마이엘린), 인지질 (예를 들어, 다이팔미토일 포스파티드산) 및 라이소인지질 (예를 들어, 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 팔미토일 라이소포스파티딜-L-세린 및 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르)의 유도체 및 라이소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실(알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르) 유도체, 예를 들어, 라이소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 및 극성 머리기의 변형, 즉, 콜린, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨, 및 양 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 라이소포스파티딜세린 및 라이소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로인지질 (예를 들어, 세팔린), 글리세로당지질 (예를 들어, 갈락토피라노사이드), 스핑고당지질 (예를 들어, 세라마이드, 강글리오시드), 도데실포스포콜린, 계란 라이소레시틴, 푸시드산 유도체 (예를 들어, 소듐 타우로-다이하이드로푸시데이트 등), 장쇄 지방산 및 그의 염 C6-C12 (예를 들어, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα 아실화 유도체, 또는 라이신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 중성 또는 산성 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 다이펩티드의 Nα 아실화 유도체, 중성 아미노산과 2개의 하전된 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 트라이펩티드의 Nα 아실화 유도체, DSS (도쿠세이트 나트륨, CAS 등록 번호 [577-11-7]), 도쿠세이트 칼슘, CAS 등록 번호 [128-49-4]), 도쿠세이트 칼륨, CAS 등록 번호 [7491-09-0]), SDS (소듐 도데실 설페이트 또는 소듐 라우릴 설페이트), 소듐 카프릴레이트, 콜산 또는 이의 유도체, 담즙산 및 이의 염 및 글리신 또는 타우린 접합체, 우르소데옥시콜산, 소듐 콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 글리코콜레이트, N-헥사데실-N, N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 음이온성 (알킬-아릴-설포네이트) 1가 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제 (예를 들어, N-알킬-N,N-다이메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜아미도-1-프로필다이메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 양이온성 계면활성제 (4차 암모늄 염기) (예를 들어, 세틸-트라이메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 도데실 β-D-글루코피라노사이드), 에틸렌다이아민으로의 프로필렌 옥사이드와 에틸렌 옥사이드의 순차적 첨가로부터 유도되는 4 작용성 블록 공중합체인 폴록사민 (예를 들어, 테트로닉(Tetronic))로부터 선택될 수 있거나, 계면활성제는 이미다졸린 유도체, 또는 그의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 특정 계면활성제 각각은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
약제학적 조성물에서의 계면활성제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.
추가의 실시 형태에서, 제형은 추가적으로 또는 대안적으로 EDTA (에틸렌다이아민 테트라아세트산) 및 벤즈아미딘HCl과 같은 프로테아제 저해제를 포함하지만, 다른 구매 가능한 프로테아제 저해제가 또한 사용될 수 있다. 프로테아제 저해제의 사용은, 자가촉매 작용을 억제하기 위해 프로테아제의 효소원을 포함하는 약제학적 조성물에 특히 유용하다.
다른 성분이 또한 또는 대안적으로 본 발명의 펩티드 약제학적 제형에 존재할 수 있는 것이 가능하다. 그러한 추가 성분은 습윤제, 유화제, 산화방지제, 증량제, 긴장성 변형제, 킬레이팅제, 금속 이온, 유지성 비히클, 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터이온 (예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수 있다. 물론, 그러한 추가의 성분은 본 발명의 약제학적 제형의 전반적인 안정성에 악영향을 주지 않아야 한다.
본 발명에 따른 항체를 함유하는 약제학적 조성물은, 그러한 치료를 필요로 하는 환자의 몇몇 부위에, 예를 들어, 피부 및 점막 부위와 같은 국소 부위에, 동맥내, 정맥내, 심장내 투여와 같은 흡수를 우회하는 부위에, 그리고 피부내, 피하, 근육내 또는 복부내 투여와 같은 흡수를 수반하는 부위에 투여된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여는 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 투여 경로, 예를 들어 혀, 설하, 협측, 입, 구강, 위 및 장, 비강, 폐, 예를 들어, 기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막을 통해, 뇨관, 및 비경구 경로를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 조성물은 몇몇 투여 형태로, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀전, 마이크로에멀전, 다중 에멀전, 폼(foam), 살브(salve), 페이스트, 플라스터, 연고, 정제, 코팅 정제, 린스, 캡슐, 예를 들어, 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌약, 직장 캡슐, 액적, 겔, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입제, 점안제, 안과용 연고, 안과용 린스, 질 페서리(pessary), 질 링, 질 연고, 주사 용액, 원위치(in situ) 변환 용액, 예를 들어 원위치 겔화, 원위치 설정, 원위치 침전, 원위치 결정화, 주입 용액, 및 임플란트로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 항체의 안정성을 추가로 향상시키고, 생체이용률을 증가시키고, 용해도를 증가시키고, 유해 효과를 감소시키고, 당업자에게 잘 알려진 시간치료법(chronotherapy)을 달성하고, 환자 순응도 또는 이들의 임의의 조합을 증가시키기 위하여, 약물 담체, 약물 전달 시스템 및 진보된 약물 전달 시스템에 추가로 배합되거나, 예를 들어 공유결합성, 소수성 및 정전기적 상호작용을 통해 그에 부착될 수 있다. 담체, 약물 전달 시스템 및 진보된 약물 전달 시스템의 예는 중합체, 예를 들어 셀룰로오스 및 유도체, 다당류, 예를 들어 덱스트란 및 유도체, 전분 및 유도체, 폴리(비닐 알코올), 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 중합체, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 이들의 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 담체 단백질, 예를 들어, 알부민, 겔, 예를 들어 열겔화 시스템, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 블록 공중합체 시스템, 지질-물 시스템에서의 상 거동의 당업자에게 잘 알려져 있는 미셀, 리포좀, 미소구체, 나노미립자, 액정 및 그의 분산물, L2 상 및 그의 분산물, 중합체성 미셀, 다중 에멀전, 자가 유화, 자가 미세유화, 사이클로덱스트린 및 그의 유도체, 및 덴드리머를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어 모두 당업자에게 잘 알려진 장치인 정량(metered dose) 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 사용한 항체의 폐 투여를 위한 고체, 반고체, 분말 및 용액의 제형화에 유용하다.
본 발명의 조성물은 제어 방출, 지속 방출, 연장 방출, 지연 방출, 및 서방형 약물 전달 시스템의 제형화에 특히 유용하다. 더욱 구체적으로, 조성물은 당업자에게 잘 알려져 있는 비경구 제어 방출 및 지속 방출 시스템 (둘 모두의 시스템은 투여 횟수의 몇 배 감소를 가져옴)의 제형화에 유용하지만 이로 제한되지 않는다. 더욱 더 바람직하게는, 제어 방출 및 지속 방출 시스템은 피하 투여된다. 본 발명의 범주를 제한함이 없이, 유용한 제어 방출 시스템 및 조성물의 예는 하이드로겔, 유지성 겔, 액정, 중합체성 미셀, 미소구체, 나노입자이다.
본 발명의 조성물에 유용한 제어 방출 시스템을 생성하는 방법은 결정화, 응축, 공결정화, 침전, 공침전, 유화, 분산, 고압 균질화, 캡슐화, 분무 건조, 마이크로캡슐화, 코아세르베이션(coacervation), 상 분리, 미소구체를 생성하기 위한 용매 증발, 압출 및 초임계 유체 공정을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일반적으로 문헌[Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)] 및 문헌[Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)]을 참조한다.
비경구 투여는, 주사기, 선택적으로 펜형 주사기에 의한 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 추가의 선택사항은 비강 또는 폐 스프레이의 형태로 항체 화합물을 투여하기 위한 용액 또는 현탁액일 수 있는 조성물이다. 추가의 선택사항으로서, 본 발명의 항체를 함유하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 무바늘 주사에 의한 또는 패치, 선택적으로 이온삼투요법용 패치로부터의 경피 투여, 또는 경점막, 예를 들어, 협측 투여에 또한 적합하게 될 수 있다.
항체는 폐 약물 전달에 적합한 임의의 알려진 유형의 장치를 사용하여, 용액, 현탁액 또는 건조 분말로서, 비히클 내에서 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 이들의 예는 폐 약물 전달을 위한 3 가지 일반적인 유형의 에어로졸 발생으로 구성되지만 이로 제한되지 않으며, 제트 또는 초음파 네뷸라이저, 정량 흡입기, 또는 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있다 (문헌[Yu J, Chien Y W. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit. Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997) 395-453] 참고).
표준화된 시험 방법에 기초하여, 입자의 공기역학적 직경(da)은 단위 밀도 (1 g/㎤)의 기준 표준 구형 입자의 기하학적 등가 직경으로서 정의된다. 가장 간단한 경우, 구형 입자에 대하여, da 는 다음에 의해 기술된 바와 같은 밀도 비의 제곱근의 함수로서 기준 직경 (d)과 관련된다:
d a= ρ ρ a d
이러한 관계에 대한 변경은 비구형 입자의 경우에 발생한다 (문헌[Edwards D A, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385] 참고). 용어 "MMAD" 및 "MMEAD"는 당업계에 잘 설명되어 있고 알려져 있다 (문헌[Edwards D A, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385] 참고). 질량 중위 공기역학적 직경(MMAD) 및 질량 중위 유효 공기역학적 직경(MMEAD)은 상호 교환 가능하게 사용되고, 통계 파라미터이고, 실제 형상, 크기, 또는 밀도에 관계없이 폐에 침착할 그의 가능성과 관련하여 에어로졸 입자의 크기를 경험적으로 기술한다 (문헌[Edwards D A, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385] 참고). MMAD는 보통 공기 중의 입자 관성 거동을 측정하는 기구인 임팩터(impactor)로 수행된 측정으로부터 계산된다.
추가의 실시 형태에서, 제형은, 10 μm 미만, 더 바람직하게는 1 내지 5 μm, 그리고 가장 바람직하게는 1 내지 3 μm의 에어로졸 입자들의 MMAD를 달성하기 위해 분무와 같은 임의의 알려진 에어로졸화 기술에 의해 에어로졸화될 수 있다. 바람직한 입자 크기는 단백질이 최적으로 흡수되는 폐 심부로의 약물의 전달을 위한 가장 효과적인 크기에 기초한다 (문헌[Edwards D A, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385] 참고).
항체를 포함하는 폐 제형의 폐 심부 침착은, 예를 들어 다음과 같지만 이로 제한되지 않는 흡입 기술의 변형을 사용함으로써 선택적으로 추가로 최적화될 수 있다: 저속 흡입 유동 (예를 들어, 30 L/분), 호흡 중지 및 작동 타이밍.
용어 "안정화된 제형"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리적 및 화학적 안정성을 갖는 제형을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단백질 제형의 "물리적 안정성"이라는 용어는 열역학적 응력으로의 항체의 노출 및/또는 소수성 표면 및 계면과 같은 불안정화되는 계면 및 표면과의 상호작용의 결과로서 생물학적 비활성 및/또는 불용성 응집체를 형성하는 항체의 경향을 지칭한다. 수성 항체 제형의 물리적 안정성은, 적합한 용기 (예를 들어, 카트리지 또는 바이알) 내에 충전된 제형을 다양한 기간 동안 상이한 온도에서 기계적/물리적 응력 (예를 들어, 교반)에 노출시킨 후에 시각적 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가된다. 제형의 시각적 검사는 어두운 배경을 사용한 선명한 집속 광(sharp focused light)에서 수행된다. 제형의 탁도는, 탁도의 정도를, 예를 들어 0 내지 3의 척도로 등급을 매기는 시각적 점수 (탁도를 나타내지 않는 제형은 시각적 점수 0에 상응하고, 일광에서 시각적 탁도를 나타내는 제형이 시각적 점수 3에 상응함)에 의해 특성화된다. 제형은, 일광에서 시각적 탁도를 나타낼 때, 항체 응집과 관련하여 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다. 대안적으로, 제형의 탁도는 당업자에게 잘 알려진 간단한 탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 수성 항체 제형의 물리적 안정성은 또한 항체의 입체구조적 상태의 분광 작용제 또는 프로브를 사용하여 평가될 수 있다. 프로브는 바람직하게는 항체의 비천연 이형태체(conformer)에 우선적으로 결합하는 작은 분자이다. 단백질 구조의 소분자 분광 프로브의 일례는 티오플라빈 T 이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 피브릴의 검출에 널리 사용되는 형광 염료이다. 피브릴, 및 아마도 또한 다른 단백질 구성의 존재 하에서, 티오플라빈 T는 피브릴 단백질 형태에 결합될 때 약 450 nm 에서 새로운 여기 최대값을 그리고 약 482 nm 에서 향상된 방출을 가져온다. 결합되지 않은 티오플라빈 T는 본질적으로 파장에서 비형광성이다.
다른 소분자는 천연 상태로부터 비천연 상태로의 단백질 구조 변화의 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 노출된 소수성 패치에 우선적으로 결합하는 "소수성 패치" 프로브가 있다. 소수성 패치는 일반적으로 그의 천연 상태에서 단백질의 3차 구조 내에 묻혀 있지만, 단백질이 언폴딩되거나 변성되기 시작함에 따라 노출된다. 이러한 작은 분자량의 분광 프로브의 예는 방향족 소수성 염료, 예를 들어 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등이다. 다른 분광 프로브는 금속-아미노산 복합체, 예를 들어, 페닐알라닌, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 및 발린 등과 같은 소수성 아미노산의 코발트 금속 복합체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체 제형의 "화학적 안정성"이라는 용어는 천연 항체 구조와 비교하여 잠재적으로 더 적은 생물학적 효능 및/또는 잠재적으로 증가된 면역원 특성을 갖는 화학적 분해 생성물의 형성을 가져오는 항체 구조의 화학적 공유결합 변화를 지칭한다. 천연 항체의 유형과 특성 및 항체가 노출되는 환경에 따라 다양한 화학적 분해 생성물이 형성될 수 있다. 화학적 분해의 제거는 아마도 완전히 회피되지 않을 수 있고, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 항체 제형의 저장 및 사용 동안 증가량의 화학적 분해 생성물이 종종 나타난다. 대부분의 단백질은 탈아미드화되기 쉬운데, 탈아미드화는 글루타미닐 또는 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 유리 카르복실산을 형성하는 과정이다. 다른 분해 경로는, 2개 이상의 단백질 분자가 아미드교환(transamidation) 및/또는 다이설파이드 상호작용을 통해 서로 공유 결합되어 공유 결합된 이량체, 올리고머 및 중합체 분해 생성물의 형성을 가져오는 고분자량 변환 생성물의 형성을 수반한다 (문헌[Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, New York 1992]). (예를 들어, 메티오닌 잔기의) 산화는 화학적 분해의 다른 변종으로서 언급될 수 있다. 항체 제형의 화학적 안정성은 상이한 환경 조건으로의 노출 후 다양한 시점에서 화학적 분해 생성물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다 (분해 생성물의 형성은 종종 예를 들어 온도를 증가시킴으로써 가속될 수 있음). 각각의 개별적인 분해 생성물의 양은 종종 다양한 크로마토그래피 기술 (예를 들어, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 이용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따른 분해 생성물의 분리에 의해 결정된다.
따라서, 상기 약술된 바와 같이, "안정화된 제형"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리적 및 화학적 안정성을 갖는 제형을 지칭한다. 일반적으로, 제형은 만료일에 도달할 때까지 (권장 사용 및 저장 조건을 준수한) 사용 및 저장 동안 안정해야 한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 6 주 초과의 사용 동안 그리고 3 년 초과의 저장 동안 안정하다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 4 주 초과의 사용 동안 그리고 3 년 초과의 저장 동안 안정하다.
본 발명의 추가의 실시 형태에서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 4 주 초과의 사용 동안 그리고 2 년 초과의 저장 동안 안정하다.
본 발명의 더욱 추가의 실시 형태에서, 항체를 포함하는 약제학적 제형은 2 주 초과의 사용 동안 그리고 2 년 초과의 저장 동안 안정하다.
적합한 항체 제형은 또한 이미 개발된 다른 치료적 단클론성 항체와 관련된 경험 내용을 조사함으로써 결정될 수 있다. 리툭산(Rituxan) (리툭시맙), 헤르셉틴(Herceptin) (트라스투주맙), 졸레어(Xolair) (오말리주맙), 벡사(Bexxar) (토시투모맙), 캄패쓰(Campath) (알렘투주맙), 제발린(Zevalin), 온콜림(Oncolym), 휴미라(Humira) 및 유사한 제형과 같은 몇몇 단클론성 항체가 임상적 상황에서 효율적인 것으로 밝혀졌고, 이러한 단클론성 항체는 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체는, 9.0 mg/mL의 염화나트륨, 7.35 mg/mL의 시트르산나트륨 이수화물, 0.7 mg/mL의 폴리소르베이트 80, 및 주사용 멸균수 중에서 IV 투여를 위해 제형화된 100 mg (10 mL) 또는 500 mg (50 mL) 1 회용 바이알 내에 10 mg/ml의 농도로 공급될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다. 대안적으로, 항체는 히스티딘, 수크로스, 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 용액 중에서 제형화될 수 있다.
진단적 응용
본 발명의 hNKG2D-항체는 또한 비-치료적 응용을 가진다. 예를 들어, 항-hNKG2D 항체는 또한 NKG2D 단백질에 대한 진단 검정에서, 예를 들어 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서의 그의 발현을 검출하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 항-hNKG2D 항체는 항-hNKG2D 치료를 위한 환자를 선택하는 검정에서 사용될 수 있다. 그러한 목적을 위하여, 항-hNKG2D 항체는, 혈청 또는 조직 표본에서 hNKG2D의 존재에 대해 분석하거나, NKG2D를 발현하는 CD4+ T 세포의 존재, 또는 NKG2D (예를 들어, NK 또는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포)를 발현하는 세포를 촉진하는 질병의 존재에 대해 시험하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 분석은 분석 시험, 예를 들어 혈액 내 가용성 MICA의 수준에 대한 분석 시험과 조합될 수 있다 (예를 들어, 스파이스(Spies) 등의 국제특허 공개 WO2003089616호 참조).
진단적 응용의 경우, 항체는 전형적으로 검출 가능한 모이어티로 표지될 것이다. 하기의 카테고리들로 일반적으로 그룹화될 수 있는 다수의 표지가 이용 가능하다:
(a) 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I와 같은 방사성 동위원소. 항체는, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 방사능은 신틸레이션 계수(scintillation counting)를 이용하여 측정될 수 있다.
(b) 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리싸민(Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드와 같은 형광 표지가 이용 가능하다. 형광 표지는, 예를 들어 상기 문헌[Current Protocols in Immunology]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량화될 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 입수 가능하고, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중 일부의 검토를 제공한다. 일반적으로 효소는 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있으며, 이는 분광광도계로 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광 변화를 정량화하기 위한 기술은 상기에 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이어서 (예를 들어, 화학 발광계를 사용하여) 측정될 수 있는 광을 방출하거나, 또는 형광 수용체에 에너지를 공여할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어, 우리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키기 위한 기술은 문헌[O'Sullivan et al, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)와, 기질로서의, 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 다이아민(OPD) 또는 3,3', 5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB))를 산화시키는 하이드로겐 퍼옥시다제;
(ii) 알칼리 포스파타아제(AP)와, 발색성 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) 베타-D-갈락토시다제(베타-D-Gal)와, 발색성 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제) 또는 형광발생성 기질인 4-메틸움벨리페릴-p-베타-갈락토시다제.
다수의 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용 가능하다. 이들의 전반적인 검토를 위해서는, 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조한다.
때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 인식할 것이다. 예를 들어, 항체는 바이오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 3개의 넓은 표지 카테고리 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 바이오틴이 아비딘에 선택적으로 결합하고, 그에 따라 표지가 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합되고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지들 중 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 항-NKG2D 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 NKG2D 항체에 결합하는 표지된 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 검정 방법, 예를 들어, 경쟁적 결합 검정, 직접적 및 간접적 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에서 이용될 수 있다. 문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
면역조직화학을 위하여, 조직 샘플은 신선한 또는 냉동 상태일 수 있거나, 파라핀 내에 매립되고, 예를 들어 포르말린과 같은 방부제에 의해 고정될 수 있다.
항체는 또한 생체내 진단 검정에 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체는, 예를 들어 핵 자기 공명, 또는 당업계에 알려져 있는 다른 수단에 의해 검출 가능한 방사성핵종 또는 비-방사성 지시약으로 표지된다. 바람직하게는, 표지는, 예를 들어 125I, 131I, 67Cu, 99mTc, 또는 111In와 같은 방사성 표지이다. 표지된 항체는, 바람직하게는 혈류를 통해 숙주에 투여되고, 숙주에서 표지된 항체의 존재 및 위치가 검정된다. 이러한 이미징 기술은 신생물(neoplasm)의 검출, 병기 결정(staging) 및 치료에 적합하게 사용된다. 방사성 동위원소는 금속-킬레이팅 화합물 또는 락토퍼옥시다제, 또는 요오드화를 위한 요오도겐 기술을 포함하는 임의의 수단에 의해 단백질에 접합된다.
편의상, 본 발명의 항체는 키트, 즉 미리 결정된 양의 시약들과 진단 검정을 수행하기 위한 설명서의 포장된 조합으로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소가 요구하는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 검정의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 상태의 농도를 제공하도록 광범위하게 달라질 수 있다. 특히, 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하는 시약은 건조 분말, 보통 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있다.
치료적 응용
본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 또는 인간화 항-hNKG2D 항체를 사용하여 환자를 치료하는 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 인간 환자에게 투여하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 또는 인간화 항체의 용도를 제공한다. 전형적으로, 환자는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 장애를 앓고 있거나 그러한 질병 또는 장애의 위험이 있다.
예를 들어, 일 태양에서, 본 발명은 인간 또는 인간화 항-NKG2D 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 NK 또는 T 세포의 hNKG2D 매개된 활성화를 감소시키거나 저해하는 방법을 제공하며, 상기 항체는 NKG2D 수용체의 리간드 매개된 활성화를 감소시키거나 예방한다. 일 실시 형태에서, 이 방법은 증가된 NK 또는 T 세포 활성이 NK 또는 T 세포에 의한 용해에 민감한 세포를 수반하거나 그에 영향을 미치거나 그에 의해 야기되는 질병, 또는 증가된 NK 및/또는 T 세포 활성에 의해 야기되거나 그에 의해 특성화되는 질병, 예를 들어 자가면역 질병 또는 장애 또는 염증성 질환에 걸린 환자에서 그러한 림프구의 활성을 감소시키는 것에 관한 것이다. 일 태양에서, 본 발명은 환자에서 만성 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 화합물로 치료되는 예시적인 질환 또는 장애는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 척추관절병증 (강직성 척추염), 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근병증 (피부근육염, 폴리근육염), 쇼그렌 증후군, 맥관염, 전신성 맥관염, 측두 동맥염, 죽상동맥경화증, 사르코이드증, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역 범혈구 감소증, 발작성 야행성 헤모글로빈 뇨증), 악성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증 (특발성 혈소판 감소증, 면역 매개된 혈소판 감소증), 갑상선염 (그레이브 병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역 매개된 신장 질병 (사구체신염, 세뇨관 간질 신염, 자가면역 난소염), 자가면역 고환염, 자가면역 포도막염, 항-인지질 증후군, 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질병, 예를 들어 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 간담도 질병, 예를 들어, 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 바이러스성 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 과립성 간염, 베게너 육아종증, 베체트병, 및 경화성 담관염, 염증성 장질환, 예를 들어 궤양성 대장염 또는 크론병, 셀리악병, 글루텐 민감성 장병증, 및 휘플병, 수포성 피부병, 다형 홍반 및 접촉성 피부염, 포진성 피부염, 건선, 심상성 천포창, 백반증 (백색피부증)을 포함하는 자가면역 또는 면역 매개된 피부병, 알레르기 질병, 예를 들어 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증 및 두드러기, 폐의 면역 질환, 예를 들어 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 만성 폐색성 폐 질환, 및 이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질병을 포함한 이식 관련 질병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 일 태양에서, 항-NKG2D 항체는 진통제, 면역억제제 (예를 들어, B 세포 고갈제 및 T 세포 저해제와 같은 B 세포 또는 T 세포 길항제; 보체 저해제), 코르티코스테로이드, 및 항-TNF 알파 작용제 또는 다른 항-사이토카인 또는 항-사이토카인 수용체 작용제, 및 항-혈관형성제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 다른 항염증제와 병용하여 사용된다. 구체적인 예는 메토트렉세이트, TSG-6, 리툭산® 또는 다른 B 세포 치료법, 항-IL12 (p40) 항체, CTLA4-Fc 융합 단백질, IL-1 수용체 길항제, IL-1 항체, IL-15 항체, IL-18 항체, 및 항-IL6R 항체를 포함한다. 병용 치료법의 추가의 예가 하기에 제공되어 있다.
하나 이상의 다른 작용제 또는 접근법이 본 치료법과 병용하여 사용될 때, 합쳐진 결과가 각각의 치료가 개별적으로 수행될 때 관찰되는 효과를 상가한 것이 되도록 하는 요건은 없다. 적어도 상가적 효과가 일반적으로 바람직하지만, NKG2D 활성의 임의의 감소 또는 단일 치료법들 중 하나 초과의 다른 유익한 효과이면 유익할 것이다. 또한, 상승적 효과를 나타내기 위한 병용 치료에 대한 특별한 요건은 없지만, 이는 확실히 가능하고 유리하다. NKG2D 기반 치료가, 예를 들어, 수 분 내지 수 주 및 수 개월 범위의 간격을 두고 다른 치료에 선행하거나 그 뒤를 이을 수 있다. 항-NKG2D 조성물 또는 다른 작용제의 1 회 초과의 투여가 이용될 것임이 또한 고려된다. 작용제들은 격일로 또는 격주로 상호 교환 가능하게 투여될 수 있거나; 항-NKG2D 치료의 사이클이 주어질 수 있고, 이어서 다른 작용제 치료법의 사이클이 주어질 수 있다. 어느 경우든, 필요한 모든 것은 투여 시간과 무관하게 치료적으로 유익한 효과를 발휘하는 데 효과적인 배합량으로 둘 모두의 작용제를 전달하는 것이다.
투여량
항체의 투여의 경우, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/㎏, 그리고 더욱 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/㎏의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 약 0.3 mg/㎏ 체중, 약 1 mg/㎏ 체중, 약 3 mg/㎏ 체중, 약 5 mg/㎏ 체중 또는 약 10 mg/㎏ 체중이거나 1 내지 10 mg/㎏의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 주당 2 회, 주당 1 회, 2 주마다 1 회, 3 주마다 1 회, 4 주마다 1 회, 1 개월에 1 회, 3 개월마다 1 회 또는 3 개월 내지 6 개월마다 1 회 투여를 수반한다. 본 발명의 항-hNKG2D 항체에 대한 바람직한 투여량 요법은 정맥내 투여 또는 피하 주사를 통한 체중 ㎏당 약 1, 3 또는 10 mg을 포함하며, 이때 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 주어진다: (i) 2 내지 4 회 투여량에 대하여 1 내지 3 주마다, 이어서 2 개월마다; (ii) 4 주마다; (iii) 매주, 또는 임의의 다른 최적 투여로 용량을 로딩함. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단클론성 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여된 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 보통 여러 차례 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은, 예를 들어, 매주, 매달, 3 개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 나타나는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1 내지 1,000 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 그리고 일부 방법에서는 약 25 내지 300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 이어서 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비-인간 항체의 순서로 긴 반감기를 나타낸다. 투여 용량 및 빈도는 치료가 예방적 또는 비-예방적 (예를 들어, 완화적 또는 치유적)인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 응용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 빈번하지 않은 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 생애 동안 치료를 계속 받는다. 완화적 또는 치유적 응용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 그리고 바람직하게는 환자가 질병의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 비교적 짧은 간격의 비교적 높은 투여량이 때때로 필요하다. 그 후에, 환자는 예방적 요법으로 투여될 수 있다.
항염증제의 적절한 용량은, 항염증제가 단독으로 또는 다른 작용제와 병용하여 투여되는 임상 치료법에서 이미 이용되는 것에 근접할 것이다. 치료되는 질환에 따라 투여량의 변화가 발생할 가능성이 있을 것이다. 치료를 실시하는 의사는 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다.
제조 물품
본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 재료를 함유하는 제조 물품이 제공된다. 예를 들어, 제조 물품은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 또는 인간화 항-hNKG2D 항체를, 사용자로 하여금 그 항체를 유효량으로 사용하여 인간에서 자가면역 또는 염증성 질병 또는 장애와 같은 장애를 치료하도록 지시하는 설명서와 함께 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 제조 물품은 전형적으로 용기, 및 그 용기 상의 또는 그와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적절한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 질환을 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공 가능한 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 하나의 활성 작용제는 본 명세서에 기재된 인간 또는 인간화 항-hNKG2D 항체, 또는 그러한 항체를 포함하는 항원 결합성 단편 또는 항체 유도체 (예를 들어, 면역접합체) 이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 예를 들어, 류마티스 관절염과 같은 선택된 질환을 치료하는 데 사용되는 것임을 나타낸다.
더욱이, 제조 물품은 (a) 본 명세서에 기재된 인간 또는 인간화 항체를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제1 용기, 및 (b) 인간 또는 인간화 항체 이외의 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시 형태에서의 제조 물품은, 제1 및 제2 조성물이 자가면역 또는 염증성 질병 또는 장애를 치료하기 위해 병용하여 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 치료제는 전술한 섹션에 기재된 임의의 애주번트 치료법일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
본 발명의 추가의 세부사항이 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
실시예 1: hNKG2D에 대한 인간 단클론성 항체의 생성 및 초기 스크리닝
재료 및 방법
항원.
세포 (NK, BAF, 또는 CHO)의 표면 상에 발현된 가용성 NKG2D-hFc 융합 단백질 (R&D, cat: 1299-NK) 또는 NKG2D(NK, BAF, 또는 CHO)를 면역화를 위한 항원으로서 사용하였다. BAF 세포를 전장 NKG2D 및 DAP10으로 공동 형질감염시켰다. DAP10 없이 세포 표면으로 수송하는 NKG2D 점 돌연변이체로 CHO 세포를 형질감염시켰다 (문헌[Wu et al., Science 1999; 385:730-2]). NK 세포는 NKG2D를 자연적으로 발현하는 1차 NK 세포였다.
마우스.
인간 항체 유전자를 발현하는 유전자도입 마우스의 KM 마우스(KM Mouse™) 품종에서 NKG2D에 대한 완전 인간 단클론성 항체를 생성시켰다 (이시다(Ishida) 등의 국제특허 공개 WO 02/43478호). 이러한 마우스 품종에서, 내인성 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen et al (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기재된 바와 같이 동형접합성 파괴시켰고, 내인성 마우스 중쇄는 휴맙(Humab) 마우스에 관한 국제특허 공개 WO 01/09187호의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형접합성 파괴시켰다. 마우스 품종은 문헌[Fishwild et al(1996)Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재된 바와 같이 인간 카파 경쇄 도입유전자인 KC05를 지닌다. 마우스 품종은 또한 국제특허 공개 WO0243478호에 기재된 바와 같이 인간 중쇄 트랜스염색체 SC20을 지닌다.
면역화.
제1 시리즈의 면역화에서, NKG2D 형질감염된 BAF 세포와 NKG2D 형질감염된 CHO 세포의 교번적 주사, 또는 임의의 애주번트의 존재 또는 부재 하에 1차 인간 NK 세포로 동물을 복강내 면역화시켰다. 각각의 마우스를 매주 또는 격주 마다 (총 6 회) 5×106개의 세포로 IP 면역화하였다. 마우스를, 희생 및 비장의 분리 전 3 일째 및 2 일째에 5×106개의 NKG2D 형질감염된 BAF 세포로 정맥내 추가 접종하였다. 동물 실험은 대니쉬 내셔널 리서치 카운슬(Danish National Research Council) 가이드라인에 따라 수행하였다.
제2 시리즈의 면역화에서, 동물을 상이한 애주번트를 사용하여 NKG2D-hFc로 복강내로 그리고 발 경로로 면역화시켰다. 각 마우스를 7 × 25 ug NKG2F-hFc/Ribi/ip/sc, 1 × 25 ug NKG2D-hFc/CFA/ip/sc, 1 × 25 ug NKG2DhFc/IFA/ip/sc, 1 × 30 ug 항-CTLA4 + 40 ug NKG2D-hFc/IFA/ip/sc, 1 × 25 ug NKG2DhFc/Ribi/ip/sc로 면역화시키고, 희생 및 비장의 분리 전 3 일째 및 2 일째에 2 × 30 ug/PBS/ip/iv로 추가 접종하였다. 동물 실험은 아메리칸 내셔널 리서치 카운슬(American National Research Council) 가이드라인에 따라 수행하였다.
마우스 혈청의 스크리닝.
면역화된 마우스로부터의 혈청을 NKG2D 특이성에 대하여 유세포 분석법에 의해 스크리닝하고, 선택된 혈청을 또한 실시예 3에 기재된 바와 같이 MICA 리간드의 결합을 중화시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. NKG2D와 특이적으로 결합하고 MICA 결합을 중화시킨 항체를 높은 역가로 생성한 마우스를 하이브리도마 생산을 위해 선택하였다.
하이브리도마의 생성.
각각의 선택된 면역화된 마우스로부터의 비장을 균질화하고, X61 Ag8653 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)로의 융합을 위해 비장세포의 단일 세포 현탁액을 사용하였다. 앞서 기재된 바와 같은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 1500을 사용하여 융합을 수행하였고 (문헌[Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]), 및 더 싸이토 펄스 CEEF-50 일렉트로퓨전 시스템(The Cyto Pulse™ CEEF-50 Electrofusion System) (Cyto Pulse Sciences, Inc.)을 사용하여 전기융합을 수행하였다.
융합된 세포를, 10% FBS 및 5% 기원(origin) (하이브리도마 클로닝 인자, BioVeris)으로 보충된 선택적 DMEM HAT 배지 중에서 96 웰 조직 배양 플레이트에 초기에 시딩하였다. 상청액을 수거하고 스크리닝하기 전에, 플레이트를, 5% FBS 및 0.7% 기원이 보충된 DMEM HT 배지로 각각 1 회 내지 2 회 배지 교환하면서 10 내지 14 일 동안 인큐베이션하였다. 양성으로 시험된 클론을 증대시키고, 안정한 클론이 생성될 때까지 제한 희석에 의해 서브클로닝하였다. 선택된 클론을, FACS 분석에 의해 항-NKG2D 특이적 항체의 존재에 대해서뿐만 아니라 MICA 결합을 중화시키는 그의 능력에 대해서도 연속적으로 스크리닝하였다.
하이브리도마 상청액의 스크리닝.
항-NKG2D 특이적 항체의 존재에 대해 시험하기 위해 직접 ELISA 또는 유세포 분석법 (FACS)을 이용하여 제1 시리즈의 면역화로부터의 하이브리도마 상청액의 1차 스크리닝을 수행하였다. 간략하게 말하면, 맥시소프(maxisorp) 플레이트를 4℃에서 PBS 중에서 50 μl의 0.4 ㎍/ml mFc-NKG2D (뮤린 Fc에 융합되고 CHO 세포에서 발현되는 NKG2D의 세포외 부분을 포함함)로 하룻밤 코팅하고, 이어서 실온에서 15 분 동안 PBS, 0.05% 트윈 20으로 차단함으로써 ELISA를 수행하였다. 후속적으로, 플레이트를 50 μl 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션하고, Fcγ 단편 특이적인 염소-항-인간 IgG-HRP (Jackson, 109-036-098)을 사용하여 NKG2D 특이적 항체를 검출하였다. 이러한 인큐베이션을 실온에서 1 시간 동안 수행하였고, 각각의 단계 사이에 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈 20으로 세척하였다. 결합된 항체를 100 μl TMB 기질(Kem-En-Tec)을 사용하여 시각화하고, 4M H3PO4로 정지시켰다. 플레이트를 450 및 620 nm에서 판독하였다. FACS의 경우, 10 μl 중의 50,000개의 세포를 90 μl의 하이브리도마 상청액과 함께 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 2% FCS를 지닌 PBS로 세척함으로써 NKG2D 발현 BaF/3 세포 및 NKG2D를 발현하지 않는 대조 BaF/3 세포로의 결합을 분석하고, 후속적으로 Fcγ 단편 특이적인 2차 염소-항-인간 IgG-HRP (Jackson, 109-036-098)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 B&D FACSArray (BD Biosciences) 상에서 분석하였다. NKG2D 발현 BaF/3 세포만을 염색하고 대조 세포를 염색하지 않는 항체를 NKG2D 특이적인 것으로 간주하였다.
제2 시리즈의 면역화에 대한 1차 스크린은 항-NKG2D 특이적 항체의 존재에 대해 시험하기 위한 직접 ELISA 이었다. 간략하게 말하면, 맥시소프 플레이트를 4℃에서 PBS 중에서 1 내지 2 mg/ml의 hFc-NKG2D (R&D Systems)로 하룻밤 코팅한 후, 실온에서 30 내지 60 분 동안 PBS, 0.05% 트윈 20, 5% 닭 혈청으로 차단함으로써 ELISA를 수행하였다. 후속적으로, 플레이트를 50 μl 하이브리도마 상청액 및 50 μl 차단 완충제와 함께 인큐베이션하고, 차단 완충제 중의 항-인간 IgG-HRP (Bethyl, A80-115P)를 사용하여 NKG2D 특이적 항체를 검출하였다. 이러한 인큐베이션을 실온에서 1 시간 동안 수행하였고, 각각의 단계 사이에 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈 20으로 세척하였다. ABTS 기질 (Moss Inc, 제품: ABTS-1000)을 사용하여 결합된 항체를 가시화하였다. 플레이트를 몰레큘러 디바이시즈 소프트웨어(Molecular Devices Software)로 415 nm 에서 판독하였다.
ELISA 1차 스크린으로부터 선택된 하이브리도마를, 상기에 기재된 바와 같이, FACS를 이용하여 2차 스크리닝하였다. 구매 가능한 뮤린 항체 (149810 및 ON72)를 대조군으로서 사용하였다.
결과
면역화된 마우스로부터의 고도로 선별적인 혈청은 NKG2D 결합 및 리간드 차단 능력에 의해 확인하였고 (도 1a 및 도 1b에 도시된 예시적인 결과), 선택된 마우스를 융합 및 하이브리도마 생성에 사용하였다. 약 2,500 개의 하이브리도마를 ELISA 및 유세포 분석법에 의해 스크리닝하고, NKG2D 특이적 클론을 확인하였다. 도 2는 상업적 항체 (149810)와 비교하여 하이브리도마 상청액 중의 인간 항체가 NKG2D 발현 세포에 결합하지만 NKG2D 음성 세포에는 결합하지 않았음을 보여준다. 제1 시리즈의 면역화로부터의 3개의 하이브리도마로부터의 항체 (16F16, 16F31 및 21F2), 및 제2 시리즈의 면역화로부터의 몇몇 항체 (MS를 포함함)를 재조합 생산 및 추가의 시험을 위해 선택하였다.
실시예 2: 재조합 생산 및 시퀀싱
인간 항체를 발현하는 융합체 마우스 비장으로부터의 수백 개의 하이브리도마의 제2 배치(batch)를 별개의 라운드의 면역화(들)로부터 얻었다. 이들을 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방식으로 FACS를 이용하여 NKG2D 특이성에 대해 스크리닝하였다. 재조합 생산 및 추가의 시험을 위하여, 하나의 하이브리도마 MS로부터의 항체를 선택하였다.
하이브리도마로부터의 mRNA의 PCR 및 단리된 생성물의 후속 시퀀싱에 의해 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 확인하였다.
재료 및 방법
RNA 정제.
절차에서 β-메르캅토에탄올을 생략한 것을 제외하고는, 제조업자의 지시에 따라 Qiagen로부터 RNeasy를 사용하여 전체 RNA를 정제하였다. RNA의 품질을 광 분광법 (260/280 nm, 1.8<비<2.0)에 의해 점검하고, 때때로 생물분석기를 사용하여 RNA 분해를 평가하였다.
RT-PCR.
전장 cDNA를 SMART-RACE (Clonetech로부터의 키트)에 의해 합성하였다.
PCR.
PCR을 Clonetech로부터의 HFII 중합효소로 수행하였다. 보존된 서열에 어닐링하는 5' 프라이머 (EcoRI를 가짐)를 SMART-RACE 동안 도입시켰다. 각각 IgG (VH) 및 카파 사슬 (VL)의 보존된 영역에 어닐링하는 2개의 3' 프라이머를 설계하였다. 제한 부위는 또한 3' 프라이머 (BsiWI (VL) 및 NheI (VH))에 존재하였다. (PCR 도입된 돌연변이를 점검하기 위해) 모든 VH 및 VL 증폭에 대해 PCR을 2중으로 수행하였다. PCR 반응이 실패한 경우, Novagen으로부터의 축퇴(degenerate) 5' 프라이머 믹스를 사용하여 VL 및 VH를 증폭시켰다.
PCR 생성물 정제.
PCR 생성물 (약 550 bp)을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 잘라내고, GFX 컬럼 (Amersham의 제품) 상에서 정제하고, DNAse가 없는 물로 용리하였다.
라이게이션
PCR 생성물 및 발현 벡터 (암피실린 내성)를 적절한 제한 효소 (VH, EcoRI + NheI 및 VL, EcoRI + BsiWI)로 절단하였다. 아이소타입 지시(isotype-dictating) 벡터 (NKG2D의 경우 IgG4) 내로의 가변 도메인의 라이게이션을 T4 리가제 (Roche)에 의해 촉매하였다. 사용된 플라스미드는 pTT5 이었다 (문헌[Durocher et al., Nucleic Acids Res 2002; 30 (2):e9; Pham et al., Biotechnol Bioeng 2003; 84 (3):332-42]).
발현 벡터 내의 삽입물의 점검 (콜로니 PCR).
컴피턴트(competent) 대장균 (Top10)을 라이게이션 믹스로 형질전환시키고, 암피실린 내성 클론을 하룻밤 선택하였다. VH 및 VL 둘 모두에 대해 총 8개의 양성 콜로니를 골라내었다. 콜로니 PCR 및 겔 전기영동 (1% 아가로스)을 통해, 예상된 크기와 일치하는 삽입물에 대하여 모든 콜로니를 점검하였다.
시퀀싱/미니프렙.
모든 양성 콜로니 PCR로부터의 분취물을 시퀀싱 (ExoSAPit를 사용함)을 위해 준비하였다. 총 32개의 PCR 생성물을 각각의 클론에 대하여 시퀀싱하였다((8*VH + 8*VL)*2 (이중 PCR)). (벡터NTI를 사용하여) 서열을 분석하고 클로닝된 VH 및 VL에 상응하는 양성 세균 클론을 업스케일링하고 (미니/맥시프렙), HEK293/6E 형질감염 (GFX 컬럼)에 대하여 DNA를 정제하였다. 하나를 초과하는 VH 및 VL 서열이 확인된 경우, 모든 가능한 VL 및 VH 조합을 HEK293/6E 세포에서 발현시켰다.
재조합 생산.
중쇄 및 경쇄의 확인된 가변 영역을 각각 중쇄 및 경쇄 인간 IgG4 프레임워크 내로 삽입하고, HEK293 세포에서 2개의 벡터로부터 높은 수준으로 발현시켰다. 항체를 단백질 A 컬럼 상에서 정제하였다.
HEK293/6E 세포에서의 항체 발현.
HEK293 세포를 Gibco로부터의 Freestyle293 배지에서 계대하였다. 형질감염 당일에, 세포를 1 백만개 세포/ml의 농도로 희석하였다. 30 ml 형질감염의 경우, 15 ㎍의 중쇄 벡터 및 15 ㎍의 경쇄 벡터를 2 ml Opti-MEM 및 40 μl 293fectin과 혼합하였다 (이어서, Freestyle293 배지로 30 ml의 총 부피가 되게 함). 6 일의 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리 (1000 rpm, 10 분)에 의해 펠렛화하고, 단백질 A 정제를 위해 상청액을 수거하였다.
정제.
인간 항체의 재조합적으로 발현된 IgG4 변이체를 MabSelect™ SuRe 단백질-A 컬럼 상에서 정제하였다. 항체의 컬럼 적용 후에, 컬럼을 10 컬럼 부피의 PBS 완충제로 세척하고, 항체를 100 mM 글리신, 100 mM NaCl 완충제, pH 3.0으로 용리시킨 후, HighTrap™ 탈염 컬럼을 사용하여 PBS 완충제로의 완충제 교환을 수행하였다. 모든 작업을 GE Healthcare Amersham Biosciences AB로부터의
Figure pct00006
시스템에 의해 제어하였다. 정제된 항체의 전형적인 농도 범위는 10 내지 130 mg/l (0.3 내지 3.3 mg/30 ml) 이었다.
결과
16F16 (IgG4) H 쇄, 16F16 L 쇄, 16F31 (IgG4) H 쇄, 및 16F31 L 쇄를 인코딩하는 cDNA 서열은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,879,985호에 개시되어 있고, 16F16 (IgG4), 16F31 (IgG4), MS (IgG4) 및 21F2 (IgG4)의 전장, 가변, 및 CDR 아미노산 서열의 각각의 서열 식별번호는 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,879,985호에 개시되어 있다.
이들 절차를 이용하여 생성되었고 본 명세서에 기재된 임상 프로토콜에 사용될 예시적인 항-NKG2D 항체는 하기에 제시된 서열을 갖는 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다:
항-NKG2D VH (서열 번호 1)
Figure pct00007
항-NKG2D VL (서열 번호 2)
Figure pct00008
이들 절차를 이용하여 생성되었고 본 명세서에 기재된 임상 프로토콜에 사용될 예시적인 항-NKG2D 항체는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5 의 중쇄 CDR 아미노산 서열 및 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 3
SYYWS
서열 번호 4
HISYSGSANYNPSLKS
서열 번호 5
WDDAFNI
서열 번호 6
RASQSVSSSYLA
서열 번호 7
GASSRAT
서열 번호 8
QQYGSSPWT
실시예 3: 중등도 내지 중증 활동성 크론병의 치료를 위한 항-NKG2D 항체
서론
주요 시험의 이러한 임상적 증명은 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 참여자에서의 항-NKG2D 항체의 안전성 및 효능에 관한 정보를 제공할 것이다.
연구에 사용될 항-NKG2D의 특징
각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 제시된 VH 및 VL 영역을 포함하는, 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 수용체에 특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린 G4 아이소타입 단클론성 항체가 이들 연구에 사용될 것이다. 이 항체는 NKG2D 리간드 결합을 차단함으로써, 그렇지 않으면 세포 증식 및 전염증성 사이토카인 및 세포독성 매개체의 방출을 가져오는 하류 신호전달 사건을 방지한다. 크론병에 걸린 환자로부터의 여러 증거는 NKG2D 수용체 활성화가 국부 사이토카인의 생성, 면역 반응의 활성화, 및 표적 장 세포의 직접적인 세포독성을 매개함으로써 질병 발병에서 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다. 총괄적으로, 표적 조직에서의 NKG2D 리간드 또는 전염증성 사이토카인의 발현에 대한 전임상 및 임상 데이터, 및 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에서의 NKG2D 수용체의 비정상적인 발현 및 활성화는 NKG2D 수용체의 억제제의 임상 개발을 위한 근거를 제공한다.
임상 연구
2015년 11월 11일 현재, 총 105 명의 대상체를 3 회의 임상 연구에서 항-NKG2D 항체에 노출시켰다: 65 명의 대상체는 2 가지 류마티스성 관절염(RA) 연구 중이었고, 40 명의 대상체는 크론병의 제2a상 연구 중이었다.
류마티스 관절염
항-NKG2D 항체를 사용한 2 가지 연구를 활동성 RA에 걸린 대상체에서 수행하였다. 단일 용량 (0.0002 내지 7.5 mg/㎏) 및 다중 용량 (0.02 내지 4 mg/㎏) 파트를 포함하는 최초 인간 대상(first-in-humans, FIH) 제1상 단일 상승 용량/다중 상승 용량 연구에서, 13 가지 용량 수준을 항-NKG2D 항체에 노출된 24 명의 대상체에서 평가하였다. 항-NKG2D 항체의 피하 투여는 조사된 용량 범위에서 잘 용인되었고, 안전성 신호는 단일 또는 다중 용량 요법 중 어느 것과도 관련이 없었다. 제2a상 무작위 배정, 단일 용량, 이중 맹검, 위약 대조, 병렬 그룹 연구에서, 메토트렉세이트(MTX)로 동시에 처리한 활동성 RA에 걸린 대상체에서 임상 효능을 평가하였다. 항-NKG2D 항체에 노출된 41 명의 대상체에서 4 mg/㎏의 항-NKG2D 항체의 단일 SC 주사는 위약과 비교하여 처리 후 6 주째, 12 주째, 또는 24 주째에 질병 활성의 통계적으로 유의한 감소를 가져오지 않았다. 항-NKG2D 항체는 잘 용인되었고, 연구 동안 안전성 우려는 발생하지 않았다.
크론병
통상적인 치료법 (코르티코스테로이드 또는 면역조절제)이 실패했거나 그에 불내성이거나 1 가지의 TNFα 길항제 치료법에 불내성 또는 불응성인 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 대상체에서의 제2a상 다기관, 무작위 배정, 이중 맹검, 위약 대조, 병렬 그룹, 단일 용량 연구에서, 크론병 활동성 지수(CDAI) 점수가 220 이상이지만 450 이하이고, 10 mg/dL 이상의 C 반응성 단백질(CRP)에 의해 또는 내시경법 (스크리닝 동안 수행되고 맹검용 중앙 이미징 판독기에 의해 판독되는 활동성 궤양의 내시경 검증)에 의해 확인된 염증이 있는 대상체만을 연구에 포함시켰다. 이 연구는 북미, 유럽, 및 이스라엘의 32 곳의 조사 현장에서 78 명의 대상체를 등록하고 무작위 배정하였다. 모든 대상체는 위약 SC (n=38) 또는 2 mg/㎏의 항-NKG2D 항체 SC (n=40)를 투여받도록 0 주째에 1:1 비로 무작위로 할당하였다. 78 명의 무작위 배정된 대상체 중에서, 평균 기준선 CDAI 점수는 330.5였고, 29.5%는 최대 1 가지의 TNFα 길항제 치료법에 대해 불내성이거나 불응성이었다 (문헌[Matthiew A et al. 2016 Gut 0:1-8. doi:10.1136]).
대상체를 4 주째에 기준선 CDAI 점수로부터의 변화의 1차 종점에 대해 평가하였다. 안전성 및 효능 평가를 24 주까지 수행하였다. 위약 그룹과 비교하여 4 주째에 항-NKG2D 항체 그룹에서 관찰된 16 점 큰 CDAI 의 감소는 유의하지 않았다 (p=0.403). 그러나, 0.10의 미리 정해진 유의성 수준에 기초하여, CDAI 점수의 감소는 12 주째에 위약 그룹과 비교하여 항-NKG2D 항체 그룹에서 유의하게 높았다 (위약과 비교하여 항-NKG2D 항체에서 55 점 큰 CDAI 의 감소가 관찰되었음, p=0.056). 0.10의 동일한 미리 정해진 유의성 수준에 기초하여, CDAI 점수의 감소는, 12 주째까지 모든 기준선후 방문에서 위약과 비교하여 항-NKG2D 항체 그룹 내의 "생물제제에 대한 사전 실패가 없는" 미리 정해진 하위 그룹 (연구 집단의 71%)에서 유의하게 높았다 (1 주, p=0.068; 2 주, p=0.048; 4 주, p=0.095; 8 주, p=0.015, 12 주, p=0.025).
이 연구의 일부로서, 대상체의 NKG2D 수용체 및 NKG2D 리간드에 대한 유전자에서의 유전적 다형성을 평가하였다. 효능 데이터의 사후 분석은 NKG2D 수용체 및/또는 MICB 리간드 (SNP 양성 코호트)에 특이적 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 갖는 대상체의 하위 그룹에서 더 큰 효능을 보여주었다. SNP 양성 상태와 더 높은 임상 효능 사이의 연관성은 이 제2b상 연구에서 전향적으로 시험될 것이다.
연구 참여의 평균 지속기간은 2개의 처리 그룹 사이에서 동등하였다. 특별한 관심 대상의 사망 또는 의학적 사건은 보고되지 않았다. 24 주까지, 1개 이상의 유해 사건(AE)을 갖는 대상체의 비율은 항-NKG2D 항체 및 위약 그룹에서 유사하였다. 위장(gastrointestinal) 사건은 둘 모두의 그룹에서 가장 일반적으로 보고된 AE였다 (항-NKG2D 항체 및 위약 그룹 내의 각각 17 명 및 14 명의 대상체). 심각한 AE(SAE)는 일반적이지 않았으며, 각각 1 회의 SAE로 무작위 배정된 대상체 78 명 중 7 명 (9%)에서 보고되었다: 항-NKG2D 항체 그룹의 5 명 (크론병 4 명, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 감염증 1 명)과 비교하여 위약 그룹의 2 명 (크론병 1 명, 신결석증 1 명). 모든 SAE는 연구 작용제에 의한 처리와 관련될 가능성이 없는 것으로 평가되었다.
총괄적으로, 이들 데이터는 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 대상체에서의 항-NKG2D 항체의 추가의 발생을 뒷받침한다.
이 프로토콜은, 이전에 실패했거나 1 가지 이상의 승인된 생물학적 작용제에 불내성 (Bio-IR)이거나, 코르티코스테로이드 또는 면역조절제에 대해 부적절한 반응을 보였거나 이를 용인해내지 못했던 (Bio-NF), 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 대상체에서 항-NKG2D 항체의 안전성 및 효능을 평가하도록 설계된 3개의 별개의 무작위 배정, 이중 맹검, 위약 대조, 병렬 그룹, 다기관 연구로 구성된다. 프로토콜은 두 파트로 나누어진다.
파트 I 에서는, 하기 2 가지 연구가 수행될 것이다:
Figure pct00009
연구 1: 생물제제 불내성 또는 불응성 (Bio-IR)인 대상체에서의 연구;
Figure pct00010
연구 2: 이전에 생물제제 치료법이 실패하지 않았던 (생물제제 비실패(Biologic nonfailure)[Bio-NF]) 대상체에서의 연구.
파트 II 에서는, 하기 연구가 수행될 것이다:
Figure pct00011
연구 3: 생물제제 불내성 또는 불응성 (Bio-IR)인 대상체에서의 용량 범위 연구
파트 I 에서의 2 가지 연구는 Bio-IR (생물제제 불내성 또는 불응성) 및 Bio-NF (이전에 생물제제 치료법이 실패하지 않았던 대상체) 대상체 둘 모두의 전용 집단을 채용함으로써 본래의 제2a상 연구 결과를 확고히 하는 역할을 한다. 허용 가능한 효능이 파트 I 에서의 Bio-IR 집단에서 확립되는 경우, 생물제제 불내성 또는 불응성인 대상체에서의 용량 범위 연구로 이루어진 프로토콜의 제3 연구가 개시될 것이다 (파트 II).
목적 및 종점
목적 및 종점
목적
목적은 3 가지 연구 각각에서 동일하다.
1차 목적
Figure pct00012
기준선으로부터 CDAI 점수를 감소시키는 항-NKG2D 항체의 효능을 평가하기 위한 것.
Figure pct00013
항-NKG2D 항체의 안전성을 평가하기 위한 것.
2차 목적
Figure pct00014
점막의 임상 관해, 임상 반응, 및 내시경 치유를 유도하고, 관해를 유지하는 항-NKG2D 항체의 효능을 평가하기 위한 것.
Figure pct00015
효능과 NKG2D 및/또는 MICB SNP 바이오마커의 존재 사이의 관계를 평가하기 위한 것.
Figure pct00016
전반적 및 질병 특이적 건강 관련 삶의 질을 개선하고 크론병 관련 입원 및 수술을 감소시키는 항-NKG2D 항체의 효능을 평가하기 위한 것.
Figure pct00017
항-NKG2D 항체 치료법의 약동학, 면역원성, 약력학, 및 바이오마커 (예를 들어, CRP, 대변 칼프로텍틴, 및 대변 락토페린의 감소)를 평가하기 위한 것.
종점
3 가지 연구 각각에 대한 1차 종점은 다음과 같다: 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화.
하기 종점은 연구 3 (연구의 용량 범위 부분)에서만 주요 2차 종점으로서 평가될 것이며; 이들 종점은 연구 1 및 연구 2 에서 평가될 것이지만, 주요 2차 종점으로 명시되지 않는다.
Figure pct00018
CDAI 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 관해 (150 미만의 CDAI).
Figure pct00019
CDAI 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 반응 (CDAI 의 기준선으로부터의 100 점 이상의 감소 또는 150 미만의 CDAI).
Figure pct00020
8 주째의 기준선으로부터의 PRO-2 (CDAI 점수 중 복부 통증과 배변 빈도 하위점수의 합)의 변화.
Figure pct00021
PRO-2 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 관해 (75 미만의 PRO-2).
Figure pct00022
PRO-2 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 반응 (PRO-2 의 기준선으로부터의 50 점 이상의 감소 또는 75 미만의 PRO-2).
Figure pct00023
12 주째의 기준선으로부터의 크론병에 대한 단순 내시경 점수(SES-CD)의 변화.
하기의 효능 종점이 3 가지 연구 각각에서 평가될 것이다:
Figure pct00024
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 CDAI 의 변화.
Figure pct00025
모든 기준선후 방문에서 CDAI 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00026
모든 기준선후 방문에서 CDAI 에 기초한 임상 반응.
Figure pct00027
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 PRO-2 의 변화.
Figure pct00028
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 복부 통증 점수 (CDAI 평가에 기초한 평균 일일 평균치)의 변화.
Figure pct00029
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 배변 빈도 점수 (CDAI 평가에 기초한 평균 일일 평균치)의 변화.
모든 기준선후 방문에서 PRO-2 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00031
모든 기준선후 방문에서 PRO-2 에 기초한 임상 반응.
Figure pct00032
모든 기준선후 방문에서의 기준선으로부터의 PRO-3 (CDAI 점수 중 복부 통증, 배변 빈도, 및 전반적 행복감 하위점수의 합)의 변화.
Figure pct00033
8 주째의 임상 반응의 대상체들 중 24 주째의 CDAI 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00034
8 주째의 임상 관해의 대상체들 중 24 주째의 CDAI 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00035
12 주째 및 24 주째의 기준선으로부터의 SES-CD 점수의 변화.
Figure pct00036
기준선으로부터의 SES-CD 점수의 3 이상의 감소에 기초한 12 주째 및 24 주째의 내시경 개선.
Figure pct00037
12 주째 및 24 주째의 SES-CD의 기준선으로부터의 적어도 50% 개선.
Figure pct00038
12 주째 및 24 주째의 내시경 치유 (점막 궤양의 부재로 정의됨).
Figure pct00039
배출 누공 개수의 기준선으로부터의 50% 이상의 감소로 정의되는, 모든 기준선후 방문에서의 누공 반응.
Figure pct00040
브리스톨 대변 형태 척도(Bristol stool form scale) (통계 분석 계획(Statistical Analysis Plan)[SAP]에서 상세히 설명됨)를 기초로 한 종점(들)
Figure pct00041
0 내지 10의 수치 등급 척도(Numerical Rating Scale, NRS)에 기초한 모든 기준선후 방문에서의 기준선으로부터의 복부 통증의 변화.
Figure pct00042
8 주째, 12 주째 및 24 주째의 기준선으로부터의 염증성 장 질환 질문지(IBDQ) 점수의 변화.
Figure pct00043
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 IBDQ (170 이상)에 기초한 임상 관해.
Figure pct00044
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 기준선으로부터의 IBDQ의 16 점 이상의 개선.
Figure pct00045
8 주째, 12 주째 및 24 주째에서의 36개 항목의 단축형 건강 설문(Short Form Health Survey) (SF-36)의 신체 요소 요약(Physical Component Summary, PCS) 및 정신 요소 요약(Mental Component Summary, MCS) 점수의 기준선으로부터의 변화.
Figure pct00046
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 SF-36의 PCS 또는 MCS 점수의 5 점 이상의 개선.
Figure pct00047
8 주째, 12 주째 및 24 주째의 기준선으로부터의 바이오마커 (CRP, 배변 칼프로텍틴, 배변 락토페린)의 변화.
Figure pct00048
SNP 상태에 의한 8 주째의 CDAI 에 기초한 임상 관해. 2개의 SNP (NKG2D 또는 MICB) 중 적어도 1개에서 양성인 대상체는 SNP 양성인 것으로 간주될 것이다.
다른 효능 종점이 SNP 상태에 의해 조사될 수 있다 (SAP에서 상세히 설명됨).
종점과 관련된 평가를 위한 섹션 0의 연구 평가(Study Evaluations)를 참조한다.
실시예 4: 연구 설계 및 근거
연구 설계의 개요
이 프로토콜은 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 대상체에서 항-NKG2D 항체의 안전성 및 효능을 평가하도록 설계된 2개의 파트로 수행되는 3 가지 별개의 연구로 구성된다 (도 1).
파트 I 에서는, 하기 2 가지 연구가 수행될 것이다:
Figure pct00049
연구 1: 생물제제 불내성 또는 불응성 (Bio-IR)인 대상체에서의 연구;
Figure pct00050
연구 2: 이전에 생물제제 치료법이 실패하지 않았던 (생물제제 비실패(Biologic nonfailure)[Bio-NF]) 대상체에서의 연구.
파트 II 에서는, 하기 연구가 수행될 것이다:
Figure pct00051
연구 3: 생물제제 불내성 또는 불응성 (Bio-IR)인 대상체에서의 용량 범위 연구
파트 I 에서의 2 가지 연구는 Bio-IR (생물제제 불내성 또는 불응성) 및 Bio-NF (이전에 생물제제 치료법이 실패하지 않았던 대상체) 대상체 둘 모두의 전용 집단을 채용함으로써 본래의 제2a상 연구 결과를 확고히 하는 역할을 한다. 허용 가능한 효능이 Bio-IR 집단에서 확립되는 경우, 생물제제 불내성 또는 불응성인 대상체에서의 용량 범위 연구로 이루어진 프로토콜의 제3 연구가 개시될 것이다 (파트 II) (도 1 참조)
실시예 5: 참여자
각각의 연구에 대한 표적 집단은 0 주째에 220 이상이지만 450 이하인 CDAI 로 정의되며, 스크리닝 시에 0.3 mg/dL 초과 (3.0 mg/L 초과)의 상승된 CRP 및/또는 250 mg/㎏ 초과의 상승된 칼프로텍틴을 갖는, 중등도 내지 중증 활동성 크론병 (적어도 3 개월의 지속 기간)에 걸린 18 세 이상의 남성 또는 여성으로 이루어진다. 대상체는 방사선촬영, 조직학, 및/또는 내시경에 의해 과거 임의의 시간에 이미 확인된 대장염, 회장염, 또는 회결장염을 가져야 한다.
추가적으로, 이들 연구에서 대상체는 이전에 1 가지 이상의 승인된 생물학적 작용제가 이전에 실패했거나 그에 불내성이거나 (즉, TNFα-길항제 또는 베돌리주맙, 이하, 생물제제 불내성 또는 불응성 대상체로 지칭됨), 또는 코르티코스테로이드 또는 면역조절제 (즉, 6-메르캅토푸린 [6-MP], 아자티오프린[AZA], 및 MTX)에 대해 부적절한 반응을 보이거나 이를 용인해내지 못했지만 생물제제에 대해서는 그러하지 않았다 (이하, 생물제제 비실패 대상체로 지칭됨). 이들 두 집단은 하기에 기재되어 있다:
Figure pct00052
생물제제 불내성 또는 불응성 (Bio- IR ) 대상체 (연구 1 및 연구 3)는, 인플릭시맙 (또는 인플릭시맙에 대한 바이오시밀러), 아달리무맙 (또는 아달리무맙에 대한 바이오시밀러), 세르톨리주맙 페골, 또는 베돌리주맙을 크론병의 치료를 위해 승인된 용량으로 투여받고, 초기에 반응하지 않았거나, 초기에 반응하였지만 이어서 반응을 상실하였거나, 투약에 불내성이었던 대상체로 정의된다. Bio-IR 대상체는 사전 TNFα 길항제 사용을 위한 8 주 이상의 세척 및 사전 베돌리주맙 사용을 위한 16 주의 세척 기간을 허용해야 한다.
Figure pct00053
생물제제 비실패 (Bio- NF ) 대상체 (연구 2)는 코르티코스테로이드 또는 면역조절제인 6-MP, AZA, 또는 MTX에 대해 부적절한 반응을 보였거나 이를 용인해내지 못했던 대상체로 정의된다. 코르티코스테로이드 의존성 (즉, 크론병의 증상의 복귀 없이 코르티코스테로이드를 성공적으로 감소시킬 수 없음)을 보였던 대상체가 또한 적격이다. Bio-NF 대상체는, 효능의 결여 또는 불내성 이외의 이유로 약물이 중단되는 (예를 들어, 약물 휴일) 경우에만 생물제제 치료법을 또한 받았었을 수 있다.
대략 450 명의 대상체가 3 가지 연구 전반에 걸쳐 등록될 것으로 예상된다:
Figure pct00054
파트 I 은 위약과 비교하여 항-NKG2D 항체의 고용량 요법의 안전성 및 효능을 연구할 것이고, 대략 200 명의 대상체 (100 명의 Bio-IR 및 100 명의 Bio-NF)를 등록할 것이다.
Figure pct00055
파트 II 는 위약과 비교하여 항-NKG2D 항체의 다중 용량 요법의 안전성 및 효능을 연구할 것이고, 이때 우스테키누맙 (STELARA®)을 기준 아암(arm)으로 한다. 파트 II 는 대략 250 명의 추가 대상체를 등록할 것이며; 파트 II 에 등록한 모든 대상체는 Bio-IR 대상체일 것이다.
파트 I 및 파트 II 의 개략도가 각각 도 2 및 도 3에 나타나 있다.
연구의 두 파트 모두에 걸쳐, 효능, PK, PD, 면역원성, 바이오마커, 및 안전성이 적절한 시간 및 이벤트 스케줄에 지시된 시점에서 평가될 것이다.
약물유전체학적 분석을 위한 혈액 샘플은 프로토콜의 이러한 요소에 개별적으로 동의한 대상체로부터 수집될 것이다 (현지 규정이 허용하는 경우). 약물유전체학적 연구에서의 대상체 참여는 선택적이다.
3 가지 연구 각각을 개별적으로 분석할 것이다. 각각의 연구에 대한 1차 종점은 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화이다.
외부의 데이터 모니터링 커미티(Data Monitoring Committee, DMC)가 대상체 안전성을 모니터링하기 위해 3 가지 연구로부터의 비맹검화된 안전성 데이터를 주기적으로 검토할 것이다. DMC는 관련 치료 영역의 적어도 1 명의 의료 전문가 및 적어도 1 명의 통계 전문가로 이루어질 것이다. DMC의 책임, 권한, 및 절차는 그 헌장에 기록되어 있을 것이다.
실시예 6: 파트 I
파트 I 에서, 기준선 CDAI 점수 (300 이하 또는 300 초과) 및 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)에 의해 계층화된 순열화 블록 무작위 배정을 사용하여 1:1 비로 위약 또는 항-NKG2D 항체 고용량을 투여받도록 100 명의 Bio-IR 대상체 및 100 명의 Bio-NF 대상체가 무작위 할당될 것이다. Bio-IR 및 Bio-NF 집단에 대하여 별개의 무작위 배정이 사용될 것이다. 각각의 집단에서 충분한 수의 SNP 양성 대상체를 갖도록 하기 위하여, 연구 1 또는 연구 2 에서 SNP 양성 대상체의 비율이 75% 미만인 경우 (유병률을 가정함), 그룹당 50 명 초과의 대상체가 무작위 배정될 수 있다.
파트 I 에서 각각의 연구에 대한 처리 그룹은 다음과 같을 것이다:
Figure pct00056
위약 0 주째, 2 주째, 4 주째, 6 주째, 8 주째, 및 10 주째의 위약 SC; 12 주로부터, 이들 대상체는 다음과 같은 추가의 용량을 투여받을 것이다:
- 12 주째에 임상 반응이 있는 (CDAI 의 기준선으로부터의 100 점 이상의 감소 또는 150 미만의 CDAI) 위약 처리된 대상체는 12 주에서 22 주까지 위약 SC 주사 q2w를 계속 투여받을 것이다.
- 12 주째에 임상 반응이 없는 위약 처리된 대상체는 12 주째에 항-NKG2D 항체 400 mg SC를 투여받고, 이어서 14 주 내지 22 주까지 항-NKG2D 항체 200 mg SC q2w를 투여받을 것이다.
Figure pct00057
0 주째의 항-NKG2D 항체 400 mg SC, 이어서 22 주까지 200 mg SC q2w.
연구 1 에서 무작위 배정된 Bio-IR 대상체의 최초 80% (처리 그룹당 적어도 40 명의 Bio-IR 대상체 및 적어도 30 명의 Bio-IR/SNP 양성 대상체)가 8 주째 방문을 완료했거나 8 주째 전에 연구 참여를 종료하였을 때, 파트 I 에서 중간 분석이 계획된다.
중간 분석은 파트 II 의 조기 시작을 허용할 수 있다. 파트 I Bio-IR 대상체의 등록은, 파트 II 가 조기에 시작되었는지 여부에 관계없이 100 명의 Bio-IR 대상체가 등록할 때까지 계속될 것이다. 중간 분석에 기초하여 파트 II 를 시작하기로 결정된 경우, 파트 I 에서의 Bio-NF 대상체의 등록은 100 명의 Bio-NF 대상체가 등록할 때까지 계속될 것이다. 파트 II 가 중간 분석에 기초하여 개시되지 않은 경우, 모든 Bio-IR 대상체가 12 주째 방문을 완료 (또는 12 주째 이전에 연구 참여를 종료) 했을 때 파트 II 로 이동할지 여부를 결정하기 위해 데이터가 분석될 것이다.
실시예 7: 파트 II
파트 II 에서, 기준선 CDAI 점수 (300 이하 또는 300 초과) 및 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)에 의해 계층화된 순열화 블록 무작위 배정을 사용하여 1:1:1:1:1의 비로 위약 또는 항-NKG2D 항체의 3 가지 용량 수준 중 하나 또는 우스테키누맙을 투여받도록 250 명의 추가의 Bio-IR 대상체가 무작위 할당될 것이다. 충분한 수의 SNP 양성 대상체를 갖도록 하기 위하여, 연구 3 에서 SNP 양성 대상체의 비율이 75% 미만인 경우 (유병률을 가정함), 그룹당 50 명 초과의 대상체가 무작위 배정될 수 있다.
파트 II 에서 처리 그룹은 다음과 같을 것이다:
Figure pct00058
위약 0 주째, 2 주째, 4 주째, 및 8 주째의 위약 SC; 12 주로부터, 이들 대상체는 다음과 같은 추가의 용량을 투여받을 것이다:
- 12 주째에 임상 반응이 있는 (CDAI 의 기준선으로부터의 100 점 이상의 감소 또는 150 미만의 CDAI) 위약 처리된 대상체는 12 주째, 14 주째, 16 주째, 및 20 주째에 위약을 계속 투여받을 것이다.
- 12 주째에 임상 반응이 없는 위약 처리된 대상체는 12 주째에 항-NKG2D 항체 150 mg SC를 투여받고, 이어서 14 주째, 16 주째, 및 20 주째에 항-NKG2D 항체 75 mg SC를 투여받을 것이다.
Figure pct00059
고용량: 0 주째의 항-NKG2D 항체 400 mg SC 및 2 주째 및 4 주째의 200 mg SC, 이어서 20 주까지 4 주마다 (q4w) 200 mg SC.
Figure pct00060
중간 용량: 0 주째의 항-NKG2D 항체 150 mg SC 및 2 주째 및 4 주째의 75 mg SC, 이어서 20 주까지 75 mg SC q4w.
Figure pct00061
저용량: 0 주째의 항-NKG2D 항체 50 mg SC 및 2 주째 및 4 주째의 25 mg SC, 이어서 20 주까지 25 mg SC q4w.
Figure pct00062
0 주째의 우스테키누맙 (6 mg/㎏ IV에 근접하는 계층적 용량) (아래의 글머리 기호에 나타낸 바와 같음), 이어서 8 주째 및 16 주째의 90 mg SC.
- 우스테키누맙 260 mg (55 ㎏ 이하의 체중).
- 우스테키누맙 390 mg (55 ㎏ 초과 85 ㎏ 이하의 체중).
- 우스테키누맙 520 mg (85 ㎏ 초과의 체중);
도 2에 나타낸 바와 같이, 대상체는 또한, 필요에 따라, 파트 II 의 맹검을 유지하기 위해 위약 투여를 받을 것이다.
실시예 8: 중간 분석
연구 1 에서 무작위 배정된 Bio-IR 대상체의 최초 80% (처리 그룹당 적어도 40 명의 Bio-IR 대상체 및 적어도 30 명의 Bio-IR/SNP 양성 대상체)가 8 주째 방문을 완료했거나 8 주째 전에 연구 참여를 종료하였을 때, 파트 I 에서 중간 분석이 계획된다.
이러한 중간 분석은, 결과가 효과를 입증하기 위해 충분한 수의 대상체가 평가되었음을 시사하는 경우, 파트 II 의 조기 시작 (즉, 연구 3, 용량 범위 부분)을 허용할 것이다. 이러한 중간 분석은 연구 1 의 수행 또는 완료에 영향을 미치지 않기 때문에, 이는 관리적인 것으로 간주될 것이고 최종 연구 1 분석을 위한 다중도 조정을 필요로 하지 않을 것이다.
중간 데이터를 검토하고 미리 규정된 결정 규칙 (중간 분석 계획에서 규정됨)에 따라 권장 결정/행위를 수립하도록 연구 팀과 무관한 스폰서(sponsor) 위원회가 개설될 것이다.
연구 2 또는 연구 3 에 대해서는 중간 분석이 계획되지 않는다.
실시예 9: 연구 설계 근거
이 프로토콜은 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 대상체에서 항-NKG2D 항체의 안전성 및 효능을 평가하도록 설계된 2개의 파트로 수행되는 3 가지 별개의 연구로 구성된다. 연구 1 및 연구 2 는 프로토콜의 파트 I 을 구성한다. 이 파트에서, 중등도 내지 중증 활동성 크론병에 걸린 Bio-IR 및 Bio-NF 대상체에서의 항-NKG2D 항체의 단일 투여 요법의 안전성 및 효능을 평가한다. 허용 가능한 효능이 (Bio-IR 대상체에 대하여) 파트 I 에서 확립된 경우, 파트 II (Bio-IR 대상체에서의 용량 범위설정 연구)가 개시될 것이다.
연구 집단
3 가지 연구 각각에 대한 표적 집단은 220 이상 450 이하의 CDAI 로 정의되며, 0.3 mg/dL 초과 (3.0 mg/L 초과)의 상승된 CRP 및/또는 250 mg/㎏ 초과의 상승된 칼프로텍틴을 갖는, 고지에 의한 동의 시에 중등도 내지 중증 크론병 (적어도 3 개월의 지속 기간)에 걸린 18 세 이상인 남성 또는 여성으로 이루어진다.
반응하지 못하거나, 반응을 상실하거나, 또는 하나 이상의 생물제제 치료법에 대해 불내성인 대상체를 포함하는 Bio-IR 집단이 이 프로토콜에 대한 주요 관심 대상 집단인데, 이는 현재의 치료법과 관련하여 가장 높은 충족되지 않은 필요성을 갖기 때문이다. 치료법에 대한 반응은 대체로 Bio-NF 집단에서보다 Bio-IR 집단에서 더 낮다.
Bio-NF 대상체의 코호트를 파트 I (연구 2)에 포함시켜 개발 프로그램 초기에 이 집단에서 항-NKG2D 항체의 효과에 대한 추가의 정보를 얻는다.
위약 무반응자에 대한 항-NKG2D 항체 용량의 선택
파트 1 에서, 항-NKG2D 항체 (400 mg/200 mg)의 고용량이 위약 무반응자에 대해 선택되었는데, 이는 이것이 이 파트에서 연구된 유일한 용량 요법이기 때문이다.
파트 2 에서, 중간 용량이 위약 무반응자에 대해 선택되었는데, 이는 이 용량이 이전 제2a상 연구에서 연구된 용량 (효능이 나타났음)보다 높기 때문에 효과적일 것으로 여겨지기 때문이다. 중간 용량은 또한 고용량과 비교하여 더 적은 주사를 필요로 한다.
실시예 10: 평가
효능 평가
연구의 두 파트 모두에 대해 선택된 효능 평가 (예를 들어, CDAI, CRP, 대변 바이오마커;)는 크론병 연구에서 질병 활성의 주요 임상 관련 효과로서 또는 임상 관련 효과를 지지하는 것으로 규제 기관에 의해 인정되는 잘 확립된 척도이다.
CDAI 는 연구 약물의 장기간 중단 후 효능 수준을 평가하기 위한 마지막 효능 및 안전성 방문 시에 계산될 것이다.
CDAI 의 변화는 3 가지 연구 각각에 대한 1차 종점으로서 사용되고 있는데, 이는 이 척도가 관해보다 더 민감하기 때문이다 (즉, CDAI 의 변화는 동일한 샘플 크기에 대하여 관해보다 더 큰 영향력을 제공함). 따라서, 연구는 CDAI 의 변화를 사용하는 제2상의 경우 더 효율적일 수 있다. 그러나, 중간 분석을 위해서는 임상 관해 종점이 사용되는데, 이는 이것이 더 엄격한 종점이고 파트 II 조기 시작 여부를 결정하기 위한 더 보수적인 결정 규칙을 제공하기 때문이다.
내시경 개선은 임상 증상 (예를 들어, CDAI 의 변화)보다 나중에 발생할 것으로 예상되기 때문에, 내시경 개선의 초기 평가는 (8 주째 대신) 12 주째에 일어날 것이다. 항-NKG2D 항체 대 위약의 적절한 비교를 위하여, 위약 대조 기간은 12 주까지 계속될 것이다.
약동학적 평가
약동학적 평가는 크론병에 걸린 대상체에서 항-NKG2D 항체의 처리과정을 추가로 이해하기 위해 사용될 것이다.
면역원성 평가
크론병에 걸린 대상체에서 항-NKG2D 항체의 면역원성을 추가로 평가하기 위해 항-NKG2D 항체에 대한 항체의 검출을 위한 혈청 샘플이 수집될 것이다.
약력학적 평가
항-NKG2D 항체에 의한 처리에 대한 크론병 대상체의 반응을 추가로 이해하기 위해 PD 분석을 위한 혈청 샘플이 수집될 것이다.
실시예 11: DNA 및 바이오마커 수집
유전적 변화는 약물 분포 및 반응의 개체간 차이에 대한 중요한 기여 인자일 수 있고, 또한 질병 감수성 및 예후를 위한 마커로서의 역할을 할 수 있음이 인식된다. 약물유전체학적 연구는 임상 결과에서 개체간 가변성을 설명하는 데 도움을 줄 수 있고, 약물에 상이하게 반응하는 집단 하위 그룹을 확인하는 데 도움을 줄 수 있다.
환자 샘플의 유전자형을 결정하고 rs2255336 또는 rs2239705 SNP를 갖는 환자를 확인함으로써, NKG2D 제2a상 임상 시험으로부터의 데이터의 사후 분석을 수행하였다. 2개의 SNP에 대한 유전자형에 기초하여 4개의 환자 그룹을 시험하였다. 모든 4개의 잠재적인 하플로타입을 갖는 대상체를 검사하였다. 이 데이터는 도 4에 요약되어 있고, 처리 전의 CDAI 점수와 비교하여 처리 후 15 일째의 CDAI 의 변화를 보여준다. 이들 데이터는 항-NKG2D 항체의 투여 후 CDAI 표현형의 감소 정도가 하플로타입과 서로 관련됨을 나타낸다. 허용 대립유전자에 대한 복합 동형접합체인 (즉, rs2255336 및 rs2239705 SNP 둘 모두를 지니는) 개체는 더 적은 MICB 및 NKG2D를 발현함으로써 CDAI 의 더 큰 감소를 가져온다. 반대로, MICB 및 NKG2D의 더 높은 발현과 관련된 대립유전자를 지닌 개체는 CDAI 의 더 작은 변화에 의해 나타나는 바와 같이 질병 수준의 더 낮은 개선을 갖는 것으로 관찰되었다. 이들 데이터는 이들 SNP와 관련된 대상체의 유전자형과 NKG2D 항체의 임상적 효능 사이의 잠재적인 상관관계를 나타낸다.
이들 SNP와 항-NKG2D 항체에 대한 반응의 연관성을 이해하기 위해 SNP 분석 (NKG2D SNP rs2255336 및 MICB [NKG2D 리간드] SNP rs2239705)을 위한 모든 대상체로부터 전혈이 수집될 것이다 (더 많은 정보에 대해서는 IB의 최신 버전을 참조함). 또한, 선택적 약물유전체학 동의서에 서명한 대상체는 완전한 유전체 시험을 거칠 것이다.
이러한 약물유전체학적 요소의 목적은 DNA를 수집하여 항-NKG2D 항체의 PK, PD, 효능, 안전성, 또는 내약성에 영향을 미칠 수 있는 유전적 인자의 확인을 가능하게 하고, 크론병과 관련된 유전적 인자를 확인하는 데 있다.
처리에 대한 생물학적 반응을 검사하고 항-NKG2D 항체 처리 및/또는 크론병과 관련된 바이오마커를 확인하기 위해 바이오마커 평가가 이루어질 것이다. 혈청 기반 바이오마커 분석을 위한 혈액 샘플은, NKG2D 경로 또는 크론병의 발병과 관련된 단백질을 평가하기 위해 모든 대상체로부터 수집될 것이다. 전혈 샘플은 RNA 발현 및 T 세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 분석을 위해 모든 대상체들로부터 수집될 것이다. 점막 생검 샘플은 유전자 및/또는 단백질 발현의 분석 및 질병 및/또는 치유의 조직학적 평가를 위한 회결장내시경(ileocolonoscopy) 동안 수집될 것이다.
NKG2D에 대한 수용체 점유율(RO) 평가 및 면역표현형 결정 평가 (NK 세포 및 CD8+ T 세포를 포함함)가 또한 수행될 것이다. 면역표현형 결정은 용량 투여 전 대 용량 투여 후에 CD4, CD8, 및 NK 세포의 수를 평가하기 위한 유세포 분석법을 이용하여 수행될 것이다.
실시예 12: 대조군, 무작위 배정, 및 맹검
연구의 두 파트 모두에서, 위약 대조군은 능동적 처리의 부재 시에 발생할 수 있는 임상적 종점에서의 변화의 빈도 및 크기를 확립하는 데 사용될 것이다. 위약 대조군에 더하여, 이 연구에서 임상적 종점의 민감도를 결정하기 위해 우스테키누맙 기준 아암이 파트 II 에서 사용될 것이다.
우스테키누맙이 기준 아암으로서 사용하기 위해 선택되었는데, 이는 우스테키누맙의 효능 및 안전성 프로파일이 잘 기술되어 있기 때문이다. 다른 치료제 (예를 들어, TNFα 길항제)의 사용은 잠재적으로 Bio-IR 대상체의 집단에 혼란을 주고 맹검 유지를 위한 상당한 환자 부담을 가져온다는 것이 또한 인식된다.
무작위 배정은, 처리 그룹으로의 대상체의 할당 편향을 최소화하고, 알려진 및 알려지지 않은 대상체 속성 (예를 들어, 인구통계학적 및 기준선 특성)이 처리 그룹에 걸쳐 고르게 균형을 이룰 가능성을 증가시키고, 처리 그룹에 걸쳐 통계 비교의 유효성을 향상시키기 위해 사용될 것이다. 맹검 처리는 데이터 수집 및 임상적 종점의 평가 동안 잠재적 편향을 감소시키는 데 사용될 것이다.
실시예 13: 용량 선택
항-NKG2D 항체
RA 및 크론병에 걸린 대상체에서의 항-NKG2D 항체의 이전의 임상 연구로부터의 PK, PD 및 효능 분석 및 안전성 데이터의 결과를 사용하여 이 프로토콜에서의 3 가지 연구에 대한 용량 선택을 위한 정보를 제공하였다. RA에 걸린 대상체에서 수행된 항-NKG2D 항체에 의한 최초 인간 대상 임상 연구인 연구 NN8555-3618에서, 조사된 최고 단일 SC 용량은 7.5 mg/㎏ 이었고, 조사된 최고 다중 SC 용량 요법은 RA 대상체에서의 총 4 회 용량에 대해 2 주마다 (q2w) 4 mg/㎏ 이었다. RA 대상체의 윤활액 내로 더 많은 약물이 들어갈 필요가 있을 것으로 생각되었기 때문에 더 높은 용량을 부분적으로 투여하였다. 그러나, 더 높은 용량에서도, 항-NKG2D 항체는 이들 대상체에서 효과적인 것으로 보이지 않았다. 이전 크론병 임상 연구로부터의 수용체 점유율 데이터는 수용체 점유율이 8 주째의 대략 80%로부터 12 주째의 대략 20% 미만으로 떨어졌음을 보여주었다 (문헌[Allez M, Skolnick BE, Wisniewska-Jarosinska M, et al Anti-NKG2D monoclonal antibody (NNC0142-0002) in active Crohn's disease: a randomised controlled trial Gut Published Online First: 03 August 2016. doi: 10.1136/gutjnl-2016-311824]).
항-NKG2D 항체는 잘 용인되었고, 이전의 임상 연구로부터의 RA 또는 크론병에 걸린 대상체에서 안전성 우려는 확인되지 않았다. 또한, 52 주 반복 용량 독성 연구는 사이노몰거스 원숭이에서 1 주에 1 회 100 mg/㎏ SC의 무영향 관찰 용량(no-observed-adverse-effect level, NOAEL)을 보여주었다. 이들 안전성 및 독성학 결과에 기초하여, 항-NKG2D 항체의 제안된 용량 요법은 허용 가능한 안전성 프로파일을 가질 것으로 예상된다.
이전 임상 연구로부터의 항-NKG2D 항체 PK 및 NKG2D RO 데이터를 사용하여 집단 PK/PD 모델링 및 시뮬레이션을 수행하였다. 본 연구를 위한 용량 요법의 선택을 안내하는 것을 돕기 위해 장에서의 모델 예측된 항-NKG2D 항체 농도 및 NKG2D RO를 사용하였다. 전신 순환과 장 사이의 5% 내지 15% 항체 분포 계수가 보고되었기 때문에 장 내의 항-NKG2D 항체의 농도가 말초 순환에서의 농도의 대략 10%인 것으로 가정함으로써 장 내의 NKG2D RO가 예측된다.
파트 I
파트 I 에 대한 선택된 항-NKG2D 항체 용량 요법은 0 주째의 400 mg SC의 로딩 용량, 이어서 22 주까지 200 mg SC q2 주를 포함한다. 0 주째의 400 mg의 로딩 용량은 임상 반응의 신속한 개시를 일으키도록 의도된다. 파트 I 용량 요법은 이전의 임상 연구에서 잘 용인된 최대 전신 노출과 유사한 전신 노출을 달성할 것으로 예측된다. 최초 인간 대상 연구에서, 4 mg/㎏ SC q2w (4 회 용량)의 최고 다중 용량 요법은 79.3 (52.8 내지 91.2) ㎍/mL의 중위 (범위) 혈청 내 Cmax를 제공하였다. 크론병에 걸린 대상체에서 혈청 내 항-NKG2D 항체 Cmax의 예측된 중위값은 64.64 ㎍/mL 이고, 8 주째의 혈청 내 중위 항-NKG2D 항체 농도는 38.94 ㎍/mL 이고, 중위 정상 상태 골(trough) 항-NKG2D 항체 혈청 농도는 38.31 ㎍/mL 이다 (표 2).
[표 2]
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장 내 항-NKG2D 항체의 농도가 혈청 내 항-NKG2D 항체의 농도의 대략 10% 인 것으로 가정하면, 장 내의 항-NKG2D 항체의 예측된 중위 피크 및 골 농도는 각각 6.46 ㎍/mL 및 3.83 ㎍/mL 이다. NKG2D RO와 항-NKG2D 항체 혈청 농도 사이의 생체외 관계의 분석은 항-NKG2D 항체 혈청 농도가 3 ㎍/mL 이상일 때 90% 이상의 RO가 달성됨을 시사한다. 그 결과, 파트 I 용량 요법은 장 내에서의 대략 99% NKG2D RO를 가져올 것으로 예상된다 (오류! 참조 출처를 찾지 못함.). 따라서, 파트 I 용량 요법은 크론병에 걸린 대상체에서 허용 가능한 안전성 한계 내에 남아있으면서 최대 임상 반응을 달성할 확률을 증가시킬 것으로 예상된다.
파트 II
항-NKG2D 항체의 3 가지 용량 요법 (고, 중간 및 저)은 크론병에 걸린 대상체에서 노출-반응 관계를 평가하기 위해 광범위한 전신 약물 노출을 제공할 것으로 예상되는 파트 II 에 대해 선택되었다. 0 주째, 2 주째, 및 4 주째의 로딩 용량은 임상 반응의 신속한 개시를 일으키도록 의도된다. 제안된 용량 요법에서의 항-NKG2D 항체의 겉보기 최종 반감기가 약 2 내지 3 주이기 때문에, 4 주에서 20 주까지 4 주 간격에서의 항-NKG2D 항체의 SC 투여는 크론병 대상체에서 임상 반응을 유지할 가능성이 있는 중위 정상 상태 골 혈청 항-NKG2D 항체 농도를 생성시킬 것으로 예상된다. 또한, 하기에 기재된 PK/PD 모델링 결과는 파트 II 에서의 4 주 투여 간격의 사용을 뒷받침한다.
파트 II 에 대한 고용량 요법은 0 주째의 400 mg, 2 주째 및 4 주째의 200 mg, 이어서 20 주까지 200 mg q4 주이다. 이러한 용량 요법은 크론병에 걸린 대상체에서 53.99 ㎍/mL의 혈청 내 중위 항-NKG2D 항체 Cmax, 18.95 ㎍/mL의 8 주째의 중위 항-NKG2D 항체 혈청 농도, 및 12.00 ㎍/mL의 정상 상태에서의 중위 골 혈청 항-NKG2D 항체 농도를 가져올 것으로 예측된다. 시뮬레이션 결과는 이 고용량 요법을 받는 대상체의 89%가 정상 상태에서 3 ㎍/mL 초과의 골 혈청 항-NKG2D 항체 농도를 유지할 것으로 예상되고, 예측된 중위 장 NKG2D RO는 96% 초과 (1) 임을 시사한다.
파트 II 에 대한 중간 용량 요법은 0 주째의 150 mg SC, 2 주째 및 4 주째의 75 mg, 이어서 20 주까지 75 mg q4w이다. 이러한 중간 용량 요법은 고용량 요법으로 달성되는 전신 노출의 대략 38%를 가져올 것으로 예측된다. 정상 상태에서의 예측된 중위 장 NKG2D RO는 87% 이다.
파트 II 에 대한 저용량 요법은 0 주째의 50 mg SC, 2 주째 및 4 주째의 25 mg, 이어서 20 주까지 25 mg q4 주이다. 저용량 요법은 크론병에 걸린 대상체에서 항-NKG2D 항체의 최소 유효 용량을 조사하도록 선택된다. 정상 상태에서의 항-NKG2D 항체의 예측된 중위 혈청 골 농도는 0.74 ㎍/mL 이며, 이는 장 내에서 64%의 중위 NKG2D RO를 가져올 것으로 예측된다. 더욱이, RA 대상체에서의 FIH 연구에서, NK 세포 상의 NKG2D 발현의 감소는 항-NKG2D 항체의 용량이 0.3 mg/㎏ q2w 이상일 때까지 관찰되지 않았고, CD8+ T 세포와 NK 세포 둘 모두 상의 NKG2D 발현의 감소는 용량이 1 mg/㎏ q2w 이상일 때까지 관찰되지 않았다. 이러한 관찰은 적어도 0.3 mg/㎏ q2w의 용량 요법이 약리학적 효과를 생성하는 데 필요할 수 있고, 25 mg q4w의 선택된 낮은 유지 용량 요법이 노출-반응 곡선의 하단부에서 치료 효과를 생성할 가능성이 있음을 시사한다.
파트 I 및 파트 II
파트 I 및 파트 II 에서 항-NKG2D 항체의 4 가지 상이한 투여 요법의 선택은 이전의 임상 연구로부터의 그리고 52 주 반복 용량 독성 연구로부터의 모든 이용 가능한 PK, 효능 및 안전성 데이터에 기초하였다. 항-NKG2D 항체에 대한 현재 이용 가능한 정보가 NKG2D RO와 약물의 임상적 효과 사이의 관계를 확립하지 않았음에 유의해야 한다. 또한, 장 조직에 대한 현재 보고된 항체 분포 계수는 제한이 있을 수 있고, 장 내 항-NKG2D 항체 농도가 정확하게 예측되지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 광범위한 약물 노출을 제공할, 파트 I 및 파트 II 에서의 항-NKG2D 항체의 4 가지 상이한 용량 요법의 사용은 크론병의 치료에서 항-NKG2D 항체의 노출-반응 관계의 확고한 특성화를 제공할 것으로 예상된다.
우스테키누맙
크론병의 치료를 위한 우스테키누맙의 적절한 용량 요법을 결정하기 위해 정맥내(IV) 우스테키누맙의 2 가지 제3상 유도 연구 및 SC 우스테키누맙을 사용한 1 가지 제3상 유지 연구로부터의 결과를 사용하였다. 그 결과, 0 주째의 6 mg/㎏의 우스테키누맙의 단일 IV 유도 용량 (체중 기반 계층적 고정 용량으로서 투여됨)에 이은 8 주마다 90 mg의 SC 유지 치료법은 환자 보고된 결과, 염증의 객관적인 척도, 및 건강 관련 삶의 질 척도뿐만 아니라 유리한 안전성 프로파일을 포함하는 종점들의 범위에 걸쳐 확고한 효능을 제공하는 것으로 입증되었다.
실시예 14: 대상체 집단
적격성 대상체에 대한 스크리닝은 연구 약물의 투여 전 5 주 이내에 수행될 것이다.
3 가지 연구에서 대상체를 등록하기 위한 포함 및 배제 기준은 하기의 2개의 하위 섹션에서 설명된다. 포함 또는 배제 기준에 대한 문의 사항이 있는 경우, 조사원은 적절한 스폰서 대표와 협의하여 연구에 대상체를 등록하기 전에 임의의 문제를 해결해야 한다. 권리 포기(waiver)는 허용되지 않는다.
하기의 포함 및 배제 기준은 이러한 프로토콜 내의 3 가지 연구 모두에 적용된다.
포함 기준
각각의 잠재적 대상체는 연구에 등록하기 위해 하기 모든 기준을 만족시켜야 한다:
1. 18 세 이상의 남자 또는 여자일 것.
2. 방사선촬영, 조직학, 및/또는 내시경에 의해 과거 임의의 시간에 확인된, 지속 기간이 적어도 3 개월인 크론병 또는 누공 크론병에 대장염, 회장염, 또는 회결장염과 함께 걸려 있을 것.
3. 220 이상이지만 450 이하인 기준선 CDAI 점수로서 정의되는, 활동성 크론병에 걸려 있을 것.
4. 스크리닝 시에 다음 중 적어도 하나를 가질 것:
a. 비정상적인 CRP (0.3 mg/dL 초과 [3.0 mg/L 초과])
또는
b. 250 mg/㎏ 초과의 칼프로텍틴.
5. 파트 I 에서, 크론병에 대한 이전의 또는 현재의 약물처치에 대해 하기의 요건을 충족할 것:
a. 1 가지 이상의 승인된 생물제제 치료법 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 베돌리주맙)에 대해 이전에 부적절한 반응, 반응의 상실, 또는 불내성을 보였거나
또는
b. 통상적인 치료법이 실패하였음:
1) 현재 적절한 치료 용량에서 코르티코스테로이드 및/또는 면역조절제 (즉, AZA, 6-MP, 또는 MTX)를 투여받고 있음.
또는
2) 코르티코스테로이드 및/또는 면역조절제 (즉, AZA, 6-MP, 또는 MTX)의 적절한 경과에 반응하지 못하거나 용인하지 못한 이력이 있음.
또는
3) 코르티코스테로이드 의존성이거나, 코르티코스테로이드 의존성의 이력이 있음.
6. 파트 II 에서, 크론병에 대한 이전의 또는 현재의 약물처치에 대해 하기의 요건을 충족할 것: 1 가지 이상의 승인된 생물제제 치료법 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 베돌리주맙)에 대해 이전에 부적절한 반응, 반응의 상실, 또는 불내성을 보였음.
7. 크론병의 치료를 위한 수반되는 약물처치에 대한 하기의 요건을 준수하며, 이는 달리 명시되지 않는 한 기준선 (0 주째) 전에 적어도 3 주 동안 이러한 요건을 충족하는 용량이 안정하거나 중단되었다면 허용함:
a. 경구 5-아미노살리실산(5-ASA) 화합물.
b. 40 mg/일 이하의 프레드니손 등가 용량의 경구 코르티코스테로이드, 또는 9 mg/일의 부데소니드, 또는 5 mg/일의 베클로메타손 다이프로피오네이트.
c. 항생제가 크론병의 1차 치료제로서 사용됨.
d. 통상적인 면역조절제 (즉, AZA, 6-MP, 또는 MTX): 대상체는 적어도 12 주 동안 그리고 기준선 전 적어도 4 주 동안 안정한 용량으로 이를 복용했었어야 함.
8. 결장직장암의 가족력, 증가된 결장직장암 위험의 개인 이력, 50 세 초과의 연령, 또는 다른 알려진 위험 인자를 갖는 대상체는 결장직장암 감시에 대해 최신 상태이어야 함 (스크리닝 동안 수행될 수 있음). 선종성 용종은 연구 작용제의 첫 번째 투여 전에 제거하여야 함.
9. 8 년 이상 동안 광범위 대장염에 걸려 있었거나 12 년 이상 동안 결장의 좌측으로 제한된 질병에 걸려 있었던 대상체는, 연구 작용제의 최초 투여 전 1 년 이내에 이형성의 존재에 대해 평가하기 위해 대장내시경(colonoscopy)을 받았거나, 스크리닝 방문 시에 악성종양의 존재에 대해 평가하기 위해 대장내시경을 받았어야 하며, 악성 종양의 증거는 없어야 함.
10. 하기의 파라미터들 내의 스크리닝 실험실 시험 결과를 가져야 함:
a. 8.0 g/dL 이상의 헤모글로빈.
b. 3.0 × 103/μL 이상의 백혈구 카운트(WBC).
c. 1.5 × 103/μL 이상의 호중구.
d. 100 × 103/μL 이상의 혈소판.
e. 1.7 mg/dL 미만의 혈청 크레아티닌.
f. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 농도는 시험을 수행하는 실험실에 대한 정상 범위의 상한(ULN) 범위의 2 배 이내여야 함.
g. 1.0 mg/dL 미만의 직접 (접합) 빌리루빈.
11. 하기의 결핵(TB) 스크리닝 기준에 따라 적격인 것으로 간주함:
a. 스크리닝 전에 잠복성 또는 활동성 TB의 이력을 갖지 않음. 활동성 TB의 증거가 없는 경우 잠복성 TB에 대해 현재 치료를 받고 있는 대상체, 또는 연구 작용제의 최초 투여 전 3 년 이내에 잠복성 TB의 이력이 있고 잠복성 TB에 대해 적절한 치료를 완료한 기록문서가 있는 대상체는 예외로 함. 이전의 TB 치료의 적절성을 검증하고 적절한 기록문서를 제공하는 것은 조사원의 책임임.
주의: 상기에 약술된 예외는, 다중 약물 내성 TB에 대한 잠재적인 우려로 인해, 높은 다중약물 내성 TB 부담이 있는 국가 (예를 들어, 브라질, 중국, 인도, 러시아 연방, 남아프리카공화국)의 대상체를 배제함.
b. 의료 이력 상에 및/또는 신체 검사 시에 활동성 TB를 암시하는 징후 또는 증상이 없음.
c. 활동성 TB에 걸린 사람과 최근 밀접한 접촉이 없었거나, 그러한 접촉이 있었다면, TB 전문 의사에게 보내져 추가의 평가를 받게 하고, 타당한 것으로 인정되면, 연구 작용제의 최초 투여 전에 또는 그와 동시에 잠복성 TB에 대해 적절한 치료를 받을 것임.
d. 어멘드먼트(Amendment) 1에 따라 기준이 수정됨.
d.1 연구 작용제의 최초 투여 전 2 개월 이내에, 퀀티페론-TB 골드(QuantiFERON-TB Gold) 시험 결과 음성이거나, 활동성 TB가 배제되고 잠복성 TB에 대한 적절한 치료가 연구 작용제의 최초 투여 전에 또는 그와 동시에 개시된 경우 퀀티페론-TB 골드 시험 결과 새롭게 양성으로 확인됨 (높은 다중약물 내성 TB 부담을 갖는 국가 [예를 들어, 브라질, 중국, 인도, 러시아 연방, 및 남아프리카 공화국]를 제외하며, 새롭게 확인된 양성 퀀티페론-TB 골드 시험 결과가 있는 대상체를 배제함). 불확정 결과는 약술된 바와 같이 취급하여야 함. 퀀티페론-TB 골드 시험이 그 국가에서 승인/등록되지 않은 경우 음성 투베르쿨린(tuberculin) 피부 시험이 추가로 필요함. 투베르쿨린 피부 시험이 권장되지만, 투베르쿨린이 이용 가능하지 않은 국가의 연구 센터의 경우 필요하지 않음. 포함 기준에서 전술한 바와 같은 잠복성 TB 및 적절한 치료의 이력을 갖는 대상체의 스크리닝 시에 퀀티페론-TB 골드 인-튜브(QuantiFERON-TB Gold In-Tube) 시험은 필요하지 않음.
e. 연구 작용제의 최초 투여 3 개월 이내에 촬영하고 자격을 갖춘 방사선 의사가 판독하여 현재의 활동성 TB 또는 과거의 비활동성 TB의 증거가 없는, 흉부 방사선사진 (후전 방향 및 측방향 영상)이 있음.
12. 임신 가능성이 있는 여성은 스크리닝 시에 음성 고민감성 혈청 (β-인간 융모성 고나도트로핀[β-hCG]) 임신 시험 결과가 그리고 0 주째에 음성 소변 임신 시험 결과가 있어야 함.
13. 무작위 배정 전에, 여성 대상체는 다음과 같아야 함:
a. 다음과 같이 정의되는, 임신 가능성 없음:
1) 초경전: 초경전 상태는 초경이 아직 발생하지 않은 상태임.
2) 폐경후: 폐경후 상태는 다른 의학적 원인 없이 12 개월 동안 월경이 없는 것으로 정의함. 폐경후 범위에서의 높은 난포 자극 호르몬(FSH) 수준 (40 IU/L 또는 mIU/mL 초과)을 사용하여 호르몬 피임법 또는 호르몬 대체 치료법을 사용하지 않는 여성에서 폐경후 상태를 확인할 수 있음; 그러나, 12 개월의 무월경 없이, 단일 FSH 측정은 불충분함.
3) 영구적 불임: 영구적 불임 방법은 자궁 적출술, 양측 난관 절제술, 양측 난관 폐색/결찰 수술, 및 양측 난소 절제술을 포함함.
또는
b. 임신 가능성이 있고 그리고:
1) 임상 연구에 참여하는 대상체에 대한 피임 방법의 사용에 관해 현지 규정에 부합하는, 매우 효과적인 피임 방법을 실시함 (일관되게 그리고 정확하게 사용될 때 년간 1% 미만의 실패율). 매우 효과적인 피임제의 예는 하기를 포함한다: 사용자 독립적 방법, 예를 들어 배란의 저해와 관련된 이식 가능한 프로게스토겐 단독 호르몬 피임법; 자궁내 장치(IUD); 자궁내 호르몬 방출 시스템(IUS); 정관절제술을 받은 파트너; 또는 성적 금욕 (연구 약물과 관련된 위험의 전기간 동안 이성간 성교를 삼가는 것으로 규정되는 경우, 그리고 대상체의 바람직한 그리고 보통의 생활 방식과 일치하는 경우에만 매우 효과적인 방법으로 간주됨); 또는 사용자 의존적 방법, 예를 들어, 배란의 저해 (경구, 질내, 경피)와 결부된 조합 (에스트로겐 및 프로게스토겐 함유) 호르몬 피임법; 또는 배란의 저해 (경구, 주사 가능)와 결부된 프로게스토겐 단독 호르몬 피임법.
2) 연구에 걸쳐, 그리고 연구 작용제의 최종 투여 후 적어도 12 주 (20 주 이전에 연구 작용제를 중단한 파트 II 의 대상체의 경우 16 주) 동안 매우 효과적인 피임 방법을 유지할 것에 합의함.
주의: 대상체의 임신 가능성이 연구의 시작 후에 변화 (예를 들어, 초경전 여성이 초경을 경험함)하거나 임신 위험이 변화 (예를 들어, 이성간 성관계를 하지 않는 여성이 성관계를 하게 됨)한 경우, 여성은 포함 기준에 걸쳐 기재된 바와 같이 매우 효과적인 피임 방법을 시작해야 함.
14. 여성은 연구 동안 보조 생식 목적으로 그리고 연구 작용제의 최종 투여 후 12 주 (20 주째 이전에 연구 작용제를 중단한 파트 II 의 대상체의 경우 16 주)의 기간 동안 난자 (ova, 난모세포)를 공여하지 않을 것에 동의해야 함.
15. 연구 동안, 그리고 연구 작용제의 최종 투여 후 적어도 12 주 (20 주 이전에 연구 작용제를 중단한 파트 II 의 대상체의 경우 16 주) 동안,
a. 임신 가능성이 있는 여성과 성관계를 하는 남성은 장벽 피임법 (예를 들어, 살정(spermicidal) 폼/겔/필름/크림/좌약과 함께 콘돔)을 사용할 것에 동의해야 함.
b. 임신한 여성과 성관계를 하는 남성은 콘돔을 사용해야 함.
c. 남성은 정자를 공여하지 않을 것에 동의해야 함.
16. 이 프로토콜에 명시된 금지사항 및 제한사항을 준수할 용의가 있고 그렇게 할 수 있음.
17. 그 또는 그녀가 연구의 목적 및 그에 필요한 절차를 이해하고 이 연구에 참여할 용의가 있음을 나타내는 고지에 의한 동의서(ICF)에 서명해야 함.
18. 어멘드먼트 1에 따라 기준이 수정됨.
18.1 SNP 시험을 위한 DNA 샘플 수집이 본 연구에서 모든 대상체에 대해 필요함. 각각의 대상체는 양성 또는 음성 중 어느 하나의 SNP 상태를 가져야 함. 각각의 대상체는, 그 또는 그녀가 현지 규정이 허용하는 추가의 선택적 DNA 연구에 동의할 것에 동의하면 별도의 ICF에 서명해야 함. 선택적 DNA 연구에 동의할 것에 대한 거부는 연구에 참여하는 것으로부터 대상체를 배제하지 않음.
제외 기준
하기 기준 중 임의의 것을 충족하는 임의의 잠재적 대상체는 연구에 참여하는 것으로부터 배제될 것이다:
1. 크론병 합병증, 예를 들어 증후성 협착 또는 협착증, 단장 증후군, 또는 수술을 필요로 할 것으로 예상될 수 있거나, 치료법에 대한 반응을 평가하기 위한 CDAI 의 사용을 불가능하게 할 수 있거나, 또는 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 의한 치료 효과를 평가하는 능력에 혼란을 줄 가능성이 있는 임의의 다른 징후가 있음.
2. 현재 농양이 있거나 농양이 있는 것으로 의심됨. 최근의 피부 및 항문주위 농양은 기준선의 적어도 3 주 전에, 또는 복강내 농양의 경우 기준선의 적어도 8 주 전에 배농되고 적절히 치료된 경우, 임의의 추가의 수술이 필요할 것으로 예상되지 않는다면, 배제하지 않음. 수술에 대한 필요성이 예상되지 않고 현재 확인된 농양이 없는 경우 활성 누공이 있는 대상체를 포함시킬 수 있음.
3. 기준선 전 6 개월 이내에 임의의 종류의 장 절제술을 받거나 기준선 전 3 개월 이내에 임의의 다른 복강내 수술을 받았음.
4. 배출되는 (즉, 기능하는) 장루(stoma) 또는 오스토미(ostomy)가 있음.
5. 명시된 기간 내에 하기의 처방된 약물처치 또는 치료법 중 임의의 것을 받았음:
a. IV 코르티코스테로이드, 기준선 전 3 주 미만.
b. 다른 경구 면역조절제 (예를 들어, 6-티오구아닌 [6-TG], 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 또는 마이코페놀레이트 모페틸, 토파시티닙 및 다른 야누스(Janus) 키나제[JAK]억제제), 기준선 전 6 주 미만 또는 작용제의 5 회의 반감기 이내 중 더 긴 기간.
c. 비생물학적 실험용 또는 조사용 작용제, 기준선 전 4 주 미만 또는 작용제의 5 회의 반감기 이내 중 더 긴 기간.
d. 비자가조직 줄기 세포 치료제 (예를 들어, 프로키말(Prochymal)), 나탈리주맙, 에팔리주맙, 또는 B 또는 T 세포를 고갈시키는 생물학적 작용제 (예를 들어, 리툭시맙, 알렘투주맙, 또는 비실리주맙), 기준선 전 12 개월 미만.
e. TNFα 길항제 생물학적 작용제 (예를 들어, mAb 치료제) 또는 TNFα를 억제 또는 제거하도록 의도된 다른 작용제, 기준선 전 8 주 미만.
f. 베돌리주맙, 기준선 전 16 주 미만.
g. 다른 면역조절성 생물학적 작용제, 기준선 전 12 주 미만 또는 작용제의 5 회의 반감기 이내 중 더 긴 기간.
h. 크론병 치료법으로서 성분채집술 (예를 들어, 아다컬럼(Adacolumn) 성분채집술) 또는 총 비경구 영양제에 의한 치료, 기준선 전 3 주 미만.
6. 지난 4 개월 동안 대변 배양물 또는 다른 검사가 클로스트리듐 디피실 독소를 포함하는 장 병원체에 대해 양성으로서, 반복 검사가 음성이고 그 병원체에 의한 진행 중인 감염의 징후가 없는 경우는 아님.
7. 유스테키누맙 또는 브리아키누맙 (ABT-874)을 포함하지만 이로 제한되지 않는, IL-12 또는 IL-23 을 표적화하는 생물학적 작용제를 이전에 투여받았음.
8. 항-NKG2D 항체를 이전에 투여받았음.
9. 기준선 전 12 개월 이내에
Figure pct00064
백신접종을 받았거나 기준선 전 12 주 이내에 임의의 다른 생세균 또는 생바이러스 백신접종을 받았음.
10. 만성 신장 감염, 만성 흉부 감염, 재발성 요로 감염 (예를 들어, 재발성 신우신염 또는 만성 비중단성(nonremitting) 방광염), 또는 개방성, 배농성, 또는 감염된 피부 상처 또는 궤양을 포함하지만 이로 제한되지 않는 진행 중인, 만성 또는 재발성 감염성 질병의 이력이 있음.
11. 감염의 현재 징후 또는 증상이 있음. 확정된 심각하지 않은 감염 (예를 들어, 급성 상기도 감염, 단순 요로 감염)은 조사원의 재량에 따라 배제되는 것으로 간주할 필요가 없음.
12. 기준선 전 8 주 동안 입원 또는 IV 항생제를 필요로 하는 임의의 감염을 포함하는 심각한 감염 (예를 들어, 패혈증, 폐렴, 또는 신우신염)의 이력이 있음.
13. 기준선 8 주 이전에 대상 포진의 증거가 있음.
14. 스크리닝 전에, 히스토플라스마증(histoplasmosis) 또는 콕시디오이데스진균증(coccidioidomycosis)을 포함하는 잠복성 또는 활동성 육아종성 감염의 이력이 있음. 잠복성 TB의 이력과 관련된 적격성에 관한 정보에 대해서는 포함 기준 11a를 참조함.
15. 외과적으로 또는 추가의 이미징에 의해 그리고 근거 문서 확인으로 명확히 해소되지 않는 한, TB를 포함하는 현재의 활동성 감염, 또는 스크리닝 또는 임의의 다른 이용가능한 흉부 방사선 사진 상의 폐 악성종양이 의심되는 결절의 증거가 있음.
16. 비결핵성 마이코박테리아 감염 또는 심각한 기회 감염 (예를 들어, 사이토메갈로바이러스 대장염, 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 아스페르길루스증)에 걸려 있거나 걸린 적이 있음.
17. 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항체 양성의 이력이 있거나, 스크리닝 시에 HIV에 대한 시험이 양성임.
18. 항바이러스 치료를 완료한 후 적어도 24 주 동안 HCV RNA에 대해 음성인 것으로 규정되는, 성공적인 치료 이력 없이 C 형 간염 바이러스(HCV)에 대한 항체에 대해 혈청양성임.
19. 대상체는 B 형 간염 바이러스(HBV)에 대한 스크리닝을 거쳐야 함. 최소한으로, 이는 HBV 표면 항원(HBsAg), HBV 표면 항체 (항-HBs), 및 HBV 코어 항체 (항-HBc) 전부에 대한 시험을 포함함:
a. 모든 HBV 스크리닝 시험 (즉, HBsAg-, 항-HBc-, 및 항-HBS-)에 대해 음성으로 시험된 대상체가 이 연구에 적격임.
b. 표면 항원에 대해 양성으로 시험된 (HBsAg+) 대상체는 다른 B 형 간염 시험의 결과와 무관하게 이 연구에 적격이 아님.
c. 표면 항원 (HBsAg-)에 대해 음성으로 시험되고 코어 항체 (항-HBc+) 및 표면 항체 (항-HBs+)에 대해 양성으로 시험된 대상체는 이 연구에 적격임.
d. 표면 항체에 대해서만 양성으로 시험된 (항-HBs+) 대상체는 이 연구에 대해 적격임.
e. 코어 항체에 대해서만 양성으로 시험된 (항-HBc+) 대상체는 B 형 간염 DNA 산 (HBV DNA 시험)에 대한 추가의 시험을 거쳐야 함. HBV DNA 시험이 양성인 경우, 대상체는 이 연구에 적격이 아님. HBV DNA 시험이 음성인 경우, 대상체는 이 연구에 적격임. HBV DNA 시험이 수행될 수 없는 경우, 대상체는 이 연구에 대해 적격이 아님.
주의: HIV, HCV, 및 HBV 시험 결과로 인해 이 연구에 적격이 아닌 대상체의 경우, 이러한 감염의 치료에 있어서 전문성이 있는 의사와의 상담이 권장됨.
20. 중증, 진행성, 또는 제어되지 않은 신장, 간, 혈액학적, 내분비, 폐, 심장, 신경학적, 대뇌, 또는 정신과 질병, 또는 이들의 징후 및 증상이 있음.
21. 이식된 장기 (스크리닝 전 12 주 초과 시점의 각막 이식편은 제외함)가 있음.
22. 유의성 불명 단클론 감마병증(monoclonal gammopathy of unknown significance, MGUS), 림프종, 또는 림프절병증 및/또는 비장비대와 같은 가능한 림프증식성 질병을 암시하는 징후 및 증상을 포함하는, 림프증식성 질병의 알려진 이력이 있음.
23. 임의의 알려진 악성종양이 있거나 악성종양의 이력이 있음 (기저 세포 암종; 피부의 원위치에서의 편평세포 암종; 또는 재발의 증거 없이 치료된 원위치에서의 자궁경부암종; 또는 스크리닝 전 5 년 이내에 재발의 증거 없이 치료된 피부의 편평상피세포 암종은 제외함).
24. 불량한 내약성 또는 정맥에 대한 용이한 접근의 결여로 인해 다수의 정맥천자를 겪는 것이 불가능하거나 그렇게 할 용의가 없음.
25. 기준선 전 과거 12 개월 이내에 물질 남용 (약물 또는 알코올) 문제가 있었던 것으로 알려짐.
26. 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙 또는 이들의 부형제 (IB를 지칭함) 중 임의의 것에 대해 알려진 알레르기, 과민증, 또는 불내성이 있음.
27. 본 연구에 참여하는 동안 조사용 작용제 또는 절차를 사용한 임의의 다른 연구에 현재 참여하고 있거나 참여하려고 함.
28. 본 연구에 등록해 있는 동안 또는 연구 작용제의 최종 투여 후 12 주 (20 주째 이전에 연구 작용제를 중단한 파트 II 의 대상체의 경우 16 주) 이내에, 임신 중이거나, 모유 수유 중이거나, 임신할 계획이 있는 여성이거나, 아버지가 될 계획이 있는 남성임.
29. 조사원의 의견으로, 참여가 대상체의 최대 관심사로 되지 않게 하거나 (예를 들어, 행복감을 약화시킴), 프로토콜 명시된 평가를 방해하거나, 제한하거나, 또는 이에 혼란을 줄 수 있는 임의의 조건을 갖춤.
30. 조사원 또는 연구 현장의 직원으로서, 제안된 연구 또는 그 조사원 또는 연구 현장의 지휘를 받는 다른 연구에 직접 관여하는 직원뿐만 아니라, 그 직원 또는 조사원의 가족 구성원임.
실시예 15: 처리 배정 및 맹검
처리 배정
중앙 무작위 배정을 본 연구에서 수행할 것이다. 대상체는, 스폰서에 의해 또는 그의 감독 하에 연구 전에 준비된 컴퓨터생성 무작위 배정 스케줄에 기초하여, 파트 I 에서 2개의 처리 그룹 중 하나에 (1:1 비) 그리고 파트 II 에서 5개의 처리 그룹 중 하나에 (1:1:1:1:1 비) 무작위로 할당될 것이다. 3 가지 연구 각각은 별개의 무작위 배정을 가질 것이다. 각각의 무작위 배정은 무작위로 순열화된 블록을 사용함으로써 균형을 이룰 것이고, 기준선 CDAI 점수 (300 이하 또는 300 초과) 및 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)에 의해 계층화될 것이다. 상호작용 웹 반응 시스템(IWRS)은 대상체에 대한 처리 할당 및 매칭 연구 약물 키트를 지시할 고유 처리 코드를 할당할 것이다. 요청자는 IWRS와 접촉할 때 그 또는 그녀 자신의 사용자 신원확인 및 개인 식별 번호를 사용해야 하고, 이어서, 대상체를 고유하게 식별하기 위해 관련 대상체의 세부사항을 제공할 것이다.
맹검
연구를 맹검 상태로 유지하기 위하여, 연구 작용제 용기는 연구 명칭 및 약물처치 번호 또는 주사기 번호를 포함하는 라벨을 가질 것이다. 라벨은 용기 내의 연구 작용제를 식별하지 않을 것이다. 약물처치 번호 또는 주사기 번호는 약물이 분배될 때 증례 기록서(case report form, CRF)에 기입될 것이다. 연구 작용제들은 외관과 포장이 동일할 것이다.
계획된 효능 및 안전성 평가가 하기의 계획된 DBL 후에 수행될 것이다 (추가의 DBL 이 발생할 수 있고, 통계 분석 계획에서 설명될 것임):
Figure pct00065
중간 분석 록(lock) (연구 1: Bio-IR 대상체): 파트 1 Bio-IR 대상체의 대략 80% (처리 그룹당 적어도 40 명의 Bio-IR 대상체 및 적어도 30 명의 Bio-IR/SNP 양성 대상체)가 그들의 8 주째 방문을 완료하거나 8 주째 전에 연구 참여를 종료하였을 때 발생함
Figure pct00066
파트 I Bio-IR에 대한 12 주째 DBL (연구 1): 모든 파트 I Bio-IR 대상체가 12 주째 방문을 완료하거나 12 주째 전에 연구 참여를 종료하였을 때 발생함
Figure pct00067
파트 I Bio-NF에 대한 12 주째 DBL (연구 2; 선택적): 이러한 DBL은 파트 I Bio-IR 대상체에 대한 12 주째 DBL에 기초하여 파트 II 를 개시하지 않도록 결정되면 발생할 것이고; 전용 DBL은 모든 Bio-NF 대상체가 12 주째 방문을 완료하거나 12 주째 전에 연구 참여를 종료했을 때 발생할 것임.
Figure pct00068
파트 I Bio-NF (연구 2) 및 파트 II (연구 3)에 대한 12 주째 DBL: 모든 파트 I Bio-NF 및 파트 II 대상체가 12 주째 방문을 완료하거나 12 주 전에 연구 참여를 종료했을 때 발생함.
Figure pct00069
24 주째 DBL (연구 1, 연구 2, 및 연구 3): 모든 파트 I 및 파트 II 대상체가 24 주째 방문을 완료하거나 24 주째 전에 연구 참여를 종료했을 때 발생함.
Figure pct00070
최종 DBL (연구 1, 연구 2, 및 연구 3): 모든 파트 I 및 파트 II 대상체가 최종 효능 및 안전성 방문을 완료하거나 최종 효능 및 안전성 방문 전에 연구 참여를 종료했을 때 발생함.
파트 I Bio-NF 및 파트 II 에 대한 12 주째 DBL 전에 발생한 DBL 시에, 제한된 수의 스폰서 요원이 처리 할당에 대해 비맹검화될 것이다. 파트 I Bio-NF 및 파트 II 에 대한 12 주째 DBL 시에, (조사 현장과 상호작용하는) 현장 감시요원을 제외한 스폰서가 처리 할당에 대해 비맹검화될 것이다. 파트 I Bio-NF 및 파트 II 에 대한 12 주째 DBL 전에 대상체-수준 데이터에 접근할 스폰서 요원의 신원확인은 비맹검화 전에 기록될 것이다. 연구 맹검은 조사원, 현장 요원, 대상체, 및 스폰서 현장 감시요원에 대해 최종 분석이 연구 내의 모든 대상체에 대해 완료될 때까지 유지될 것이다. 이러한 조치는 나머지 조사원 및 대상체 평가에서의 잠재적 편향을 완화시킬 것이다.
처리 할당을 잠재적으로 비맹검화할 수 있는 데이터 (즉, 연구 약물 혈청 농도, 항-약물 항체, 처리 배정, 및 연구 약물 준비/의무 데이터)는 맹검의 무결성이 유지되고 편향 가능성이 최소화되는 것을 보장하기 위해 특별한 주의를 기울여 취급될 것이다. 특히, 비맹검화 전에, 이러한 정보는 데이터 정제를 목적으로 제한된 수의 데이터 관리 직원들만, 그리고 적용가능한 경우, 독립적인 약물 감사를 수행할 목적으로 품질 보증 대표자만 이용 가능할 것이다.
CRP, 대변 락토페린, 및 대변 칼프로텍틴 시험의 SNP 상태 및 기준선후 결과는 조사 현장에 대하여 맹검화될 것이다. 조사 현장에서 이들 데이터를 요청하는 경우, 최종 분석이 완료된 후에 제공될 것이다.
지정된 약사, 또는 다른 적절하게 자격을 갖추고 권한을 갖는 요원, 및 독립적인 약물 감시요원은 연구 작용제에 대하여 비맹검화될 것이다. 위약 주입/주사는 우스테키누맙 주입/항-NKG2D 항체 주사와 동일한 외관을 가질 것이다. 어떠한 상황에서도, 비맹검화 요원은 대상체에 대한 처리 할당을 드러내지 않아야 한다.
생물분석 목적을 위하여, PK, 항-약물 항체, 및 PD 생물분석이 개시되기 전에, 비맹검화 데이터 관리 팀은, 대상체가 무작위 배정된 용량 수준이 아닌 대상체가 어떤 처리 (항-NKG2D 항체, 우스테키누맙, 또는 위약)를 받았는지에 대한 정보를 스폰서 생물분석자에게 제공할 것이다. PK, 면역원성, 및 PD 생물분석을 수행할 목적으로, 얀센(Janssen)의 바이오로직스 클리니컬 파마콜로지(Biologics Clinical Pharmacology)에 있는 생물분석자는 약물 농도의 결정, 연구 작용제에 대한 항체의 검출, 또는 PD 평가를 위한 혈청 샘플의 분석 시에 처리 수준 데이터 (항-NKG2D 항체, 우스테키누맙, 또는 위약)에 대하여 비맹검화될 것이다. 샘플은 적용되는 처리에 기초하여 분리될 것이며; 대상체 식별 및 주어진 용량은 드러나지 않을 것이다.
추가로, 주어진 대상체의 처리 할당은, SUSAR(suspected unexpected serious adverse reaction)에 대한 규제 보고 요건을 충족하기 위해 스폰서, IRB/IEC(Institutional Review Board/Independent Ethics Committee), 및 현장 요원에게 비맹검화될 수 있다.
조사원은 무작위 배정 코드를 제공받지 않을 것이다. 이 코드는 조사원이 개별 대상체에 대한 맹검을 해제시킬 수 있는 기능을 갖는 IWRS 내에서 유지될 것이다.
정상적인 상황 하에서, 맹검은 최종 분석이 모든 대상체에 대해 완료될 때까지 해제되지 않아야 한다. 그렇지 않다면, 맹검은 특정 응급 처리/행동 과정이 대상체의 처리 상태를 아는 것에 의해 지시될 경우에만 해제되어야 한다. 그러한 경우, 조사원은 IWRS와 접촉함으로써 응급 시에 처리의 실체를 확정할 수 있다. 조사원은, 맹검을 해제하기 전에, 특정 상황을 논의하기 위해 가능하다면 스폰서 또는 그의 지명자와 접촉하는 것이 권장된다. 스폰서 또는 그의 지명자와의 전화 접촉은 일당 24 시간, 주당 7 일 동안 이용 가능할 것이다. 맹검이 해제되는 경우, 스폰서는 가능한 한 빨리 통보를 받아야 한다. 비맹검화를 위한 날짜, 시간, 및 이유는 CRF의 적절한 섹션에 그리고 근거 문서로 IWRS에 의해 기록되어야 한다. 코드 해제를 나타내는 IWRS로부터 수신된 기록문서는 연구 현장 감시요원을 비맹검화시키지 않도록 안전한 방식으로 대상체의 근거 문서와 함께 보존되어야 한다. 조사원은 연구 현장 감시요원 또는 스폰서 요원에게 연구 처리 할당을 드러내지 않도록 권고된다.
개별적 코드 해제 절차는, 규제 또는 건강 당국으로부터의 특정 요청을 따르도록 개별 대상체의 비맹검화를 허용하기 위해 얀센 글로벌 메디컬 세이프티(Janssen Global Medical Safety) 그룹에 의한 사용을 위해 이용 가능할 것이다.
처리 할당이 비맹검화된 대상체는 추가의 연구 작용제 투여가 중단될 것이지만, 예정된 평가를 위해 계속 복귀하여야 한다 (섹션 오류! 참조 출처를 찾지 못함.).
실시예 16: 투여량 및 투여
파트 I
연구의 파트 I (도 2)에서, 위약 무반응자가 12 주째에 투여받는 것을 제외하고는, 모든 대상체는 0 주째에 위약 SC 또는 항-NKG2D 항체 400 mg SC를 투여받고, 2 주째, 4 주째, 6 주째, 8 주째, 10 주째, 12 주째, 14 주째, 16 주째, 18 주째, 20 주째, 및 22 주째에 위약 SC 또는 항-NKG2D 항체 200 mg SC를 투여받을 것이다. 위약 무반응자는 12 주째에 항-NKG2D 항체 400 mg SC를 그리고 14 주째, 16 주째, 18 주째, 20 주째, 및 22 주째에 항-NKG2D 항체 200 mg SC를 투여받을 것이다. 파트 I 에서 연구 약물 농도는 100 mg/mL 이다.
파트 I 에서 맹검을 유지하기 위하여, 모든 대상체는 0 주째 및 12 주째에 4 회의 SC 주사를 투여받고, 2 주째, 4 주째, 6 주째, 8 주째, 10 주째, 14 주째, 16 주째, 18 주째, 20 주째, 및 22 주째에 2 회의 SC 주사를 투여받을 것이다.
파트 II
연구의 파트 II (도 3)에서, 대상체는 하기와 같이 위약, 항-NKG2D 항체의 3 가지 용량 요법 중 하나, 또는 우스테키누맙을 투여받기 위해 동일한 비율로 무작위로 할당될 것이다:
Figure pct00071
위약: 0 주째, 2 주째, 4 주째, 8 주째, 12 주째, 16 주째, 및 20 주째의 위약 SC. 12 주째의 위약 무반응자는 12 주째에 항-NKG2D 항체 150 mg SC를 그리고 14 주째, 16 주째, 및 20 주째에 항-NKG2D 항체 75 mg SC를 투여받을 것이다.
Figure pct00072
항-NKG2D 항체 고용량: 0 주째의 400 mg SC 및 2 주째, 4 주째, 8 주째, 12 주째, 16 주째, 및 20 주째의 200 mg SC. (연구 약물 농도 = 100 mg/mL)
Figure pct00073
항-NKG2D 항체 중간 용량: 0 주째의 150 mg SC 및 2 주째, 4 주째, 8 주째, 12 주째, 16 주째, 및 20 주째의 75 mg SC. (연구 약물 농도= 0 주째의 100 mg/mL 및 50 mg/mL, 후속 용량의 경우 75 mg/mL)
Figure pct00074
항-NKG2D 항체 저용량: 0 주째의 50 mg SC 및 2 주째, 4 주째, 8 주째, 12 주째, 16 주째, 및 20 주째의 25 mg SC. (연구 약물 농도= 0 주째의 50 mg/mL, 후속 용량의 경우 25 mg/mL)
Figure pct00075
우스테키누맙: 0 주째의 6 mg/㎏ IV (섹션 0)에 근접하는 계층적 용량 그리고 8 주째 및 16 주째의 90 mg SC.
0 주째의 IV 연구 작용제의 투여는 1 시간 이상의 기간에 걸쳐 일어나야 한다. 주입은 준비 5 시간 이내에 완료되어야 한다.
파트 II 에서 맹검을 유지하기 위하여, 모든 대상체는 0 주째에 4 회의 SC 주사 + IV 주입을, 2 주째, 4 주째, 12 주째, 및 20 주째에 2 회의 SC 주사를, 8 주째 및 16 주째에 3 회의 SC 주사를, 그리고 14 주째에 1 회의 SC 주사를 투여받을 것이다.
처리 순응
연구 작용제는 자격이 있는 직원에 의한 IV 주입 또는 SC 주사로서 투여될 것이다. 각 투여의 세부사항은 CRF에 기록될 것이다. IV 주입의 경우, 이는 IV 주입의 날짜 및 시작과 중지 시간 그리고 주입 부피를 포함할 것이고; SC 주사의 경우, 이는 SC 주사의 날짜 및 시간을 포함할 것이다.
실시예 17: 효능 평가
CDAI 는, PRO-2, PRO-3, 브리스톨 대변 형태 척도, 및 NRS 0 내지 10 척도를 기초로 한 복부 통증과 함께 항-NKG2D 항체에 대한 질병 활동성 반응을 평가하기 위한 1차 도구일 것이다. 염증 정도는 혈청 CRP 농도를 측정함으로써 평가될 것이다. 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙 처리를 반영할 수 있는 마커의 변화를 평가하기 위해 대변 샘플이 수집되고 분석될 것이다. 대상체의 행복감은 IBDQ 및 SF-36을 사용하여 측정될 것이다. 점막 치유는 회결장내시경에 의해 평가될 것이다. 누공 질병에 걸린 대상체의 경우, 누공 폐쇄가 또한 평가될 것이다.
크론병 활동성 지수
CDAI 는 8 가지 상이한 크론병 관련 변수인 장외 증상, 복부 종괴, 체중, 헤마토크릿, 액체 대변의 총 횟수, 복부 통증/경련, 지사약(들) 및/또는 아편제의 사용, 및 전반적인 행복감에 대한 정보를 수집함으로써 평가될 것이다. 마지막 4 가지 변수는 대상체에 의해 다이어리 카드에 7 일에 걸쳐 점수가 매겨진다. PRO-2 점수는 액체 대변의 총 횟수 및 복부 통증/경련의 CDAI 요소에 기초한다. CDAI 를 또한 기초로 하는 PRO-3 점수는 PRO-2 요소 + 전반적인 행복감을 포함한다. 대상체는 매일 다이어리 기입사항을 완료하고, 그 다이어리를 매 방문 시에 가져와야 한다.
브리스톨 대변 형태 척도
브리스톨 대변 형태 척도는 인간 대변의 형태 (또는 굳기)를 7개의 카테고리로 분류하기 위한 의료 보조수단이다. 이는 다양한 장 질환 (예를 들어, 과민성 장 증후군)에 대한 치료제의 유효성을 평가하기 위한 연구 도구로서 사용되어 왔다. 대상체는 매일 다이어리 기입사항으로서 브리스톨 대변 형태 척도를 완료하고, 그 다이어리를 12 주째까지 매 방문 시에 가져올 것이다.
복부 통증 수치 등급 척도
통증에 대한 NRS는 성인에서 통증 강도의 일차원 척도이다. 11 점 (0 내지 10) NRS가 복통 통증을 평가하는 데 사용될 것이다. 점수 0은 "통증 없음"을 나타내고, 점수 10은 "상상할 수 있는 가장 심한 통증"을 나타내며, 점수가 높을수록 통증 중증도 및 강도가 높다는 것을 나타낸다. 대상체는 지난 24 시간 동안 최악일 때의 통증을 가장 잘 반영하는 1개만을 선택할 것이다. 복통 NRS는 매일 평가될 것이다. 대상체는 매일 다이어리 기입사항을 완료하고, 그 다이어리를 매 방문 시에 가져와야 한다.
C 반응성 단백질
C 반응성 단백질은 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 환자에서 염증의 마커로서 유용한 것으로 입증되었다. 크론병에서, 상승된 CRP 농도는 중증 임상 활성, 상승된 침강 속도, 및 대장내시경에 의해 검출되는 바와 같은 활동성 질병과 연관되어 있다. 오류! 참조 출처를 찾지 못함., 오류 참조 출처를 찾지 못함. CRP의 측정을 위한 혈액 샘플은 시간 및 이벤트 스케줄에 표시된 방문 시에 모든 대상체로부터 수집될 것이다. CRP는 검증된 고민감도 CRP 검정을 이용하여 검정될 것이다. 기준선후 CRP 측정의 결과는 중앙 실험실에 의해 조사원에게 공개되지 않을 것이다.
대변 락토페린 및 칼프로텍틴
대변 락토페린 및 대변 칼프로텍틴은 IBD에 걸린 환자에서 치료에 대한 장 염증 및 반응을 확인하는 데 있어서 민감하고 특이적인 마커인 것으로 입증되었다. 대변 락토페린 및 칼프로텍틴 농도를 위한 대변 샘플은 시간 및 이벤트 스케줄에 표시된 방문 시에 모든 대상체로부터 수집될 것이다. 대변 락토페린 및 칼프로텍틴 농도에 대한 검정은 검증된 방법을 이용하여 수행될 것이다. 마이크로바이옴(microbiome)과 같은 장 염증 및 치료 반응과 관련된 추가의 마커에 대하여 추가의 시험이 또한 대변 샘플에 대해 수행될 수 있다. 기준선후 대변 락토페린 및 칼프로텍틴 시험의 결과는 중앙 실험실에 의해 조사원에게 공개되지 않을 것이다.
염증성 장 질환 질문지
IBDQ는 다음 4 가지 관점에 걸쳐 PRO를 평가하기 위한 IBD에 걸린 대상체를 위한 32 항목 자가 보고용 질문지이다: 장 증상 (묽은 대변, 복부 통증), 전신성 증상 (피로, 변경된 수면 패턴), 사회 기능 (출근율, 사교 모임 취소의 필요성), 및 정서 기능 (분노, 우울증, 과민성). 점수는 32 내지 224의 범위이며, 점수가 높을수록 더 나은 결과를 나타낸다.
36 항목 단축형 건강 설문
8 가지 기능적 도메인 척도로 전반적인 건강 상태를 측정하기 위해 SF-36가 개발되었다.
Figure pct00076
건강 문제로 인한 신체 기능의 제한.
Figure pct00077
신체 건강 문제로 인한 일상적인 역할 활동의 제한.
Figure pct00078
육체적 통증.
Figure pct00079
전반적인 정신 건강 (심리적 고통 및 행복감).
Figure pct00080
개인 또는 정서 문제로 인한 일상적인 역할 활동의 제한.
Figure pct00081
신체 또는 정신 건강 문제로 인한 사회 기능의 제한.
Figure pct00082
활력 (에너지 및 피로).
Figure pct00083
전반적인 건강 지각.
8 가지 척도 점수에 기초하여, 신체 요소 요약(PCS) 및 정신 요소 요약(MCS)이 도출될 수 있다. 척도 점수와 요약 점수는, 일반적인 미국 인구 규준(norm)을 기반으로, 점수를 50의 평균 및 10의 표준 편차로 변환하기 위해 선형 변환이 수행되는 규준 기반 시스템을 사용하여 0 내지 100의 점수로 전환된다. SF-36에 의해 측정된 개념은 임의의 연령, 질병, 또는 처리 그룹에 특이적이지 않아서, 다양한 질병의 상대적 부담과 다양한 처리의 상대적 이득의 비교를 가능하게 한다.
누공 평가
모든 대상체는 누공에 대해 평가될 것이다. 누공 질병에 걸린 대상체의 경우, 누공 폐쇄가 평가될 것이다. 장피 누공 (예를 들어, 항문주위 및 복부)은 약한 가압에도 불구하고 배출이 없을 때 더 이상 배출되지 않는 (즉, 폐쇄된) 것으로 간주될 것이다. 직장질 누공은 물리적 검사 또는 관련 증상 (예를 들어, 직장 물질의 통과 또는 질로부터의 배기음(flatus))의 부재에 기초하여 폐쇄된 것으로 간주될 것이다.
내시경 종점
점막 치유는 내시경 (회결장내시경) 도중에 평가될 것이다. 각각의 현장에 제공된 연구 참조 매뉴얼에 따라, 스크리닝, 12 주째, 및 24 주째에 점막 염증 및 궤양의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 비디오 회결장내시경 검사가 수행될 것이며; 비디오 회결장내시경 검사가 방문일에 수행되지 않는 경우, 0 주째 방문 적어도 8 일 전에 그리고 12 주째 방문 최대 8 일 전에 수행되어야 한다. 24 주째 비디오 회결장내시경이 제안되지만, 필수적인 것은 아니며; 수행되는 경우, 24 주째 방문 최대 8 일 전에 수행되어야 한다. 비디오 내시경은 처리 그룹 및 연구 방문에 대해 맹검화될 중앙 시설에 의해 평가될 것이다. 완전한 비디오 내시경 검사는 시각화될 수 없는 경우 말단 회장의 평가를 필요로 하지 않는다.
SES-CD 점수는 5개의 회결장 분절에 걸친 4 가지 내시경 요소 (궤양의 존재/크기, 궤양에 의해 덮인 점막 표면의 비율, 임의의 다른 병변에 의해 영향을 받은 점막 표면의 비율, 및 협소화/협착의 존재/유형)의 평가에 기초한다. 각각의 내시경 요소는 각각의 부분에 대해 0 내지 3으로 점수화되고, 총 점수는 모든 요소 점수의 합 (범위, 0 내지 56)으로부터 도출된다. SES-CD 점수는 중앙 판독자(central reader)에 의해 평가될 것이다.
SES-CD 점수의 평가에 더하여, 치료적 개입에 반응하는 점막 궤양의 분해 (부재)로서 전통적으로 규정되는 내시경 치유가 또한 중앙 판독자에 의해 평가될 것이다.
실시예 18: 약동학 및 면역원성 평가
평가
항-NKG2D 항체 및 우스테키누맙 (항-NKG2D 항체에 대한 항체 및 우스테키누맙에 대한 항체)의 PK 및 면역원성을 평가하기 위해 혈청 샘플이 사용될 것이다. 연구 기간 중에 또는 그 후에 발생하는 문제를 다루는 안전성 또는 효능 양상을 평가하기 위하여, 면역원성의 추가의 특성화를 위하여, 또는 관련 바이오마커의 평가를 위하여, 항-NKG2D 항체와 우스테키누맙 및 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체의 혈청 농도의 분석을 위해 수집된 샘플이 추가로 사용될 수 있다. 유전자 분석은 이들 혈청 샘플에 대해 수행되지 않을 것이다. 대상체의 비밀보장은 유지될 것이다.
연구 작용제의 혈청 농도만이 평가될 방문 시에 (즉, 연구 작용제에 대한 항체는 평가되지 않을 것임), 1개의 충분한 부피의 정맥 혈액 샘플이 수집되어야 하고, 각 혈청 샘플은 2개의 분취물로 나누어져야 한다 (하나는 연구 작용제의 혈청 농도에 대한 것이고, 다른 하나는 예비용임). 연구 작용제 및 연구 작용제에 대한 항체의 혈청 농도가 평가될 방문 시에, 1개의 충분한 부피의 정맥 혈액 샘플이 수집되어야 한다. 각 혈청 샘플은 3개의 분취물로 나누어질 것이다 (각각 연구 작용제의 혈청 농도에 대한 것, 연구 작용제에 대한 항체에 대한 것, 및 예비용임).
혈청 농도
스폰서에 의해 또는 그의 감독 하에 검증되고 특이적이며 민감한 방법을 이용하여 항-NKG2D 항체 및 우스테키누맙의 농도를 결정하기 위해 혈청 샘플이 분석될 것이다.
면역원성 평가 (연구 작용제에 대한 항체)
항-NKG2D 항체 및 우스테키누맙에 대한 항체의 검출 및 특성화는 스폰서에 의해 또는 그의 감독 하에 검증된 검정 방법을 이용하여 수행될 것이다. 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체의 검출을 위해 수집된 모든 샘플은 항체 데이터의 해석을 가능하게 하기 위해 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙 혈청 농도에 대해 또한 평가될 것이다.
혈청 샘플은 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 결합하는 항체에 대해 스크리닝될 것이고, 확인된 양성 샘플의 역가가 보고될 것이다. 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체의 안정성을 검증하고/하거나 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙의 면역원성을 추가로 특성화하기 위해 다른 분석이 수행될 수 있다. 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체는 시간 및 이벤트 스케줄에 따라 모든 대상체로부터 채취된 혈액에 대해 평가될 것이다. 추가로, 샘플은 또한 연구가 종료된 대상체의 최종 방문 시에 수집되어야 한다. 이들 샘플은 스폰서 또는 스폰서의 지명자의 요구에 의해 시험될 것이다.
실시예 19: 바이오마커 및 다른 약력학적 평가
바이오마커 평가는 처리에 대한 생물학적 반응을 검사하고 항-NKG2D 항체 처리 및/또는 크론병과 관련된 바이오마커를 확인하기 위해 이루어질 것이다. 평가는 시간 및 이벤트 스케줄에 따라 수집된 혈청, 전혈, 대변, 및 점막 생검 샘플 내의 관련 바이오마커의 평가를 포함할 것이다.
혈청 기반 바이오마커
혈청 기반 바이오마커 분석을 위한 혈액 샘플은 모든 대상체로부터 수집될 것이다. 수행될 검정은 다음을 포함할 수 있다: MICA, MICB, 및 UBP 1 내지 6을 포함하지만 이로 제한되지 않는 NKG2D 경로와 관련된 단백질뿐만 아니라 SAA (혈청 아밀로이드 A), IFNγ, 또는 매트릭스 메탈로프로테이나아제와 같은 크론병과 관련된 단백질의 측정.
전혈 기반 바이오마커
RNA 발현에 대한 연구 작용제의 효과를 연구하기 위해 모든 대상체로부터 전혈 샘플이 수집될 것이다. 전혈 분석은 또한 크론병의 발병과 관련된 RNA 발현을 검사할 수 있다. TCR 레퍼토리의 분석을 위해 추가의 혈액 샘플이 얻어질 것이다.
생검 기반 바이오마커
유전자 및 단백질 발현에 대한 연구 작용제의 효과를 연구하기 위하여 그리고 질병 및 치유의 조직학적 평가를 위하여 점막 생검 샘플이 비디오 회결장내시경 도중에 수집될 것이다 (추가의 세부사항에 대해서는 연구 참조 매뉴얼을 참조함). 점막 생검 분석은 또한 크론병의 발병과 관련된 유전자 및 단백질 발현을 검사할 수 있다.
NKG2D 수용체 점유율
NKG2D RO 평가는 시간 및 이벤트 스케줄에 명시된 시점에서 수행될 것이다. NKG2D RO는 검증된 유세포 분석 검정을 이용하여 결정될 것이다.
면역표현형 결정
면역표현형 결정 평가 (NK 세포 및 CD8+ T 세포를 포함함)는 시간 및 이벤트 스케줄에 명시된 시점에서 수행될 것이다. 면역표현형 결정은 유세포 분석법을 이용하여 수행될 것이다.
약물유전체학적 (DNA) 평가
모든 대상체는 스크리닝 시에 NKG2D SNP rs2255336 및 MICB (NKG2D 리간드) SNP rs2239705에 대해 시험될 것이다. 별도의 ICF에 서명한 대상체의 경우, 질병 또는 약물에 대한 반응과 특정 유전자의 연관성을 탐색하기 위해 완전한 유전체 시험이 수행될 것이다. 단지 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙과 관련된 DNA 연구 또는 이 약물이 개발된 질병과 관련된 DNA 연구가 수행될 것이다. 10 mL 혈액 샘플이 이 시험을 위해 모든 대상체로부터 수집될 것이며; DNA 추출 실패의 경우, 대체용 약물유전체학적 혈액 샘플이 대상체에게 요청될 것이다.
또한, 대상체는 연구의 다른 양상에 참여하는 것, 또는 장래에 연구에 참여하는 것에 영향을 주지 않고서 언제든지 완전한 유전체 시험을 위한 그의/그녀의 선택적 DNA 동의를 철회할 수 있다.
실시예 20: 통계 방법
통계 분석은 스폰서에 의해 또는 스폰서의 권한 하에 수행될 것이다. 효능 및 안전성 데이터를 분석하는 데 사용되는 통계 방법에 대한 일반적인 설명이 하기에 약술되어 있다. 특정 세부사항은 통계 분석 계획에서 제공될 것이다.
기술 통계 (예를 들어, 평균, 중위값, 표준 편차, 사분위수 범위, 최소값 및 최대값)가 연속형 변수를 요약하는 데 사용될 것이다. 카운트 및 퍼센트가 범주형 변수를 요약하는 데 사용될 것이다. 그래픽 데이터 디스플레이 (예를 들어, 라인 플롯(line plot))가 또한 데이터를 요약하는 데 사용될 수 있다.
범주형 데이터에 적합한 분석 (예를 들어, 적절한 경우 카이 제곱(chi-square) 시험 또는 코크란-맨텔-헨젤(Cochran-Mantel-Haenszel) 카이 제곱 시험)이 선택된 종점 (예를 들어, 임상 관해)을 달성한 대상체의 비율을 비교하는 데 사용될 것이다. 희귀 사건의 경우, 피셔(Fisher)의 정확 시험이 처리 비교를 위해 사용될 것이다. 연속 반응 파라미터는 반데르발덴 정상 점수에 대한 분산 분석(ANOVA) 또는 공분산(ANCOVA) 모델을 사용하여 비교될 것이다.
모든 통계 시험은 달리 명시되지 않는 한 0.05 (양측)의 유의 수준에서 수행될 것이다. 공칭 p 값이 모든 처리 비교를 위해 표시될 것이다.
실시예 21: 샘플 크기 결정
3 가지 연구 모두에 대한 샘플 크기 계산 (연구 1 [파트 I Bio-IR 대상체], 연구 2 [파트 I Bio-NF 대상체], 및 연구 3 [파트 II Bio-IR 대상체])은, 2 샘플 t 시험을 사용하여 항-NKG2D 항체와 위약 사이의 8 주째 (각 연구에서 1차 종점)의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화의 유의한 차이를 검출하기 위한 능력에 의해 결정되었다.
파트 I 내의 샘플 크기
Bio-IR 대상체 (연구 1)
모든 Bio-IR 대상체
Bio-IR 대상체에서의 샘플 크기 계산을 위한 가정은, TNF-길항제 치료법이 실패했거나 그에 불내성이었던 크론병에 걸린 대상체에서 스폰서에 의해 수행된 연구인 CNTO1275CRD3002 로부터의 데이터에 기초하였다. 상기 연구에서, 8 주째의 기준선으로부터의 평균 CDAI 변화는 -25.1 (SD = 91.41) 및 -78.7 (SD = 91.79) 이었고, 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율은 위약 및 우스테키누맙 6 mg/㎏ 그룹에 대해 각각 7% 및 21% 였다. 이들 가정은 비완료자인 대상체의 6%의 영향을 포함하였다.
현재의 연구의 경우, 8 주째의 기준선으로부터의 평균 CDAI 변화가, 92의 공통 SD로, 항-NKG2D 항체 그룹에서 -79 이고 위약 그룹에서 -25 라고 가정하면, 처리 그룹당 50 명의 대상체는 0.05 (양측; 표)의 전체 유형 1 오차로 항-NKG2D 항체와 위약 사이의 처리 차이를 검출하는 대략 80% 능력을 제공할 것이다.
임상 관해에 대한 능력 계산은, 우스테키누맙에 대해 이전에 관찰된 것보다 항-NKG2D 항체에 대해 10% 더 큰 효능을 보여주는 잠재력에 기초한다. 연구 1 의 처리 그룹당 50 명의 Bio-IR 대상체는, 항-NKG2D 항체가 이전 연구에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 더 큰 31%의 관해율을 가진다고 가정하면, 0.05 (양측; 표)의 전체 유형 1 오차로 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율에서 위약으로부터의 차이를 검출하는 90% 능력을 또한 제공할 것이다.
실시예 22: SNP 양성 (Bio-IR/SNP+)인 Bio-IR 대상체
앞서 기재된 바와 같이, 이전의 제2a상 연구에서의 효능 데이터의 사후 분석은 SNP 양성이었던 대상체의 하위 그룹에서 더 큰 효능을 보였다. 따라서, SNP 양성 상태와 더 높은 임상 효능 사이의 연관성이 본 연구에서 전향적으로 조사될 것이다. 크론병 집단의 75%가 SNP 양성일 것이라는 가정에 기초하여, 50명의 Bio-IR 대상체는 대략 38 명의 Bio-IR/SNP+ 대상체를 제공할 것이다. 그룹당 38 명의 Bio-IR/SNP+ 대상체는, 항-NKG2D 항체가 그 연구에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 더 큰 31%의 관해율을 가진다고 가정하면, 0.05 (양측; 표 3)의 전체 유형 1 오차로 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율에서 위약으로부터의 차이를 검출하는 80% 능력을 제공할 것이다.
[표 3]
Figure pct00084
실시예 23: Bio-NF 대상체 (연구 2)
모든 바이오-NF 대상체
Bio-NF 대상체에서의 샘플 크기 계산을 위한 가정은, 코르티코스테로이드 또는 면역조절제가 실패했거나 그에 불내성이었지만 TNF-길항제 치료법이 실패하지 않았던 크론병에 걸린 대상체에서 스폰서에 의해 수행된 연구인 CNTO1275CRD3002 로부터의 데이터에 기초하였다. CNTO1275CRD3002 에서, 8 주째의 기준선으로부터의 평균 CDAI 변화는 -66.3 (SD = 97.81) 및 -116.3 (SD = 102.88) 이었고, 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율은 위약 및 우스테키누맙 6 mg/㎏ 그룹에 대해 각각 20% 및 40% 였다. 이들 가정은 (CNTO1275CRD3002 에서의) 비완료자인 대상체의 4%의 영향을 포함하였다.
Bio-NF 집단에서의 치료 옵션의 이용 가능성을 반영하여, 연구 2 의 경우, 샘플 크기 추정은 이전에 평가된 치료제 (예를 들어, 우스테키누맙)에 의해 보여진 것보다 큰 원하는 효과에 기초하였다. 따라서, 8 주째의 기준선으로부터의 평균 CDAI 변화가, 100의 공통 SD로, 항-NKG2D 항체 그룹에서 -152 이고 (CNTO1275CRD3002에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 큰 50%의 관해율에 기초하여 도출됨) 위약 그룹에서 -66 이라고 가정하면, 처리 그룹당 50 명의 대상체는 0.05 (양측; 표)의 전체 유형 1 오차로 항-NKG2D 항체와 위약 사이의 처리 차이를 검출하는 99% 능력을 제공할 것이다.
처리 그룹당 50 명의 Bio-NF 대상체는, 항-NKG2D 항체가 CNTO1275CRD3002 에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 더 큰 50%의 관해율을 가진다고 가정하면, 0.05 (양측; 표)의 전체 유형 1 오차로 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율에서 위약으로부터의 차이를 검출하는 89% 능력을 또한 제공할 것이다.
SNP 양성 (Bio-NF/SNP+)인 Bio-NF 대상체
크론병 집단의 75%가 SNP 양성일 것이라는 가정에 기초하여, 50명의 Bio-NF 대상체는 대략 38 명의 Bio-NF/SNP+ 대상체를 제공할 것이다. 그룹당 38 명의 Bio-NF/SNP+ 대상체는, 항-NKG2D 항체가 CNTO1275CRD3002 에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 더 큰 50%의 관해율을 가진다고 가정하면, 0.05 (양측; 표)의 전체 유형 1 오차로 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율에서 위약으로부터의 차이를 검출하는 80% 능력을 제공할 것이다.
실시예 24: 파트 II 에서의 샘플 크기 (연구 3)
모든 Bio-IR 대상체
연구 1 에서 Bio-IR 집단에 대해 사용된 것과 동일한 가정을 사용하여, 처리 그룹당 50 명의 대상체는, 0.05 (양측)의 전체 유형 1 오차로 7개의 후보 용량 반응 모델 (SAP 에서 상세히 설명됨)에 기초하여 8 주째의 CDAI 의 기준선으로부터의 변화에 대한 용량 반응 신호를 검출하는 85%의 평균 능력을 제공할 것이다. 처리 그룹당 50 명의 대상체는, 0.05 (양측; 표)의 유형 I 오차로 8 주째의 CDAI 의 기준선으로부터의 변화에 대한 최대 용량을 사용한 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이의 처리 차이를 검출하는 대략 80% 능력을 또한 제공할 것이다. 이는 파트 II 에서 250 명의 대상체의 총 샘플 크기를 가져올 것이다 (우스테키누맙 처리 그룹에 대한 추가의 50 명의 대상체를 포함함).
파트 II 에서의 처리 그룹당 50 명의 Bio-IR 대상체는, 항-NKG2D 항체가 CNTO1275CRD3001 에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 더 큰 31%의 관해율을 가진다고 가정하면, 0.05 (양측; 표)의 유형 1 오차로 8 주째 (최초의 주요 2차 종점)의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율에서 최대 용량을 사용한 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이의 차이를 검출하는 90% 능력을 또한 제공할 것이다.
SNP 양성 (Bio-IR/SNP+)인 Bio-IR 대상체
크론병 집단의 75%가 SNP 양성일 것이라는 가정에 기초하여, 50명의 Bio-IR 대상체는 대략 38 명의 Bio-IR/SNP+ 대상체를 제공할 것이다. 그룹당 38 명의 Bio-IR/SNP+ 대상체는, 항-NKG2D 항체가 CNTO1275CRD3001 에서의 우스테키누맙 관해율보다 10% 더 큰 31%의 관해율을 가진다고 가정하면, 0.05 (양측; 표)의 유형 1 오차로 8 주째의 임상 관해에 있어서의 대상체의 비율에서 최대 용량을 사용한 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이의 차이를 검출하는 80% 능력을 제공할 것이다.
효능 분석
이 프로토콜은 3개의 별개의 연구로 구성된다. 각각의 연구는 1차 종점에 대한 별도의 유형 I 오차 제어와 함께 별도로 분석될 것이다 (0.05 수준의 유의성). 각 연구 내의 다른 종점은 다중도를 위해 제어되지 않을 것이다.
각 연구에 대해 하나씩 3 가지 분석 세트가 이 프로토콜에서 계획된 분석에 사용될 것이다. 각 연구의 경우, 분석 세트는 연구 작용제를 투여받은 모든 무작위 배정된 대상체이다. 효능 분석은 변형된 처리 의향(intent-to-treat) 원칙에 기초할 것이다. 따라서, 연구 작용제를 투여받은 각각의 대상체에 대한 효능 데이터는 받은 실제 처리에 관계없이 할당된 처리에 따라 분석될 것이다.
실시예 25: 연구 1 (파트 I Bio-IR 대상체) 1차 종점 분석
파트 I 에서의 Bio-IR 대상체에 대한 1차 종점은 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화이다.
CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화는 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이에서 비교될 것이다. 비교를 위하여, 반데르발덴 정상 점수에 대한 ANCOVA 모델이 처리와 함께 고정 인자로서 사용될 것이고, 기준선 CDAI 점수와 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)가 공변량으로서 사용될 것이다. 이러한 분석을 위하여, 섹션 0에 명시된 바와 같은 처리 실패 규칙 및 누락 데이터 규칙이 적용될 것이다.
유의 수준 0.05에서 위약 그룹과 비교하여 항-NKG2D 항체 그룹에서 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화의 유의한 개선이 검출된다면, 연구 1 은 양성 연구인 것으로 간주될 것이다.
다른 효능 종점 분석
하기 종점이 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이에서 비교될 것이다.
Figure pct00085
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 CDAI 의 변화.
Figure pct00086
모든 기준선후 방문에서 CDAI 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00087
모든 기준선후 방문에서 CDAI 에 기초한 임상 반응.
Figure pct00088
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 PRO-2 의 변화.
Figure pct00089
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 복부 통증 점수 (CDAI 평가에 기초한 평균 일일 평균치)의 변화.
Figure pct00090
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 배변 빈도 점수 (CDAI 평가에 기초한 평균 일일 평균치)의 변화.
Figure pct00091
모든 기준선후 방문에서 PRO-2 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00092
모든 기준선후 방문에서 PRO-2 에 기초한 임상 반응.
Figure pct00093
모든 기준선후 방문에서 기준선으로부터의 PRO-3 의 변화.
Figure pct00094
8 주째의 임상 반응의 대상체들 중 24 주째의 CDAI 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00095
8 주째의 임상 관해의 대상체들 중 24 주째의 CDAI 에 기초한 임상 관해.
Figure pct00096
12 주째 및 24 주째의 기준선으로부터의 SES-CD 점수의 변화.
Figure pct00097
기준선으로부터의 SES-CD 점수의 3 이상의 감소에 기초한 12 주째 및 24 주째의 내시경 개선.
Figure pct00098
12 주째 및 24 주째의 SES-CD의 기준선으로부터의 적어도 50% 개선.
Figure pct00099
12 주째 및 24 주째의 내시경 치유 (점막 궤양의 부재로 정의됨).
Figure pct00100
배출 누공 개수의 기준선으로부터의 50% 이상의 감소로 정의되는, 모든 기준선후 방문에서의 누공 반응.
Figure pct00101
브리스톨 대변 형태 척도(Bristol stool form scale) (SAP에서 상세히 설명됨)를 기초로 한 종점(들)
Figure pct00102
0 내지 10의 NRS에 기초한 모든 기준선후 방문에서의 기준선으로부터의 복부 통증의 변화.
Figure pct00103
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 기준선으로부터의 IBDQ 점수의 변화.
Figure pct00104
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 IBDQ (170 이상)에 기초한 임상 관해.
Figure pct00105
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 기준선으로부터의 IBDQ의 16 점 이상의 개선.
Figure pct00106
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 SF-36의 PCS 및 MCS 점수의 기준선으로부터의 변화.
Figure pct00107
8 주째, 12 주째, 및 24 주째의 SF-36의 PCS 또는 MCS 점수의 5 점 이상의 개선.
Figure pct00108
8 주째, 12 주째 및 24 주째의 기준선으로부터의 바이오마커 (CRP, 배변 칼프로텍틴, 배변 락토페린)의 변화.
Figure pct00109
SNP 상태에 의한 8 주째의 CDAI 에 기초한 임상 관해. 2개의 SNP (NKG2D 또는 MICB) 중 적어도 1개에서 양성인 대상체는 SNP 양성인 것으로 간주될 것이다.
다른 효능 종점이 SNP 상태에 의해 조사될 수 있다 (SAP에서 상세히 설명됨).
실시예 26: 연구 2 (파트 I Bio-NF 대상체) 1차 종점 분석
파트 I 에서의 Bio-NF 대상체에 대한 1차 종점은 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화이다.
CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화는 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이에서 비교될 것이다. 비교를 위하여, 반데르발덴 정상 점수에 대한 ANCOVA 모델이 처리와 함께 고정 인자로서 사용될 것이고, 기준선 CDAI 점수와 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)가 공변량으로서 사용될 것이다. 이러한 분석을 위하여, 처리 실패 규칙 및 누락 데이터 규칙이 적용될 것이다.
유의 수준 0.05에서 위약 그룹과 비교하여 항-NKG2D 항체 그룹에서 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화의 유의한 개선이 검출된다면, 연구 2 는 양성 연구인 것으로 간주될 것이다.
다른 효능 종점 분석
항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이의 비교는 또한 명시된 종점 각각에 대해 이루어질 것이다.
실시예 27: 연구 3 (파트 II) 1차 종점 분석
1차 종점은 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화이다.
항-NKG2D 항체 용량에 대한 용량-반응 관계를 분석하기 위해 (용량-반응 분석에 대한 효능 측정은 8 주째의 CDAI점수의 기준선으로부터의 변화임) 다중 비교 절차를 모델링 기법인 MCP-Mod와 조합한 통합 전략이 이용될 것이다. 이 접근법은 2개의 주요 단계로 이루어진다. 제1 단계는 전체 유형 1 오차를 제어하면서 다수의 대비 시험을 통해 용량-반응 신호를 시험하는 것으로 이루어진다. 용량-반응 신호가 검출되는 경우, 제2 단계는 관찰된 데이터를 가장 잘 설명하는 모델을 선택하고 이를 사용하여 관련 정밀도로 적절한 용량을 추정하는 것이다. 용량-반응 분석의 세부사항은 SAP에 제공될 것이다.
연구 3 은 1차 종점에 대한 용량 반응 신호가 검출된다면 양성인 것으로 간주될 것이다. 용량-반응 분석에 더하여, 항-NKG2D 항체 처리 그룹 대 위약 그룹의 쌍대 비교가 8 주째의 CDAI 점수의 기준선으로부터의 변화에 대해 수행될 것이며; 이러한 비교는 다중도를 위해 조정되지 않을 것이다. 이러한 비교를 위하여, 반데르발덴 정상 점수에 대한 ANCOVA 모델이 처리와 함께 고정 인자로서 사용될 것이고, 기준선 CDAI 점수와 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)가 공변량으로서 사용될 것이다. 우스테키누맙 처리 그룹과, 항-NKG2D 항체 처리 그룹 또는 위약의 쌍대 비교는 계획되지 않지만; 요약 통계가 우스테키누맙 처리 그룹에 대해 제공될 것이다.
전술된 분석에 대해, 8 주째 전에 1개 이상의 처리 실패 규칙을 충족한 대상체는 8 주째까지 진행한 CDAI 점수에 대해 기준선 값을 가질 것이다. 8 주째 방문 전에 하기 사건 중 임의의 것이 있는 대상체는 실제 CDAI 점수에 관계없이 1차 종점 분석에 대해 처리 실패인 것으로 간주될 것이다:
Figure pct00110
수반되는 크론병 약물처치의 명시된 변화 (SAP 에서 상세히 설명됨).
Figure pct00111
크론병 관련 수술 (농양 배농 또는 세톤 배치(seton placement)는 제외함).
Figure pct00112
효능의 결여로 인한 또는 크론병을 악화시키는 AE로 인한 연구 작용제의 중단
또한, 평가를 위해 복귀하지 않거나 8 주째의 CDAI 점수를 계산하기에 불충분한 데이터를 갖는 (즉, CDAI 의 4개 미만의 요소가 이용 가능함) 대상체는 8 주째를 향해 진행한 이용 가능한 마지막 CDAI 점수를 가질 것이다.
1차 종점 분석의 강건성을 조사하기 위하여, 1차 종점의 민감도 분석이 상이한 누락 데이터 접근법을 이용하여 수행될 것이며; 이러한 분석은 SAP 에서 설명될 것이다. 또한, 연구 참가 시에 대변 빈도 및 복부 통증의 미리 정해진 임계값을 충족하지 않는 대상체를 제외한 민감도 분석이 1차 종점에 대해 수행될 것이며; 임계값 및 분석이 또한 SAP 에서 설명될 것이다.
주요 2차 종점 분석
주요 2차 종점은 다음과 같다:
Figure pct00113
CDAI 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 관해 (150 미만의 CDAI).
Figure pct00114
CDAI 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 반응 (CDAI 의 기준선으로부터의 100 점 이상의 감소 또는 150 미만의 CDAI).
Figure pct00115
8 주째의 기준선으로부터의 PRO-2 의 변화.
Figure pct00116
PRO-2 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 관해 (75 미만의 PRO-2).
Figure pct00117
PRO-2 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 반응 (PRO-2 의 기준선으로부터의 50 점 이상의 감소 또는 75 미만의 PRO-2).
Figure pct00118
12 주째의 기준선으로부터의 SES-CD 의 변화.
8 주째의 임상 관해 및 임상 반응의 주요 2차 종점 (CDAI 또는 PRO-2 에 의해 규정됨)은, 기준선 CDAI 점수 (300 이하 또는 300 초과)와 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)에 의해 계층화된 코크란-맨텔-헨젤(CMH) 카이 제곱 시험 (양측)을 이용하여 각각의 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 그룹 사이에서 비교될 것이다. 또한, CDAI 에 의해 측정된 바와 같은 8 주째의 임상 관해의 종점에 대하여, 항-NKG2D 항체 용량에 대한 용량 반응 관계를 검사하기 위해 MCP-MOD 전략이 이용될 것이다.
8 주째 전에 (1차 종점에 대해 명시된 바와 같은) 1개 이상의 처리 실패 규칙을 충족하는 대상체는 임상 관해 또는 임상 반응 상태가 아닌 것으로 간주될 것이다. 8 주째에 누락 CDAI 점수 (즉, CDAI 점수의 4개 미만의 요소)를 갖는 대상체는, CDAI 점수에 의해 측정되는 바와 같이, 임상 관해 또는 임상 반응 상태가 아닌 것으로 간주될 것이다. 8 주째에 누락 PRO-2 점수 (즉, PRO-2의 적어도 1개의 요소 점수가 누락됨)를 갖는 대상체는, PRO-2 점수에 의해 측정되는 바와 같이 임상 관해 또는 임상 반응 상태가 아닌 것으로 간주될 것이다.
8 주째의 기준선으로부터의 PRO-2의 변화는, 처리와 함께 반데르발덴 정상 점수에 대한 ANCOVA 모델을 고정 인자로서 사용하고 기준선 PRO-2 점수와 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)를 공변량으로서 사용하여 각각의 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 그룹 사이에 비교될 것이다.
8 주째 전에 1개 이상의 처리 실패 규칙을 충족한 대상체는 8 주째까지 진행한 기준선 PRO-2 점수를 가질 것이다. 평가에 대해 복귀하지 않거나 8 주째에 누락 PRO-2 점수를 갖는 대상체는 8 주째까지 진행한 이용 가능한 마지막 PRO-2 점수를 가질 것이다.
12 주째의 기준선으로부터의 SES-CD의 변화는, 처리와 함께 반데르발덴 정상 점수에 대한 ANCOVA 모델을 고정 인자로서 사용하고 기준선 SES-CD 점수와 SNP 양성 상태 (예 또는 아니오)를 공변량으로서 사용하여 각각의 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 그룹 사이에 비교될 것이다. SES-CD 점수에 대한 데이터 취급 규칙이 SAP에 제공될 것이다.
주요 2차 종점에 대하여, 우스테키누맙 처리 그룹과, 항-NKG2D 항체 처리 그룹 또는 위약의 쌍대 비교는 계획되지 않지만; 요약 통계가 우스테키누맙 처리 그룹에 대해 제공될 것이다.
연구 참가 시에 대변 빈도 및 복부 통증의 미리 정해진 임계값을 충족하지 않는 대상체를 제외한 민감도 분석이 주요 2차 종점에 대해 수행될 것이며; 임계값 및 분석이 SAP 에서 설명될 것이다.
다중 비교를 위한 조정은 주요 2차 종점에 대해 이루어지지 않을 것이다.
다른 효능 종점 분석
각각의 항-NKG2D 항체 처리 그룹과 위약 처리 그룹 사이의 비교는 또한 명시된 종점 각각에 대해 이루어질 것이다. 우스테키누맙 처리 그룹과, 항-NKG2D 항체 처리 그룹 또는 위약의 쌍대 비교는 이러한 종점에 대해 계획되지 않지만; 요약 통계가 우스테키누맙 그룹에 대해 제공될 것이다.
약동학적 분석
혈청 항-NKG2D 항체 및 우스테키누맙 농도의 기술 통계는 각 샘플링 시점에서 계산될 것이다. 시간 경과에 따른 혈청 항-NKG2D 항체 및 우스테키누맙 농도가 각각의 처리 그룹에 대해 요약될 것이다.
정량 가능한 최저 농도 미만의 농도는 요약 통계에서 0으로 처리될 것이다.
비선형 혼합 효과 모델링(NONMEM)을 사용한 항-NKG2D 항체에 대한 집단 PK 분석 접근법이 PK 파라미터를 평가하는 데 이용될 것이다. 집단 PK 파라미터 추정치에 대한 중요한 공변량의 영향이 평가될 수 있다. 세부사항이 집단 PK 분석 계획에서 제공될 것이고, 집단 PK 분석의 결과는 별도의 기술 보고서에 제시될 것이다.
면역원성 분석
항-NKG2D 항체에 대한 항체 및 우스테키누맙에 대한 항체의 발생률과 역가가, 일정 용량의 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙을 투여받고 항-NKG2D 항체에 대한 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체의 검출을 위한 적절한 샘플이 있는 모든 대상체 (즉, 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙의 최초 투여 후에 얻어진 적어도 1개의 샘플이 있는 대상체)에 대해 요약될 것이다.
항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체에 대해 양성인 대상체의 목록이 제공될 것이다. 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체의 최대 역가가 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체에 대해 양성인 대상체에 대해 제공될 것이다.
항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 중화 항체(NAb)의 발생률이, 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 항체에 대해 양성이고 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙에 대한 NAb에 대해 평가 가능한 샘플이 있는 대상체에 대해 요약될 것이다.
바이오마커 분석
바이오마커 분석은 측정된 바이오마커에 대한 항-NKG2D 항체의 효과를 특성화하여, 처리와 관련된 바이오마커를 확인하고 이러한 바이오마커가 항-NKG2D 항체에 대한 반응을 예측할 수 있는지를 결정할 것이다. 우스테키누맙의 바이오마커 분석은 우스테키누맙을 위한 신규한 바이오마커를 확인하기 위해서가 아닌 비교로서 수행될 것이다.
혈청, 전혈 분석, 대변, 및 점막 생검 분석 (조직학을 포함함)의 결과는 별도의 기술 보고서로 보고될 것이다.
약동학적/약력학적 분석
항-NKG2D 항체와 PD 및/또는 임상적 종점의 혈청 농도 사이의 관계가 검사될 것이다.
시간 경과에 따른 NKG2D RO (%)가 각각의 처리 그룹에 대해 요약될 것이다.
시간 경과에 따른 말초 혈액 NK 세포 및 T 세포 (CD4+ 및 CD8+를 포함함)의 절대 수 및 백분율이 각각의 처리 그룹에 대해 요약될 것이다.
약물유전체학적 분석
선택적 DNA 동의서에 서명한 대상체로부터의 DNA 수집물에 대한 탐구적 유전자 분석은 별도의 기술 보고서로 제시될 것이다.
중간 분석
무작위 배정된 파트 I Bio-IR 대상체의 최초 80% (처리 그룹당 적어도 40 명의 Bio-IR 대상체 및 적어도 30 명의 Bio-IR/SNP 양성 대상체)가 8 주째 방문을 완료했거나 8 주째 전에 연구 참여를 종료하였을 때, 연구 1 에서 중간 분석이 계획된다. 이러한 중간 분석은, 결과가 효과를 입증하기 위해 충분한 수의 대상체가 평가되었음을 시사하는 경우, 파트 II 의 조기 시작 (즉, 연구 3, 용량 범위 부분)을 허용할 것이다. 이러한 중간 분석은 연구 1 의 수행 또는 완료에 영향을 미치지 않기 때문에, 이는 관리적인 것으로 간주될 것이고 최종 연구 1 분석을 위한 다중도 조정을 필요로 하지 않을 것이다.
1차 효능 평가는 (Bio-IR 대상체에서의) 8 주째의 임상 관해에 대한 항-NKG2D 항체와 위약 사이의 비교인데, 이는 관해가 CDAI 의 변화보다 더 엄격한 종점 (본 연구의 경우 1차 종점)이고, 파트 II 를 조기에 시작할지 여부를 결정하기 위한 더 보수적인 결정 규칙을 제공하기 때문이다. 다른 선택된 효능 분석 (예를 들어, CDAI 및 PRO-2의 변화, 임상 반응)이 또한 수행될 것이며; 세부사항은 중간 분석 계획에서 제공될 것이다.
중간 데이터를 검토하고 중간 분석 계획에서 규정될 미리 규정된 결정 규칙에 따라 권장 결정/행위를 수립하도록 연구 팀과 무관한 스폰서 위원회가 개설될 것이다.
실시예 28: 연구 약물 정보
연구 약물의 물리적 설명
파트 I 및 파트 II 에서, 본 연구를 위해 공급된 항-NKG2D 항체는 동결건조된 약물 생성물이며, 이는 주입을 위해 1.1 mL의 물로 재구성 시에 10 mL 유리 바이알에서 34 mM L-히스티딘, 8.6% (w/v) 수크로스, 및 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.0 중 100 mg/mL의 항-NKG2D 항체를 함유한다. 이것은 스폰서의 책임 하에 제조 및 제공될 것이다.
항-NKG2D 항체에 대한 위약은 10 mL 유리 바이알에서 34 mM L-히스티딘, 8.6% (w/v) 수크로스, 및 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.0의 9 mL 용액으로 이루어진다.
파트 II 에서, IV 주입을 위한 우스테키누맙 5 mg/mL의 최종 바이알 형태 생성물 및 대응하는 위약은 1 회 용량 강도 (즉, 26 mL 공칭 부피 중의 130 mg)를 갖는 30 mL 바이알 중에 1 회용 멸균 용액으로서 공급될 것이다.
우스테키누맙 SC는, 1.0 mL 공칭 부피 중에 pH 6.0 에서 우스테키누맙 90 mg, L-히스티딘, L-히스티딘 일염산염 일수화물, 수크로스, 및 폴리소르베이트 80을 함유하는 1 mL (90 mg 용량)의 부피로 1 회용 사전충전형 주사기(PFS) 중의 멸균 용액으로서 공급될 것이다. 방부제는 존재하지 않는다. PFS 상의 바늘 커버는 건조 천연 고무 (라텍스의 유도체)를 함유하며, 이는 라텍스에 민감한 개체에서 알레르기 반응을 야기할 수 있다. 액체 위약은 1 mL PFS로 공급될 것이다.
위약 투여는 각각의 항-NKG2D 항체 또는 우스테키누맙 투여와 동일한 외관을 가질 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH INC. BROADMERKEL, CARRIE CURRAN, MARK GREENBAUM, LINDA TELESCO, SHANNON <120> METHODS OF TREATING CROHN'S DISEASE WITH AN ANTI-NKG2D ANTIBODY <130> JBI5096WOPCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2017-08-17 <150> 62/377,358 <151> 2016-08-19 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 9 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr 20 25 30 Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu 35 40 45 Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly 50 55 60 Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn 65 70 75 80 Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 85 90 95 Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln 100 105 110 Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met 115 120 125 Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp 130 135 140 Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile 145 150 155 160 Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro 165 170 175 Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr 180 185 190 Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 210 215

Claims (17)

  1. 크론병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 서열 번호 3, 4 및 5에 각각 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과, 서열 번호 6, 7, 및 8에 각각 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는, 안전하고 유효한 양의 항-NKG2D 항체를 상기 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 적어도 1 회의 투여 사이클을 포함하며, 상기 적어도 1 회의 사이클 각각에 대하여, 상기 항-NKG2D 항체가 다음과 같이 투여되는, 방법: (a) 400 mg 항-NKG2D 항체의 1 회 용량 및 (b) 200 mg 항-NKG2D 항체의 적어도 1 회 용량.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항체는 정맥내 또는 피하 투여를 위해 제형화되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치료는 최대 6 회의 사이클로 이루어지는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 200 mg 용량은 11 회 투여되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 NKG2D 항체의 용량 (b)의 투여는 22 주 동안 2 주마다 1 회 투여되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항체는 크론병의 증상의 감소, 임상 반응의 유도, 임상 관해의 유도 또는 유지, 질병 진행의 저해 및 질병 합병증의 저해로 이루어진 군으로부터 선택되는 효과를 상기 인간 환자에서 생성하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항체는 크론병 활동성 지수 점수의 감소, C 반응성 단백질 발현 수준의 감소, 대변 칼프로테인(calprotein) 발현 수준의 감소 및 개방성 배출 누공(open draining fistula) 개수의 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 효과를 상기 인간 환자에서 생성하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인간 환자의 크론병 활동성 지수 점수는 적어도 100 점 감소되는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 인간 환자의 크론병 활동성 지수 점수는 150 미만으로 감소되는, 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 크론병의 증상의 감소는 상기 인간 환자에서의 개방성 배출 누공의 적어도 50% 감소인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 환자는 상기 항-NKG2D 항체의 투여 전에 중등도 내지 중증 활동성 크론병으로 진단된, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 인간 환자는 상기 항-NKG2D 항체의 투여 전에 220 내지 450의 크론병 활동성 지수 점수를 갖는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 환자는 상기 항-NKG2D 항체의 투여 전에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) rs2255336 및/또는 rs2239705를 포함하는 유전자형을 갖는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항-NKG2D 항체는 서열 번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 2를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  15. 크론병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법으로서,
    (a) 상기 인간 환자로부터 생물학적 샘플을 얻고 상기 생물학적 샘플에 대해 유전자형 검정을 수행함으로써, 상기 인간 환자가 NKG2D 수용체 유전자 또는 MICB 유전자에 SNP를 갖는지 여부를 결정하는 단계;
    (b) 상기 환자가 상기 SNP를 가진 경우 항-NKG2D 수용체 항체를 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 항-NKG2D 항체는 서열 번호 3, 4 및 5에 각각 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과, 서열 번호 6, 7, 및 8에 각각 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항-NKGD2 항체는 (a) 400 mg 항-NKG2D 항체의 1 회 용량 및 (b) 200 mg 항-NKG2D 항체의 적어도 1 회 용량의 투여를 포함하는 적어도 1 회의 사이클로 투여되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 SNP는 rs2255336 또는 rs2239705 인, 방법.
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