CN110191702A

CN110191702A - 用于治疗受损皮肤组织的局部敷料组合物

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Publication number: CN110191702A
Application number: CN201780064252.2A
Authority: CN
Inventors: 哈比尔·F·赫拉基瓦拉; 扎哈比亚·赫拉基瓦拉; 维杰·夏尔马
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-08-30
Also published as: ZA201902275B; WO2018073837A1; US20190262494A1; MX2019004314A; CA3040197A1; BR112019007815A2; AU2017345677A1; JP2019531159A; AU2017345677A2; EP3528783A1

Abstract

本发明涉及用于治疗个体中受损皮肤组织的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的间充质干细胞。特别地，本发明涉及用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂。

Description

用于治疗受损皮肤组织的局部敷料组合物

技术领域

本发明涉及用于治疗个体中受损皮肤组织的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的间充质干细胞。特别地，本发明涉及用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40，000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂。

背景技术

干细胞的特征在于它们的自我更新能力和分化潜能。这些细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。大多数成体干细胞是在成体器官中发现的可以分化成其来源组织的特定细胞类型的次要群体，例如间充质干细胞。一些证据表明，在适当的环境下，间充质干细胞能够分化成中胚层，内胚层甚至外胚层细胞。此外，间充质干细胞具有迁移和移植到宿主组织中的能力，这有助于修复和增强组织再生。

间充质干细胞介导的免疫调节作用可用于治疗各种自身免疫疾病，例如克罗恩病，1型糖尿病，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，干燥综合征和系统性硬化症。然而，尽管它们对免疫应答具有深远的影响，但这些疗法在某些患者中不会引起临床上显著的缓解。一些文献和专利公开了从患者分离的血液成分在治疗包括自身免疫和皮肤病在内的几种疾病的用途。

间充质干细胞是多能细胞，可以在几种组织中发现，例如骨髓，脂肪组织，滑膜，乳牙，脐带血和血管。间充质干细胞是用于治疗的有希望的细胞类型，因为它们具有分化成修复组织的潜力并且还具有营养和免疫调节能力。虽然它们已被证明能够改善受损组织，但它们的贡献似乎并非源于长期植入和分化。这表明间充质干细胞除了能够分化成中胚层谱系的细胞外，还可以刺激内源性组织修复。此外，已显示由MSC分泌的生长因子如转化生长因子β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)影响组织修复和免疫过程。间充质干细胞还具有“抗炎”特性。这些细胞分泌减轻炎症并促进正常伤口的伤口愈合的因子。

一些文献和专利公开了间充质干细胞在治疗皮肤病中的用途。Song等人(2016)公开了间充质干细胞的伤口敷料。美国专利8,435,787号公开了使用藻酸盐技术对肝细胞进行微囊化。Bussche等人(2015)公开了用于皮肤伤口愈合的微囊化马间充质基质细胞。Schmitt等人(2015)公开了含有人间充质细胞的系统的基质。Isakson等人(2015)公开了间充质干细胞在使用纤维蛋白喷雾用于皮肤伤口愈合中的用途。Maxson等人(2012)和Duscher等人(2014)公开了间充质干细胞在伤口愈合中的作用。美国公开2012/0141433号公开了汽化干细胞衍生物的组合物及其用于治疗皮肤血管疾病的方法，例如静脉曲张，慢性(长期)静脉功能不全，血栓性静脉炎和动静脉瘘。

已知间充质干细胞不稳定，并且当在环境条件下储存时它们的活力受到损害。需要开发含有间充质干细胞的储存稳定的局部敷料组合物，其中大多数间充质干细胞保持存活用于治疗受损皮肤组织。

发明内容

在本发明的一个一般方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂。

在本发明的另一个一般方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的所含间充质干细胞保持存活。

在本发明的另一个一般方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的所述间充质干细胞保持存活。

在本发明的另一个一般方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的双室喷雾形式的储存稳定的局部敷料组合物，所述组合物含有(i)一个室中的间充质干细胞和局部基质组分，和(ii)另一个室中的胶凝组分，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，超过约80％的间充质干细胞保持存活。

在另一实施方案中，将间充质干细胞组分(一个室)与含有氯化钙溶液的胶凝组分(另一个室)分离。

在本发明的另一个一般方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的凝胶形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述凝胶合有嵌入局部基质中的间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述局部凝胶在约25℃下储存至少6个月时，超过约80％的所述间充质干细胞保持存活。

在本发明的另一个一般方面，提供了治疗个体中受损皮肤组织的方法，所述方法包括：(i)向受损皮肤组织区域施用含有每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞和药学上可接受的赋形剂的组合物，和(ii)在间充质干细胞组合物上施用冻干粉末形式的局部基质和任选的药学上可接受的赋形剂，从而在受损皮肤组织上形成原位海绵剂。

在本发明的一实施方案中，受损皮肤组织包括创伤性伤口，手术伤口，糖尿病性溃疡，压迫性溃疡，静脉性溃疡，瘢痕，烧伤，皮损，湿疹和皮肤溃疡。受损皮肤组织的非限制性实例包括糖尿病足溃疡，寻常型天疱疮，以及大疱性表皮松解症，脓疱病，化脓性汗腺炎，瘢痕疙瘩，扁平苔藓。

在本发明的另一实施方案中，间充质干细胞来源于个体的脂肪组织，骨髓，华顿氏胶质(Whartons jelly)，牙齿组织或脐带，优选所述间充质干细胞来源于脂肪组织；其中所述间充质干细胞适合自体移植或同种异体移植。

在本发明的另一实施方案中，局部敷料组合物含有选自血管内皮生长因子，肝细胞生长因子，成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的生长因子。

在本发明的一实施方案中，局部敷料含有每平方厘米高达约40,000，或约35,000，或约30,000，或约25,000，或约20,000，或约15,000或约10,000个间充质干细胞。优选地，局部敷料每平方厘米含有约10,000至约30,000，或约15,000至约25,000，或约20,000个间充质干细胞。

在本发明的另一实施方案中，当所述组合物在约25℃下储存至少约6个月时，超过约85％，或超过约80％的所含间充质干细胞保持存活。优选地，当所述组合物在约25℃下储存约12个月，或约18个月，或约24个月时，间充质干细胞保持存活。

在一实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，该组合物也是稳定的。优选地，当所述组合物在约2℃至约8℃下储存约6个月，约12个月，或约18个月，或约24个月时，间充质干细胞保持存活。

在本发明的又一实施方案中，局部基质包括藻酸盐，聚氨酯，胶原，壳聚糖，果胶和透明质酸。在另一实施方案中，局部基质包括2％w/v的藻酸盐溶液，或2％w/v的壳聚糖溶液，或2％w/v的透明质酸溶液。

在本发明的另一实施方案中，组合物是溶液，悬浮液，乳液，软膏，泡沫，糊剂，凝胶，喷雾剂，绷带，贴剂，霜剂，洗剂或粉末的形式。在本发明的上下文中，组合物为绷带或贴剂的形式。

在本发明的另一实施方案中，绷带或贴剂是无菌的，其中绷带或贴剂的厚度为约0.5mm至约10mm。

在本发明的另一实施方案中，提供了制备绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)将无菌纱布片放置在不锈钢铸模上；

b)将间充质干细胞和藻酸盐基质应用于所述无菌纱布片上；

c)将所述铸模放入氯化钙溶液浴中；

d)将所述铸模转移到含有磷酸盐缓冲溶液的浴中以洗去过量的钙；

e)将所述纱布片放入培养基瓶中进行培养；

f)在37℃，5％CO₂培养所述纱布片，持续14天；和

g)将培养的纱布片置于三层小袋中以获得所述局部敷料组合物。

在另一实施方案中，本发明涉及在局部敷料组合物中稳定间充质干细胞的方法，所述方法包括在局部基质中与药学上可接受的赋形剂一起嵌入每平方厘米多达约40，000个间充质干细胞，其中至少当所述组合物在约25℃下储存至少约6个月时，约80％的所含间充质干细胞保持存活。

附图说明

图1显示了在人个体中施用局部敷料组合物之前和6周之后的伤口表面的照片比较。

图2显示了在人个体中施用局部敷料组合物之前和3个月之后的伤口表面的照片比较。

图3显示了在人个体中浸渍到海绵剂上的间充质干细胞的照片呈现。

具体实施方式

虽然已经就其具体实施方案描述了本发明，但某些修改和等同对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围内。

本发明的发明人惊奇地发现间充质干细胞用于治疗个体中受损皮肤组织例如急性或慢性伤口的有益用途。本发明人发明了用于修复受损皮肤组织的稳定有效的局部敷料组合物，所述组合物含有嵌入局部基质中的间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂。

在本发明的另一个方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的所含间充质干细胞保持存活。

在本发明的另一个方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的间充质干细胞保持存活。

在本发明的另一个方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的双室喷雾形式的储存稳定的局部敷料组合物，所述组合物含有(i)一个室中的间充质干细胞和局部基质组分，和(ii)另一个室中的胶凝组分，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，超过约80％的间充质干细胞保持存活。

在另一实施方案中，胶凝组分含有第二室中含有的氯化钙溶液，其与第一室物理分离。在另一实施方案中，氯化钙溶液在致动时不与喷雾中的间充质干细胞成分混合。

在本发明的另一个一般方面，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的凝胶形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述凝胶含有嵌入局部基质中的间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述局部凝胶在约25℃下储存至少6个月时，超过约80％的间充质干细胞保持存活。

如本文所用，术语“储存稳定”涉及含有间充质干细胞的局部敷料组合物，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的间充质干细胞保持存活。

如本文所用，术语“局部敷料”涉及本发明组合物在损伤皮肤组织的部位的外部施用。因此，这种局部敷料组合物可用于包括其中组合物通过与待处理的皮肤表面直接接触而在外部施用的那些药物形式的发明。

如本文所用，术语“治疗”是指来自本发明的局部敷料组合物的有益或期望的临床结果。

如本文所用，术语“受损皮肤组织”是指具有任何类型损伤的皮肤组织。

如本文所用，术语“存活”是指保持活性和功能的间充质干细胞。

如本文所用，术语“间充质干细胞”是指来源于个体的脂肪组织，骨髓，华顿氏胶质(Whartonsjelly)，牙齿组织或脐带的间充质干细胞。

如本文所用，术语“自体”是指来源于相同个体的细胞或组织。

如本文所用，术语“同种异体”是指来源于相同物种的另一个遗传上不相似的个体的细胞或组织。

在本发明的一实施方案中，受损皮肤组织包括急性伤口和/或慢性伤口。

间充质干细胞是非造血细胞，多能细胞，可以分化成多种不同的细胞类型，并产生骨骼，软骨和其他间充质组织。间充质干细胞在形态学上由具有少量细胞突的小细胞体表征。细胞体含有大而圆的细胞核，细胞核突出，被精细分散的染色质颗粒包围，使细胞核具有清晰的外观。细胞体的其余部分含有少量高尔基体，粗面内质网，线粒体和多核糖体。细长的细胞广泛分散，邻近的细胞外基质由少量网状原纤维组成，但没有其他类型的胶原原纤维。

在本发明的一实施方案中，间充质干细胞来源于个体的脂肪组织，骨髓，华顿氏胶质(Whartonsjelly)，牙齿组织或脐带。优选地，间充质干细胞来源于脂肪组织，并且这种间充质干细胞适合于自体移植或同种异体移植。

在本发明的另一实施方案中，组合物含有选自血管内皮生长因子，肝细胞生长因子，成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的生长因子。

在本发明的一实施方案中，局部敷料含有每平方厘米约10,000至约30,000，或约15,000至约25,000，或约20,000个间充质干细胞。

在另一实施方案中，局部敷料组合物含有每平方厘米约10,000，或约15,000，或约20,000，或约25,000，或约30,000，或约35,000，或约40,000个间充质干细胞。每种量构成本发明的另一实施方案。

局部基质是降低间充质干细胞从伤口部位迁移的趋势的潜在解决方案。基质有助于固定细胞以使细胞存活。在本发明的另一实施方案中，局部基质包括藻酸盐，聚氨酯，胶原，壳聚糖，果胶和透明质酸。在另一实施方案中，局部基质包括2％w/v的藻酸盐溶液，或2％w/v的壳聚糖溶液，或2％w/v的透明质酸溶液。

在本发明的另一实施方案中，绷带或贴剂是无菌的，并且其中绷带或贴剂的厚度为约0.5mm至约10mm，或约1mm，或约2mm，或约3mm，或约4mm，或约5mm，或约6mm，或约7mm，或约8mm，或约9mm。每种量构成本发明的另一实施方案。

a)将无菌纱布片放置在不锈钢铸模上；

b)将间充质干细胞和藻酸盐基质应用于所述无菌纱布片上；

c)将所述铸模放入氯化钙溶液浴中；

e)将所述纱布片放入培养基瓶中进行培养；

f)在37℃，5％CO₂培养所述纱布片，持续14天；和

在本发明的一实施方案中，局部敷料组合物任选含有选自增稠剂，缓冲剂，表面活性剂，抗氧化剂，稳定剂和溶剂的药学上可接受的赋形剂。

本文所用的“增稠剂”包括但不限于阴离子纤维素材料中的一种或多种，例如羧甲基纤维素钠；阴离子聚合物，如羧乙烯基聚合物；非离子纤维素材料，如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素；羟乙基纤维素；阳离子纤维素材料，如Polymer JR 400；阳离子胶材料，如Jaguar C₁₃S；其他胶材料，如阿拉伯树胶，黄蓍胶，刺槐豆胶，瓜尔豆胶和角叉菜胶；蛋白质，如白蛋白和蛋白质水解物；粘土材料，如膨润土，锂蒙脱石，硅酸铝镁，硅酸钠镁及其组合。优选的增稠剂是羟乙基纤维素。

增稠剂的浓度范围为组合物重量的约5％至约25％，或组合物重量的约10％，或约15％，或约20％。每种浓度构成本发明的另一实施方案。优选的浓度为组合物重量的约5％，或约10％，或约15％，或约20％。

本文所用的“防腐剂”包括但不限于乙醇，苯甲酸，苯甲酸钠，山梨酸，山梨酸钾，丙酸钠，以及对羟基苯甲酸的甲基，乙基，丙基和丁基酯中的一种或多种，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇，苯氧基乙醇，二溴二氰基丁烷，福尔马林，三氯生及其组合。防腐剂的浓度范围为组合物重量的0.1％至2％，或组合物重量的约0.1％，或约0.2％，或约0.3％，或约0.4％，或约0.5％，或约0.6％，或约0.7％，或约0.8％，或约0.9％，或约1.0％，或约1.1％，或约1.2％，或约1.3％，或约1.4％，或约1.5％，或约1.6％，或约1.7％，或约1.8％，或约1.9％，或约2％。防腐剂的优选浓度为组合物重量的约0.3％，或约0.45％，或约0.5％，或约0.65％，或约0.75％。

本文所用的“缓冲剂”包括但不限于柠檬酸，柠檬酸一水合物，硼酸，和磷酸，柠檬酸钠，柠檬酸钠二水合物，磷酸二氢钾，磷酸二钠及其组合中的一种或多种。

本文所用的“表面活性剂”可选自包括以下中的一种或多种的组：双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠，双(十三烷基)磺基琥珀酸钠，双(二烷基)磺基琥珀酸盐，聚二甲基硅氧烷和聚乙烯/聚丙烯-氧化物的共聚物中的一种或多种，聚氧丙烯(12)聚二甲基硅氧烷，十六烷基PEG/PPG-10/1聚二甲基硅氧烷，月桂酸己酯和聚甘油-4-异硬脂酸酯，PEG-10聚二甲基硅氧烷，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，脱水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80)，聚乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯，聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯20十六烷基醚，聚乙二醇叔辛基苯基醚，二(2-乙基己基)磷酸钠，二(油基)磷酸钠，二(十三烷基)磷酸钠，十二烷基苯磺酸钠，3-十二烷基氨基丙磺酸钠，3-十二烷基氨基丙酸钠，N-2-羟基十二烷基-N-甲基牛磺酸钠，卵磷脂，蔗糖脂肪酸酯，2-乙基己基甘油，辛酰甘氨酸醇，单烷基二醇的长链疏水邻位二醇，单烷基甘油，或单酰基甘油，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚乙二醇氢化蓖麻油，油酸钾，油酸钠，氯化十六烷基吡啶，溴化烷基三甲基铵，苯扎氯铵，溴化联十二烷基二甲基铵，溴化三辛基甲基铵，十六烷基三甲基溴化铵，十六烷基二甲基乙基溴化铵，及其组合。优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80，油酸钠，卵磷脂，蔗糖脂肪酸酯和聚氧乙烯蓖麻油衍生物。每个构成本发明的替代实施例

本文所用的合适的“抗氧化剂”可选自包括以下中的一种或多种的组：乙酰半胱氨酸，抗坏血酸，抗坏血酸多肽，抗坏血酸二棕榈酸酯，抗坏血酸甲基硅醇果胶酸酯，抗坏血酸棕榈酸酯，抗坏血酸硬脂酸酯，BHA，BHT，叔丁基对苯二酚，半胱氨酸，半胱氨酸HCl，二戊基对苯二酚，二叔丁基对苯二酚，联十六烷基硫代二丙酸酯，二油基生育酚甲基硅烷醇，抗坏血酸硫酸二钠，二硬脂酸基硫代二丙酸酯，硫代二丙酸双十三烷基酯，没食子酸十二烷基酯，异抗坏血酸，抗坏血酸酯，阿魏酸乙酯，阿魏酸，没食子酸酯，对苯二酚，巯基乙酸异辛酯，曲酸，抗坏血酸镁，抗坏血酸磷酸镁，抗坏血酸甲基硅醇，天然植物抗氧化剂如绿茶或葡萄籽提取物，去甲二氢愈创木酸，没食子酸辛酯，苯基硫代乙醇酸，抗坏血酸生育酚磷酸钾，亚硫酸钾，没食子酸丙酯，醌，迷迭香酸，抗坏血酸钠，亚硫酸氢钠，异抗坏血酸钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，超氧化物歧化酶，硫代乙醇酸钠，山梨醇糠醛，硫二甘醇，硫代二乙酰胺，硫代二乙醇酸，硫代乙醇酸，硫代乳酸，硫代水杨酸，生育酚聚醚-5，生育酚聚醚-10，生育酚聚醚-12，生育酚聚醚-18，生育酚聚醚-50，生育酚，tocophersolan，生育酚乙酸酯，生育酚亚油酸酯，生育酚烟酸酯，生育酚琥珀酸酯，三(壬基苯基)磷酸酯，及其组合。

在本发明的另一实施方案中，使用脂肪形成，软骨形成和成骨分化培养基评估间充质干细胞分化的能力。细胞表面标志物通过流式细胞术评估。在流式细胞仪通过染料排除7AAD分析测定细胞的存活力。使用Cycle Test BD和FITC BrdU Flow Kit(BDBisSciences)确定细胞周期分析和DNA倍性。支原体以及sox2，nanog的表达分别通过PCR和RT-PCR进行。使用LAL测定试剂盒和微生物培养方法确定内毒素和无菌。

在另一实施方案中，使间充质干细胞生长并在本领域技术人员已知的生长培养基中制备其悬浮液。优选的培养基选自但不限于磷酸盐缓冲盐水，生理盐水，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，Hank平衡盐溶液(HBSS)，DMEM-F12和DMEM-低葡萄糖。最优选的培养基是DMEM。

在另一实施方案中，本发明涉及在局部敷料组合物中稳定间充质干细胞的方法，所述方法包括在局部基质中与药学上可接受的赋形剂一起嵌入每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，其中至少当所述组合物在约25℃下储存至少约6个月时，约80％的所含间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的每平方厘米约10,000至约30,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月或至少12个月时，至少约80％的所含间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约15,000至约25,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月或至少12个月时，至少约90％的所含间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约15,000至约22,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约2℃至约8℃下储存至少12个月或至少18个月时，至少约90％的所含间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约18,000至约22,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月或至少12个月时，至少约90％的间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了用于治疗个体中受损皮肤组织的绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约20,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约2℃至约8℃下储存至少12个月或至少18个月时，至少约90％的间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了用于治疗个体的急性和/或慢性伤口的无菌绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约18,000至约22,000个间充质干细胞和包装在层压袋中的无菌纱布，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月或至少12个月时，至少约90％的间充质干细胞保持存活。

在本发明的一实施方案中，提供了小袋或小包装，其含有用于治疗个体的急性和/或慢性伤口的无菌绷带或贴剂形式的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约18,000至约22,000个间充质干细胞，和无菌纱布，其中当小袋或小包装在约25℃下储存至少6个月或至少12个月时，至少约90％的间充质干细胞保持存活。在一实施方案中，小袋或小包装由包括聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚丙烯，铝，聚烯烃，聚酰胺，聚氯乙烯，乙基乙烯基共聚物和聚苯乙烯的材料制成。

在本发明的一实施方案中，提供了试剂盒，其含有(i)用于治疗个体的急性和/或慢性伤口的无菌绷带或贴剂形式的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入藻酸盐基质中的每平方厘米约18,000至约22,000个间充质干细胞和无菌纱布，和(ii)含有棉，包裹物和伤口清洁剂的外科手术辅助物；其中当小袋或小包装在约25℃下储存至少6个月或至少12个月时，至少约90％的间充质干细胞保持存活。

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例仅用于举例说明本发明，并不限制本发明的范围。某些修改和等同对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围内。

实施例

实施例1：间充质干细胞的局部绷带/贴剂组合物

用0.01M PBS洗涤来自个体的脂肪组织的间充质干细胞，并转移到用10％FBS完全培养基(补充有10％FBS的DMEM培养基)预先润湿的一次性培养瓶底部，并在37℃、5％CO₂、潮湿的环境培养1-2小时。培养基每三天更换一次。当细胞达到＞80％汇合时，用0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)EDTA对细胞进行胰蛋白酶消化，并以2×10⁴细胞/cm²的密度进行传代培养。

在DMEM培养基中制备含有间充质干细胞(约100×10⁸个细胞)和2％藻酸钠的5mL悬浮液。

制备绷带/贴剂形式的局部敷料组合物的方法：

a)将无菌纱布片放置在不锈钢铸模上；

b)将间充质干细胞和藻酸盐基质应用于所述无菌纱布片上；

c)将所述铸模放入氯化钙溶液浴中；

e)将所述纱布片置于培养基瓶中进行培养；

f)将所述纱布片在37℃，5％CO₂下培养14天；和

g)将培养的纱布片置于三层小袋中，得到绷带/贴剂形式的局部敷料组合物。

实施例1A：实施例1的局部绷带/贴剂组合物在伤口愈合中的应用。

局部绷带/贴剂已用于治疗个体中受损皮肤组织，即伤口。实施例1的局部敷料组合物的应用适用于自体移植或同种异体移植。根据实施例1，在无菌条件下制备局部绷带/贴剂。在施用绷带/贴剂之前，用无菌生理盐水轻轻冲洗伤口以除去碎片。将含有间充质干细胞的局部贴剂施用于受伤的皮肤表面。将局部绷带/贴剂留在伤口上3至7天。局部绷带/贴剂应用已重复至少3次，直至观察到伤口闭合。从表1，表2和图1的结果可以明显看出，在3个月的治疗结束时观察到伤口区域已经被显著修复并且伤口完全闭合。

表1

表2

实施例1B：间充质干细胞的生存力的稳定性数据。

使用脂肪形成，软骨形成和成骨分化培养基评估分离和培养的间充质干细胞的分化能力。通过流式细胞术评估细胞表面标志物。在流式细胞仪通过染料排除7AAD分析测定细胞的存活力。

为了研究，按照实施例1中给出的程序制备表3中提到的六种局部敷料组合物(C1，C2，C3，C4，C5和C6)。

表3

从表2中显而易见的是，当所述组合物在约4℃和25℃下储存12个月时，至少约80％的间充质干细胞保持存活。

实施例2：间充质干细胞和冻干藻酸盐粉末的局部组合物：

在DMEM培养基中制备含有间充质干细胞(约100×10⁸个细胞)的5mL悬浮液。制备2％w/v藻酸盐聚合的凝胶并冻干。

实施例2A：实施例2的局部敷料组合物在伤口愈合中的应用：

局部敷料组合物已用于治疗个体中受损皮肤组织，即伤口。实施例2的局部敷料组合物的应用适用于自体移植或同种异体移植。根据实施例2，组合物已在无菌条件下制备。在施用组合物之前，用无菌生理盐水轻轻冲洗伤口以除去碎片。将含有间充质干细胞的组合物施用于受伤的皮肤表面。将冻干粉末应用于间充质干细胞的应用；从而在伤口表面上形成海绵剂。将间充质干细胞浸渍到海绵剂上，如图3所示。将组合物留在伤口表面上1至3天。将组合物应用重复至少3次，直至观察到伤口闭合。从表4和图2的结果可以明显看出，在6周的治疗结束时观察到伤口区域被显著修复并且伤口闭合。

表4

实施例3：间充质干细胞，藻酸盐和钙化剂的双室喷雾组合物：

在Hypo 培养基中制备含有间充质干细胞和2％藻酸钠的5mL悬浮液。分别制备5mL CaCl₂(150mM)溶液。将间充质干细胞-藻酸盐悬浮液和氯化钙溶液无菌填充到具有两个独立室和阀门的容器中，以获得如下的双室喷雾：

A部分：间充质干细胞成分(第一室)

注意：^*间充质干细胞的量可以选自每毫升40,000至80,000,000个细胞。

B部分：钙化成分(第二室)

成分	量(5毫升)
		氯化钙溶液	150mM

实施例3A：实施例3的局部敷料组合物在伤口愈合中的应用：

局部敷料组合物已用于治疗个体中受损皮肤组织，即伤口。实施例3的局部敷料组合物的应用适用于自体移植或同种异体移植。根据实施例3，组合物已在无菌条件下制备。在施用组合物之前，用无菌生理盐水轻轻冲洗伤口以除去碎片。将含有间充质细胞的局部喷雾施用于受伤的皮肤表面。将组合物留在伤口表面上1至3天。将组合物应用重复至少3次，直至观察到伤口闭合。从表5的结果可以明显看出，在8周的治疗结束时伤口区域被显著修复并且伤口闭合。

表5

实施例4：嵌入藻酸盐基质中的间充质干细胞的凝胶组合物：

在Hypo 培养基中制备含有间充质干细胞和2％藻酸钠的悬浮液。制备丙二醇和羟乙基纤维素的混合物。将含有间充质干细胞的悬浮液在搅拌下缓慢加入到丙二醇和羟乙基纤维素的混合物中。最后，加入盐水(氯化钠溶液0.9％w/v)补充体积，得到凝胶组合物。所有步骤均在无菌条件下进行：

注意：^*间充质干细胞含量为每毫升4,00,000个细胞。间充质干细胞的量可以选自每毫升40,000至80,000,000个细胞。

实施例4A：实施例4的局部用组合物在伤口愈合中的应用

局部用组合物已用于修复患者的皮肤伤口。根据实施例4，在无菌条件下制备局部组合物。在施用组合物之前，用无菌生理盐水轻轻冲洗伤口以除去碎片。将含有间充质细胞的局部组合物施用于受伤的皮肤表面。将局部组合物留在伤口上1至3天。局部组合物应用重复至少3次，直至观察到伤口闭合。从表6中显而易见的是，在6周的治疗结束时观察到伤口区域被显著修复并且伤口闭合。

表6

实施例5：间充质干细胞的局部敷料组合物

用0.01M PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤来自个体的脂肪组织的间充质干细胞，并转移到用10％FBS(胎牛血清)完全培养基(补充有10％FBS的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养基)预先润湿的一次性培养瓶底部，并在37℃、5％CO₂、潮湿的环境培养1-2小时。培养基每三天更换一次。当细胞达到＞80％汇合时，用0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)EDTA对细胞进行胰蛋白酶消化，并以2×10⁴细胞/cm²的密度进行传代培养。在Hypo培养基中制备含有间充质干细胞和2％藻酸钠的5mL悬浮液，得到的局部组合物。所有步骤均在无菌条件下进行，如下所示：

实施例6：间充质干细胞的局部敷料组合物

用0.01M PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤来自个体的脂肪组织的间充质干细胞，并转移到用10％FBS(胎牛血清)完全培养基(补充有10％FBS的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养基)预先润湿的一次性培养瓶底部，并在37℃、5％CO₂、潮湿的环境培养1-2小时。培养基每三天更换一次。当细胞达到＞80％汇合时，用0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)EDTA对细胞进行胰蛋白酶消化，并以2×10⁴细胞/cm²的密度进行传代培养。

在Hypo 培养基中制备含有间充质干细胞的5mL悬浮液，以获得局部组合物。所有步骤均在无菌条件下进行，如下所示：

Claims

1.用于治疗个体中受损皮肤组织的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述局部敷料含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的所含间充质干细胞保持存活。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述受损皮肤组织包括创伤性伤口，手术伤口，糖尿病性溃疡，压迫性溃疡，静脉性溃疡，瘢痕，烧伤，皮损，湿疹和皮肤溃疡。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中当所述组合物在约25℃下储存至少约12个月时，至少约85％的所含间充质干细胞保持存活。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述局部敷料含有每平方厘米多达约35,000个间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述局部敷料含有每平方厘米约10,000至约30,000个间充质干细胞。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述局部基质包括藻酸盐，聚氨酯，胶原，壳聚糖，果胶和透明质酸。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为溶液，悬浮液，乳液，软膏，泡沫，糊剂，凝胶，喷雾剂，绷带，贴剂，霜剂，洗剂或粉末的形式。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物为绷带或贴剂的形式。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述间充质干细胞来源于个体的脂肪组织，骨髓，华顿氏胶质(Whartons jelly)，牙齿组织或脐带。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述间充质干细胞适合于自体移植或同种异体移植。

11.用于治疗个体中受损皮肤组织的绷带或贴剂形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述绷带或贴剂含有嵌入局部基质中的每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，至少约80％的间充质干细胞保持存活。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述绷带或贴剂是无菌的。

13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述绷带或贴剂的厚度为约0.5mm至约10mm。

14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述受损皮肤组织包括创伤性伤口，手术伤口，糖尿病性溃疡，压迫性溃疡，静脉性溃疡，瘢痕，烧伤，皮损，湿疹和皮肤溃疡。

15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述间充质干细胞来源于脂肪组织。

16.根据权利要求11所述的组合物，其中所述局部基质包括2％w/v的藻酸盐溶液。

17.制备权利要求11的储存稳定的局部敷料组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)将无菌纱布片放置在不锈钢铸模上；

b)将间充质干细胞和藻酸盐基质应用于所述无菌纱布片上；

c)将所述铸模放入氯化钙溶液浴中；

e)将所述纱布片放入培养基瓶中进行培养；

f)在37℃，5％CO₂培养所述纱布片，持续14天；和

18.用于治疗个体中受损皮肤组织的双室喷雾形式的储存稳定的局部敷料组合物，所述组合物含有(i)一个室中的间充质干细胞和局部基质组分，和(ii)另一个室中的胶凝组分，其中当所述组合物在约25℃下储存至少6个月时，超过约80％的间充质干细胞保持存活。

19.用于治疗个体中受损皮肤组织的凝胶形式的储存稳定的局部敷料组合物，其中所述凝胶合有嵌入局部基质中的间充质干细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂，其中当所述局部凝胶在约25℃下储存至少6个月时，超过约80％的间充质干细胞保持存活。

20.治疗个体中受损皮肤组织的方法，所述方法包括：(i)向受损皮肤组织区域施用含有每平方厘米多达约40,000个间充质干细胞和药学上可接受的赋形剂的组合物，和(ii)在间充质干细胞组合物上施用冻干粉末形式的局部基质和任选的药学上可接受的赋形剂，从而在所述受损皮肤组织上形成原位海绵剂。