CN110484497A - 一种血小板裂解液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种血小板裂解液及其制备方法和应用 Download PDF

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刘广亚
许育兵
单桂秋
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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Abstract

本发明提供一种血小板裂解液及其制备方法和应用，其中，本发明的制备方法包括如下步骤：S1、制备所需浓度血小板的富血小板血浆；S2、将富血小板血浆放置‑20℃冰箱冰冻保存24h，取出至于37℃水浴箱中解冻5min；重复以上冻融过程；S3、将最后一次解冻的富血小板血浆离心，取上清液，即为所需血小板裂解液。本发明在‑20℃常规冰箱条件下制备血小板裂解液，无需超低温冰箱及液氮设备，实现在没有特殊设备情况下制备血小板裂解液。无需添加任何外源性物质，安全性较高。可以制备出比目前常规方法相同或更优的血小板裂解液。

Description

一种血小板裂解液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种血小板裂解液及其制备方法和应用。
背景技术
血小板裂解液是富血小板血浆的衍生物，是将浓缩血小板进一步裂解后所获得的液体成分，它不仅去除了残余细胞结构，降低免疫原性，而且生长因子及其它生物活性蛋白被保留下来。
现有技术中，主要通过-80℃超低温冰箱和液氮反复冻融、超声处理、激光处理等方法制备，上述制备方法需要特殊的设备以及专业的技术方可完成，不利于血小板裂解液的扩展应用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种血小板裂解液的制备方法，其制备要求较低，降低了设备要求和技术要求。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种血小板裂解液的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备所需浓度血小板的富血小板血浆；
S2、将富血小板血浆放置-20℃冰箱冰冻保存24h，取出至于37℃水浴箱中解冻5min；重复以上冻融过程；
S3、将最后一次解冻的富血小板血浆离心，取上清液，即为所需血小板裂解液。
作为优选地，所述步骤S2中，冻融过程反复进行4次。
作为优选地，所述步骤S3中，离心条件为在3000G的分离因素下离心20min。
利用上述方法获得的血小板裂解液培养细胞。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、在-20℃常规冰箱条件下制备血小板裂解液，无需超低温冰箱及液氮设备，实现在没有特殊设备情况下制备血小板裂解液。
2、无需添加任何外源性物质，安全性较高。
3、可以制备出比目前常规方法相同或更优的血小板裂解液。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
一种血小板裂解液的制备方法，包括如下步骤：
S1、现有方法制备所需浓度血小板的富血小板血浆；
S2、将富血小板血浆放置-20℃冰箱冰冻保存24h，取出至于37℃水浴箱中解冻5min；重复以上冻融过程4次；
S3、将最后一次解冻的富血小板血浆离心，取上清液(目的即通过离心将细胞碎片去除)，即为所需血小板裂解液，其中，离心条件为在3000G的分离因素下离心20min。
将制备收集的血小板裂解液在血细胞计数仪检测残余血小板个数，计算裂解率。
裂解率：每次冻融后取样重复血小板计数3次，计算平均裂解率。本方法的血小板裂解率为95.6％。与邓小军等人制备的血小板裂解率无明显差异(邓小军,叶永清,林秀妹等.浓缩血小板制备血小板裂解液及其质量特性的初步研究.中国输血杂志,2017,30(10)：1143-1145)。
生长因子检测结果：
A组：-20℃反复冻融检测结果；
B组：-80℃反复冻融检测结果；
C组：添加牛凝血酶和钙离子激活PRP制备激活上清。
A、B两组与C组间比较，PDGF-AA、TGF-β、IGF的含量无明显差异，且差异无统计学意义P＞0.05。A、B两组组间比较，PDGF-AA、TGF-β、IGF的含量差异也无统计学意义(P＞0.05)。见表1。
表1不同组别之间PDGF-AA、TGF-β、IGF检测结果(x—±s)
促进小鼠软骨细胞增殖的CCK8试验
实验组A、B、C，3组与对照组(5％胎牛血清)比较，在24、48和72h三个时间点，促细胞增殖效果差异具有统计学意义，P＜0.05；实验组A、B、C3组组内比较，促细胞增殖效果差异无统计学意义，P＞0.05；组内比较：A、B、C3组在不同时间点，均随着时间的增加，细胞的促增殖效果越好，差异均有统计学意义P＜0.05。具体见表2。
表2不同组别PRP作用于不同时间对小鼠软骨细胞增殖的影响(x—±s，OD值)
注：*与对照组比较，24h的F值分别为27.2、18.641、77.023，P＜0.05；&与对照组比较，48h的F值分别为15.162、33.543、21.927，P＜0.05；△与对照组比较，72h的F值分别为64.228、22.742、14.283，P＜0.05。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种血小板裂解液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备所需浓度血小板的富血小板血浆；
S2、将富血小板血浆放置-20℃冰箱冰冻保存24h，取出至于37℃水浴箱中解冻5min；重复以上冻融过程；
S3、将最后一次解冻的富血小板血浆离心，取上清液，即为所需血小板裂解液。
2.根据权利要求1所述的一种血小板裂解液的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，冻融过程反复进行4次。
3.根据权利要求1所述的一种血小板裂解液的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，离心条件为在3000G的分离因素下离心20min。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法制得的血小板裂解液。
5.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法制得的血小板裂解液在细胞培养中的应用。
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