CN116209749A - 靶向mage-a4肽的细胞/基因疗法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于治疗患有与MAGE‑A4肽相关的癌症的受试者的组合物和方法。实施方案涉及结合MAGE‑A4肽的CAR、编码结合MAGE‑A4肽的CAR的多核苷酸、包含结合MAGE‑A4肽的CAR的修饰细胞和包含结合MAGE‑A4肽的CAR的修饰细胞群。

Description

靶向MAGE-A4肽的细胞/基因疗法

相关申请交叉引用

本申请要求2020年6月11日提交的美国临时申请号63/037,758和2021年1月6日提交的美国临时申请号63/134,313的权益；所有这些都以全文引用的方式并入本文。

序列表信息

于2021年5月24日或前后创建的名为“sDS1.0099PCT_ST25.txt”的计算机可读文本文件，文件大小约为35.7KB，包含本申请的序列表，并在此以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本公开涉及修饰细胞(包括遗传修饰细胞)的组合物和用于细胞扩增和维持的方法及其用途，以治疗包括癌症在内的疾病。

背景

癌症的特征是侵入或扩散到身体其他部位的细胞异常生长。在人类中，有一百多种癌症，比如发生在肺组织中的肺癌。由于肺癌细胞失去了正常细胞的特性，因此肺癌细胞之间的联系也就消失了。一旦癌细胞脱落，它们就会通过血液和/或淋巴系统扩散到整个身体并危及生命。目前，肺癌是男性和女性癌症死亡的主要原因，是男性和女性中第二常见的癌症。据报道，黑色素瘤抗原家族A4(MAGE-A4)在许多恶性肿瘤中过度表达，包括肺癌、结肠癌和膀胱癌。因此，MAGE-A4是包括非小细胞肺癌在内的多种恶性肿瘤的免疫治疗靶点。

技术方案

本公开描述了嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含胞外域、跨膜域和胞内域，并且其中所述胞外域包含氨基酸序列SEQ ID NO:10或13。在实施方案中，所述CAR结合MAGE-A4。在实施方案中，CAR结合包含氨基酸序列SEQ ID NO：14的MAGE-A4肽。在实施方案中，CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：11或12。在实施方案中，CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：15、16或17。

实施方案描述了包含本文所述的CAR和载体的组合物。实施方案描述了包含本文所述的CAR和药学上可接受的载体的药物组合物。实施方案描述了编码上述CAR的核酸。实施方案描述了包含编码上述CAR的核酸的载体、细胞或细胞群。在实施方案中，细胞群包含T细胞。实施方案描述了包含上述T细胞群的药物组合物。实施方案描述了在有需要的受试者中刺激抗肿瘤免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的药物组合物，从而刺激抗肿瘤免疫反应。在实施方案中，受试者被诊断患有肺癌、结肠癌或膀胱癌。实施方案描述了在表达MAGE-A4肽的细胞群中刺激免疫反应的方法，该方法包括使表达MAGE-A4肽的细胞群与有效量的上述药物组合物接触。

本发明内容并非旨在识别所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图的简要说明

参考附图描述了详细描述。在不同的图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。

图1显示了T细胞上CAR和CD137表达的流式细胞术结果。

图2显示了与底物细胞共培养24小时的CAR T细胞上CD137表达的流式细胞术结果。

图3A和3B用直方图来显示图2的流式结果。

图4A和4B显示与底物细胞共培养24小时的CAR T细胞的细胞因子释放。

图5A、5B和5C显示了MAGE-A4 CAR T细胞在体外实验中的抗肿瘤作用。

图6A和6B显示了与底物细胞共培养的MAGE-A4 CAR T细胞的细胞因子释放和细胞扩增。

图7A、7B和7C显示体内实验方案的示意图以及证明MAGE-A4 CAR T具有抗肿瘤活性的体内实验结果。

图8显示了图7所示实验的小鼠中肿瘤体积的变化。

图9A和9B显示MAGE-A4 CAR之间的抗肿瘤活性比较，包括4-1BB(MAGE-A4 4-1BBCAR)或CD28(MAGE-A4 CD28 CAR)的共刺激结构域。

实施例

除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但还是描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一个/种(a/an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)物品的语法对象。举例来说，“一种要素”意指一种要素或多于一种要素。

“大约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用，术语“激活”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。激活也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”的使用范围最广，是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性或功能即可。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段；以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如，抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠，产生了六个高变环(3个环来自H链，3个环来自L链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。所述术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而生成的抗体。合成的DNA是使用本领域可用和众所周知的技术来获得。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可涉及抗体产生或特异性免疫功能细胞的激活或两者兼有。抗原包括任何大分子，所述大分子包括所有蛋白质或肽，或衍生自重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品中生成、合成或衍生自生物样品，所述生物样品包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移灶数量减少、肿瘤细胞增殖减少、减少在肿瘤细胞存活方面，具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体第一时间预防肿瘤发生的能力来体现。

术语“自体抗原”是指被免疫系统误认为是外来的内源性抗原。自体抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，以及细胞表面受体。

术语“自体的”用于描述衍生自受试者的材料，其随后被重新引入同一受试者中。

术语“同种异体的”用于描述衍生自相同物种的不同受试者的移植物。例如，供体受试者可以与受体受试者相关或不相关，但是供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标志物。

术语“异种的”用于描述衍生自不同物种的受试者的移植物。作为实例，供体受试者与受体受试者来自不同的物种，并且供体受试者和受体受试者可以是遗传学和免疫学上不相容的。

术语"癌症"一词是指一种以异常细胞快速、不受控制地生长为特征的疾病。癌细胞可以在局部或通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的例子包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”、“包括(includes)”和“包括(including)”将被理解为将被理解为包含一个既定步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或要素。

短语“由......组成(consisting of)”意指包括并且限于短语“由......组成(consisting of)”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”指示所列出的要素是必需或强制性的，并且不存在其他要素。

短语“基本上由......组成(consisting essentially of)”意指包括在短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由......组成(consisting essentially of)”指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列要素的活动或动作，可以存在或可以不存在。

术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则关联在一起的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配，或在核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有重要作用。

术语“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补，或者编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外的一种信号，所述信号介导T细胞应答，包括增殖、激活、分化和其他细胞应答的至少一种。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，诸如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指与主要信号(诸如TCR/CD3连接)结合，导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。

术语“疾病”和“病状”可以互换使用，或可以不同，因为特定的疾病或病状可能没有已知的病原体(因此病因尚未得到解决)，因此它还不是公认的疾病，但仅是一种不良病状或综合症，其中临床医生已鉴定出或多或少的特定症状的集合。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状态要比没有病症的情况下不利。如果不及时治疗，病症不一定会导致动物健康状态进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或意图的结果。例如，在治疗背景下的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述生物过程具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了用“U”代替“T”以外)并且通常提供在序列表中的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链可被称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源的”是指并非天然存在于野生型细胞或生物体中，但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。同样，通过分子生物学技术从第一生物体分离并转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个其他拷贝，从而促进编码多肽的过表达。

术语“表达或过表达”是指例如由其启动子驱动，将特定核苷酸序列转录和/或翻译成前体或成熟蛋白。“过表达”是指在转基因生物或细胞中的基因产物产量超过正常或未转化的生物或细胞中的产量水平。如本文所定义，术语“表达”是指表达或过表达。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作连接至待表达的核苷酸序列的表达控制(调节)序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或提供在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的并入重组多核苷酸的所有载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

病毒可以用于将核酸体外和体内(在受试者体内)递送到细胞中。可用于将核酸递送到细胞中的病毒包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺相关病毒。

还存在用于将核酸递送到细胞中的非病毒方法，例如电穿孔、基因枪、声波穿孔、磁转染，以及使用寡核苷酸、脂质体、树状聚合物和无机纳米颗粒。

术语“同源的”是指当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间在该位置呈序列相似性或序列同一性，例如，如果两个DNA分子中相对应的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在所述位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列享有的匹配或同源位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。当比对两个序列时进行比较，以得到最大同源性。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指用作抗体的一类蛋白质。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物，诸如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物中的一抗。IgG是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，IgM是初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒很重要。IgD是不具有已知抗体功能但可以充当抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过暴露于过敏原时，引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。

术语“分离的”是指实质上或本质上从通常伴随其原生状态的组分中分离出来的材料。所述材料可以是细胞或大分子，诸如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已从以天然存在状态的方式位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段。或者，如本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从其天然细胞环境以及从其与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化肽或多肽分子。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与其缔合的组分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指在其天然存在或天然状态下从通常与其缔合的其他细胞类型中分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语简单地是指在其天然状态下从与其天然缔合的细胞中分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞并非在体外培养。

在本公开的上下文中，使用了以下常见存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可以包括内含子，在某种程度上，编码蛋白质的核苷酸序列可以包含一个或多个内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。此外，使用慢病毒能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而产生稳定转导的遗传信息。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的情况下受试者中的反应水平相比，和/或与其他相同但未治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反应水平的可检测的增加或降低。所述术语涵盖干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者、优选地人中介导有益的治疗反应。

当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，所述核酸是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。

术语“在转录控制下”是指启动子可操作地连接至多核苷酸并相对于多核苷酸并处于正确的位置和方向，以控制由RNA聚合酶进行的转录开始和多核苷酸表达。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在指示相对于来自特定组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自患者的所述组织或器官中的疾病区域(例如实体瘤)的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定患有特征在于肿瘤抗原过表达的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型而命名(诸如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤、粘肉肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴性恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS(中枢神经系统)肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形胶质细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上低水平表达。实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例提供在表1中。

表1

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术语组合物的“肠胃外施用”包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文可互换使用，并且是指适用于本文描述的方法的任何人或动物。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，诸如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

需要治疗或其有需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病状或病症的受试者。其有需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病状或病症的受试者。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度至少为10个碱基的聚合形式核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型核苷酸。所述术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分开的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸代替的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，从而使改变后的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物功能或活性或相对于参考多核苷酸具有增加的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与本文描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％以及其间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，诸如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括酶促多肽或“酶”，其通常催化各种化学反应(即，增加其速率)。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个替换而与参考多肽区分开，所述一个或多个替换可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守替换，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有大致相似特性的其他氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基代替的多肽。

术语“启动子”是指由细胞的合成机制识别或引入合成机制，开始多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。术语“表达控制(调节)序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合(bind)”、“结合(binds)”或“与......相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中第二分子但基本上不识别或粘附于样品中其他结构无关分子的分子。如本文所用关于抗体的术语“特异性结合”，是指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种种间反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binding)”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，意味着相互作用取决于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是结合任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在包含标记“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离、未标记的A)的分子将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计学上显著的”意指结果不太可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p值，所述p值是在虚假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝虚假设。在简单情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。“减少”或“降低”或“较少”的量通常是“统计学上显著的”或生理上显著的量，并且可包括与本文描述的量或水平相比约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括介于1和大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少量。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件而诱导的初次应答，诸如经由TCR/CD3复合物进行的信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织。

术语“刺激分子”是指T细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的分子。例如，来源于刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。刺激分子包括负责进行信号传导的结构域。

术语“刺激配体”是指以下配体，所述配体当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上时，可以与细胞例如T细胞上的同源结合伴侣(本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次应答，包括激活、免疫应答的开始、增殖和相似过程。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且尤其涵盖载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。

术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指本发明中研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的的能引起组织、系统或受试者的生物或医学反应的受试者化合物的量。术语“治疗有效量”包括当给药时足以防止出现或在一定程度上减轻所治疗的紊乱或疾病的一种或多种体征或症状的化合物的量。。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。在本领域中已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体是通过多重减少HIV毒力基因生成的，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，从而使得载体具有生物安全性。

范围：在整个公开内容中，可以以范围形式来呈现本公开的各个方面。应当理解的是，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活的限制。因此，对范围的描述应被认为已明确公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围的描述诸如从1到6应被认为已明确公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的各个数，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

“嵌合抗原受体(CAR)”分子是至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域的重组多肽。在实施方案中，CAR的结构域在同一多肽链上，例如嵌合融合蛋白。在实施方案中，所述结构域在不同多肽链上，例如结构域是不连续的。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。抗原结合结构域可用于扩增和/或维持修饰的细胞(诸如CAR T细胞)，或用于杀死肿瘤细胞(诸如实体瘤)。在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域可结合抗原，例如WBC表面上的细胞表面分子或标志物。

本文描述的细胞，包括诸如CAR细胞和修饰T细胞等的修饰细胞，可以来源于干细胞。干细胞可以是成人干细胞、胚胎干细胞、尤其是非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞、或造血干细胞。修饰的细胞还可以是树突状细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，所述T细胞选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。在实施方案中，修饰的细胞可以来源于CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞。在对本发明的细胞进行扩增和基因修饰之前，可以通过各种非限制性方法从受试者中获得细胞来源。T细胞可获自多种非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员可获得和已知的任何数量的T细胞系。在实施方案中，修饰的细胞可来源于健康供体，诊断患有癌症的患者或诊断为感染的患者。在实施方案中，修饰的细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

细胞群是指两个或更多个细胞的组。细胞群中的细胞可以是相同的，以使得细胞群是同质细胞群。细胞群中的细胞可以是不同的，以使得细胞群是混合细胞群或异质细胞群。例如，混合细胞群可以包括：含有第一CAR的修饰细胞；以及含有第二CAR的细胞，其中第一CAR和第二CAR结合不同抗原。

术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化成其他类型细胞能力的某些类型的细胞中的任何一种。例如，干细胞产生两个子干细胞(如在体外与胚胎干细胞培养时发生)或一个干细胞和经历分化的细胞(如在可产生血细胞的造血干细胞中发生)。不同类别的干细胞可以基于其来源和/或其分化成其他类型细胞的能力程度来加以区分。例如，干细胞可以包括胚胎干(ES)细胞(即多能干细胞)、体干细胞、诱导型多能干细胞以及任何其他类型干细胞。

多能胚胎干细胞可存在于胚泡内细胞团中，并且具有先天分化能力。例如，多能胚胎干细胞具有在体内形成任何类型细胞的潜力。当体外长时间生长时，ES细胞保持多能性，因为子代细胞保留了多向分化的潜力。

体干细胞可以包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成人干细胞(存在于各种组织中，诸如骨髓)。这些细胞被认为具有低于多能ES细胞的分化能力，其中胎儿干细胞的能力大于成人干细胞的能力。体干细胞显然仅分化成有限数量类型的细胞，并被描述为专能的(multipotent)。“组织特异性”干细胞通常仅产生一种类型的细胞。例如，胚胎干细胞可以分化成血液干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，其可以进一步分化成各种血细胞(例如，红细胞、血小板、白细胞等)。

诱导型多能干细胞(即iPS细胞或iPSC)可以包括通过诱导特定基因表达而从非多能细胞(例如，成年体细胞)人工衍生的一种多能干细胞。诱导型多能干细胞在许多方面类似于天然存在的多能干细胞(诸如胚胎干(ES)细胞)，所述方面诸如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、可活嵌合体形成以及潜力和可分化性。诱导型多能细胞可获自成人胃、肝、皮肤和血液细胞。

在实施方案中，用于杀死肿瘤的抗原结合结构域可结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如肿瘤相关的MUC1(tMUC1)、神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺特异性蛋白(prostein)、PSMA、Her2/neu、存活素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、CD19和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可被称为CD19 CAR或19CAR，所述CD19 CAR或19CAR是包括结合CD19的抗原结合结构域的CAR分子。

在实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域包含抗体和非抗体分子。抗体的实例包括scFv(单链可变片段)、重链可变(VH)区或双链CAR。抗体还可以包括纳米抗体，例如骆驼重链(VHH)抗体。非抗体分子的例子包括细胞因子、天然配体/受体对(包括先天免疫受体和TNF受体及其配体)、生长因子、蛋白质和肽。细胞因子的例子包括IL13，例如IL13E13Y突变蛋白，用于靶向肿瘤上的IL13受体α2。配体/受体对的例子包括NKG2D及其配体。生长因子的例子包括VEGF，用于靶向肿瘤细胞上的VEGF受体。肽的例子包括设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)和单体。单体包括使用纤连蛋白III型结构域(FN3)作为分子支架构建的合成结合蛋白。例如，Adnectin^TM是基于第10个纤连蛋白III型结构域的单体。

在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括至少一个scFv或至少单域抗体。作为实例，在CAR上可以存在两个scFv。scFv包括靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，两者通过柔性接头连接。通过使用短连接肽连接轻链可变区和/或重链可变区可制备单链可变区片段(Bird等人,Science 242:423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)₃(SEQ ID:18)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。其他序列的接头也已被设计并使用了(Bird等人,1988,同上)。通常，接头可以是短的柔性多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。针对scFv的合成产生，可以使用自动合成仪。针对scFv的重组产生，可以将合适的含有编码scFv的多核苷酸的质粒引入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核生物，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者可以是原核生物，诸如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操作诸如多核苷酸的连接来制备。产生的scFv可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号传导结构域。共刺激结构域和信号传导结构域的功能在于响应于抗原结合而传递信号并激活分子，诸如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，信号传导结构域衍生自初级信号传导结构域，诸如CD3ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括一个或多个衍生自共刺激分子的功能型信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是用于激活针对抗原的细胞应答所必需的细胞表面分子(除抗原受体或其配体以外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括以下的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD40-MyD88、CD244、NKG2D、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、或其任何组合。

在实施方案中，信号传导结构域包括CD3 zeta、DAP10、DAP12、FcεRIγ、Fyn、Lck、Syk、Zap70或其组合的信号传导结构域。在实施方案中，信号传导结构域包括源自T细胞受体的CD3 zeta结构域。

本文所述的CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域包含CD28、4-1BB、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD7、CD8α、CD28、FcεRIγ、NKG2D或OX40的跨膜结构域。

在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔域。如本文所用，术语“间隔域”通常意指在多肽链上起到将跨膜结构域连接至细胞外结构域和/或细胞质结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔域可以包含高达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸，并且最优选地25至50个氨基酸。在实施方案中，本文描述的CAR的间隔区域包括CD4、CD7、CD8、CD28、IgD、IgG1或IgG4的间隔区域。

在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可以在相同的结合分子上，例如由单个核酸编码的双特异性CAR。在实施方案中，双特异性CAR可以具有通过接头连接在一起的两种不同的scFv分子。双特异性CAR(或串联CAR(tanCAR))可以包括两个结合域：scFv1和scFv2。在实施方案中，scFv1结合白细胞抗原(例如CD19)，并且scFv2结合实体瘤抗原(例如MAGE-A4肽)。在实施方案中，scFv1结合实体瘤抗原，并且scFv2结合另一种实体瘤抗原(例如，MAGE-A4肽和CLDN 18.2)。Claudin18.2(CLDN 18.2)是胃特异性的Claudin-18的一种同源异构体。CLDN 18.2在胃腺癌和胰腺癌中高度表达。在实施方案中，scFv1结合在肿瘤细胞上表达但不在正常组织上表达的抗原(例如，MAGE-A4肽)；scFv2结合在与实体瘤相关的非必需组织上表达的抗原；并且组织的正常细胞的杀死不会对受试者(例如，TSHR、GUCY2C)造成危及生命的事件(例如，并发症)。非必需组织的实例包括器官如前列腺、乳房或黑素细胞。在实施方案中，scFv1和scFv2结合在相同非必需组织上表达的不同抗原(例如，前列腺癌的ACPP和SLC45A3，以及尿路上皮癌的SIGLEC15和UPK2)。

在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可以在CAR和/或T细胞受体(TCR)上并且由单独的核酸编码。TCR的结合域可以靶向肿瘤细胞上的特定肿瘤抗原或肿瘤标志物。在实施方案中，TCR结合域是靶向特定肿瘤抗原的TCRα结合域或TCRβ结合域。在实施方案中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链。

本公开描述了治疗患有与MAGE-A4肽相关的癌症的受试者的组合物和方法，MAGE-A4肽是一种通常在正常组织细胞很少表达但存在于某些癌症中的蛋白质。实施方案涉及编码CAR结合MAGE-A4肽(MAGE-A4 CAR)的多核苷酸、CAR结合MAGE-A4肽、包含CAR结合MAGE-A4肽的修饰细胞和包含CAR结合MAGE-A4肽的修饰细胞群。

HLA-肽复合物(HPC)是指受HLA复合物限制的淋巴细胞表位或抗原。例如，T细胞表位出现在抗原呈递细胞的表面，在那里它们与MHC分子结合。在人类中，专职抗原呈递细胞专门呈递MHC II类肽，而大多数有核体细胞呈递MHC I类肽。MHC I类分子呈递的T细胞表位通常包括8至11个氨基酸长度的肽，而MHC II类分子呈递更长的肽，长度为13-17个氨基酸，非经典MHC分子也呈非肽糖脂等表位。在实施方案中，HPC可以包括α1、α2和α3结构域、β-巨球蛋白和抗原肽。在实施方案中，MAGE-A4肽包含HPC。

作为仅在人类睾丸的生殖细胞和各种人类癌症中表达的癌症/睾丸(CT)抗原，MAGE-A4(黑色素瘤抗原家族A4)，也称为黑色素瘤相关抗原4，被公认为非常安全的癌症靶点。MAGE-A4在各种肿瘤中表达，包括75％的食管癌、60％的头颈癌、48％的非小细胞肺癌、33％的胃癌和21％的霍奇金病，但没有任何表达在睾丸以外的正常组织中。患有MAGE-A4表达的非小细胞肺癌、头颈癌和成人T细胞白血病/淋巴瘤的患者通常会自发产生MAGE-A4诱导的体液或细胞免疫反应。CT抗原如MAGE-A4在肿瘤中的高表达可能与膀胱癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和头颈癌患者预后不良有关。

一些MAGE基因家族蛋白仅在生殖细胞和癌症中表达(MAGE-A到MAGE-C家族)。其他在正常组织中广泛表达(MAGE-D到MAGE-H)。所有这些MAGE蛋白家族都具有与其他MAGE蛋白序列密切匹配的同源区域，并且包含在免疫识别中显示为HLA/肽复合物的肽。因此，重要的是选择对所需MAGE肽/HLA-A2抗原具有高度特异性的TCR临床候选者。

MAGE-A4是MAGE A基因家族的CTA成员。该功能是未知的，尽管它被认为可能在胚胎发育中发挥作用。在肿瘤发病机制中，它似乎与肿瘤转化或肿瘤进展的各个方面有关。MAGE-A4与大量肿瘤有关，包括精原细胞瘤、先天性角化不良、黑色素瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌。

MAGE-A4包含源自MAGE-A4的HLA限制性肽抗原。更多MAGE-A4肽及其抗体可在WO2016/199141中找到，通过引用将其并入本文。在实施方案中，MAGE-A4肽是指肽GVYDGREHTV(SEQ ID NO：14)，对应于已知MAGE-A4蛋白的氨基酸残基编号230-239。

编码CAR结合MAGE-A4肽(MAGE-A4 CAR)的多核苷酸可以进一步包含编码一种或多种细胞因子的多核苷酸。修饰的细胞包含多核苷酸。修饰细胞群包括修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞包括一种或多种不同的抗原结合结构域。遗传修饰细胞可以包括至少两个不同的抗原结合结构域：用于扩增和/或维持遗传修饰细胞的第一抗原结合结构域和用于杀死靶细胞例如肿瘤细胞的第二抗原结合结构域。例如，第一抗原结合结构域结合表面标志物，例如白细胞(WBC)的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合肿瘤细胞的靶抗原。在实施方案中，细胞表面分子是WBC的表面抗原。CAR可以包含第一或第二抗原结合结构域。修饰的细胞包含第一和第二抗原结合结构域。在实施方案中，修饰细胞包含两组修饰细胞，即(1)包含第一抗原结合结构域的第一组修饰细胞和(2)包含第二结合结构域的第二组修饰细胞。在实施方案中，修饰细胞是包含两组不同修饰细胞的混合群体。CAR可以是双特异性CAR。例如，两个抗原结合结构域位于相同的CAR(双特异性CAR或串联CAR(tanCAR))上、不同的CAR分子上或CAR和T细胞受体(TCR)上。单个CAR可以包括至少两个不同的抗原结合结构域，或者两个不同的抗原结合结构域各自位于单独的CAR上。

CARs结合MAGE-A4肽的技术可以整合到

中。有关/>

的更多信息可在PCT公开号：WO2020146743中找到，通过引用将其并入本文。

实施方案描述了一种刺激T细胞介导的免疫反应的方法，该方法包括：使包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的MAGE-A4的细胞群体与包含CARs结合MAGE-A4肽的修饰细胞群体接触，其中CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

实施方案描述了治疗具有表达MAGE-A4肽的肿瘤的受试者的方法，该方法包括：施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含修饰细胞群，该修饰细胞群包含结合MAGE-A4肽的CAR，其中CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及MAGE-A4肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在实施方案中，CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：8-17中的至少一个。

在实施方案中，胞内结构域包含一个或多个信号结构域，例如CD3 zeta、DAP10、DAP12、FcεRIγ、Fyn、Lck、Syk和Zap70的一个或多个信号结构域。在实施方案中，胞内结构域包含CD3 zeta信号结构域。在实施方案中，胞内结构域进一步包含共刺激信号传导区，其包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1的共刺激分子的胞内结构域、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD40-MyD88、CD244、NKG2D、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任意组合。

在实施方案中，T细胞介导的免疫反应包括释放一种或多种包含IFN-γ的细胞因子。在实施方案中，修饰的T细胞包括NK细胞、T细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒性T淋巴细胞和/或调节性T细胞。

在实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含修饰细胞群，该修饰细胞群包含结合白细胞(WBC)抗原的CAR。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，WBC的抗原是CD19、CD20、CD22或BCMA。

实施方案描述了包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、细胞质结构域和跨膜结构域的双特异性CAR，其中第一抗原结合结构域识别第一抗原，并且第二抗原结合结构域识别第二抗原，并且第一抗原不同于第二抗原。在实施方案中，第一抗原和第二抗原不在同一细胞上表达。在实施方案中，第一抗原是血液成分的抗原，第二抗原是实体瘤的抗原。在实施方案中，第一抗原是CD19，第二抗原是MAGE-A4肽。

在实施方案中，第一结合域结合非必需组织的抗原，第二结合域结合肿瘤组织的抗原。例如，第一个结合域结合TSHR或GUCY2C，第二个结合域结合MAGE-A4肽。

实施方案描述了CAR，其中CAR包含胞外域、跨膜域和胞内域，并且其中胞外域包含氨基酸序列SEQ ID NO:10或13。

在实施方案中，CAR结合MAGE-A4肽。在实施方案中，CAR与包含氨基酸序列SED IDNO：14的MAGE-A4肽结合。在实施方案中，CAR包含氨基酸序列SED ID NO：11或12。在实施方案中，CAR包含氨基酸序列SED ID NO：15、16或17。在实施方案中，细胞内结构域包含CD3zeta信号结构域。在实施方案中，胞内结构域进一步包含共刺激信号传导区，其包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1的共刺激分子的胞内结构域、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD40-MyD88、CD244、NKG2D、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任意组合。

实施方案描述了包含上述CAR和载体的组合物。实施方案描述了包含上述CAR和药学上可接受的载体的药物组合物。实施方案描述了编码上述CAR的核酸。实施方案描述了包含编码上述CAR的核酸的载体。实施方案描述了包含编码上述CAR的核酸的细胞。实施方案描述了包含编码上述CAR的核酸的细胞群。在实施方案中，细胞群包含T细胞。实施方案描述了包含上述T细胞群的药物组合物。

实施方案描述了在有需要的受试者中刺激抗肿瘤免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用有效量的上述药物组合物，从而刺激抗肿瘤免疫反应。在实施方案中，受试者被诊断患有肺癌、结肠癌或膀胱癌。实施方案描述了在表达MAGE-A4肽的细胞群中刺激免疫反应的方法，该方法包括使细胞群与有效量的上述药物组合物接触。在实施方案中，免疫反应是T细胞介导的免疫反应。在实施方案中，细胞群在受试者中。在实施方案中，免疫反应是抗肿瘤免疫反应。

本公开还描述了一种或多种编码第一CAR分子和第二CAR分子或TCR的核酸。第一CAR包括第一抗原结合结构域并且第二CAR或TCR包括第二抗原结合结构域。在实施方案中，第一CAR和第二CAR或TCR作为单独的多肽表达且由至少两种单独的核酸编码。在实施方案中，单个CAR至少包含本文所述的第一和第二抗原结合结构域并且由单个核酸编码。在实施方案中，两种不同的抗原结合结构域可由多于一种核酸编码。此外，本公开描述了包含本文所述核酸的载体和包含本文所述核酸的细胞。在实施方案中，细胞包括遗传修饰的细胞，例如遗传修饰的T细胞，例如CAR T细胞。

本公开还描述了修饰细胞群，例如修饰T细胞的混合群，其有效地扩增和/或维持患者体内的遗传修饰细胞。在实施方案中，遗传修饰细胞的混合群体包括至少两种不同的遗传修饰细胞，第一遗传修饰细胞表达抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰细胞，第二遗传修饰细胞表达抗原结合结构域以杀死靶细胞，例如肿瘤细胞。这两个抗原结合结构域是不同的分子并结合不同的抗原。在实施方案中，遗传修饰细胞的混合群体进一步包括表达至少两个不同抗原结合结构域的第三遗传修饰细胞、用于扩增和/或维持遗传修饰细胞的第一抗原结合结构域和用于杀死靶细胞的第二个抗原结合区域(其中两个不同的抗原结合结构域在同一细胞上表达)。

在实施方案中，修饰细胞的混合群体包括表达至少两个不同抗原结合结构域的遗传修饰细胞，用于扩增和/或维持修饰细胞的第一抗原结合结构域和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域(其中两个不同的抗原结合结构域在同一细胞上表达)。

在实施方案中，修饰细胞的混合群体包括表达用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合结构域的修饰细胞，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰的T细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞(其中两个不同的抗原结合结构域在相同的修饰细胞上表达)。

在实施方案中，修饰细胞的混合群体包括表达用于扩增和/或维持修饰T细胞的抗原结合结构域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合结构域的修饰细胞，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰的细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞(其中两个不同的抗原结合结构域在相同的修饰细胞上表达)。

本公开描述了包含本文所述的修饰细胞的混合群体的组合物。关于混合修饰细胞(例如，T细胞)及其用途的更多信息可以在PCT/US2020/13099中找到，其通过引用并入本文。

在实施方案中，修饰的细胞是修饰的T细胞、修饰的NK细胞、修饰的巨噬细胞或修饰的树突细胞。在实施方案中，修饰的T细胞是CAR T细胞。在实施方案中，表达两个不同抗原结合结构域的修饰细胞可以是单个CAR T细胞。在实施方案中，单个CAR T细胞可以是双特异性CAR T细胞。

在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域结合WBC的表面抗原，并且用于杀死靶细胞的抗原结合结构域结合肿瘤抗原。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，B细胞的表面抗原是CD19，而肿瘤抗原是MAGE-A4肽。

此外，本公开描述了本文所述的修饰细胞的组合物或混合群体用于在有需要的患者中增强CAR T细胞的扩增和/或维持的用途。CAR T细胞的增强扩增和维持提高了CAR T细胞疗法的功效。本公开描述了一种用本文所述的修饰细胞的混合群体治疗患有肿瘤的患者的方法。在实施方案中，遗传修饰细胞的混合群体扩增和/或维持患者体内的修饰细胞并有效抑制肿瘤的生长。在实施方案中，肿瘤是实体瘤。

受试者中的淋巴细胞或T细胞反应是指与辅助、杀伤、调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞反应可能包括在免疫过程中协助其他WBC以及识别和破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞等活动。受试者中的T细胞反应可以通过各种指标来测量，例如T细胞杀死的病毒感染细胞和/或肿瘤细胞的数量、T细胞释放的细胞因子(例如，IL-6和IFN-γ)的量在体内和/或在与病毒感染的细胞和/或肿瘤细胞共培养中，来指示受试者中T细胞的增殖水平、T细胞的表型变化(例如记忆T细胞的变化)和受试者中T细胞的寿命或长寿水平。

在实施方案中，本文所述的增强T细胞反应的方法可以有效地治疗有需要的受试者，例如，被诊断患有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指肿块，它可以是液体的集合，例如血液，或固体肿块。肿瘤可以是恶性的(癌性的)或良性的。血癌的例子包括慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。

实体瘤通常不包含囊肿或液体区域。恶性实体瘤的主要类型包括肉瘤和癌。肉瘤是在称为间充质细胞的软组织细胞中发育的肿瘤，可以在血管、骨骼、脂肪组织、韧带淋巴管、神经、软骨、肌肉、韧带或肌腱中发现，而癌是在上皮细胞中形成的肿瘤，存在于皮肤和粘膜中。最常见的肉瘤类型包括未分化的多形性肉瘤，它涉及软组织和骨细胞；平滑肌肉瘤，涉及排列在血管、胃肠道和子宫内的平滑肌细胞；骨肉瘤，涉及骨细胞；和涉及脂肪细胞的脂肪肉瘤。肉瘤的一些例子包括尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、软骨肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、纤维肉瘤和神经胶质瘤。

五种最常见的癌症包括腺癌，涉及产生液体或粘液的器官，例如乳房和前列腺；基底细胞癌，涉及皮肤最外层的细胞，例如皮肤癌；鳞状细胞癌，涉及皮肤的基底细胞；和移行细胞癌，影响泌尿道中的移行细胞，包括膀胱、肾脏和输尿管。癌的例子包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、肾癌和膀胱癌，以及胆管癌。

本文所述的方法可用于治疗被诊断患有癌症的受试者。癌症可以是血癌或可以是实体瘤，例如肉瘤或癌。治疗方法包括向受试者施用有效量的本文所述的包含第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的混合T细胞群以提供T细胞应答，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与WBC的细胞表面分子不同的抗原。在实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括选择性地增强体内表达第一抗原结合域和第二抗原结合域的T细胞的增殖。

实施方案描述了包含MAGE-A4 CAR和程序性死亡受体1(PD-1)显性阴性的变体、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞减毒剂(BTLA),T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3),淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3),具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT),白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIRl),自然杀伤细胞受体2B4(2B4)或CD 160。在实施方案中，修饰的细胞进一步包含编码自杀基因的核酸，和/或自杀基因包含HSV-TK自杀基因系统。在实施方案中，与相应的野生型T细胞相比，分离的T细胞包含少量的TCR。

显性阴性突变具有与野生型等位基因起拮抗作用的改变的基因产物。这些突变通常会导致分子功能发生改变(通常不活跃)，并以显性或半显性表型为特征。在实施方案中，本文所述的修饰细胞包含显性失活(DN)形式的PD-1受体。在实施方案中，本文所述的修饰细胞中DN PD-1受体的表达受诱导基因表达系统的调节。在实施方案中，诱导型基因表达系统是lac系统、四环素系统或半乳糖系统。

本公开描述了药物组合物。药物组合物包括以下一种或多种：CAR分子、TCR分子、修饰的CAR T细胞、包含CAR或TCR的修饰细胞、修饰细胞的混合群体、核酸和本文所述的载体。药物组合物以适合待治疗(或预防)的疾病的方式给药。给药的量和频率将由诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。

术语“药学上可接受的”是指由美国联邦或州政府的监管机构或EMA(欧洲药品管理局)批准或列入美国药典药典(United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28Reissue，由美国药典公约公司，马里兰州罗克维尔，出版日期：2010年4月)或其他公认的用于动物，尤其是人类的药典。

术语“载体”是指稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或与治疗剂一起给药的载体。药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是静脉注射药物组合物时优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

当指明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗有效量”时，本公开的组合物的待施用的精确量可以由医生根据年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况等个体差异来确定。可以说，包含本文所述的修饰细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量给药，包括那些范围内的所有整数值。修饰的细胞组合物也可以在这些剂量下多次给药。这些细胞可以通过免疫疗法中常见的输注技术进行注射(参见例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来轻易确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。在实施方案中，可能需要将活化的T细胞施用于受试者，然后再抽血(或进行单采术)，收集活化和扩增的T细胞，并将这些活化和扩增的T细胞重新注入患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中被激活。在实施方案中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中被激活。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次回输方案可以选择出某些T细胞群。

本文所述的药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(iv)注射或腹膜内施用于患者。在实施方案中，本文所述的修饰的细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于受试者。在实施方案中，本公开的T细胞组合物通过静脉内注射给药。修饰细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在实施方案中，使用本文所述的方法或本领域已知的方法激活和扩增T细胞至治疗水平并将其与任何数量的相关药物一起(例如，之前、同时或之后)给予患者，例如作为联合治疗，包括但不限于抗病毒治疗的药物西多福韦和白细胞介素2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)；或那他珠单抗治疗多发性硬化症(MS)患者；或依法利珠单抗治疗银屑病患者或其他治疗进行性多灶性脑白质病(PML)患者的方式。在进一步的实施方案中，本文所述的T细胞可以与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和他克莫司(FK506)、抗体或其他免疫消融剂例如CAM PATH、抗CD3抗体组合使用或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达利滨、环孢菌素、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5：763-773，1993；Isoniemi(同上)))。在实施方案中，本文所述的细胞组合物与骨髓移植、使用诸如氟达拉滨等化疗剂的T细胞消融疗法、外束放射疗法(XRT)联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者、环磷酰胺或抗体，如OKT3或CAMPATH。在实施方案中，本文所述的细胞组合物在B细胞消融疗法之后施用。例如，与CD20反应的药剂，例如Rituxan，可以施用于患者。在实施方案中，受试者可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在实施方案中，在移植之后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。向有需要的受试者施用的上述治疗的剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗接受者而变化。取决于各种因素，可以根据医生的本领域公认的实践来进行人施用剂量的缩放。关于使用修饰细胞治疗癌症的方法的其他信息在美国专利5,500,000中提供。US8,906,682，通过引用整体并入。

在实施方案中，受试者中的T细胞应答是指与辅助性、杀伤性、调节性和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞反应可能包括在免疫过程中帮助其他白细胞以及识别和破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞等活动。受试者中的T细胞反应可以通过各种指标来测量，例如病毒感染的细胞和/或T细胞杀死的肿瘤细胞的数量、T细胞在与病毒感染的细胞共培养时释放的细胞因子的量和/或肿瘤细胞、T细胞在受试者中的增殖水平、T细胞的表型变化(例如，记忆T细胞的变化)，以及受试者中T细胞的寿命或寿命长度。

T细胞反应还包括细胞因子的释放。尽管细胞因子释放通常与全身炎症和疾病并发症有关，但细胞因子的释放似乎也与CAR T细胞疗法的功效有关。细胞因子的释放可能与过继转移细胞的扩增和进行性免疫激活相关，例如在CAR T细胞疗法中。本公开描述了响应于本文所述的修饰的T细胞的混合群体，特别是响应于存在包括用于扩增细胞的抗原结合结构域的第一CAR和包括用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的第二CAR或TCR。在实施方案中，本公开描述了IL-6和IFN-γ在引入本文所述的第一CAR和第二CAR或TCR的受试者中的释放。在实施方案中，受试者需要癌症治疗，并且癌症治疗是胰腺癌治疗。在实施方案中，本公开描述了通过测量细胞因子释放水平来确定CAR T细胞疗法的功效或监测功效。在实施方案中，使用本文描述的修饰的T细胞的混合群体的CAR T细胞治疗时，受试者中细胞因子(例如，IL-6和/或IFN-γ)的释放多于含有第二个CAR而不含第一个CAR的T细胞的释放。

实施方案涉及使用或使用编码MAGE-A4 CAR的多核苷酸和/或治疗剂来治疗患有癌症(例如肺癌)的受试者的方法。在实施方案中，该方法或用途包括提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，该载体基因组包含多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接到表达控制元件，该表达控制元件赋予多核苷酸转录的能力，向受试者注射一定量的病毒颗粒，可使得多核苷酸在受试者中表达。在实施方案中，腺相关病毒(AAV)制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供的AAV产品基本上不含AAV空衣壳。有关病毒颗粒的给药和制备的更多信息，请参见美国专利号：9840719和Milani等人，Sci.翻译。医学。11,eaav7325(2019)2019年5月22日，通过引用将其并入本文。

在实施方案中，多核苷酸可以整合到修饰细胞的基因组中，并且修饰细胞的后代也将表达多核苷酸，从而产生稳定转染的修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞表达编码CAR的多核苷酸，但多核苷酸不整合到修饰细胞的基因组中，使得修饰的细胞在有限的时间段内(例如，几天)表达瞬时转染的多核苷酸，之后多核苷酸通过细胞分裂或其他因素丢失。例如，多核苷酸以重组DNA构建体、mRNA或病毒载体的形式存在于修饰细胞中，和/或多核苷酸是mRNA，其未整合到修饰细胞的基因组中。

在实施方案中，治疗剂包含或为细胞因子。细胞因子的实例包括IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、MIP-ln、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM-CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L、铁蛋白及其任意组合。在实施方案中，细胞因子包括促炎细胞因子，例如IFN-γ、IL-15、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。在实施方案中，病毒颗粒包括多个多核苷酸，并且多核苷酸编码IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17、IL-12和IL-23中的至少一种.关于治疗剂及其用途的更多信息可以在PCT公开号：WO2020106843中找到，其通过引用并入本文。

以下是示例性实施例：

1.淋巴细胞，用于治疗患有表达MAGE-A4肽的实体瘤的受试者或在受试者中刺激T细胞介导的免疫反应的方法，该方法包括：将有效量的淋巴细胞给予患有该实体的受试者瘤；其中所述淋巴细胞包含CAR，所述CAR包含胞外域、跨膜域和胞内域，并且其中所述胞外域包含氨基酸序列SEQ ID NO:10或13。

2.实施方案1的淋巴细胞，其中CAR结合黑素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽。

3.实施方案1的淋巴细胞，其中所述CAR结合包含氨基酸序列SED ID NO:14的MAGE-A4肽。

4.实施方案1的淋巴细胞，其中CAR包含氨基酸序列SED ID NO:11或12。

5.实施方案1的淋巴细胞，其中CAR包含氨基酸序列SED ID NO:16或17。

6.实施方案1的淋巴细胞，其中所述细胞内结构域包含CD3 zeta、DAP10、DAP12、FcεRIγ、Fyn、Lck、Syk和Zap70的一个或多个信号结构域。

7.实施方案1的淋巴细胞，其中所述细胞内结构域进一步包含共刺激信号传导区域，所述共刺激信号传导区域包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30的共刺激分子的胞内结构域、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD40-MyD88、CD244、NKG2D、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任意组合。

8.淋巴细胞，用于治疗患有表达MAGE-A4肽的实体瘤的受试者或在受试者中刺激T细胞介导的免疫反应的方法，该方法包括：将有效量的淋巴细胞给予患有该实体的受试者瘤；其中淋巴细胞包含CAR结合MAGE-A4肽，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：8和SEQID NO：9。

9.实施方案8的淋巴细胞，其中所述细胞内结构域包含CD3 zeta、DAP10、DAP12、FcεRIγ、Fyn、Lck、Syk和Zap70的一个或多个信号结构域。

10.实施方案8的淋巴细胞，其中所述细胞内结构域还包含共刺激信号传导区域，所述共刺激信号传导区域包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30的共刺激分子的胞内结构域、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD40-MyD88、CD244、NKG2D、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任意组合。

11.实施方案8的淋巴细胞，其中所述T细胞介导的免疫反应包括释放一种或多种包含IFN-γ的细胞因子。

12.实施方案8的淋巴细胞，其中修饰的T细胞包括NK细胞、T细胞、自然杀伤T细胞、细胞毒性T淋巴细胞和/或调节性T细胞。

13.实施方案1-12中任一项的淋巴细胞，其中所述方法进一步包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含修饰细胞群，所述修饰细胞群包含结合WBC抗原的CAR。

14.根据实施例13所述的方法，其中所述WBC是B细胞。

通过参考以下示例性实施例和示例进一步描述本公开。提供这些示例性实施例和示例仅用于说明的目的，并且不旨在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

例子

如下所述，生成了编码单个CAR分子的慢病毒载体并将其转染到T细胞中。与细胞培养和建立细胞毒性T淋巴细胞检测相关的技术可以在“Control of large,establishedtumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137 domains”，PNAS，2009年3月3日，第106卷。第9期,3360–3365和“ChimericReceptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate EnhancedSurvival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo”，MolecularTherapy，2009年8月，第17卷。第8期1453–1464中找到，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。

图1显示了T细胞上CAR和CD137表达的流式细胞术结果。第0天，从健康志愿者处抽取外周血并分选以收集CD3⁺ T细胞。以1:1的比例将抗CD3/CD28 dynabeads添加到收集的T细胞中。在第1天，活化的T细胞与多个病毒载体混合感染，包括编码结合CD19的CAR(CD19CAR)(感染复数(MOI)＝15)(SEQ ID NO:5)和编码结合MAGE-A4肽的CAR(MAGE-A4 CAR)(MOI＝15)(SEQ ID NO:10)。

图2显示了与底物细胞共培养24小时后CAR T细胞上CD137表达的流式细胞术结果。H1703是一种经典的HLA-02阳性和MAGE-A4肽阳性的肿瘤细胞，K19是一种CD19阳性的细胞，HEP-G2是MAGE-A4阴性的细胞。如图2所示，MAGE-A4 CAR的CD137表达增加，说明MAGE-A4CAR T细胞与H1703共培养时被激活。图3以直方图的形式显示了图2流式细胞术的结果。图4显示了与底物细胞共培养24小时后CAR T细胞的细胞因子释放情况。如图4所示，与H1703共培养导致MAGE-A4 CAR T细胞释放了细胞因子(IL4和IFN-γ)。

图5A-5C显示了MAGE-A4 CAR T细胞在体外实验中的抗肿瘤作用。图5A通过Western Blot显示了MAGE-A4在人胚胎肾(HEK)细胞系293T和人肿瘤细胞系A375中的表达情况。图5B使用免疫荧光(IF)染色显示了MAGE-A4在293T和A375细胞系中的表达情况。图5C显示了在与A375细胞系共培养的MAGE-A4 CAR T细胞中CD137的表达情况。图6A和6B显示了与底物细胞共培养的MAGE-A4 CAR T细胞的细胞因子释放和细胞扩增情况。图6A显示了MAGE-A4 CAR T细胞的细胞因子的释放情况，包括了TNF-α、IFN-γ和Gramzyme B。图6B显示了使用CellTracing^TM分析的MAGE-A4 CAR T细胞的扩增情况。

通过向NOD scidγ(NPG^TM)小鼠皮下注射4.0×10⁶A375细胞建立肿瘤模型。植入肿瘤细胞的小鼠随机分为三组，即Mock组(n＝3)、NT组(n＝4)和CAR T组(n＝4)。分别通过尾静脉给予它们PBS、3.0×10⁶NT细胞或3.0×10⁶MAGE-A4 CAR T细胞。对小鼠状态进行监测，并通过眼眶静脉丛采血来检测外周血中T细胞的增殖和细胞因子释放情况。最终，处死小鼠并测量肿瘤大小。

图7A-7C分别显示了体内实验方案的示意图和证明MAGE-A4 CAR T具有抗肿瘤活性的体内实验结果。图7A为体内实验方案的示意图。图7B显示第21天和第28天小鼠外周血中细胞因子IFN-γ的释放情况。图7C显示通过免疫组化(IHC)染色检测的小鼠中MAGE-A4的表达情况。(抗体：CST,Inc.MAGE-A4(E7O1U)XP Rabbit mAb#824910)。图8显示了图7实验中小鼠肿瘤体积的变化情况(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示无显着差异)。

图9A和9B显示了不同共刺激结构域的MAGE-A4 CAR的抗肿瘤活性比较，包括4-1BB(MAGE-A4 4-1BB CAR)和CD28(MAGE-A4 CD28 CAR)。通过向NPG^TM小鼠皮下注射4.0×10⁶A375细胞建立肿瘤模型。将植入肿瘤细胞的小鼠随机分为三组，即Mock组(n＝3)、NT组(n＝4)、CAR T组(n＝4)。分别通过尾静脉给予MAGE-A4 4-1BB CAR T细胞或MAGE-A4 CD28CAR T细胞。监测小鼠，并且通过眼眶静脉丛采血来检测外周血中T细胞的增殖和细胞因子释放情况。最终，将小鼠处死，并测量肿瘤大小。结果表明，MAGE-A4 CD28 CAR T细胞比MAGE-A4 4-1BB CAR T细胞表现出更强的抗肿瘤活性。

表2：序列ID和相应的标识符

名称	SEQ ID:
		SP	1
铰链和跨膜结构域	2
		共刺激域	3
CD3-zeta	4
		scFv人源化CD19	5
scFv CD19	6
		WTCD3zeta	7
MAGE-A4 VL chain	8
		MAGE-A4 VH chain	9
MAGE-A4 scFv 1	10
		MAGE-A4 CAR 1(41BB)	11
MAGE-A4 CAR 2(CD28)	12
		MAGE-A4 scFv 2	13
MAGE-A4 peptide	14
		MAGE-A4 CAR 3	15
MAGE-A4 CAR 4	16
		MAGE-A4 CAR 5	17

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用的方式整体并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地和单独地指示通过引用的方式并入一样。尽管已经根据各种实施方案描述了前述内容，但本领域技术人员将理解可以在不背离其精神的情况下可以进行各种修改、替换、省略和改变。

序列表

<110> 创新细胞治疗控股有限公司

创新细胞治疗公司

<120> 靶向MAGE-A4肽的细胞/基因疗法

<130> I071-0080PCT

<150> 63/037,758

<151> 2020-06-11

<150> 63/134,313

<151> 2021-01-06

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 69

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

50 55 60

Ser Leu Val Ile Thr

65

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 5

<211> 242

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 6

<211> 242

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 7

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

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50 55 60

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Gly Ile Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gly

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

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<210> 11

<211> 481

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser

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50 55 60

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65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

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100 105 110

Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

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Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Val Met Lys Pro Gly Ala Ser Val

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Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Ile

165 170 175

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Arg

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<211> 480

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

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65 70 75 80

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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

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<210> 13

<211> 237

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Val Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

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50 55 60

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100 105 110

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130 135 140

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val

1 5 10

<210> 15

<211> 481

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Val

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50 55 60

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65 70 75 80

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Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Ser Phe Thr Tyr Trp Gly

115 120 125

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165 170 175

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Thr Ser Pro Lys Phe Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly

195 200 205

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

325 330 335

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Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

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Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

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420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg

<210> 16

<211> 481

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser

35 40 45

Ser Val Asp Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro

50 55 60

Lys Phe Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser

100 105 110

Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Val Met Lys Pro Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Ile

165 170 175

Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu

180 185 190

Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

195 200 205

Lys Ala Thr Phe Thr Ala His Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Asp Ser Asn Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

325 330 335

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Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

355 360 365

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370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

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Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg

<210> 17

<211> 482

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser

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Ser Val Asp Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro

50 55 60

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65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

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115 120 125

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130 135 140

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Val Met Lys Pro Gly Ala Ser Val

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Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Ile

165 170 175

Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu

180 185 190

Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

195 200 205

Lys Ala Thr Phe Thr Ala His Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln

210 215 220

Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Asp Ser Asn Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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370 375 380

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

405 410 415

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

435 440 445

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

450 455 460

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

465 470 475 480

Pro Arg

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly Ser linker

<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims (21)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中所述细胞外结构域包含SEQ ID NO:10或13的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CAR结合黑素瘤相关抗原4(MAGE-A4)肽。

3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CAR结合包含SED ID NO:14的MAGE-A4肽的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含SED ID NO：11或12的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含SED ID NO：16或17的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含CD3 zeta、DAP10、DAP12、FcεRIγ、Fyn、Lck、Syk、Zap70中的一个或多个信号结构域。

7.根据权利要求1所述的CAR，其中所述细胞内结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、CD40-MyD88、CD244、NKG2D、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一个或多个细胞内结构域。

8.一种组合物，其包含权利要求1-7中任一项的CAR和载体。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的CAR和药学上可接受的载体。

10.一种编码权利要求1-7中任一项所述的CAR的核酸序列。

11.一种载体，其包含编码权利要求1-7中任一项所述的CAR的核酸序列。

12.一种细胞，其包含编码权利要求1-7中任一项所述的CAR的核酸序列。

13.包含编码权利要求1-7中任一项的CAR的核酸序列的细胞群。

14.根据权利要求13所述的细胞群，其中所述细胞群包含T细胞和/或NK细胞。

15.一种药物组合物，其包含权利要求14所述的T细胞群。

16.一种在受试者中增强抗肿瘤免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求15中所述的药物组合物，从而增强抗肿瘤免疫反应。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者被诊断患有肺癌、结肠癌或膀胱癌。

18.一种在表达MAGE-A4肽的细胞群中增强免疫反应的方法，所述方法包括施加有效量的根据权利要求15中所述的药物组合物与所述细胞接触。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的免疫反应是T细胞介导的免疫反应。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述的细胞群在受试者中。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述的免疫反应是抗肿瘤免疫反应。

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