CN111358808A - 免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法 - Google Patents
免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体SCE免疫调节制剂制备方法，包括免疫细胞获取；获得免疫细胞和免疫细胞悬液；免疫细胞提取物制备；将细胞成分裂解，得到裂解细胞悬液，一次离心后收集上清液，转入30KD超滤管，二次离心后取滤出液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，制得免疫细胞提取物浓缩溶液；脂质体制备。本发明扩展了细胞提取物和因子通过口服吸收容易被消化液降解的风险，有利于细胞培养和扩增提高产出率，可以避免外源分子的干扰和产品副作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法。
背景技术
免疫细胞在健康及临床上体现出显著优势，特别是在癌症等免疫性疾病的治疗和免疫平衡调整方面，免疫细胞具有很好的临床应用价值，已经被广泛应用于临床和实践中。免疫细胞中存在大量免疫相关因子和抗体，传统活细胞应用只能在临床医院通过静脉输液方式给药，免疫细胞数量有限，仅仅从采集的血液中直接提取，由于量的限制，无法实现市场应用，并且免疫细胞治疗属于要求极为严格的临床医学技术，只能在特定要求的临床医院中，只能通过输液静脉给药，作为临床手段治疗使用，无法使得免疫细胞的应用在健康领域得到普及和推广，目前还未发现通过将免疫细胞和免疫细胞培养中的生物细胞因子，提取出来，并应用于实践的创新技术。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法。
本发明提出的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，包括以下步骤：
S1：免疫细胞获取；获得免疫细胞和免疫细胞悬液；
S2：免疫细胞提取物制备；将细胞成分裂解，得到裂解细胞悬液，一次离心后收集上清液，转入30KD超滤管，二次离心后取滤出液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，制得免疫细胞提取物浓缩溶液；
S3：脂质体制备：称取大豆卵磷脂和胆固醇，加乙醇并加热，充分溶解，移入烧瓶中，55℃减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在烧瓶侧壁，使乙醇溶剂完全挥发，将生物蛋白包裹在脂质体中，采用微射流法，反复操作使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再整粒除菌，将制得的免疫细胞提取物浓缩液加入去离子水或者磷酸盐水溶液中，不断旋转振摇下摇匀得水溶液II，再将水溶液II加入烧瓶中，不断旋转振摇下得到脂质体乳液，使脂质薄膜充分水化，直至乳液变为透明，并过0.22um滤膜，得到载免疫细胞提取物的纳米脂质体制剂。
优选地，所述S1中，免疫细胞获取的具体步骤为：将加入抗凝剂的外周血移入离心管中，以900g离心10分钟后，吸取上层血浆，将上层血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在900g下离心10分钟，再将血浆保存于4℃下，下层细胞加入生理盐水，混合获得细胞悬液，将细胞悬液置于分离液中，于800g离心30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞。
优选地，所述分离液包括以下重量份的组分:海藻糖3份、右旋糖酐1份、千金藤碱1份、银耳多糖1份、海带多糖0.5份、超低粘度海藻酸钠0.2份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1份，所述外周血与生理盐水的体积比为1:2。
优选地，所述S1中，免疫细胞获取的具体步骤为：将保存免疫细胞的冻存管投入37℃水浴，平摇直至细胞完全融化，将细胞悬液接种到一个添加了5％V/V的自体血浆的X-VIV015培养基的培养皿中，调整细胞密度为3×105个/m，放于37℃、5％二氧化碳增养箱内培养，72h后换液，以后每隔48h换液一次，贴壁生长，细胞长满至80％-90％，消化细胞，进行传代培养，选P5代处于对数生长期的细胞，酶消化后将细胞悬液全部移至离心管中。
优选地，所述S2中，将细胞成分裂解的具体步骤为：在37℃和-80℃之间反复冻融5次，在-80℃冷冻，在37℃融化。
优选地，所述S2中，一次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机4℃、1500xg离心10min，二次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机5000xg离心30min。
优选地，所述S3中，加乙醇并加热至55℃超声，将生物蛋白包裹在脂质体中的具体步骤为：常压下，加一定比例的生理盐水或20mMPBS溶液，通过旋转洗膜至水合完全，并4℃孵育过夜。
优选地，所述S3中，微射流法的具体步骤为：开始时控制压力为50-60MPa，第2次开始，压力增加至120MPa，反复操作使脂质体粒径均匀。
优选地，所述S3中，整粒除菌的具体步骤为：依次通过0.45μm和0.22μm滤膜整粒除菌，细胞因子浓缩液和去离子水的比例1：5，磷酸盐水溶液的PH为6.8。
优选地，所述S3中，旋转振摇在水溶旋转蒸发仪上进行，脂质薄膜充分水化的具体步骤为：探式超声仪在冰水浴条件下使脂质薄膜充分水化20-120min。
本发明中的有益效果为：
1.创新药物的给药方式，扩展了细胞提取物和因子通过口服吸收容易被消化液降解的风险，直接通过口腔粘膜给药，或者做成缓释肠溶吸收的产品，可以将细胞免疫用于大众健康，通过特殊的生物分子提取技术、分子筛选、特殊给药方式，能够打破细胞治疗只局限于临床使用的限制，有利于做出普适性的口服吸收的标准产品，推广及普通大众，维护健康。
2.采用特殊自体血浆的培养基，有利于细胞培养和扩增提高产出率，可以避免外源分子的干扰和产品副作用，有利于产品质量稳定和后续个性化定制产品的开发，打破了传统对细胞的直接应用，将细胞通过特殊裂解，使得活细胞将全部细胞因子释放出来，再进行提取，制备成标准产品，不受制于活细胞应用限制，使得免疫细胞能够被更大范围更大规模的应用，并提高了使用效率。
3.通过对有限的免疫细胞进行实验室培养扩增，成倍增加细胞数量，同时在培养过程中，细胞还会产生大量的细胞因子，将细胞和因子中的有益成分全部提取出来，提高了产品浓度、扩展了产品中生物因子的数量和品种，更适合市场需求，通过二次不同的超滤技术，将其它无用化学分子进行分离，只保留细胞提取物和因子浓缩液成分，提高了产品浓度和使用效率。
附图说明
图1为本发明提出的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1，参照图1，免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，包括以下步骤：
S1：免疫细胞获取；将加入抗凝剂的外周血移入离心管中，以900g离心10分钟后，吸取上层血浆，将上层血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在900g下离心10分钟，除去血小板等，其后，将血浆保存于4℃，下层细胞加入生理盐水，外周血与生理盐水的体积比为1:2，混合获得细胞悬液，将细胞悬液置于分离液中，分离液包括以下重量份的组分:海藻糖3份、右旋糖酐1份、千金藤碱1份、银耳多糖1份、海带多糖0.5份、超低粘度海藻酸钠0.2份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1份，于800g离心30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
S2：免疫细胞提取物制备：将获得的免疫细胞和免疫细胞悬液，在37℃和-80℃之间反复冻融5次，即在-80℃冷冻，在37℃融化，将细胞成分裂解，得到的裂解细胞悬液，在无菌级操作间高速离心机4℃、1500xg离心10分钟收集上清液，去除破碎细胞碎片和死亡细胞，将离心后上清再次转入30KD超滤管，无菌级操作间，高速离心机5000xg离心30min，取滤出液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到免疫细胞提取物浓缩溶液；
S3：脂质体制备：称取大豆卵磷脂、胆固醇，加乙醇并加热至55℃超声，使其充分溶解，移入茄形瓶中，55℃减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在茄形瓶侧壁，使得乙醇溶剂完全挥发，为将生物蛋白包裹在脂质体中，常压下，加一定比例的生理盐水，通过旋转洗膜至水合完全，并4℃孵育过夜，采用微射流法，开始时控制压力为50-60MPa，第2次开始，压力增加至120MPa，反复操作使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再依次通过0.45μm和0.22μm滤膜整粒除菌，将制得的免疫细胞提取物浓缩液加入去离子水中并在水溶旋转蒸发仪上不断旋转振摇下摇匀得水溶液II，细胞因子浓缩液和去离子水比例1：5，然后将水溶液II加入茄形瓶中，在水浴旋转蒸发仪上不断旋转振摇下得到脂质体乳液，探式超声仪在冰水浴条件下使脂质薄膜充分水化20-120分钟，直至乳液变为透明为止，并过0.22um滤膜，得到载免疫细胞提取物的纳米脂质体制剂。
实施例2，参照图1，免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，包括以下步骤：
S1：免疫细胞获取；将保存免疫细胞的冻存管投入37℃水浴，平摇直至细胞完全融化，将细胞悬液接种到一个添加了5％V/V的自体血浆的X-VIV015培养基的培养皿中，调整细胞密度为3×105个/m，放于37℃、5％C02增养箱内培养，72h后换液，以后每隔48h换液一次，贴壁生长，细胞长满至80％-90％，消化细胞，进行传代培养，选P5代处于对数生长期的细胞，酶消化后将细胞悬液全部移至离心管中；
S2：免疫细胞提取物制备：将获得的免疫细胞和免疫细胞悬液，在37℃和-80℃之间反复冻融5次，即在-80℃冷冻，在37℃融化，将细胞成分裂解，得到的裂解细胞悬液，在无菌级操作间高速离心机4℃、1500xg离心10分钟收集上清液，去除破碎细胞碎片和死亡细胞，将离心后上清再次转入30KD超滤管，无菌级操作间，高速离心机5000xg离心30min，取滤出液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到免疫细胞提取物浓缩溶液；
S3：脂质体制备：称取大豆卵磷脂、胆固醇，加乙醇并加热至55℃超声，使其充分溶解，移入茄形瓶中，55℃减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在茄形瓶侧壁，使得乙醇溶剂完全挥发，为将生物蛋白包裹在脂质体中，常压下，加一定比例的生理盐水，通过旋转洗膜至水合完全，并4℃孵育过夜，采用微射流法，开始时控制压力为50-60MPa，第2次开始，压力增加至120MPa，反复操作使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再依次通过0.45μm和0.22μm滤膜整粒除菌，将制得的免疫细胞提取物浓缩液加入去离子水中并在水溶旋转蒸发仪上不断旋转振摇下摇匀得水溶液II，细胞因子浓缩液和去离子水比例1：5，然后将水溶液II加入茄形瓶中，在水浴旋转蒸发仪上不断旋转振摇下得到脂质体乳液，探式超声仪在冰水浴条件下使脂质薄膜充分水化20-120分钟，直至乳液变为透明为止，并过0.22um滤膜，得到载免疫细胞提取物的纳米脂质体制剂
实施例3，参照图1，与实施例1-2相比，区别在于：将生理盐水替换为20mMPBS溶液。
实施例4，参照图1，与实施例1-3相比，将去离子水替换为磷酸盐水溶液，磷酸盐水溶液的PH为6.8。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：免疫细胞获取；获得免疫细胞和免疫细胞悬液；
S2：免疫细胞提取物制备；将细胞成分裂解，得到裂解细胞悬液，一次离心后收集上清液，转入30KD超滤管，二次离心后取滤出液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，制得免疫细胞提取物浓缩溶液；
S3：脂质体制备：称取大豆卵磷脂和胆固醇，加乙醇并加热，充分溶解，移入烧瓶中，55℃减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在烧瓶侧壁，使乙醇溶剂完全挥发，将生物蛋白包裹在脂质体中，采用微射流法，反复操作使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再整粒除菌，将制得的免疫细胞提取物浓缩液加入去离子水或者磷酸盐水溶液中，不断旋转振摇下摇匀得水溶液II，再将水溶液II加入烧瓶中，不断旋转振摇下得到脂质体乳液，使脂质薄膜充分水化，直至乳液变为透明，并过0.22um滤膜，得到载免疫细胞提取物的纳米脂质体制剂。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S1中，免疫细胞获取的具体步骤为：将加入抗凝剂的外周血移入离心管中，以900g离心10分钟后，吸取上层血浆，将上层血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在900g下离心10分钟，再将血浆保存于4℃下，下层细胞加入生理盐水，混合获得细胞悬液，将细胞悬液置于分离液中，于800g离心30min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞。
3.根据权利要求2所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述分离液包括以下重量份的组分:海藻糖3份、右旋糖酐1份、千金藤碱1份、银耳多糖1份、海带多糖0.5份、超低粘度海藻酸钠0.2份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1份，所述外周血与生理盐水的体积比为1:2。
4.根据权利要求2所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S1中，免疫细胞获取的具体步骤为：将保存免疫细胞的冻存管投入37℃水浴，平摇直至细胞完全融化，将细胞悬液接种到一个添加了5％V/V的自体血浆的X-VIV015培养基的培养皿中，调整细胞密度为3×105个/m，放于37℃、5％二氧化碳增养箱内培养，72h后换液，以后每隔48h换液一次，贴壁生长，细胞长满至80％-90％，消化细胞，进行传代培养，选P5代处于对数生长期的细胞，酶消化后将细胞悬液全部移至离心管中。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S2中，将细胞成分裂解的具体步骤为：在37℃和-80℃之间反复冻融5次，在-80℃冷冻，在37℃融化。
6.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S2中，一次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机4℃、1500xg离心10min，二次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机5000xg离心30min。
7.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，加乙醇并加热至55℃超声，将生物蛋白包裹在脂质体中的具体步骤为：常压下，加一定比例的生理盐水或20mMPBS溶液，通过旋转洗膜至水合完全，并4℃孵育过夜。
8.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，微射流法的具体步骤为：开始时控制压力为50-60MPa，第2次开始，压力增加至120MPa，反复操作使脂质体粒径均匀。
9.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，整粒除菌的具体步骤为：依次通过0.45μm和0.22μm滤膜整粒除菌，细胞因子浓缩液和去离子水的比例1：5，磷酸盐水溶液的PH为6.8。
10.根据权利要求1所述的免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，旋转振摇在水溶旋转蒸发仪上进行，脂质薄膜充分水化的具体步骤为：探式超声仪在冰水浴条件下使脂质薄膜充分水化20-120min。
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