CN109908177A - 一种用于伤口愈合的干细胞分泌因子精华液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用伤口愈合的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，它主要包括如下步骤：（1）脐带组织的选取；（2）分离并培养间充质干细胞；（3）获取P2代细胞并继续培养，收集培养上清原液；（4）对步骤（3）中获取的上清原液超滤浓缩获取精华液，并除菌安瓿瓶分装；（5）对步骤（3）中获取的干细胞培养上清原液和步骤（4）中获取的浓缩精华液，分别做伤口愈合因子：白细胞介素8（IL8），白细胞介素6（IL6），转化生长因子β1（TGF‑β1），单核细胞趋化蛋白1（MCP‑1），血管内皮生长因子，GM‑CSF和TIMP‑1的含量检测。本发明方法可以有效去除间充质干细胞培养上清液的杂质，而且得到的伤口愈合因子的纯度和产量都很高，安瓿瓶包装保障了精华液的产品质量，方便使用，为伤口愈合的佳品。

Description

一种用于伤口愈合的干细胞分泌因子精华液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于伤口愈合精华液的制备方法，特别涉及一种脐带间充质干细胞伤口愈合因子精华液的制备方法。

背景技术

伤口愈合是一个涉及多种类型细胞的复杂过程，正常情况下伤口的修复过程包括三个阶段，炎症期、肉芽组织形成期、组织改造塑型期，在这一过程中有一系列已知的细胞因子和生物化学反应发生，大量研究表明细胞因子在伤口愈合的各个阶段均发挥着重要的作用，他们通过介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，参与组织修复、更新和再生，已有研究指出通过添加外源性细胞因子，可以有效改善伤口愈合状况，具有重要的临床意义。

研究表明表皮生长因子（EGF）能够促进，加速核酸代谢，加快细胞从G-GI期转化，促进细胞的有丝分裂，促进表皮细胞增殖，从而促进伤口愈合。

转化生长因子β1能促进表皮细胞移动，趋化巨噬细胞和纤维母细胞，促进细胞外基质合成和塑形，与疤痕形成有重要关系。

白介素6可促进角质细胞迁移和瘢痕组织形成，白介素8有加速角质细胞增殖和上皮组织再生的能力，在炎症反应中均发挥重要作用。

很多精细的化工产品多含有乙醇、着色剂、铅汞等对人体肌肤有还得物质，消费者在使用过程中对身体是有害的，严重可能造成皮炎及感染问题，并且都不具有生物活性，不能从根本上改善皮肤的新陈代谢和生存环境,更不能达到伤口快速愈合的目的。

干细胞分泌因子中含有各种生理作用极强的生长因子，其作用备受瞩目，由于其在伤口愈合过程中发挥着重要作用，其有望在皮肤、角膜、消化道伤口的愈合中发挥重要作用，并且可以用于美容业中纹眉、美瞳线后的的皮肤修复，市场前景广阔。

发明内容

本发明提供了一种分离间充质干细胞分泌因子的方法，它包括如下步骤。

（1）脐带组织选取：选取1个健康产妇正常分娩或者剖腹产脐带组织，为孕妇自愿的前提下选取，2℃～8℃条件下保存，24小时内进行处理。

（2）分离并培养脐带间充质干细胞：根据步骤（1）中取得的脐带组织，在24小时内进行间充质干细胞的分离和培养，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，将脐带组织剪成小段，并将脐带内血管以及脐带表面羊膜组织去除，剩余的部分用镊子和手术刀分离开，将组织块转移到T175的培养瓶中，加入脐带间充质干细胞专用培养基，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。

（3）获取P2代细胞：经过对步骤（2）中的组织进行培养，观察脐带间充质干细胞的生长状态，发现每块组织都有细胞爬出时将培养瓶中的组织块取出，继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰蛋白酶消化，获取P1代细胞；P1代细胞转移到T175的培养瓶中继续培养，当回合度达到90%左右时胰蛋白酶消化，获得P2代细胞。

（4）收集干细胞上清原液：每个脐带组织在步骤（3）中获得的P2代细胞以1×10⁴/cm²接种密度分别接种到5个T175的培养瓶中，37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时，当P2代细胞生长汇合度达到85%-90%的时候，收取P2代细胞的培养上清原液，用3mL的EP管取2mL的待检样品，剩余样本保存在-20℃备用。

（5）过滤浓缩收集精华液过程：将步骤（4）中获得的上清原液，平衡至室温，转入离心管中，在3000rmp条件下离心10分钟，留上清，弃沉淀；将离心得到的140mL左右的上清液转入装好的超滤杯中，旋好杯盖，按下卡扣，接通氮气，缓慢调整氮气压力，先开罐体阀门，然后调节分压阀门，在10psi条件下使离心上清透过100KD超滤膜。待杯内液体下降到7mL左右时，停止过滤，先关掉分压阀门，然后关掉罐体阀门，留取过滤液；清洗超滤杯，将100KD透过液转入装好3KD超滤膜的超滤杯中，在氮气压力55psi的条件下超滤，待杯内液体达到14mL时停止加压，将3KD截留液也用3mLEP管留取2mL，用于伤口愈合因子检测，其余样品放入-20℃冰箱中暂存。

(6)伤口愈合因子浓度检测：此步骤中所用的检测试剂盒均为R&D System品牌，在检测之前先用试剂盒中的标准品测出各检测项目标准品的OD值，并制作标准曲线备用；对步骤（4）收集到的细胞因子上清原液和步骤（5）收集到的细胞因子上清浓缩液统一从冰箱中取出，恢复到室温，分别进行白细胞介素 8（IL8），白细胞介素 6（IL6），转化生长因子 1（TGF-β1），单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1），血管内皮生长因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 总共7个指标的检测；每个样品的每项检测指标均严格按照使用说明进行实验操作，将计算出的OD值根据各标准曲线换算成对应的浓度，结果见下表1。

对浓缩液进行除菌分装：将浓缩好的干细胞因子上清液，先经过0.22um的滤器进行除菌过滤，除菌后以5ml/瓶分装到安瓿瓶中，4℃保存备用。

通过对浓缩前后的伤口愈合因子进行检测，发现间充质干细胞培养上清液确实存在大量的伤口愈合因子，其中TIMP-1和MCP-1分泌量最多，经过10倍浓缩后，虽然大部分都有40%以上的损失量，但是仍然能够收集到50%-60%的伤口愈合因子，证明此方法获取高浓度的细胞因子还是非常有效果的。

根据本发明所述方法制备的脐带间充质干细胞，按照2006年国际细胞治疗协会（ISCT）制定的标准进行生物学鉴定，其中表面抗原阳性指标CD73，CD90，CD105表达率≥95%，阴性指标CD34，CD45，CD19，CD11b，HLA-DR的表达率≤2%。

安全性检测：①细菌/真菌培养；②病毒检测，包括艾滋病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋体，人巨细胞病毒；③内毒素检测；④原癌基因检测，包括不同代次c-myc、Bmi1、H-ras三个基因的表达水平；⑤支原体检测等。所有安全性指标符合要求后，才能作为合格安全的产品使用。

此发明优势有以下几点。

在细胞培养过程中，使用的试剂种类少，相对来说培养基的配置简单，操作方便，并且培养效果非常好，大大缩短了培养的时间。

本发明所使用的培养基是干细胞临床级专用培养基（LONZA-UItraCULTURESerum-free Medium和life-UItoser混合液），用此方法获得高浓度的伤口愈合因子精华液，具有生物活性，并且无动物来源的添加剂，也减少了支原体、真菌、和病毒等微生物的危险，对人类来说，使用起来更加安全有效。

本发明根据各个细胞因子的分子量不同，分别为：白细胞介素 8（IL8）分子量为69-79KD；白细胞介素6（IL6）分子量为21-30KD；转化生长因子 1（TGF-β1）分子量为44.3KD；单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）分子量为8-10KD；血管内皮生长因子（VEGF）分子量为34-45KD；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分子量为18-22KD；基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）分子量为25.21KD，选择适合的滤膜区间3KD-100KD，保障了所有要收集的伤口愈合因子都在此区间范围内，为获得高纯度的浓缩液提供了理论基础。

本发明获得了高浓度的细胞因子精华液，并且对间充质干细胞进行了表型鉴定，终产品进行了安全性检测，保障了产品的整个生产工艺的安全性，是值得信赖的产品。

附图说明

图1根据本发明的实例二中的A方法，大部分组织块周围都有间充质干细胞细胞爬出时的状态。

图2根据本发明的实例二中的A方法，此时间充质干细胞的汇合度达到85%左右，可以进行传代培养时候的状态。

图3根据本发明的实例二中的B方法，在有组织块的情况下，间充质干细胞密度达到85%左右，可以将组织取出传代培养时候的状态。

图4根据本发明的实例四中，P2代间充质干细胞继续扩大培养，汇合度达到85%左右时候的状态。

图5间充质干细胞流式表型鉴定结果。

图6梅毒、丙肝、HIV的检测结果。

图7 HBV病毒检测结果。

图8内毒素检测结果。

图9原癌基因检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。

一、分离脐带组织。

将获取的脐带组织，在24小时内处理采集的脐带组织，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，一般要冲洗2-3遍，后将脐带组织剪成小段，每段大约长2cm，之后去掉脐带内的2条动脉血管和1条静脉以及脐带表面羊膜组织，将剩余部分用镊子和手术刀分离开，得到需要培养的组织块。

二、培养获取的组织块，分成两个组分别进行。

A.将分离出的组织块放在150mm的培养皿中，将组织块用手术刀继续切割，大小在1mm³左右，将切好的组织块，转移到T175的培养瓶中，加入间充质干细胞专用培养基（LONZA-UItraCULTURE Serum-free Medium和life-UItoser混合液），放在37℃，5%CO₂（v/v）培养箱中静置培养，第3天换液，之后每2天换一次液，观察大部分组织块都有细胞爬出后，见图1，去掉组织块，换液，在细胞的汇合度达到80%-90%之间见图2，进行传代扩增。

B.将分离出的组织块放在150mm的培养皿中，将组织块用手术刀继续切割成大小为1mm³左右的小块，将切好的组织块转移到T175的培养瓶中，加入间充质干细胞专用培养基（LONZA-UItraCULTURE Serum-free Medium和life-UItoser混合液），放在37℃，5%CO₂（v/v）培养箱中静置培养，第3天换液，之后每3天换一次液，组织块一直跟细胞一起进行培养，观察当细胞的汇合度达到80-90%的时候见图3，将组织块取出，进行传代扩增。

经过两组对比试验发现，在培养获取的组织块中，组织块从中间取出，或者最后取出，对于间充质干细胞P0代细胞的整体培养扩增效果并没有很大影响，两种方法都可以成功获得健康充足的间充质干细胞。

三、获取P2代间充质干细胞。

将T175的培养瓶，放在百级超净台中，用10ml移液器将培养瓶中的培养上清液转移到离心管中备用；再用PBS清洗两遍，然后再将T175的培养瓶中加入5ml胰蛋白酶，在显微镜下观察消化情况，当细胞都处于悬浮并呈圆形状态时，用培养基上清液终止反应，并300g离心5min收集细胞，弃上清；收集细胞用PBS重悬吹打清洗细胞，300g离心5min弃上清；将P1代细胞用间充质干细胞专用培养基重悬细胞，加入到T175的培养瓶中继续培养，当汇合度达到90%左右时，加入5mL胰蛋白酶，在显微镜下观察消化情况，当细胞都处于悬浮并呈圆形状态时，用培养基上清液终止反应，并300g离心5min收集细胞，弃上清，获得P2代细胞，并用间充质干细胞专用培养基重悬细胞。

四、P2代细胞的扩大培养。

将重悬好的间充质干细胞以1×10⁴个细胞/cm²的密度接种到5个T175的培养瓶中继续培养，37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时，当P2代细胞生长汇合度达到85%-90%的时候，见图4，收取P2代细胞的培养上清原液，用3mL的EP管分别取2mL的上清原液待检样品，进行伤口愈合因子的原液检测，将待检样品和剩余样本保存在-20℃备用。

五、上清液过滤浓缩。

将上清原液，平衡至室温，转入离心管中，在3000rmp条件下离心10分钟，留上清，弃沉淀；将离心得到的140mL左右的上清液转入装好的超滤杯中，旋好杯盖，按下卡扣，接通氮气，缓慢调整氮气压力，先开罐体阀门，然后调节分压阀门，在10psi条件下使离心上清透过100KD超滤膜。待滤出液体积达到133ml时，停止过滤，先关掉分压阀门，然后关掉罐体阀门，留取过滤液；清洗超滤杯，将100KD透过液转入装好3KD超滤膜的超滤杯中，在氮气压力55psi的条件下超滤，待杯内液体达到14ml时停止加压，将3KD截留液也用3mLEP管留取2ml待检样品，其余样品放入-80℃冰箱中暂存。

六、ELISA检测伤口愈合因子。

所用的检测试剂盒均为R&D System品牌的，在检测之前先用试剂盒中的标准品测出各检测项目标准品的OD值，并制作标准曲线备用；对干细胞培养上清原液和干细胞培养上清浓缩液统一从冰箱中取出，恢复到室温，分别进行白细胞介素 8（IL8），白细胞介素 6（IL6），转化生长因子 1（TGF-β1），单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1），血管内皮生长因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 总共7个指标的检测；每个样品的每项检测指标均严格按照使用说明进行实验操作，将计算出的OD值根据各标准曲线换算成对应的浓度。

七、间充质干细胞免疫表型鉴定。

取第2代细胞，流式细胞术检测间充质干细胞免疫表型，待细胞汇合度达90%左右时，消化收集细胞，计数后按1×10⁶个细胞/管，分装5管；PBS清洗后，1000rpm离心5分钟，弃上清，残留200μl，吹打混匀细胞；分别加入PE标记的CD34，CD73，CD105，CD11b抗体以及FITC标记的CD19，CD45，CD90和HLA-DR抗体，并设计阴性对照；在4℃下，避光反应30分钟，PBS清洗后，1000rpm离心5分钟，弃上清，用 200μl 的PBS吹打混匀细胞后直接上样检测；也可用200μl的1%多聚甲醛固定，置4℃冰箱于3日内上样检测。流式免疫表型检测结果符合间充质干细胞的特征，如图5所示。

八、产品安全性检测。

对收集到的细胞培养上清液进行细菌/真菌培养，结果显示为阴性；用Elisa方法进行病毒检测，包括艾滋病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋体，人巨细胞病毒，检测结果见图6和图7；用鲎试剂方法检测内毒素含量，显示为阴性；④支原体检测检测结果如图8，其中图6、7和8中的检测样品编号都命名为CSC2017101001。

原癌基因检测:原癌基因（proto-oncogene）是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必需的，在进化上高度保守。当原癌基因的机构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，细胞增殖与分裂失去控制，从而形成肿瘤。检测体外传代培养的间充质干细胞是否表达原癌基因，可预警发生恶性转化的间充质干细胞，对保证间充质干细胞产品的安全性起到重要作用。

本发明采用real-time PCR方法，测定P1、P6、P11和P16共四个代次的间充质细胞原癌基因c-myc、Bmi1、H-ras的表达情况。本发明的检测结果表明，四个代次表达水平都比较低，没有显著高水平表达的代次，如图9所示，表明本方法提取的脐带间充质干细胞没有发生恶性转化的迹象。

Claims (12)

1.脐带的选取：选取1根健康产妇正常分娩的脐带组织，为孕妇自愿的前提下选取，2℃～8℃条件下保存。

2.分离脐带组织：根据权利要求1中取得的脐带组织，在24小时内将包含间充质部分的组织块分离出来，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，将脐带组织剪成小段，并将脐带内血管去除，后将脐带表面的羊膜组织也剥离开，剩余的部分用镊子和手术刀分离开，得到含有间充质干细胞的组织块。

3.组织块的培养：将组织块转移到150mm的培养皿中，用18号手术刀片切割成1mm³左右的小块，将小组织块转移到T175的培养瓶中，加入脐带间充质干细胞专用培养基，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。

4.获取P2代细胞：观察脐带间充质干细胞的生长状态，当汇合度达到50%的时候将培养瓶中的组织块取出，继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰蛋白酶消化，获取P1代细胞，P1代细胞转移到T175的培养瓶中继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰酶消化，获得P2代细胞。

5.获取干细胞培养上清原液：将P2代细胞以1×10⁴/cm²接种密度分别接种到5个T175的培养瓶中培养，37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时，当P2代细胞生长汇合度达到85%-90%的时候，收取P2代细胞的培养上清原液，-20℃储存备用。

6.获取浓缩精华液：对权利要求5的上清液在3000rpm条件下离心10分钟，留上清弃沉淀；然后通过100KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩精华液，经过滤器除菌过滤后，经安瓿瓶进行分装。

7.伤口愈合因子浓度检测：用ELISA方法检测权利要求5中留取的上清原液样品和权利要求6中留取的精华液样品中白细胞介素 8（IL8），白细胞介素 6（IL6），转化生长因子 1（TGF-β1），单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1），血管内皮生长因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 的浓度水平。

8.用于权利要求7中的脐带间充质干细胞培养上清原液和浓缩液待检样品，在检测前应恢复到室温，避免反复冻融。

9.实验以样本稀释液为空白对照，并作复孔检测，检测的整个过程要严格按照ELISA因子检测试剂盒说明书进行检测。

10.根据权利要求1-6所述的间充质干细胞因子精华液的制备方法，其特征在于，所述的脐带组织来源的间充质干细胞是通过以下方式获得的：（1）冲洗脐带组织，优选的使用含有青霉素-链霉素的氯化钠盐缓冲液冲洗脐带组织；（2）将脐带组织切成小块后，优选1mm³左右的小块，平铺于培养瓶底部，进行培养。

11.权利要求6中，选取的浓缩区间范围是3KD-100KD之间，其中要收集和检测的伤口愈合因子的分子量都在此范围内，其分别是：白细胞介素 8（IL8）分子量为69-79KD；白细胞介素6（IL6）分子量为21-30KD；转化生长因子 1（TGF-β1）分子量为44.3KD；单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）分子量为8-10KD；血管内皮生长因子（VEGF）分子量为34-45KD；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分子量为18-22KD；基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）分子量为25.21KD。

12.权利要求7中所用的检测试剂盒均为R&D System品牌的，先用试剂盒中的标准品测出各标准品的OD值，并制作标准曲线备用；样品在检测之前统一在冰箱中取出，恢复到室温，每个样品的每项检测指标均严格按照使用说明进行实验操作，将计算出的OD值根据各标准曲线换算成对应的浓度。