CN113769103B - 一种治疗糖尿病皮肤溃疡的间充质干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种治疗糖尿病皮肤溃疡的间充质干细胞制剂及其制备方法。该间充质干细胞制剂包含水胶体凝胶和间充质干细胞；所述水胶体凝胶包括羧甲基纤维素钠和果胶，所述羧甲基纤维素钠和果胶的摩尔比为80～100：1。本发明的间充质干细胞制剂采用特定的水胶体凝胶搭载间充质干细胞，有效延长了间充质干细胞在伤口部位的驻留时间，促进间充质干细胞的植入，且显著提高了糖尿病皮肤溃疡的伤口愈合率，有效促进皮肤组织再生、促进新血管生成和调节巨噬细胞极化，表明本发明的间充质干细胞制剂适用于糖尿病皮肤溃疡的预防和/或治疗。

Description

一种治疗糖尿病皮肤溃疡的间充质干细胞制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗糖尿病皮肤溃疡的间充质干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病皮肤溃疡(Diabetic cutaneous ulcers，DCU)是指糖尿病患者由于长期血糖控制不良，进而引起神经病变及不同程度的各种末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成以及深部组织的破坏。糖尿病皮肤溃疡是糖尿病患者由于神经血管病变导致微循环障碍而发生的溃疡和坏疽，是神经病变、血管病变和局部感染共同作用的结果。糖尿病患者的机体长期处于高糖环境中，导致内源性一氧化氮不足，在高糖环境下白细胞功能缺陷，引起免疫应答不足。同时，新生血管缺乏、创面顽固性细菌感染、皮肤真皮层细胞新生刺激或分化不良都是造成DCU难以愈合的原因。糖尿病皮肤溃疡常反复发作，易形成顽固且难愈性的溃疡，治疗失当易向深部发展，乃至致残、截肢，严重威胁患者的健康和生活质量。传统的药物治疗、血管搭桥术、经皮内血管形成手术和支架置入术等方法在糖尿病皮肤溃疡的治疗方面均存在一定的局限性，体现在效果差、副作用强、患者不适性、诱导慢性炎症发生等，导致这些治疗方法在临床上的应用倍受限制。目前临床上仍缺乏治疗DCU的有效手段。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于发育早期中胚层间质组织或外胚层神经上皮和神经脊的成体干细胞。MSCs是一类异质性细胞群体，具有多系谱分化潜能。在体内，间充质干细胞不仅能分化成其它细胞参与组织损伤修复，还能通过旁分泌作用促进组织再生。专利CN104248644A提供了一种包含温敏性水凝胶和骨髓间充质干细胞的复合制剂，该复合制剂可促进糖尿病皮肤创伤的修复，但是效果并不十分理想，使用后的伤口平均未愈合面积仍高达25％左右。
发明内容
本发明针对上述现有治疗糖尿病皮肤溃疡方法的不足，旨在提供一种治疗糖尿病皮肤溃疡的间充质干细胞制剂及其制备方法，为糖尿病皮肤溃疡的预防和/或治疗提供一种新的药物制剂。
本发明的首要目的是提供一种间充质干细胞制剂。
本发明的另一目的是提供上述间充质干细胞制剂在制备预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡的产品中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种间充质干细胞制剂，包含水胶体凝胶和间充质干细胞；所述水胶体凝胶包括羧甲基纤维素钠和果胶，所述羧甲基纤维素钠和果胶的摩尔比为80～100：1。
优选地，所述羧甲基纤维素钠和果胶的摩尔比为85～95：1。
最优选地，所述羧甲基纤维素钠和果胶的摩尔比为90：1，见实施例1。
由于间充质干细胞移植过程中细胞活力的降低，导致间充质干细胞对糖尿病皮肤溃疡的治疗作用可能会随着时间的推移而逐渐减弱，使治疗效果变差，此外，间充质干细胞存活能力差、伤口处驻留时间短、细胞的植入率低、易流失等因素也严重影响了其对糖尿病皮肤溃疡的治疗效率，因此，本发明用特定的水胶体凝胶(Hydroactive Gel)搭载间充质干细胞，可有效延长间充质干细胞在伤口处的驻留时间，长时间保持细胞的活性，防止细胞流失和植入率低对治疗的不良影响，且由于该水胶体凝胶采用的原料均是天然材料，毒性极低，不会造成细胞的死亡，不会给伤口带来额外影响。
优选地，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或经血间充质干细胞。
最优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，见实施例1。
脐带华通氏胶间充质干细胞，简称脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derivedwharton’s jelly mesenchymal stem cells，WJMSCs)是一类从脐带黏性结缔组织分离获得的间充质干细胞。与其他来源的间充质干细胞相比，WJMSCs具有以下适合于临床应用的特性：1)WJMSCs来源广泛、非侵入性采集、无风险，不存在任何伦理道德争议；2)WJMSCs具有更强的体外扩增能力，相比较于骨髓间充质干细胞，WJMSCs细胞集落形成的频率更高，群体倍增次数更多，一根脐带获取的MSCs数量大约相当于成人5000mL骨髓获得的MSCs数量；3)WJMSCs具有更强的多能性以及自我更新能力，由于来源于胎儿组织，还维持在较早的胚胎阶段，保留了部分早期胚胎干细胞标记及内胚层标记；4)WJMSCs具有强免疫调节能力，WJMSCs高水平表达耐受性分子如IL-10、TGF-β、HLA-G，免疫调节蛋白如CD200、CD273，以及细胞因子如IL-1β、IL-8等，使其表现出更低的免疫原性及更高的免疫抑制活性。
优选地，其制备方法为：水胶体凝胶用磷酸盐缓冲盐溶液、生理盐水或完全培养基稀释后，再搭载间充质干细胞。
针对具体需要，可加入药用上或生理上可接受的物质来调节水胶体凝胶(Hydroactive Gel)温度至临床所需温度，这些物质可选自不同分子量大小的聚乙二醇(PEG)等大分子物质，或是维他命C等小分子物质。
进一步优选地，所述稀释为将水胶体凝胶稀释至5～10倍体积。
最优选地，所述稀释为将水胶体凝胶稀释至5倍体积，见实施例1。
优选地，所述间充质干细胞的浓度为5×106～2×107个/mL。
最优选地，所述浓度为2×107个/mL，见实施例3。
本发明通过构建临床上常用的糖尿病皮肤溃疡模型——二型糖尿病大鼠的皮肤伤口模型，对其伤口进行多组药物的移植，结果显示间充质干细胞制剂组的间充质干细胞在伤口上的驻留时间最长、植入效果好，整体促伤口愈合效果最佳，新生毛囊数目最多，真皮层厚度最厚，疤痕宽度最小，皮肤组织胶原蛋白沉积最多，真皮层中促炎性M1巨噬细胞(CD86阳性)数量最少、抗炎型M2巨噬细胞(CD163阳性)数量最多，Ki-67阳性细胞增殖和CD31阳性血管新生效果最好，表明间充质干细胞制剂可显著提高糖尿病皮肤溃疡的伤口愈合率，显著促进皮肤组织再生和新血管生成，以及有效调节巨噬细胞极化，适用于糖尿病皮肤溃疡的预防和/或治疗。因此，上述间充质干细胞制剂在制备预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡的产品中的应用应在本发明请求保护的范围之内。
优选地，所述预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡包括促进伤口愈合、促进皮肤组织再生、促进新血管生成或调节巨噬细胞极化中的一种或几种。
优选地，所述预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡包括增加真皮层厚度、增加新生毛囊数量、增加胶原纤维沉积量、减少瘢痕宽度、减少促炎型巨噬细胞数量、增加抗炎型巨噬细胞数量、增加细胞总增殖比例或增加新生血管数量中的一种或几种。
本发明具有以下有益效果：
本发明的间充质干细胞制剂采用特定的水胶体凝胶搭载间充质干细胞，有效延长了间充质干细胞在伤口部位的驻留时间，促进间充质干细胞的植入，且显著提高了糖尿病皮肤溃疡的伤口愈合率，有效促进皮肤组织再生、促进新血管生成和调节巨噬细胞极化，表明本发明的间充质干细胞制剂适用于糖尿病皮肤溃疡的预防和/或治疗。
附图说明
图1A是细胞存活情况检测结果；图1B是细胞活性检测结果。
图2A是Hydroactive Gel的形态图；图2B是扫描电镜图。
图3A是细胞形态图；图3B是WJMSCs存活情况检测结果；图3C是WJMSCs存活率；图3D是WJMSCs活性检测结果；图3E是WJMSCs的增殖能力检测结果；图3F是增殖细胞的比例统计结果。
图4A是WJMSCs的凋亡情况检测结果；图4B是WJMSCs的凋亡及抗凋亡相关基因表达情况检测结果；图4C是WJMSCs的线粒体分布及损伤情况检测结果。
图5A是二型糖尿病大鼠的皮肤伤口模型构建及细胞治疗示意图；图5B是伤口愈合情况结果；图5C是第7天伤口愈合率的统计结果；图5D是第14天伤口愈合率的统计结果。
图6A是H&E染色结果；图6B是新生毛囊数目的统计结果；图6C是真皮层厚度的统计结果；图6D是疤痕宽度的统计结果。
图7是Masson三色染色结果。
图8A是CD86阳性M1巨噬细胞的转化情况检测结果；图8B是CD163阳性M2巨噬细胞的转化情况检测结果；图8C是Ki-67阳性细胞的增殖情况检测结果；图8D是CD31阳性血管的新生成情况检测结果。
图9A是移植24h后皮肤伤口处EGFP阳性WJMSCs的分布情况检测结果；图9B是移植72h后皮肤伤口处EGFP阳性WJMSCs的分布情况检测结果；图9C是图9A中EGFP阳性细胞数量的定量统计结果；图9D是图9B中EGFP阳性细胞数量的定量统计结果。
其中，Hydroactive Gel表示水胶体凝胶，WJMSCs表示脐带间充质干细胞，Hydroactive Gel+WJMSCs表示水胶体凝胶搭载脐带间充质干细胞得到的间充质干细胞制剂。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1间充质干细胞制剂的制备
将羧甲基纤维素钠、果胶按90：1的摩尔比混合，得到1mL水胶体凝胶(HydroactiveGel)，再将Hydroactive Gel用WJMSCs的完全培养基分别稀释至5倍体积和10倍体积，再搭载脐带间充质干细胞(浓度为5×106～2×107个/mL)，得到间充质干细胞制剂。用于以下实验。
实施例2 Hydroactive Gel对WJMSCs的影响
(1)不同比例稀释后的Hydroactive Gel对WJMSCs的影响
用Live/DeadTM Cell Imaging Kit检测间充质干细胞制剂中WJMSCs的存活情况(图1A)，结果显示在Hydroactive Gel的5倍和10倍稀释比例下，WJMSCs的存活情况没有显著变化；用CCK-8分别检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的细胞活性(图1B)，结果显示在Hydroactive Gel的5倍和10倍稀释比例下，WJMSCs的细胞活性没有显著变化。说明将Hydroactive Gel稀释至5～10倍体积，搭载WJMSCs时对其存活情况和细胞活性没有显著影响，对WJMSCs无毒性，适用于搭载WJMSCs。此外，相比起10倍体积稀释后的HydroactiveGel，稀释倍数为5的Hydroactive Gel搭载间充质干细胞得到的间充质干细胞制剂粘度更高，更有利于延长WJMSCs在伤口部位的驻留时间。
以下实验使用的Hydroactive Gel均为按实施例1方法制备的5倍体积稀释后的Hydroactive Gel，使用的间充质干细胞制剂均为按实施例1制备的5倍体积稀释后的Hydroactive Gel搭载WJMSCs得到的间充质干细胞制剂。
(2)Hydroactive Gel对WJMSCs的包裹情况
在不同温度条件下(4℃和37℃)用显微镜观察Hydroactive Gel的形态(图2A)，结果显示，不同温度下的Hydroactive Gel变化不大，均为凝胶状态，有一定的粘稠度。再用扫描电镜分别对Hydroactive Gel和间充质干细胞制剂进行扫描，得到图2B的电镜扫描图，由图可知，WJMSCs可被Hydroactive Gel完整包裹，有效地附着在Hydroactive Gel的孔隙中。
(3)Hydroactive Gel对WJMSCs存活率、细胞活性和增殖能力的影响
将WJMSCs和间充质干细胞制剂分别培养24h，通过显微镜明场拍照得到图3A的细胞形态图，可以看出两组细胞形态无显著差异，均成纤维状且贴壁生长，说明用HydroactiveGel搭载WJMSCs，对WJMSCs的细胞形态无显著影响。
用Live/DeadTM Cell Imaging Kit检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的存活情况(图3B)，并统计其存活情况得到图3C的存活率，说明用Hydroactive Gel搭载WJMSCs，对WJMSCs的存活率没有显著影响。
用CCK-8检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的细胞活性(图3D)，结果表明在细胞接种后24h，间充质干细胞制剂中WJMSCs的细胞活性轻微低于单独WJMSCs；在接种后48h，间充质干细胞制剂中WJMSCs的细胞活性与单独WJMSCs相比无显著差异。
用EdU试剂盒检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的增殖能力(图3E)，并统计两组中EdU阳性细胞的数量，计算得到图3F中增殖细胞的比例统计结果，结果显示两者的增值能力无明显差异，说明用Hydroactive Gel搭载WJMSCs，对WJMSCs的增值能力没有显著影响。
(4)Hydroactive Gel对WJMSCs细胞凋亡和线粒体的影响
用TUENL免疫荧光检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的凋亡情况(图4A)，结果显示两者细胞的凋亡情况趋向一致，说明用Hydroactive Gel搭载WJMSCs，对WJMSCs的凋亡无明显影响。
用qRT-PCR检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的凋亡及抗凋亡相关基因(BAX、BCL2、AVEN)的表达情况(图4B)，结果显示两组细胞的凋亡及抗凋亡相关基因表达没有显著差异，说明用Hydroactive Gel搭载WJMSCs，对WJMSCs的凋亡及抗凋亡相关基因表达无明显影响。
用MitoTracker免疫荧光检测单独WJMSCs和间充质干细胞制剂中WJMSCs的线粒体分布及损伤情况(图4C)，结果显示两组细胞的线粒体形态和分布没有显著差异，说明用Hydroactive Gel搭载WJMSCs，对WJMSCs的线粒体分布无明显影响，不损伤WJMSCs的线粒体。
综上可知，本发明的Hydroactive Gel可有效包裹间充质干细胞，且对间充质干细胞无毒性，不会影响间充质干细胞的形态、存活率、细胞活性、增殖能力、凋亡及抗凋亡，以及线粒体形态和分布，适用于搭载间充质干细胞，制备得到间充质干细胞制剂。
实施例3间充质干细胞制剂对糖尿病皮肤溃疡的治疗作用
(1)间充质干细胞制剂对皮肤伤口愈合的影响
用高糖高脂日粮饲养SD大鼠4周后，通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建二型糖尿病大鼠模型，二型糖尿病大鼠的皮肤伤口模型构建及细胞治疗示意图如图5A所示，第6周时分别将PBS、Hydroactive Gel、WJMSCs(数量为2×106个)、间充质干细胞制剂(WJMSCs的数量为2×106个，浓度为2×107个/mL)和WJMSCs(数量为1×107个)移植至糖尿病大鼠皮肤伤口处，再分别于移植后第5、7、10和14天检查伤口愈合情况，整体结果如图5B所示，其中，第7天的伤口愈合率如图5C所示，第14天的伤口愈合率如图5D所示。
从图5B可知，随着时间的推移，各组伤口有不同程度的改善，但改善程度均不如间充质干细胞制剂组；图5C显示各组移植药物7天后，PBS组的未愈合伤口面积为71.28％±7.24，Hydroactive Gel组的未愈合伤口面积为64.82％±5.71，WJMSCs(2×106个)组的未愈合伤口面积为67.42％±1.48，间充质干细胞制剂组的未愈合伤口面积为43.84％±2.11，WJMSCs(1×107个)组的未愈合伤口面积为58.24％±2.60，可见间充质干细胞制剂组的伤口愈合效果最佳，显著优于其它各组；图5D显示各组移植药物14天后，PBS组的未愈合伤口面积为48.57％±5.07，Hydroactive Gel组的未愈合伤口面积为45.16％±4.43，WJMSCs(2×106个)组的未愈合伤口面积为40.72％±1.34，间充质干细胞制剂组的未愈合伤口面积为7.65％±1.50，WJMSCs(1×107个)组的未愈合伤口面积为37.98％±2.68，可见间充质干细胞制剂组的促伤口愈合效果最佳，显著优于其它各组。图5B～5D均说明间充质干细胞制剂可显著提高糖尿病皮肤溃疡的伤口愈合率。
(2)间充质干细胞制剂对伤口处皮肤组织再生的影响
收集实施例3(1)的各组糖尿病大鼠移植药物14天后的伤口处皮肤组织样品，经固定、脱水、包埋和切片后分别进行H&E染色(图6A)和Masson三色染色(图7)，以检测不同组糖尿病大鼠皮肤组织再生情况。
分析图6A可得各组皮肤组织中新生毛囊数目的统计结果(图6B)、各组皮肤组织中真皮层厚度的统计结果(图6C)、各组皮肤组织疤痕宽度的统计结果(图6D)，从图6B～6D可以看出，间充质干细胞制剂组的新生毛囊数目最多，真皮层厚度最厚，疤痕宽度最小，与其它各组均存在显著性差异。从图7可以看出，间充质干细胞制剂组的颜色最深，即皮肤组织胶原蛋白沉积最多。
可见，间充质干细胞制剂可显著增加真皮层厚度、增加新生毛囊数量、减少瘢痕宽度、增加胶原纤维沉积量，因此，间充质干细胞制剂可显著促进皮肤组织再生。
(3)间充质干细胞制剂对伤口处巨噬细胞转化及血管生成的影响
同实施例3(1)构建二型糖尿病大鼠皮肤伤口模型的方法，将PBS、HydroactiveGel、WJMSCs和间充质干细胞制剂分别移植至糖尿病大鼠皮肤伤口处，对各组皮肤组织样品进行免疫组织化学检测，得到图8A的各组皮肤组织中CD86阳性M1巨噬细胞的转化情况、图8B的各组皮肤组织中CD163阳性M2巨噬细胞的转化情况、图8C的各组皮肤组织中Ki-67阳性细胞的增殖情况、图8D的各组皮肤组织中CD31阳性血管的新生成情况。
从图8A可知，间充质干细胞制剂组的真皮层中促炎性M1巨噬细胞(CD86阳性)数量最少；从图8B可知，间充质干细胞制剂组的真皮层中抗炎型M2巨噬细胞(CD163阳性)数量最多；从图8C可知，间充质干细胞制剂组的Ki-67阳性细胞数量最多；从图8D可知，间充质干细胞制剂组的CD31阳性血管新生成数量最多。可见，间充质干细胞制剂可有效减少促炎型巨噬细胞数量、增加抗炎型巨噬细胞数量、增加细胞总增殖比例和增加新生血管数量。
综上可知，间充质干细胞制剂可显著提高糖尿病皮肤溃疡的伤口愈合率，可显著促进皮肤组织再生和新血管生成，有效调节巨噬细胞极化，适用于糖尿病皮肤溃疡的预防和/或治疗。
实施例4间充质干细胞在糖尿病皮肤溃疡伤口处的植入和驻留情况
同实施例3(1)构建二型糖尿病大鼠皮肤伤口模型的方法，将过表达EGFP的WJMSCs和间充质干细胞制剂分别移植至糖尿病大鼠皮肤伤口处，在移植24h、72h后对各组皮肤组织样品经固定、脱水后进行切片，再分别进行组织免疫荧光检测，分别得到图9A、图9B的皮肤伤口处EGFP阳性WJMSCs的分布情况，并将图9A中EGFP阳性细胞数量进行定量统计得到图9C，将图9B中EGFP阳性细胞数量进行定量统计得到图9D。
从图9A～9D可知，在药物移植24h、72h后，间充质干细胞制剂组的EGFP阳性细胞数量最多，且显著高于WJMSCs组，说明用Hydroactive Gel搭载WJMSCs，有效延长了WJMSCs在伤口上的驻留时间，使WJMSCs在糖尿病皮肤溃疡伤口处不易流失，进而促进WJMSCs的植入，有利于糖尿病皮肤溃疡的治疗。
综上所述，本发明的间充质干细胞制剂采用特定的水胶体凝胶搭载间充质干细胞，有效延长了间充质干细胞在伤口部位的驻留时间，促进WJMSCs的植入，且显著提高了糖尿病皮肤溃疡的伤口愈合率，有效促进皮肤组织再生、促进新血管生成和调节巨噬细胞极化，表明本发明的间充质干细胞制剂适用于糖尿病皮肤溃疡的预防和/或治疗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种间充质干细胞制剂在制备预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡的产品中的应用，所述间充质干细胞制剂包含水胶体凝胶和间充质干细胞；所述水胶体凝胶包括羧甲基纤维素钠和果胶，所述羧甲基纤维素钠和果胶的摩尔比为80～100：1；
所述间充质干细胞制剂的制备方法为：水胶体凝胶用磷酸盐缓冲盐溶液、生理盐水或完全培养基稀释后，再搭载间充质干细胞；
所述稀释为将水胶体凝胶稀释至5～10倍体积；
所述间充质干细胞的浓度为5×106～2×107个/mL。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡包括促进伤口愈合、促进皮肤组织再生、促进新血管生成或调节巨噬细胞极化中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗糖尿病皮肤溃疡包括增加真皮层厚度、增加新生毛囊数量、增加胶原纤维沉积量、减少瘢痕宽度、减少促炎型巨噬细胞数量、增加抗炎型巨噬细胞数量、增加细胞总增殖比例或增加新生血管数量中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠和果胶的摩尔比为90：1。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或经血间充质干细胞。
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