CN110777114A - 一种从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法。本申请从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法，包括从小鼠的股骨或胫骨中获取完整的没有破坏的骨髓，然后采用胶原酶对获取的完整骨髓进行消化，获得间充质干细胞。本申请的小鼠骨髓间充质干细胞制备方法，提高了从小鼠骨髓中制备骨髓间充质干细胞的效率，并且，所制备的小鼠骨髓间充质干细具有更好的体外分化潜能。
Description
技术领域
本申请涉及间充质干细胞制备方法领域，具体涉及一种从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞是一类异质性很高的基质干细胞类群。多种成体组织和器官都含有间充质干细胞。间充质干细胞最早从骨髓分离出来，体外培养时可以形成纺锤形并具有克隆形成能力的单核细胞。间充质干细胞在体外培养时不仅可以作为造血干细胞的支持细胞，还具有多种的分化潜能，可以分化为成骨细胞，脂肪细胞以及软骨细胞。除了体外功能，大量的研究表明间充质细胞在体内同样是造血干细胞微环境中的重要组成部分，还在多种组织损伤修复中发挥了重要的调节作用以及修复作用。除了这两方面的功能，间充质干细胞还被报道具有显著的免疫调节功能。在多种急性炎症模型或者自身免疫疾病模型中，体内输注的间充质干细胞可以迁移至炎症区域，通过分泌多种免疫调节因子发挥相应的免疫调节功能，并且促进损伤细胞的存活。
目前采用了一套公认的表面标记分子来定义间充质干细胞，人源的间充质细胞不表达造血细胞相关的分子如CD45、CD34、CD14及共刺激分子CD80、CD86等，主要表达CD44、CD90、CD73和CD71等表面分子。而鼠源的间充质干细胞同样也不表达造血相关的分子如CD45、Ter119及内皮细胞相关分子CD31等，主要表达PDGFRα、SCA-1及CD44等表面分子。虽然已经用了大量的表面分子来定义间充质干细胞，但是这些表面分子定义的间充质干细胞仍然是一群异质性很高的细胞类群，并不是单一的细胞类群。例如流式分选的间充质干细胞的克隆形成能力并不一致，并且体外分化时具有多种分化潜能。与此同时间充质干细胞还是最早应用于临床研究及疾病治疗的干细胞类型，主要用于免疫排斥反应的调节，组织损伤修复等疾病的治疗。但是间充质干细胞的临床应用同样面临了很多问题，例如治疗效果不稳定，制备流程没有统一的标准，组织器官来源多样等等。目前研究对间充质干细胞认识的局限性很大程度上限制了其走向临床应用。如何更深入的认识探究间充质干细胞异质性，多样性是目前研究领域的难点和热点。
由于正常人以及病人样本获得途径的局限，因此采用模式生物展开针对间充质干细胞的研究就显现的尤为必要。其中小鼠是使用最多遗传背景研究最为广泛的模式生物。但是小鼠骨髓来源的间充质干细胞却十分难获得。主要的原因是小鼠骨髓的间充质干细胞比例较低，普通的分离方法会对这群细胞造成较大损伤，给后续研究带来很多困难。目前比较常用的小鼠骨髓间充质干细胞制备方法主要是利用机械力将骨髓细胞吹散从而由小鼠股骨或胫骨骨腔中吹出，然后获得单细胞悬液，进行贴壁培养，通过更换培养液将不能贴壁生长的细胞淘汰，最终获得具有克隆形成能力的贴壁生长的单核细胞，即骨髓间充质干细胞。这种方法获得间充质干细胞的效率较低，并且培养的细胞中会混有一定比例的CD45阳性的巨噬细胞。
发明内容
本申请的目的提供一种改进的从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法，包括从小鼠的股骨或胫骨中获取完整的没有破坏的骨髓，然后采用胶原酶对获取的完整骨髓进行消化，获得间充质干细胞。其中，获得间充质干细胞，本申请的一种实现方式中，具体采用的是流式细胞仪分选，并对分选的产物进行培养实验，最终获得可以使用的间充质干细胞。可以理解，直接对骨髓进行消化获得的是全骨髓细胞，其中间充质干细胞大概只占有0.2％的比例，因此需要进行流式分析或流式分选以及后续的培养实验。
需要说明的是，本申请的小鼠骨髓间充质干细胞制备方法，直接获取完整的骨髓，并采用胶原酶消化的方式获得骨髓间充质干细胞；一方面，最大限度的保障了骨髓间充质干细胞的获取率，相对于采用机械力将骨髓细胞吹散的方式，本申请的制备方法效率更高，能够获得更多的高质量骨髓间充质干细胞；另一方面，与现有的机械力吹散后贴壁培养获得的间充质干细胞相比，本申请采用胶原酶消化后制备的骨髓间充质干细胞，具有更好的体外分化潜能。
优选的，本申请从小鼠的股骨或胫骨中获取完整的没有破坏的骨髓，具体包括，采用点胶针头从骨髓腔中将完整的骨髓吹出。
可以理解，从股骨或胫骨中获取完整骨髓的方法有很多种，采用点胶针头吹出只是本申请一种实现方式中采用的具体方案，不排除还可以采用其它方式获得完整的骨髓。另外，采用点胶针头吹出骨髓时需要注意避免破坏骨髓的完整结构。
优选的，采用胶原酶对获取的完整骨髓进行消化，具体包括，采用含有一型胶原酶和分散酶的HBSS缓冲液对完整骨髓进行消化。
其中，HBSS缓冲液，即Hank's Balanced Salt Solution，也就是Hank's平衡盐溶液，是细胞清洗常用的缓冲液。
优选的，一型胶原酶的浓度为1-5mg/mL，优选为3mg/mL；分散酶的浓度为5-50U/mL，优选为20U/mL。
优选的，消化的条件为37℃恒温摇床180-250rpm/min消化两次，每次15-30min。优选的，摇床的速度为220rpm/min，每次消化的时间为20min。
需要说明的是，其中消化两次是指，例如，采用含3mg/mL一型胶原酶和20U/mL分散酶的HBSS缓冲液37℃恒温摇床220rpm/min消化20min后，更换新鲜的含3mg/mL一型胶原酶和20U/mL分散酶的HBSS缓冲液，再进行一次37℃恒温摇床220rpm/min消化20min。
优选的，本申请的制备方法还包括，消化完成后，采用不含一型胶原酶和分散酶的HBSS缓冲液终止消化。
优选的，本申请的制备方法还包括，终止消化后，进行裂解红细胞处理，获得的细胞即间充质干细胞。
需要说明的是，本申请的裂解红细胞处理，具体是指通过改变溶液的渗透压对骨髓胶原酶消化后的产物进行红细胞裂解，室温裂解1分钟后用10倍体积的PBS缓冲液中和，600g离心后获得剩余细胞进行后续流式以及体外培养等实验。
本申请的另一面公开了本申请的方法制备的小鼠骨髓间充质干细胞。
需要说明的是，与现有方法制备的小鼠骨髓间充质干细胞相比，本申请制备方法获得的小鼠骨髓间充质干细胞，由于没有经过贴壁培养筛选，具有更好的体外分化潜能，更适用于小鼠骨髓间充质干细胞分化研究和培养。
优选的，本申请的制备方法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具体为CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞。
优选的，CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞中，95％的细胞为LepR+的间充质干细胞。
优选的，CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞中，90％的细胞为CD51+细胞类群。
优选的，小鼠骨髓间充质干细胞占总细胞比例为0.1％-0.4％，优选为0.2％。
需要说明的是，本申请制备方法能有效制备CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞，为相应的细胞类群研究奠定了基础，特别是其中95％的细胞为LepR+的间充质干细胞，90％的细胞为CD51+细胞类群，这极大的方便了细胞类群的研究和试验。并且，本申请制备的小鼠骨髓间充质干细胞占总细胞比例0.2％左右，大大提高了小鼠骨髓提取间充质干细胞的效率。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的小鼠骨髓间充质干细胞制备方法，提高了从小鼠骨髓中制备骨髓间充质干细胞的效率，并且，所制备的小鼠骨髓间充质干细具有更好的体外分化潜能。
附图说明
图1为本申请实施例中CFU-F检测酶解法分离的骨髓间充质干细胞克隆数的观察结果；
图2为本申请实施例中成骨分化培养细胞的染色结果；
图3为本申请实施例中成脂分化培养细胞的染色结果；
图4为本申请实施例中成软骨分化培养细胞的染色结果。
具体实施方式
胶原酶通常用于实体器官组织的消化处理，但是应用于小鼠骨髓间充质干细胞的分离尚未有相关研究和报道。本申请创造性的采用胶原酶对完整的骨髓进行消化处理，进而获得小鼠骨髓间充质干细胞；采用胶原酶消化的方法从骨髓中分离获得间充质干细胞，不仅极大的提高了间充质干细胞的分离效率，而且实验证实分离获得的间充质干细胞的体外分化潜能也显著增强。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材。
实施例
一、酶解法分离小鼠骨髓间充质干细胞
本例采用二氧化碳处死6到8周的商品化购买的C57雌性或者雄性小鼠，采用小鼠解剖器械分离获得小鼠两侧后退的股骨以及胫骨。待剔除多余的肌肉后用点胶针头将股骨以及胫骨的骨髓从骨髓腔中吹出，保持骨髓的完整性不被破坏。然后，每个小鼠的骨髓用700μL含有3mg/mL的一型胶原酶以及20U/mL的分散酶的HBSS缓冲液(以下简称消化液)于37℃恒温摇床220rpm/min消化两次，每次20min；具体的，消化完一次后，室温沉降5min，将上清转移至10mL的PBS中和消化，再加入700μL的消化液进行第二轮消化。消化结束后用HBSS缓冲液终止，并利用溶液改变渗透压进行红细胞裂解，经过后续裂解红细胞计数等操作后，所获得的细胞即可用于流式细胞仪分析或者后续体外培养分化等实验。其中，所获得的细胞并非间充质干细胞，而是全骨髓细胞，间充质干细胞只是其中一部分，大概占0.2％的比例。
其中，裂解红细胞计数，具体包括，加入1mL红细胞裂解液裂解1分钟，加入10mL的PBS缓冲液终止，室温离心机600g离心5分钟，弃上清，再用1mL的PBS缓冲液重悬细胞，稀释后进行细胞计数。具体稀释倍数可以根据需求而定，以便于观察计数为准。
二、克隆形成实验
用酶解法分离的骨髓单细胞悬液计数后，按照104cells/cm2接种于6孔板，用含有10μM的Y-27632(Rock inhibitor)的低糖DMEM完全培养基(20％FBS，％1PS)进行培养，7天后进行克隆计数，通过CFU-F检测酶解法分离的骨髓间充质干细胞的克隆形成能力。
三、流式细胞仪分析
将1×106数量的骨髓单核细胞用100μL的流式染色缓冲液进行重悬，然后用CD16/32抗体0.5μL进行室温封闭半小时，然后加入1mL流式染色缓冲液漂洗一次，室温离心机600g离心5min，弃上清后用200μL流式染色缓冲液重悬细胞，分别加入anti-CD45-APC(eBioscience,clone30-F11)、anti-Ter119-APC(eBioscience,cloneTER119)、anti-CD31-APC(Biolegend,clone MEC13.3)、anti-PDGFRa-PE(eBioscience,cloneAPA5)、Biotin-anti-LepR(R&D)、anti-CD51-PE(eBioscience,cloneRMV7)流式抗体1μL，避光冰上染色一小时，加入1mL流式染色缓冲液重悬细胞，室温离心机600g离心5min，用200μL流式染色缓冲液重悬细胞后，加入0.6μL的Apc-cy7 steptavidin的流式二抗染色半小时。流式上机进行检测。
四、结果
1.流式细胞仪分析酶解法所获得的小鼠骨髓间充质干细胞
本例采用一型胶原酶以及分散酶的酶解法分离获得小鼠骨髓间充质干细胞后，采用流式分析的方法对所获得的骨髓单细胞分析，结果发现，本例的分离方法成功的分离出CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞，并且还发现这群细胞中95％比例的细胞是LepR+的间充质干细胞。此外还发现这群细胞中90％比例的细胞是CD51+的细胞类群。流式染色的结果表明本例采用的酶解法很好的保存了小鼠骨髓间充质干细胞的完整性，获得了占总细胞比例在0.2％左右的一群细胞类群。
2.CFU-F检测酶解法分离的骨髓间充质干细胞的克隆形成能力
本例采用CFU-F方法分析了酶解法所分离的骨髓间充质干细胞的克隆形成能力，实验结果显示，采用酶解法所分离的骨髓间充质干细胞具有很好的克隆形成能力，每50万细胞能够形成约30-40个左右的克隆。本例分别提取了三个小鼠的骨髓间充质干细胞，三者的克隆形成能力都差不多，观察结果如图1所示，图中mouse1、mouse2和mouse3分别为提取自三个小鼠的骨髓间充质干细胞的观察结果。
3.酶解法所分离的骨髓间充质干细胞体外具有多向的分化能力
本例将酶解法所分离的全骨髓细胞贴壁培养之后，待细胞形成克隆之后原位分别在成骨分化的培养基、成脂分化培养基和成软骨的分化培养基诱导下进行三系分化。具体如下：
分别接种三份的间充质干细胞于12孔板进行克隆形成实验，待克隆形成后三份其中一份更换为成骨分化培养基进行成骨分化培养，一份更换为成脂分化培养基进行成脂分化培养，一份更换为成软骨分化培养基进行成软骨分化培养。更换分化培养基后，于37℃含有0.5％的CO2恒温细胞培养箱中进行诱导分化培养。
其中，成骨分化培养基含有10％胎牛血清、1×双抗、1×丙酮酸钠、50μg/ml的抗坏血酸、10mM的β磷酸甘油以及10nM的地塞梅松的MEMα-Basic培养基。成脂分化培养基为含有10％胎牛血清、1×双抗、1×丙酮酸钠、0.5μM异丁基甲基黄嘌呤、60μM的吲哚美希、5μg/μL的胰岛素以及10μM的胰岛素的MEMα培养基。成软骨分化培养基含有10％胎牛血清、1×双抗、1×丙酮酸钠、0.5μM异丁基甲基黄嘌呤、60μM的吲哚美希、5μg/μL的胰岛素以及10μM的胰岛素的MEMα培养基。
成骨分化培养14天后，进行茜素红染色。具体的，每3天更换一次成骨分化培养基，诱导分化14天后，弃掉培养基，PBS缓冲液漂洗一遍后用4％多聚甲醛室温固定10分钟，弃掉固定液，加入2％的茜素红染液室温染色20分钟，弃掉染色液，清水漂洗2到3次后室温晾干拍照。
成脂分化培养7天后，进行油红染色。具体的，每3天更换一次成脂分化培养基，诱导分化7天后，4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后用60％异丙醇漂洗1次，加入60％异丙醇配置的油红染色液室温染色20分钟，弃掉染色液后清水漂洗2到3次，加入清水覆盖细胞，于显微镜下拍照观察脂滴形成情况。
成软骨分化培养14天后，进行甲苯胺蓝染色。具体的，每3天更换一次成软骨分化培养基，诱导分化14天后，4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后加入甲苯胺蓝染色液室温染色20分钟，弃掉染色液后清水漂洗2到3次，于显微镜下拍照观察软骨细胞形成情况。
实验结果如图2至图4，图2为成骨分化培养细胞的染色结果图，图3为成脂分化培养细胞的染色结果图，图4为成软骨分化培养细胞的染色结果图。图2至图4的结果显示，本例所分离的骨髓间充质干细胞在体外具有很好的分化潜能，在特定分化诱导的条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种从小鼠骨髓中获得间充质干细胞的方法，其特征在于：包括从小鼠的股骨或胫骨中获取完整的没有破坏的骨髓，然后采用胶原酶对获取的完整骨髓进行消化，获得间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述从小鼠的股骨或胫骨中获取完整的没有破坏的骨髓，具体包括，采用点胶针头从骨髓腔中将完整的骨髓吹出。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述采用胶原酶对获取的完整骨髓进行消化，具体包括，采用含有一型胶原酶和分散酶的HBSS缓冲液对完整骨髓进行消化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述一型胶原酶的浓度为1-5mg/mL，分散酶的浓度为5-50U/mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述消化的条件为37℃恒温摇床180-250rpm/min消化两次，每次15-30min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：还包括，消化完成后，采用不含一型胶原酶和分散酶的HBSS缓冲液终止消化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：还包括，终止消化后，进行裂解红细胞处理，获得的细胞即间充质干细胞。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法制备的小鼠骨髓间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的小鼠骨髓间充质干细胞，其特征在于：所述小鼠骨髓间充质干细胞为CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞。
10.根据权利要求9所述的小鼠骨髓间充质干细胞，其特征在于：所述CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞中，95％的细胞为LepR+的间充质干细胞；
优选的，所述CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+的骨髓间充质干细胞中，90％的细胞为CD51+细胞类群；
优选的，所述小鼠骨髓间充质干细胞占总细胞比例为0.1％-0.4％。
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