CN113684172A

CN113684172A - 一种细胞三维培养材料、制备方法及应用

Info

Publication number: CN113684172A
Application number: CN202110893097.3A
Authority: CN
Inventors: 杨磊; 林潇; 吴康
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2021-08-04
Filing date: 2021-08-04
Publication date: 2021-11-23

Abstract

本发明公开了一种细胞三维培养材料、制备方法及应用。材料由凝胶基体和液态有机添加剂构成，具有良好的生物相容性、力学稳定性、抗菌性、保水性和抗冻性，易于长期存储，用于细胞培养时操作简单，细胞存活率高。将凝胶溶液或凝胶的培养基溶液与液态有机添加剂混合均匀，即得到一种细胞三维培养材料。在本发明提供的材料可在大温度范围长期培养细胞，细胞超低温下存活数月至数年，生理温度下存活数周，低于生理温度下存活数天、高于生理温度下存活数小时，并维持细胞表型。材料可应用于体外细胞培养、细胞存储、干细胞干性维持、细胞转运、细胞体内递送、水溶性和油溶性药物的细胞反应测试、组织再生修复等方面。

Description

一种细胞三维培养材料、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种可在大温度范围内长期细胞三维培养的材料、制备方法及其应用。

背景技术

传统的细胞培养主要在二维平面上进行，如细胞培养孔板、细胞培养瓶、细胞培养皿等。然而，在体内微环境中细胞被三维细胞外基质包裹，细胞与三维细胞外基质间存在密切相互作用，因而二维培养难以准确反映细胞在体内的真实生长情况，而且应用范围狭窄。细胞三维培养技术是指将细胞在材料载体所提供的三维空间中培养，材料载体支持细胞存活和特定功能发挥，最终可构建成一种三维细胞-材料载体复合物。细胞三维培养在细胞扩增、组织工程、药物筛选、再生医学等生物医学工程领域具有巨大应用潜力。

水凝胶是一类具有特定三维微观结构的高含水率材料，在生物医学工程领域已经得到了广泛的应用，包括细胞三维培养。然而，基于传统水凝胶材料的细胞三维培养方法仍具有一定局限性。第一，成型后的水凝胶的微观形貌和力学性能很大程度上受材料含水率影响，而水凝胶的含水率受外界环境影响较大。比如，常见水凝胶放置于空气中时水凝胶会快速失水，导致凝胶网络收缩、刚度升高；而放置于液体培养基后，水凝胶会迅速发生溶胀，导致凝胶网络扩张、刚度下降。这种不稳定性导致细胞在水凝胶中存活、表型和功能发挥的不确定性。第二，负载细胞的水凝胶中往往需加入一些生物因子和/或药物，为细胞生存或特定功能发挥提供化学微环境。然而，由于大部分水凝胶是亲水性聚合物（少部分水凝胶为疏水性聚合物），因此往往仅能负载一种亲水性药物（或一种疏水性药物），可负载的药物类型单一。第三，大多数水凝胶无抗菌性、容易滋生细菌，而水凝胶灭菌较为复杂、影响细胞培养的应用，水凝胶体内应用存在的感染风险也极大限制其应用。第四，细胞在超低温环境下可长期保存，而常见水凝胶在超低温下性状发生巨大变化，而且易产生冰晶损伤细胞，无法实现水凝胶-细胞复合物在超低温环境下的长期保存，也是限制其临床转化应用的一个因素。

因此，开发可克服上述缺陷的细胞三维培养方法和培养材料具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术基于水凝胶的细胞三维培养存在的不足，本发明提供一种材料体系的微观结构和力学性能具有高稳定性、可同时负载水溶性和油溶性因子及药物、具有抗菌能力细胞三维培养材料、制备方法及其应用，实现在大温度范围内对细胞进行长期三维培养。

实现本发明目的的技术方案是提供一种细胞三维培养材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）按质量百分数计，将4～10%的聚乙烯醇、明胶、聚乙二醇、聚2-羟乙基甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰化明胶、透明质酸中的一种或任意组合加入到去离子水或无血清细胞培养基中，在温度为30～95℃的条件下搅拌处理1.5～2小时，得到凝胶水溶液或无血清细胞培养基溶液；聚乙烯醇的分子量为1750±50；

（2）按体积比1.5～2：1，将甘油、乙二醇、丙二醇、山梨糖醇、硅油中的一种，或它们的任意组合加入到步骤（1）得到的凝胶水溶液或无血清细胞培养基溶液中，得到混合液，再在温度为30～95℃的条件下搅拌处理1～2小时，得到一种液态的细胞三维培养材料；或将液态的材料在室温下静置2～3小时，得到一种固化的细胞三维培养材料。

本发明所述的一种细胞三维培养材料的制备方法，在步骤（2）中, 按浓度为0.01～1 mg/mL将生物功能性组分加入到混合液或液态的细胞三维培养材料中，所述的生物功能性组分包括油溶性、水溶性细胞因子及药物中的一种，或它们的任意组合，得到一种具有生物功能的细胞三维培养材料。

本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种液态或固化的细胞三维培养材料。

本发明提供一种细胞三维培养材料的应用，将其用于体外细胞培养、干细胞干性保持、细胞长期存储、细胞转运、细胞冷热损伤防护、细胞体内递送、水溶性和油溶性药物的细胞反应测试、组织修复。

在本发明技术方案中，将细胞三维培养材料用于体外细胞培养的方法，把固化的细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，置于所含细胞的细胞完全培养基中，进行体外细胞三维培养，或将细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，进行体外细胞三维培养，或将液态的细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，于37℃的细胞培养箱中静置2～6小时完成固化，进行体外细胞三维培养。

将细胞三维培养材料用于干细胞干性保持的方法，把干细胞加载于细胞三维培养材料内，在环境温度为35～37℃下进行培养，维持干细胞干性。

将细胞三维培养材料用于细胞转运的方法，把细胞加载于细胞三维培养材料中，在温度低于37℃的条件下进行细胞转运。

将细胞三维培养材料用于水溶性和油溶性药物的细胞反应测试的方法，把水溶性和油溶性药物负载于细胞三维培养材料中，再将细胞加载于细胞三维培养材料内，用于检测细胞反应。

本发明的原理是：选取生物相容性较好的可降解凝胶为基体，在凝胶溶液中引入大量液态有机添加剂形成液态预凝胶，通过凝胶网络与有机添加剂间的交联作用最终形成凝胶材料。通过材料制备参数的选择，保证了材料具有合适的含水率、微观结构、力学性能和渗透性，可支持细胞的存活。本发明提供的材料含水率控制在较低范围，同时有机添加剂的加入使得材料具有优异的保水能力，通过高密度氢键交联形成的凝胶网络体系具有低溶胀性，因此保证了材料微观结构和力学性能的稳定性，维持细胞稳定的表型和功能。同时，液态有机添加剂的引入使得体系具有抗冻性能，进一步抑制低温下冰晶的形成、可以保证细胞在-80℃下冻存后，在37 ℃复苏时仍维持高存活率。还由于本发明制备的材料体系中水相油相共存，可将水溶性药物和油溶性药物通过溶质的形态载入材料中，实现水溶性药物和油溶性药物在材料中的可控负载、良好扩散及其与细胞的充分作用。同时，由于材料的水相和油相溢出特性，材料表面呈现两性状态，赋予材料广谱抗菌能力。

具体地，本发明所制备的细胞三维培养材料具有以下特征：

1.在37℃、应变1%、0.1～10 Hz测量条件下，进行流变学表征，其储能模量为90～4200 Pa，耗能模量为5～400Pa之间，损耗角正切tanδ为0.03～0.15，复数粘度为2～5700Pa·s。具有良好的注射性能，可以通过32G的胰岛素针头进行注射。

2.具有较低的细胞毒性，根据GB/T 16886.5-2017的测试方法，采用浸提液法对材料进行细胞毒性评估，对骨髓间充质干细胞和椎间盘髓核细胞的细胞毒性的定性评价等级为0～1级。

3.具有广谱抗菌特性，采用直接接触法，对三种细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌)和一种真菌(白色念珠菌)的抗菌效果，对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）、绿脓杆菌（P. aeruginosa）和白念珠菌（C. albicans）的抑菌率可达85%～99.8%。

4.可同时负载水溶性药物（如二甲双胍）和油溶性药物（如姜黄素）实现药物缓释，其中水溶性药物浓度为0～0.5 mg/mL，油溶性药物浓度为0～1 mg/mL。

5.当环境湿度不低于（≥）60%时，材料含水率可保持稳定。

6.材料浸泡到去离子水或液体细胞培养基中，体积变化率不高于（≤）5%。

7.将材料37 ℃浸泡于细胞培养基中，14天后完全降解，材料植入大鼠皮下，10天后完全降解。

8.在体外充当细胞三维培养的载体时，当通过添加含牛血清的细胞培养基进行细胞培养，在35～37 ℃的CO₂培养箱中培养7天后细胞存活率为80～95%；当无外部培养基添加时，在35～37 ℃的CO₂培养箱中培养7天后细胞存活率为70～85%。

9.作为细胞支架负载细胞在-196～-80 ℃冻存2个月后解冻，细胞存活率大于70%。

10.作为细胞支架负载细胞后，无液体培养基的情况下，在38～42 ℃培养4小时，细胞存活率大于50%；在1～35 ℃培养7天，细胞存活率大于50%。

本发明细胞三维培养方法可用于体外细胞培养、干细胞干性保持、细胞长期存储、细胞转运、细胞冷热损伤防护、细胞体内递送、水溶性和油溶性药物的细胞反应测试、组织修复。其中组织修复方案包括将材料或其预凝胶与含细胞的牛血清悬液共混，植入到体内辅助组织修复，以及将材料或其预凝胶直接植入到体内，募集周围组织细胞进行体内三维培养，辅助组织修复。

与现有技术相比，本发明具有如下显著的有益效果：

1.本发明解决了传统水凝胶因含水率和温度改变而影响其微观结构和机械性能的问题，可以在不高于生理环境温度下的大范围温度内长期支持细胞存活、表型维持和功能表达，特别是可维持干细胞干性，而且可以在高于生理环境温度下支持细胞存活一定时间。本发明制备的材料可同时均匀可控负载油溶性与水溶性因子和药物，实现两种药物在支架中的扩散，可为细胞培养构建特定化学微环境，也可进行多种药物的细胞反应测试。因此，该体系具有较高的应用潜力。

2.本发明制备的材料兼具良好的生物相容性和广谱抗菌能力，用于细胞三维培养时可避免细菌污染对支架内细胞影响，同时降低体内应用时的感染风险。

3.本发明制备的材料具有可控的力学性能和降解性能，应用于不同组织的修复时可调控力学性能和降解周期与组织修复需求匹配。

4.本发明所述材料的制备方案具有环境友好、成本低廉、工艺简单、设备要求低的优势，制备的材料易于长期存储、使用简单。上述优势利于本发明技术方案的临床转化。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的材料应用于培养细胞的活死荧光染色图；

图2为本发明实施例2提供的材料应用于培养细胞的免疫荧光染色图；

图3为本发明实施例3提供的材料应用于培养细胞的活死荧光染色图；

图4为本发明实施例5提供的材料应用于大鼠尾部椎间盘培养细胞的苏木精&伊红染色的组织学染色图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步阐述。

实施例1：

将1.2 g 聚乙烯醇（PVA）加入到18.8 mL无血清的α-MEM细胞基础培养基中，在90℃加热搅拌至完全溶解，得到6 wt% PVA的培养基溶液；将28.2 mL的丙二醇加入6 wt% PVA的培养基溶液，加热在95℃下搅拌至溶液均一化，得到材料培养基预混液。

用10 wt%的胎牛血清重悬大鼠骨髓间充质干细胞，用去针头的1mL注射器将材料培养基预混液与胎牛血清共混后种入24孔板中，在37℃细胞培养箱中静置2 h固化。12 h后，在孔板中胶体上方加入1 mL含10 wt%胎牛血清的α-MEM细胞基础培养基，继续培养3天后使用Calcein-AM/PI 细胞双染试剂盒对材料培养基中的骨髓间充质干细胞进行活死荧光染色。

采用本实施例提供的细胞三维培养材料，培养所得的细胞活死荧光染色图片见附图1。图1显示，利用ZEISS LSM 800 with Airyscan 共聚焦倒置荧光显微镜进行选区Z-Stack扫描，在显微镜下可以看到细胞均匀分布在凝胶中，细胞主要以圆球的形式聚集成簇生长，且细胞存活率较高。

本实施例提供的材料可应用于体外细胞培养、细胞存储、干细胞干性维持、细胞转运、细胞体内递送、水溶性和油溶性药物的细胞反应测试、组织再生修复等方面。

将细胞三维培养材料用于体外细胞培养的方法为：把固化的细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，置于所含细胞的细胞完全培养基中，进行体外细胞三维培养，或将细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，进行体外细胞三维培养，或将液态的细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，于37℃的细胞培养箱中静置2～6小时完成固化，进行体外细胞三维培养。

将细胞三维培养材料用于干细胞干性保持的方法为：把干细胞加载于细胞三维培养材料内，在环境温度为35～37℃下进行培养，维持干细胞干性。

将细胞三维培养材料用于细胞转运的方法为：把细胞加载于细胞三维培养材料中，在温度低于37℃的条件下进行细胞转运。

将细胞三维培养材料用于水溶性和油溶性药物的细胞反应测试的方法为：把水溶性和油溶性药物负载于细胞三维培养材料中，再将细胞加载于细胞三维培养材料内，用于检测细胞反应。

实施例2：

将1.2 g 聚乙烯醇（PVA）加入到18.8 mL无血清的DMEM/F12细胞基础培养基中，在90 ℃加热搅拌至完全溶解，得到6 wt% PVA的培养基溶液；将28.2 mL的山梨糖醇加入6wt% PVA的培养基溶液，加热在95℃下搅拌至溶液均一化，得到材料培养基预混液。

用10 wt%的胎牛血清重悬大鼠椎间盘髓核细胞，用去针头的1mL注射器将材料培养基预混液与胎牛血清共混后种入24孔板中，在37℃细胞培养箱中静置2 h固化。12 h后，在孔板中胶体上方加入1 mL含10 wt%胎牛血清的DMEM/F12细胞基础培养基，继续培养3天后使用Calcein-AM/PI 细胞双染试剂盒对材料培养基中的大鼠椎间盘髓核细胞进行活死荧光染色。

采用本实施例提供的细胞三维培养材料，培养所得的细胞活死荧光染色图片参见附图2；图2为使用倒置荧光显微镜拍摄细胞活死荧光染色图片，绿色为活细胞，红色为死细胞，可以看到尽管存在少部分死亡的细胞，大部分细胞仍为活细胞。

实施例3：

将1.2 g 聚乙二醇加入到18.8 mL无血清的α-MEM细胞基础培养基中，在90 ℃加热搅拌至完全溶解，得到6 wt% 聚乙二醇的培养基溶液；然后将28.2 mL的甘油加入6 wt%聚乙二醇的培养基溶液并加热，在95 ℃下搅拌至溶液均一化，得到材料培养基预混液。用10 wt%的胎牛血清重悬大鼠骨髓间充质干细胞，用去针头的1 mL注射器将材料培养基预混液与胎牛血清共混后种入24孔板中，在37 ℃细胞培养箱中静置2 h固化。12 h后，在孔板中胶体上方加入1 mL含10 wt%胎牛血清的α-MEM细胞基础培养基，继续培养3天留待备用。

吸去胶体表面的培养基，使用PBS冲洗胶体表面，将载有骨髓间充质干细胞的凝胶置于-80 ℃冰箱冷冻24 h。将低温冷藏后的凝胶置于37 ℃细胞培养箱5分钟，加入37 ℃的含10 wt%胎牛血清的α-MEM细胞基础培养基1 mL，并继续培养1h后使用Calcein-AM/PI 细胞双染试剂盒对材料培养基中的骨髓间充质干细胞进行活死荧光染色。

本实施例培养所得的冻存-复苏后的细胞活死荧光染色图片见附图3。图3为使用倒置荧光显微镜拍摄细胞活死荧光染色图片，绿色为活细胞，红色为死细胞，可以看到尽管存在少部分死亡的细胞，大部分细胞仍为活细胞。

实施例4：

将1.2 g PVA加入到18.8 mL无血清的α-MEM细胞基础培养基中，在90 ℃加热搅拌至完全溶解，得到6 wt% PVA的培养基溶液；然后将28.2 mL的乙二醇加入6 wt% PVA的培养基溶液并加热，在95℃下搅拌至溶液均一化，得到材料培养基预混液。用10 wt%的胎牛血清重悬大鼠骨髓间充质干细胞，用去针头的1mL注射器将材料培养基预混液与胎牛血清共混后种入24孔板中，在37℃细胞培养箱中静置2 h固化。12 h后，在孔板中胶体上方加入1 mL含10 wt%胎牛血清的α-MEM细胞基础培养基，继续培养3天留待备用。

吸去胶体表面的培养基，使用PBS冲洗胶体表面后，加入1 mL含10 wt%胎牛血清的α-MEM细胞基础培养基，将载有骨髓间充质干细胞的凝胶置于40 ℃的细胞培养箱中继续培养。培养24 h后，吸去表面培养基，并用PBS冲洗凝胶表面，使用Calcein-AM/PI 细胞双染试剂盒对材料培养基中的骨髓间充质干细胞进行活死荧光染色。

本实施例培养所得的细胞经高温培养后，尽管存在少部分死亡的细胞，大部分细胞仍为活细胞。

实施例5：

使用戊巴比妥麻醉300g左右的SD大鼠，待其完全麻醉后用酒精棉球对尾部进行消毒，使用21G的针头对其尾部椎间盘进行穿刺，旋转针头12 s后继续保持穿刺状态18s后拔出针头，完成髓核退变椎间盘穿刺造模。

造模后第三天，在椎间盘内进行注射治疗。将1.2 g PVA加入到18.8 mL的去离子水中，在90 ℃加热搅拌至完全溶解，得到6 wt% PVA的溶液；然后将28.2 mL的山梨糖醇加入6 wt% PVA的溶液并加热，在95℃下搅拌至溶液均一化，得到材料预混液。将预混液与牛血清的细胞悬液共混，制备PVA/山梨糖醇组织工程支架预混液。使用戊巴比妥麻醉大鼠并将尾部消毒，使用100μL的微量进样器分别向大鼠椎间盘造模节段注射30μL 材料预混液和PVA/山梨糖醇组织工程支架预混液，4周后通过影像学及组织学染色观察其退变情况。

参见附图4，为本实施例中的材料应用于大鼠尾部椎间盘培养细胞的苏木精&伊红染色的组织学染色图片。如图4所示，从组织学染色可以看出材料修复的髓核组织形状较为饱满；纤维环无扭曲变形；终板形状均一，无明显变形；软骨部分无明显损坏，椎间盘总体无明显退变。

实施例6：

将0.4 g、1.2 g、2.0 g PVA分别加入到19.2 mL、18.8 mL、18.0 mL的去离子水中，在90 ℃加热搅拌至完全溶解，得到4 wt%、6 wt%、10 wt% PVA的溶液；然后将28.8 mL、28.2mL、27 mL的甘油分别加入至4 wt%、6 wt%、10 wt% PVA的溶液并加热，在95℃下搅拌至溶液均一化，得到材料预混液，并将预混液置入直径为20 mm的圆柱体模具中。在室温下，静置12小时并留待备用。测量3种材料在37℃、应变1%、0.1～10 Hz的测量条件下的储能模量、耗能模量、损耗正切、复数粘度和在相对湿度52%、环境温度37 ℃的测量条件下放置7天后的绝对含水率以及细胞毒性等级、负载髓核细胞后不同温度下培养一定时间后的细胞存活率、-80 ℃冷冻保存1年后细胞存活率、抗菌率、体积变化率、体内/外降解周期、药物负载浓度，结果列于表1。

表1 实施例6中不同凝胶材料的材料学性能和生物学性能

。

Claims

1.一种细胞三维培养材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种细胞三维培养材料的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中, 按浓度为0.01～1 mg/mL将生物功能性组分加入到混合液或液态的细胞三维培养材料中，所述的生物功能性组分包括油溶性、水溶性细胞因子及药物中的一种，或它们的任意组合，得到一种具有生物功能的细胞三维培养材料。

3.按权利要求1制备方法得到的一种液态或固化的细胞三维培养材料。

4.权利要求3所述的一种细胞三维培养材料的应用，其特征在于用于体外细胞培养、干细胞干性保持、细胞长期存储、细胞转运、细胞冷热损伤防护、细胞体内递送、水溶性和油溶性药物的细胞反应测试、组织修复。

5.根据权利要求4所述的一种细胞三维培养材料的应用，其特征在于：所述用于体外细胞培养的方法，将固化的细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，置于所含细胞的细胞完全培养基中，进行体外细胞三维培养，或将细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，进行体外细胞三维培养，或将液态的细胞三维培养材料与含细胞的牛血清悬液共混，于37℃的细胞培养箱中静置2～6小时完成固化，进行体外细胞三维培养。

6.根据权利要求4所述的一种细胞三维培养材料的应用，其特征在于：所述用于干细胞干性保持的方法，将干细胞加载于细胞三维培养材料内，在环境温度为35～37℃下进行培养，维持干细胞干性。

7.根据权利要求4所述的一种细胞三维培养材料的应用，其特征在于：所述用于细胞转运的方法，将细胞加载于细胞三维培养材料中，在温度低于37℃的条件下进行细胞转运。

8.根据权利要求4所述的一种细胞三维培养材料的应用，其特征在于：所述用于水溶性和油溶性药物的细胞反应测试的方法，将水溶性和油溶性药物负载于细胞三维培养材料中，再将细胞加载于细胞三维培养材料内，用于检测细胞反应。