JP2024519869A - 二重特異性キメラ抗原受容体、及びそれを発現する遺伝子操作された免疫細胞 - Google Patents

Abstract

細胞外抗原結合ドメイン内に、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む二重特異性キメラ抗原受容体（二重特異性ＣＡＲ）であって、ｓｃＦｖ及びＶＨＨが、腫瘍関連抗原に結合する、二重特異性キメラ抗原受容体。そのような二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞、及び遺伝子操作された免疫細胞の治療的使用もまた、本明細書に提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１９０，４８０号の優先権の利益を主張する。

養子細胞移入療法は、自己免疫細胞又は同種免疫細胞のエクスビボ拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及びその後の患者への注入を伴う免疫療法の一種である。免疫細胞は、悪性細胞を特異的に標的とするようにエクスビボで改変されてもよい。改変には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために、Ｔ細胞の操作が含まれる。ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法などの養子細胞移入療法の有望性は、しばしば毒性（例えば、サイトカイン関連毒性）によって制限される。例えば、養子細胞移入免疫療法は、サイトカインレベルの非生理学的上昇（サイトカイン放出症候群）を引き起こし得、これは、レシピエントの死亡につながり得る（例えば、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（４）：８４３－８５１，２０１０を参照されたい）。更に、改変された免疫細胞は、患者ではうまく拡張しない場合があり、インビボでは長く持続しない場合があり、インビボでは自らの活性によって開始される細胞傷害性環境に感受性であり得る。

したがって、治療的有効性を維持又は増強しながら、これらの改変された免疫細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を改善し、ＣＡＲ－Ｔ療法に関連する毒性を低減するためのアプローチを開発することが大変興味深い。

本開示は、２つの別個の抗原又は抗原エピトープに結合する二重特異性細胞外抗原結合ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の開発に少なくとも部分的に基づいており、それによって、そのようなインビボで発現する免疫細胞の治療有効性を改善する。

いくつかの態様では、本開示は、（ａ）第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原結合部分と、（ｃ）共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｄ）細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。第１の抗原結合部分は、ＶＨＨ断片などの単一ドメイン抗体可変断片であり得、第２の抗原結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。

第１の抗原結合部分は、第１の腫瘍関連抗原に結合し、第２の抗原結合部分は、第１の腫瘍関連抗原とは異なる第２の腫瘍関連抗原に結合する。場合によっては、第１及び第２の腫瘍抗原は、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、クローディン１８．２、及びＶＥＧＦＲＩＩから選択される。具体的な例では、第１の腫瘍抗原はＣＤ１９であり、第２の腫瘍抗原はＢＣＭＡである。代替的に、第１の腫瘍抗原はＢＣＭＡであり、第２の腫瘍抗原はＣＤ１９である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドにおける第１の抗原結合部分は、ＣＤ１９に結合するＶＨＨ断片（抗ＣＤ１９ ＶＨＨ）であり、第２の抗原結合部分は、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖ（抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）である。代替的に、第１の抗原結合部分は、ＢＣＭＡへのＶＨＨ結合（抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ）であり、第２の抗原結合部分は、ＣＤ１９へのｓｃＦｖ断片結合（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）である。

いくつかの例では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列を含み得る抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む。代替的又は追加的に、二重特異性ＣＡＲは、配列番号４、５又は６のアミノ酸配列を含み得る抗ＢＣＭＡ ＶＨＨを更に含む。具体的な例では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号１１のアミノ酸配列を（例えば、細胞外二重特異性抗原結合ドメインとして）含む。

他の例では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を含み得る抗ＣＤ１９ ＶＨＨを更に含む。代替的又は追加的に、二重特異性ＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み得る抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを更に含む。そのような二重特異性ＣＡＲは、配列番号１１、１２、７１、又は７２のアミノ酸配列を含み得る。１つの具体的な例では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号１１のアミノ酸配列を（例えば、細胞外二重特異性抗原結合ドメインとして）含む。別の具体的な例では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号１２のアミノ酸配列を（例えば、細胞外二重特異性抗原結合ドメインとして）含む。

他の態様では、本開示は、（ａ）ＢＣＭＡに結合するＡＰＲＩＬの切断断片である第１の抗原結合部分と、（ｂ）腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合する単一ドメイン抗体可変断片（ＶＨＨ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である第２の抗原結合部分と、（ｃ）共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｄ）細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。

場合によっては、ＢＣＭＡに結合するＡＰＲＩＬの切断断片は、配列番号５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。具体的な例では、ＡＰＲＩＬの切断断片は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。代替的又は追加的に、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ又は抗ＣＤ１９ ＶＨＨである。いくつかの例では、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖであり、これは、配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ１９ ＶＨＨであり、これは、配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含み得る。具体的な例では、二重特異性ＣＡＲは、配列番号５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を（例えば、細胞外二重特異性抗原結合ドメインとして）含み得る。

本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかは、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分との間にペプチドリンカーを更に含んでもよい。そのようなペプチドリンカーは、約４～４０アミノ酸長であってもよい。いくつかの例では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、４－１ＢＢ又はＣＤ２８からの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。代替的又は追加的に、二重特異性ＣＡＲポリペプチド内の細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ細胞質シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。具体的な例では、二重特異性ＣＡＲポリペプチドにおける細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン及びＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインの両方を含む。いくつかの例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、任意選択で、例えば、Ｃ末端に、ＳＴＡＴ結合モチーフを含むＣＤ３ｚ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。

本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを更にしてもよい。場合によっては、膜貫通ドメイン及び／又はヒンジドメインは、第１又は第２の抗原結合部分と共刺激ドメインとの間に位置し得る。いくつかの例では、膜貫通ドメイン及び／又はヒンジドメインは、ＣＤ８に由来する。

本明細書で提供される例示的な二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、配列番号６３～７０のアミノ酸配列のいずれかを含み得る。

他の態様では、本開示はまた、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子操作された免疫細胞の集団を提供する。Ｔ細胞などの遺伝子操作された免疫細胞の集団は、以下の特徴：（ａ）１つ以上の炎症誘発性サイトカインをコードする１つ以上の破壊された内因性遺伝子を有すること、及び（ｂ）炎症誘発性サイトカインを標的とする１つ以上のアンタゴニストを発現すること、のうちの１つ以上を更に含み得る。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインとしては、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン１（ＩＬ－１）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の集団は、破壊された内因性インターフェロンガンマ遺伝子、破壊された内因性ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。場合によっては、内因性インターフェロンガンマ遺伝子、内因性ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子、又はその両方が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムによって破壊される。

代替的又は追加的に、遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを発現する。いくつかの例では、ＩＬ－６アンタゴニストは、ヒトＩＬ６に特異的な抗体（抗ＩＬ６抗体）又はヒトＩＬ６Ｒに特異的な抗体（抗ＩＬ６Ｒ抗体）である。いくつかの例では、ＩＦＮγアンタゴニストは、ヒトＩＦＮγ（抗ＩＦＮγ抗体）に特異的な抗体である。場合によっては、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＦＮγ抗体、又はその両方は、ｓｃＦｖ抗体であり得る。

いくつかの例では、遺伝子操作された免疫細胞は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現する。そのような抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号１５のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現する。そのような抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み得る。更に他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現する。そのような抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの具体的な例では、本明細書に開示される抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ抗体のうちのいずれかを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、配列番号６３、６４、６５、又は６６のアミノ酸配列を含む二重特異性ＣＡＲを更に発現し得る。

いくつかの例では、遺伝子操作された免疫細胞は、抗ＩＬ６ ｓｃＦｖを発現し、抗ＩＬ６ ｓｃＦｖは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み得る。他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、抗ＩＬ６ ｓｃＦｖを発現し、抗ＩＬ６ ｓｃＦｖは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み得る。更に他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、抗ＩＬ６ ｓｃＦｖを発現し、抗ＩＬ６ ｓｃＦｖは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み得る。

代替的に、遺伝子操作された免疫細胞は、抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖを発現し、抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み得る。他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖを発現し、抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み得る。更に他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖを発現し、抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み得る。

具体的な例では、遺伝子操作された免疫細胞は、配列番号３４、３５、３６、又は３７のアミノ酸配列を含む抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ又は抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖを発現し得る。

いくつかの例では、ＩＬ－１アンタゴニストを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＬ－１ＲＡであり、これは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み得る。

本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞の集団は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクログラフ、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせであってもよい。場合によっては、免疫細胞は、ヒト免疫細胞である。具体的な例では、ヒト免疫細胞は、ヒトＴ細胞を含む。

更に、本開示は、本明細書に開示される免疫細胞の集団と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。

更に他の態様では、本開示は、対象における望ましくない細胞を低減又は排除するための方法を特徴とし、本方法は、治療有効量の本明細書に開示される免疫細胞の集団又はそのようなものを含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。場合によっては、対象は、がんを有するヒト患者であり、がん細胞は、第１の腫瘍関連抗原、第２の腫瘍関連抗原、又はその両方を発現するがん細胞を含む。

いくつかの例では、対象は、固形腫瘍又は血液がんを有するヒト患者である。例えば、ヒト患者は、乳がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、前立腺がん、卵巣がん、中皮腫、結腸がん、又は胃がんであり得る固形腫瘍を有し得る。他の例では、ヒト患者は、白血病、リンパ腫、又は多発性骨髄腫であり得る血液がんを有し得る。

また本開示の範囲内にあるのは、本明細書にも開示される標的疾患（例えば、がん）の治療で使用するための本明細書に記載される免疫細胞の集団及び薬学的組成物、並びにがんなどの標的疾患の治療に使用するための医薬品を製造するためのそのような免疫細胞集団及び薬学的組成物の使用である。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。

二重特異性ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン内の抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖ及びＶＨＨ）のタンデム配列を有する二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドの例示的な設計を示す概略図である。 例示的な抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ、及び任意選択で例示的な抗ＩＬ６ ｓｃＦｖを分泌する二重特異性抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容するＡＬＬ患者の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞拡大及びＩＦＮγのレベルを示す図を含む。図２Ａ：例示的な抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを分泌する二重特異性抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ Ｔ細胞を受けるＡＬＬ患者からのＣＡＲ＋Ｔ細胞発現。図２Ｂ：ＡＬＬ患者における末梢ＩＦＮγレベル。図２Ｃ：例示的な抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ及び例示的な抗ＩＬ６ ｓｃＦｖを分泌する二重特異性抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容するＡＬＬ患者の末梢血中のＩＦＮγのレベル。 難治性及び再発性多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断され、二重特異性抗ＣＤ１９ ＶＨＨ ｓｃＦｖ／抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ ＣＡＲ単独で、又は抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖと組み合わせて発現する遺伝子操作Ｔ細胞で処置された患者の末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞拡大及びＩＦＮγのレベルを示す図を含む。図３Ａ及び３Ｃ～３Ｄ：二重特異性ＣＡＲ及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現する遺伝子操作されたＴ細胞で処置された患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞拡張。図３Ｂ：二重特異性ＣＡＲ及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現する遺伝子操作されたＴ細胞で処置された例示的な患者におけるＩＦＮγの血中レベル。図３Ｅ：二重特異性ＣＡＲを発現するが、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現しない遺伝子操作されたＴ細胞で処置された患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞拡張。 二重特異性抗ＣＤ１９ ＶＨＨ ｓｃＦｖ／抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ ＣＡＲを単独で、又は抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖと組み合わせて発現する遺伝子操作されたＴ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す図を含む。図４Ａ：Ｎａｌｍ６細胞の標的化。図４Ｂ：ＭＭ１Ｓ細胞の標的化。図４Ｃ：ＲＰＭＩ ８２２６細胞の標的化。

養子細胞移入免疫療法は、がんなどの疾患細胞を排除するために免疫細胞活性化及びサイトカイン分泌に依存する。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者において常に十分に拡大又は活性化するとは限らない。

本開示は、例えば、複数の腫瘍関連抗原又は腫瘍関連抗原の複数の部分を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の開発によって、それによりインビボでの治療有効性を改善することによって、現在の養子型ＣＡＲ－Ｔ療法に関連する制限を克服することを目的とする。場合によっては、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲ中の複数の抗原結合部分は、単一ドメイン抗体フォーマット（例えば、ＶＨＨ）及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）フォーマットの組み合わせであり得る。

ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデムフォーマットを含む二重特異性ＣＡＲは、場合によっては、２つのｓｃＦｖ結合部分間の干渉によって引き起こされ得るＣＡＲ発現問題を示したことが観察された。理論に束縛されるものではないが、ＶＨＨ／ｓｃＦｖ二重特異性ＣＡＲフォーマットは、この潜在的なＣＡＲ表現問題を解決するように設計されている。これまでに試験したＶＨＨ／ｓｃＦｖフォーマットの例示的な二重特異性ＣＡＲは全て、免疫細胞において十分な発現を示した。本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、炎症誘発性サイトカインのアンタゴニストを発現するように操作された追加の遺伝子改変、炎症誘発性サイトカインの内因性遺伝子を破壊するように操作された追加の遺伝子改変、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

Ｉ．二重特異性キメラ抗原受容体
いくつかの態様では、本開示は、２つの異なる腫瘍関連抗原又は腫瘍関連抗原の２つの異なる抗原エピトープ（同じ抗原内にあり得る）に結合することができる二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

ＣＡＲは、目的の標的抗原（例えば、腫瘍細胞抗原）に対する結合特異性を有し、そのような標的抗原への結合の際に免疫発現において免疫応答を引き起こすことができる、人工的（非自然発生の）受容体である。ＣＡＲは、多くの場合、少なくとも細胞内シグナル伝達ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含む。Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４，２０１０。本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲは、異なる標的抗原又は異なる抗原エピトープに対して特異性を有する２つの抗原結合部分（すなわち、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分）を含む。場合によっては、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲは、細胞外ドメインとして２つの抗原結合部分と、１つ以上のシグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを含み得る細胞内ドメインと、を含む単一のポリペプチドであり得る。細胞外ドメイン及び細胞内ドメインは、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、又はそれらの組み合わせを介して連結されてもよい。

いくつかの例では、柔軟なペプチドリンカー、例えば、Ｇ／Ｓリッチリンカーを使用して、２つの隣接する機能ドメイン、例えば、２つの抗原結合部分を接続してもよい。例えば、Ｇ／Ｓリッチリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎを含んでもよく、このｎは、１、２、３、４、５、又は６である。例示的なＧ／Ｓリッチリンカーとしては、Ｇ_４Ｓ（配列番号７５）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号７６）、又は及び（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号７７）が挙げられる。別の例では、柔軟なペプチドリンカーは、ＥＡＡＡＫ（配列番号７４）のモチーフを含み得る。そのようなペプチドリンカーは、モチーフの１つ以上のコピー、例えば、モチーフの１、２、３、４、５、又は６つのコピーを含有してもよい。

本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲの例示的な設計は、図１に見出すことができる。

（ａ）二重特異性細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、２つの目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原、別名、がん抗原）又は２つの抗原エピトープに特異的である。本明細書で使用される場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、非腫瘍細胞又は他の種類の腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞又は特定の種類の腫瘍細胞上でレベルの上昇を示す抗原である。

細胞外抗原結合ドメインは、目的の２つの抗原（例えば、２つの腫瘍関連抗原）又は目的の抗原の２つの抗原エピトープに結合することができる第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含む。また、目的の抗原は、様々な種類のがんに対する有望な免疫療法の標的抗原として特定されている細胞上に発現された任意の天然分子であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチドの第１の抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体フォーマット、例えば、重鎖のみ抗体断片（ＶＨＨ）であり得、第２の抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）フォーマットであり得る。

ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体は、単一のモノマー可変抗体ドメインを含有する抗体の一種である。そのような抗体は、アルパカ重鎖ＩｇＧ抗体に由来し得る。代替的に、特定の標的抗原に結合することができるＶＨＨ抗体は、従来の方法、例えば、抗体ライブラリスクリーニングを介して単離され得る。

ｓｃＦｖ断片は、可塑性ペプチドリンカーによって連結された重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含有する。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、ＶＨからＶＬへの配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）にあり得る。代替的に、ｓｃＦｖは、ＶＬからＶＬへの配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）にあり得る。ｓｃＦｖ断片のＶＨ及びＶＬドメイン（又は本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドにおける任意の２つの隣接する機能ドメイン）を接続するために使用するための柔軟なペプチドリンカーは、Ｇ／Ｓリッチペプチドリンカーであり得、これは、融合ポリペプチドにおいて当技術分野において一般的に使用される。例示的なペプチドリンカーを、以下の配列表２に提供する。

ＶＨＨ及びｓｃＦｖは、２つの機能ドメインを接続するために当該技術分野において一般的に使用される、Ｇ／Ｓペプチドリンカーなどの柔軟なペプチドリンカーを介して接続され得る。場合によっては、細胞外ドメインは、ＶＨＨからｓｃＦｖへの配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）であり得る。代替的に、細胞外ドメインは、ｓｃＦｖからＶＨＨへの配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）であり得る。図１に示される例示的な構成を参照されたい。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、２つの腫瘍関連抗原に結合し得る。腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、セプラーゼ（ＦＡＰとしても知られる）、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、クローディン１８．２、及びＶＥＧＦＲＩＩが挙げられる。

他の例では、標的腫瘍抗原のうちの１つは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）上で発現する表面発現タンパク質分解酵素であるＦＡＰである。ＦＡＰは、前立腺、肺及び膵臓がん、並びに中皮腫などのがんの間質微小環境の主要な構成要素とみなされる。更に、ＦＡＰは、正常組織と比較して、患者腫瘍及び患者由来膠芽腫培養物の大部分において一貫して過剰発現していた。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９及びＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする。いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメインは、ＶＨＨフォーマットの抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン（抗ＣＤ１９ ＶＨＨ）を含む。抗ＣＤ１９ ＶＨＨ断片の例は、配列表１（配列番号１～３）に提供されている。例えば、Ｓ．Ｒ．Ｂａｎｉｈａｓｈｅｍｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｒａｎ Ｊ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２１（５）：４５５－４６４，２０１８）、及びＣＮ１０５３８４８２５８に記載されており、これらの関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる。代替的に、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットの抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）を含む。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの例もまた、配列表１（配列番号７～９、７１）に提供されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１３５３３５も参照されたい。いくつかの例では、抗ＣＤ１９ ＶＨＨ又は抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、例えば、同じ重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、配列表１に提供される例示的な抗ＣＤ１９ ＶＨＨ又は例示的な抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに由来し得る。Ｋａｂａｔ定義に基づいて決定される、配列表１に列挙される例示的な抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、太字であり、下線が引かれている。

ＣＤ１９及びＢＣＭＡを標的とする二重特異性ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＶＨＨフォーマットの抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ）を含み得る。抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ断片の例は、配列表１（配列番号４～６）に提供されている。ＷＯ２０１８／２３７０３７（その関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる）も参照されたい。代替的に、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフォーマットの抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）を含む。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖの例もまた、配列表１（配列番号１０～１２、７２）に提供されている。いくつかの例では、抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ又は抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、例えば、同じ重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、配列表１に提供される例示的な抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ又は例示的な抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖに由来し得る。Ｋａｂａｔ定義に基づいて決定される、配列表１に列挙される例示的な抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、太字であり、下線が引かれている。

本明細書に記載の抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、抗ＣＤ１９ ＶＨＨ結合部分及び抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ結合部分を含み得、これらは、任意の好適な配向、例えば、抗ＣＤ１９ ＶＨＨ／抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端に向かう）又は抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ１９ ＶＨＨ（Ｎ末端からＣ末端に向かう）であり得る。抗ＣＤ１９ ＶＨＨ及び抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ断片は、柔軟なペプチドリンカー、例えば、配列表１及び配列表２に提供されるものを介して連結され得る。代替的に、本明細書に記載の抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ結合部分及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ結合部分を含み得、これらは、任意の好適な配向、例えば、抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端に向かう）又は抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ／抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ（Ｎ末端からＣ末端に向かう）であり得る。抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ及び抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ断片は、可柔軟なペプチドリンカー、例えば、配列表１及び配列表２に提供されるものを介して連結され得る。

いくつかの例では、本明細書に記載の抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、（ａ）配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、（ｂ）配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＶＨＨと、を含む。

いくつかの例では、本明細書に記載の抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、（ａ）配列番号ＮＯ：１、２、又は３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ＶＨＨと、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖと、を含む。

ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方を標的とする、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲの例示的な細胞外ドメインは、配列表１に提供される配列番号１１、１２、７１、及び７２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、（ａ）ＢＣＭＡに結合する切断されたＡＰＲＩＬ断片（例えば、ＡＰＲＩＬ（Ｕｎｉｐｒｏｔ０７５８８８）のカノニカル配列の塩基１１６～２５０、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｂｌｏｏｄ，１３１（７）：７４６－７５８）、及び（ｂ）例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＶＨＨ又は抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖのいずれかなどのＶＨＨ又はｓｃＦｖフォーマットのＣＤ１９に結合する抗原結合部分を含み得る（配列表１を参照）。ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）は、ＢＣＭＡ及び膜貫通活性剤、並びにカルシウム調節剤及びシクロフィリンリガンド（ＴＡＣＩ）のための天然の高親和性リガンドである。ＡＰＲＩＬはＴＮＦＳＦ１３としても知られている。ＡＰＲＩＬのアミノ末端は、プロテオグリカンに結合するが、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩとの相互作用には関与しない。場合によっては、切断されたＡＰＲＩＬ断片（ｔｒＡＰＲＩＬ）が、ＢＣＭＡに結合するための天然に存在するヒトＡＰＲＩＬの残基１１６～２５０を含み得る（例えば、からなる）が、プロテオグリカン結合活性を有さない（例えば、からなる）。一例では、ｔｒＡＰＲＩＬは、野生型ＡＰＲＩＬ分子からのＮ末端１１５アミノ酸を欠いている。米国特許第１０，１６０，７９４号を参照されたい（その関連開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により組み込まれる）。一例として、二重特異性ＣＡＲを作製するためのｔｒＡＰＲＩＬは、配列番号５８として記載することができる。代替的に、ｔｒＡＰＲＩＬ断片は、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％の同一性であってよく、ＢＣＭＡに結合する。ＢＣＭＡ結合は、当技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、米国特許第１０，１６０，７９４号に記載されるように、決定され得る。

いくつかの例では、抗ＣＤ１９部分は、例えば、配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列を含む、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖであり得る。代替的に、抗ＣＤ１９部分は、例えば、配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含む、抗ＣＤ１９ ＶＨＨであり得る。抗ＣＤ１９部分は、柔軟なペプチドリンカー、例えば、本明細書に開示されるもの（例えば、配列番号５７又は７３）を介して、ｔｒＡＰＲＩＬに連結されてもよい。場合によっては、抗ＣＤ１９部分は、ｔｒＡＰＲＩＬに対してＮ末端部分に位置し得る。代替的に、ｔｒＡＰＲＩＬは、抗ＣＤ１９部分に対してＮ末端部分に位置し得る。ｔｒＡＰＲＩＬ含有二重特異性細胞外ドメインの例としては、配列番号５９、６０、６１、及び６２が挙げられる。

（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかは、共刺激ドメインを更に含んでもよい。共刺激ドメインのための非限定的な供給源としては、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２が挙げられる。したがって、ＣＡＲは、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２、又はそれらの任意の組み合わせに由来する共刺激ドメインを有し得る。いくつかの例では、二重特異性ＣＡＲは、例えば、ヒト４－１ＢＢからの共刺激受容体４－１ＢＢ（別名ＣＤ１３７）に由来する共刺激ドメインを含み得る。４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインの一例は、アミノ酸配列の配列番号３９を含む（例えば、それからなる）。

代替的又は追加的に、二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなどのＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインを更に含み得る。例示的なＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとしては、配列番号４３を含む（例えば、それからなる）断片が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、例えば、そのＣ末端部分に連結されたＳＴＡＴ結合モチーフを挿入するように改変され得る。ＳＴＡＴ３結合モチーフは、アミノ酸配列ＹＸ_１Ｘ_２Ｑを有してよく、Ｘ_１及びＸ_２は、各々独立してアミノ酸である。特に、ＹＸ_１Ｘ_２Ｑモチーフは、ＹＲＨＱ（配列番号４１）であり得る。いくつかの例では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＳＴＡＴ３結合モチーフを含有するＣＡＲ構築物中の断片は、配列番号４２のアミノ酸配列を含んでもよい（例えば、それからなってもよい）。

場合によっては、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβシグナル伝達ドメインを更に含んでもよく、これは、任意選択で、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢからのものなどの追加の共刺激ドメイン、又はそれらの組み合わせと組み合わせてもよい。理論に束縛されるものではないが、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインの存在は、そのようなものを含む二重特異性ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの持続性を大幅に改善する。ＩＬ２Ｒβは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）のβ鎖である。ＩＬ－２Ｒβシグナル伝達ドメインは、ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒ相互作用によって媒介されるシグナル伝達経路を引き起こすことができるＩＬ２Ｒβポリペプチド内の断片（例えば、ヒトなどの好適な種の）を指す。ＩＬ－２Ｒβポリペプチド及びそのシグナル伝達ドメインは、当該技術分野において既知である。例えば、ヒトＩＬ－２Ｒβポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿０００８６９．１（その内容が、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。他の種に由来するＩＬ－２Ｒβポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫなどの公に利用可能な遺伝子データベースから得ることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドにおいて使用されるＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上）同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインは、配列番号４０を含む（例えば、それからなる）。

２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３の場合のように修正された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行い、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムの利用時には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。

（ｃ）その他のＣＡＲ構成成分
本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかは、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、ヒンジドメイン、又は両方を更に含んでもよい。いくつかの例では、ＴＭＤは、細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し得る。図１を参照されたい。代替的又は追加的に、ヒンジドメインは、細胞外抗原結合ドメインとＴＭＤとの間、ＴＭＤと細胞内シグナル伝達ドメインとの間、及び細胞内シグナル伝達ドメインが１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、又は細胞質シグナル伝達ドメインの組み合わせを含む場合、細胞内シグナル伝達ドメイン内に位置し得る。二重特異性ＣＡＲポリペプチド構築物で一般的に使用されるいかなるＴＭＤ及び／又はヒンジドメインも、ここで使用することができる。米国特許第１０，１６０，７９４号を参照されたい。

いくつかの例では、ＴＭＤは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のアルファ、ベータ又はゼータ鎖の細胞表面受容体などの好適な細胞表面受容体から得ることができる。いくつかの例では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＩｇＤ、又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４などのＩｇＧのものであり得る。米国特許第１０，１６０，７９４号を参照されたい。一例では、ＴＭＤは、ヒトＣＤ８ａのものであってもよく、例えば、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるヒトＣＤ８Ａのものであり得る。

いくつかの例では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲは、ヒンジドメインを更に含んでもよく、ヒンジドメインは、二重特異性細胞外抗原結合ドメインのＣ末端、及び膜貫通ドメインのＮ末端に連結されてもよい。好適なヒンジドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＩｇＤ、又はＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に由来し得る。一例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８のものであってもよく、例えば、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるヒトＣＤ８のものであり得る。場合によっては、ＴＭＤ及びヒンジドメインは、本明細書に開示されるものなどの柔軟なペプチドリンカーを介して接続され得る。

二重特異性ＣＡＲポリペプチドの構築に使用するための任意の成分は、天然に存在するタンパク質（例えば、免疫細胞受容体などの細胞受容体、例えば、本明細書に開示されるもの）の断片であり得る。代替的に、ＣＡＲ成分は、野生型の対応物のバリアントであり得、野生型の対応物と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、実質的に同じ生体活性を維持し得る。場合によっては、バリアントは、野生型の対応物と比較して最大１５個（例えば、最大１２、１０、８、６、５、４、３、２、又は１個）のアミノ酸置換を含有し得る。いくつかの例では、１つ以上のアミノ酸残基の置換は、保存的アミノ酸残基の置換である。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法をコンパイルする参照文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出されるような、当業者に既知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（（ａ）Ａ→Ｇ、Ｓ；（ｂ）Ｒ→Ｋ、Ｈ；（ｃ）Ｎ→Ｑ、Ｈ；（ｄ）Ｄ→Ｅ、Ｎ；（ｅ）Ｃ→Ｓ、Ａ；（ｆ）Ｑ→Ｎ；（ｇ）Ｅ→Ｄ、Ｑ；（ｈ）Ｇ→Ａ；（ｉ）Ｈ→Ｎ、Ｑ；（Ｊ）Ｉ→Ｌ、Ｖ；（ｋ）Ｌ→Ｉ、Ｖ；（ｌ）Ｋ→Ｒ、Ｈ；（ｍ）Ｍ→Ｌ、Ｉ、Ｙ；（ｎ）Ｆ→Ｙ、Ｍ、Ｌ；（ｏ）Ｐ→Ａ；（ｐ）Ｓ→Ｔ；（ｑ）Ｔ→Ｓ；（ｒ）Ｗ→Ｙ、Ｆ；（ｓ）Ｙ→Ｗ、Ｆ；及び（ｔ）Ｖ→Ｉ、Ｌ。

（ｄ）例示的な二重特異性ＣＡＲポリペプチド
本明細書に開示される例示的な二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、第１の抗原結合部分、柔軟なペプチドリンカー（例えば、配列番号５７）、第２の抗原結合部分、ヒンジドメイン（例えば、配列番号５３などのＣＤ８ヒンガー）、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号３８などのＣＤ８膜貫通ドメイン）、共刺激ドメイン（例えば、配列番号３９などの４－１ＢＢ共刺激ドメイン）、ＩＬ２Ｒｂシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号４０）、及び細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号４２又は４３などのＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン）を含み得る。場合によっては、二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、Ｎ末端にシグナルペプチド、例えば、配列表１（配列番号４５～５２）に提供される例示的なシグナルペプチドを更に含み得る。

いくつかの例では、二重特異性ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ１９及びＢＣＭＡに特異的であり、上記の成分を含む。例としては、配列番号６４、６６、６８、又は７０（成熟ポリペプチド）及び配列番号６３、６５、６７、又は６９（Ｎ末端シグナルペプチドを含む）が挙げられる。

ＩＩ．二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞
一態様では、本開示は、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供する。免疫細胞の集団は、１つ以上の破壊された内因性炎症誘発性サイトカイン遺伝子を更に含み得る。本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物体内から自然に由来することを指す。代替的又は追加的に、二重特異性ＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、炎症誘発性サイトカインを標的とする１つ以上のアンタゴニスト（例えば、外因性）を更に発現し得る。そのような遺伝子操作された免疫細胞は、インビボで炎症誘発性サイトカインによって媒介されるシグナル伝達を阻害していたであろう。場合によっては、本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞は、インビボで２つ以上のサイトカインシグナル伝達の阻害を示し得る。

本開示の目的のために、「アンタゴニスト」という用語は、標的タンパク質自体、標的タンパク質の生物学的活性、又は生物学的活性の結果が、任意の有意義な程度、例えば、少なくとも２０％、５０％、７０％、８５％、９０％、又はそれ以上で実質的に無効化、減少、又は中和される、全ての識別された用語、タイトル、及び機能的状態並びに特徴を包含することが明確に理解されるであろう。

炎症誘発性サイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ２、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ｓＩＬ－１ＲＩ、ｓＩＬ－２Ｒα、ｓＩＬ６Ｒ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＭＩＰα、ＭＩＰβ、ＣＳＦ１、ＬＩＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、エオタキシン、ＴＮＦ、ＭＣＰ１、ＭＩＧ、ＲＡＧＥ、ＣＲＰ、アンジオポエチン－２、ＶＷＦ、ＴＧＦα、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、パーフォリン、グランザイム、及びフェリチンが挙げられる。場合によっては、炎症誘発性サイトカインとしては、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

Ａ．免疫細胞
任意の免疫細胞は、本明細書に記載の細胞を操作するために使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば、限定されないが、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞であり得る。他の実施形態では、免疫細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）の集団の分化に由来する。

本明細書に開示される操作された細胞を作製するために有用な免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせであってもよい。Ｔ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。一例では、免疫細胞は、ヒト免疫細胞である。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、対象、例えば、ヒト対象から直接採取され得る。細胞は、本明細書に記載されるように遺伝子改変され、遺伝子操作された免疫細胞は、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法において、同じ対象に再び注入される。この場合、遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける対象に自己由来である。別の実施形態では、免疫細胞は、ドナー対象から直接採取され、改変され、遺伝子操作された免疫細胞は、療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を必要とするレシピエント対象に注入され得る。ドナー免疫細胞は、レシピエント対象にＨＬＡマッチングされ、すなわち、細胞は、レシピエント対象に同種異系である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、対象の末梢血から採取され、本明細書に開示される遺伝子改変の前にインビトロで拡大される。

Ｂ．炎症誘発性サイトカインのアンタゴニスト
場合によっては、本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞は、炎症誘発性サイトカイン、例えば、本明細書に開示されるものに対する１つ以上のアンタゴニストを発現するように操作され得る。いくつかの例では、アンタゴニストは、ＩＬ－６アンタゴニスト抗体、例えば、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、又は抗ｇｐ１３０抗体である。代替的又は追加的に、遺伝子操作された免疫細胞は、１つ以上のＩＬ－１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１ＲＡ又は当該技術分野において既知であるか、又は本明細書に開示されている他のものを更に含み得る。代替的又は追加的に、遺伝子操作された免疫細胞は、１つ以上のＩＦＮγアンタゴニスト、例えば、アンタゴニストＩＦＮγ抗体又は当該技術分野において既知であるか、又は本明細書に開示されている他のものを発現するように操作されてもよい。

本明細書に開示されるような典型的な抗体分子は、通常抗原結合に関与する重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られる、より保存された領域が点在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても知られる超可変領域へと更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当該技術分野において既知の方法論を使用して、例えば、当該技術分野において周知であるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／又は接触定義によって正確に特定することができる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８、及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。また、英国の医療研究評議会（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）におけるヒトゲノムマッピングプロジェクトリソース（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、並びにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイト（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｇｒｏｕｐ ｗｅｂｓｉｔｅ）に記載されている抗体ルールも参照されたい。

本明細書で使用される抗体（複数形で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的タンパク質、例えば、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクト（例えば、完全長）抗体及び重鎖抗体（例えば、アルパカ重鎖ＩｇＧ抗体）だけでなく、その抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；ＶＨＨ）（ナノボディとしても知られている）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合改変抗体を含む、必要な特異性の抗原認識部位を含む任意の他の改変された構成も包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（若しくはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、５つの主要な分類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々の分類のサブユニット構造及び三次元構造は、周知である。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質又はその受容体に「結合する」本明細書に記載の抗体は、標的タンパク質又は受容体に特異的に結合し得る。標的又はエピトープに「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当該技術分野においてよく理解されている用語であり、かかる特異的結合を決定する方法も当該技術分野において周知である。分子は、代替の標的と比較して、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又は特定の標的抗原とより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的結合」を示すと言われている。抗体は、他の物質と結合するよりも、より大きい親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合、標的サイトカインと「特異的に結合する」。例えば、ＩＬ－６又はＩＬ－６Ｒエピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、他のＩＬ－６エピトープ、非ＩＬ－６エピトープ、他のＩＬ－６Ｒエピトープ、又は非ＩＬ－６Ｒエピトープに結合するよりも、より大きい親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で、このＩＬ－６エピトープ又はＩＬ－６Ｒエピトープに結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的若しくは優先的に結合し得るか、又は結合しない場合があることも理解される。したがって、「特異的結合」又は「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（ただし、それを含むことができる）。一般に、しかし必ずしもそうではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。

本明細書に記載の抗体は、マウス、ラット、ヒト、又は任意の他の起源（キメラ若しくはヒト化抗体を含む）であり得る。そのような抗体は、非自然発生であり、例えば、ヒトによる行為（例えば、そのような動物に所望の抗原又はその断片を免疫化すること）がなければ、動物において産生されないであろう。

本明細書に記載の抗体のうちのいずれかは、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は、不均一な抗体集団を指す。これらの２つの用語は、抗体の供給源又はそれが作製される様式を限定しない。

一例では、本明細書に記載の方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその抗原結合断片である非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得るが、抗体の性能を更に精製及び最適化するために含まれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域又はドメインの少なくとも一部も含むであろう。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように改変されたＦｃ領域を有し得る。他の形態のヒト化抗体は、１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、及び／又は６つ）を有し、これは元の抗体に関して変化させられ、これは、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも称される。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴い得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の標的タンパク質の拮抗性抗体は、標的タンパク質（例えば、ヒトＩＬ－６、ヒトＩＬ－６Ｒ、若しくはヒトＩＦＮγ）又はその抗原エピトープに対して好適な結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数又はＫＡを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載の拮抗性抗体は、標的抗原又は抗原エピトープに対して少なくとも１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有し得る。増加した結合親和性は、減少したＫＤに対応する。第２の抗原と比較して、第１の抗原に対する抗体の高い親和性結合は、第２の抗原に結合するためのＫＡ（又はＫＤの数値）よりも、第１の抗原に結合するためのより高いＫＡ（又はＫＤのより小さい数値）によって示され得る。そのような場合、抗体は、第２の抗原（例えば、第２のコンフォメーション又はその模倣物中の同じ第１のタンパク質、又は第２のタンパク質）と比較して、第１の抗原（例えば、第１のコンフォメーション又はその模倣物中の第１のタンパク質）に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拮抗性抗体は、前駆体形態の標的タンパク質又は別のタンパク質、例えば、標的タンパク質と同じファミリーの炎症性タンパク質への結合親和性と比較して、成熟形態の標的タンパク質へのより高い結合親和性（より高いＫＡ又はより小さなＫＤ）を有する。（例えば、特異性又は他の比較のための）結合親和性の差は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、又は１０^５倍であり得る。

結合親和性（又は結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、又は分光法（例えば、蛍光アッセイを使用する）を含む、様々な方法によって決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）中である。これらの技術は、標的タンパク質濃度の関数として結合した結合タンパク質の濃度を測定するために使用することができる。結合した結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、一般に、以下の方程式：
［Ｂｏｕｎｄ］＝［Ｆｒｅｅ］／（Ｋｄ＋［Ｆｒｅｅ］）によって遊離標的タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度に関連付けられる。

しかし、時には、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される、ＫＡに比例する親和性の定量的測定値を得ることで十分であり、したがって、より高い親和性が、例えば、２倍高いかどうかを決定するなどの比較に使用して、親和性の定性的測定値を取得するか、又は例えば、機能アッセイ、例えば、インビトロ又はインビボアッセイにおける活性によって、親和性の推論を取得することができるために、ＫＡの正確な決定は必ずしも必要ではない。

いくつかの例を、以下に提供する。

（ａ）ＩＬ６シグナル伝達を標的とするアンタゴニスト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子操作された免疫細胞はまた、ＩＬ－６アンタゴニストを発現してもよい。

ＩＬ－６は、膜糖タンパク質ｇｐ１３０及びＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を含む複合体を通してシグナル伝達する（例えば、Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６３（６）：１１４９－５７，１９９０を参照されたい）。標的細胞上のＩＬ－６Ｒに結合するＩＬ－６は、ｇｐ１３０ホモ二量体化及びその後のシグナル伝達を促進する。本明細書で使用される場合、ＩＬ－６Ｒは、ＩＬ－６Ｒの膜結合形態及び可溶性形態（ｓＩＬ－６Ｒ）の両方を含む。ＩＬ－６に結合した場合、可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ）は、アゴニストとして作用し、ｇｐ１３０の二量体化及びシグナル伝達を促進することもできる。トランスシグナル伝達（ｔｒａｎｓ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は、特定の細胞型によるｓＩＬ－６Ｒ分泌が、ｇｐ１３０のみを発現してＩＬ－６に応答する細胞を誘導することによって生じ得る（例えば、Ｔａｇａｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：７９７－８１９，１９９７、及びＲｏｓｅ－Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３００（Ｐｔ２）：２８１－９０，１９９４を参照されたい）。一例では、ｓＩＬ－６Ｒは、ヒトＩＬ－６Ｒの細胞外ドメインを含む（例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１８３（４）：１３９９－４０６，１９９６を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変された免疫細胞は、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体（ｇｐ１３０を含む、ＩＬ－６Ｒ）に結合する抗体であり得るＩＬ－６アンタゴニストを発現する。そのような抗体（拮抗性抗体）は、免疫細胞上のＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒの結合を妨げ、それによってＩＬ－６によって媒介される細胞シグナル伝達を抑制することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ－６拮抗性抗体は、ＩＬ－６シグナル伝達に結合し、それを少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）阻害することができる。本明細書に記載のＩＬ－６拮抗性抗体の阻害活性は、当該技術分野において既知の日常的な方法によって決定することができる。

例示的な抗ＩＬ－６抗体及び抗ＩＬ－６Ｒ抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）は、太字で示されるＣＤＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイトによって記載される抗体ルールに従って決定される）を伴って以下に提供される（参照抗体１～６）。

抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、及び抗ｇｐ１３０抗体を含む、ＩＬ－６シグナル伝達経路を阻害する例示的な抗体が配列表１（ＡＢ１～ＡＢ６、及びＩＬ６アンタゴニストｓｃＦｖ１－ｓｃＦｖ４）に提供され、これらの全てが本開示の範囲内である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－６拮抗性抗体は、本明細書に提供される参照抗体（例えば、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つ）のうちの１つと同じＩＬ－６抗原（例えば、ヒトＩＬ－６）若しくはＩＬ－６Ｒ（例えば、ヒトＩＬ－６Ｒ）内の同じエピトープに結合するか、又はＩＬ－６若しくはＩＬ－６Ｒ抗原への結合から参照抗体と競合する。本明細書で提供される参照抗体としては、抗体１～６が挙げられ、これらのそれぞれの構造的特徴及び結合活性が本明細書で提供される。本明細書に記載される参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体と全く同じエピトープ又は実質的に重複するエピトープ（例えば、３つ未満の非重複アミノ酸残基、２つ未満の非重複アミノ酸残基、又は１つのみの非重複アミノ酸残基を含有する）に結合し得る。２つの抗体が、同族抗原への結合から互いに競合するかどうかは、当技術分野において周知である競合アッセイによって決定することができる。そのような抗体は、当業者に既知であると、例えば、実質的に類似した構造的特徴（例えば、相補性決定領域）を有するもの、及び／又は当技術分野において既知のアッセイによって特定されるものとして特定され得る。例えば、競合アッセイは、参照抗体のうちの１つを使用して実施して、候補抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、又はＩＬ－６若しくはＩＬ－６Ｒ抗原へのその結合と競合するかを決定することができる。

場合によっては、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗性抗体は、本明細書に開示される参照抗体（例えば、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つ）と同じ重鎖ＣＤＲ及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲは、抗原結合を担う領域／残基であり、そのような領域／残基は、当該技術分野において既知である方法によって、参照抗体（上に示す）の重鎖／軽鎖配列のアミノ酸配列から特定することができる。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイト、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９－８１７（１９８７）、並びに当該技術分野において既知であるか、又は本明細書に開示されている他のものに記載される抗体ルールを参照されたい。抗体におけるＣＤＲ領域の決定は、当業者の技術範囲内で十分であり、例えば、本明細書に開示される方法、例えば、Ｋａｂａｔ法（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））又はＣｈｏｔｈｉａ法（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８））である。本明細書で使用されるとき、ＣＤＲは、当該技術分野において既知である任意の方法によって定義されるＣＤＲを指し得る。同じＣＤＲを有する２つの抗体は、２つの抗体が同じ方法によって決定されるそのＣＤＲの同じアミノ酸配列を有することを意味する。

本明細書に開示される例示的な抗ＩＬ－６又は抗ＩＬ－６Ｒ抗体（例えば、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つ）のうちのいずれかの機能的バリアントも本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体と実質的に類似した結合活性及び生物活性（例えば、実質的に類似した結合親和性、結合特異性、阻害活性、又はそれらの組み合わせ）を保持しながら、参照抗体と比較して、Ｖ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ、又はＨＣ ＣＤＲのうちの１つ以上及び／若しくはＬＣ ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸残基変異を含有してよい。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＩＬ－６アンタゴニスト抗体は、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つなどの参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を集合的に含有するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。「集合的」とは、３つのＨＣ ＣＤＲの全てにおけるアミノ酸変異の総数が、規定の範囲内であることを意味する。代替的又は追加的に、抗ＩＬ－６又は抗ＩＬ－６Ｒ抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を集合的に含有するＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３を含み得る。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗性抗体は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３を含み得、それらのうちの少なくとも１つは、参照抗体（例えば、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つ）の対応物のＨＣ ＣＤＲと比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有する。具体的な例では、本抗体は、参照抗体（例えば、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つ）のＨＣ ＣＤＲ３と比べて５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＨＣ ＣＤＲ３を含む。代替的又は追加的に、ＩＬ－６拮抗性抗体は、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３を含み得、それらのうちの少なくとも１つは、参照抗体の対応物のＬＣ ＣＤＲと比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有する。具体的な例では、本抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ３と比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＬＣ ＣＤＲ３を含む。

場合によっては、アミノ酸残基変異は、保存的アミノ酸残基置換であり得る。本明細書の開示を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－６拮抗性抗体は、例えば、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つの参照抗体の重鎖ＣＤＲと集合的に少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい。代替的又は追加的に、本抗体は、参照抗体の軽鎖ＣＤＲと集合的に少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％又は９８％）同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ－６拮抗性抗体は、ＡＢ１又はＡＢ２などのＡＢ１～ＡＢ６のうちのいずれか１つの参照抗体の重鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは９８％）同一である重鎖可変領域、及び／又は参照抗体の軽鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは９８％）同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。

本開示はまた、本明細書に開示される参照ＩＬ－６拮抗性抗体のうちのいずれかの生殖細胞系バリアントも提供する。生殖細胞系バリアントは、フレームワーク領域内で、対応する生殖細胞系列配列に対するその親抗体と比較して１つ以上の変異を含有する。生殖細胞系バリアントを作製するために、親抗体若しくはその一部の重鎖又は軽鎖可変領域配列（例えば、フレームワーク配列）は、抗体生殖細胞系列配列データベース（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎのバイオインフォマティクス及び計算生物学グループのウェブサイト、ｖｂａｓｅ２ウェブサイト、又はＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）のウェブサイトに記載される抗体ルール）に対するクエリとして使用して、生殖細胞系列配列と親抗体との間のフレームワーク領域のうちの１つ以上において親抗体によって使用される対応する生殖細胞系配列及びアミノ酸残基変異を識別することができる。次いで、生殖細胞系列配列に基づいて１つ以上のアミノ酸置換を親抗体に導入し、生殖細胞系バリアントを生成することができる。

いくつかの例では、本明細書に記載の拮抗性抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。代替的又は追加的に、拮抗性抗体は、ｓｃＦｖである。例示的なｓｃＦｖ抗体を、以下の配列表２に提供する。

（ｂ）ＩＬ－１アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞はまた、ＩＬ－１アンタゴニストを発現してもよい。

インターロイキン－１は、当該技術分野において既知のサイトカインであり、２つのアイソフォーム、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを含む。ＩＬ－１は、急性炎症のアップレギュレーション及びダウンレギュレーション、並びに他の生物学的経路において重要な役割を果たす。

いくつかの例では、本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞において発現されるＩＬ－１アンタゴニストは、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）であり得る。ＩＬ－１ＲＡは、免疫細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などの様々な種類の細胞によって分泌され得る、天然に存在するポリペプチドである。それは細胞表面のＩＬ－１Ｒ受容体に結合し、それによってＩＬ－１／ＩＬ－１Ｒ相互作用によって引き起こされる細胞シグナル伝達を防止する。ヒトＩＬ－１ＲＡは、ＩＬ１ＲＮ遺伝子によってコードされる。一例では、ヒトＩＬ－１ＲＡは、配列番号５４のアミノ酸配列（成熟タンパク質）を含み得る。場合によっては、ヒト－ＩＬ－１ＲＡは、Ｎ末端に、例えば、配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含み得る。

他のＩＬ－１アンタゴニストとしては、抗ＩＬ－１α又は抗ＩＬ－１β抗体が挙げられる（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ＺＬ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．１７（１）：９５－１０６）；米国特許第７，５３１，１６６号及び同第８，３８３，７７８号を参照されたい（これらの内容はそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。

（ｃ）ＩＦＮγアンタゴニスト
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＦＮγアンタゴニストを、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲと組み合わせて、任意選択で、また、本明細書に開示される１つ以上の追加の遺伝子改変と組み合わせて発現し得る。

ＩＦＮγアンタゴニストは、三元ＩＦＮγ／ＩＦＮγＲ１／ＩＦＮγＲ２の形成を遮断し得る。ＩＦＮγ Ｒ１は、リガンド結合及びシグナル伝達に必要である。ＩＦＮγアンタゴニストは、拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片、分泌型ＩＦＮγ受容体又は受容体のリガンド結合断片、及び拮抗性抗ＩＦＮγＲ抗体又はその抗原結合断片であってもよく、それにより、ＩＦＮγアンタゴニストは、ＩＦＮγ／ＩＦＮγＲ相互作用及び下流シグナル伝達を遮断する。一実施形態では、ＩＦＮγアンタゴニストは、分泌される。拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片は、インビボで放出されるＩＦＮγリガンドに結合し、したがって、ＩＦＮγリガンドは、細胞表面上に発現するその天然受容体であるＩＦＮγＲ１と相互作用することができない。分泌型ＩＦＮγ受容体又はリガンド結合断片は、デコイ受容体として機能し、インビボで放出されるＩＦＮγリガンドを捕捉し、したがって、ＩＦＮγリガンドは、細胞表面上に発現されるその天然受容体であるＩＦＮγＲ１と相互作用することもできない。一実施形態では、分泌型ＩＦＮγＲ又はリガンド結合断片は、天然ヒトＩＦＮγ受容体の細胞外部分である。拮抗性抗ＩＦＮγＲ抗体又はその抗原結合断片は、細胞上に発現されるＩＦＮγ受容体に結合し、ＩＦＮγリガンドと、この受容体との相互作用、並びに２つのＩＦＮγＲ１及び２つのＩＦＮγＲ２サブユニットを含有する完全な受容体複合体の結果として生じるリガンド誘導アセンブリを防止する。完全受容体複合体が、ＩＦＮγシグナル伝達経路に必要である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変された免疫細胞は、ＩＦＮγ拮抗性抗体を発現する。いくつかの例では、本明細書に記載されるＩＦＮγ拮抗性抗体は、ＩＦＮγシグナル伝達を、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）阻害することができる。本明細書に記載のＩＦＮγ拮抗性抗体の阻害活性は、当該技術分野において既知の日常的な方法によって決定することができる。

例示的な抗ＩＦＮγ抗体及び抗ＩＬ－６Ｒ抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）は、太字のＣＤＲ及び下線（Ｋａｂａｔ定義に基づく）を伴って以下の配列表１（参照抗ＩＦＮγ１～３）に提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＦＮγ拮抗性抗体は、本明細書に提供される参照抗体のうちの１つ（例えば、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つ）と同じＩＦＮγ抗原（例えば、ヒトＩＦＮγ）内の同じエピトープに結合するか、又はＩＦＮγ抗原への結合から参照抗体と競合する。本明細書で提供される参照抗体としては、抗ＩＦＮγ１～３が挙げられ、これらのそれぞれの構造的特徴及び結合活性が本明細書で提供される。配列表２を参照されたい。一例では、抗ヒトＩＦＮ－γ抗体は、ＡＭＧ８１１に由来してもよく、米国特許第７，３３３５，７４３号に記載されており、その関連部分は、本明細書に参照される主題及び目的のために参照により本明細書に組み込まれる。代替的に、抗ヒトＩＦＮ－γ抗体は、フォントリズマブ又はエマパルマブに由来し得る。他の拮抗性抗ＩＦＮγ抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に参照される主題及び目的のために参照によりその全体が組み込まれる米国特許第９，６８２，１４２号に見出すことができる。

場合によっては、本明細書に開示されるＩＦＮγ拮抗性抗体は、本明細書に開示される参照抗体（例えば、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つ）と同じ重鎖ＣＤＲ及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。

本明細書に開示される例示的な抗ＩＦＮγ抗体のうちのいずれか（例えば、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つ）の機能的バリアントも本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体と実質的に類似した結合活性及び生物活性（例えば、実質的に類似した結合親和性、結合特異性、阻害活性、又はそれらの組み合わせ）を保持しながら、参照抗体と比較して、Ｖ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ、又はＨＣ ＣＤＲのうちの１つ以上及び／若しくはＬＣ ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸残基変異を含有してよい。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＩＦＮγ拮抗性抗体は、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つなどの参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を集合的に含有するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。代替的又は追加的に、抗ＩＦＮγ抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を集合的に含有するＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施例では、本明細書に開示されるＩＦＮγ拮抗性抗体は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３を含み得、それらのうちの少なくとも１つは、参照抗体（例えば、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つ）の対応物のＨＣ ＣＤＲと比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有する。具体的な例では、本抗体は、参照抗体（例えば、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つ）のＨＣ ＣＤＲ３と比べて５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＨＣ ＣＤＲ３を含む。代替的又は追加的に、ＩＦＮγ拮抗性抗体は、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３を含み得、それらのうちの少なくとも１つは、参照抗体の対応物のＬＣ ＣＤＲと比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有する。具体的な例では、本抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ３と比べて、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＬＣ ＣＤＲ３を含む。

場合によっては、アミノ酸残基変異は、保存的アミノ酸残基置換であり得る。本明細書の開示を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＩＦＮγ拮抗性抗体は、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つなどの参照抗体の重鎖ＣＤＲと集合的に少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい。代替的又は追加的に、本抗体は、参照抗体の軽鎖ＣＤＲと集合的に少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％又は９８％）同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγ拮抗性抗体は、抗ＩＦＮγ１～３のうちのいずれか１つなどの参照抗体の重鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは９８％）同一である重鎖可変領域、及び／又は参照抗体の軽鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは９８％）同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。

本開示はまた、本明細書に開示される参照ＩＦＮγ拮抗性抗体のうちのいずれかの生殖細胞系バリアントも提供する。いくつかの例では、本明細書に記載の拮抗性抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。代替的又は追加的に、拮抗性抗体は、ｓｃＦｖである。例示的なｓｃＦｖ抗体を、以下の配列表２に提供する。

他の実施形態では、本明細書に開示されるＩＮＦγアンタゴニストは、可溶性ＩＦＮγＲ断片、例えば、天然ヒトＩＦＮγ受容体の細胞外部分であってもよい。例示的なＩＦＮγＲ断片は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，５７８，７０７号及び同第７，４４９，１７６号に記載されており、これらの各々の関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる。高親和性ＩＦＮγ受容体複合体は、Ｉ型膜タンパク質であるＩＦＮγＲ１（ＩＦＮγＲα）及びＩＦＮγＲ２（ＩＦＮγＲβ）の２つの型で構成されている。両方のタンパク質は、ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーであり、全体の配列同一性の約５２％を共有する。ＩＦＮγＲ１は、ＩＦＮγ結合及び受容体の内在化に必要かつ十分であるリガンド結合サブユニットである。ＩＦＮγＲ２は、ＩＦＮγシグナル伝達に必要とされるが、それ自体ではＩＦＮγとは結合しない。ヒトＩＦＮγＲ１ ｃＤＮＡは、１７ａａのシグナルペプチド、２２８ａａの細胞外ドメイン、２３ａａの膜貫通ドメイン、及び２２１ａａの細胞内ドメインを有する４９９個のアミノ酸（ａａ）残基のタンパク質をコードする。ＩＦＮγシグナル伝達に拮抗する可溶性ＩＦＮγＲ断片は、２２８ａａの細胞外ドメインを含み得る。

更に他の実施形態では、本明細書に開示されるＩＦＮγアンタゴニストは、拮抗性抗ＩＦＮγＲ抗体又はその抗原結合断片、例えば、米国特許第４，８９７，２６４号及び同第７，４４９，１７６号に記載されるものであり得、これらの関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる。

本明細書に記載のＩＦＮγアンタゴニストのうちのいずれかは、ＩＦＮγアンタゴニストのＮ末端に位置するシグナルペプチドを含んでもよく、その結果、ＩＦＮγアンタゴニストは、そのようなアンタゴニストを発現する遺伝子操作された免疫細胞によって分泌され得る。例示的なシグナルペプチドは、配列表２に提供され、そのうちのいずれも、ＩＦＮγアンタゴニストに使用することができる。

Ｃ．内因性炎症誘発性サイトカイン遺伝子の破壊
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかを発現し、任意選択で、本明細書に開示されるアンタゴニストのうちの１つ以上も発現する遺伝子操作された免疫細胞は、１つ以上の破壊された内因性炎症誘発性サイトカイン遺伝子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子及び／又はＩＦＮγ遺伝子）を有し得る。いくつかの例を、以下に提供する。

（ａ）内因性インターフェロンガンマ遺伝子の破壊
いくつかの例では、本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞は、そのような遺伝子改変を伴わない対応物の免疫細胞と比較して、減少したレベルのＩＦＮγを提供するように遺伝子操作され、例えば、対応物の免疫細胞と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低い。そのような遺伝子操作された免疫細胞によって産生されたＩＦＮγの量は、当該技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、細胞培養培地のＥＬＩＳＡアッセイ又はそのような改変された細胞で処置された患者の血液ＩＦＮγレベルによって決定され得る。

他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、そのような遺伝子組換えを有さない対応物の免疫細胞と比較して、減少したレベルのＩＦＮγＲ（例えば、ＩＦＮγＲ１）を、例えば、対応物の免疫細胞と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下させ得る。

いくつかの例では、ＩＦＮγの低下は、例えば、遺伝子編集によって、内因性ＩＦＮγ遺伝子及び／又は内因性ＩＦＮγＲ遺伝子を破壊することによって達成されてもよい。本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかを発現するそのような遺伝子操作された免疫細胞は、インビボでのＩＦＮγシグナル伝達によって媒介される限定されたサイトカイン放出症候群を有することが予想される。

遺伝子編集を含む、宿主細胞における内因性遺伝子の発現をダウンレギュレートするための当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本明細書に記載のＩＦＮγ若しくはＩＦＮγＲの発現レベルを低下させることができる。ヒトＩＦＮγ及びＩＦＮγＲ１のゲノム情報は、それぞれ、ＧＥＮＢＡＮＫ遺伝子ＩＤ：３４５８及び遺伝子ＩＤ：３４５９で見出される。

いくつかの例では、遺伝子編集方法を使用して、内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子を破壊してもよい。遺伝子編集システムは、内因性対立遺伝子における標的領域を切断することができるエンドヌクレアーゼを伴ってもよい。鋳型核酸の非相同末端結合は、ゲノム中の二本鎖切断を修復し、変異（例えば、挿入、欠失、及び／又はフレームシフト）を標的部位に導入し得る。

いくつかの例では、ノックアウトイベントは、ノックインイベントと結合することができ、所望の分子（例えば、本明細書に記載のＩＬ６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト又はＩＬ１アンタゴニスト）をコードする外因性核酸は、相同組換えと組み合わせた遺伝子編集を介してＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子のゲノム遺伝子座に挿入することができ、外因性核酸を標的ゲノム部位に挿入し、それによって、内因性標的遺伝子を破壊する。

一例では、内因性ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲ遺伝子の破壊は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集系を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子編集方法を介して達成することができる。ＩＦＮγ遺伝子を破壊するために、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対する標的部位アジュバントに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用してもよい。ｓｇＲＮＡ分子は、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合したカスタム設計の短いｃｒＲＮＡ配列の両方を含有する。ヒトＩＦＮγ遺伝子内（例えば、エクソン１内）の例示的な遺伝子標的部位、ｇＲＮＡの対応するスペーサー配列、及び例示的なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を配列表３に提供する。これらのｇＲＮＡのいずれも、ヒトＩＦＮγ遺伝子を破壊するために使用することができる。

ＩＦＮγＲ遺伝子を破壊するために、市販のＯｒｉＧｅｎｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩＦＮγＲ１ヒト遺伝子ノックアウトキット（ＣＲＩＳＰＲ）カタログ番号ＫＮ２０２７６１を使用してもよい。そのようなキットを使用する方法は、当該技術分野において既知である。

他の例では、ＩＦＮγ又はＩＦＮγＲのレベルの低下は、アンチセンス技術を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、又はＲＮＡ干渉技術を介してＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）を干渉することによって達成することができる。代替的に、リボザイムを使用して、この目標を達成してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド又は干渉ＲＮＡは、内因性標的遺伝子の標的領域に相補的な断片又はその転写物を含むオリゴヌクレオチドである。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の方法によって標的細胞に送達され得る。代替的に、レンチウイルスベクター又はその等価物などの発現ベクターを使用して、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド又は干渉ＲＮＡを発現することができる。

Ｄ．遺伝子操作された免疫細胞の集団
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲ）のうちのいずれかを発現し、例えば、炎症誘発性サイトカインを標的とする１つ以上のアンタゴニストを発現するように操作され、内因性炎症誘発性サイトカインの発現を（例えば、例えば、遺伝子編集による内因性遺伝子の破壊を介して）低減するように操作された１つ以上の追加の遺伝子組換えを含む、遺伝子操作された免疫細胞の集団である。

いくつかの例では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作された免疫細胞は、ＩＬ６シグナル伝達を阻害する拮抗性抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）、ＩＦＮγシグナル伝達を阻害する拮抗性抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）、ＩＬ１アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを更に発現し得る。そのような拮抗剤の例が、本明細書に開示される。

代替的又は追加的に、本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞は、１つ以上の炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ又はＧＭ－ＣＳＦ）をコードする１つ以上の破壊された内因性遺伝子を含み得る。遺伝子操作された免疫細胞は、目的の遺伝子、例えば、ＴＣＲ成分をコードする遺伝子、又はＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ成分をコードする遺伝子における更なる遺伝子編集を含み得る。場合によっては、本明細書に開示される拮抗剤のうちのいずれかをコードする核酸は、破壊された遺伝子座に挿入され得る。

遺伝子操作された免疫細胞の集団は、異なる遺伝子組換え又は異なる遺伝子組換えの組み合わせを有する細胞を含む、異種であり得る。例えば、集団内の細胞のサブグループは、二重特異性ＣＡＲと炎症誘発性サイトカインのアンタゴニストとを共発現し得、集団内の細胞の別のサブグループは、二重特異性ＣＡＲを発現し得、破壊された内因性標的遺伝子を有し得る。集団内の細胞は、まとめて、本明細書に開示されるような所望の遺伝子組換えの全てを有する。場合によっては、免疫細胞の集団の一部は、（ａ）ＩＬ６アンタゴニスト及び／又はＩＦＮγアンタゴニストの発現と組み合わせて、二重特異性ＣＡＲを発現し、（ｂ）二重特異性ＣＡＲを発現し、内因性ＩＦＮγ遺伝子及び／又はＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をノックダウンすることと組み合わせて、又は（ｃ）二重特異性ＣＡＲを発現し、ＩＬ６アンタゴニスト及び／又はＩＦＮγアンタゴニストを発現し、内因性ＩＦＮγ遺伝子及び／又はＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をノックダウンすることと組み合わせて、各細胞において所望される遺伝子改変の全てを示し得る。いくつかの例では、そのような部分は、本明細書に開示されるような遺伝子操作された免疫細胞の全集団の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）を構成し得る。

ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト及びＩＬ－１アンタゴニストを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する特定のノックイン及びノックアウト遺伝子組換えは、ＷＯ２０１９／１７８２５９及びＷＯ２０２０／１４６２３９に見出すことができ、これらの各々の関連開示は、本明細書に開示される目的及び主題のために参照により組み込まれる。

ＩＩＩ．遺伝子操作された免疫細胞を調製する方法
ノックイン及びノックアウト改変のうちのいずれかは、本明細書に記載の日常的な方法及び／又はアプローチによって、好適な免疫細胞に導入することができる。典型的には、そのような方法は、標的内因性炎症性タンパク質の発現をダウンレギュレートするか、目的のサイトカインアンタゴニストを発現させるか、又は目的の免疫抑制性サイトカインを発現させるかのいずれかを行うために、好適な免疫細胞内への遺伝物質の送達を伴う。

（Ａ）ノックイン改変
本明細書に記載の１つ以上の二重特異性ＣＡＲ、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストのノックインを生成するために、１つ以上の二重特異性ＣＡＲ、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、及びＩＬ－１アンタゴニストのコード配列を、好適な発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター、及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターが、挙げられるが、これらに限定されない）にクローニングし、従来の組換え技術を使用して宿主免疫細胞に導入され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。その結果、本開示の改変された免疫細胞は、少なくとも１つの二重特異性ＣＡＲ、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、又はＩＬ－１アンタゴニストをコードする１つ以上の外因性核酸を含み得る。場合によっては、そのような分子のコード配列は、細胞のゲノムに組み込まれる。場合によっては、そのような分子のコード配列は、細胞のゲノムには組み込まれない。

ノックインは、外因性核酸を宿主細胞に導入することを指す。場合によっては、外因性核酸は、宿主細胞のゲノム部位に挿入され得る（例えば、コードされた遺伝子産物の安定した発現のために）。代替的に、外因性核酸は、（例えば、コードされた遺伝子産物の一過性発現のために）染色体外に存在し得る。

目的のコード配列を含む外因性核酸は、更に、コード配列に作動可能に連結し得る好適なプロモーターを含み得る。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して（例えば、サイトカインアンタゴニストのために）コードＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を開始することができる核酸上のヌクレオチド配列（部位）を指し、その後、それは対応するタンパク質に翻訳される（すなわち、遺伝子の発現）。プロモーターは、コード配列に対して正しい機能的位置及び方向にあり、そのコード配列の転写開始及び発現を制御する（「駆動する」）（対応するタンパク質分子を生成する）場合、コード配列に「作動可能に連結されている」とみなされる。場合によっては、本明細書に記載のプロモーターは、他の調節因子に依存しない転写を開始する、構成的であり得る。いくつかの例では、本明細書に記載のプロモーターは、転写の調節因子に依存する、誘導性であり得る。例示的なプロモーターとしては、ユビキチン、ＲＳＶ、ＣＭＶ、ＥＦ１α、及びＰＧＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、本明細書に記載の１つ以上の炎症性サイトカインの１つ以上のアンタゴニストをコードする１つ以上の核酸を、１つ以上の好適なプロモーターに作動可能に連結して、従来の方法を介して免疫細胞に導入して、１つ以上のアンタゴニストの発現を駆動させることができる。

更に、本明細書に記載の外因性核酸は、例えば、哺乳動物細胞における安定又は一過性のトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ｍＲＮＡ安定性のための転写終結及びＲＮＡプロセシングシグナル、複製のＳＶ４０ポリオーマ起点及び適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１、汎用性の高い複数のクローニング部位、並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーターのうちのいくつか又は全てを更に含有してもよい。導入遺伝子を含有するベクターを産生するための好適な方法は、当該技術分野において周知であり、かつ利用可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。

場合によっては、１つ以上の二重特異性ＣＡＲ、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、又はＩＬ－１アンタゴニストは、様々な分子が別個のポリペプチドとして発現されるように、マルチシストロン様式で、１つの発現カセット内に構築され得る。いくつかの例では、内部リボソーム侵入部位を２つのコード配列の間に挿入して、この目標を達成することができる。代替的に、自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ）を、２つのコード配列の間に挿入することができる。そのようなマルチシストロン発現カセットの例示的な設計を以下の実施例に提供する。

（Ｂ）ノックアウト改変
宿主細胞における内因性遺伝子の発現をダウンレギュレートするための当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本明細書に記載の標的内因性サイトカイン／タンパク質の産生のレベルを低下させることができる。遺伝子編集方法は、内因性対立遺伝子における標的領域を切断することができるエンドヌクレアーゼの使用を伴ってもよい。鋳型核酸の非相同末端結合は、ゲノム中の二本鎖切断を修復し、変異（例えば、挿入、欠失、及び／又はフレームシフト）を標的部位に導入し得る。遺伝子編集方法は、一般に、標的核酸における二本鎖切断の生成に関与するエンドヌクレアーゼの種類に基づいて分類される。例としては、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／エンドヌクレアーゼ系、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＲＣホーミングエンドヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ（例えば、メガ－ＴＡＬ）、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

改変メガヌクレアーゼを含む、メガヌクレアーゼを使用する種々の遺伝子編集システムが、当該技術分野に記載されており、例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３－８０，２０１４、Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１－２６，２０１４、Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ５５（８）：５５３－６９，２０１２によるレビュー及びそれらに引用される参考文献を参照されたい。いくつかの例では、ノックアウトイベントはノックインイベントと結合することができ、本明細書に記載されるものなどの所望の分子をコードする外因性核酸は、遺伝子編集を介して目的の標的内因性遺伝子の遺伝子座に挿入することができる。

代替的に、ノックアウト改変うちのいずれかは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ）又はリボザイムを使用して、当該技術分野において既知の方法を介して達成され得る。標的サイトカイン／タンパク質に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイトカインの内因性遺伝子の標的領域に相補的若しくは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド、又はそのようなものをコードするｍＲＮＡを指す。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の方法によって標的細胞に送達され得る。代替的に、レンチウイルスベクター又はその等価物などの発現ベクターを使用して、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる。

（Ｃ）改変された免疫細胞を含む免疫細胞集団の調製
本明細書に記載の改変された免疫細胞のうちのいずれか、又はそれらの組み合わせを含む免疫細胞の集団は、宿主免疫細胞の集団に、ノックイン改変のうちの１つ以上、ノックアウト改変のうちの１つ以上、又はそれらの組み合わせを導入することによって調製され得る。ノックイン及びノックアウト改変は、任意の順序で宿主細胞に導入され得る。

場合によっては、１つ以上の改変は、前の改変イベントの後、及び次の改変イベントの前に、改変された細胞の単離及び／又は濃縮を伴わずに、順次、宿主細胞に導入される。その場合、得られる免疫細胞集団は、異なる改変又は異なる改変の組み合わせを有する細胞を含む、不均一であり得る。そのような免疫細胞集団は、非改変免疫細胞も含み得る。免疫細胞集団で生じる各改変イベントのレベルは、宿主免疫細胞の総数に対して、そのような改変を誘導する遺伝物質の量によって制御することができる。また、上記の議論も参照されたい。

他の場合には、改変された免疫細胞は、第２の改変イベントを実行する前に、第１の改変イベントの後に単離され、濃縮され得る。このアプローチは、細胞に導入された全てのノックイン及び／又はノックアウト改変を有する実質的に均質な免疫細胞集団の生成をもたらすであろう。

いくつかの例では、ノックイン改変及びノックアウト改変は、宿主免疫細胞に別々に導入される。例えば、ノックアウト改変は、標的サイトカインの内因性遺伝子をノックアウトするための遺伝子編集を介して行われ、ノックイン改変は、１つ以上のサイトカインアンタゴニストを産生するための別個の外因性発現カセットを宿主免疫細胞に送達することによって行われる。場合によっては、ノックイン及びノックアウトイベントは同時に発生することができ、例えば、ノックインカセットは、ノックアウトされる標的遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。

ＩＶ．治療的用途
いくつかの態様では、本開示は、疾患又は障害を治療する細胞療法に基づく方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の免疫細胞の集団又は本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。本明細書に記載の改変された免疫細胞を含む免疫細胞の集団のうちのいずれかは、白血病又はリンパ腫などの標的疾患を治療するための養子免疫細胞療法（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ）で使用され得る。免疫細胞、特にＣＡＲのノックイン、ＩＬ－６拮抗性抗体のノックイン、ＩＬ－１アンタゴニスト、又はこれらの組み合わせに導入されたノックイン及びノックアウト改変により、そのような治療的使用は、治療細胞の増殖を改善すると同時に、同じ若しくはより良好な治療効果を達成することが期待される。

本明細書に記載の治療方法を実施するために、本明細書に記載の改変された免疫細胞のうちのいずれかを含む有効量の免疫細胞集団を、好適な経路（例えば、静脈内注入）を介して治療を必要とする対象に投与することができる。１つ以上の免疫細胞集団を薬学的に許容される担体と混合して、投与前に薬学的組成物を形成することができ、これも本開示の範囲内である。免疫細胞は、対象に対して自己由来であってもよく、すなわち、免疫細胞は、治療を必要とする対象から得られ、本明細書に記載の１つ以上のサイトカインアンタゴニストを発現させるために、ＣＡＲ構築物及び／若しくは外因性ＴＣＲ、又はそれらの組み合わせを発現するために、１つ以上の標的サイトカイン／タンパク質（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現を低減させるように改変される。次いで、得られた改変された免疫細胞を、同じ対象に投与することができる。対象への自己細胞の投与は、非自己細胞の投与と比較して、免疫細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。代替的に、免疫細胞は、同種異系細胞であってもよく、すなわち、細胞は、第１の対象から得られ、本明細書に記載されるように改変され、第１の対象とは異なるが同じ種の第２の対象に投与される。例えば、同種異系免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与され得る。

一実施形態では、細胞療法の前に、対象は、細胞療法のために対象を調整するためのリンパ枯渇治療を受けた。リンパ枯渇治療の例は、フルダラビン及びシクロホスファミドのうちの１つ以上を対象に投与することを含む。

処置される対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット、イヌ、モルモット、ウサギ、ハムスター、ネコ、ヤギ、ヒツジ、又はサル）であり得る。対象は、がんに罹患している、感染症を有しているか、又は免疫障害を有し得る。例示的ながんとしては、血液悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、及び多発性骨髄腫）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な感染症としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、デングウイルス感染症、マラリア、敗血症及び大腸菌感染症が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な免疫疾患としては、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、乾癬、グレイブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、及び血管炎などの自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

場合によっては、本明細書に開示されるＴ細胞などの遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方を標的とする二重特異性ＣＡＲ（例えば、本明細書に開示されるもの）を発現する。そのような二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋及び／又はＢＣＭＡ＋がん（例えば、血液がん又は固形腫瘍）を有するヒト患者を治療するために使用することができる。いくつかの例では、がんは、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫であり得る。他の例では、がんは、多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、又は難治性多発性骨髄腫であり得る。代替的に、ヒト患者は、乳がん、胃がん、神経芽腫、又は骨肉腫を有し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞関連がんの治療に有用である。非限定的なＢ細胞関連がんとしては、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優性ホジキンリンパ腫、ケーラー病及び骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、大細胞拡散性Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質形成性リンパ腫、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸潤リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富な大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症に伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大細胞型ＡＬＫ陽性リンパ腫Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫（ＰＢＬ）、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に起因する大Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の特徴を有する未分類Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫との間の中間的な特徴を有する未分類Ｂ細胞リンパ腫、及び他のＢ細胞関連リンパ腫が挙げられる。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象に治療効果を付与するために必要な各活性剤の、単独の量又は１つ以上の活性剤を組み合わせた量を指す。有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズ、性別並びに体重を含む個々の患者パラメータ、治療期間、投与経路、賦形剤の使用、他の活性薬剤（もしあれば）との共用、及び医療従事者の知識並びに専門知識内の同様の要因に応じて、当業者によって認識されるように変化する。投与される量は、治療される対象に依存し、例えば、個体の免疫系が細胞媒介性免疫応答を産生する能力が含まれる。投与される必要がある有効成分の正確なマウント（ｍｏｕｎｔｓ）は、施術者の判断に依存する。しかしながら、好適な投与範囲は当業者によって容易に決定可能である。

本明細書で使用される「治療する」という用語は、標的疾患、標的疾患の症状、又は標的疾患に対する素因を有する対象に、疾患、疾患の症状、又は疾患に対する素因を治し、癒し、緩和し、軽減し、変化させ、直し、改善し、改良し、又は影響を与えることを目的として、１つ以上の活性剤を含む組成物を適用又は投与することを指す。

有効量の免疫細胞は、適切な経路、例えば、静脈内注入を介して治療を必要とするヒト患者に投与され得る。場合によっては、約１×１０^６～約１×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ヒト患者（例えば、白血病患者、リンパ腫患者、又は多発性骨髄腫患者）に与えられてもよい。いくつかの例では、ヒト患者は、複数回用量の免疫細胞を受容することができる。例えば、患者は、２日連続で、２つの用量の免疫細胞を受けてもよい。場合によっては、第１の用量は、第２の用量と同じである。他の場合では、第１の用量は、第２の用量よりも低いか、又は逆もまた同様である。

免疫細胞の使用を伴う本明細書に開示される治療方法のうちのいずれにおいても、対象は、細胞療法と同時にＩＬ－２を投与され得る。より具体的には、有効量のＩＬ－２は、細胞療法の前、その間、又はその後に、好適な経路を介して対象に与えられ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、免疫細胞の投与後に対象に与えられる。

代替的又は追加的に、本明細書に開示される細胞療法によって治療される対象は、免疫細胞注入後にＩＬ－６アンタゴニスト（細胞療法で使用される免疫細胞によって産生されるＩＬ－６アンタゴニストを除く）を伴う治療を受けない場合がある。

本明細書に記載される改変された免疫細胞を含む免疫細胞集団は、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法等の他の種類のがん療法と組み合わせて利用され得る。そのような療法は、本明細書に記載の免疫療法と同時に、又は順次（任意の順番で）投与することができる。追加の治療薬と同時投与される場合、相加作用又は相乗作用により、各薬剤に対する適切な治療有効用量が低減され得る。

いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、遺伝子操作された細胞の注入から１４日以内に治療されている対象において重度のＣＲＳを誘発しない。治療方法の一実施形態では、治療される対象は、トシリズマブなどの追加の抗ＩＬ－６療法を受ける必要がない場合がある。いくつかの実施形態では、治療されている対象は、免疫系を抑制するためにステロイド療法を受ける必要がない場合がある。他の実施形態では、治療される対象は、本明細書に開示される免疫細胞の注入と併せて、メチルプレドニゾロン及びデキサメタゾンなどの免疫抑制ステロイドを受けてもよい。熟練した臨床医は、治療中のＣＲＳのグレード／重症度を監視及び評価し、発症しているＣＲＳを抑制するために適切な薬物を適時に投与するために、対象のバイタルサイン及び症状を決定することができる。

いくつかの例では、対象は、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ療法の前に、腫瘍量を低減するための好適な抗がん療法（例えば、本明細書に開示されるもの）に供される。例えば、対象（例えば、ヒトがん患者）は、腫瘍負荷を実質的に低減する用量で化学療法（例えば、単一の化学療法剤又は２つ以上の化学療法剤の組み合わせを含む）に供されてもよい。場合によっては、化学療法は、対象における白血球総数を、１０^８／Ｌ未満、例えば、１０^７／Ｌ未満に低下させ得る。初期抗がん療法後、及び／又は本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞療法後の患者の腫瘍負荷は、日常的な方法を介してモニタリングされ得る。患者が、最初の抗がん療法の後に、かつ／又はＣＡＲ－Ｔ療法の後に、がん細胞の高い増殖速度を示した場合、患者は、腫瘍負荷を低減するための新しいラウンドの化学療法に供され、続いて本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ療法のうちのいずれかに供されてもよい。

本明細書に記載の改変された免疫細胞との組み合わせに有用な他の抗がん治療薬の非限定的な例としては、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤＬ１、ＰＤ１、及びＣＴＬＡ４阻害剤）、抗血管新生剤（例えば、ＴＮＰ－４７０、血小板第４因子、トロンボスポンジン－１、組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子、プロラクチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、形質転換成長因子ベータ、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、可溶性ＫＤＲ及びＦＬＴ－１受容体、及び胎盤プロリフェリン関連タンパク質）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片）、化学療法剤化合物が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な化学療法用化合物としては、ピリミジン類似体（例えば、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、及びシタラビン）；プリン類似体（例えば、フルダラビン）；葉酸アンタゴニスト（例えば、メルカプトプリン及びチオグアニン）；抗増殖剤又は抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド、タキサンなどの微小管破壊剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、並びにエピポドフィロコキシン；ＤＮＡ損傷剤（例えば、アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルブシン、エピルビシン、ヘキサメチネラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｈｎｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、並びにエトポシド）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、放射線又は放射線及び化学療法は、本明細書に記載の改変された免疫細胞を含む細胞集団と組み合わせて使用される。追加の有用な薬剤及び療法は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐ Ｄ Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ Ｎ．Ｊに見出すことができる。

Ｖ．治療的使用及び遺伝子操作された免疫細胞の作製のためのキット
本開示はまた、本明細書に記載される免疫細胞集団のうちの１つ以上を含む本明細書に記載される標的疾患のうちのいずれかの使用のためのキット及び本明細書に記載される改変された免疫細胞の作製に使用するためのキットも提供する。

本明細書に記載の治療的使用のためのキットは、薬学的組成物を形成するように製剤化され得る免疫細胞集団を含む１つ以上の容器を含み得る。免疫細胞集団は、本明細書に記載の改変された免疫細胞のうちのいずれか又はそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載のＴリンパ球、ＮＫ細胞などの免疫細胞の集団は、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ構築物を更に発現し得る。

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおける免疫細胞集団の使用のための説明書を追加的に含むことができる。含まれる説明書は、対象において意図する活性を達成するための、対象への免疫細胞集団又はそのようなものを含む薬学的組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が治療を必要としているかどうかを識別することに基づいて、治療に適した対象を選択する説明を更に含み得る。いくつかの実施形態では、説明書は、免疫細胞集団又はそれを含む薬学的組成物を、治療を必要とする対象に投与することの説明を含む。

本明細書に記載されるものなどを含む免疫細胞集団又は薬学的組成物の使用に関する説明書は、一般に、意図される処置のための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、１回投与用、バルクパッケージ（例えば、複数回投与用パッケージ）又はサブユニット投与用であり得る。本開示のキットに提供される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書に書かれた説明書である。ラベル又は添付文書は、薬学的組成物が、対象における疾患又は障害の治療、発症の遅延、及び／又は緩和のために使用されることを示す。

本明細書に提供されるキットは、好適なパッケージング内に存在する。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、瓶、柔軟なパッケージングなどが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与装置、又は注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、無菌アクセスポートを有し得る。薬学的組成物中の少なくとも１つの活性剤は、改変された免疫細胞又はそれらの組み合わせのうちのいずれかを含む免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞）の集団である。

キットは、任意選択で、緩衝液及び解釈情報などの追加の成分を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上の又は容器に関連するラベル若しくは添付文書を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、上述のキットの内容物を含む製造物品を提供する。

本明細書に記載の改変された免疫細胞を作製する際に使用するためのキットもまた、本明細書に提供される。そのようなキットは、免疫細胞にノックイン及び／又はノックアウト改変を導入する際に使用するための試薬をそれぞれ含有する１つ以上の容器を含み得る。例えば、キットは、本明細書に記載されるような１つ以上のノックアウト改変を行うための遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素を含み得る。代替的又は追加的に、キットは、本明細書にも記載されるサイトカインアンタゴニストを発現するための１つ以上の外因性核酸と、外因性核酸を宿主免疫細胞に送達するための試薬とを含み得る。そのようなキットは、宿主免疫細胞に対して所望の改変を行うための説明書を更に含み得る。

一般的な手技
本開示の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫療法の従来の技法が用いられる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ１９８４）、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎ．Ｎ．Ｓｈａｈ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｒｖｉｅｒ，２０１９，ＩＳＢＮ：９７８０３２３６６１８１２）、Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｍ．Ｙ．Ｂａｌｋｈｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，ＩＳＢＮ：９７８０１２８１９７４７９）、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｖ．Ｐｉｃａｎｃｏ－Ｃａｓｔｒｏ，Ｋ．Ｃ．Ｒ．Ｍａｌｍｅｇｒｉｍ，Ｋ．Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＵＳ，２０２０，ＩＳＢＮ：９７８１０７１６０１４８８）、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ（Ｃ．Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｓ．Ａ．Ａｂｕｔａｌｉｂ，Ｍ．－Ａ． Ｐｅｒａｌｅｓ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１８；ＩＳＢＮ：９７８３３１９５４３６８０）及びＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｍｉｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，ＩＳＢＮ：９７８０１２８０２６７５５）などの文献に完全に説明されている。

本開示は、本明細書の説明に記載される、又は図面に示される構成要素の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施されることが可能である。また、本明細書で使用される用語及び用語は、記載の目的であり、限定するものとみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、及びそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの等価物、並びに追加の項目を包含することを意味する。本明細書及び添付の特許請求の範囲でも使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。

更に詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用された全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために参照により組み込まれる。

実施例１：二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の調製
血液試料をヒト患者ドナーから採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を日常的な実践を介して血液試料から単離した。抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲ、及び任意選択で抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号２１又は配列番号１８）及び／又は抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ（配列番号３５）をコードするレンチウイルス発現ベクターをＰＢＭＣに導入して、二重特異性ＣＡＲ及び任意選択で抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ及び抗ＩＬ６ ｓｃＦｖの発現を可能にした。

抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲの２つの設計が探索された：（ａ）抗ＣＤ１９ ＶＨＨ／抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、及び（ｂ）抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ。二重特異性ＣＡＲ構築物の全ては、ＣＤ８リード配列（配列番号４５）、ＧＳリンカー（配列番号５７）、ＣＤ８ヒンジドメイン（配列番号５３）、ＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号３８）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号３９）、ＩＬ－２Ｒｂシグナル伝達ドメイン（配列番号４０）、及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン（配列番号４２）を含有する。配列表２を参照されたい。（ａ）の構築物は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、（ｂ）の構築物は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。

場合によっては、構築物（ａ）又は（ｂ）のコード配列と、Ｔ２Ａコード配列リンカーによって接続された抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号２１又は配列番号１８）のコード配列とを含むバイシストロン性発現ベクターを使用して、二重特異性ＣＡＲと抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（秘密性（ｓｅｃｒｅｔｉｖｅ））の両方を発現する遺伝子操作Ｔ細胞を作製した。他の例では、構築物（ａ）又は（ｂ）のコード配列、Ｔ２Ａコード配列によって（ａ）又は（ｂ）のコード配列に接続された抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号２１又は配列番号１８）のコード配列、及びＰ２Ａコード配列を介して抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖのコード配列に接続された抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ（配列番号３５）のコード配列を含む、トリシストロン性発現ベクター。

健康なドナーから収集した一次Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって活性化した。１日後、Ｔ細胞を、上記の二重特異性ＣＡＲのうちの１つ、及び任意選択で上記に開示された抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ及び抗ＩＬ６ ｓｃＦｖのうちの１つをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入された細胞を増殖させ、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ３発現について試験し、ＣＤ３＋集団を更なる分析のためにゲート化した。

ＣＡＲ発現は、ＣＡＲにおける抗体断片を認識するビオチン化一次抗体及びストレプトアビジンとコンジュゲートされた蛍光標識された二次抗体を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。

二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性を、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖、細胞傷害性、又はそれらの組み合わせを評価するために、標的抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は標的腫瘍細胞とのＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養によって分析した。

実施例２：抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞を有する急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）患者の治療
急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）を有するヒト患者を、以下に詳述するように二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した。

（Ａ）抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを分泌する二重特異性ＣＡＲ Ｔ細胞による処置
難治性及び再発性急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）と診断された患者（ＡＬＬ患者１）を、標準的なリンパ枯渇処置後に、０．４×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、例示的な抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号２１のアミノ酸配列を含む、上記の実施例１を参照されたい）のみを分泌する二重特異性ＣＡＲ Ｔ細胞（抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、実施例１の設計（ｂ）を参照されたい）を静脈内注入によって投与した。

処置後、血液試料を患者から採取した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の顕著な拡大が経時的に検出され（図２Ａ）、低レベルのＩＦＮγが血液試料中で検出された（図２Ｂ）。この結果は、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現する二重特異性抗ＣＤ１９／ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、持続的なＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖を誘導するのに十分であることを示唆する。この患者は、臨床的有効性において完全奏効を示した。この処置中、グレード２のＣＲＳのみが観察された。

（Ｂ）抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの両方を分泌する二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞による処置
ＡＬＬと診断された患者（ＡＬＬ患者２）に、上記実施例１に開示されるアミノ酸配列を含む抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの両方を発現する二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ／抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、実施例１の設計（ｂ）を参照）を静脈内注入することによって投与した。この患者は、臨床的有効性において完全奏効を示した。この処置中、グレード１のＣＲＳのみが観察された。患者１と同様に、患者２もまた、処置後の血液試料中の低レベルのＩＦＮγを示した（図２Ｃ）。

実施例３：二重特異性抗ＣＤ１９／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞による多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の治療
難治性及び再発性のＭＭと診断された最大３人の患者（ＭＭ患者１、ＭＭ患者２、及びＭＭ患者３）に、静脈内注入（患者１、０．４×１０^８個、患者２、０．８×１０^８個；患者３、０．８×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞）を介して、上記実施例１に開示される配列番号２１のアミノ酸配列を含む二重特異性ＣＡＲ構築物（ａ）及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。難治性及び再発性ＭＭと診断された１人の患者（ＭＭ患者４）に、二重特異性ＣＡＲ構築物（ａ）を発現するが、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。

処置後、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の拡大及びＩＦＮγのレベルは、ＭＭ患者の各々において決定された。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有意な拡大は、この実施例で処置されたＭＭ患者の全てにおいて検出された。図３Ａ及び図３Ｃ～３Ｄ。低レベルのＩＦＮγもまた、二重特異性ＣＡＲ及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの両方を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された患者の末梢血中に検出された。１人の代表的な患者からのデータについては、図３Ｂを参照されたい。これは、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現する二重特異性抗ＣＤ１９／ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、頑健なＣＡＲ＋Ｔ細胞の拡大を誘導することができることを示している。二重特異性ＣＡＲ及び抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを共発現して治療したＭＭ患者は、治療後に完全奏効（ＣＲ）を達成した。骨髄検査は、処置前に患者１において７９．５％の異常形質細胞を検出したが、処置中に１日に１０ｍｇのノルエピネフリンによって成功裏に解決された一過性の軽度の低血圧のみが存在し、したがってグレード３のＣＲＳが観察された。患者２及び患者３におけるこの処置中、グレード１のＣＲＳのみが観察された。

二重特異性ＣＡＲを発現するが、抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現しないＴ細胞で処置したＭＭ患者においても、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大が観察された。図３Ｅ。この患者の臨床応答は評価中である。この処置中、グレード１のＣＲＳのみが観察された。

実施例４：二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイ
二重特異性ＣＡＲ構築物（ａ）と、上記実施例１に開示される抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖ（配列番号２１）とを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と、二重特異性ＣＡＲ構築物（ａ）のみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞とのインビトロ細胞傷害性を、この実施例で評価した。

ヒトＴ細胞を活性化し、形質導入して、二重特異性ＣＡＲと抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの両方、又は二重特異性ＣＡＲのみを発現する遺伝子操作されたＴ細胞を生成した。得られた操作されたＴ細胞を、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で緑色蛍光タンパク質（レポーターとしてのＧＦＰ）を発現する標的腫瘍細胞とインキュベートした。殺傷有効性は、細胞傷害性のレベルと逆相関である生体ＧＦＰ＋標的細胞の数をカウントすることによって、フローサイトメトリーによって評価した。図４Ａ～４Ｃに示されるように、両方のタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ６細胞（Ｂ細胞前駆白血病細胞）、ＭＭ１Ｓ細胞（多発性骨髄腫細胞）、及びＲＰＭＩ８２２６細胞（形質細胞腫細胞）に対して一定レベルの細胞傷害性を示した。抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖの共発現は、ＭＭ１Ｓ細胞及びＲＰＭＩ８２２６細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性に顕著な影響を示さなかったが、Ｎａｌｍ６細胞に対する細胞傷害性を低下させることが見出された。図４Ａを、図４Ｂ及び４Ｃと比較して参照されたい。

他の実施形態
本明細書に開示される特徴はいずれも、任意の組み合わせで組み合わせ得る。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、又は同様の目的に適う代替的特徴に置き換え得る。したがって、別途明記されない限り、開示される各特徴は、全般的な一連の同等の、又は同様の特徴の一例に過ぎない。

当業者には上の記載から、本発明に不可欠な特徴を容易に確認することが可能であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な改変及び修正を施して、様々な使用及び条件に適合させることが可能である。したがって、他の実施形態も請求項の範囲内にある。

等価物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載され、図示されているが、当業者には、機能を実施し、かつ／又は本明細書に記載される結果及び／又は１つ若しくは複数の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構成が容易に想像され、このような変形及び／又は修正はそれぞれ、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲に内にあるとみなされる。より一般的に、本明細書に記載されるパラメータ、寸法、材料、及び配置はいずれも例示を意図するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示を用いる具体的な１つ又は複数の用途によって決まることが当業者に容易に理解されよう。当業者には、ルーチンの実験を用いて、本明細書に記載される具体的な本発明の実施形態の均等物が多数認識される、又は確認することが可能であろう。したがって、上記の実施形態が単なる例として示されるものであり、添付の請求項及びその均等物の範囲内において、具体的に記載及び特許請求される以外の方法で、諸実施形態を実施し得ることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載される個々のそれぞれの特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法に関するものである。更に、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が互いに相容れないものでなければ、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせが本開示の本発明の範囲内に含まれる。

本明細書で定義及び使用される定義はいずれも、定義される用語の辞書での定義、参照により組み込まれる文献での定義、及び／又は通常の意味に対して支配的な位置にあることが理解されるべきである。

本明細書に開示される参考文献、特許、及び特許出願はいずれも、それが引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文献全体がそれに包含されることもある。

本明細書及び請求項で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。

本明細書及び請求項で使用される「及び／又は」という語句は、そのように等位結合される要素の「一方又は両方」、すなわち、いくつかの場合には接続的に存在し、別の場合には選言的に存在する要素を意味するものであると理解されるべきである。「及び／又は」用いて列挙される複数の要素も同じように、すなわち、「１つ以上の」要素がそのように等位結合されていると解釈されるべきである。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外にも、具体的に特定されるその要素と関係があるか、無関係であるかを問わず、任意選択で他の要素が存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言葉とともに「Ａ及び／又はＢ」と言う場合、それは、一実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；更に別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指し得る。

本明細書及び請求項で使用される「又は」は、上で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、１つのリストのなかの項目を分ける場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的なものである、すなわち、多数の要素又は要素のリストのうち少なくとも１つの要素を含むだけでなく、２つ以上の要素、及び任意選択で、列挙されていない他の項目を含むものと解釈されるべきである。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちのちょうど１つ」、又は請求項で使用される「よりなる」など、そうでないことが明記される用語に限り、多数の要素又は要素のリストのうちちょうど１つの要素が含まれることを指す。一般に、本明細書で使用される「ｏｒ」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちのちょうど１つ」などの排他的用語が先行する場合、排他的選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが、両方ではない」）を示すものとのみ解釈されるべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

本明細書及び請求項で１つ又は複数の要素のリストを指して使用される「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストのなかの要素のうちの任意の１つ又は複数のものから選択される、少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストのなかに具体的に列挙されている少なくとも１つの要素及び全要素を必ずしも含むものではなく、要素のリストのなかの要素の任意の組み合わせを除外するものではないことが理解されるべきである。この定義はまた、任意選択で、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリストのなかで具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素と関係があるか、無関係であるかを問わず存在し得ることを認めるものである。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」も同様に、若しくは「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」も同様に）は、一実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＡが存在し、Ｂは存在しないこと（及び任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＢが存在し、Ａは存在しないこと（及び任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；更に別の実施形態では、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＡと、任意選択で２つ以上を含む少なくとも１つのＢ（及び任意選択で、他の要素を含む）などを指し得る。

また、本明細書で特許請求され、２つ以上の段階又は行為を含む方法ではいずれも、そうでないことが明記されない限り、その方法の段階又は行為の順序は、必ずしもその方法の段階又は行為が記載されている順序に限定されないことが理解されるべきである。

Claims (44)

1. 二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、
   ａ）第１の抗原結合部分と、
   ｂ）第２の抗原結合部分と、
   ｃ）共刺激シグナル伝達ドメインと、
   ｄ）細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み、
   前記第１の抗原結合部分が、単一ドメイン抗体可変断片（ＶＨＨ）であり、前記第２の抗原結合部分が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、
   前記第１の抗原結合部分が、第１の腫瘍関連抗原に結合し、前記第２の抗原結合部分が、任意選択で前記第１の腫瘍関連抗原とは異なる第２の腫瘍関連抗原に結合する、二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
2. 前記第１及び第２の腫瘍抗原が、５Ｔ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、デスモグレイン（Ｄｓｇ３）、ＨＥＲ－２、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＤ２、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、メソテリン、ＲＯＲ１、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＣ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、クローディン１８．２、及びＶＥＧＦＲＩＩからなる群から選択される、請求項１に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
3. 前記第１の腫瘍抗原が、ＣＤ１９であり、前記第２の腫瘍抗原が、ＢＣＭＡであるか、又は逆もまた同様である、請求項１に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
4. 前記第１の抗原結合部分が、ＣＤ１９に結合するＶＨＨ断片（抗ＣＤ１９ ＶＨＨ）であり、前記第２の抗原結合部分が、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖ（抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）であるか、又は前記第１の抗原結合部分が、ＢＣＭＡに結合するＶＨＨ（抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ）であり、前記第２の抗原結合部分が、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ断片（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）である、請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
5. 前記抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖが、配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列を含み、かつ／又は前記抗ＢＣＭＡ ＶＨＨが、配列番号４、５、若しくは６のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
6. ａ）及びｂ）が、配列番号１１、４４、６３、６４、６７、６８、７１、又は７９、任意選択で配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
7. 前記抗ＣＤ１９ ＶＨＨが、配列番号１、２、若しくは３のアミノ酸配列を含み、かつ／又は前記抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
8. ａ）及びｂ）が、配列番号１２、６５、６６、６９、７０、７２、７８、又は８０、任意選択で配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
9. 二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、
   ａ）ＢＣＭＡに結合するＡＰＲＩＬの切断断片である、第１の抗原結合部分と、
   ｂ）腫瘍関連抗原に結合する、単一ドメイン抗体可変断片（ＶＨＨ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、第２の抗原結合部分と、
   ｃ）共刺激シグナル伝達ドメインと、
   ｄ）細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
10. 前記ＢＣＭＡに結合するＡＰＲＩＬの切断断片が、配列番号５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記ＡＰＲＩＬの切断断片が、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
11. 前記第２の抗原結合部分が、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ又は抗ＣＤ１９ ＶＨＨである、請求項９又は１０に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
12. 前記抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖが、配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列を含むか、又は前記抗ＣＤ１９ ＶＨＨが、配列番号１、２、若しくは３のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
13. ａ）及びｂ）が、配列番号５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
14. 前記第１の抗原結合部分と前記第２の抗原結合部分との間にペプチドリンカーを更に含み、任意選択で、前記ペプチドリンカーが、約４～４０アミノ酸長である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
15. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ又はＣＤ２８に由来する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
16. 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ｚ細胞質シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
17. 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、任意選択で、ＳＴＡＴ結合モチーフを含むＣＤ３ｚ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項１６に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
18. 任意選択で、前記第１又は第２の抗原結合部分と前記共刺激ドメインとの間に位置する、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
19. 前記膜貫通ドメイン及び／又は前記ヒンジドメインが、ＣＤ８に由来する、請求項１８に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
20. 配列番号６３～７０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチド。
21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲポリペプチドを発現する、遺伝子操作された免疫細胞の集団。
22. 以下の特徴：
    ｅ）１つ以上の炎症誘発性サイトカインをコードする１つ以上の破壊された内因性遺伝子を有すること、及び
    ｆ）前記炎症誘発性サイトカインを標的とする１つ以上のアンタゴニストを発現させること、のうちの１つ以上を更に含む、請求項２１に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
23. 前記炎症誘発性サイトカインが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＧＭ－ＣＳＦ、及びインターロイキン１（ＩＬ－１）からなる群から選択される、請求項２２に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
24. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、破壊された内因性インターフェロンガンマ遺伝子、破壊された内因性ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２２又は２３に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
25. 前記内因性インターフェロンガンマ遺伝子、前記内因性ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子、又はその両方が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムによって破壊される、請求項２４に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
26. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＦＮγアンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
27. 前記ＩＬ－６アンタゴニストが、ヒトＩＬ６に特異的な抗体（抗ＩＬ６抗体）又はヒトＩＬ６Ｒに特異的な抗体（抗ＩＬ６Ｒ抗体）であり、かつ／又は前記ＩＦＮγアンタゴニストが、ヒトＩＦＮγに特異的な抗体（抗ＩＦＮγ抗体）である、請求項２６に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
28. 前記抗ＩＬ６抗体、前記抗ＩＦＮγ抗体、又はその両方が、ｓｃＦｖ抗体である、請求項２７に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
29. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、
    （ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    （ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
    （ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖを発現する、請求項２８に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
30. 前記抗ＩＦＮγ ｓｃＦｖが、配列番号１５、１８、又は２１のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
31. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、配列番号４４、６３～７０、又は７８～８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む二重特異性ＣＡＲを発現する、請求項３０に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
32. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、
    （ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    （ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
    （ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む抗ＩＬ６ ｓｃＦｖを発現する、請求項２８に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
33. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、
    （ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    （ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
    （ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖを発現する、請求項２８に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
34. 前記抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ又は抗ＩＬ６Ｒ ｓｃＦｖが、配列番号３４、３５、３６、又は３７のアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
35. 遺伝子操作された免疫細胞が、ＩＬ－１アンタゴニストを発現し、前記ＩＬ－１アンタゴニストが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１ＲＡである、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
36. 前記遺伝子操作された免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクログラフ、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、骨髄由来抑制細胞、間葉系幹細胞、それらの前駆体、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２２～３５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
37. 前記免疫細胞が、ヒト免疫細胞である、請求項２２～３６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
38. ヒトＴ細胞を含む、請求項３７に記載の遺伝子操作された免疫細胞の集団。
39. 請求項２２～３８のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
40. 対象における望ましくない細胞を低減又は排除するための方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項２２～３８のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団又は請求項３９に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
41. 前記対象が、第１の腫瘍関連抗原、第２の腫瘍関連抗原、又はその両方を発現するがん細胞を含む、がんを有するヒト患者である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記対象が、固形腫瘍又は血液がんを有するヒト患者である、請求項４０又は４１に記載の方法。
43. 前記ヒト患者が、乳がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、前立腺がん、卵巣がん、中皮腫、結腸がん、及び胃がんからなる群から選択される固形腫瘍を有する、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ヒト患者が、白血病、リンパ腫、又は多発性骨髄腫である血液がんを有する、請求項４２に記載の方法。